CN114983942B - 治疗幽门螺杆菌感染的多功能微泡、制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种治疗幽门螺杆菌感染的多功能微泡、制备及其应用。本发明通过自组装过程成功制备出一种治疗幽门螺杆菌感染的多功能微泡，该多功能微泡可以通过声动力产生的空化效应直接杀伤细菌，增加生物被膜内氧气的含量，从而增强了光动力治疗的效果，实现了光动力‑声动力联合治疗幽门螺杆菌感染的目的，可有效改善现有技术中药物靶向性差、耐药性强、安全性差、治疗效果不显著等问题。

Description

治疗幽门螺杆菌感染的多功能微泡、制备及其应用
技术领域
本发明涉及光动力和声动力联合治疗技术领域。更具体地，涉及一种治疗幽门螺杆菌感染的多功能微泡，制备及其应用。
背景技术
胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是全球最常见的恶性肿瘤之一，在癌症死亡原因中位列第二。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是胃癌的一类致癌物，因幽门螺杆菌感染引起的疾病包括消化道溃疡、慢性胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤等，不良预后就是胃癌。我国胃癌高发区成人幽门螺杆菌感染率在60%以上，积极治疗胃内幽门螺杆菌感染是预防胃癌的有效手段。目前临床上主要采用四联药物治疗幽门螺杆菌感染，即一种质子泵抑制剂（抑制胃酸）+一种铋剂（保护胃黏膜）+两种抗生素。由于幽门螺杆菌对抗生素已出现一定的耐药性，单种抗生素治疗成功率不超过50%，只有几种抗生素联合使用才有较高的成功率，并且随着幽门螺杆菌耐药性的不断增强，使用多种抗生素的根除失败率也有逐年上升的趋势。
光动力杀菌技术是基于内源性或外源性光敏剂在光照下产生活性氧物种（ROS）杀灭细菌的技术，初步临床试验显示其对幽门螺杆菌的清除率在治疗后即刻可达99%。因为光动力杀菌的本质是ROS对生物有机体的氧化清除作用，不存在耐药性的问题，有望成为与抗生素疗法互补的治疗手段。然而为了躲避机体的清除机制，幽门螺杆菌会在胃黏膜上形成生物被膜，致使幽门螺杆菌处于与外界氧气隔绝的乏氧环境中，低的ROS产生效率导致光动力杀菌效果降低。此外，幽门螺杆菌在受到抗生素或ROS等不利刺激后，会转变为休眠性的球性菌，球性菌处于低代谢状态，对抗生素或光敏剂的摄取降低，也降低了治疗效果。
近年来有研究表明，在光动力治疗幽门螺杆菌感染的基础上联合声动力治疗可以增强杀菌效果。其原理是由于体液中溶解的少量气体微泡（空化核）会产生超声空化现象，即当超声波能量足够高时，液体中的微泡在超声场的作用下振动、生长并不断聚集声场能量，当能量达到某个阈值时，空化气泡急剧崩溃闭合的现象，能加速非均相物质间的扩散，进而产生与外部氧气环境连通的通道，增加生物被膜内氧气的含量，进而增强光动力杀菌效果。此外，超声波也可以激活休眠的球性菌，增强幽门螺杆菌的代谢能力，增加幽门螺杆菌对光敏剂的摄取。因此，光动力治疗联合声动力治疗的方式被广泛关注。
目前，虽然已有较多将微泡用作纳米药物载体的相关报道，但具有微生物靶向性的微泡仍鲜有报道，尤其是还没有针对治疗幽门螺杆菌感染的靶向性微泡，也没有光动力治疗联合声动力治疗幽门螺杆菌感染的技术报道。
发明内容
基于以上缺陷，本发明的第一个目的在于提供一种微泡。所述微泡的脂质双分子外壳是通过自组装过程将含巯基的靶向分子，支撑分子以及具有两亲性的磷酸分子结合起来而形成的，具有对幽门螺杆菌靶向识别能力。
本发明的第二个目的在于提供一种制备上述微泡的方法。
本发明的第三个目的在于提供一种利用如上微泡负载光敏剂来制备多功能微泡。
本发明的第四个目的在于提供一种制备如上多功能微泡的方法。
本发明的第五个目的在于提供一种利用如上多功能微泡在制备治疗幽门螺杆菌感染的光动力治疗药物、声动力治疗药物或光声联合治疗药物中的应用。
为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：
