CN103127522A - 一种脂肪酸-姜黄素衍生物的缀合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种结构如式（I）所示的脂肪酸-姜黄素衍生物的缀合物及其应用。本发明姜黄素脂肪酸缀合物可极大提高姜黄素稳定性，而且该缀合物极易与载体mPEG₂₀₀₀-PLGA疏水部分形成致密的疏水核，形成稳定的粒径在100nm左右的纳米粒，且载药量高，并具有良好的肝脏靶向性，可极大提高姜黄素在肝脏组织中的药效浓度。本发明姜黄素脂肪酸缀合物纳米粒可用于肿瘤，尤其是肝癌疾病的治疗。

Description

一种脂肪酸-姜黄素衍生物的缀合物及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一种脂肪酸-姜黄素衍生物的缀合物及其应用。

（二）背景技术

根据世界卫生组织公布的数据，肝癌发病率位居恶性肿瘤发病率的第5位，死亡率位居第3位，而其中55%的病例发生在我国。传统的化学药物如烷化剂和抗代谢药，虽然在抑制和杀伤癌细胞方面取得了良好疗效，然而却由于其毒副作用、不良反应及癌症复发等因素并没有根本性解决癌症问题。不过，近年由于癌症相关基因的发现及相关靶分子的阐明，使得癌症治疗逐渐走向联合化疗、靶向性治疗及个体化治疗等方式。其中，靶向性药物治疗表现尤为突出。

姜黄素（curcumin）是从姜科植物Curcuma longa L.中提取的一种多羟基化合物，大量研究表明，姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基、抗微生物以及对心血管系统、消化系统等多方面药理作用，且几乎没有明显毒副作用（Cheng AL,Hsu CH,Lin JK,et al.Phase I clinical trial ofcurcumin,a chemopreventive agent,in patients with high-risk orpre-malignant lesions[J].Anticancer Res.2001,21(4B):2895-900.）。近年来，姜黄素越来越受到国内外学者的重视，在癌症预防、癌症治疗、抗肿瘤细胞转移及阿耳茨海默(氏)病等神经病变方面研究尤关注，并且在欧美等国家已经开展多项相关临床研究。

姜黄素制剂方面国内外学者已进行了不少探讨，几乎涵盖了绝大部分制剂类型，如脂质体、固体分散剂、环糊精复合物、壳聚糖复合物、生物可降解微球及微乳、微胶束等（如参见中国专利申请第200510042547.9号、第200610027827.7号、第CN200610026576.0号）。但由于姜黄素水溶性及生物利用度固有属性，其口服制剂提高生物利用度很有限；脂质体类载药量、包封率和稳定性等一直是个问题；姜黄素纳米粒总体载药量不高，而且姜黄素水中稳定性极差，同样也致使一般纳米粒的稳定性不好；而更为重要的是，大部分姜黄素制剂体内靶组织器官姜黄素仍然未能达到药效浓度，因此，至今没有一个姜黄素新药走上市场。

（三）发明内容

为了克服姜黄素生物利用度低，稳定性差，制剂的包封率低、靶组织器官难以达到药效浓度等不足，本发明提供了具有较好稳定性的脂肪酸-姜黄素衍生物的缀合物及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种脂肪酸-姜黄素衍生物的缀合物，结构如式（I）所示：

式（I）中：

R₁和R₂彼此独立为下列之一：硝基、氨基、C1~C4烷氧基或二低级烷基（C1~C4烷基）氨基；

R₃和R₄彼此独立为下列之一：氢、卤素或硝基；

R₅为C12~C22脂肪链，包括饱和、不饱和或多不饱和的脂肪链。

本发明中，“缀合”指的是小分子（姜黄素）和脂肪酸任选通过酯键共价连接，“缀合物”就是这种共价连接的产物。本发明缀合物为姜黄素衍生物（II）和脂肪酸（III）经酯化反应制得，脂肪酸共价连接在姜黄素衍生物的酚羟基上。其中，脂肪酸优选为天然脂肪酸中的不饱和脂肪酸，更优选为多不饱和脂肪酸。

具体的，本发明缀合物由如下步骤制得：

（1）将式（II）和式（III）所示化合物通过一步酯化得到式（I）所示的姜黄素衍生物缀合物；酯化反应的溶剂选自无水的N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、氯仿和二氯甲烷中的一种或多种，优选为干燥的二氯甲烷；脂肪酸和姜黄素衍生物的投料摩尔比大于2.5：1，优选为3:1。

