KR102505008B1 - 글루타치온 또는 활성산소에 응답성을 가지는 나노광역동 치료제 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 본 발명은 여드름, 항암 치료, 항염증 치료, 바이러스나 박테리아 등에 의한 감염증 치료 등을 위한 광역동 치료제에 관한 것으로, 광증감제, 고분자, 및 일단이 상기 광증감제와 결합되고, 타단이 상기 고분자와 결합된 링커를 포함하는 공중합체를 포함하는 나노광역동 치료제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 글루타치온 또는 활성산소가 있는 조건에서 선택적으로 약물을 방출할 수 있고, 암조직에 대한 약물전달이 선택적 조건에서 이루어지도록 하여, 인체 조직내에서 보다 활용도가 높은 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 본 발명은 여드름, 항암 치료, 항염증 치료, 바이러스나 박테리아 등에 의한 감염증 치료 등을 위한 광역동 치료제에 관한 것으로, 광증감제, 고분자, 및 일단이 상기 광증감제와 결합되고, 타단이 상기 고분자와 결합된 링커를 포함하는 공중합체를 포함하는 나노광역동 치료제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 글루타치온 또는 활성산소가 있는 조건에서 선택적으로 약물을 방출할 수 있고, 암조직에 대한 약물전달이 선택적 조건에서 이루어지도록 하여, 인체 조직내에서 보다 활용도가 높은 것을 특징으로 한다.
광역동 치료 (photodynamic therapy, PDT)는 광역동 치료제(photosensitizer)를 사용하여 특정 파장에서 빛을 조사하여 질병 부위만을 선택적으로 치료함으로써, 기존의 암 치료법인 수술, 방사선요법, 약물요법의 부작용 및 암치료 이후의 후유증 문제를 해결할 수 있는 대체치료법으로 주목받고 있다.
광역동 치료제는 빛을 조사하지 않으면 높은 농도에서도 세포 독성을 거의 나타내지 않고, 오직 특정 파장의 빛에 의해 활성화되어 활성 산소종인 일항산소, 산소라디칼, 수퍼옥사이드, 폐록사이드 등을 생성하여 세포의 사멸을 유도함으로써, 빛을 조사한 부위에서만 질병을 치료할 수 있는 효과를 가진다. 활성산소는 세포내 구성성분들인 불포화 지방산, 단백질, guanine 등과 화학적으로 반응하고 그 구조에 손상을 입혀 암세포와 같은 질병 세포가 세포자연사(apoptosis)나 세포괴사(necrosis)를 보이는데, 활성산소가 증가할수록 손상의 정도도 커지고 세포자연사 또는 세포 괴사에 의해 더 많은 세포가 죽게되며, 결과적으로 질병을 치료할 수 있는 기술이다. 광역동 치료제를 정맥 주사하고 난 후, 일정 시간이 지나면 질병 부위인 암조직에 광역동 치료제가 선택적으로 축적되고, 특정 파장의 빛을 조사한 부위에서만 활성산소가 발생하여 암세포를 선택적으로 사멸하게되고, 빛을 조사하지 않은 정상 조직은 아무런 영향을 받지 않는다.
전통적인 항암제의 경우 암세포와 더불어 정상세포에도 전달이 되므로 심각한 부작용을 보이는 반면, 광역동 치료에 사용되는 광역동 치료제는 암에 선택적으로 축적되고 빛을 조사한 암 부위에서만 독성을 나타내므로, 전통 항암제 치료시 보이는 탈모현상, 면역기능 저하, 구토 등의 심각한 부작용을 보이지 않는다. 또한 광역동 치료 시술시 극히 적은 통증만 수반되고 부작용이 거의 없기 때문에 반복적인 치료가 가능하고, 말기암 환자에게도 반복치료를 통해 최소한의 고통으로 생명을 연장시킴으로써, 환자의 생활의 질을 향상시킬 수 있는 장점이 있다. 또한 광역동 치료는 수술이 불가능한 환자의 대체 치료에도 효과적인 치료법으로 각광받고 있다. 구강암 (gingival cancer), 폐암 (lung cancer), 담관암 (cholangiocarcinoma), 대장암 (Colon cancer) 등에서 수술을 할 수 없는 암환자나, 체력이 허약하여 수술이나 항암제 치료가 불가한 노약자, 또는 수술을 거부하는 환자의 경우에도 수술을 대체하여 광역동 치료를 수행할 수 있다.
광역동 치료에 사용되는 광역동 치료제는 제1세대, 제2세대, 제3세대로 분류될 수 있으며, 이 중 제 2세대 광역동 치료제중의 하나인 프로토포르피린 IX나 클로린 e6는, 이온화될 수 있는 카복실그룹이 두 개 또는 세 개를 가진 비대칭 분자이며, 프로토포르피린 IX나 클로린 e6는 소수성 특징을 가지고 있어서, pH 조건에 따라 다른 이온성 형태로 존재하게 되며, 광역동 치료 효과도 달라지게 된다. 프로토포르피린 IX나 클로린 e6는 1 세대 광역동 치료제와 비교하여 짧은 종양 축적 시간, 더 빠른 배출, 그리고 높은 활성산소 생성 효율을 나타낸다. 게다가 프로토포르피린 IX나 클로린 e6는 각각 근적외선인 630 nm, 664 nm 파장에 의해 활성화되므로 피부 또는 점막조직 깊이 빛을 조사할 수 있으므로, 보다 더 효과적인 작용을 가능하게 한다. 광역동 치료제는 이미 임상에서 좋은 결과를 보여 왔으므로 최근들어 더욱 관심의 대상이 되었다. 그러나 광역동 치료제의 이러한 장점에도 불구하고 프로토포르피린 IX나 클로린 e6는 강한 음이온성을 띠고 있으므로, 암세포내로의 이입이 상대적으로 낮고 질병 세포내에서 머무르는 시간도 짧은 편이어서, 결과적으로 질병 세포인 암세포에 대한 선택성이 낮기 때문에 정맥주사 또는 경구 투여시 전신으로 고르게 분포하여, 상대적으로 특정 장기 또는 특정 암세포에 대한 선택성이 낮은 편이며, 비록 암세포보다는 농도가 낮더라도 정상세포에도 분포하므로 약 한달 정도 빛으로부터 차단된 생활을 해야 하는 등의 불편이 따르게 된다.
