WO2019004669A2 - 광감작제를 포함한 마이크로버블-나노입자 복합체 및 이를 포함하는 항암 치료제 - Google Patents

광감작제를 포함한 마이크로버블-나노입자 복합체 및 이를 포함하는 항암 치료제 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a microbubble-nanoparticle complex containing a photosensitizer and to an anticancer therapeutic agent containing the same, and more particularly, to a microbubble-nanoparticle complex containing a photosensitizer, which can be simultaneously used as an ultrasound contrast agent, a photodynamic therapeutic agent, and a chemical drug therapeutic agent, To a microbubble-nanoparticle complex capable of selectively delivering a drug and a photosensitizer to a tissue, and an anticancer therapeutic agent containing the same.
  • Photodynamic therapy is a technique that can treat intractable diseases such as cancer without surgery by using a photosensitizer with selectivity and photosensitivity to various tumors. It is a side effect such as a chemotherapeutic agent Is a kind of curative law without.
  • a photosensitizer is administered to a subject by intravenous injection, and the excited photosensitizer activates the oxygen molecule to convert it into a singlet oxygen or a new radical To selectively attack and collapse cancer cells and various tumor tissues.
  • Photodynamic therapy can remove only diseased cells while preserving normal cells. In most cases, the risk of general anesthesia can be ruled out, and the operation is easy because it can be operated with only local anesthesia. Therefore, there is no need to remove damaged organs, and there is an advantage in that the recovery is quick after the minimally invasive procedure, the hospitalization period is shortened, and the patient's welfare is improved.
  • photodynamic therapy using a photosensitizer is a method in which a photosensitizer is administered to a subject by intravenous injection and then the appropriate light is irradiated to induce selective attack or death of cancer cells or tumor tissue.
  • a photosensitizer is administered to a subject by intravenous injection and then the appropriate light is irradiated to induce selective attack or death of cancer cells or tumor tissue.
  • conventional anticancer drugs widely used in drug therapy have anticancer effects, but they exhibit cytotoxicity, so they affect not only cancer cells but also normal cells, and often exhibit undesirable side effects.
  • cancer patients who have received medication experience side effects such as bacterial infections, natural hemorrhage, hair loss, nausea and vomiting due to reduction of red blood cells, white blood cells and platelets. Therefore, there is a growing need for a targeted drug delivery system that selectively attacks cancer cells without affecting surrounding normal cells.
  • the present invention provides a drug delivery system that can be simultaneously used as an ultrasound contrast agent, a photodynamic therapy agent, and a chemical drug treatment agent.
  • the present invention provides a drug delivery system capable of selectively delivering to cancer cells.
  • One aspect of the present invention is
  • the present invention also relates to a microbubble-nanoparticle complex.
  • the present invention relates to a method for preparing nanoparticles, comprising the steps of: preparing a nanoparticle containing a photosensitizer, a microbubble filled with a gas, and a drug; And mixing the nanoparticles with the microbubbles in water at a predetermined ratio and reacting the nanoparticles with the microbubbles.
  • the micro bubble structure When the bubble structure is destroyed by ultrasonic waves, the micro bubble is converted into a micelle or a liposome of tens of nanometers containing a photosensitizer, And when the laser is irradiated to the photosensitizer, oxygen is generated in the form of active oxygen or radical to destroy the cancer cells,
  • the nanoparticles are related to an anticancer therapeutic agent which is sonoporated with cancer cells by the ultrasound, selectively moved, and releases anticancer drugs for a predetermined time.
  • the complex of the present invention contains a gas for ultrasound contrast agent and a photosensitizer substance in the microbubble, and the nanoparticles bonded to the microbubble surface contain the drug, they can be used simultaneously as an ultrasound contrast agent, a photodynamic therapy agent, and a chemical drug treatment agent have.
  • the complex of the present invention can provide an ultrasound image of a lesion tissue using gas filled in the microbubble core part when the ultrasound is irradiated, and it is also possible to provide a microbubble in a small size micelle containing a photosensitizer The liposomes can be destroyed to efficiently penetrate and accumulate drugs and photosensitizers into the lesion tissue.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of a microbubble-nanoparticle composite according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram illustrating the mechanism of action of the microbubble-nanoparticle complex.
  • FIG. 3 is a confocal fluorescence microscope image of the microbubble-nanoparticle composite prepared in Example 1.
  • FIG. 4 shows particle sizes of microbubbles (MBs), nanoparticles (HSA NPs), and complexes (NPs-MBs) bonded thereto prepared in the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing an image obtained by photographing microbubbles before and after being destroyed by ultrasonic waves and an average size thereof.
  • Figure 7 shows the degree of active oxygen production for Ce6 microbubbles.
  • FIG. 10 shows the results of measuring the cell survival rate of whether the combined therapeutic effect is sufficiently generated for the actual cancer cell model by fusing the physical properties of the particle, the photodynamic therapy effect, and the sonoporation effect.
  • FIG. 1 is a conceptual view of a microbubble-nanoparticle composite according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a schematic view illustrating an action mechanism of a microbubble-nanoparticle composite.
  • the microbubble-nanoparticle complex of the present invention includes microbubbles and nanoparticles.
  • the microbubbles can be photosensitizers and gas-filled microspheres, gas-filled liposomes or gas-forming emulsions.
  • the microbubble may be a microsized liposome based on phospholipids filled with the photosensitizer and gas.
  • the liposome is formed by an amphipathic compound comprising a phospholipid.
  • amphipathic compounds are typically arranged at the interface between the aqueous medium and an essentially water-insoluble organic solvent to stabilize the emulsified solvent droplets.
  • the amphipathic compound includes a compound having a hydrophilic extreme head portion (e.g., a polar or ionic group) capable of reacting with an aqueous medium and a molecule having a hydrophobic organic tail portion (e.g., a hydrocarbon chain) capable of reacting with an organic medium do.
  • the amphipathic compound may be a mixture of two immiscible liquids (e.g., water and oil), a mixture of liquid and gas (e.g., gas microbubbles in water), or a mixture of liquid and insoluble particles ) Is a compound capable of stabilizing a mixture of substances which are not normally miscible with other methods.
  • two immiscible liquids e.g., water and oil
  • a mixture of liquid and gas e.g., gas microbubbles in water
  • a mixture of liquid and insoluble particles Is a compound capable of stabilizing a mixture of substances which are not normally miscible with other methods.
  • an inert gas and water are injected into the dried phospholipid thin film and the photosensitizer, and then ultrasonicated to form a photosensitizer and a liposome filled with a contrast agent gas therein.
  • the liposome forms a microbubble by using a combination of ultrasonic waves and a mechanical agitation method
  • the gas for contrast agent is filled in a microbubble core region
  • the photosensitizer is an intermediate layer formed by a hydrophobic organic tail portion Inner side) of the container.
  • the photosensitizer may be of a hydrophobic nature.
  • the photosensitizer is simply physically bonded to the lipid forming the microbubble without chemical bonding.
  • the microbubble structure is destroyed by ultrasonic waves, the microbubbles are converted into nano-sized liposomes or micelles.
  • the photosensitizer is carried on the hydrophobic sites of liposomes and micelles, .
  • amphiphilic phospholipid known compounds can be used.
  • DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC
  • DOPE 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DMPE 1,2-dimyristoyl-sn- 3-phosphatidylethanolamine
  • DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • amphiphilic phospholipid compound may use a modified phospholipid compound.
