CN109833484B - 一种不含甲氨喋呤和含甲氨蝶呤的聚乙二醇化聚l-赖氨酸-羟基喜树碱纳米粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不含氨甲喋呤和含甲氨蝶呤的聚乙二醇化聚L‑赖氨酸‑羟基喜树碱纳米粒的制备方法。所述方法是将PEG和HCPT接枝在PLL骨架上，形成PPH；将PPH在不存在或存在MTX的情况下进行自组装透析，分别形成PPH NPs和MTX‑PPHNPs。
Description
技术领域
本发明涉及一种不含甲氨喋呤和含甲氨蝶呤的聚乙二醇化聚L-赖氨酸-羟基喜树碱纳米粒的制备方法。
背景技术
癌症是一种危及生命的疾病。世界卫生组织(WHO)报道，恶性肿瘤已成为21世纪人类的“第一杀手”。目前，化疗药物仍然是所有分期癌症专利的一线治疗方法。它们对杀死癌细胞非常有效，但也能杀死正常细胞。由化疗引起的严重的全身细胞毒性和免疫抑制却抵消了治疗的益处并缩短了癌症患者的寿命。因此，战略性提高化疗药物疗效和减少副作用仍在积极研究中。在目前的研究中，我们设计了一种纳米粒子来携带10-羟基喜树碱(HCPT)和甲氨蝶呤(MTX)，并进一步探索两种药物组合的抗癌作用。
CPT是醌类生物碱(即喜树碱)的衍生物，分离自中国树木喜树，属于天然抗癌药物。作为DNA拓扑异构酶I抑制剂，它抑制DNA复制进入S期细胞周期，导致不可逆转的DNA链破坏，诱导细胞凋亡。在CPT的衍生物中，HCPT已被用于治疗不同类型的癌症，包括原发性肝癌，胃癌，结肠直肠癌，膀胱癌，头颈部上皮癌和白血病。HCPT的副作用如骨髓抑制，中性粒细胞减少，泌尿系统损害和引起严重腹泻都有文献记载。
嘌呤和嘧啶合成的需要叶酸，这也是DNA合成的需要。甲氨蝶呤(MTX)可竞争性抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)。甲氨蝶呤对DHFR的亲和力是叶酸的1000倍。DHFR催化二氢叶酸转化为具有活性的四氢叶酸酯，这是嘌呤和嘧啶合成的一种共酶。MTX可抑制核苷碱的合成，由于这种基础结构的消耗可减少DNA的合成。MTX是一类属于抗代谢的化疗药物。它被用于治疗多种癌症，其中包括结直肠癌。与其他一般的化疗药物一样，MTX也会阻止正常细胞的正常工作，导致骨髓抑制和免疫细胞毒性等副作用。
联合使用两种及两种以上化疗药物是治疗肿瘤转移的有效方法。这种作用可以是协同作用、加性作用或抑制作用，因为多种药物可以在不同的途径中抑制肿瘤生长或诱导肿瘤细胞凋亡。联合用药可以减少单个药物的剂量和副作用。据报道，氟嘧啶/叶酸(5-FU/LV)联合伊立替康(喜树碱衍生物)或奥沙利铂可延长IV期癌症患者的寿命。胸腺嘧啶是DNA复制所需的核苷，而5-Fu作为亚氨酸合成酶(TS)可抑制剂阻止胸腺嘧啶的合成。因为5-Fu和MTX有类似的抗肿瘤使用途径；本发明尝试制备一种包载HCPT及MTX的纳米粒子，结合两种药物来检验其抗肿瘤作用。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种不含甲氨喋呤和含甲氨蝶呤的聚乙二醇化聚L-赖氨酸-羟基喜树碱纳米粒的制备方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述不含甲氨喋呤和含甲氨蝶呤的聚乙二醇化聚L-赖氨酸-羟基喜树碱纳米粒的制备方法，其特征在于，所述方法是将PEG和HCPT接枝在PLL骨架上，形成PPH；将PPH在不存在或存在MTX的情况下进行自组装透析，分别形成PPH NPs和MTX-PPHNPs；所述PEG为聚乙二醇，所述HCPT为10-羟基喜树碱，所述PLL为聚-L-赖氨酸，所述PPH为聚乙二醇聚-L-赖氨酸羟基喜树碱聚合物，所述MTX为甲氨蝶呤，所述PPH NPs为PPH纳米颗粒所述MTX-PPH NPs为负载MTX的PPH纳米颗粒。
上述方法具体包括如下步骤：
(1)合成PEG-g-PLL；