프로토포르피린 IX나 클로린 e6는 광역동 치료 효과는 뛰어나지만 음이온성 성질 때문에 세포 혹은 조직 내로의 흡수가 방해되는 단점이 있고, 전신으로 고르게 퍼지기 때문에 암세포 또는 종양조직 내로의 선택적인 흡수를 증가시키기 위해 이러한 광역동 치료제를 개질하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로서, 글루타치온 또는 활성산소가 있는 조건에서 선택적으로 약물을 방출할 수 있고, 암조직에 대한 약물전달이 선택적 조건에서 이루어지도록 하여, 인체 조직내에서 보다 활용도가 높은 나노광역동 치료제를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
본 발명에 따른 나노광역동 치료제는 광증감제(A), 고분자(B), 및 일단이 상기 광증감제와 결합되고, 타단이 상기 고분자와 결합된 링커(L)를 포함하는 공중합체를 포함하고, 상기 공중합체는 
(여기서, n은 1 내지 1,000의 범위에 속하는 수)의 결합 관계를 갖는 것일 수 있다.
상기 광증감제는 하기 화학식 1 내지 화학식 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
상기 고분자는 히아루론산 (Hyaluronic acid), 덱스트란 (dextran), 카르복시 메칠 덱스트란 (Carboxymethyl dextran), 풀루란(Pullulan), 셀룰로오스 (cellulose), 카르복시메칠 셀룰로오스 (carboxymethyl cellulose), 콘드로이친 술페이트 (chondrotin sulfate), 키토산 (chitosan), 스클레로글루칸 (scleroglucan), 이눌린 (Inulin) 셀룰로오스 (cellulose), 아밀로오스 (Amylose), 녹말 (Starch), 만난(Mannan), 커들란(Curdlan), 쉬조필란(schizophyllan), 베타글루칸(beta-glucan), 후코이단 (Fucoidan), 폴리비닐알코올(poly(vinyl alcohol), PVA), 젤라틴 (gelatin) 폴리에틸렌옥시드 (poly(ehtylene oxide), PEO), 폴리비닐피롤리돈 (poly(vinylpirrolidone), PVP), 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG), 폴리락티드(Poly(lactide), PLA), 폴리클로코라이드(Poly(glycolide), PGA), 폴리락티드-코-클리코라이드(Poly(lactideco-glycolide), PLGA), 콜라겐 (Collagen), 폴리카프롤락톤 (poly(ε-caprolactone), PCL) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 링커는 시스타민 (cystamine), 셀레노시스타민 (selenocystamine), 디셀레노시스타민(diselenocystamine), 디셀레노디프로피오닉엑시드 (diselenodipropionic acid), 디티오디프로피오닉엑시드 (Dithiodipropionic acid), 티오디프로피오닉엑시드 (Thiodipropionic acid), 디티오글리콜릭엑시드 (Dithiodiglycolic acid), 디티오디부티릭엑시드 (Dithiodibutyric acid), 비스아크릴로일 시스타민 (Bis(acryloyl)cystamine) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 링커는 황이중구조 또는 셀레늄 이중구조를 가질 수 있다.
상기 공중합체는 하기 화학식 7로 표현되는 화합물을 포함할 수 있다.
[화학식 7]
(여기서, m, n은 1 내지 1,000의 범위에 속하는 수)
상기 공중합체는 하기 화학식 8로 표현되는 화합물을 포함할 수 있다.
[화학식 8]
(여기서, m, n은 1 내지 1,000의 범위에 속하는 수이고, R1은 하이드로원소 또는 아미노메틸페닐보로닉 산 피나콜 에스터 (4-(aminomethyl)phenyl boronic acid pinacol ester(PBAP)이다.)
상기 공중합체는 입자 크기가 50nm 내지 500nm일 수 있다.
상기 공중합체는 이중블록 또는 삼중블록 공중합체일 수 있다.
본 발명에 따른 나노광역동 치료제의 제조방법은 (1) 고분자, 링커 및 광증감제를 준비하는 단계; (2) 상기 고분자와 링커를 결합하는 단계; (3) 상기 (2)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계; (4) 상기 (3)의 결과물의 광증감제에 링커를 결합하는 단계; (5) 상기 (4)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계; 및 (6) 상기 (4) 내지 (5) 단계를 반복하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (1) 고분자, 링커 및 광증감제를 준비하는 단계는 상기 고분자를 용매 100중량부 기준으로 0.01 중량부 내지 30 중량부가 되도록 준비하는 단계; 상기 링커를 용매 100중량부 기준으로 0.01 중량부 내지 30 중량부로 상기 용매에 용해하는 단계; 상기 광증감제를 용매 100중량부 기준으로 0.01 중량부 내지 30 중량부가 되도록 준비하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (3) 상기 (2)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계는 상기 (2)의 결과물의 링커의 말단 아민기에 상기 광증감제를 공유결합 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 (4) 상기 (3)의 결과물의 광증감제에 링커를 결합하는 단계는 상기 (3)의 결과물의 광증감제의 말단 카르복실기에 상기 링커를 공유결합 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 (5) 상기 (4)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계는 상기 (4)의 결과물의 링커의 말단 아민기에 상기 광증감제를 공유결합 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 (6) 상기 (4) 내지 (5) 단계를 반복하는 단계는 바람직하게는 2회 내지 10회 반복할 수 있다.
본 발명에 따르면, 종양조직 또는 암세포의 글루타치온 (Glutathione, GSH) 또는 활성산소종(reactive oxygen species)에 특이적으로 반응하여 황이중구조 또는 셀레늄이중구조의 결합이 분해되면서 광증감제가 방출되어 광역동 치료를 할 수 있는 나노입자의 제작에 관한 것이며, 일반 조직에 대한 부작용은 최소화하고 특정 파장의 빛을 조사하여 암세포에게만 독성을 보이며, 일반 광역동 치료제보다 치료능력이 향상될 수 있다.
또한, 광증감제가 담지된 나노입자 또는 나노섬유 형태로 제작되므로, 치료용 스텐트에 막 형성, 나노섬유상조직 코팅 또는 나노섬유 웹(부직포형태)을 부착하도록 하여 산화환원 반응 응답형성 광증감제 방출형 치료용 스텐트를 제조할 수 있다.
본 발명에 따르면, 구강암, 폐암, 담도암, 대장암과 같은 악성 종양 세포 혹은 종양조직내로의 광역동 치료제를 효과적으로 전달할 수 있는, 새로운 제3세대 나노광역동 치료제 제조가 가능할 것이다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 나노광역동 치료제의 제조방법을 보여주는 플로우차트이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 나노광역동 치료제인 폴리프로토포르피린 IX-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체을 합성하는 과정을 나타내는 반응식이다.
도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 나노광역동 치료제인 클로린 e6-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체을 합성하는 과정을 나타내는 반응식이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 3에 따른 나노광역동 치료제의 투과 전자 현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 3에 따른 나노광역동 치료제의 입자의 평균 크기를 입도분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6(a) 및 도 6(b)는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2에 따른 나노광역동 치료제의 글루타치온에 의한 프로토포르피린 IX의 방출 속도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제의 인간 구강암 세포인 KB세포에서의 흡수율을 비교한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제의 인간 구강암 세포인 KB세포에서의 투과 전자 현미경 사진이다.