（2）上述（1）反应混合物经过滤，层析纯化得到式（I）姜黄素衍生物缀合物；层析纯化可以采用硅胶柱也可以是凝胶柱，优选为sephadexLH20凝胶过滤层析方法分离纯化。

本发明缀合物也可以其药学上可接受的盐形式给药，“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的盐，基本上不改缀合物的活性。能与本发明的缀合物成盐的酸有盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、琥珀酸、马来酸、柠檬酸等；能与本发明的缀合物成盐的碱有碱金属或碱土金属的氢氧化物、铵等。

申请人发现，利用脂肪酸将姜黄素酯化后形成的姜黄素脂肪酸缀合物，此方法可极大提高姜黄素稳定性。此外，天然的脂肪酸如二十二碳六烯酸（DHA）是人体必需的多不饱和脂肪酸，本身也具有一定的抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用（Serini S,Fasano E,Piccioni E,Cittadini AR,CalvielloG.Differential anti-cancer effects of purified EPA and DHA and possiblemechanisms involved.Curr Med Chem.2011;18(26):4065-4075.）。而肝脏是脂类代谢的中枢，在脂类的消化、吸收、分解、合成和运输中均起着核心作用，其对脂质的摄取具有较高的选择性，使得脂质在肝脏中堆积，因此，脂肪酸化的药物对肝脏有一定的靶向作用（Matthews B，Nigel W.TumorTargeting by Covalent Conjugation of a Natural Fatty Acid to Paclitaxel.CLIN CANCER R,2001,7:3229-3238.）；而有关载体方面，已有大量研究报道表明，以mPEG2000-PLGA（聚乙二醇-聚乳酸丙烯酸聚合物）为载体制备的纳米粒本身也具有明显的肝脏靶向性（JC Olivier.Drug Transport toBrain with Targeted Nanoparticles[J].NeuroRx,2005,2(1):108-119.）。本发明用mPEG₂₀₀₀-PLGA作为载体，使姜黄素脂肪酸缀合物极易与载体mPEG₂₀₀₀-PLGA疏水部分形成致密的疏水核，形成稳定的粒径在100nm左右的纳米粒，且载药量高，并具有良好的肝脏靶向性，可极大提高姜黄素在肝脏组织中的药效浓度。

优选的，R₁和R₂为C1~C4烷氧基，R₃和R₄为氢，R₅为C18~C22多不饱和脂肪链。

更为优选的，R₁和R₂为甲氧基，R₃和R₄为氢，R₅为ω-3多不饱和脂肪酸链。

本发明的缀合物可用于姜黄素衍生物所能治疗的病况中，如用于抗炎、抗氧化、抗诱变、抗衰老、抗HIV病毒、降血脂、抗动脉粥样硬化、药物增敏、或抗肿瘤等，尤其可用于抗肿瘤。因此，本发明还涉及所述的缀合物在制备抗肿瘤药物中的应用。根据剂型，本发明缀合物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，例如口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药，优选为胃肠道外给药，如静脉注射。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由医师根据实际情况（如，病人的病情、体重等）而方便地确定。对于一般的成人，给药剂量以式（I）所示的缀合物计，可以是每kg成人体重1ng~10g，优选是每kg体重100μg~100mg，最优选的是每kg体重5mg~20mg。

优选的，所述药物制成纳米制剂，所述纳米制剂由如下方法制得：将式（I）缀合物与适量载体mPEG_n-PLGA微粒溶于有机溶剂中得到有机相，将有机相注入到含有辅料的水相中，得到的混合液减压除去有机相，过0.22μm滤膜，得到含有纳米粒的混悬液，所述混悬液进一步制成注射剂或其他剂型；所述有机溶剂为丙酮或四氢呋喃，优选为四氢呋喃；所述辅料为聚乙二醇、吐温或泊洛沙姆，，优选为聚乙二醇和泊洛沙姆，更优选为泊洛沙姆。缀合物与载体及辅料的用量比例取决于所要制备的药物对负载量和含药量的要求，本领域普通技术人员可根据需要进行调整。其中mPEG分子量为1~20KDa，优选为2~5KDa，更优选为2KDa；mPEG_n-PLGA分子量为20~100KDa，优选为50KDa，其中PLGA为乳酸和羟基乙酸随机聚合而成的聚合物，乳酸和羟基乙酸可以是任何比例。