(2)合成10-HCPT-SA；
(3)将PEG-g-PLL与10-HCPT-SA反应合成PPH；
(4)将PPH溶解在DMF中自组装为PPH NPs；或者，将PPH溶解在DMF中，将MTX溶解在DMF中，将溶解有PPH的DMF加入溶解有MTX的PPH中，自组装后得到MTX-PPH NPs。
其中，所述合成PEG-g-PLL是将SA和DMAP溶于无水CH2Cl2(1mM:1mM:10mL)中，在60℃回流加热后，加入PEG并继续加热并搅拌，得溶液；将溶液用乙醚沉淀，然后过滤，干燥后将白色粉末溶于去离子水中，然后用水透析，再将溶液冻干；PEG-g-PLL通过PEG/SA的羧酸基团与PLL的胺基团在PEG/L-赖氨酸摩尔比为1:20下缀合而产生；将PEG-SA，NHS和EDCI(1:1.25:0.125mM)溶解在DMSO中，在室温下搅拌，得反应溶液A，将PLL溶解在去离子水中(0.25g：1mL)并滴加到反应溶液A中(1:1)，并将pH调节至6.5，然后在室温下搅拌，再通过使用MW＝8-14kDa的透析袋来纯化样品，将纯化的样品冷冻干燥以备使用。
所述合成10-HCPT-SA是将SA溶解于纯CH2Cl2溶剂(1mM:1mM:300mL)中，搅拌后，加入HCPT，室温(21～25℃)N2保护下搅拌48h，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到了粗产物，将HCPT-SA、EDCI和NHS(1：1.2：1.2mM)溶于纯DMSO中，室温下搅拌后，得反应溶液B。
所述将PEG-g-PLL与10-HCPT-SA反应(0.086:0.2mM)合成PPH是将PEG-g-PLL加入反应溶液B中，在室温和N2保护下搅拌，然后将反应混合物放入MW＝8～14kDa的透析袋中，用50％DMSO溶液透析，再去去离子水透析，最后将溶液冻干，得到淡黄色疏松粉末状的PPH。
所述将PPH溶解在DMF中自组装为PPH NPs是将10mg PPH在37℃时溶解在10mL DMF中，然后用MW＝8～14kDa的透析袋在蒸馏水透析，6h内换10次透析袋，然后使用探针式声波发生器在100W下对溶液进行声波处理，并在冰水中脉冲，得自组装的PPH NPs；将自组装PPHNPs用0.45μm薄膜过滤，在4℃下储存。
将10mg PPH在37℃时溶解在8mL DMF(5:4)中，将2mg MTX溶解在2mL DMF，将溶解有PPH的DMF(8mL)加入溶解有MTX的PPH(2mL)中，自组装后得到MTX-PPH NPs，将MTX-PPHNPs用MW＝7kDa的透析袋在蒸馏水中透析6h,换透析袋10次，得到纯的MTX-PPH NPs，在4℃储存。
本发明通过连接臂将聚乙二醇(PEG)和10-羟基喜树碱(HCPT)接枝在聚-L-赖氨酸(PLL)骨架上，形成聚乙二醇聚-L-赖氨酸羟基喜树碱聚合物(PPH)。通过在不存在或存在甲氨蝶呤(MTX)的情况下进行自组装透析，分别形成PPH纳米粒子(PPH纳米粒子)和负载MTX的PPH纳米粒子(MTX-PPH纳米粒子)。用傅里叶变换红外光谱表征PPH聚合物的化学结构。光谱学(FTIR)和质子核磁共振(1H NMR)光谱学证实成功接枝HCPT。通过动态光散射(DLS)测量，PPH NPs和MTX-PPH NPs的尺寸分别为163.8nm和170.5nm，zeta电位分别为27.9mV和26.2mV。透射电子显微镜1(TEM)显示PPH NP为球形。通过UV-Vis分光光度计测量药物装载和包封效率。MTX的负载量和包封率分别为4.12％和42.92％。HCPT的负载能力为1.40％。通过MTT法检测结肠癌细胞系SW620和HCT116对PPH NPs和MTX-PPH NPs的药物细胞毒性。HCPT和MTX释放是pH依赖性的；同时，HCPT和PLL的键合仅在酸性条件下被破坏。与游离形式相比，纳米颗粒中的HCPT显着增强细胞毒性。
附图说明
