KR20110064006A

KR20110064006A - 신규한 케르세틴 콘쥬게이트, 피발록시메틸 케르세틴 및 이소프로필록시카르보닐메톡시 케르세틴 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20110064006A
Application number: KR1020090120419A
Authority: KR
Inventors: 정유훈; 박광수; 박혜리; 김미경; 이채운
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2011-06-15
Also published as: KR101127596B1

Abstract

본 발명은 케르세틴의 안정성을 획기적으로 개선함으로써 케르세틴의 항암활성을 향상시킨 신규한 케르세틴 콘쥬게이트 및 그 제조방법에 관한 것이다.

케르세틴, 케르세틴 콘쥬게이트, 피발록시메틸 케르세틴, 이소프로필록시카르보닐메톡시 케르세틴, 안정성, 세포독성, 항암성

Description

신규한 케르세틴 콘쥬게이트, 피발록시메틸 케르세틴 및 이소프로필록시카르보닐메톡시 케르세틴 및 그 제조방법{A novel quercetin conjugate, POM-Q or POC-Q and a method for manufacturing the same}

케르세틴은 식물유래 플라보노이드계 화합물로서 항산화 효과, 항암 효과, 항바이러스 효과를 비롯한 여러 가지 다양한 생리활성을 갖는 것으로 공지되어 있다(Ferry, D. R. et al. Clin . Cancer . Res. 1996, 2(4), 659-668; Lamson, D. W.; Brignall, M. S. Altern . Med . Rev . 2000, 5(3), 196-208).

그러나 케르세틴은 수용성이 낮고, 소장에서의 흡수도가 매우 떨어지는 문제점을 가지고 있다. 또한 케르세틴은 대사효소에 의해 페놀 수산화기에 메틸기, 술폰기, 그리고 글루쿠론산 등이 결합된 대사체로 쉽게 전환되는데, 일반적으로 케르세틴 대사체는 케르세틴이 가지는 생리활성을 가지지 못한다. 따라서 낮은 수용성, 낮은 세포흡수도, 그리고 빠른 대사 작용으로 인해 케르세틴은 낮은 생물학적 이용 가능성 (bioavailability)을 보이는 문제점을 가지고 있다(Formica, J. V; Regelson, W. Fd . Chem . Toxic . 1995, 33, 1061-1080; Mariusz K. P. BioFactors . 2000, 12, 175-180; O’Leary, K. A.; Day, A. J.; Needs, P. W.; Mellon, F. A.; O’Brien, N. M.; Williamson, G. Biochem . Pharmacol. 2003, 65, 479).

케르세틴의 약동력학적 특성을 개선하기 위해 다양한 케르세틴 콘쥬게이트를 개발하려는 노력이 있어 왔으나 대부분의 경우에 케르세틴 에스테르 및 케르세틴 카바메이트 형태를 갖는 콘쥬게이트들은 화학적 가수분해 및 효소에 의한 가수분해에 의해 빠르게 케르세틴으로 전환되는 단점을 가지고 있어 매우 제한된 효용을 가지고 있어서 케르세틴 콘쥬게이트의 화학적 안정성에 대한 보완이 요구되어지고 있다(Mulholland, P. J.; Ferry, D. R.; Anderson, D.; Hussain, S. A.; Young, A. M.; Cook, J. E.; Hodgkin, E.; Seymour, L. W.; Kerr, D. J. Ann . Oncol . 2001, 12, 245, Mi Kyoung Kim, Kwang-su Park, Woon-seok YeO, Hyunah Choo, Youhoon Chong. Bioorg . Med . Chem . 2009, 17, 1164-1171, Mi Kyoung Kim, Kwang-su Park, Woon-seok Yeo, Hyunah Choo, Youhoon Chong. Bioorg . Med . Chem . 2009, 17, 1164-1171).

이러한 단점을 개선하고자 에스테르보다 안정한 형태인 카바메이트 (carbamate)류의 프로드러그인 케르세틴 글리신 카바메이트 (quercetin-glycine carbamate prodrug) QC12 [화학식 1]가 개발되어 임상 실험된 바 있다 (Mulholland, P. J.; Ferry, D. R.; Anderson, D.; Hussain, S. A.; Young, A. M.; Cook, J. E.; Hodgkin, E.; Seymour, L. W.; Kerr, D. J. Ann . Oncol . 2001, 12, 245).

QC12는 케르세틴과 비교하여 월등히 향상된 수용성을 가지고 있으며 37 ℃ 물에서 천천히 케르세틴으로 가수분해 (반감기 16.9 시간) 되는 등 프로드러그로서의 우수한 특성을 가지고 있으나 생체 내에서 가수분해 효소에 의해 매우 빠르게 가수분해 (반감기 0.39 시간) 되어 경구 투여제로 개발될 수 없는 한계를 가지고 있었다 (Mulholland, P. J.; Ferry, D. R.; Anderson, D.; Hussain, S. A.; Young, A. M.; Cook, J. E.; Hodgkin, E.; Seymour, L. W.; Kerr, D. J. Ann . Oncol . 2001, 12, 245).

[화학식 1]

케르세틴-아미노산 콘쥬게이트 (quercetin-amino acid conjugate)[화학식 2]는 가장 최근에 개발된 (Mi Kyoung Kim, Kwang-su Park, Woon-seok YeO, Hyunah Choo, Youhoon Chong. Bioorg . Med . Chem . 2009, 17, 1164-1171) 케르세틴 프로드러그로서, 케르세틴과 다양한 아미노산의 콘쥬게이트를 카바메이트 형태로 형성함으로써 6배 (Qu-K)에서 52배 (Qu-E)에 이르는 수용성의 증가는 물론, 세포투과성 또한 케르세틴에 비해 향상됨을 보였다. 또한, 케르세틴-아미노산 콘쥬게이트들은 세포 용해물(cell lysate)에 포함된 다양한 가수분해 효소에 노출시켰을 때, 약 1시간 30분 (Qu-D, Qu-A 및 Qu-F)에서 3시간 (Qu-K, Qu-E)의 반감기를 갖는 것으로 확인되어 가수분해 효소에 대한 케르세틴-아미노산 콘쥬게이트의 안정성이 확연히 증가한 것을 보여주었다. 그러나, 케르세틴-아미노산 콘쥬게이트는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 세포배양액에서 10분에서 60분 이내에 매우 빨리 화학적으로 가수분해되는 단점 (Mi Kyoung Kim, Kwang-su Park, Woon-seok Yeo, Hyunah Choo, Youhoon Chong. Bioorg . Med . Chem . 2009, 17, 1164-1171)을 가지고 있어서 케르세틴 프로드러그의 화학적 안정성에 대한 보완이 요구되어졌다.

[화학식 2]

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 인산완충액 및 세포배양액 등의 세포밖 환경에서의 화학적 및 효소적 가수분해에 안정하고, 암세포주로 효과적으로 침투 가능하며, 침투 후 세포내에서 케르세틴으로 전환됨으로써 케르세틴의 세포내 농도를 증가시켜 궁극적으로는 케르세틴의 생리활성, 특히 암세포주에 대한 케르세틴의 항암활성을 증가시킬 수 있는 케르세틴 콘쥬게이트를 개발하기 위함이다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 상기에서 언급한 특성을 가진 케르세틴 콘쥬게이트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 케르세틴 콘쥬게이트의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식의 화합물을 제공한다.

