CN110302391A - 一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂及其制备方法 - Google Patents

一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于胶束制剂抗肿瘤技术领域，公开了一种葡聚糖‑槲皮素聚合物载药胶束制剂及其制备方法。该方法将改性的槲皮素与葡聚糖反应后制备得葡聚糖‑槲皮素前药聚合物，该葡聚糖‑槲皮素前药聚合物在超纯水中自发分散形成胶束。本发明所制备的葡聚糖‑槲皮素聚合物载药胶束制剂，明显的改善了药物的水溶性，提高了其生物利用度，有利于临床应用研究。制备的葡聚糖‑槲皮素聚合物载药胶束制剂可作为一种新型的抗肿瘤制剂，在癌症治疗中具有较大的研究价值和应用前景。

Description

一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于胶束制剂抗肿瘤技术领域，本发明涉及一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂及其制备方法。
背景技术
槲皮素(Quercetin,QT)，是从天然植物中提取的多酚黄酮类化合物,具有广泛的药理作用。研究表明槲皮素对多种癌症均具备良好的抑制作用，如肺癌,肝癌，乳腺癌等。然而由于其溶解度低，亲水性差,在胃肠道中不稳定，以及广泛的首过代谢，槲皮素在临床上的应用受到了很大的限制。为了提高槲皮素的生物利用度，目前的研究主要集中于利用纳米技术制备槲皮素的各种新型制剂，如包合物、微乳、脂质体、聚合物胶束、纳米结晶等。槲皮素结构中含有五个酚羟基，羟基位置的不同导致其性质不同，因此可以根据这一特性获得多种槲皮素的衍生物。槲皮素具有多种生物活性和药理作用。然而，槲皮素为平面型分子，分子堆积比较紧密，分子间引力作用大，不容易分散在溶剂中，使其水溶性较差，口服生物利用度较低。最高血浆浓度仅为0.13～7.6μM，因此大大限制了其临床研究。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂及其制备方法，本发明提供的聚合物载药胶束制剂不仅能够改善药物的水溶性，还可使药物被包裹在疏水内核可以保持药物的活性，有利于其到达特定组织或细胞发挥药效。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂制备方法，具体步骤如下：
S1.制备葡聚糖-槲皮素聚合物Dex-QT固体粉末：将槲皮素QT溶于吡啶在60℃加热搅拌至槲皮素完全溶解后将反应体系转移到冰浴条件下，向反应体系中滴加乙酸酐，室温搅拌；将产物抽滤后真空干燥，得五乙酰槲皮素FAQ。将五乙酰槲皮素、除水剂无水碳酸钾、催化剂碘化钾加入溶剂丙酮溶解。60-80℃滴加溴乙酸乙酯，60-80℃反应过夜，抽滤，旋干，得7-槲皮素氧乙酸乙酯QEA。用甲醇将7-槲皮素氧乙酸乙酯QEA溶解，加入氢氧化钾溶液；然后将反应体系冷却至-4℃，利用盐酸调节体系pH值至2-3；将反应物进行后处理后真空干燥，得7-槲皮素氧乙酸QE。将7-槲皮素氧乙酸在冰浴条件下滴加二氯亚砜，于80℃条件下反应，旋干，得7-槲皮素氧乙酰氯QT-cl。将7-槲皮素氧乙酰氯和葡聚糖粉末溶解于1～20mL的DMSO中，并加入吡啶作为缚酸剂，室温反应；反应结束后，将反应液透析，冷冻干燥，得葡聚糖-槲皮素聚合物Dex-QT固体粉末。
S2.将葡聚糖-槲皮素聚合物Dex-QT固体粉末，溶于水中，室温下，漩涡震荡并辅助超声，使其在水中分散均匀，自发形成一定浓度的胶束制剂。
进一步的，所述步骤S1中槲皮素QT与乙酸酐的摩尔比例为1：1～5，槲皮素QT与吡啶的摩尔比例为1～5：1。所述的乙醇均为70％乙醇。
进一步的，所述步骤S1中五乙酰槲皮素FAQ与溴乙酸乙酯的摩尔比例为1～10:1，五乙酰槲皮素FAQ与丙酮的质量比为3:1～5，五乙酰槲皮素FAQ与催化剂碘化钾的质量比为1～10:1，五乙酰槲皮素FAQ与除水剂的质量比例为1～5:1。
进一步的，所述步骤S1中7-槲皮素氧乙酸乙酯QEA与甲醇的用量为1:1～5。所述的氢氧化钾的质量分数为13％，加入量为5mL；盐酸的浓度为2.5mol/L。
进一步的，所述步骤S1中7-槲皮素氧乙酸QE与二氯亚砜的摩尔比例为5～10:1。所述的尾气为氯化氢和二氧化硫气体，所述的尾气回收的溶液选自氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钠或碳酸钠中的任一种。
进一步的，所述步骤S1中7-槲皮素氧乙酰氯QT-cl与葡聚糖的摩尔比为1:1，7-槲皮素氧乙酰氯QT-cl与缚酸剂的摩尔比为1:1，所述的透析为去离子水透析，每6h换一次水。
进一步的，所述步骤S2中葡聚糖-槲皮素聚合物Dex-QT与水的质量比为10～1：1～10；所述的漩涡震荡并辅助超声为漩涡震荡10～20min后超声10～20min，超声频率为40-80KHZ。
进一步的，所述步骤S2中的水为去离子水、双蒸水、超纯水中的任一种。
进一步的，所述步骤S1中的冰浴条件温度为-4℃。