图1：(A)PEG接枝聚赖氨酸羟基喜树碱(PPH)的化学合成步骤。(B)PPH与MTX-PPH合成及自组装原理图；
图2：PLL，PEG，PEG-g-PLL，HCTP和聚乙二醇化的HCPT接枝PLL(PPH)的傅里叶变换红外(FTIR)光谱；
图3：PLL,PEG,PEG-g-PLL,HCPT和聚乙二醇化的HCTP-接枝-PLL(PPH)的核磁共振谱(1HNMR)；
图4：HCPT和PPH的紫外吸收光谱；
图5：zeta电位(A)；大小分布(B)；和PPH NPs的透射电子显微镜(TEM)图像(C)；
图6：zeta电位(A)；尺寸分布(B)；和PPH NPs的透射电子显微镜(TEM)图像(C)；
图7：72小时的体外HCPT和MTX释放曲线；
图8：用不同药物组(HCPT，MTX，MTX+HCPT，PPH和MTX-PPH)处理的HCT116细胞和SW620细胞的MTT分析。
具体实施方式
甲氧基聚乙二醇(2kDa)购自Sigma-Aldrich(中国上海)；10-羟基喜树碱购自Ltd能源化学公司(中国上海)；多聚L-赖氨酸(30～70kDa)购自上海瑞恩生物科技有限公司(中国上海)；其他试剂如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和4-二甲基氨基哌啶(DMAP)购自阿拉丁试剂有限公司(中国上海)。
1、PEG-接枝-多聚-L-赖氨酸-羟基喜树碱(PPH)轭合物的合成
PEG-接枝-多聚-L-赖氨酸(PEG-g-PLL)和PPH的化学合成过程在图1A中示出，并且图1B中示出了PPH和MTX-PPH形成的示意性途径。
PEG-g-PLL的合成：PEG琥珀酸酯(PEG-SA)如(Jeong Y I,Kim D G,Jang M K,etal.Preparation and spectroscopic characterization of methoxy poly(ethyleneglycol)-grafted water-soluble chitosan[J].Carbohydrate Research,2008,343(2):282-289)所述合成。简言之，将0.15g SA(1.5mmol)和0.18g DMAP(1.5mmol)溶于15mL无水CH2Cl2中。在60℃回流加热3小时后，加入2g PEG(1.0mmol)并继续加热并搅拌24小时。将所得溶液用乙醚沉淀，然后过滤。干燥后将白色粉末溶于去离子水中，然后用水透析2天，之后将溶液冻干。PEG-g-PLL通过PEG/SA的羧酸基团与PLL的胺基团在PEG/L-赖氨酸摩尔比为1:20下缀合而产生。接着，将0.2g PEG-SA(0.096mmol)，0.014g NHS(0.12mmol)和0.022gEDCI(0.012mmol)溶解在10mL二甲基亚砜(DMSO)中，在室温下搅拌4小时。将PLL(0.25g，0.19mmol)溶解在10mL去离子水中并滴加到反应溶液中，并将pH调节至6.5。然后将混合物在室温下搅拌24小时。随后，通过使用透析袋(MW＝8-14kDa)用离子水进行透析来纯化样品。最后，将纯化的样品冷冻干燥以备使用。
PPH的合成：HCPT琥珀酸酯的合成(10-HCPT-SA)，首先将0.05gSA溶解于0.06g(0.5mmol)纯CH2Cl2溶剂中，搅拌4h后，加入0.15g HCPT(0.40mmol)，室温N2保护下搅拌48h，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到了粗产物，将所得二分之一的HCPT-SA、0.046g EDCI和0.028gNHS溶于15mL纯DMSO中，室温下搅拌4h。然后将0.18g PEG-g-PLL加入反应溶液中，在室温和N2保护下搅拌48h，然后将反应混合物放入透析袋中(MW＝8～14kDa)，用50％DMSO溶液透析，再去去离子水透析，最后将溶液冻干，得到淡黄色疏松粉末状的PPH。