本发明公开一种微泡，包括脂质双分子外壳和包裹在脂质双分子外壳内部的气体；所述脂质双分子外壳由至少一种含巯基的靶向分子，支撑分子，以及至少一种具有两亲性的磷酸分子共同自组装形成；
所述靶向分子选自如下通式T1或T2所述化合物：
；/>；
其中，R1-R4各自独立代表氢、C1-C16的烷基或C1-C16的烷氧基中的一种；
C1-C16的烷基包括C1-C16的直链烷基或C1-C16的支链烷基，C1-C16的烷氧基包括C1-C16的直链烷氧基或C1-C16的支链烷氧基；R1、R2各自相同或不同；R3、R4各自相同或不同；
所述支撑分子为一种具有小的亲水基团和一个大的亲油基团组成的化合物，在一个具体的实施方式中，优选为胆固醇，起到稳定微泡结构的目的，胆固醇主体的亲油基团可以和中空微泡壳内部的亲油基团通过分子间作用力很好的结合，进而起到稳定中空微泡壳结构的作用；
所述磷酸分子选自如下T3-1或T4-1所示化合物，其中所述T4-1为DSPE-mPEG2000：
；
。
在本申请中，通式T1或T2的含巯基的靶向分子可以与具有两亲性的磷酸分子以及支撑分子通过分子间作用力和氢键自组装结合在一起形成微泡结构，该结构的表面富含大量巯基，巯基对幽门螺杆菌具有一定的靶向作用，并且巯基可以与幽门螺杆菌的细胞膜实现较好地结合，由此赋予了微泡结构对幽门螺杆菌的靶向识别能力。之后发明人又利用微泡负载光敏剂分子制备得到多功能微泡，该多功能微泡通过声动力产生的空化效应直接杀伤幽门螺杆菌，也加速非均相物质间的扩散，进而产生与外部氧气环境连通的通道，增加生物被膜内氧气的含量，随着氧气含量的提升，也就增强了光动力治疗的效果，从而实现了光动力-声动力联合治疗幽门螺杆菌感染的目的，展现了广阔的应用前景。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据微泡成分和微泡性能等方面的需求，有选择性地对靶向分子的R1-R4取代基进行调整，例如通过增加或减少取代基链的长度，可以改变中空微泡上修饰靶向分子的比例，进而改变靶向中空微泡与幽门螺杆菌的亲和能力，当然也可以使用其他含巯基的靶向分子替代本发明通式T1或T2的化合物，也都在本发明的保护范围之内；同样地，本领域技术人员也可以根据微泡表面流动性、微泡膜厚度等方面的需求，有选择性地对磷酸分子中的R5-R10取代基进行调整，例如改变取代基的长度可以改变中空微泡膜的厚度，减少取代基链长度可以减小厚度，增加取代基链长度可以增加厚度，取代基中烷基链为亲油链，烷氧基链为亲水链，通过使用亲油链和亲水链搭配，可以赋予磷酸分子两亲性。另外，微泡的脂质双分子外壳内的气体通常为空气或氧气。
进一步，所述通式T1化合物选自如下所示之一化合物：
；/>。
进一步，所述靶向分子、支撑分子和磷酸分子的质量比为1:0.1-50:5-500；示例性地，所述靶向分子、支撑分子和磷酸分子还可以为1:1-5:5-50，1:1-10:5-50，1:1-20:5-50，1:1-30:5-50，1:1-40:5-50，1:1-50:5-50，1:5-50:5-500，1:10-50:5-500，1:15-50:5-500，1:20-50:5-500，1:25-50:5-500，1:30-50:5-500，1:35-50:5-500，1:40-50:5-500，1:45-50:5-500，1:10-20:5-500，1:10-30:5-500，1:10-40:5-500，1:20-40:5-500，1:10-50:50-500，1:10-50:5-500等等。在配方使用时，靶向分子和磷酸分子可以任意选自对应通式结构中一种或多种组合的化合物，只要保证三种分子的比例关系在设定的范围内即可。
进一步，所述微泡的平均粒径为100nm-1000nm；示例性地，所述微泡的平均粒径还可以为200nm，300nm，400nm，500nm，600nm，700nm，800nm，900nm等等，以及任意两点值所形成的区间范围。
为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：
本发明公开一种制备上述微泡的方法，包括如下步骤：
将靶向分子、支撑分子和磷酸分子按比例加入到二氯甲烷和甲醇混合液中，溶解后，减压蒸馏至干，加入去离子水，在10-60℃下搅拌5-120min自组装即得。