  • a modified phospholipid is phosphatidylethanolamine (DMPE-PEG) or phosphoethanolamine (DSPE-PEG) which is modified with polyethylene glycol (PEG), and the like, as modified phospholipids to which polyethylene glycol .
  • amphiphilic phospholipid compound used in the present invention may comprise NHS (Nhydroxy succinimide) to form an amide bond.
  • NHS Nhydroxy succinimide
  • an additional amphipathic substance may be further included.
  • amphipathic substance examples thereof include lysozyme, stearic acid, polyethylene glycol, polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene fatty acid stearate, polyoxyethylene Fatty alcohol, and the like.
  • the gas to be filled in the liposome may be a known gas without limitation.
  • carbon dioxide, helium, nitrogen, argon, sulfur hexafluoride or perfluorinated gas may be used.
  • the gas is preferably a fluoride-containing fluoride, and examples thereof include perfluoropropane (C3F8), sulfur hexafluoride (SF6), perfluoropentane, decafluorobutane and perfluoro There is perfluorohexane.
  • the photosensitizer may be selected from the group consisting of a phorphyrins compound, a chlorine compound, a bacteriochlorins compound, a phthalocyanine compound, a naphthalocyanines compound, and a 5-aminoevuline esters) compounds.
  • the photosensitizer may be selected from the group consisting of chlorin e6, hematoporphyrin, 5-aminolevulinic acid (ALA), purpurin, benzoporphyrin, and phthalocyanine.
  • the micro bubble may have a diameter of 0.1 to 10 ⁇ , preferably 1 to 10 ⁇ .
  • the micro bubble may reflect ultrasonic waves or break the bubble structure depending on the intensity of the irradiated ultrasonic waves. For example, when the micro bubble is irradiated with an ultrasonic wave of 0.35 MPa or less, an ultrasound image of the lesion tissue can be obtained without breaking the micro bubble.
  • the micro bubble when the micro bubble is irradiated with an ultrasonic wave of 0.35 MPa or more, the micro bubble can be destroyed.
  • the liposome forming the skeleton of the microbubble is transformed into a micelle or liposome of a size of several tens to several hundred nanometers.
  • the gas filled in the micro bubble provides a pressure wave at the same time as the destruction of the bubble structure, so that the photosensitizer, micelle, liposome, and nanoparticle can be injected into the lesion tissue as an ultrasonic wave to contribute to enhancement of the delivery efficiency.
  • the photo sensitizer supported on the micelle or liposome may be excited to generate active oxygen or radical oxygen.
  • the nanoparticles contain a drug therein.
  • the nanoparticles may contain albumin to form self-aggregates.
  • a cohesive protein can be used as the nanoparticles.
  • the nanoparticles can circulate in the blood for a long period of time, maintain a cohesive structure, stably transfer the drug, and use known albumin having cancer targeting properties.
  • the albumin may be human serum albumin or a fragment thereof.
  • the nanoparticles may have a diameter of 156.02 ⁇ 65.76 nm, preferably 100 to 300 nm.
  • drugs contained in the nanoparticles those which can be loaded on the known albumin can be used without limitation.
  • drugs include but are not limited to docetaxel, cis-platin, camptothecin, paclitaxel, tamoxifen, anasterozole, Gleevec, 5-fluorouracil (5-FU), Floxuridine, Leuprolide, Flutamide, Zoledronate, Doxorubicin, Vincristine, Gemcitabine ), Streptozocin, Carboplatin, Topotecan, Belotecan, Irinotecan, Vinorelbine, Hydroxyurea, Valrubicin, ), Retinoic acid series, methotrexate, Meclorethamine, Chlorambucil, Busulfan, Doxifluridine, Vinblastine Vinblastin, Mitomycin, Prednisone, Testostron (Testost) erogen, mitoxantron, aspirin, salicylates, ibu
  • the nanoparticles may be bound to microbubbles by an activated reactor of a linker or microbubble surface.
  • the reactor may be a thiol or an amine or the linker may be a compound containing the above-mentioned reactor.
  • the microbubble and the nanoparticles may be amide bonds between them.
  • the bond may be formed by an amide bond occurring between a carboxyl group in the microbubble and an amine group contained in a majority of the albumin.
  • the composite of the present invention contains a gas for ultrasound contrast agent and a photosensitizer substance in the microbubble, and the nanoparticles bonded to the microbubble surface contain the drug, the ultrasound contrast agent, the photodynamic therapeutic agent, and the chemical drug therapeutic agent Can be used at the same time.
  • the present invention includes a step of preparing nanoparticles each containing a photosensitizer and a microbubble filled with a gas, and a step of mixing the nanoparticles with the microbubbles in water at a predetermined ratio and reacting To a method for producing microbubble-nanoparticle complexes.
  • the step of preparing the microbubbles includes a step of preparing each of a lipid solution and a photosensitizer solution, a step of mixing and drying, and a hydration and an ultrasonic treatment step.
  • the lipid solution is formed by mixing a lipid and a lipid derivative having NHS with a solvent. More specifically, the lipid solution may be formed by adding a lipid: NHS-containing lipid derivative in an amount of 7 to 9: 1 to 3 in an organic solvent (for example, chloroform).
  • an organic solvent for example, chloroform
  • the amphiphilic phospholipid compound described above can be used.
  • the method may include adding an emulsifier when preparing the lipid solution.
  • the emulsifier include lysozyme, stearic acid, polyethylene glycol, polyoxyethylene, fatty acid esters, polyoxyethylene fatty acid stearate, and polyoxyethylene fatty alcohol.
  • the photosensitizer solution may be formed by mixing the photosensitizer in an organic solvent (e.g., methanol).
  • an organic solvent e.g., methanol
  • the two solutions are mixed at a predetermined ratio, an inert gas is added thereto, and the mixture is allowed to stand for a predetermined time to evaporate the solvent.
  • the method comprises 10 to 20 parts by weight of the photosensitizer relative to 100 parts by weight of the lipid (sum of lipid + NHS-containing lipid derivatives).
  • the method can evaporate the solvent to obtain a thin film in which the lipid and photosensitizer are mixed.
  • the method includes the steps of hydrating a mixed thin film of lipid and photosensitizer into water, injecting the gas at a high pressure, and ultrasonic processing.
  • water, glycol, and a mixture of glycerin are added to a vessel containing the mixed thin film, and the mixture is melted while maintaining the temperature at 55 to 60 ° C.
  • Ultrasonic processing is performed by putting gas (C3F8) a mechanical agitation method may be used in combination with stirring to prepare a microbubble carrying a photosensitizer.
  • the albumin forms self-aggregates.
  • the nanoparticles may be bonded to the microbubble surface using a phospholipid derived from a linker or a chemical reactor.
  • the linker or the reactor may include a thiol group, an amine group, biotin-avidin group, or the like.
  • the microbubble and the nanoparticles may be amide bonds between them.
  • the bond may be formed by an amide bond occurring between a carboxyl group in the microbubble and an amine group contained in a majority of the albumin.
  • the NHS present on the microbubble surface is hydrolyzed to water, and the carboxyl groups remaining on the microbubble surface and the amine groups present in the nanoparticles can be amide bonded.
  • the mixing ratio of the nanoparticles and the microbubbles may be 1: 0.5 to 2 in terms of the molar ratio of the coupling reactor.
  • the present invention relates to an anticancer therapeutic agent (photodynamic therapy body).
  • the anticancer therapeutic agent may be a complex of microbubbles and nanoparticles as described above.
  • microbubbles are filled with a photosensitizer and a gas for an ultrasound contrast agent.