도 9(a) 및 9(b)는 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제가 인간 구강암 세포인 KB세포와 쥐의 섬유아세포(Mouse fibroblast)인 NH3T3에 대해 빛을 조사하지 않았을 때 보이는 고유 독성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제가 인간 구강암 세포인 KB세포에 빛을 조사하였을 때 활성산소 생성에 미치는 영향을 비교한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제가 인간 구강암 세포인 KB세포에 빛을 조사하였을 때 암세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 나노광역동 치료제인 폴리프로토포르피린 IX-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체을 합성하는 과정을 나타내는 반응식이다.
도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 나노광역동 치료제인 클로린 e6-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체을 합성하는 과정을 나타내는 반응식이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 3에 따른 나노광역동 치료제의 투과 전자 현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 3에 따른 나노광역동 치료제의 입자의 평균 크기를 입도분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6(a) 및 도 6(b)는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2에 따른 나노광역동 치료제의 글루타치온에 의한 프로토포르피린 IX의 방출 속도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제의 인간 구강암 세포인 KB세포에서의 흡수율을 비교한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제의 인간 구강암 세포인 KB세포에서의 투과 전자 현미경 사진이다.
도 9(a) 및 9(b)는 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제가 인간 구강암 세포인 KB세포와 쥐의 섬유아세포(Mouse fibroblast)인 NH3T3에 대해 빛을 조사하지 않았을 때 보이는 고유 독성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제가 인간 구강암 세포인 KB세포에 빛을 조사하였을 때 활성산소 생성에 미치는 영향을 비교한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제가 인간 구강암 세포인 KB세포에 빛을 조사하였을 때 암세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다. 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "상에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "하부에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 아래에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 폴리머 조성물 및 배합물의 양을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 발명에 따른 나노광역동 치료제는 광증감제(A), 고분자(B), 및 일단이 상기 광증감제와 결합되고, 타단이 상기 고분자와 결합된 링커(L)를 포함하는 공중합체를 포함하고, 상기 공중합체는 
(여기서, n은 1 내지 1,000의 범위에 속하는 수)의 결합 관계를 갖는 것일 수 있다.
상기 광증감제는 하기 화학식 1 내지 화학식 6 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
상기 광증감제는 프로토포르피린 IX (protoporphyrin IX) 및 그 유도체, 클로린 e6 (chlorin e6) 및 그 유도체, 아미노레뷸리닉산 (5-aminolevulinic acid) 및 그 유도체, 프탈로시아닌 (Phthalocyanine), pheophorbide 및 그 유도체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있고, 상기 물질에 한정되는 것은 아니며 광증감제로 사용하는 것이면 특별한 제한이 없다.
상기 광증감제는, 바람직하게는, 프로토포르피린 IX, 클로린 e6 및 클로린 e6- 아미노메틸페닐보로닉 산 피나콜 에스터 (4-(aminomethyl)phenyl boronic acid pinacol ester(PBAP)) 공유결합체일 수 있다.
프로토포르피린 IX 및 클로린 e6는 이온화될 수 있는 카복실그룹이 두 개 또는 세 개를 가진 비대칭 분자이며, 소수성 특징을 가지고 있어서, pH 조건에 따라 다른 이온성 형태로 존재하게 되고, 1세대 광역동 치료제와 비교하여 짧은 종양 축적 시간, 더 빠른 배출, 그리고 높은 활성산소 생성 효율을 나타낸다. 따라서, 뛰어난 광역동 치료 효과를 보인다.
상기 고분자는 히아루론산 (Hyaluronic acid), 덱스트란 (dextran), 카르복시 메칠 덱스트란 (Carboxymethyl dextran), 풀루란(Pullulan), 셀룰로오스 (cellulose), 카르복시메칠 셀룰로오스 (carboxymethyl cellulose), 콘드로이친 술페이트 (chondrotin sulfate), 키토산 (chitosan), 스클레로글루칸 (scleroglucan), 이눌린 (Inulin) 셀룰로오스 (cellulose), 아밀로오스 (Amylose), 녹말 (Starch), 만난(Mannan), 커들란(Curdlan), 쉬조필란(schizophyllan), 베타글루칸(beta-glucan), 후코이단 (Fucoidan), 폴리비닐알코올(poly(vinyl alcohol), PVA), 젤라틴 (gelatin) 폴리에틸렌옥시드 (poly(ehtylene oxide), PEO), 폴리비닐피롤리돈 (poly(vinylpirrolidone), PVP), 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG), 폴리락티드(Poly(lactide), PLA), 폴리클로코라이드(Poly(glycolide), PGA), 폴리락티드-코-클리코라이드(Poly(lactideco-glycolide), PLGA), 콜라겐 (Collagen), 폴리카프롤락톤 (poly(ε-caprolactone), PCL) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있고, 상기 물질에 한정되는 것은 아니며 시스타민, 셀레노시스타민, 프로토포르피린 IX 및 클로린 e6와 결합시킬 수 있는 물질이면 특별한 제한이 없다.
상기 고분자는 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG)일 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜은 수용성 합성 고분자의 일종으로 인체에 무해하고 면역작용이 없고 생체내에서 쉽게 분해되어 인체 밖으로 배출되므로 약물을 전달할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 수용성 특성 때문에 소수성 물질들의 수용성을 높여서 수용액에 쉽게 용해할 수 있게 하므로 용해도를 증진시킬 수 있다. 또한 나노입자의 표면을 친수성을 가지도록 해줌으로써, 정상세포 및 장기에 대한 축적을 줄이고 종양 조직에 대한 축적을 증진시키는 효과가 있으므로 생체재료 및 나노입자의 종양 표적성을 증진킬 수 있다.
또한, 폴리에틸렌 글리콜은 암 조직에서의 광증감제의 흡수, 시스타민이 결합된 프로토포르피린 IX 등과의 결합성, 획득수율 등을 고려하면 고분자 중 가장 적합한 결과를 보였다.
상기 링커는 시스타민 (cystamine), 셀레노시스타민 (selenocystamine), 디셀레노시스타민(diselenocystamine), 디셀레노디프로피오닉엑시드 (diselenodipropionic acid), 디티오디프로피오닉엑시드 (Dithiodipropionic acid), 티오디프로피오닉엑시드 (Thiodipropionic acid), 디티오글리콜릭엑시드 (Dithiodiglycolic acid), 디티오디부티릭엑시드 (Dithiodibutyric acid), 비스아크릴로일 시스타민 (Bis(acryloyl)cystamine) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있고, 상기 물질에 한정되는 것은 아니며 특별한 제한이 없다.
상기 링커는 바람직하게는 시스타민 또는 셀레노시스타민일 수 있다.