优选的，所述mPEG_n-PLGA为mPEG₂₀₀₀-PLGA，分子量为50KDa，PLGA为乳酸和羟基乙酸摩尔比50:50的聚合物。

具体的，本发明缀合物及其纳米制剂制备过程如下：

1、Cur-FA₂的合成

姜黄素（Cur）两端酚羟基能在催化剂的作用下与脂肪酸（FA）发生双酯化反应，生成Cur-FA₂。称取一定量的已除水的FA，用干燥的CH₂Cl₂溶解，向里面加入事先用干燥CH₂Cl₂溶解好的DCC和DMAP，并润洗，冰浴条件下搅拌反应30min后，加入已经称量好的姜黄素（Cur），避光条件下冰浴搅拌一段时间后，转入室温（25℃左右）反应过夜。产物在-20℃析晶，过滤。滤液减压浓缩至干。加乙醚析晶，过滤。滤液减压挥干得产物。所得产物经sephadex LH20凝胶柱分离纯化，得到高纯度Cur-FA₂。

2、Cur-FA₂复合物纳米粒的制备

溶剂挥发法制备纳米粒：取上述产物Cur-FA₂一定量，加入适量载体mPEG₂₀₀₀-PLGA，用适量四氢呋喃或丙酮完全溶解，然后在磁力搅拌器搅拌下，用注射器缓慢滴加到装有一定量泊洛沙姆的双蒸水的圆底烧瓶中，滴加完毕后于适当温度减压除尽四氢呋喃或丙酮，过0.22μm滤膜，得纳米粒混悬液。

本发明的有益效果主要体现在：本发明姜黄素脂肪酸缀合物可极大提高姜黄素稳定性，而且该缀合物极易与载体mPEG₂₀₀₀-PLGA疏水部分形成致密的疏水核，形成稳定的粒径在100nm左右的纳米粒，且载药量高，并具有良好的肝脏靶向性，可极大提高姜黄素在肝脏组织中的药效浓度。

（四）附图说明

图1为Cur-DHA₂产物薄层色谱鉴定结果；其中1和8为DHA；2和5为姜黄素；3和6为副产物Cur-DHA；4和7为产物Cur-DHA₂；其中1~4为磷钼酸乙醇105℃显色5min拍照；5~8为未显色的样品拍照记录；

图2为Cur-EPA₂产物薄层色谱鉴定结果；其中1和6为Cur-EPA₂，2和5为Cur-EPA，3和4为Cur；1~3为紫外光照射下拍照，4~6为可见光下拍照；

图3为Cur-EPA₂纳米粒与Cur纳米粒体外释放率比较；

图4为正常小鼠体内组织中Cur-DHA₂相对分布率；

图5为正常小鼠体内组织中Cur相对分布率。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：Cur-DHA₂的合成与鉴定及纳米粒制备

1、Cur-DHA₂的合成

DHA（二十二碳六烯酸）中加入适量的甲苯，共沸除水后，称取DHA802.53mg（2.443mmol），加入事先干燥CH₂Cl₂溶解好的DCC（505.05mg，2.443mmol）和DMAP（4-二甲氨基吡啶）（355.78mg，2.443mmol），并用干燥CH₂Cl₂润洗。冰浴条件下搅拌反应30min后，加入已经称量好的姜黄素（Cur）300mg（0.8144mmol），并加入干燥CH₂Cl₂润洗，避光条件下冰浴搅拌一段时间后，转入室温（25℃左右）反应过夜。产物在-20℃析晶，过滤。滤液减压浓缩至干。加乙醚析晶，过滤。滤液减压挥干得产物。所得产物经sephadex LH20凝胶柱分离纯化，得到高纯度Cur-DHA₂。2、薄层色谱鉴定

取各样品适量，用氯仿溶解，毛细管点样于GF254薄层板（青岛海洋化工分厂，厚度0.20-0.25mm，活度：三色分开），以CHCl₃：CH₃OH=8：0.1展开；除去展开剂后磷钼酸乙醇液105℃显色5min，拍照记录，结果如图1所示，为预期产物，且纯度较高。