  • the nanoparticles are attached to the surface of the microbubble multiple times and contain the drug.
  • the micro bubble structure When the bubble structure is destroyed by ultrasonic waves, the micro bubble is converted into a micelle or a liposome of tens of nanometers containing a photosensitizer, And when the laser is irradiated to the photosensitizer, active oxygen or radical oxygen is generated to destroy the cancer cells.
  • the nanoparticles can be sonoporated with cancer cells by the ultrasonic waves, selectively move, and release anticancer drugs for a predetermined time.
  • 1,2-disteraoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), DSPE-PEG2000-NHS (1,2- dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine- hydroxysuccinimide) were mixed in a molar ratio of 9: 1 and dissolved in chloroform.
  • Ce6 was dissolved in methanol at 5 mg / ml. Then, 50 ⁇ l and 10 ⁇ l of each of the above two solutions were added to glass vials, and nitrogen was added thereto. It was stored in a vacuum condition for more than 2 hours to completely evaporate the solvent and completely dry.
  • the microbubbles carrying the physical (hydrophobic) properties of Ce6 as described above do not require a chemical reaction and purification process due to the chemical bonding between the lipid molecules and Ce6, so that the manufacturing cost and time are very efficient .
  • this method can be used not only in the kind of the photosensitizer exhibiting similar characteristics, it is not necessary to consider a reactor using a chemical reaction, and the material to be applied is very comprehensive. In terms of loading efficiency, it shows about 33% efficiency when it is prepared at 10% weight ratio to lipid. This indicates a photosensitizer concentration of 16.5 / / ml in a bubble prepared with 0.5 mg / ml of lipid, which is a sufficient concentration for photodynamic therapy. In particular, it is possible to treat at a significantly lower concentration than the clinically used Ce6 concentration (0.1 ⁇ 2.5 mg / kg) because of its advantage that it can be delivered only to local lesions, not to the form in which Ce6 is distributed throughout the whole body.
  • Nanoparticles were formed. Then, the mixture was stirred at room temperature for about 24 hours to evaporate the ethanol to form crosslinking. Thereafter, the precipitated particles were allowed to settle through centrifugation (13,200 rpm, 10 minutes), the unreacted material was removed by separating / redispersing the upper layer solution, and finally centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes. Size particles to obtain only nanoparticles.
  • the nanoparticles thus obtained and the microbubbles were mixed at a molar ratio of 1: 0.5 to 2 for 2 hours at room temperature to bind the nanoparticles to the microbubbles by amide bond. Unbound HSA nanoparticles were removed by centrifugation.
  • EDC and NHS are sufficiently added in advance to supplement the NHS lost during the microbubble production process, and the remaining EDC and NHS are washed with a centrifuge to increase the coupling efficiency.
  • FIG. 3 is a confocal fluorescence microscope image of the microbubble-nanoparticle composite prepared in Example 1.
  • FIG. FIG. 3 shows the binding of the microbubble-nanoparticles using a fluorescence dye.
  • the fluorescent dye used was FITC, which represents green color
  • DiIC18 which represents red color.
  • HSA-NPs were coated with green color by adding 10-20% of FITC-conjugated bovine serum albumin.
  • Microbubbles were labeled by loading lipophilic DiIC18 between the bilayers of microbubbles. Referring to the merged picture of FIG. 3, it was confirmed that the nanoparticles bonded with the green fluorescent material were well bonded to the surface of the microbubble bearing the red fluorescent material.
  • FIG. 4 shows particle sizes of microbubbles (MBs), nanoparticles (HSA NPs), and complexes (NPs-MBs) bonded thereto prepared in the present invention.
  • microbubbles showed particle sizes ranging from 1 to 10 ⁇ m, and nanoparticles ranged from 100 to 400 nm.
  • FIG. 5 is a graph showing an image obtained by photographing microbubbles before and after being destroyed by ultrasonic waves and an average size thereof.
  • the average particle size of microbubbles before destruction by ultrasonic waves was about 2217.45 nm, and the bubble particles were clearly photographed in the images.
  • the size of the particles measured after the microbubbles were destroyed after the application of the ultrasonic waves was only 98.10 nm. As a result, particles were not captured in the image photographs.
  • FIG. 5 shows that after a bubble is broken by ultrasonic waves, a bubble of several to several tens of micro-sized is transformed into a micelle or a liposome of several tens of nanometers.
  • Such particle size reduction of the microbubble shows that accumulation of the photosensitizer in the tumor may be easier (using the enhanced permeability and retention (EPR) effect).
  • EPR enhanced permeability and retention
  • Ce6-loaded microbubbles show two peaks shifted by about 6 nm and 50 nm from the original Ce6 absorbance.
  • FIG. 6 shows that when ultrasound is applied to Ce6-supported bubbles to change into liposome or micelle form (the result of FIG. 5), they are still shifted.
  • Figure 7 shows the degree of active oxygen production for Ce6 microbubbles.
  • DCFDA irradiation method was used to experimentally verify the production of reactive oxygen species in the microbubble - nanoparticle complex supported with Ce6 as a photosensitizer by laser irradiation. This is a method of preliminarily introducing an active oxygen labeling agent into a cell and examining the release of fluorescence according to the presence of active oxygen.
  • the laser was processed at 671 nm and 100 mW / cm 2 for 30 seconds.
  • the Ce6-microbubbles (Ce6-MBs) of the present invention and the nanoparticles -Ce6-microbubbles (DOX) of the present invention as compared to the control (CTL) and the positive control group (TBHP -NPs / Ce6-MBs) was irradiated with ultrasound to break down the microbubbles and enter the cells in the form of liposome or micelle. As a result, it was confirmed that a sufficient amount of active oxygen was generated by generating fluorescence remarkably high.
  • Fig. 8 shows the effect of sonoporation according to ultrasonic irradiation on microbubbles.
  • sonoporation is effected by breaking the bubbles when ultrasonic waves are applied, and high drug delivery efficacy can be expected for surrounding cells or tissues.
  • the cell lines were treated with ultrasonic waves at 0.2 W / cm 2 and 50% duty cycle for 30 seconds, and then the effect of the anticancer agent and the photosensitizer was confirmed.
  • the case where the ultrasound is not applied to the cell is found in the form of a specific structure inside the cell (liposome or endosome such as intracellular microenvironment) Able to know.
  • the photosensitizer delivered by the intracellular digestion mechanism may be decomposed and excreted, resulting in insufficient effect, or there may be a limit that active oxygen is produced only in the local site.
  • the ultrasonic wave is applied to induce the sonoporation effect of the bubble, it can be confirmed that not only the amount of the photosensitizer is increased, but also it is spread throughout the cytoplasm.
  • the release of the photosensitizer to the target more efficiently occurs through ultrasound, which verifies that more efficient drug delivery is possible not only at the cellular level but also throughout the tissue. Therefore, it is possible to perform photodynamic treatment for a wider range of lesion tissues by laser irradiation.
  • FIG. 9 shows the effect of microbubble sonoporation on spheroid cell population via 3D-culture.
  • FIG. 9 is a result of forming a tumor cell spheroid through 3D-culture to simulate an environment similar to pancreatic cancer tissue, and further confirming the introduction effect of the nanoparticle itself on the tumor cell spheroid.
  • the ultrasonic wave was processed at 2.0 W / cm 2 and 50% duty cycle for 30 seconds.
  • the Ce6-supported bubble is transformed into a liposome-like form carrying Ce6.
  • the nanoparticles carrying the anticancer agent attached to the surface of the bubble are immediately transferred to the surrounding lesion tissue by the sonoporation effect.