시스타민은 황이중구조를 가지고, 양 말단에 아민(amine)기를 가져 글루타치온이 존재하는 조건에서 분해가 됨으로써 광증감제를 방출시켜 광역동 치료를 할 수 있다.
셀레노시스타민은 셀레늄이중구조를 가지고 양 말단에 아민(amine)기를 가져 활성산소가 존재하는 조건에서 분해가 됨으로써 광증감제를 방출시켜 광역동 치료를 할 수 있다.
상기 링커는 황이중구조(disulfide, -S-S-) 또는 셀레늄이중구조(diselenium)를 가질 수 있다.
황이중 구조(disulfide, -S-S-)는 암세포에서 많이 발현되는 글루타치온(glutathione)에 의해 선택적으로 분해될 수 있다. 또한 글루타치온 농도는 정상 세포보다는 암세포에서, 세포외부보다는 세포내에서 약 10배에서 100배까지 높게 발현된다. 따라서 황이중 구조를 가진 화합물은 정상세포보다는 암세포의 내부에서 황이중 구조가 선택적으로 분해되어 약물을 방출할 수 있는 능력이 커지게 된다.
셀레늄 이중구조(diselenium)는 암종에서 발생하는 활성 산소에 의해 셀레늄이중구조가 분해되고, 정상조직에는 독성이 적지만 암세포에서는 항암 효과도 있다. 특히 셀레늄이중구조는 셀레늄간의 결합이 가시광선에 의해 결합이 분해될 수 있다. 그러므로 가시광선을 사용하여 치료를 하는 광역동 치료제와 공유결합을 시킬 경우 정상세포를 피하여 암세포에만 선택적으로 약물을 전달할 수 있다.
상기 공중합체는 하기 화학식 7로 표현되는 화합물을 포함할 수 있다.
[화학식 7]
(여기서, m, n은 1 내지 1,000의 범위에 속하는 수)
상기 화학식 7은 폴리프로토포르피린 IX-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체이다.
종양조직 또는 암세포의 글루타치온 (Glutathione, GSH) 또는 활성산소종(reactive oxygen species)에 특이적으로 반응하여 황이중구조를 가진 시스타민과의 결합이 분해되면서 광증감제가 방출되어 광역동 치료를 할 수 있다.
상기 공중합체는 하기 화학식 8로 표현되는 화합물을 포함할 수 있다.
[화학식 8]
(여기서, m, n은 1 내지 1,000의 범위에 속하는 수이고, R1은 하이드로겐(hydrogen) 또는 아미노메틸페닐보로닉 산 피나콜 에스터 (4-(aminomethyl)phenyl boronic acid pinacol ester(PBAP)이다.)
상기 화학식 8은 클로린 e6-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체이다.
종양조직 또는 암세포의 글루타치온 (Glutathione, GSH) 또는 활성산소종(reactive oxygen species)에 특이적으로 반응하여 셀레늄이중구조를 가진 셀레노시스타민과의 결합이 분해되면서 광증감제가 방출되어 광역동 치료를 할 수 있다.
상기 공중합체는 입자 크기가 50nm 내지 500nm일 수 있다.
상기 공중합체는 이중블록 또는 삼중블록 공중합체일 수 있다.
상기 공중합체는 바람직하게는 이중블록 공중합체일 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 나노광역동 치료제의 제조방법을 보여주는 플로우차트이다. 상기 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 나노광역동 치료제의 제조방법은 (1) 고분자, 링커 및 광증감제를 준비하는 단계(S100); (2) 상기 고분자와 링커를 결합하는 단계(S200); (3) 상기 (2)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계(S300); (4) 상기 (3)의 결과물의 광증감제에 링커를 결합하는 단계(S400); (5) 상기 (4)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계(S500); 및 (6) 상기 (4) 내지 (5) 단계를 반복하는 단계(S600);를 포함할 수 있다.
상기 (1) 고분자(B), 링커(L) 및 광증감제(A)를 준비하는 단계(S100)는 상기 고분자를 용매 100중량부 기준으로 0.01 중량부 내지 30 중량부가 되도록 준비하는 단계; 상기 링커를 용매 100중량부 기준으로 0.01 중량부 내지 30 중량부로 상기 용매에 용해하는 단계; 및 상기 광증감제를 용매 100중량부 기준으로 0.01 중량부 내지 30 중량부가 되도록 준비하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (2) 상기 고분자와 링커를 결합하는 단계(S200)는 준비한 상기 고분자와 링커를 혼합하여 20시간 내지 28시간을 반응시키는 단계; 및 반응한 혼합물을 투석하고 정제하고 동결건조하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (3) 상기 (2)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계(S300)는 상기 (2)의 결과물의 링커의 말단 아민기에 상기 광증감제를 공유결합 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 (3) 상기 (2)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계(S300)는 상기 광증감제를 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC))와 N-하드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide, NHS)로 활성화시켜 광증감제-NHS 결합물을 만드는 단계; 상기 광증감제-NHS 결합물을 상기 (2)의 결과물의 링커와 혼합하여 20시간 내지 28시간을 반응시키는 단계; 및 반응한 혼합물을 투석하고 정제하고 동결건조하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (4) 상기 (3)의 결과물의 광증감제에 링커를 결합하는 단계(S400)는 상기 (3)의 결과물의 광증감제의 말단 카르복실기에 상기 링커를 공유결합 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 (4) 상기 (3)의 결과물의 광증감제에 링커를 결합하는 단계(S400)는 상기 링커를 용매 100중량부 기준으로 0.01 중량부 내지 30 중량부로 상기 용매에 용해하는 단계; 상기 (3)의 결과물의 광증감제를 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC))와 N-하드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide, NHS)로 활성화시켜 광증감제-NHS 결합물을 만드는 단계; 상기 광증감제-NHS 결합물을 상기 링커와 혼합하여 20시간 내지 28시간을 반응시키는 단계; 및 반응한 혼합물을 투석하고 정제하고 동결건조하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (5) 상기 (4)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계(S500)는 상기 (4)의 결과물의 링커의 말단 아민기에 상기 광증감제를 공유결합 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 (5) 상기 (4)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계(S500)는 상기 광증감제를 용매 100중량부 기준으로 0.01 중량부 내지 30 중량부가 되도록 준비하는 단계; 상기 광증감제를 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC))와 N-하드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide, NHS)로 활성화시켜 광증감제-NHS 결합물을 만드는 단계; 상기 광증감제-NHS 결합물을 상기 (4)의 결과물의 링커와 혼합하여 20시간 내지 28시간을 반응시키는 단계; 및 반응한 혼합물을 투석하고 정제하고 동결건조하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (6) 상기 (4) 내지 (5) 단계를 반복하는 단계(S600)는 바람직하게는 2회 내지 10회 반복할 수 있다.