为达到上述第三个目的，本发明采用下述技术方案：
本发明公开一种治疗幽门螺杆菌感染的多功能微泡，所述多功能微泡包括如上所述的微泡以及负载在微泡脂质双分子间隙内的光敏剂。
进一步，所述光敏剂的结构如下所示：
。
当然，在光敏剂选择时，可以选择一种或多种临床应用于幽门螺杆菌治疗的光敏化合物，只要保证其在体系内的比例关系即可。
为达到上述第四个目的，本发明采用下述技术方案：
本发明公开一种制备如上多功能微泡的方法，包括如下步骤：
将靶向分子、支撑分子、光敏剂和磷酸分子按比例加入到二氯甲烷和甲醇混合液中，溶解后，减压蒸馏至干，加入去离子水，在10-60℃下搅拌5-120min自组装得到多功能微泡。
进一步，所述光敏剂在二氯甲烷和甲醇混合液中的浓度为0.001- 40μg/mL。
进一步，所述靶向分子、光敏剂、支撑分子和磷酸分子的质量比1:1- 10:0.1-50:5-500；示例性地所述靶向分子、光敏剂、支撑分子和磷酸分子还可以为1:1-10:5-50:5-500，1:1-10:10-50:5-500，1:1-10:15-50:5-500，1:1-10:20-50:5-500，1:1-10:25-50:5-500，1:1-10:30-50:5-500，1:1-10:35-50:5-500，1:1-10:40-50:5-500，1:1-10:45-50:5-500，1:1-10:10-20:5-500，1:1-10:10-30:5-500，1:1-10:10-40:5-500，1:1-10:20-40:5-500，1:1-10:10-50:50-500，1:1-10:10-50:5-500，1:1-2:1-5:10-100，1:1-2:1-10:10-100，1:1-2:1-20:10-100，1:1-2:1-30:10-100，1:1-2:1-40:10-100，1:1-2:1-5:10-200，1:1-2:1-5:10-300，1:1-2:1-5:10-400，1:1-2:1-5:10-500等等。在配方使用时，靶向分子和磷酸分子可以任意选自对应通式结构中一种或多种组合的化合物，只要保证四种物质的比例关系在设定的范围内即可。
进一步，所述多功能微泡的平均粒径为100nm-1000nm；示例性地，所述微泡的平均粒径还可以为200nm，300nm，400nm，500nm，600nm，700nm，800nm，900nm等等，以及任意两点值所形成的区间范围。
为达到上述第五个目的，本发明公开一种利用如上多功能微泡在制备治疗幽门螺杆菌的光动力治疗药物、声动力治疗药物或光声联合治疗药物中的应用。
在一个具体的实施方式中，光动力治疗测试或光声联合治疗测试选择的光源为激光或LED光源；优选地，所述光源的波长为400-750nm，所述光照时间为0.1-120min，光照强度为2-1000mW/cm2。
在一个具体的实施方式中，声动力治疗测试或光声联合治疗测试的超声强度为1MHz，500mW/cm2，超声时间为1-30分钟。
本发明的有益效果如下：
本发明公开一种治疗幽门螺杆菌感染的多功能微泡，制备及其应用。本发明通过自组装过程成功制备出一种治疗幽门螺杆菌感染的多功能微泡，可有效改善现有技术中药物靶向性差、耐药性强、安全性差、治疗效果不显著等问题，具备如下优势：
（1）靶向性好：利用靶向分子上的巯基基团能与幽门螺杆菌的细胞膜良好结合和靶向识别的特点，使制备的微泡可以靶向识别幽门螺杆菌，从而减少对其他微生物或细胞的结合，提高治疗过程的安全性。
（2）治疗效果好：多功能微泡通过声动力产生的空化效应可以直接杀伤细菌，也能加速非均相物质间的扩散，进而产生与外部氧气环境连通的通道，增加生物被膜内氧气的含量，随着氧气含量的提升，也就增强了光动力治疗的效果，从而实现了光动力-声动力联合治疗幽门螺杆菌感染的目的，展现了较好的应用前景。
（3）耐药性弱：该多功能微泡不易产生耐药性，幽门螺杆菌根除率较高。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出实施例1制得的微泡1a的粒径分布图片。
图2示出实施例2制得的微泡1b的共聚焦显微镜成像照片。
图3示出实施例3中制得的多功能微泡1c的共聚焦显微镜成像照片。