  • the liposome carrying Ce6 has the EPR effect through the enlarged blood vessel wall cell gap due to the sonoporation effect, And is transmitted to surrounding tissues by the continuous sonoporation effect of.
  • Ce6 since it is easy to release into the surrounding tissues in bubbles or liposomes, the photodynamic therapy can be applied to a wider range of lesion tissues and cells, compared with a chemically bonded lipid molecule.
  • FIG. 10 shows the results of measuring the cell survival rate of whether the combined therapeutic effect is sufficiently generated for the actual cancer cell model by fusing the physical properties of the particle, the photodynamic therapy effect, and the sonoporation effect. The efficacy of the combined treatment for cancer cells can be verified through FIG.
  • DOX-NPs / MBs DOX-nanoparticles
  • Ce6, microbubbles NPs / Ce6-MBs
  • NPs / Ce6-MBs Ce6 microbubbles
  • the concentration of Ce6 was 1 ⁇ DOX, the concentration of the drug was 100 ⁇ , and the laser was treated with 30 seconds at 671 nm, 1.0 J / cm 2 , 0.2 W / cm 2 for ultrasound, and 5 seconds at 50% duty cycle.
  • the cell line was an MIA-paca-2 human pancreatic cancer cell line and cultured for a total of 48 hours.
  • microbubble-nanoparticle complex (DOX-NPs / Ce6-MBs) of the present invention when the microbubble-nanoparticle complex (DOX-NPs / Ce6-MBs) of the present invention was irradiated with laser + ultrasonic waves, overall cell death efficiency was higher than other particles. This confirms that the combination therapy has higher anticancer efficacy than the single treatment.
  • the microbubble-nanoparticle complex (DOX-NPs / Ce6-MBs) according to the present invention did not add laser or ultrasonic wave or applied only one kind of laser or ultrasonic wave, , It was confirmed that the cell death efficiency can be maximized.
  • the microbubble-nanoparticle complex (DOX-NPs / Ce6-MBs) of the present invention improved cell death efficiency by at least 10% or more as compared with all other groups.
  • the complex of the present invention can be used as an ultrasound contrast agent, a photodynamic therapeutic agent, and a chemical drug therapeutic agent.

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Abstract

본 발명은 초음파 조영제, 광역학 치료제 및 화학적 약물 치료제로 동시에 사용가능하고, 초음파 감응을 통해 특정 암 조직에 선택적으로 약물과 광감작제를 전달할 수 있는 마이크로버블-나노입자 복합체 및 이를 포함하는 항암 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 복합체는 마이크로 버블 내부에 초음파 조영제용 가스와 광감작제 물질을 함유하고, 마이크로 버블 표면에 결합된 나노입자는 약물을 함유하고 있으므로 초음파 조영제, 광역학 치료제 및 화학적 약물 치료제로 동시에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 복합체는 초음파가 조사되면 마이크로 버블 코어 부분에 충진된 가스를 이용하여 병변 조직에 대한 초음파 영상을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 마이크로 버블을 좀 더 작은 크기의 미셀이나 리포좀으로 파괴하여 약물과 광감작제를 병변 조직에 효율적으로 침투 및 축적시킬 수 있다.

Description

광감작제를 포함한 마이크로버블-나노입자 복합체 및 이를 포함하는 항암 치료제
본 발명은 광감작제를 포함한 마이크로버블-나노입자 복합체 및 이를 포함하는 항암 치료제에 관한 것으로서, 보다 자세하게는, 초음파 조영제, 광역학 치료제 및 화학적 약물 치료제로 동시에 사용가능하고, 초음파 감응을 통해 특정 암 조직에 선택적으로 약물과 광감작제를 전달할 수 있는 마이크로버블-나노입자 복합체 및 이를 포함하는 항암 치료제에 관한 것이다.
광역학 치료법(photodynamic therapy, PDT)이란, 각종 종양에 대해 선택성 및 광증감성이 있는 광감작제(photosensitizer)를 이용해 수술 없이 암 등의 난치병을 치료할 수 있는 기술의 하나로서, 화학요법제와 같은 부작용이 없는 일종의 근치법이다. 예컨대 광감작제를 정맥주사에 의해 대상자에 투여하고, 이에 적절한 광(light)을 조사함으로써, 여기(excite)된 광감작제가 산소분자를 활성화시켜 단일항(singlet) 상태의 산소로 변환 혹은 새로운 라디칼을 만들어 암세포나 각종 종양조직만을 선택적으로 공격, 궤멸시키는 것이다.
광역학 치료는 정상 세포를 보존하면서 병든 세포만 선택적으로 제거할 수 있어 대부분의 경우에 전신마취의 위험성을 배제할 수 있고, 간단하게 국소마취만으로도 수술할 수 있기 때문에 시술이 용이하다. 따라서 손상 장기의 적출이 필요 없고 최소 침습의 시술 후 회복이 빠르고 입원 기간을 단축시켜 환자의 복지를 증진시키는 등의 장점이 있다.
하지만, 대부분의 광감작제들은 난용성이며, 인체 잔류시간이 길어 광독성이 크다. 또한 광감작제가 고가이고 인체 내에서 대사가 느려 광독성의 부작용이 발견되고 있으며, 체내 투입 시 광감작제의 뭉침에 의해 치료 효율이 저하되는 문제점이 있다.
현재, 광감작제를 이용한 광역학 치료법은 광감작제를 정맥주사에 의해 대상자에게 투여하고, 이후 적절한 빛(light)을 조사함으로써 암세포나 종양조직을 선택적으로 공격 또는 사멸을 유도하는 것이었으나, 현재의 광역학 치료법은 빛의 투과 제한으로 부피가 큰 종양에는 사용되고 있지 못하며, 종양 내의 광감작제의 농도가 낮아 효율적인 치료 효과를 보이지 못하고 있다.
또한, 약물 치료법에 널리 사용되는 기존의 항암제는 항암효과를 갖지만, 세포독성을 나타내기 때문에 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 영향을 미쳐서 원치 않는 부작용을 나타내는 경우가 많다. 예를 들면, 약물 치료를 받은 암환자는 적혈구, 백혈구 및 혈소판의 감소 등으로 세균감염, 자연출혈, 탈모, 메스꺼움 및 구토의 부작용을 겪게 된다. 따라서, 주변 정상세포에 영향을 끼치지 않고 암세포만을 선택적으로 공격하는 표적지향성 약물전달시스템(targeted drug delivery system)의 필요성이 증가되고 있다.
[참고특허]
한국등록특허 10-1267318
한국등록특허 10-1487088
본 발명은 초음파 조영제, 광역학 치료제 및 화학적 약물 치료제로 동시에 사용 가능한 약물 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명은 암세포에 선택적으로 전달가능한 약물 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양상은
광감작제와 초음파 조영제용 가스가 충진된 마이크로 버블 ; 및
상기 마이크로 버블 표면에 복 수개 부착되고 약물을 함유하는 나노입자 ;를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체에 관련된다.
본 발명은 광감작제와 가스가 충진되는 마이크로 버블과 약물을 함유하는 나노입자를 각각 제조하는 단계 ; 및 상기 나노입자와 상기 마이크로버블을 소정 비율로 물에 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는 마이크로버블-나노입자 복합체의 제조방법에 관련된다.