2、FTIR((红外光谱),1H NMR(核磁共振氢谱)和UV(紫外光谱分析)
将PLL，PEG，PEG-g-PLL，HCPT和PPH的标准样品压制成薄膜用于FTIR扫描，范围为4000-400cm-1(NicoletTM Nexus 470-ESP，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)。将PLL溶解在D2O中，并将PEG，PEG-g-PLL，HCPT和PPH溶解在DMSO-d6中，在500MHz NMR光谱仪(BRUKER AVANCE-500，Bruker)上记录。采用紫外可见分光光度计(Shimadzu UV-2550,Kyoto,Japan)检测HCPT含量，以pH为8.5的NaOH为溶剂，制备了HCPT的标准曲线，将PPH配制成5mg/3mL溶液，测量吸收曲线，进一步计算HCPT含量。
3、PPH纳米颗粒(NPs)和MTX负载的PPH纳米颗粒(MTX-PPHNPs)的制备及表征
采用透析法制备PPH NPs，简单来说,10mgPPH在37℃时溶解在10mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后对1000mL蒸馏水透析(MW＝8～14kDa)，6h内换10次透析袋。然后，使用探针式声波发生器在100W下对溶液进行声波处理，并在冰水中脉冲2min(脉冲开2.0s，脉冲关2.0s)。
自组装PPH NPs用0.45μm薄膜过滤，在4℃下储存。MTX负载的PPH NPs方案简短描述:10mgPPH在37℃时溶解在8mLDMF中,2mgMTX溶解在2mLDMF,然后慢慢加入PPH混合。
MTX负载的PPH NPs用透析袋(MW＝7kDa)在1000mL蒸馏水中透析6h,换透析袋10次。
得到纯的MTX-PPH NPs，储存在4℃，进行实验表征与评估。
4、PPHNPs和MTX-PPH NPs的表征
动态光散射(DLS,Zetasizer 3000HS,Malvern Instruments,Malvern,UK)测定PPH NPs和MTX-PPH NPs在11.4V/cm和13.0mA时的粒径大小分布和zeta电位。将PPH NPs和MTX-PPH NPs(1.0mg/mL)溶液滴入铜网中，自然风干后经TEM(透射电镜Tecnai G2 20 S-Twin,FEI Hong Kong,Hong Kong)观察80kV加速电压下纳米粒子的形态特征。
5、负载能力(LC)和载药效率(EE)的确定
MTX在303nm处有吸收峰，药物的浓度是根据紫外-可见分光光度计(日本京都岛津UV-2550)测量的吸光度来计算的。根据下式计算MTX负载能力和载药的效率，
EE％＝(负载中药量)/(总药量)×100％
LC％＝(纳米颗粒中的药物量)/(纳米颗粒重量)×100％
6、PPH纳米粒子体外药物释放的测定
将PPH纳米粒子的溶液(5mL)置于透析袋(MW：8-12kDa)中，并于pH 7.4和pH5.6的PBS溶液中(释放介质，25mL)透析。移除释放介质(2mL)以测定在一定的时间间隔(Tn，n＝0,0.5,1,2,4,8,12,24,48和72h)中释放的HCPT和MTX的浓度，同时加入等量的PBS溶液以维持相同体积的透析缓冲液。用紫外分光光度计测量溶液中10-HCPT和MTX的浓度。根据下式计算药物释放百分比(Q％):
7、体外细胞毒性
使用两种结肠癌细胞SW620和HCT116，通过MTT试验测定响应于药物治疗的细胞活力来评估每种药物的抗癌活性。将细胞以每孔20,000个细胞接种于96孔板中，并在含有10％胎牛血清(FBS)的改良的Eagle培养基(DMEM)中于37℃，5％CO 2下培养过夜。然后，将药物加入到细胞各孔。以DMSO为溶剂制备所有的药物原液，然后加入介质进一步稀释至所需的药物浓度。DMSO浓度小于0.1％，其由用于处理对照细胞的载体组成。与药物一起孵育24小时后，除去介质并开始MTT。根据制造商的方案进行MTT测定。基于药物处理的细胞对对照细胞的吸光度计算细胞活力的百分比。将载体处理的细胞计为100％存活率。细胞活力的剂量效应曲线在单独的游离MTX，单独的游离HCPT，游离形式的MTX和HCPT的组合，PEG接枝PLL聚合物，PPH NPs以及MTX-PPH NPs的处理下进行。