3、Cur-DHA₂纳米粒的制备

精密称取上述Cur-DHA₂2mg，载体mPEG₂₀₀₀-PLGA（济南岱罡生物工程有限公司）5mg，溶于5ml四氢呋喃中，作为有机相；称取20mg的泊洛沙姆188溶于10ml的双蒸水中，配制成水相，在700rpm的转速搅拌下将有机相溶液用注射器注入到水相中。得到的溶液在30℃减压蒸干四氢呋喃，过0.22μm滤膜，即得到纳米粒混悬液，粒径92nm。其中，药物的含量为20%，载体的含量为50%，泊洛沙188的含量为0.2%，药物载体质量比为2:5，有机相水相体积比为1:2。

实施例2：Cur-EPA₂的合成与鉴定及纳米粒制备

1、Cur-EPA₂的合成

EPA（二十碳五烯酸）中加入适量的甲苯，共沸除水后，称取EPA1.478g（4.886mmol），加入事先干燥CH₂Cl₂溶解好的DCC（N,N-二环已基碳二亚胺）（1.01g，4.886mmol）和DMAP（711.56mg，4.886mmol），并用干燥CH₂Cl₂润洗。冰浴条件下搅拌反应30min后，加入已经称量好的姜黄素（Cur）0.6g（1.6288mmol），并加入干燥CH₂Cl₂润洗，避光条件下冰浴搅拌一段时间后，转入室温（25℃左右）反应过夜。产物在-20℃析晶，过滤。滤液减压浓缩至干。加乙醚析晶，过滤。滤液减压挥干得产物。所得产物经sephadex LH20凝胶柱分离纯化，得到高纯度Cur-EPA₂。2、产物薄层色谱鉴定

将适量EPA、Cur和上述纯化产物（Cur-EPA₂）用氯仿溶解，毛细管点样硅胶GF254荧光板（青岛海洋化工分厂，厚度0.20~0.25mm，活度：三色分开），以CHCl₃：CH₃OH=8：0.1展开；展开完毕后用吹风机除去氯仿，紫外灯下及可见光下拍照记录，结果见图2。从图2结果可以看出，斑点单一，为预期产物，且纯度较高。

3、Cur-EPA₂纳米粒的制备

精密称取上述Cur-EPA₂10mg，载体mPEG₂₀₀₀-PLGA25mg，溶于50ml丙酮中，作为有机相；称取200mg的泊洛沙姆188溶于100ml的双蒸水中，配制成水相，在700rpm的转速搅拌下将有机相溶液用注射器注入到水相中。得到的溶液在30℃减压蒸干丙酮，过0.22μm滤膜，即得到纳米粒混悬液，粒径103nm。其中，药物的含量为20%，载体的含量为50%，泊洛沙188的含量为0.2％，药物载体质量比为2:5，有机相水相体积比为1:2。

实施例3：纳米粒体外释放试验

分别取Cur-DHA₂、Cur-EPA₂和Cur纳米粒（制备方法同上）适量，用已灭菌的10ml PBS溶液稀释，放入已灭菌的试管中，置于37℃摇床上振荡，转速100r/min。于不同时间点取出500μl，20000r/min，离心40min，取上清液，测姜黄素的含量，结果见图3。另补加500μlPBS溶液到试管中。

如图3所示，Cur纳米粒在4小时内有90%释放，5天内几乎全部释放；而Cur-EPA₂纳米粒要25天左右释放度才能够达到92.5%；由此可见，Cur-EPA₂纳米粒可以极大地提高姜黄素的稳定性，且延长释放时间。

实施例4：纳米粒体外抗肿瘤试验

将以上实施例制备的姜黄素缀合物纳米粒加入到96孔板的孔中，处理48h，其中每个孔分别含有相应的人源HepG2肿瘤细胞株，其细胞密度为1.0×10⁴个/孔。检测不同纳米粒的姜黄素缀合物对HepG2的抑制率，得出半抑制浓度（IC₅₀）。结果如表1所示，本发明的姜黄素缀合物纳米粒对人源肝癌细胞株HepG2肿瘤细胞具有明显的抗肿瘤活性。

表1：姜黄素缀合物纳米粒对人源肿瘤HepG2细胞的抑制作用

纳米粒	IC50（μM）
		Cur-DHA2	85.44±2.47
Cur-EPA2	101.61±1.84
		Cur	52.18±3.17

实施例5：Cur-DHA₂纳米粒体内组织分布试验

取纳米粒适量，用生理盐水溶解。另外取雄性昆明种小鼠24只，体重18~22g，平均分成8组，每组3只小鼠；每只小鼠按25mg/kg给药，尾静脉注射，分别于注射后3min、15min、45min、120min、4h、6h、8h、12h取一组小鼠，摘眼球取血，4000r/min离心5min，取血浆，-20℃保存备用，然后将小鼠颈椎脱臼处死，解剖取肝、心、脾、肺、肾和脑，分别称重记录，-20℃保存备用。