图4示出实施例1中制得的微泡1a与幽门螺杆菌结合后的扫描电镜照片。
图5示出实施例1中制得的微泡1a在超声条件下产生活性氧能力的曲线。
图6示出实施例9不同样品在不同条件下的抑菌实验对比。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
微泡1a的制备：
靶向分子T1-1的结构式如下：
；
具有两亲性的磷酸分子T3-1的结构式如下：
；
具有两亲性的磷酸分子T4-1的结构式如下，其中所述T4-1为DSPE-mPEG2000：
；
化合物T3-1、T4-1和胆固醇可以通过商业购买获得，化合物T1-1的合成方法，参照WO9929349。
将9.8mg化合物T3-1、1.8mg化合物T4-1、1mg胆固醇和1mg化合物T1-1溶于三氯甲烷与甲醇的混合溶剂（v/v=3:5，5ml）中，搅拌使其充分溶解。减压蒸馏除去有机溶剂，得到一层白色薄膜。加入5ml去离子水，在45℃，空气条件下搅拌10 min，获得乳白色溶液，即得到微泡1a。
实施例2
微泡1b的制备：
靶向分子T1-2的结构式如下：
；
化合物T3-1、化合物T4-1和胆固醇可以通过商业购买获得，其中所述T4-1为DSPE-mPEG2000，化合物T1-2的合成方法，参照WO9929349。
将9.8mg化合物T3-1、1.8mg化合物T4-1、1mg胆固醇和1mg化合物T1-2溶于三氯甲烷与甲醇的混合溶剂（v/v=3:5，5ml）中，搅拌使其充分溶解。减压蒸馏除去有机溶剂，得到一层白色薄膜。加入5ml去离子水，在45℃，空气条件下搅拌10min，获得乳白色溶液，即得到微泡1b。
实施例3
治疗幽门螺杆菌感染的多功能微泡1c的制备：
光敏剂P3的结构式如下：
；
化合物T3-1、化合物T4-1和胆固醇可以通过商业购买获得，其中所述T4-1为DSPE-mPEG2000，化合物T1-1的合成方法，参照WO9929349，光敏剂P3的合成方法，参照CN106467487。
将9.8mg化合物T3-1、1.8mg化合物T4-1、1mg胆固醇、1mg化合物T1-1和2mg光敏剂P3溶于三氯甲烷与甲醇的混合溶剂（v/v=3:5，5ml）中，搅拌使其充分溶解。减压蒸馏除去有机溶剂，得到一层红色薄膜。加入5ml去离子水，在45℃，空气条件下搅拌10 min，获得黄色溶液，透析24h除去未包覆的光敏剂P3。即得到多功能微泡1c。
实施例4
对实施例1中制备的微泡1a进行动态光散射测试：
将实施例1中制备的微泡1a用去离子水稀释至一定浓度，进行动态光散射测试。图1为获得的粒径分布数据，实施例1中的微泡的平均粒径约为650nm，粒径分布在100nm-1000nm之间。
实施例5
对实施例1中制备的微泡1a进行共聚焦显微镜成像测试：
将实施例1中制备的微泡1a用去离子水稀释，将溶液滴在盖玻片上，用另一片盖玻片夹紧，用滤纸从侧面吸出多余水分，进行共聚焦显微镜成像测试。图2为获得的显微镜下照片，实施例1中的微泡呈圆形，中间的明亮部分说明微泡为中空结构，圆圈的深色部分为微泡的外膜。
实施例6
对实施例3中制备的多功能微泡1c进行共聚焦显微镜成像测试：
将实施例3中制备的多功能微泡1c用去离子水稀释，将溶液滴在盖玻片上，用另一片盖玻片夹紧，用滤纸从侧面吸出多余水分，进行共聚焦显微镜成像测试。图3为获得的显微镜下照片，实施例3中的多功能微泡呈圆形，在488nm激光的激发下，可以观察到荧光，荧光主要集中在多功能微泡的膜部分，说明光敏剂P3主要集中在多功能微泡1c的脂质双分子间隙内。
实施例7
对实施例1中制备的微泡1a进行扫描电镜观察与幽门螺杆菌的靶向结合：
取适量的菌悬液与微泡混合，3500rpm离心15min去上清，见细菌沉淀绿豆样大小。弃培养基，用PBS轻轻漂洗三次。弃PBS后，加入电镜固定液，将细菌吹散悬浮于固定液内，室温固定2h。使用乙醇梯度（25%、50%、75%、95%、100%）脱水三次。脱水后，乙酸异戊酯固定，制备50-70nm的超薄切片，喷金冻干后进行扫描电镜观察。图4为扫描电镜下拍摄的照片，棒状物体为幽门螺杆菌，球形物体为微泡，可以看出微泡和幽门螺杆菌具有较好的结合。
实施例8
测试实施例1中制备的微泡1a的空化效应。