合成的葡聚糖-槲皮素前药聚合物，从结合物分子特征来看，葡聚糖端由于具有多个羟基而具有很好的亲水性，槲皮素端为平面型分子，分子间存在氢键，不容易被溶剂分散，具有疏水性。
聚合物的亲水段的葡聚糖在水中稳定而形成胶束的亲水外壳，疏水段的槲皮素自动缔合而形成胶束的疏水内核；脂溶性药物槲皮素可以被包裹在疏水内核中，避免受外界环境影响而丧失药效，而亲水性的外壳则能有效地躲避其被机体的防御系统清除，达到抗肿瘤的效果。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
1.由于槲皮素水溶性较差导致其生物利用度低，本发明首次将上述经过制备形成的7-槲皮素氧乙酰氯与水溶性好、生物相容性高和可降解的葡聚糖作为载体将两者缀合形成葡聚糖-槲皮素聚合物，其特征是该结合物在水中能通过物理自组装形成以葡聚糖壳，槲皮素为核的两亲性胶束。改善药物的水溶性，提高生物利用度，有利于临床应用研究。
2.本发明提供的制备方法，条件温和，方便易行，有效的避免了剧烈的反应条件对槲皮素药物活性的破坏。且该方法仅对槲皮素进行改性，避免了实验的繁琐性，并且该方法具有良好的通用性，可普遍用于槲皮素与其他载体相结合的制备工艺中。
3.葡聚糖作为水溶性高分子聚合物，以其作为载体，在提高药物水溶性的同时，还能延长药物在体内的滞留时间，实现制剂对肿瘤的靶向治疗作用。本发明首次将槲皮素与葡聚糖相结合，是一种具有较长的体内作用时间，较好的主动靶向功能的葡聚糖-槲皮素聚合物自组装胶束制剂。该聚合物胶束与槲皮素原料药相比，显示了更强的细胞摄取作用，以及更长的动物体内循环时间和抗肿瘤疗效。制备的葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂可作为一种新型的抗肿瘤制剂，在癌症治疗中具有较大的研究价值和应用前景。
4.本发明提供制备方法制备的葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂胶束澄清透明，分散均一，利用透射电子显微镜观察胶束粒子的微观形貌，结果显示，胶束呈圆球形，大小均一，分散均匀，无团聚现象。
5.为了提高槲皮素的生物利用度，本发明以水溶性好、生物相容性高和可降解的葡聚糖作为载体，将两者缀合形成具备自组装能力的葡聚糖-槲皮素聚合物，改善药物的水溶性。合成了葡聚糖-槲皮素前药聚合物，从结合物分子特征来看，葡聚糖端由于具有多个羟基而具有很好的亲水性，槲皮素端为平面型分子，分子间存在氢键，不容易被溶剂分散，具有疏水性。利用结合物两亲性的特点，本发明首先通过物理自组装制备葡聚糖-槲皮素自组装胶束，本发明制备的葡聚糖-槲皮素胶束改善了槲皮素水溶性差，生物利用度低的问题。
6.本发明所制备得具有自组装能力(在水中物理自组装)的聚合物葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的抗肿瘤效果较其他新型制剂有比较明显的抑制肿瘤细胞的优势。
附图说明
图1是本发明实施例20中的Dex、QT、和Dex-QT的紫外吸收光谱图。
图2是本发明实施例20中葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂胶束粒径分布图(A)、胶束的Zeta电位分布图(B)。
图3是葡聚糖(A)和本发明实施例20的载药胶束(B)的透射电镜图，其中A为Dex，B为Dex-QT胶束。
图4是本发明实施例20中葡聚糖、槲皮素和本发明的载药胶束对乳腺癌细胞(A)和肺癌细胞(B)的增殖抑制图。
图5是本发明实施例20中葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂胶束对肺癌细胞内ROS含量的影响图。
图6是本发明实施例20中葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束诱导A549细胞凋亡坏死的形态变化图。
图7是本发明实施例20中葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂胶束诱导A549细胞凋亡坏死的定量分析图。
图8是本发明葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂胶束理论图。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。以下实施例中的水可以为去离子水、双蒸水、超纯水中的任意一种。
实施例1-10中的葡聚糖-槲皮素聚合物Dex-QT固体粉末制备步骤如下：
将槲皮素溶于吡啶在60℃加热搅拌至槲皮素完全溶解后将反应体系转移到-4℃冰浴条件下，向反应体系中滴加乙酸酐，室温搅拌；将产物处理后真空干燥，得五乙酰槲皮素。将五乙酰槲皮素、除水剂无水碳酸钾、催化剂碘化钾加入丙酮溶解。60℃滴加溴乙酸乙酯，保温反应过夜，抽滤，旋干，得7-槲皮素氧乙酸乙酯。用甲醇将7-槲皮素氧乙酸乙酯溶解，加入氢氧化钾溶液；然后将反应体系冷却，利用盐酸调节体系pH值；将反应物进行后处理后真空干燥，得7-槲皮素氧乙酸。将7-槲皮素氧乙酸冰浴条件下滴加二氯亚砜，于80℃条件下剧烈反应，旋干，得7-槲皮素氧乙酰氯。将7-槲皮素氧乙酰氯和葡聚糖粉末溶解于1mL的DMSO中，并加入吡啶作为缚酸剂，室温反应；反应结束后，将反应液透析，冷冻干燥，得葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末。