다른 양상에서, 본 발명은
광감작제와 초음파 조영제용 가스가 충진된 마이크로 버블 ; 및
상기 마이크로 버블 표면에 복 수개 부착되고 약물을 함유하는 나노입자를 포함하되,
상기 마이크로 버블은 조사된 초음파를 반사시켜 영상을 제공하고, 상기 마이크로 버블은 초음파에 의해 버블 구조가 파괴되면, 광감작제가 함유된 수십 나노미터의 마이셀(Micelle) 또는 리포좀(Liposome)으로 변형되어 암세포로 소노포레이션(sonoporation)되어 이동하고, 및 레이저가 상기 광감작제에 조사되면 활성산소나 라디칼 상태의 산소를 발생시켜 상기 암세포를 파괴하고,
상기 나노입자는 상기 초음파에 의해 암세포로 소노포레이션(sonoporation)되어 선택적으로 이동하고, 소정 시간동안 항암 약물을 방출하는 항암 치료제에 관련된다.
본 발명의 복합체는 마이크로 버블 내부에 초음파 조영제용 가스와 광감작제 물질을 함유하고, 마이크로 버블 표면에 결합된 나노입자는 약물을 함유하고 있으므로 초음파 조영제, 광역학 치료제 및 화학적 약물 치료제로 동시에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 복합체는 초음파가 조사되면 마이크로 버블 코어 부분에 충진된 가스를 이용하여 병변 조직에 대한 초음파 영상을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 마이크로 버블을 광감작제를 함유한 작은 크기의 마이셀이나 리포좀으로 파괴하여 약물과 광감작제를 병변 조직에 효율적으로 침투 및 축적시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일구현예에 의한 마이크로 버블-나노입자 복합체의 개념도를 나타낸다.
도 2는 마이크로 버블-나노입자 복합체의 작용 메카니즘을 도시한 개략도이다.
도 3은 실시예 1에서 제조한 마이크로 버블-나노입자 복합체의 confocal fluorescence microscope 이미지이다.
도 4는 본 발명에서 제조된 마이크로 버블(MBs), 나노입자(HSA NPs) 및 이들이 결합된 복합체(NPs-MBs)의 입자 사이즈를 보여준다.
도 5는 초음파에 의해 파괴되기 전과 후의 마이크로 버블을 촬영한 이미지와 평균 크기를 측정한 그래프이다.
도 6은 Ce6가 담지된 마이크로 버블의 흡광 특성을 보여준다.
도 7은 Ce6-마이크로 버블에 대한 활성산소 생성 정도를 보여준다.
도 8은 마이크로 버블에 대한 초음파 조사에 따른 Sonoporation 효과에 따른 cell uptake 를 보여준다.
도 9는 3D-배양을 통한 spheroid 세포에 대한 마이크로 버블의 Sonoporation 효과로 나노입자의 침투효과를 보여준다.
도 10은 입자의 물성, 광역학치료 효능, Sonoporation 효과를 융합하여 실제 암세포 모델에 대하여 복합치료 효능이 충분히 발생하는지에 대한 세포 생존율을 측정한 결과이다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체 예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일구현예에 의한 마이크로 버블-나노입자 복합체의 개념도를 나타내고, 도 2는 마이크로 버블-나노입자 복합체의 작용 메카니즘을 도시한 개략도이다.
도 1을 참고하면, 본 발명의 마이크로 버블-나노입자 복합체는 마이크로 버블 및 나노입자를 포함한다.
상기 마이크로버블은 광감작제와 가스가 충전된 마이크로스피어(microspheres), 가스 충전된 리포좀 또는 가스 포밍 에멀젼(gas-forming emulsions)일 수 있다. 바람직하게는 상기 마이크로버블은 인지질 기반의 리포좀에 상기 광감작제와 가스가 충진되어 마이크로 크기화 된 것일 수 있다.
상기 리포좀은 인지질을 포함하는 양친매성 화합물에 의해 형성된다. 이러한 양친매성 화합물은 전형적으로 수성 매질과 본질적으로 수불용성인 유기용매 간의 계면에 배열되어, 유화된 용매 미세방울을 안정화한다. 상기 양친매성 화합물은 수성 매질과 반응할 수 있는 친수성극 머리 부분(예: 극성 또는 이온성기)과 유기 매질과 반응할 수 있는 소수성 유기 꼬리 부분(예: 탄화수소 사슬)을 가진 분자를 가진 화합물을 포함한다. 양친매성 화합물은 비혼화성인 두 가지의 액체(예: 물과 오일)의 혼합물, 액체와 기체의 혼합물 (예: 물 중에 기체 마이크로버블) 또는 액체와 불용성 입자의 혼합물 (예. 물중에 금속 나노 입자)과 같이 다른 방법으로는 통상적으로 섞일 수 없는 물질의 혼합물을 안정화시킬 수 있는 화합물이다.
특히, 본 발명에서는 건조된 인지질 박막과 광감작제에 비활성 기체와 물을 주입한 후 초음파 처리하여 내부에 광감작제와 조영제용 가스가 충진된 리포좀을 형성할 수 있다.
상기 리포좀은 초음파와 기계적 교반(mechanical agitation) 방법을 병용하여 마이크로 버블을 형성하게 되고, 상기 조영제용 가스는 마이크로 버블 코어 영역에 충진되고, 상기 광감작제는 소수성 유기 꼬리 부분이 구성하는 중간층 (껍질 내부)에 충진되어 담지될 수 있다.
상기 광감작제는 소수성 성질인 것을 사용할 수 있다.
상기 광감작제는 마이크로 버블을 형성하는 지질과 화학 결합 없이 단순히 물리적으로 결합되어 있다. 초음파에 의해 상기 마이크로 버블 구조가 파괴되면, 마이크로버블이 나노크기의 리포좀이나 마이셀로 변환되는데, 이때 광감작제는 리포좀이나 마이셀의 소수성 위치에 담지되어 병변 조직에 좀 더 용이하게 이동 축척될 수 있다.
상기 양친매성 인지질로는 공지된 화합물을 사용할 수 있으며, 일예로는 1,2-디스테아르오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민(1,2-Dimyristoyl-snglycero-3-phosphatidylethanolamine, DMPE), 1,2-디스테아르오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2- distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE) 등이 있다.
또한, 상기 양친매성 인지질 화합물은 변형된 인지질 화합물을 사용할 수 있다. 변형된 인지질의 예는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 첨가된 변형된 인지질의 예는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 함께 변형된 포스파티딜에탄올아민(DMPE-PEG) 또는 포스포에탄올아민(DSPE-PEG) 등이 있다.
바람직하게는, 본 발명에 사용되는 양친매성 인지질 화합물은 아미드 결합을 형성하기 위한 NHS(Nhydroxy succinimide)를 포함할 수 있다.
본 발명에서는 상기 양친매성 화합물 이외에 부가적인 양친매성 물질을 추가로 포함할 수 있는데, 그 일예로는 리소지질, 스테아르산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산스테아르레이트, 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 등이 있을 수 있다.
상기 리포좀 내부에 충진되는 가스는 공지된 기체를 제한 없이 사용할 수 있으며, 일예로서 이산화탄소, 헬륨, 질소, 아르곤, 설퍼 헥사플루오라이드, 퍼플루오르화 기체를 사용할 수 있다. 상기 기체는 불소가스가 포함된 불화물이 바람직하고, 예로는 퍼플루오로프로판(C3F8), 설퍼 헥사플루오라이드(SF6), 퍼플루오로펜탄(perfluoropentane), 데카플루오로부탄 (decafluorobutane) 및 퍼플루오로헥산(perfluorohexane)가 있다.