取15ml的去离子水，加入5mg 对苯二甲酸（sigma，40818，166.13g/mol）和93μL1mol/L的NaOH，搅拌4h（转速400r/min），配成浓度为2mmol/L（pH=10.3）的对苯二甲酸碱性溶液。取100μL的微泡分别加入一定体积的对苯二甲酸溶液中，超声（1MHz，500mW/cm2）作用10min。超声结束后避光保存，使用荧光分光光度计测量发射光谱（激发波长310nm；发射波长425nm）。图5为测试获得的荧光谱图，可以看出在加入微泡后，进行超声时产生的荧光信号最强，说明实施例1的微泡1a有较好的空化效应。
实施例9
测试实施例3中制备的多功能微泡1c在光动力-声动力联合治疗幽门螺杆菌的效果。
取培养好的幽门螺杆菌的单个菌落，用比浊仪调整菌悬液为0.1McF，接种于96孔板中，每孔添加100μL菌悬液。将待实验幽门螺杆菌分为四组：空白组、光照组、光照+超声组、光照+超声+多功能微泡组。空白组每孔加100μL PBS，光照组、光照+超声组每孔加100μL的5μM光敏剂P3（终浓度为2.5μM），光照+超声+多功能微泡组添加多功能微泡1c，使光敏剂P3终浓度为2.5μM，避光孵育30min。孵育结束后，空白组继续孵育10min，光照组使用532nm、40mW/cm2的激光照射10min，光照+超声组及光照+超声+多功能微泡组使用532nm、40mW/cm2的激光和1MHz、500mW/cm2的超声同时处理10min。
处理结束后，每孔各取100μL菌悬液接种于哥伦比亚血平板，并用涂布棒涂匀，置于微需氧袋中37℃培养3天，观察各平板单个菌落的形成情况。
从图6可以看出，空白对照组中幽门螺杆菌的生长是最多的，光照组和超声组有一定的幽门螺杆菌灭活效应，光照+超声+多功能微泡组具有更好的幽门螺杆菌灭活效果。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种微泡，其特征在于，包括脂质双分子外壳和包裹在脂质双分子外壳内部的气体；所述脂质双分子外壳由至少一种含巯基的靶向分子，支撑分子，以及至少一种具有两亲性的磷酸分子共同自组装形成；
所述靶向分子选自如下T1-1或T1-2所述化合物：
；/>；
所述支撑分子选自胆固醇；
所述磷酸分子选自如下T3-1或T4-1所示化合物，其中所述T4-1为DSPE-mPEG2000：
；
；
所述靶向分子、支撑分子和磷酸分子的质量比为1:1-5:5-50。
2.根据权利要求1所述的微泡，其特征在于，所述微泡的平均粒径为100nm-1000nm。
3.一种如权利要求1-2任一所述的微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将靶向分子、支撑分子和磷酸分子按比例加入到二氯甲烷和甲醇混合液中，溶解后，减压蒸馏至干，加入去离子水，在10-60℃下搅拌5-120min自组装即得。
4.一种治疗幽门螺杆菌感染的多功能微泡，其特征在于，所述多功能微泡包括如权利要求1-2任一所述的微泡以及负载在微泡脂质双分子间隙内的光敏剂。
5.根据权利要求4所述的多功能微泡，其特征在于，所述光敏剂的结构如下所示：
。
6.一种如权利要求4或5所述的多功能微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将靶向分子、支撑分子、光敏剂和磷酸分子按比例加入到二氯甲烷和甲醇混合液中，溶解后，减压蒸馏至干，加入去离子水，在10-60℃下搅拌5-120min自组装得到多功能微泡。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述光敏剂在二氯甲烷和甲醇混合液中的浓度为0.001-40μg/mL。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述靶向分子、光敏剂、支撑分子和磷酸分子的质量比1:1- 2:1-5:5-50。
9.如权利要求4或5所述的多功能微泡在制备治疗幽门螺杆菌感染的光动力治疗药物、声动力治疗药物或光声联合治疗药物中的应用。
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