其中，槲皮素QT与乙酸酐的摩尔比例为1：1，槲皮素QT与吡啶的摩尔比例为1：1。所述的乙醇均为70％乙醇。五乙酰槲皮素FAQ与溴乙酸乙酯的摩尔比例为1:1，五乙酰槲皮素FAQ与丙酮的质量比为3:1，五乙酰槲皮素FAQ与催化剂碘化钾的质量比为1:1，五乙酰槲皮素FAQ与除水剂的质量比例为1:1。7-槲皮素氧乙酸乙酯QEA与甲醇的用量为1:1。所述的氢氧化钾的质量分数为13％，加入量为5mL；盐酸的浓度为2.5mol/L。7-槲皮素氧乙酸QE与二氯亚砜的摩尔比例为5:1。所述的尾气为氯化氢和二氧化硫气体，所述的尾气回收的溶液选自氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钠或碳酸钠中的任一种。7-槲皮素氧乙酰氯QT-cl与葡聚糖的摩尔比为1:1，7-槲皮素氧乙酰氯QT-cl与缚酸剂的摩尔比为1:1，所述的透析为去离子水透析，每6h换一次水。
实施例11-20中的葡聚糖-槲皮素聚合物Dex-QT固体粉末制备步骤如下：
将槲皮素溶于吡啶在60℃加热搅拌至槲皮素完全溶解后将反应体系转移到-4℃冰浴条件下，向反应体系中滴加乙酸酐，室温搅拌；将产物处理后真空干燥，得五乙酰槲皮素。将五乙酰槲皮素、除水剂无水碳酸钾、催化剂碘化钾加入丙酮溶解。80℃滴加溴乙酸乙酯，保温反应过夜，抽滤，旋干，得7-槲皮素氧乙酸乙酯。用甲醇将7-槲皮素氧乙酸乙酯溶解，加入氢氧化钾溶液；然后将反应体系冷却，利用盐酸调节体系pH值；将反应物进行后处理后真空干燥，得7-槲皮素氧乙酸。将7-槲皮素氧乙酸冰浴条件下滴加二氯亚砜，于80℃条件下剧烈反应，旋干，得7-槲皮素氧乙酰氯。将7-槲皮素氧乙酰氯和葡聚糖粉末溶解于20mL的DMSO中，并加入吡啶作为缚酸剂，室温反应；反应结束后，将反应液透析，冷冻干燥，得葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末。
其中，槲皮素QT与乙酸酐的摩尔比例为1：5，槲皮素QT与吡啶的摩尔比例为5：1。所述的乙醇均为70％乙醇。五乙酰槲皮素FAQ与溴乙酸乙酯的摩尔比例为10:1，五乙酰槲皮素FAQ与丙酮的质量比为3:5，五乙酰槲皮素FAQ与催化剂碘化钾的质量比为10:1，五乙酰槲皮素FAQ与除水剂的质量比例为5:1。7-槲皮素氧乙酸乙酯QEA与甲醇的用量为1:5。所述的氢氧化钾的质量分数为13％，加入量为5mL；盐酸的浓度为2.5mol/L。7-槲皮素氧乙酸QE与二氯亚砜的摩尔比例为10:1。所述的尾气为氯化氢和二氧化硫气体，所述的尾气回收的溶液选自氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钠或碳酸钠中的任一种。7-槲皮素氧乙酰氯QT-cl与葡聚糖的摩尔比为1:1，7-槲皮素氧乙酰氯QT-cl与缚酸剂的摩尔比为1:1，所述的透析为去离子水透析，每6h换一次水。
实施例1
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(1mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(10mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例2
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(2mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(10mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例3
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(3mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(10mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例4
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(4mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(10mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例5
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(5mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(10mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例6