[화학식]

상기 화학식에서, R₁ 또는 R₂는 H,

,또는

인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 화학식의 화합물, 그 화합물의 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또 상기 화학식의 화합물, 그 화합물의 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항암 조성물의 화합물은 R₁이

,또는

인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 a) 케르세틴과 아세트산무수물을 반응시켜서 2-(3,4-디아세톡시페닐)4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트리일 트리아세테이트을 제조하는 단계;b) 상기 2-(3,4-디아세톡시페닐)4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트리일 트리아세테이트을 티오페놀(Thiophenol), N-메틸-2-피롤리디논(NMP,N-methyl-2-pyrrolidinone), 및 이미다졸과 반응시켜서 4-(3,5-디아세톡시-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-2-일)-1,2-페닐린 디아세테이트을 제조하는 단계; 및 c)상기 4-(3,5-디아세톡시-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-2-일)-1,2-페닐린 디아세테이트에 피발산 요오드화메틸 에스테르(POM-I) 또는 요오드화메틸 이소프로필 카르보네이트(POC-I)와 반응시키는 단계를 포함하는 2-(3,4-디히드록시페닐)-3,5-디히드록시-4-옥소-4H-크로멘-7-일옥시] 메틸 피발레이트 또는 [2-(3,4-디히드록시페닐)-3,5-디히드록시-4-옥소-4H- 크로멘-7-일옥시]메틸 이소프로필 카르보네이트의 제조방법을 제공한다.

또 본 발명은 a) 케르세틴과 디클로로디페닐메탄을 반응시켜서 2-(2,2-디페 닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-3,5,7-트리히드록시-4H-크로멘- 4-온을 제조하는 단계;b) 상기 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-3,5,7-트리히드록시-4H-크로멘- 4-온을 아세트산무수물과 함께 피리딘 용매에 녹여서 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트리일 트리아세테이트를 제조하는 단계;c)상기 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트리일 트리아세테이트을 티오페놀(PhSH, Thiophenol), N-메틸-2-피롤리디논(N-methyl-2-pyrrolidinone), 및 이미다졸과 반응시켜서 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]-디옥솔-5-일)-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘 -3,5-디일 디아세테이트를 제조하는 단계;d) 상기 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]-디옥솔-5-일)-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘 -3,5-디일 디아세테이트를 아세톤 용매 하에서 벤질브로미드와 탄산칼륨(K₂CO₃)과 반응시켜서 7-(벤질옥시)-2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-4-옥소-4H-크로멘 -3,5-디일 디아세테이트를 제조하는 단계;e) 상기 7-(벤질옥시)-2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-4-옥소-4H-크로멘 -3,5-디일 디아세테이트를 포화된 암모니아-메탄올 처리하여 7-(벤질옥시)-2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-3,5-디히드록시- 4H-크로멘-4-온을 제조하는 단계; 및 f) 상기 7-(벤질옥시)-2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-3,5-디히드록시- 4H-크로멘-4-온을 피발산 요오드화메틸 에스테르(POM-I) 또는 요오드화메틸 이소프로필 카르보네이트(POC-I)와 반응하는 단계를 포함하는 [2-(3,4-디히드록시페닐)-5,7-디히드록시-4-옥소-4H-크로멘-3-일옥시] 메틸 피발레이트 또는 [2-(3,4-디히드록시페닐)-5,7-디히드록시-4-옥소-4H- 크로멘-3-일옥시)메틸 이소프로필 크로보네이트의 제조방법을 제공한다.

또 본 발명은 a) 케르세틴과 디클로로디페닐메탄을 반응시켜서 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-3,5,7-트리히드록시-4H-크로멘- 4-온을 제조하는 단계; 및 b) 상기 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-3,5,7-트리히드록시-4H-크로멘- 4-온을 피발산 요오드화메틸 에스테르 또는 요오드화메틸 이소프로필 카르보네이트와 반응하는 단계를 포함하는 본 발명의 [2-(3,4-디히드록시페닐)-5-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-3,7-디일]비스 (옥시)비스(메틸렌) 비스(2,2-디메틸프로파노에이트) 또는 [2-(3,4- 디히드록시페닐)-5-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-3,7-디일]비스(옥시)비스(메틸렌) 이소프로필 디카르보네이트의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 화합물은 본 발명의 화합물의 화학구조 및/또는 작용성을 기초로 하여 제조될 수 있다. 또한 본 발명의 화합물의 화학구조를 갖고 작용성을 갖는 유사체, 동족체 및 의사체도 제공한다.

상기 화학식으로 표시되는 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 상기 화학식으로 표시되는 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "암" 또는 "종양"은 간암, 흑색종, 유방암, 흑색종, 편평세포암, 결장 및 일반적으로 GI 관, GIST의 암, 폐암, 특히 소세포 폐암, 및 비-소세포 폐암, 두부 및 경부 암, 비뇨생식계암, 혈액암, 특히 백혈병, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 고환암, 전립선암 또는 방광암; 호지킨(Hodgkin's) 질환 또는 카포시(Kaposi's) 육종을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 사용된 용어 "항암" 또는 "항종양"은 상기에서 열거한 암의 개시, 진행 등의 억제, 또는 암 세포의 사멸 등을 의미하지만 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 조성물은 주사제, 경구투여제제, 경피투여제제 등 암 환자에게 가능한 어떠한 투여 경로로도 적용 가능하다.

본 발명의 조성물은 경구투여, 비경구 투여, 피하투여, 피내투여 등의 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 본 발명의 화합물로 1일 0.001 ~ 100mg/체중 kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 ~30mg/체중 kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 이루어질 수 있고, 여러 번 나누어 이루어질 수도 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 99 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 일반적으로 약제학적 제제로 투여되며, 이는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 그것을 혼합함으로써 만들어진다. 약제학적 제제는 예를 들어, 산제, 정제, 캡슐, 액제 등과 같은 경구 투여제제, 경피흡수제, 로션제,유제 및 현탁제, 첩부제, 크림제, 카타플라스마제 등과 같은 외용제, 정맥주사제, 근육주사제 등과 같은 주사제 등이 있다.

이들 약제학적 조성물은 통상적인 방법에 의해 조제된다. 그 중 특히 바람직한 것은 외용제로, 그 구체적인 예로는 크림상,연고상, 겔상, 로션상, 유액상, 스틱상, 팩상, 유기용매에 의한 용액상 등의 제형이 있으나, 제형의 범위가 이에 한정되어 있는 것은 아니다.

약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 약제학 분야에서 사용되는 일반적인 어떤 통상의 것도 될 수 있으며, 본 발명의 화합물과 반응하지 않는다. 산제, 정제, 캡슐 등을 위한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 적절한 예는 옥수수전분, 유당, 만니톨, 미결정형 셀룰로오스 등의 부형제, 크로스카멜로오즈 소디움, 감자 전분, 정제백당 등의 붕해제, 정제젤라틴, 아라비아 고무, 메칠셀룰로오스, 에칠셀룰로오스, 포비돈 등의 결합제, 스테아린산 마그네슘, 경질무수규산, 탈크 등의 활택제가 있다.

정제는 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 프탈산히드록시프로필메칠셀룰로오스, 초산프탈산셀룰로오스, 산화티탄, 폴리소르베이트, 정제백당 등의 코팅제로 통상의 방법에 의해 코팅될 수 있다.