상기 광감작제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 광감작제는 Chlorin e6, hematoporphyrin, 5-Aminolevulinic acid (ALA), Purpurin, Benzoporphyrin, Phthalocyanine로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 마이크로버블은 직경이 0.1~10㎛, 바람직하게는 1~10㎛일 수 있다.
상기 마이크로 버블은 조사된 초음파의 세기에 따라 초음파를 반사시키거나 버블 구조가 파괴될 수 있다. 예를 들면, 상기 마이크로 버블에 0.35MPa 이하의 초음파를 조사하면, 마이크로버블의 파괴없이 병변조직의 초음파 영상을 얻을 수 있다.
한편, 상기 마이크로 버블에 0.35MPa 이상의 초음파를 조사하면, 마이크로버블은 파괴될 수 있다.
상기 마이크로 버블은 초음파에 의해 버블 구조가 파괴되면, 마이크로 버블의 골격을 형성하는 리포좀은 수십 내지 수백 나노의 좀 더 작은 크기의 마이셀(Micelle) 또는 리포좀(Liposome) 형태로 변형된다. 또한, 마이크로 버블 내부에 충진된 가스는 버블 구조 파괴와 동시에 압력파를 제공하여 초음파와 같이 상기 광감작제, 마이셀, 리포좀 및 나노입자를 병변 조직 내부로 강제 주입하여 전달 효능 향상에 기여할 수 있다.
레이저광이 상기 마이셀 내지 리포좀에 조사되면, 상기 마이셀 내지 리포좀에 담지되어 있는 광감작제가 여기하여 활성산소나 라디칼 상태의 산소를 발생시킬 수 있다.
상기 나노입자는 내부에 약물을 함유한다. 상기 나노입자는 알부민을 포함하여, 자기 집합체(self-aggregates)를 형성할 수 있다.
상기 나노입자로는 응집성이 있는 단백질을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 혈액 내에서 장기간 순환 하면서도 응집 구조가 유지되어 약물을 안정적으로 전달할 수 있고, 암 표적성이 있는 공지된 알부민을 사용할 수 있다. 상기 알부민은 인간혈청 알부민 또는 이의 단편을 사용할 수 있다. 상기 나노입자는 직경이 156.02± 65.76nm, 바람직하게는 100~300nm일 수 있다.
상기 나노입자 내부에 함유되는 약물로는 이미 공지된 알부민에 적재될 수 있는 것들을 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 약물로는 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라틴(cis-platin), 캠토세신(camptothecin), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(Anasterozole), 글리벡(Gleevec), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드(Leuprolide), 플로타미드(Flutamide), 졸레드로네이트(Zoledronate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈(Gemcitabine), 스트렙토조토신(Streptozocin), 카보플라틴(Carboplatin), 토포테칸(Topotecan), 벨로테칸(Belotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 히도록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 레티노익산(retinoic acid) 계열, 메소트렉세이트(Methotrexate), 메클로레타민(Meclorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 부술판(Busulfan), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 마이토마이신(Mitomycin), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantron), 아스피린(aspirin), 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 나노입자는 링커 또는 마이크로 버블 표면의 활성화된 반응기에 의해 마이크로버블에 결합될 수 있다. 상기 반응기로는 싸이올기(thiol), 아민기(amine)이거나, 링커로는 상기 반응기를 포함하는 화합물일 수 있다.
좀 더 구체적으로는 상기 마이크로버블과 상기 나노입자는 이들 사이에 아미드 결합(amide bond)될 수 있다. 상기 결합은 마이크로버블중의 카르복실기와 상기 알부민에 다수 포함된 아민기 사이에 일어나는 아미드 결합으로 형성될 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 복합체는 마이크로 버블 내부에 초음파 조영제용 가스와 광감작제 물질을 함유하고, 마이크로 버블 표면에 결합된 나노입자는 약물을 함유하고 있으므로 초음파 조영제, 광역학 치료제 및 화학적 약물 치료제로 동시에 사용할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 광감작제와 가스가 충진되는 마이크로 버블과 약물을 함유하는 나노입자를 각각 제조하는 단계 및 상기 나노입자와 상기 마이크로버블을 소정 비율로 물에 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는 마이크로버블-나노입자 복합체의 제조방법에 관련된다.
상기 마이크로버블을 제조하는 단계는 지질용액과 광감작제 용액을 각각 제조하는 단계, 혼합하여 건조시키는 단계, 수화 및 초음파 처리단계 를 포함한다.
상기 지질용액은 지질과 NHS를 구비하는 지질 유도체를 용매와 혼합하여 형성한다. 좀 더 자세하게는, 상기 지질용액은 지질 : NHS를 구비하는 지질유도체의 몰비를 7~9 : 1~3 범위로 유기용매(예를 들면, 클로로포름 등)에 넣어주어 형성할 수 있다.
상기 인지질, NHS를 구비하는 인지질 유도체는 앞에서 상술한 양친매성 인지질 화합물을 사용할 수 있다. 상기 방법은 지질용액 제조시 유화제를 첨가할 수 있다. 상기 유화제로는 리소지질, 스테아르산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 스테아르레이트, 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 등을 사용할 수 있다.
상기 광감작제 용액은 광감작제를 유기 용매(예를 들면, 메탄올 등)에 넣어 혼합하여 형성할 수 있다.
상기 방법은 두 개의 용액을 소정 비율로 혼합하고, 여기에 불활성 가스를 가해준 후 소정 시간 동안 방치하여 용매를 증발시킨다.
상기 방법은 상기 지질(지질+NHS를 구비하는 지질유도체의 합) 100중량부 대비 상기 광감작제를 10~20 중량부 포함되는 것이 바람직하다.
상기 방법은 용매를 증발시켜 지질과 광감작제가 혼합된 박막을 수득할 수 있다.
이어서, 상기 방법은 지질과 광감작제의 혼합 박막을 물에 넣어 수화시키고, 여기에 가스를 고압으로 주입하여 초음파 처리하는 단계를 포함한다.
좀 더 구체적으로, 상기 혼합 박막이 들어 있는 용기에 PBS 1ml을 첨가한 뒤, 상층의 기체를 C3F8 gas로 치환시켜 준 뒤, mechanical agitation으로 격렬히 교반하여 광감작제가 담지된 마이크로 버블을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 혼합 박막이 들어 있는 용기에 물, 글리콜, 글리세린 혼합액을 넣어 55~60℃의 온도를 유지하면서 녹이고, 여기에 가스(C3F8)를 200kPa로 넣어 초음파 처리하거나, 초음파와 mechanical agitation 방법을 병용하여 교반시켜 광감작제가 담지된 마이크로 버블을 제조할 수 있다.
약물을 함유하는 나노입자를 제조하는 단계는
알부민을 물에 녹인 후 여기에 약물을 주입하여 혼합물을 제조하는 단계, 상기 혼합물의 pH를 7~10, 바람직하게는 pH 8.0~8.5로 조절한 후 알코올류를 적하시키는 단계를 포함하고, 상기 단계에 의해 상기 알부민이 자기 집합체(self-aggregates)를 형성한다.
상기 나노입자와 상기 마이크로버블을 반응시키는 단계는 링커 또는 화학 반응기가 유도된 인지질을 이용하여 나노입자를 마이크로버블 표면에 결합시킬 수 있다. 상기 링커 또는 반응기로는 싸이올기(thiol), 아민기(amine) 바이오틴(biotin)-아비딘(avidin)등이 있을 수 있다.