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(6mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(10mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例7
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(7mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(10mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例8
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(8mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(10mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例9
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(9mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(10mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例10
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(10mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(10mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例11
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(10mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(1mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例12
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(10mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(2mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例13
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(10mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(3mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例14
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(10mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(4mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例15
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(10mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(5mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例16
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(10mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(6mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例17
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(10mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(7mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例18
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(10mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(8mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例19
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(10mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(9mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
实施例20
葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂的制备方法，步骤如下：
将(1mg)葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于(1mL)水中，室温下，超声10min，使其在水中分散均匀，自发形成胶束制剂。
取上述实施例20制备的胶束适量，利用纳米激光粒度仪检测胶束的粒径与Zeta电位，结果如图2所示，粒径大小约210nm，电位为-1.1mV。利用透射电子显微镜观察胶束粒子的微观形貌，结果如图3所示，胶束呈圆球形，大小均一，分散均匀，无团聚现象。
按照实施例20制备的葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂，葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂能够提高药物的溶解度，延长药物在体内的半衰期，改变药物的组织分布，降低毒副作用等，在聚合物-药物结合物的研究中具有很大的优势。该聚合物可以极大的改善槲皮素的水溶性，提高其生物利用度，此外，亲水性的外壳能够避免被机体的防御系统识别和清除，更高效的到达肿瘤部位，发挥治疗效果。
按照实施例20制备的葡聚糖-槲皮素聚合物，采用CCK-8法对细胞存活率进行考察。其特征是颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞的毒性成反比。使用酶标仪检测OD值，可间接反映细胞存活率。分别考察槲皮素、葡聚糖和葡聚糖-槲皮素聚合物对乳腺癌细胞和肺癌细胞的增殖抑制能力。如图4所示随着药物浓度的增加，槲皮素和葡聚糖-槲皮素聚合物对细胞的增殖抑制能力逐渐加强，细胞存活率逐渐降低。如图4所示，葡聚糖-槲皮素聚合物胶束对乳腺癌细胞和肺癌细胞均具有很好的增殖抑制效果，且增殖抑制能力要强于槲皮素，这与结合物良好的水溶性关系密切，使其更容易通过包吞作用进入肿瘤微环境，发挥更好的药效。
为了更准确直观的的评价葡聚糖-槲皮素聚合物的抑癌效果，分别计算出了槲皮素和葡聚糖-槲皮素聚合物胶束作用于乳腺癌细胞和肺癌细胞的半抑制浓度。
如表1所示槲皮素原料药作用于乳腺癌细胞和肺癌细胞的IC50值说明了修饰后的葡聚糖-槲皮素聚合物胶束具有更好的肿瘤抑制效果。且槲皮素和葡聚糖-槲皮素聚合物胶束对肺癌细胞的IC50值均小于乳腺癌细胞，说明药物对肺癌细胞的增殖抑制能力更强。
表1槲皮素和载药胶束对MCF-7(乳腺癌)细胞和A549(肺癌)细胞的IC50值
对葡聚糖-槲皮素聚合物作用于肺癌细胞后，对胞内ROS含量进行检测。如图5所示，随着药物浓度的增加，胞内ROS含量逐渐升高，并且均高于空白对照组，当药物浓度达到一定值时，即可抑制一半的细胞发生增殖。说明葡聚糖-槲皮素聚合物可以有效地刺激肺癌细胞产生较多的ROS，而ROS的累积可以通过激活p38MAPK或线粒体信号通路，从而诱导细胞凋亡，间接证明了葡聚糖-槲皮素聚合物具有很好的诱导细胞凋亡的作用。
如上述实施例20制备的胶束进行紫外波长扫描如图1所示，对葡聚糖、槲皮素、和葡聚糖-槲皮素聚合物进行紫外检测，测得的紫外吸收光谱图。在600-200nm范围内：槲皮素QT在259nm和373nm波长处出现了紫外吸收峰；葡聚糖Dex在此范围内并未出现紫外吸收；葡聚糖-槲皮素聚合物也在259nm和373nm波长处出现了紫外吸收峰，证明槲皮素与葡聚糖接枝成功。
如上述实施例20制备的葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束诱导A549细胞在20μM、80μM和200μM三个不同浓度Dex-QT胶束的作用下，分别培养24h和48h的细胞凋亡坏死形态。从图中6可知，空白组细胞只出现了个别绿色荧光和红色荧光，说明细胞生长状态良好，无明显凋亡现象。随着药物浓度的增大和培养时间的延长，荧光数逐渐增多，大部分为红色荧光，说明凋亡细胞数逐渐增加，且大部分凋亡细胞处于晚期凋亡或坏死阶段，少部分处于早期凋亡阶段。
如上述实施例20制备的葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束流式细胞仪定量检测结果。如图7所示，散点图中，左下象限代表正常细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞，左上象限代表坏死细胞。从图中可以看出，24h时，随着药物浓度的增大，正常细胞数从85.0％逐渐降低至53.5％，凋亡坏死细胞数从15％逐渐升高至46.5％，其中，晚期凋亡和坏死细胞数从13.5％逐渐升高至36.6％。48h时，随着药物浓度的增大，正常细胞数从79.9％逐渐降低至44.5％，凋亡坏死细胞数从20.1％逐渐升高至55.5％。其中，晚期凋亡和坏死细胞数从7.6％逐渐升高至34.2％。结果表明，随着药物浓度的增大和培养时间的延长，凋亡坏死细胞数逐渐增多，且大部分凋亡坏死细胞处于晚期凋亡和坏死阶段，少部分处于早期凋亡阶段，这与图6荧光染色结果基本一致。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂制备方法，其特征是，具体步骤如下：