8、统计分析
所有试验在体外进行至少3次，结果表示为平均值的标准偏差(SD)(阳性和阴性)。当p<0.05时，考虑有显着差异。
9、结果
1)傅里叶红外光谱和核磁共振氢谱分析
PPH的合成如图1所示。反应物、PEG-g-PLL和PPH的化学结构用1H NMR和IR光谱证实(图2和图3)。如图2所示，PEG-g-PLL的光谱仍存有L-赖氨酸残基(在1616cm-1处有氨基的N-H伸缩振动)和PEG(在1113cm-1和2885cm-1处分别有C-O和C-H伸缩振动)的特征峰。PEG-g-PLL还显示新形成的酰胺键峰在1653cm-1处(C＝O伸缩)和酯键在1734cm-1处的峰(C＝O伸缩)，表明PEG和PLL的成功结合。在PPH谱中，酰胺键和酯键的峰分别位于1649cm-1和1736cm-1处。然而，在PPH的红外光谱中，没有观察到HCPT的特征峰，这可能是因为测试样品中HCPT的含量太低。因此，使用1H NMR光谱进一步确认PPH的结构。如图3所示，HCPT(a，b，c，d和k)中质子的特征峰分别出现在PPH的光谱中。在～3.91ppm处的峰与L-赖氨酸残基的-CH-相关，在PPH中转变为～4.10ppm(e)。在3.51ppm(f；-CH2CH2O-)和3.24ppm(g；CH3-)处的峰分别为PEG中的亚甲基和甲基质子。此外，来自琥珀酰基连接体的亚甲基质子的dd峰分别在2.67和2.33ppm，表明HCPT和PEG-g-PLL的成功结合。紫外-可见光谱用于进一步确认PPH的结构。如图3所示，HCPT的特征峰完全反映在PPH(343nm和413nm)中。通过HCPT负载量(％)＝PPH中HCPT的量/PPH的量×100％计算，得到PPH中HCPT的负载量约为1.4％。
2)PPH NPs的尺寸分布，zeta电位和形态
PPH NPs的平均分布大小和多分散指数(PDI)分别为163.8nm和0.234。PPH NPs的zeta电位为27.9mV。(图5)尽管完全由PEG外部修饰，PPHNPs仍然表现出亲水性，因为多聚-L-赖氨酸形成了纳米颗粒的亲水壳，其中一些带电氨基未被PEGs覆盖。TEM图像显示PPHNPs呈球形。
3)MTX-PPH NPs的表征
MTX-PPH NPs的平均分布尺寸和多分散指数(PDI)分别为170.5nm和0.308；载药后纳米颗粒的粒径略有增加，并且分散程度降低。MTX-PPH NPs的zeta电位为26.2mV(图6)。加载药物后电位微弱下降。TEM显示MTX-PPH NPs呈球形。MTX的载荷为4.12％，包封率为42.92％。
4)体外测定PPHNPs中MTX和HCPT的释放
图7显示MTX-HCPT-NPs在pH 5.6或7.4的培养基中3天后MTX和HCPT的累积释放。结果显示HCPT和MTX释放模式均为pH敏感。在生理条件下如PH为7.4，HCPT释放几乎为零。pH5.6模拟了癌症的酸性微环境，HCPT的释放量大大增加到药物负荷的约20％。这是因为酸度促进了HCPT与MTX-HCPT-NPs主链之间的酯键断裂并释放出HCPT。MTX释放模式也对pH敏感。在低pH下释放比在生理条件下显着增加。因此，可以考虑将纳米颗粒作为药物载体靶向癌症，其中药物在酸性条件下卸载。
5)MTX-PPH NPs的细胞毒性