좀 더 구체적으로는 상기 마이크로버블과 상기 나노입자는 이들 사이에 아미드 결합(amide bond)될 수 있다. 상기 결합은 마이크로버블중의 카르복실기와 상기 알부민에 다수 포함된 아민기 사이에 일어나는 아미드 결합으로 형성될 수 있다. 좀 더 구체적으로는, 상기 마이크로버블 표면에 존재하는 NHS가 물에 가수분해되고, 마이크로버블 표면에 잔존하는 카르복실기와 상기 나노입자에 존재하는 아민기가 아미드 결합될 수 있다.
상기 나노입자와 상기 마이크로버블의 혼합 비율은 결합 반응기의 몰 비로 1 : 0.5~2일 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 항암 치료제(광역학 치료체)에 관련된다. 상기 항암 치료제는 앞에서 상술한 마이크로버블과 나노입자의 복합체를 사용할 수 있다.
상기 마이크로 버블은 광감작제와 초음파 조영제용 가스가 내부에 충진된다.
상기 나노입자는 상기 마이크로 버블 표면에 복 수개 부착되고 약물을 함유한다.
상기 마이크로 버블은 조사된 초음파를 반사시켜 영상을 제공하고, 상기 마이크로 버블은 초음파에 의해 버블 구조가 파괴되면, 광감작제가 함유된 수십 나노미터의 마이셀(Micelle) 또는 리포좀(Liposome)으로 변형되어 암세포로 소노포레이션(sonoporation)되어 이동하고, 및 레이저가 상기 광감작제에 조사되면 활성산소나 라디칼 상태의 산소를 발생시켜 상기 암세포를 파괴한다.
상기 나노입자는 상기 초음파에 의해 암세포로 소노포레이션(sonoporation)되어 선택적으로 이동하고, 소정 시간동안 항암 약물을 방출할 수 있다.
상기 항암 치료제에 관해서는 앞에서 상술한 마이크로버블과 나노입자의 복합체를 참고할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
마이크로 버블 제조
지질로는 1,2-disteraoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DSPC), DSPE-PEG2000-NHS(1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-n-[poly(ethyleneglycol)]2000-N-hydroxysuccinimide)를 9 : 1의 molar ratio로 혼합하여 chloroform에 녹였다. Ce6는 Methanol에 5 mg/ml로 녹였다. 이후, 위 두 용액을 glass vial에 각각 50㎕, 10㎕씩 넣어 섞은 후 질소를 가해주었다. 이를 진공 조건에서 2시간 이상 보관하여 용매를 모두 증발시켜 완벽히 건조시켰다. 이 후, glass vial에 PBS 1ml을 첨가한 뒤, 상층의 기체를 C3F8 gas로 치환시켜 준 뒤, Mechanical agitation method를 이용하여 격렬히 교반함으로서 Ce6가 담지되고 C3F8이 충진된 마이크로 버블을 수득하였다.
추가로, 위와 같은 Ce6의 물리적 (소수성) 특성을 이용하여 이를 담지한 마이크로 버블은, 지질 분자와 Ce6간의 화학적 결합에 따른 화학반응 및 정제과정이 필요하지 않기 때문에, 제조 비용 및 시간이 매우 효율적이다. 또한, 본 방식은 유사한 특성을 보이는 광감작제를 종류에 국한되지 않고 사용이 가능하기 때문에, 화학반응을 이용한 반응기 등을 고려할 필요가 없어 적용대상물질이 매우 포괄적이다. 로딩 효율에 있어서도, 지질 대비 10% 중량비로 제조하였을 때, 약 33%의 효율을 보인다. 이는 0.5mg/ml의 지질로 제조한 버블에 있어서 16.5 ㎍/ml의 광감작제 농도를 나타내는 것으로, 광역학치료에 있어 매우 충분한 농도이다. 특히, 전신에 Ce6가 분포되는 형태가 아니라 국소적인 병변에만 전달할 수 있다는 장점 때문에, 임상적으로 사용되는 Ce6의 농도 (0.1~2.5 mg/kg)에 비하여 현저히 낮은 농도에서 치료가 가능하다.
나노입자 제조( HSA - NPs )
알부민/Distilled water (DW) 용액 (40 mg/ml)을 Traut’s reagent/DW (2 mg/ml)과 pH 7~9, 상온 (25℃)의 조건에서 1:1의 부피비로 1.5시간 반응시켰다. 반응 이후, Centrifugal filter (Molecular weight cut off, MWCO: 30 kDa)를 이용하여 (4,000rpm, 5분) 원심분리를 총 2회 수행하여 미반응 Traut’s reagent를 제거하여 순수한 thiolated 알부민을 얻었다. 이 후, DOX/DW (10 mg/ml), 100㎕를 앞에서 수득한 thiolated 알부민 용액 1ml과 섞어 교반시켜 주며, 약 1시간 이후 Ethanol을 1ml/min의 속도로 첨가시켜 줌으로써 protein precipitation 현상을 이용하여 나노입자를 형성시켰다. 이후, 상온에서 교반을 24시간 정도 진행하여 Ethanol을 증발시켜 가교결합을 형성하였다. 이후, 원심분리를 통해 (13,200 rpm, 10 분), 제조된 입자를 가라앉히고 상층용액을 분리/재분산 함으로써 미반응물을 제거하고, 최종적으로 3,000 rpm, 5분 동안의 원심분리를 통하여 가라앉은 마이크로 크기의 입자를 제거함으로써 나노입자만을 획득하였다.
마이크로버블과 나노입자의 결합
앞에서 수득한 나노입자와 마이크로 버블을 1:0.5~2의 결합 반응기의 몰비로 상온에서 2시간 동안 혼합하여 아미드 결합으로 나노입자를 마이크로 버블에 결합하였다. 결합되지 않은 HSA 나노입자는 원심분리로 제거하였다.
참고로, 마이크로 버블 제작 과정 중 손실된 NHS를 보충시켜주기 위하여 사전에 EDC와 NHS를 충분히 추가하여 반응시켜 원심분리기로 잔여 EDC, NHS를 세척하면 좀 더 결합효율을 높일 수 있다.
도 3은 실시예 1에서 제조한 마이크로 버블-나노입자 복합체의 confocal fluorescence microscope 이미지이다. 도 3은 마이크로 버블-나노입자의 결합을 fluorescence dye를 이용하여 결합 유무를 확인한 것으로, 형광염료(fluorescence dye)는 green color를 나타내는 FITC와 red color를 나타내는 DiIC18을 사용하였다. 나노입자 제조 시에 FITC가 결합된 bovine serum albumin을 10-20% 첨가하여 제작함으로써 HSA-NPs에 green color를 입혔으며 microbubble은 제조 시에 lipophilic한 DiIC18를 microbubble의 bilayer 사이에 적재함으로써 labeling 하였다. 도 3의 merged된 사진을 참고하면, 초록색 형광물질이 결합된 나노입자가 빨간색 형광물질이 담지된 마이크로 버블의 표면에 잘 결합되어 있는 것을 확인하였다.
도 4는 본 발명에서 제조된 마이크로 버블(MBs), 나노입자(HSA NPs) 및 이들이 결합된 복합체(NPs-MBs)의 입자 사이즈를 보여준다. 도 4를 참고하면, 마이크로 버블은 1~10㎛ 범위의 입자 사이즈를 보여주고, 나노입자는 100~400nm 범위를 보여주었다.