피부외용제에 사용되는 성분으로는 예를 들어, 액체유지, 고체유지, 밀랍, 탄화수소, 고급지방산, 고급알코올, 에스테르류,계면활성제, 보습제, 수용성 고분자화합물, 점증제, 피막제, 저급알코올, 다가알코올, 당류, 아미노산류, 유기아민류, pH조정제, 산화방지제, 향료, 물 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다. 이들 성분은 각각 1종 이상을 사용하여도 된다.

패취제의 점착 기제의 적절한 예에는 아크릴계 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리이소부틸렌 등과 같은 폴리머 기제, 트리에칠시트레이트, 트리에칠아세틸시트레이트, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에칠렌글리콜 등의 가소제를 들 수 있다.

주사제는 주사를 위해 증류수에 본 발명의 화합물의 염을 용해시킴으로써 조제할 수 있지만, 필요시, 등장화제, 무통화제, pH 조정제, 용해보조제, 완충제, 보존제 등을 첨가할 수 있다. 주사제는 또한 현택액의 형태가 될 수 있는 데, 이는 주사용 증류수 또는 식물유에 본 발명의 화합물 그 자체를 현탁시킴으로써 조제할 수 있으며 필요 시, 기제, 현탁화제 등을 첨가할 수 있다. 또한 주사제는 산제의 형태이거나, 동결건조된 것일 수 있고, 이는 사용시 용해되고, 부형제 등을 더 첨가할 수 있다.

상기의 제제들은, 환자의 투약계획에 따라 일정량의 약물이 일정속도로 방출되어 환자의 순환계로 흡수될 수 있도록 적절한 방법에 의하여 제어방출제제로서 제공될 수도 있다. 제어방출의 예로서는 매트릭스 형태의 또는 코팅막 형태의 정제, 또는 과립제 또는 이를 봉입한 캅셀제, 또는 경피흡수제제 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 본 발명의 화합물 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본원 발명의 다양한 실시양태에서, 함께 사용될 수 있는 항암제는 화학요법제, 방사능요법제, 또는 둘 다이다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 케르세틴에 피발록시메틸기(POM) 및 이소프로필록시 카르보닐메톡시기(POC) 등의 promoiety를 도입한 신규한 케르세틴 콘쥬게이트를 개발하여 케르세틴 및 기존 케르세틴 콘쥬게이트의 약동력학적 성질, 특히 가수분해에 대한 안정성을 향상시킴으로써 궁극적으로 케르세틴의 생리활성을 증가시키고자 예의 노력한 결과, 아래 [화학식 3]과 같이 케르세틴의 3번과 7번 위치에 피발록시메틸기(POM) 혹은 이소프로필록시카르보닐메톡시기(POC)를 도입한 케르세틴 콘쥬게이트 7-POM-Q, 7-POC-Q, 3-POM-Q, 3-POC-Q, 3,7-bis-POM-Q, 3,7-bis-POC-Q 등을 합성하여 인산완충액 및 세포배양액 등의 세포밖 환경에서의 화학적 및 효소적 가수분해에 대한 안정성 및 다양한 암세포주에 대한 세포독성등을 평가함으로써 케르세틴 콘쥬게이트로서의 유용성을 입증하고 본 발명을 완성하였다.

[화학식 3]

이에 본 발명자들은 가수분해에 안정하며 암세포주로 효과적으로 침투하여 세포내에서 케르세틴으로 전환되는 케르세틴 콘쥬게이트를 개발하기 위하여 피발록시메틸기(POM) 혹은 이소프로필록시 카르보닐메톡시기(POC)를 promoiety로 도입한 신규한 케르세틴 콘쥬게이트를 개발하고자 하였다. 케르세틴 콘쥬게이트 합성에 promoiety로 사용된 피발록시메틸기(POM) 혹은 이소프로필록시카르보닐메톡시기(POC)는 항바이러스제인 아데포비어 디피복실 (adefovir dipivoxyl; Hepsera)와 테노포비어 디이소프록실 푸마레이트 (tenofovir disoproxil fumarate; Viread)의 프로드러그에 도입되었던 작용기로서 약물에 접합된 상태로 약물의 지용성을 증가시킴으로써 수동확산을 통한 약물의 막투과성을 향상시키며 표적세포로 침투한 후에는 가수분해 효소에 의해 분해되어 약물을 배출하는 것으로 공지되어 있다.

본 발명에서는 상기 [화학식 3]과 같이 케르세틴의 3번과 7번 위치에 피발록시메틸기(POM) 혹은 이소프로필록시카르보닐메톡시기(POC)를 도입한 케르세틴 콘쥬게이트를 합성하여 인산완충액 및 세포배양액 등의 세포밖 환경에서의 화학적 및 효소적 가수분해에 대한 안정성, 다양한 암세포주에 대한 세포독성등을 평가함으로써 케르세틴 콘쥬게이트로서의 유용성을 입증하고 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 상기 [화학식 3]으로 표기되는 케르세틴 콘쥬게이트를 합성하였다. 구체적으로, [도 1], [도 2], 및 [도 3]은 케르세틴 콘쥬게이트를 시중 구입 가능한 출발물질로부터 합성하는 과정을 나타낸 것이다. 피발록시기(pivaloxymethyl; POM) 혹은 이소프로필록시 카르보닐메톡시기 (isopropyloxy carbonylmethoxy; POC)를 위치선택적으로 도입하기 위해서 선택적인 가리움기의 도입이 필요했는데, 이때 두 가지 방법이 중요하게 사용되었다. 하나는 케르세틴의 모든 수산화기를 가리운 후, 7번 수산화기의 가리움기만 선택적으로 제거하는 방법이고 다른 하나는 케르세틴의 B-ring을 선택적으로 가리는 방법이다. 먼저, 케르세틴을 과량의 아세트산 무수물과 반응시키면 quercetin peracetate (2, [도 1])가 얻어지는데 여기에서 7번 수산화기만을 선택적으로 제거하여 피발록실요오드 (POM-iodide) 혹은 이소프로필록시카르보닐메톡시 요오드 (POC-I)와 반응시켜 7-POM-Q (4a, [도 1])와 7-POC-Q (4b, [도 1])를 합성하였다. 한편, 케르세틴을 1,1-dichlorodiphenylmethane과 반응하면 B-ring에 가리움기가 도입된 케르세틴(5, [도 2])을 합성할 수 있는데, 이 물질에 위에서와 같은 방법을 이용하여 7번 수산화기에 선택적으로 가리움기를 도입한 후 POM-I 혹은 POC-I와 반응시키면 3-POM-Q (10a, [도 2]) 혹은 3-POC-Q (10b, [도 2])를 얻을 수 있다. 한편, 위에서 얻은 화합물 5를 가리움기 도입 과정 없이 과량의 POM-I 혹은 POC-I와 반응시키면 3,7- bis-POM-Q (11a, [도 2]) 혹은 3,7-bis-POC-Q (11b, [도 2])를 얻을 수 있다.

이하, 케르세틴 콘쥬게이트의 합성과정을 상세히 설명한다.