또한, 상기와 같이 암세포에 친화적인 폴리에틸렌 글리콜에 프로토포르피린 IX 또는 클로린 e6가 공중합체를 구성하고 있는 나노광역동 치료제를 이용하여 광증감제 조절 방출형 치료용 스텐트 제작도 가능하다. 이러한 스텐트 제작과정을 간략히 설명하기로 한다.
먼저, 본 발명에 의해 제조된 나노광역동 치료제를 전기방사가 가능한 농도로 물(H2O), 에탄올, DMAc(dimethyl acetamide), DMF(N, N-dimethylformamide), NMP(N-methyl-2-pyrrolidinone), DMSO(dimethyl sulfoxide) 등과 같은 적당한 용매에 용해하여 방사용액을 제조한다. 이때 방사용액은 이렇게 제조된 방사용액은 나노섬유의 제조시에는 섬유상 구조를 형성하기 위해 방사용액(고분자와 약물이 담지된 혼합용액)의 농도를 3~60 중량%로 제조하여 섬유의 모폴러지(morphology)를 제어하는 것이 바람직하다. 상기와 같이 제조된 방사용액을 이용하여 스텐트상에 직접 방사하여 스텐트의 표면에 나노섬유가 코팅되도록 하는 것이 가능하다.
또는, 별도의 집전판을 구비하여 나노섬유 웹(부직포 형태)을 먼저 제조하고, 상기 나노섬유 웹을 금속튜브상 스텐트에 접착시는 공정 예를 들면, 생분해성 글루나 물리적인 방법등을 이용하여 스텐트상에 나노섬유가 부착되도록 하여 제조할 수 있다.
또한, 나노입자를 이용하여 필름형태의 막으로 제조할 수도 있다. 이러한 필름형태의 막을 제조하여 스텐트의 외면에 접착시킴으로써 약물방출조절형 치료용 스텐트의 제작도 가능하다.
이하, 하기 실시예 및 비교예를 참조하여 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 기술적 사상이 이에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 및 2: 폴리프로토포르피린 IX-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체의 합성 및 나노광역동 치료제 제조
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 나노광역동 치료제인 폴리프로토포르피린 IX-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체을 합성하는 과정을 나타내는 반응식이다.
실시예 1은 폴리에틸렌 글리콜에 시스타민을 공유결합시키고 말단의 아민기에 프로토포르피린 IX을 공유결합 시킨 다음, 다시 프로토포르피린 IX의 말단 카르복실기에 시스타민을 공유결합 시키는 과정을 4회이상 반복하여 폴리에틸렌 글리콜에 프로토포르피린 IX이 4개 이상 연결된 이중블록 공중합체를 합성하는 과정을 거쳤다. 이의 과정을 좀 더 상세히 설명하면, 폴리에틸렌 글리콜 2,000mg을 디메칠술폭사이드에 녹이고 여기에 시스타민 디하이드로클로라이드 (cystamine dihydrochloride) 1,126mg을 첨가하고 추가로 24시간동안 교반한 뒤 증류수에 대하여 2일동안 투석하고 동결건조하여 분말을 수득하여 폴리에틸렌 글리콜-시스타민 공유결합체을 얻었다. 다음으로 프로토포르피린 IX 563mg과 디메칠술폭사이드 (Dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹이고 여기에 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 192mg, N-하드록시숙신이미드 115 mg을 첨가하고 약 3시간 동안 교반한 다음, 폴리에틸렌 글리콜-시스타민 공유결합체 2,140mg과 혼합하여 추가로 24시간동안 교반한 다음 증류수에 대하여 2일동안 투석하고 동결건조하여 분말을 수득하여 폴리에틸렌 글리콜에 프로토포르피린 IX이 시스타민을 중간매개체로 하여 폴리프로토포르피린 IX-폴리에틸렌 글리콜 공유결합체를 얻었다. 얻어진 폴리프로토포르피린 IX-폴리에틸렌 글리콜 공유결합체 2,700mg을 디메칠술폭사이드에 녹인 다음, 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 192mg, N-하드록시숙신이미드 115 mg을 첨가하고 약 3시간 동안 교반한 다음 시스타민 디하이드로클로라이드 1,126mg을 첨가하고 추가로 24시간동안 교반 한뒤 증류수에 대하여 2일동안 투석하고 동결건조하여 분말을 수득하여 폴리에틸렌 글리콜-프로토포르피린 IX 공유결합체의 말단에 다시 시스타민이 공유결합된 폴리에틸렌 글리콜-프로토포르피린 IX 공유결합체을 얻고, 여기에 프로토포르피린 IX를 다시 공유결합시키는 과정을 세 번 이상 반복하여, 폴리에틸렌 글리콜에 프로토포르피린 IX가 네 개 이상 반복된 구조를 갖는 폴리에틸렌 글리콜-폴리프로토포르피린 IX 이중블록 공중합체를 합성하였다 (Poly(PpIX)bPEG-4).
실시예 2는 상기 기술한 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜에 시스타민을 공유결합시키고 말단의 아민기에 프로토포르피린 IX을 공유결합 시킨 다음, 다시 프로토포르피린 IX의 말단 카르복실기에 시스타민을 공유결합 시키는 과정을 8번 더 반복하여 프로토포르피린 IX가 아홉 개 이상 연결된 폴리에틸렌 글리콜-폴리프로토포르피린 IX 이중블록 공중합체를 합성하는 과정을 거쳤다(Poly(PpIX)bPEG-9).
상기 합성된 폴리에틸렌 글리콜-폴리프로토포르피린 IX 이중블록 공중합체인 실시예 1 내지 실시예 2 각각 20mg을 디메칠술폭사이드에 녹인 후 증류수에 분산시킨 다음 투석막에 넣고 증류수에 대하여 2일동안 투석하여 나노입자를 제조하였고, 최종적으로 나노광역동 치료제 수용액을 얻었다.
실시예 3 및 4: 폴리클로린 e6-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체의 합성 및 나노광역동 치료제 제조
도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 나노광역동 치료제인 클로린 e6-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체을 합성하는 과정을 나타내는 반응식이다.