取200μl血浆放入EP管中，加入400μl（氯仿：甲醇=3:7）的混合溶液萃取药物，超声1min，混合均匀，10000r/min，离心5min，取出上清，将沉淀再加入上述混合溶剂400μl洗涤，超声1min，10000r/min，离心5min，合并上清液，减压旋转蒸干，取200μl（THF：甲醇=1∶1）溶解，12000r/min，离心5min，取上清液，用HLPC法测含量。各个组织器官加2ml PBS7.4缓冲溶液，按上述处理方法提取药物，测含量，结果见图4、图5。

由图4:Cur-DHA₂相对分布图可以看出，肝脏中Cur-DHA₂从0.05h到12h内分布率都大于其他各个脏器，说明Cur-DHA₂主要在肝脏中分布较多。由图5可见，姜黄素只在肝、脾、肾中检测到一定的含量，而在血浆、肺、肾中均未检测到，说明肝、脾、肾是Cur-DHA₂代谢的主要器官。实施例6：Cur-DHA₂纳米粒体内抗肿瘤作用研究

（1）H22荷瘤模型（肝癌模型）建立：取小鼠H22细胞株（ATCC）腹腔内接种八天的种鼠，无菌条件下用5mL注射器抽吸出1～2mL牛奶状、较粘稠的腹水，先用0.4%苔盼蓝染色，计活细胞率>90％，再用白细胞稀释液计数瘤细胞数，然后以灭菌D-Hanks液稀释调整肿瘤细胞浓度为1.0×10⁷个/mL，小鼠右前肢腋窝皮下接种0.1mL/只，共接种50只。

（2）分组给药：上述小鼠造模24h后随机平均分为以下五组：A组（空白组，每天尾静脉注射空白纳米粒0.2mL）、B组（纳米粒低剂量组，每天尾静脉注射0.2mL，相当给予姜黄素0.1mg/只）、C组（纳米粒中剂量，每天尾静脉注射0.2mL，相当给予姜黄素0.3mg/只）和D组（纳米粒高剂量，每天尾静脉注射0.2mL，相当给予姜黄素0.6mg/只），E组（环磷酰胺组，腹腔注射0.2mlCTX），连续给药14天。

于最后一次给药后一天，颈椎脱臼法处死小鼠，解剖称取瘤重，计算肿瘤抑制率。

结果如表2所示，Cur-DHA₂纳米粒对患有肝癌小鼠的肿瘤生长具有良好的抑制作用。

表2：Cur-DHA₂纳米粒对肝癌小鼠肿瘤抑制作用

Claims (6)

1.一种脂肪酸-姜黄素衍生物的缀合物，结构如式（I）所示：

式（I）中：

R₁和R₂彼此独立为下列之一：硝基、氨基、C1~C4烷氧基或二低级烷基氨基；

R₃和R₄彼此独立为下列之一：氢、卤素或硝基；

R₅为C12~C22脂肪链。

2.如权利要求1所述的脂肪酸-姜黄素衍生物的缀合物，其特征在于：R₁和R₂为C1~C4烷氧基，R₃和R₄为氢，R₅为C18~C22多不饱和脂肪链。

3.如权利要求1所述的脂肪酸-姜黄素衍生物的缀合物，其特征在于：R₁和R₂为甲氧基，R₃和R₄为氢，R₅为ω-3多不饱和脂肪酸链。

4.权利要求1所述的缀合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述药物制成纳米制剂，所述纳米制剂由如下方法制得：将式（I）缀合物与适量载体mPEG_n-PLGA微粒溶于有机溶剂中得到有机相，其中m表示单甲氧基，n表示PEG分子量，将有机相注入到含有辅料的水相中，得到的混合液减压除去有机相，过0.22μm滤膜，得到含有纳米粒的混悬液；所述有机溶剂为丙酮或四氢呋喃；所述辅料为聚乙二醇、吐温或泊洛沙姆。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述mPEG_n-PLGA为mPEG₂₀₀₀-PLGA，分子量为50KDa，PLGA为乳酸和羟基乙酸摩尔比50:50的聚合物。

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