케르세틴(1, [도 1])을 아세트산무수물과 함께 피리딘(Pyridine) 용매에 녹여 75℃에서 교반하면 케르세틴의 모든 수산화기가 아세틸기로 가리움된 케르세틴(2, [도 1])이 얻어지는데 이 물질을 티오페놀(PhSH, Thiophenol), N-메틸-2-피롤리디논(NMP, N-methyl-2-pyrrolidinone), 그리고 이미다졸과 함께 0℃에서 교반시킴으로써 7번 수산화기에서만 선택적으로 가리움기가 제거된 중간체(3, [도 1])를 합성할 수 있다. 이를 피발록실요오드(POM-I) 혹은 이소프로필록시카보닐메톡실요오드(POC-I)와 반응시킨 후, 메탄올에 포화된 암모니아 용액을 사용한 가리움 제거 방법을 통해서 7번 수산화기에만 POM 및 POC promoiety가 선택적으로 도입된 케르세틴 콘쥬게이트 4a와 4b를 합성할 수 있다 [도 1].

한편, 3번 수산화기에만 선택적으로 콘쥬게이트를 도입하기 위해서는 좀 더 복잡한 과정이 필요한데, 우선 케르세틴을 1,1-dichlorodiphenylmethane과 반응하여 B-ring이 가리움 된 케르세틴(5, [도 2])을 얻은 후 이 물질을 아세트산무수물과 함께 피리딘 용매에 녹여 75℃에서 교반하여 나머지 수산화기가 모두 아세틸기로 가리움 된 물질(6, [도 2])을 얻을 수 있다. 이 물질을 위에서와 같이 티오페놀(PhSH, Thiophenol), N-메틸-2-피롤리디논(NMP, N-methyl-2- pyrrolidinone), 그리고 이미다졸과 함께 0℃에서 교반시킴으로써 B-ring은 디페닐메틸기로 가리움 되고 7번 수산화기 이외의 수산화기는 모두 아세틸로 가리움 된 중간체(7, [도 2])가 합성된다. 이 중간체를 아세톤 용매 하에서 벤질브로미드와 탄산칼륨(K₂CO₃)과 함께 교반하면 7번 수산화기에 벤질기가 도입된 화합물 8 ([도 2])이 얻어지는데, 여기에 포화된 암모니아-메탄올 용액을 가하면 모든 아세틸 작용기가 제거된 화합물 9 ([도 2])를 얻는다. 그 결과, 화합물 9의 5번과 3번 수산화기가 복원되는데 이 때 5번 수산화기는 4번 케토 작용기와 분자내 수소결합을 형성하여 친핵성 치환반응이 어려우므로 3번 수산화기에만 선택적으로 콘쥬게이트를 도입할 수 있다. 얻어진 케르세틴 콘쥬게이트들로부터 7번 벤질기를 수소분해 반응(H₂, Pd/C)을 통해 제거하면 3번에 선택적으로 promoiety가 도입된 케르세틴 콘쥬게이트 7-POM-Q (10a, [도 2]) 및 7-POC-Q (10b, [도 2])를 각각 얻을 수 있다. 마지막으로, 위에서 얻어진 화합물 5와 과량의 POM-I 및 POC-I를 반응시키면 분자내 수소결합 때문에 친핵성이 떨어지는 5번 수산화기를 제외한 3번과 7번 수산화기에 동시에 promoiety가 도입된 케르세틴 콘쥬게이트를 얻을 수 있고, 이 화합물들의 7번 벤질기를 수소분해 반응을 통해 제거하면 3,7-bis-POM-Q (11a, [도 2]) 및 3,7-bis-POC-Q(11b, [도 2])를 얻을 수 있다.

이하, 합성된 케르세틴 콘쥬게이트의 안정성과 암세포주에 대한 세포독성을 분석한 결과를 상세히 설명한다.

우선, 합성된 케르세틴 콘쥬게이트(4a, 4b, 10a, 10b, 11a, 11b)와 케르세틴의 안정성을 비교하기 위해 인산완충액 및 세포배양액에서(37℃) 24 시간 동안 배양한 결과, 케르세틴은 매우 빠르게(반감기 5.5 시간 이하) 분해되어 활성을 완전 히 상실하는 것으로 확인되었다. 일반적으로 케르세틴 콘쥬게이트들은 안정한 것으로 나타났으나 7번 수산화기 자리에 POM 혹은 POC 작용기가 도입된 콘쥬게이트[7-POM-Q (4a), 7-POC-Q (4b)]는 세포가 존재하지 않는 세포배양액에서 배양했을 때 서서히[반감기 150분 (7-POM-Q, 4a), 120분 (7-POC-Q, 4b), 도 3] 케르세틴으로 전환된 후 분해되는 것이 관찰되었다. 그러나 7-POM-Q 혹은 7-POC-Q를 세포가 포함된 세포배양액에서 배양하면 케르세틴으로 전환되거나 분해되지 않고 안정하게 세포로 침투하는 것이 관찰되었다 [도 4]. 따라서 7번 POM 혹은 POC 콘쥬게이트가 비록 세포배양액에서 가수분해되기는 하지만 가수분해 속도보다 빠르게 세포로 침투하기 때문에 일반적인 세포배양 조건하에서 가수분해되거나 분해되지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 다른 케르세틴 콘쥬게이트들(3-POM-Q, 3-POC-Q, 3,7-bis-POM-Q, 3,7-bis-POC-Q) 역시 세포를 포함하는 세포배양액에서 가수분해 및 분해되지 않고 안정하게 세포로 침투하는 것이 확인되었다 [도 4]. 세포로 침투한 케르세틴 콘쥬게이트들은 세포내에 존재하는 가수분해 효소들의 작용에 의해 POM 및 POC promoiety를 잃고 케르세틴으로 전환되거나 대사효소의 작용에 의해 케르세틴 대사체로 전환될 것이다. 일반적으로 케르세틴 대사체는 케르세틴에 비해 활성이 매우 떨어지는 것으로 보고되어 있으므로[(a) Rice-Evans, C. A.; Miller, N. J.; Paganga, G. Free Radical Biol. Med. 1996, 20, 933. (b) Yamamoto, N.; Moon, J. H.; Tsushida, T.; Nagao, A.; Terao, J. Arch. Biochem. Biophys. 1999, 372, 347. (c) Koga, T.; Meydani, M. Am. J. Clin. Nutr. 2001, 73, 941. (d) Da Silva, E. L.; Tsushida, T.; Terao, J. Arch. Biochem. Biophys. 1998, 349, 313. (e) Cornish, K. M.; Williamson, G.; Sanderson, J. Free Radical Biol. Med. 2002, 33, 63.] 케르세틴 콘쥬게이트가 대사작용을 피해 promoiety를 잃고 케르세틴으로 전환되는 속도가 적절히 유지된다면 세포내 활성 케르세틴의 농도를 증가시키는 효과를 가져올 것으로 예상된다. 따라서, 케르세틴 콘쥬게이트가 세포내에서 어떠한 전환과정을 거치는지를 간접적으로 알아보기 위해 암세포주에 대한 케르세틴 콘쥬게이트의 항암활성을 검증하였다. 케르세틴 콘쥬게이트의 세 가지 암세포주(MCF-7, HCT116, DU145)에 대한 세포독성을 측정한 결과, 7번 수산화기 자리에 promoiety가 도입된 콘쥬게이트들(7-POM-Q, 7-POC-Q, 3,7-bis-POM-Q, 3,7-bis-POC-Q)은 케르세틴에 비해 월등히 향상된 세포독성을 보였으나 3번 수산화기에 promoiety를 갖는 콘쥬게이트(3-POM-Q, 3-POC-Q)는 케르세틴과 마찬가지로 암세포주의 생존능력에 전혀 영향을 주지 못하였다 [도 5, 도 6]. 이상의 암세포주에서의 케르세틴 콘쥬게이트의 항암활성을 종합하면, 3-POM-Q 및 3-POC-Q는 promoiety의 가수분해보다 대사작용이 빠르게 진행되어 비활성 대사체를 형성하기 때문에 세포독성을 보이지 않는 것으로 이해되며 이에 반해 7번 위치에 promoiety가 도입된 7-POM-Q, 7-POC-Q, 3,7-bis-POM-Q, 3,7-bis-POC-Q 등은 대사작용 이전에 promoiety의 가수분해가 안정적으로 진행되어 케르세틴으로 전환되는 것으로 보인다. 이 결과는 케르세틴의 7번 수산화기가 3번 수산화기보다 먼저 대사작용을 거쳐 phase II 대사체를 형성한다고 밝힌 선행연구 결과와 정확히 일치함을 확인할 수 있다[(a) Van der Woude, H.; Boersma, M. G.; Vervoort, J.; Rietjens, I. M. C. M. Chem. Res. Toxicol. 2004, 17, 1520 (b) Day, A. J.; Bao, Y.; Morgan, M. R. A.; Williamson, G. Free Radical Biol. Med. 2000, 29, 1234 (c) Van Zanden, J. J.; Van der Woude, H.; Vaessen, J.; Usta, M.; Wortelboer, H. M.; Cnubben, N. H. P.; Rietjens, I. M. C. M. Biochem. Pharmacol. 2007, 74, 345]. 같은 맥락에서, 3,7-bis-POM-Q (혹은 3,7-bis-POC-Q)가 7-POM-Q (혹은 7-POC-Q)와 세 개의 서로 다른 암세포주에서 비슷한 세포독성 경향을 보이는 것으로 보아 3번과 7번 수산화기에 도입된 두 개의 promoiety 중에 3번 치환기가 먼저 가수분해되어 7-POM-Q (혹은 7-POC-Q)로 전환되는 것으로 기대된다.