为了完成药物的剂量-效应曲线，设计了游离MTX(5,10,1520μg/mL)，游离HCPT(3,6,9,12μg/mL)和两种药物与添加剂剂量组合的系列浓度。用于处理SW620和HCT116细胞，用于与PPH(3,6,9,12μg/mL)和MTX-PPH(5,10,1520μg/mL)的纳米药物的剂量-效应曲线进行比较。24小时后，停止药物治疗并估计对治疗反应的细胞活力。无论是游离形式的HCTP和MTX还是联合使用都没有明显引发细胞死亡，估计SW620和HCT116的最大细胞死亡率分别约为25％和40％(图8)，这可能是由于药物不稳定性和游离形式的水溶性差。事实上，响应于组合治疗的细胞毒性的效果甚至比单独的每种药物单独治疗的效果更差。PPH和MTX-PPH的治疗显著增强细胞死亡至约60％。
本发明成功制造并表征了两种纳米颗粒，即PPH和MTX-PPH。前者采用化学合成方法将HCPT移植到PLL骨架上，然后将MTX物理封装在纳米粒子内(图1).PEG被接枝到PLL的亲水侧，以阻断PPH NPs表面的正电荷，从而使PPH NPs和MTX-PPH NPs可通过单核吞噬细胞系统(MPS)逃避吞噬作用，延长其在血液循环中的保留时间。类似的方法已成功用于合成壳聚糖纳米粒子中的姜黄素和米托蒽醌，并证明其具有抗癌作用。大小小于200nm的纳米粒子的活性显着增强。PPH NP和MTX-PPH NP均显示小于200nm的纳米粒子，外部正电荷和pH敏感性，与聚蒽醌和姜黄素壳聚糖纳米粒子的特征相似.PPH的结构已经通过FTIR，1HNMR和TEM证实。
HCPT和MTX是广谱化疗药物。典型的问题是它们非特异性地杀死正常增殖细胞并诱导免疫抑制。因此，主动或被动地将药物引导至癌症部位是减少副作用的策略之一。本发明制造的纳米粒子可以以pH依赖的方式被动地指导和排出药物到癌细胞。药物释放和MTT细胞活力的结果表明HCPT接枝的纳米颗粒可以实现该目的。与游离HCPT相比，PPH NPs显着增加HCT116癌细胞死亡30％和SW620癌细胞死亡50％(图8)。纳米粒子中的药物可用性可能由于药物溶解度的改善而显着改善。HCPT释放模式表明，在中性pH下，HCPT不能从纳米颗粒中除去，因此，除非在酸性条件下，否则不应介导药物作用(图7)。
在化疗中使用“cooktail”药物是提高癌症治疗效果的另一种策略。HCPT已经被报导，它与一些其他化疗药物联用，比方说5-FU和folinc acid，这些药物对延长晚期癌症患者有很好的效果。在当前的研究中，本发明设计了一种药物，将HCPT和MTX包封在纳米颗粒中，并把它命名为“MTX-PPH NPs”，我们在HCT116 and SW620 cells中测试了它的细胞毒性。然而，联合HCTP和MTX对SW620的药物细胞毒性没有进一步增强，对HCT116细胞的细胞毒性作用略有增加；然而，引起HCT 116显著耐药。HCPT和MTX的作用机制存在本质上的差异，虽然HCPT均具有抑制DNA合成的作用，但HCPT对DNA合成抑制作用的效力远远高于MTX，因为HCPT直接抑制DNA拓扑异构酶。对于HCT116等高度增殖的细胞，HCPT介导了更高的细胞毒性作用，并引发了更大的药物毒性作用。因此，优化肿瘤治疗药物的剂量至关重要。
10、结论
本发明成功制备了HCPT和MTX-HCPT纳米颗粒，其抗癌活性明显增强，这可能是由于在酸性条件下水溶性和药物释放能力的提高。SW620和HCT116结肠癌细胞对HCPT治疗均敏感。然而，只有HCT116细胞介导了耐药性。HCPT与MTX联合用药并没有进一步提高疗效。本研究提供了HCPT纳米颗粒生物利用度用于结肠癌治疗的方法，同时也表明MTX与HCPT联合并不能进一步提高药物疗效。
Claims (7)
1.一种不含甲氨蝶呤和含甲氨蝶呤的聚乙二醇化聚L-赖氨酸-羟基喜树碱纳米粒的制备方法，其特征在于，所述方法是将PEG和HCPT接枝在PLL骨架上，形成PPH；将PPH在不存在或存在MTX的情况下进行自组装透析，分别形成PPH NPs和MTX-PPHNPs；所述PEG为聚乙二醇，所述HCPT为10-羟基喜树碱，所述PLL为聚-L-赖氨酸，所述PPH为聚乙二醇聚-L-赖氨酸羟基喜树碱聚合物，所述MTX为甲氨蝶呤，所述PPH NPs为PPH纳米颗粒；所述MTX-PPH NPs为负载MTX的PPH纳米颗粒；