실시예 3은 클로린 e6에 아미노메틸페닐보로닉 산 피나콜 에스터를 결합시켜 클로린 e6-아미노메틸페닐보로닉 산 피나콜 에스터 공유결합체를 합성하고, 클로린 e6-아미노메틸페닐보로닉 산 피나콜 에스터 공유결합체를 폴리에틸렌 글리콜에 셀레노시스타민을 중간 매개체로 하여 클로린 e6가 4개 이상 연결된 구조를 갖는 폴리에틸렌 글리콜-클로린 e6 이중블록 공중합체를 합성하는 과정을 거친 것이다. 이의 과정을 좀 더 상세히 설명하면, 클로린 e6 597mg을 디메칠술폭사이드에 녹이고 여기에 아미노 메칠 페닐보로닉 엑시드 피나콜 에스터 하이드로클로라이드(4-(Aminomethyl)phenylboronic acid pinacol ester hydrochloride) 270mg을 혼합한 다음 12시간 동안 교반하여 클로린 e6-페닐보로닉 엑시드 피나콜 에스터 공유결합체를 합성하였다. 또한 폴리에틸렌 글리콜 2,000mg을 디메칠술폭사이드에 녹이고 여기에 셀레노 시스타민 디하이드로클로라이드 (selenocystamine dihydrochloride) 1,595mg을 첨가하고 추가로 24시간동안 교반 한뒤 증류수에 대하여 2일동안 투석하고 동결건조하여 분말을 수득하여 폴리에틸렌 글리콜-셀레노시스타민 공유결합체를 얻었다. 다음으로 클로린 e6-페닐보로닉 엑시드 피나콜 에스터 공유결합체 812mg을 디메칠술폭사이드에 녹이고, 여기에 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 192mg, N-하드록시숙신이미드 115 mg을 첨가하고, 약 3시간 동안 교반한 다음, 다시 여기에 폴리에틸렌 글리콜-셀레노시스타민 공유결합체 2,230mg을 첨가하여 24시간 동안 반응한 후, 2일동안 투석하고 동결건조하여, 셀레노시스타민을 중간 매개체로 한 클로린 e6-폴리에틸렌 글리콜 공유결합체를 얻었다. 얻어진 폴리에틸렌 글리콜-클로린 e6 공유결합체 2,810mg을 디메칠 술폭사이드에 녹이고, 말단 카르복실 기를 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 192mg, N-하드록시숙신이미드 115 mg을 첨가하고 약 3시간 동안 교반한 다음, 셀레노 시스타민 디하이드로클로라이드 1,595mg을 첨가하고, 추가로 24시간동안 교반한 뒤, 증류수에 대하여 2일동안 투석하고 동결건조하여 분말을 수득하여, 클로린 e6-폴리에틸렌 글리콜 공유결합체의 말단에 다시 셀레노시스타민이 공유결합된 혼합물을 얻었다. 또한 상기에 기술한 바와 같이 말단 아민기에 다시 클로린 e6-페닐보로닉 엑시드 피나콜 에스터 공유결합체를 공유결합시키는 과정을 세 번 더 반복하여 폴리에틸렌 글리콜에 클로린 e6가 네 개 이상 연결된 폴리클로린 e6-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체를 합성하였다(Poly(Ce6-PBAP)bPEG-4).
실시예 4는 상기에 기술한 바와 같이 말단 아민기에 다시 클로린 e6-페닐보로닉 엑시드 피나콜 에스터 공유결합체를 공유결합시키는 과정을 8번 더 반복하여 클로린 e6가 아홉 개 이상 연결된 폴리클로린 e6-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체를 합성하는 과정을 거쳤다(Poly(Ce6-PBAP)bPEG-9).
상기 합성된 폴리클로린 e6-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체 20mg을 디메칠술폭사이드에 녹인 후 증류수에 분산시킨 다음 투석막에 넣고 증류수에 대하여 2일동안 투석하여 나노입자를 제조하였고, 최종적으로 나노광역동 치료제 수용액을 얻었다.
비교예 1 및 2
비교예 1은 프로토포르피린 IX을 디메칠술폭사이드에 녹인 후 증류수에 분산시킨 다음 투석막에 넣고 증류수에 대하여 2일동안 투석하여 나노입자를 제조하였고, 최종적으로 나노광역동 치료제 수용액을 얻었다.
비교예 2는 클로린 e6을 디메칠술폭사이드에 녹인 후 증류수에 분산시킨 다음 투석막에 넣고 증류수에 대하여 2일동안 투석하여 나노입자를 제조하였고, 최종적으로 나노광역동 치료제 수용액을 얻었다.
실험예 1: 나노광역동 치료제 분석
실시예 1 및 실시예 3에서 제조한 나노광역동 치료제의 형태와 입자크기를 조사하였다. 그 결과는 도 4 및 도 5와 같다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 3에 따른 나노광역동 치료제의 투과 전자 현미경 사진이다. 도 4를 참조하면, 본 발명의 실시예 1 및 실시예 3에 따른 나노광역동 치료제는 약 50~200 nm 사이의 크기를 가지는 나노입자가 형성됨을 알 수 있었으며, 그 형상은 나노 크기의 구형으로 물리적으로 가장 적합한 형상을 가짐을 알 수 있었다.
또한 도 5는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 3에 따른 나노광역동 치료제의 입자의 평균 크기를 입도분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 5를 참조하면, 입자의 평균 크기는 실시예 1(Poly(PpIX)bPEG-4)은 156 nm 였으며, 실시예 3(Poly(Ce6-PBAP)bPEG-4)는 189 nm 이였음을 알 수 있었다.
실험예 2: 나노광역동 치료제로부터 프로토포르피린 IX의 방출속도 측정
실시예 1 및 실시예 2의 프로토포르피린 IX의 방출 속도를 측정하는 실험을 진행하였다. 상기 실험은 글루타치온을 함유한 인산완충용액 (phosphate buffered saline (PBS) solution, 0.01M, pH7.4)에서 실시하였으며 방출된 프로토포르피린 IX의 양은 UV spectrophotometer를 이용하여 630 nm 에서 측정하였다.
도 6(a) 및 도 6(b)는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2에 따른 나노광역동 치료제의 글루타치온에 의한 프로토포르피린 IX의 방출 속도를 나타낸 그래프이다. 도 6(a) 및 도 6(b)를 참조하면, 인산완충용액 상에서는 프로토포르피린 IX의 방출속도가 느렸으며 약 4일 동안 20% 미만이 방출되었으나 글루타치온이 있는 경우는 4일동안 100% 가까이 방출되었으며, 실시예 1과 실시예 2는 글루타치온의 농도에 의존적으로 방출속도가 빨라짐을 확인 하였다. 이 결과로서 프로토포르피린 IX의 방출속도가 암세포에 많은 글루타치온에 의해 선택적으로 약물을 방출하는 것을 확인하였으며, 암세포에 나노광역동 치료제를 선택적으로 전달 할 수 있음을 확인하였다.
실험예 3: 암세포에 대한 나노광역동 치료제의 항암성능 측정
한국세포주은행에서 구입한 인간구강편평상피암 세포주인 KB에 대하여 광역동 치료 성능을 검증하였다. 또한 NIH3T3 mouse fibroblast 세포를 가지고 프로토포르피린 IX와 폴리프로토포르피린 IX-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체 나노광역동 치료제의 독성을 검증하였다.