상기의 과제해결 수단 및 하기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 케르세틴의 7번 수산화기에 도입된 POM 혹은 POC promoiety는 케르세틴 콘쥬게이트의 안정성 및 세포투과성을 향상시켜 효과적인 세포침투를 도와줄 뿐만 아니라, 세포내에서 metabolic blocker로서의 역할을 수행함으로써 케르세틴 대사체의 생성을 막아 세포내 케르세틴의 농도를 증가시킴으로써 궁극적으로 케르세틴의 암세포주에 대한 세포독성을 향상시키는 효과가 있음을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 아니하는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 케르세틴과 MTT [(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide)]를 포함한 모든 시약과 용매는 시그마-알드리치에서 구입하였다. DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)과 페니실린, 스트렙토마이신 그리고 송아지혈청(FBS)은 인비트로젠에서 구입하였다.

실시예 1: 피발산 요오드화메틸 에스테르(pivaloxymethyl iodide)의 제조: 피발산 클로로메틸 에스테르(6.6 mmol)를 아세톤(10 mL)에 녹인 용액에 요오드화나트륨(33.2 mmol)을 가한다. 이 혼합물을 60 ^oC 에서 3 시간동안 환류 교반 한다. 반응물을 식힌 후 고체를 거르고 얻어진 여과액을 감압 농축시키고 더 이상의 정제 없이 다음 반응에 사용한다.

실시예 2: 요오드화메틸 이소프로필 카르보네이트(isopropyloxy carbonylmethoxy iodide)의 제조: 클로로메틸 클로로포르메이트(7.8 mmol)를 에테르(10 mL)에 녹인 용액에 이소프로필 알콜(7.8 mmol)과 피리딘(7.8 mmol)을 가한다. 이 혼합물을 상온에서 24 시간 동안 교반한 후, 생성된 고체를 거른다. 걸러진 여과액을 1% 구연산 수용액, 물 그리고 탄산수소나트륨 수용액의 순서로 씻어내 준다. 유기 용매층을 황산마그네슘으로 탈수한 후 감압 농축하여 얻어진 무색의 액체를 아세톤(20 mL)에 녹인 용액에 요오드화나트륨(39 mmol)을 가한다. 이 혼합물을 60 ^oC 에서 3 시간동안 환류 교반 한다. 반응물을 식힌 후 고체를 거르고 얻어진 여과액을 감압 농축한 후, 더 이상의 정제 없이 다음 반응에 사용한다.

실시예 3: 2-(3,4-디아세톡시페닐)4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트리일 트리아세테이트 ( 2 )의 제조: 케르세틴 (1) (16.5 mmol)과 아세트산무수물(132 mmol)을 피리딘(35 mL) 용매하에서 환류하면서 6 시간 동안 교반한다. 반응물을 감압 농축한 후 실리 카겔 관컬럼크로마토그래피(4:1:1 = 헥산:아세톤:티클로로메탄)로 정제하면 노란색 가루 형태의 케르세틴 유도체 2를 54% 수율로 얻을 수 있다: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.72 (dd, J = 8.6, 2.0 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.34 (s, 12H).

실시예 4: 4-(3,5-디아세톡시-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-2-일)-1,2-페닐린 디아세테이트 ( 3 )의 제조: 아세틸로 전부 가리움 된 케르세틴(2, 5.85 mmol)과 이미다졸(1.17 mmol)을 N-메틸-2-피롤리디논(30 mL)에 녹인 용액에 티오페놀(4.69 mmol)을 0℃에서 천천히 가한다. 이 혼합물을 상온에서 2 시간 동안 교반한다. 반응 혼합액을 아세트산 에틸에스테로로 희석한 후, 2 N 염산 수용액으로 씻어낸다. 유기층을 황산마그네슘을 이용하여 수분을 제거한 뒤 감압 농축하여 실리카겔 관컬럼크로마토그래피 (2:1:1 = 헥산:아세톤:아세트산 에틸에스테르)로 정제하면 하얀 가루 형태의 케르세틴 유도체 3을 73% 수율로 얻을 수 있다: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.33 (s, 1H), 7.83-7.80 (m, 2H), 7.51 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 2.33 (s, 6H), 2.30 (s, 6H).