S1.制备葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末；将槲皮素溶于吡啶加热搅拌至槲皮素完全溶解后将反应体系转移到冰浴条件下，向反应体系中滴加乙酸酐，室温搅拌；将产物抽滤后真空干燥，得五乙酰槲皮素；将五乙酰槲皮素、除水剂无水碳酸钾、催化剂碘化钾加入溶剂丙酮溶解，滴加溴乙酸乙酯，反应过夜，抽滤，旋干，得7-槲皮素氧乙酸乙酯；用甲醇将7-槲皮素氧乙酸乙酯溶解，加入氢氧化钾溶液；然后将反应体系冷却，调节体系pH值；将反应物进行后处理后真空干燥，得7-槲皮素氧乙酸；将7-槲皮素氧乙酸在冰浴条件下滴加二氯亚砜，反应后旋干，得7-槲皮素氧乙酰氯；将7-槲皮素氧乙酰氯和葡聚糖粉末溶解于DMSO中；并加入吡啶作为缚酸剂，室温反应；反应后将反应液透析，冷冻干燥，得葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末。
S2.将葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末，溶于水中，室温下，漩涡震荡并辅助超声，使其在水中分散均匀，自发形成一定浓度的胶束制剂。
2.如权利要求1所述的一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂制备方法，其特征是，所述步骤S1的具体步骤为：将槲皮素溶于吡啶在60℃加热搅拌至槲皮素完全溶解后将反应体系转移到冰浴条件下，向反应体系中滴加乙酸酐，室温搅拌；将产物抽滤后真空干燥，得五乙酰槲皮素；将五乙酰槲皮素、除水剂无水碳酸钾、催化剂碘化钾加入溶剂丙酮溶解，60-80℃滴加溴乙酸乙酯，60-80℃反应过夜，抽滤，旋干，得7-槲皮素氧乙酸乙酯；用甲醇将7-槲皮素氧乙酸乙酯溶解，加入氢氧化钾溶液；然后将反应体系冷却至-4℃，利用盐酸调节体系pH值至2-3；将反应物进行后处理后真空干燥，得7-槲皮素氧乙酸；将7-槲皮素氧乙酸在冰浴条件下滴加二氯亚砜，于80℃条件下反应，旋干，得7-槲皮素氧乙酰氯；将7-槲皮素氧乙酰氯和葡聚糖粉末溶解于1～20mL的DMSO中；并加入吡啶作为缚酸剂，室温反应；反应结束后，将反应液透析，冷冻干燥，得葡聚糖-槲皮素聚合物固体粉末。
3.如权利要求1所述的一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂制备方法，其特征是，所述步骤S1中槲皮素与乙酸酐的摩尔比例为1：1～5，槲皮素与吡啶的摩尔比例为1～5：1；所述的乙醇均为70％乙醇。
4.如权利要求1所述的一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂制备方法，其特征是，所述步骤S1中五乙酰槲皮素与溴乙酸乙酯的摩尔比例为1～10:1，五乙酰槲皮素与丙酮的质量比为3:1～5，五乙酰槲皮素与催化剂碘化钾的质量比为1～10:1，五乙酰槲皮素与除水剂的质量比例为1～5:1。
5.如权利要求1所述的一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂制备方法，其特征是，所述步骤S1中7-槲皮素氧乙酸乙酯与甲醇的用量为1:1～5；所述的氢氧化钾的质量分数为13％，加入量为5mL；盐酸的浓度为2.5mol/L。
6.如权利要求1所述的一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂制备方法，其特征是，所述步骤S1中7-槲皮素氧乙酸与二氯亚砜的摩尔比例为5～10:1；所述的尾气为氯化氢和二氧化硫气体，所述的尾气回收的溶液选自氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钠或碳酸钠中的任一种。
7.如权利要求1所述的一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂制备方法，其特征是，所述步骤S1中7-槲皮素氧乙酰氯与葡聚糖的摩尔比为1:1，7-槲皮素氧乙酰氯l与缚酸剂的摩尔比为1:1，所述的透析为去离子水透析，每6h换一次水。
8.如权利要求1所述的一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂制备方法，其特征是，所述步骤S2中葡聚糖-槲皮素聚合物与水的质量比为10～1：1～10；所述的漩涡震荡并辅助超声为漩涡震荡10～20min后超声10～20min，超声频率为40-80KHz。
9.如权利要求1所述的一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂制备方法，其特征是，所述步骤S2中的水为去离子水、双蒸水、超纯水中的任一种。
10.如权利要求1所述的一种葡聚糖-槲皮素聚合物载药胶束制剂制备方法，其特征是，所述步骤S1中的冰浴条件温度为-4℃。
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