도 7은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제의 인간 구강암 세포인 KB세포에서의 흡수율을 비교한 그래프이다. 도 8은 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2의 KB세포에서의 투과 전자 현미경 사진이다. 세포는 DMEM 배지를 이용하여 CO2 배양기에서 37℃에서 배양하였다. 세포를 96웰에 각 웰당 20,000 개의 세포를 깔고 하룻밤 동안 배양한 뒤, serum이 없는 배지로 교환한 뒤 본 발명에 의해 제조된 실시예 1 내지 4과 비교예 1 내지 비교예 2를 각 농도에 따라 처리하였다.
도 7을 참조하면, 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 모두 농도에 의존적으로 세포 내에서 프로토포르피린 IX의 양이 증가하는 것을 알 수 있었다. 특히 비교예 1에 비해 실시예 1 및 실시예 2가 세포 내로 각각 약 3배, 4배 이상 월등하게 더 많은 양이 이입되는 것을 확인하였다. 또한 실시예 3 및 실시예 4 역시 비교예 2에 비해 약 3-4배 이상 월등하게 더 많은 양이 세포내로 이입되는 것을 확인하였다.
또한, 도 8을 참조하면, 비교예 1에 비해 실시예 1 및 실시예 2의 경우 형광 강도가 훨씬 강한 것을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 기존의 광역동 치료제에 비하여 나노로 입자화한 나노광역동 치료제가 암세포를 더 잘 공격할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
도 9(a) 및 9(b)는 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제가 인간 구강암 세포인 KB세포와 쥐의 섬유아세포(Mouse fibroblast)인 NH3T3에 대해 빛을 조사하지 않았을 때 보이는 고유 독성을 나타낸 그래프이다. 세포는 DMEM 배지를 이용하여 CO2 배양기에서 37 oC에서 배양하였다. 세포를 96웰에 각 웰당 20,000 개의 세포를 깔고 하룻밤 동안 배양한 뒤, serum이 없는 배지로 교환한 뒤 본 발명에 의해 제조된 실시예 1 내지 4과 비교예 1 내지 비교예 2를 각 농도에 따라 처리하였다. 처리 후 약 2시간동안 암조건에서 배양한 후 인산완충용액으로 세척한 후, 새로운 배지를 넣어주고 추가로 24시간동안 CO2 배양기에서 37 oC에서 배양한 뒤, MTT 분석방법으로 세포의 생존율을 비교하였다.
도 9(a) 및 도 9(b)를 참조하면, 빛을 조사하지 않은 경우, 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2 모두, 2μg/mL의 농도까지는 세포의 생존율이 80% 이상 유지되었으며, 10μg/mL의 농도까지도 70% 이상의 생존율을 기록하였다. 특정 파장의 빛을 비추지 않는 경우, 실시예가 비교예와 마찬가지로 암세포뿐만 아니라 정상세포에 독성이 없거나 미미한 것을 확인할 수 있다.
도 10은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제가 인간 구강암 세포인 KB세포에 빛을 조사하였을 때 활성산소 생성에 미치는 영향을 비교한 그래프이다. 세포를 96웰에 각 웰당 20,000 개의 세포를 깔고 하룻밤 동안 배양한 뒤, serum이 없는 배지로 교환한 뒤 본 발명에 의해 제조된 실시예 1 내지 4과 비교예 1 내지 비교예 2를 각 농도에 따라 처리하였다. 광조사를 위해 LED램프 (SH system, Korea)를 사용하였다. 파장은 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1은 630 nm 의 파장대에서 조사하였고, 실시예 3, 실시예 4 및 비교예 2는 664 nm 의 파장대에서 조사하였으며, 빛의 강도는 2 J/cm2 였다(photo-radiometer로 측정 (DeltaOhm, Italy)). 처리 후 약 2시간동안 암조건에서 배양한 후, 새로운 DMEM 배지로 교환 후 발생한 활성산소의 수준을 디클로로디하이드로플루오리세인 디아세테이트 (2', 7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)로 측정하였다.
도 10을 참조하면, 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2 모두 농도에 의존적으로 활성산소를 생산해 내었으며, 실시예 1 내지 실시예 4 는 비교예 1 내지 비교예 2에 비하여 50% 이상의 활성산소를 더 많이 생성해 낸 것을 알 수 있었다. 이 결과로서 본 발명에 따른 실시예 1 내지 4가 기존의 비교예 1 내지 2 활성산소 생성능력이 우수한 것을 확인할 수 있다.
도 11은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2에 따른 나노광역동 치료제가 인간 구강암 세포인 KB세포에 빛을 조사하였을 때 암세포 생존율을 나타낸 그래프이다. KB세포에 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1 내지 비교예 2를 농도에 따라 처리한 후 2시간동안 암조건에서 배양하고 새로운 DMEM 배지로 교환 후, 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1은 630 nm의 파장대에서, 실시예 3, 실시예 4 및 비교예 2는 664 nm의 파장대에서 2.0 J/cm2 로 처리하였다. 처리한 세포를 CO2 배양기에서 추가로 24시간 동안 배양한 뒤 MTT 분석방법으로 세포의 생존능을 분석하였다.
도 11을 참조하면, 비교예 1에 비해 실시예 1 및 실시예 2가 암세포에 대한 광독성이 훨씬 더 우수한 것을 확인하였으며, 실시예 3 및 실시예 4도 마찬가지로 비교예 2와 비교하여 광독성이 훨씬 뛰어 난 것을 확인하였다. 또한 실시예 1 내지 4가 비교예 1 내지 2에 비해 약 3분의 1 내지, 4분의 1 농도에서도 암세포를 절반 이상 죽이는 것을 확인할 수 있다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 암에서 발현되는 글루타치온 또는 활성산소에 선택적으로 분해되는 시스타민 또는 셀레노시스타민으로 연결된 프로토포르피린 IX나 클로린 e6가 폴리에틸렌 글리콜에 이중블록 공중합체 형태로 연결된 공유결합체는 나노광역동 치료제로 제작이 가능하고, 글루타치온, 활성산소 등에 반응하여 프로토포르피린 IX나 클로린 e6의 조절 방출이 이루어지므로, 암세포에 특이적으로 전달이 가능하고 프로토포르피린 IX나 클로린 e6 그 자체보다도 인체 내에서 보다 향상된 광역동 치료성능을 발휘함을 확인할 수 있다. 따라서 나노입자 형태로 구성된 폴리프로토포르피린 IX-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체 및 폴리클로린 e6-폴리에틸렌 글리콜 이중블록 공중합체 또는 두 물질을 동시에 사용한 삼중블록 공중합체는, 그 자체를 치료용 약물로 사용하거나 또는 필름형상이나 나노섬유 형태로 제작하여 스텐트에 결합시켜 사용하는 등 다양한 형태의 치료용 스텐트를 제작할 수 있다.