실시예 5: [2-(3,4-디히드록시페닐)-3,5-디히드록시-4-옥소-4H-크로멘-7-일옥시] 메틸 피발레이트( 4a ) 및 [2-(3,4-디히드록시페닐)-3,5-디히드록시-4-옥소-4H- 크로멘-7-일옥시]메틸 이소프로필 카르보네이트( 4b )의 제조: 위에서 얻은 화합물 3 (0.32 mmol)을 아세톤(8 mL)에 녹이고 탄산칼륨(0.64 mmol)과 피발산 요오드화메틸 에스테르(0.96 mmol) 혹은 이소프로필록시카르보닐메톡시 요오드(0.96 mmol)를 넣고 상온에서 4 시간 동안 교반한다. 반응물을 거름종이로 거르고 나서 감압 농축하여 얻은 노란색 액체를 더 이상의 정제 없이 바로 다음 반응에 사용한다. 위에서 얻은 노란색 액체를 암모니아가 포화된 메탄올(10 mL)에 녹인 뒤 0℃ 에서 2 시간동안 교반한다. 반응물을 감압 농축하여 실리카겔 관컬럼크로마토그래피(1:1 = 헥산:아세트산 에틸에스테르)를 통해서 정제하면 7번 수산화기에만 피발록시기가 콘쥬게이트된 케르세틴(4a)과 7번 수산화기에만 이소프로필록시 카르보닐메톡시기가 콘쥬게이트된 케르세틴(4b)을 각각 91% 수율과 84% 수율로 노란색 가루 형태로 얻어을 수 있다: For 4a: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.64 (s, 1H), 7.73 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.90 (s, 2H), 1.15 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 176.7, 176.4, 161.8, 160.9, 156.0, 148.4, 148.1, 145.5, 136.6, 122.1, 120.5, 116.0, 115.6, 105.4, 98.6, 94.2, 84.8, 38.8, 26.9; LC/MS (ESI) m/z Found: 415.2 [M-H]^-; Calcd for C₂₁H₂₀O₉: 416.11; For 4b: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.63 (s, 1H), 7.73 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.60 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.95 (s, 2H), 4.87-4.80 (m, 1H), 1.24 (d, J = 6.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 176.4, 161.5, 160.9, 156.0, 153.2, 148.3, 148.1, 145.5, 136.6, 122.1, 120.6, 116.0, 115.6, 105.5, 98.7, 94.1, 87.2, 73.1, 21.7; LC/MS (ESI) m/z Found: 417.2 [M-H]^-; Calcd. for C₂₀H₁₈O₁₀: 418.09.

실시예 6: 2-(2,2-디페닐벤조[ d ][1,3]디옥솔-5-일]-3,5,7-트리히드록시-4H-크로멘- 4-온 ( 5 )의 제조: 케르세틴(1, 14.8 mmol)과 디클로로디페닐메탄(44.3 mmol)을 180℃에서 30 분 동안 환류 교반한다. 반응물을 감압 농축한 뒤 실리카겔 관컬럼크로마토그래피 (4:1 = 헥산:아세트산 에틸에스테르)를 통해 정제하면 노란색 가루형태의 케르세틴 유도체 5를 35% 수율로 얻을 수 있다: ¹H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 12.18 (s, 1H), 7.89-7.92 (m, 2H), 7.63-7.69 (m, 5H), 7.45-7.49 (m, 5H), 7.19 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 6.58 (s, 1H), 6.28 (s,1H).

실시예 7: 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트리일 트리아세테이트 ( 6 )의 제조: 위에서 얻은 3'-OH와 4'-OH가 디페닐메탄기로 가리움된 케르세틴(5)(2.14 mmol)을 피리딘(10 mL)에 녹이고 아세트산무수물(10.7 mmol)을 상온에서 가한다. 반응물을 6 시간 동안 환류 교반한 후 감압 증류하고 실리카겔 관컬럼크로마토그래피(2:1 = 헥산:아세트산 에틸에스테르)를 통해서 정제하면 하얀 색 가루 형태의 케르세틴 유도체 6을 93% 수율로 얻을 수 있다: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.57-7.59 (m, 4H), 7.38-7.44 (m, 7H), 7.36 (s, 1H), 7.30 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.34 (s, 3H), 2.32 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 169.5, 169.1, 168.7, 168.1, 156.6, 154.8, 154.6, 149.8, 149.4, 147.4, 139.5, 133.0, 130.0, 129.0, 126.2, 124.3, 123.2, 117.9, 114.9, 114.3, 110.3, 109.7, 108.6, 21.2, 21.1, 20.7; LC/MS (ESI) m/z Found: 593.3 [M+H]⁺; Calcd. for C₃₄H₂₄O₁₀: 592.14.

실시예 8: 2-(2,2- 디페닐벤조 [d][1,3]- 디옥솔 -5-일)-7-히드록시-4-옥소-4H- 크로멘 -3,5- 디일 디아세테이트 ( 7 )의 제조: 위에서 얻은 화합물 6(2.0 mmol)과 이미다졸(0.4 mmol)을 N-메틸-2-피롤리디논(24 mL)에 녹인 용액에 티오페놀(1.62 mmol)을 0℃에서 천천히 가하고 상온에서 2 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 아세트산 에틸에스테르로 희석한 후, 2 N 염산 수용액으로 씻어낸다. 유기층을 황산마그네슘으로 처리하여 수분을 제거한 뒤 감압 농축하여 실리카겔 관컬럼크로마토그래피 (1:1 = 헥산:아세트산 에틸에스테르)를 이용하여 정제하면 노란색 액체 형태의 케르세틴 유도체 7을 90% 수율로 얻을 수 있다: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.55-7.58 (m, 4H), 7.37-7.41 (m, 8H), 6.92 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 2.35 (s, 3H), 2.29 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 169.4, 169.2, 168.4, 163.1, 158.0, 154.0, 150.6, 149.3, 147.5, 139.6, 132.7, 130.1, 129.1, 126.3, 124.1, 123.7, 118.0, 109.7, 109.6, 109.4, 108.6, 101.5, 21.3, 20.8; LC/MS (ESI) m/z Found: 549.3 [M-H]^-; Calcd. for C₃₂H₂₂O₉: 550.13.

실시예 9: 7-( 벤질옥시 )-2-(2,2- 디페닐벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일)-4-옥소-4H- 크로멘 -3,5- 디일 디아세테이트 ( 8 )의 제조: 위에서 얻은 케르세틴 유도체 7(1.8 mmol)을 아세톤(20 mL)에 녹인 용액에 탄산칼륨(1.8 mmol)과 벤질브로미드(2.7 mmol)를 가하고 상온에서 12 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 거름종이에 거른 후 여과액을 감압 농축하여 얻어진 잔류물을 실리카겔 관컬럼크로마토그래피(2:1 = 헥산:아세트산 에틸에스테르)를 통해서 정제하면 노란색 액체 형태의 케르세틴 유도체 8을 69% 수율로 얻을 수 있다: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.57-7.59 (m, 4H), 7.39-7.39 (m, 13H), 6.97 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.14 (s, 2H), 2.42 (s, 3H), 2.31 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 169.5, 169.2, 168.3, 163.1, 157.9, 154.2, 150.4, 149.4, 147.5, 139.6, 136.2, 132.9, 130.1, 129.1, 120.0, 128.8, 128.5, 126.3, 124.2, 123.6, 118.0, 110.6, 109.7, 108.6, 100.8, 70.9, 21.3, 20.8; LC/MS (ESI) m/z Found: 641.3 [M+H]⁺; Calcd. for C₃₉H₂₈O₉: 640.17.

실시예 10: 7-( 벤질옥시 )-2-(2,2- 디페닐벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일)-3,5-디히드록시- 4H- 크로멘 -4-온 ( 9 )의 제조: 위에서 얻은 케르세틴 유도체 8(1.25 mmol)을 암모니아가 포화된 메탄올 (12 mL)에 녹인 뒤 0℃ 에서 2 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 얻어진 잔류물을 실리카겔 관컬럼크로마토그래피 (6:2:1 = 헥 산:디클로로메탄:아세트산 에틸에스테르)를 이용하여 정제하면 노란색 가루 형태의 케르세틴 유도체 9를 90% 수율로 얻을 수 있다: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 11.69 (s, 1H), 7.77-7.81 (m, 2H), 7.59-7.61 (m, 4H), 7.34-7.44 (m, 10H), 7.09 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.54 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 2.2 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 176.6, 164.4, 160.8, 156.4, 148.1, 147.1, 146.4, 139.8, 137.2, 136.5, 129.9, 129.0, 128.9, 128.5, 128.2, 126.1, 125.5, 123.5, 117.5, 109.3, 108.2, 104.6, 98.5, 93.4, 70.3; LC/MS (ESI) m/z Found: 557.3 [M+H]⁺; Calcd. for C₃₅H₂₄O₇: 556.15.