所述PPH的结构式为
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
(1)合成PEG-g-PLL；
(2)合成10-HCPT-SA；
(3)将PEG-g-PLL与10-HCPT-SA反应合成PPH；
(4)将PPH溶解在DMF中自组装为PPH NPs；或者，将PPH溶解在DMF中，将MTX溶解在DMF中，将溶解有PPH的DMF加入溶解有MTX的DMF中，自组装后得到MTX-PPH NPs；其中SA为琥珀酸酐。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述合成PEG-g-PLL是将SA和DMAP溶于无水CH2Cl2中，SA、DMAP、无水CH2Cl2的比为1mM:1mM:10mL，在60℃回流加热后，加入PEG并继续加热并搅拌，得溶液；将溶液用乙醚沉淀，然后过滤，干燥后将白色粉末溶于去离子水中，然后用水透析，再将溶液冻干；PEG-g-PLL通过PEG-SA的羧酸基团与PLL的胺基团在PEG/L-赖氨酸摩尔比为1:20下缀合而产生；
将PEG-SA，NHS和EDCI溶解在DMSO中，PEG-SA、NHS、EDCI的比为1mM:1.25mM:0.125mM，在室温下搅拌，得反应溶液A，将PLL溶解在去离子水中，PLL、去离子水的比为0.25g:1mL，并滴加到反应溶液A中,按照1mL:1mL的比例，并将pH调节至6.5，然后在室温下搅拌，再通过使用MW＝8-14kDa的透析袋来纯化样品，将纯化的样品冷冻干燥以备使用。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述合成10-HCPT-SA是将SA和DMAP溶解于纯CH2Cl2溶剂中，SA、DMAP、纯CH2Cl2溶剂的比为1mM:1mM:300mL，搅拌后，加入HCPT，按照0.4mM:0.5mM的比例，室温21～25℃N2保护下搅拌48h，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到了粗产物，将HCPT-SA、EDCI和NHS,按照1mM：1.2mM：1.2mM的比例,溶于纯DMSO中，室温下搅拌后，得反应溶液B。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述将比值为0.086mM:0.2mM的PEG-g-PLL与10-HCPT-SA反应合成PPH是将PEG-g-PLL加入反应溶液B中，在室温和N2保护下搅拌，然后将反应混合物放入MW＝8～14kDa的透析袋中，用50％DMSO溶液透析，再用去离子水透析，最后将溶液冻干，得到淡黄色疏松粉末状的PPH。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述将PPH溶解在DMF中自组装为PPH NPs是将10mg PPH在37℃时溶解在10mLDMF中，按照1mg:1mL的比例，然后用MW＝8～14kDa的透析袋在蒸馏水透析，6h内换10次透析袋，然后使用探针式声波发生器在100W下对溶液进行声波处理，并在冰水中脉冲，得自组装的PPHNPs；将自组装PPHNPs用0.45μm薄膜过滤，在4℃下储存。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将10mg PPH在37℃时溶解在8mLDMF中，按照比例为5mL:4mL，将2mgMTX溶解在2mLDMF，将上述溶解有PPH的DMF加入溶解有MTX的DMF中，按照4:1的比例，自组装后得到MTX-PPH NPs，将MTX-PPH NPs用MW＝7kDa的透析袋在蒸馏水中透析6h,换透析袋10次，得到纯的MTX-PPH NPs，在4℃储存。
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