이상, 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (31)
- 하기 화학식 1로 표현되는 프로토포르피린IX를 포함하는 광증감제(A),
폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG)을 포함하는 고분자(B), 및
일단이 상기 광증감제와 결합되고, 타단이 상기 고분자와 결합된 링커(L);
를 포함하는 공중합체;를 포함하고,
상기 공중합체는 폴리에틸렌 글리콜에 프로토포르피린IX 9개가 시스타민을 포함하는 링커로 서로 연결되어 반복되는 구조를 갖는 것인 나노광역동 치료제.
[화학식 1]
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- 제1항에 있어서,
상기 링커는 황이중구조(disulfide, -S-S-)를 가진 것인 나노광역동 치료제. - 삭제
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- 제1항 또는 5항의 나노광역동 치료제의 제조방법에 있어서,
(1) 고분자(B), 링커(L) 및 광증감제(A)를 준비하는 단계;
(2) 상기 고분자와 링커를 결합하는 단계;
(3) 상기 (2)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계;
(4) 상기 (3)의 결과물의 광증감제에 링커를 결합하는 단계;
(5) 상기 (4)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계; 및
(6) 상기 (4) 내지 (5) 단계를 반복하는 단계;를 포함하고,
상기 (6) 상기 (4) 내지 (5) 단계를 반복하는 단계는 8회 반복하는 것인 나노광역동 치료제의 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 (1) 고분자(B), 링커(L) 및 광증감제(A)를 준비하는 단계는
상기 고분자를 2,000mg 준비하는 단계;
상기 링커를 1,126mg 준비하는 단계; 및
상기 광증감제를 563mg 준비하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 나노광역동 치료제의 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 (3) 상기 (2)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계는
상기 (2)의 결과물의 링커의 말단 아민기에 상기 광증감제를 공유결합 시키는 것을 특징으로 하는 나노광역동 치료제의 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 (4) 상기 (3)의 결과물의 광증감제에 링커를 결합하는 단계는
상기 (3)의 결과물의 광증감제의 말단 카르복실기에 상기 링커를 공유결합 시키는 것을 특징으로 하는 나노광역동 치료제의 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 (5) 상기 (4)의 결과물의 링커에 광증감제를 결합하는 단계는
상기 (4)의 결과물의 링커의 말단 아민기에 상기 광증감제를 공유결합 시키는 것을 특징으로 하는 나노광역동 치료제의 제조방법. - 삭제
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- 제10항에 있어서,
상기 링커는 황이중구조(disulfide, -S-S-)를 가진 것인 나노광역동 치료제의 제조방법. - 삭제
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- 제10항에 있어서,
상기 (2) 단계는,
준비한 상기 고분자와 링커를 혼합하여 24시간 반응시키는 단계; 및
반응한 혼합물을 증류수에 2일동안 투석하고 정제하고 동결건조하는 단계;를 포함하는 것인 나노광역동 치료제의 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 (3) 단계는,
상기 광증감제를 용매인 디메칠술폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹이고, 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC)) 192mg와 N-하드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide, NHS) 115mg를 첨가하여 3시간동안 교반 및 활성화시켜 광증감제-NHS 결합물을 만드는 단계;
상기 광증감제-NHS 결합물을 상기 (2)의 결과물의 링커와 혼합하여 24시간 반응시키는 단계; 및
반응한 혼합물을 증류수에 2일동안 투석하고 정제하고 동결건조하는 단계; 를 포함하는 것인 나노광역동 치료제의 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 (4) 단계는,
상기 (3)의 결과물의 광증감제를 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC)) 192mg와 N-하드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide, NHS) 115mg를 첨가하여 3시간동안 교반 및 활성화시켜 광증감제-NHS 결합물을 만드는 단계;
상기 광증감제-NHS 결합물을 상기 링커 1,126mg 와 혼합하여 24시간을 반응시키는 단계; 및
반응한 혼합물을 증류수에 2일동안 투석하고 정제하고 동결건조하는 단계; 를 포함하는 것인 나노광역동 치료제의 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 (5) 단계는,
상기 광증감제를 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC)) 192mg와 N-하드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide, NHS) 115mg를 첨가하여 3시간동안 교반 및 활성화시켜 광증감제-NHS 결합물을 만드는 단계;
상기 광증감제-NHS 결합물을 상기 (4)의 결과물의 링커와 혼합하여 24시간을 반응시키는 단계; 및
반응한 혼합물을 증류수에 2일동안 투석하고 정제하고 동결건조하는 단계; 를 포함하는 것인 나노광역동 치료제의 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 (1) 단계에서,
상기 고분자, 링커 및 광증감제의 무게비는 3.5~3.6: 2: 1인 나노광역동 치료제의 제조방법. - 제10항에 있어서,
프로토포르피린IX의 농도가 1 내지 5μg/ml일 때, KB 세포에서의 형광 강도(Fluorescence intensity, FI)가 2500 내지 10000인 나노광역동 치료제의 제조방법. - 제10항에 있어서,
630 nm 의 파장에서 2J/cm2의 빛 강도에서 프로토포르피린IX의 농도가 1 내지 5μM일 때, KB 세포에서의 형광 강도(Fluorescence intensity, FI)가 420 내지 700인 나노광역동 치료제의 제조방법. - 제10항에 있어서,
630 nm 의 파장에서 2J/cm2의 빛 강도에서 프로토포르피린IX의 농도가 0.1 내지 10μM일 때, 암세포 생존률이 20 내지 70인 나노광역동 치료제의 제조방법.
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| KR1020210194017A KR102505008B1 (ko) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 글루타치온 또는 활성산소에 응답성을 가지는 나노광역동 치료제 및 이의 제조방법 |
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102068609B1 (ko) | 2018-04-27 | 2020-01-21 | 울산과학기술원 | 광감각제, 광감각제를 포함하는 조성물 및 광역동 치료 방법 |
| KR20200033759A (ko) * | 2018-09-20 | 2020-03-30 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체 및 이를 포함하는 광역학 치료용 조성물 |
| KR20210015692A (ko) * | 2019-08-02 | 2021-02-10 | 전남대학교병원 | 클로린 e6 다중결합체 및 이를 이용한 나노광증감제 |
| KR102245552B1 (ko) * | 2018-02-28 | 2021-04-29 | 부산대학교 산학협력단 | 나노약물 복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도 |
| KR102253745B1 (ko) | 2019-06-26 | 2021-05-21 | 울산과학기술원 | 광역동 치료용 이리듐 복합체의 담지를 위한 나노젤 |
-
2021
- 2021-12-31 KR KR1020210194017A patent/KR102505008B1/ko active
Patent Citations (5)
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| Title |
|---|
| Biomedical Materials. 2020. Vol.15, Article 055034.* * |
| Materials(Basel). 2022. Vol.15 No.1, Article 138.* * |
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