실시예 11: [2-(3,4- 디히드록시페닐 )-5,7-디히드록시-4-옥소-4H- 크로멘 -3- 일옥시 ] 메틸 피발레이트 ( 10a ) 및 [2-(3,4- 디히드록시페닐 )-5,7-디히드록시-4-옥소-4H- 크로멘 -3- 일옥시 ) 메틸 이소프로필 크로보네이트 ( 10b )의 제조: 위에서 얻은 케르세틴 유도체 9(0.36 mmol)를 아세톤(7 mL)과 N,N-다이메틸포름알데히드(4 mL)에 녹인 용액에 탄산칼륨(0.4 mmol)과 피발산 요오드화메틸 에스테르(0.54 mmol) 혹은 요오드화메틸 이소프로필 카르보네이트(0.54 mmol)를 넣고 상온에서 12 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 거름종이에 거르고 여과액을을 감압 농축하면 노란색 액체가 얻어지는데 이를 더 이상 정제하지 않고 바로 다음 반응에 사용한다. 위에서 얻어진 노란색 액체를 테트라히드로퓨란(3 mL)과 메탄올(3 mL)에 녹인 용액에 Pd/C (15 mg)를 가하고 수소 대기하에서 12 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 규조토를 통 하여 거르고, 여과액을 감압 농축한 뒤 얻어진 잔류물을 실리카겔 관컬럼크로마토그래피(2:1:1 = 헥산:디클로로메탄:아세트산 에틸에스테르)를 이용하여 정제하면 3번 수산화기에만 피발록시기가 콘쥬게이트된 케르세틴 유도체(10a, 67% 수율)와 3번 수산화기에만 이소프로필록시 카르보닐메톡시기가 콘쥬게이트된 케르세틴 유도체(10b, 61% 수율)를 각각 노란색 가루 형태로 얻을 수 있다: For 10a: ¹H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 12.63 (s, 1H), 7.68 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.60 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.28 (s, 1H), 5.80 (s, 2H), 0.88 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 177.2, 177.0, 164.7, 161.6, 156.7, 156.5, 149.3, 145.5, 134.8, 121.7, 120.8, 116.2, 115.8, 104.3, 99.1, 94.1, 87.3, 38.4, 26.6; LC/MS (ESI) m/z Found: 415.2 [M-H]^-; Calcd. for C₂₁H₂₀O₉: 416.11; For 10b: ¹H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 12.62 (s, 1H), 7.63 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.55 (dd, J = 8.5, 2.2 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.29 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.72 (s, 2H), 4.58 (septet, J = 6.3 Hz, 1H), 1.08 (s, 3H), 1.06 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 177.2, 164.8, 161.6, 157.1, 156.8, 153.5, 149.2, 145.5, 134.6, 121.6, 120.7, 116.1, 115.8, 104.3, 99.2, 94.1, 92.1, 72.4, 21.4; LC/MS (ESI) m/z Found: 417.1 [M-H]^-; Calcd. for C₂₀H₁₈O₁₀: 418.09.

실시예 12: [2-(3,4- 디히드록시페닐 )-5-히드록시-4-옥소-4H- 크로멘 -3,7- 디일 ] 비스 (옥시) 비스 (메틸렌) 비스 (2,2- 디메틸프로파노에이트 ) ( 11a ) 및 [2-(3,4- 디히드록시페닐 )-5-히드록시-4-옥소-4H- 크로멘 -3,7- 디일 ] 비스 ( 옥시 ) 비스 (메틸렌) 이소프로필 디카르보네이트 ( 11b )의 제조: 위에서 얻은 케르세틴 유도체 5(0.32 mmol)를 아세톤(8 mL)에 녹인 용액에 탄산칼륨(0.64 mmol)과 피발산 요오드화메틸 에스테르(0.96 mmol) 혹은 요오드화메틸 이소프로필 카르보네이트(0.96 mmol)를 가하고 상온에서 4 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 거름종이로 거르고 여과액을 감압 농축하면 노란색 액체를 얻을 수 있는데 이를 더 이상 정제하지 않고 다음 반응에 사용한다. 위에서 얻은 노란색 액체를 테트라히드로퓨란(3 mL)과 메탄올(3 mL)에 녹인 용액에 Pd/C (15 mg)을 가하고 수소 대기하에서 12 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 규조토를 통하여 거르고 여과액을 감압 농축하여 얻어진 잔류물을 실리카겔 관컬럼크로마토그래피(1:1 = 헥산:아세트산 에틸에스테르)를 이용하여 정제하면 3번과 7번 수산화기에 피발록시기가 콘쥬게이트된 케르세틴(11a, 63% 수율)과 3번과 7번 수산화기에 이소프로필록시 카르보닐메톡시기가 콘쥬게이트된 케르세틴(11b, 66% 수율)을 각각 노란색 가루 형태로 얻을 수 있다: For 11a: ¹H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 12.65 (s, 1H), 7.71 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.62 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.95 (s, 2H), 5.81 (s, 2H), 1.20 (s, 9H), 0.89 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 178.7, 177.6, 177.2, 163.5, 163.0, 157.9, 157.5, 149.6, 145.9, 136.4, 123.0, 122.5, 117.0, 116.2, 107.3, 99.8, 95.1, 87.9, 85.3, 39.5, 39.1, 27.1, 26.9; LC/MS (ESI) m/z Found: 529.3 [M-H]^-; Calcd. for C₂₇H₃₀O₁₁: 530.18; For 11b: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 12.36 (s, 1H), 7.83 (d, 1.8 Hz, 1H), 7.54 (dd, J = 8.5, 1.8 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.93-5.03 (m, 1H), 4.54-4.64 (m, 1H), 1.33 (d, J = 6.3 Hz, 6H), 1.09 (d, J = 6.3 Hz, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 177.5, 162.0, 161.4, 157.8, 156.4, 153.5, 153.2, 149.5, 145.6, 135.0, 121.7, 120.5, 116.2, 115.8, 106.5, 99.5, 94.6, 90.1, 87.2, 73.1, 72.4, 21.7, 21.5; LC/MS (ESI) m/z Found: 533.3 [M-H]^-; Calcd. for C₂₅H₂₆O₁₃: 534.14.

실시예 13: 인산완충용액에서 케르세틴 콘쥬게이트의 화학적 안정성 측정: 합성된 케르세틴 콘쥬게이트들(50 mM)을 인산완충용액에(PH 7.4) 넣고 37℃에서 배양하였다. 시간 간격별로(0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 360 분) 적정량(300 μL)의 샘플을 취하여 불순물을 거른 뒤 C-18로 이루어진 역상 컬럼을 장착한 HPLC를 이용하여 분석하였다. 흐름 속도 1 mL/분; 검출, UV 340 nm; 이동상 0-8 분(10% 아세토니트릴을 함유한 물과 0.1% 포름산), 8-12 분(40% 아세토니트릴을 함유한 물과 0.1% 포름산), 12-15 분(90% 아세토니트릴을 함유한 물과 0.1% 포름산) 그리고 15-20 분(10% 아세토니트릴을 함유한 물과 0.1% 포름산).

실시예 14: 세포가 없는 배지에서 케르세틴 콘쥬게이트의 화학적 안정성 측정: 합 성된 케르세틴 콘쥬게이트들(50 mM)을 세포가 없는 배지에 넣고 37℃에서 배양하였다. 시간 간격별로(0, 30, 90, 120, 150, 210, 240, 360 분) 적정량(300 μL)의 샘플을 취하여 불순물을 거른 뒤 C-18로 이루어진 역상 컬럼을 장착한 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 이동상은 실시예 13의 조건과 같다.

실시예 15: 세포가 있는 배지에서 케르세틴 콘쥬게이트의 화학적 안정성 측정: 합성된 케르세틴 콘쥬게이트들(50 mM)을 세포가 있는 배지에 넣고 37℃에서 배양하였다. 시간 간격별로(0, 30, 90, 120, 150, 210, 240, 360 분) 적정량(300 μL)의 샘플을 취하여 불순물을 거른 뒤 C-18로 이루어진 역상 컬럼을 장착한 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 이동상은 실시예 13의 조건과 같다.

실시예 16: 케르세틴 콘쥬게이트의 암세포주에 대한 세포독성 ( Cytotoxicity ) 측정: 유방암(MCF-7), 대장암(HCT116), 그리고 전립선암(DU145) 세포주에 대한 케르세틴 콘쥬게이트의 세포독성을 검증하였다. 각각의 암세포마다 5 x 10³ 개의 세포를 96-well plate에 준비하고 10% FBS 및 1% 항생제를 포함한 DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) 배지 조건 하에서 하루 동안 배양하였다(37℃, 5% CO₂). 합성된 케르세틴 콘쥬게이트들을 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹인 용액을 7 개의 농도(0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 μM)로 묽힌 후 배양된 세포주에 각각 가하였다. 이를 24 시간 동안 배양한 뒤 MTT assay를 통해서 세포의 생존량을 측정하였다.

도 1은 케르세틴의 7-OH 에만 콘쥬게이트를 도입하는 방법을 요약해 보여준다.

도 2는 케르세틴의 3-OH 에만 콘쥬게이트를 도입하는 방법과 3-OH와 7-OH 모 두 콘쥬게이트를 도입하는 방법을 요약해 보여준다.

도 3은 세포가 없는 배지에서 케르세틴 7-OH 콘쥬게이트의 화학적 안정성을 보여준다.

도 4는 세포가 있는 배지에서 케르세틴 콘쥬게이트들의 화학적 안정성을 보 여준다.

도 5는 케르세틴 콘쥬게이트들의 세포 독성 활성을 측정한 것을 보여준다.

도 6은 케르세틴 콘쥬게이트들이 MCF-7에서의 세포 독성 양상을 보여준다.

Claims

하기 화학식의 화합물.

[화학식]

여기서, R₁ 또는 R₂는 H,
,또는
임.
제 1항의 화합물, 그 화합물의 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물.
제 1항의 화합물, 그 화합물의 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 화합물은 R₁이
,또는
인 항암용 약학 조성물.
a) 케르세틴과 아세트산무수물을 반응시켜서 2-(3,4-디아세톡시페닐)4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트리일 트리아세테이트을 제조하는 단계;

b) 상기 2-(3,4-디아세톡시페닐)4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트리일 트리아세테이트을 티오페놀(PhSH, Thiophenol), N-메틸-2-피롤리디논(NMP, N-methyl-2-pyrrolidinone), 및 이미다졸과 반응시켜서 4-(3,5-디아세톡시-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-2-일)-1,2-페닐린 디아세테이트을 제조하는 단계; 및

c)상기 4-(3,5-디아세톡시-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-2-일)-1,2-페닐린 디아세테이트에 피발산 요오드화메틸 에스테르(POM-I) 또는 요오드화메틸 이소프로필 카르보네이트(POC-I)와 반응시키는 단계를 포함하는 제1항의 2-(3,4-디히드록시페닐)-3,5-디히드록시-4-옥소-4H-크로멘-7-일옥시] 메틸 피발레이트 또는 [2-(3,4-디히드록시페닐)-3,5-디히드록시-4-옥소-4H- 크로멘-7-일옥시]메틸 이소프로필 카르보네이트의 제조방법.
a) 케르세틴과 디클로로디페닐메탄을 반응시켜서 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-3,5,7-트리히드록시-4H-크로멘- 4-온을 제조하는 단계;

b) 상기 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-3,5,7-트리히드록시-4H-크로멘- 4-온을 아세트산무수물과 함께 피리딘 용매에 녹여서 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트리일 트리아세테이트를 제조하는 단계;

c)상기 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-4-옥소-4H-크로멘-3,5,7-트 리일 트리아세테이트을 티오페놀(PhSH, Thiophenol), N-메틸-2-피롤리디논(NMP, N-methyl-2-pyrrolidinone), 및 이미다졸과 반응시켜서 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]-디옥솔-5-일)-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘 -3,5-디일 디아세테이트를 제조하는 단계;

d) 상기 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]-디옥솔-5-일)-7-히드록시-4-옥소-4H-크로멘 -3,5-디일 디아세테이트를 아세톤 용매 하에서 벤질브로미드와 탄산칼륨(K₂CO₃)과 반응시켜서 7-(벤질옥시)-2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-4-옥소-4H-크로멘 -3,5-디일 디아세테이트를 제조하는 단계;

e) 상기 7-(벤질옥시)-2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-4-옥소-4H-크로멘 -3,5-디일 디아세테이트를 포화된 암모니아-메탄올 처리하여 7-(벤질옥시)-2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-3,5-디히드록시- 4H-크로멘-4-온을 제조하는 단계; 및

f) 상기 7-(벤질옥시)-2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-3,5-디히드록시- 4H-크로멘-4-온을 피발산 요오드화메틸 에스테르 또는 요오드화메틸 이소프로필 카르보네이트와 반응하는 단계를 포함하는 제1항의 [2-(3,4-디히드록시페닐)-5,7-디히드록시-4-옥소-4H-크로멘-3-일옥시] 메틸 피발레이트 또는 [2-(3,4-디히드록시페닐)-5,7-디히드록시-4-옥소-4H- 크로멘-3-일옥시)메틸 이소프로필 크로보네이트의 제조방법.
a) 케르세틴과 디클로로디페닐메탄을 반응시켜서 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-3,5,7-트리히드록시-4H-크로멘- 4-온을 제조하는 단계; 및

b) 상기 2-(2,2-디페닐벤조[d][1,3]디옥솔-5-일]-3,5,7-트리히드록시-4H-크로멘- 4-온을 피발산 요오드화메틸 에스테르 또는 요오드화메틸 이소프로필 카르보네이트와 반응하는 단계를 포함하는 제1항의 [2-(3,4-디히드록시페닐)-5-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-3,7-디일]비스 (옥시)비스(메틸렌) 비스(2,2-디메틸프로파노에이트) 또는 [2-(3,4- 디히드록시페닐)-5-히드록시-4-옥소-4H-크로멘-3,7-디일]비스(옥시)비스(메틸렌) 이소프로필 디카르보네이트의 제조방법.