도 5는 초음파에 의해 파괴되기 전과 후의 마이크로 버블을 촬영한 이미지와 평균 크기를 측정한 그래프이다. 도 5를 참고하면, 초음파에 의해 파괴되기 전의 마이크로버블의 평균 입자 사이즈는 2217.45nm 정도이며, 이미지에도 버블 입자가 선명하게 촬영되었다. 하지만, 도5 을 참고하면, 초음파가 가해진 후 마이크로 버블이 파괴된 후 측정된 입자들의 사이즈는 98.10 nm에 불과하였으며, 결과적으로, 이미지 사진에서도 입자가 촬영되지 못하였다.
도 5는 초음파에 의해 버블이 파쇄된 이후, 수 내지 수십 마이크로 크기의 버블이 수십 나노미터의 마이셀(Micelle) 혹은 리포좀(Liposome)으로 변형되는 것을 보여준다. 이와 같은 마이크로 버블의 입자 사이즈 축소는 (Enhanced permeability and retention (EPR) 효과를 이용하여) 종양 내 광감작제의 축적이 보다 용이할 수 있음을 보여준다.
도 6은 Ce6가 담지된 마이크로 버블의 흡광 특성을 보여준다. 도 6을 참고하면, 마이크로 버블에 담지된 Ce6은 약 50nm 정도에 해당하는 red-shift 현상이 관측되었다. 이러한 현상은 Ce6가 마이크로 버블의 lipid hydrophobic chain 내에 고밀도로 존재함으로써 발생하는 현상으로써, Ce6가 버블 내부, 특히, 소수성 꼬리 부분에 잘 로딩되었음을 보여준다.
Ce6가 담지된 마이크로 버블은, 도 6에서 확인할 수 있듯이, 본래의 Ce6 흡광에서 약 6nm, 50nm shifting된 두 개의 peak를 보인다. 특히, 도 6에서는 Ce6가 담지된 버블에 초음파를 가해주어 리포좀 또는 마이셀 형태로 변화되었을 때 (도5의 결과), 여전히 shifting된 형태를 보임을 알 수 있다. 또한, Tween 20을 리포좀 구조의 붕괴를 위하여 섞어주었을 때 shifting된 peak가 없어지는 것을 통하여, Ce6가 초음파 조사 이후에도 마이크로버블이 파쇄되면서 형성되는 리포좀 또는 마이셀 내부로 자동적으로 로딩되어 존재한다는 것을 재확인 할 수 있다.
도 7은 Ce6-마이크로 버블에 대한 활성산소 생성 정도를 보여준다.
먼저, 광감작제로써 Ce6가 담지된 마이크로 버블-나노입자 복합체의 레이저 조사에 따른 세포 내 활성산소 생성을 실험적으로 검증하기 위하여 DCFDA 조사법을 활용하였다. 이는, 세포 내에 활성산소 표지제를 미리 도입시켜 활성산소의 존재에 따라 형광이 방출되는 것을 검사하는 방식이다.
이 때 레이저는 671 nm, 100 mW/cm2로, 30초씩 처리해 주었다.
도 7을 참고하면, 대조군(CTL), 양성 대조군(Positive control group)인 TBHP(tert-Butyl hydroperoxide)에 비해서 본원발명의 Ce6-마이크로 버블(Ce6-MBs)과 나노입자-Ce6-마이크로 버블(DOX-NPs/Ce6-MBs)에 초음파를 조사하여 마이크로버블이 파쇄되어 리포좀 또는 마이셀 형태로 세포내로 들어간 경우 현저히 높은 형광을 발생함으로써 충분한 양의 활성산소가 생성됨을 확인하였다.
결과적으로, Ce6가 담지된 마이크로 버블과 초음파를 조사하여 마이크로버블이 파쇄된 군에서만 높은 형광이 검출됨으로써 본원발명의 복합체에 의한 광역학치료 효능이 검증되었다.
도 8은 마이크로 버블에 대한 초음파 조사에 따른 Sonoporation 효과를 보여준다. 마이크로 버블의 존재 시, 초음파를 가해주면 버블의 파쇄에 의하여 sonoporation 효과가 발생하며, 주변 세포 혹은 조직에 대하여 높은 약물전달 효능을 기대할 수 있다. 일반 세포주에 대해서 초음파를 0.2 W/cm2,50% duty cycle로 30초씩 처리해 준 후 항암제 및 광감작제의 전달효능을 확인하였다.
도 8을 참고하면, 마이크로 버블-나노입자 복합체의 경우가 초음파를 조사해 주었을 때(US(+)), 나노입자 내부의 항암제 및 마이크로 버블 내부의 광감작제의 세포 내 도입이 sonoporation 효과에 의해 극대화됨으로써 담지된 항암제 및 광감작제의 전달율이 가장 높음을 확인할 수 있었다.
특히, 마이크로 버블 내부에 담지된 광감작제의 경우, 초음파를 가해주지 않은 상태로 세포에 전달되는 경우를 보면 세포 내부에 특정 구조체의 형태 (리포좀 혹은 세포 내 미세기관인 엔도좀 등)로 존재함을 알 수 있다. 이 경우 세포 내 소화 기작에 의해 전달된 광감작제가 분해, 배출되어 충분한 효과를 거둘 수 없거나 국소적인 부위에서만 활성산소가 생성되는 한계가 존재할 수 있다. 반면, 초음파를 가해주어 버블의 sonoporation 효과를 유도하였을 경우에는 광감작제의 전달량 자체가 증가할 뿐 아니라, 세포질 내에 전반적으로 퍼져서 존재하는 것을 확인할 수 있다. 즉, 초음파를 통하여 표적에 대한 광감작제의 방출이 더욱 효율적으로 일어난다는 것으로써, 이는 세포 단계에서 뿐 아니라 조직 전체적으로 더욱 효율적인 약물 전달이 가능함을 검증한다. 따라서, 레이저 조사에 의해 더욱 광범위한 병변조직 범위에 대하여 광역학치료가 가능하다는 것이다.
도 9는 3D-배양을 통한 spheroid 세포군에 대한 마이크로 버블의 Sonoporation 효과를 보여준다. 도 9는 췌장암 조직과 유사한 환경을 모사하기 위해 3D-배양을 통한 tumor cell spheroid를 형성하고, 이에 대한 나노입자 자체의 도입 효능을 추가로 확인한 결과이다. 이 때, 초음파는 2.0 W/cm2, 50% duty cycle로 30초씩 처리해 주었다.
도 9를 참고하면, 초음파에 감응하는 마이크로 버블과 결합된 나노입자(NP-MB)는 단순한 나노입자(NP)에 비해 tumor cell spheroid 내부 깊숙이까지 훨씬 많은 양이 침투함을 확인할 수 있었다.
혈관 내에서 초음파를 통하여 sonoporation 효과를 유도하였을 경우, 앞선 결과에서 알 수 있듯이 Ce6를 담지한 버블은 Ce6를 담지한 리포좀 형태로 변형된다. 이 때, 버블의 표면에 부착된 항암제를 담지한 나노입자는 sonoporation 효과에 의해 즉각적으로 주변 병변조직으로 전달되지만, Ce6를 담지한 리포좀은 sonoporation 효과에 의해 넓어진 혈관벽세포 간극을 통한 EPR효과 및 추가적인 버블의 연속적인 sonoporation 효과에 의해 주변 조직으로 전달된다. 특히 Ce6의 경우, 화학적으로 지질 분자에 결합되어 있는 형태에 비하여 손쉽게 버블 혹은 리포좀 내에서 주변 조직부로 방출이 용이하기 때문에, 더욱 광범위한 병변조직 및 세포에 대하여 광역학치료가 가능하다는 장점을 보인다.
도 10은 입자의 물성, 광역학치료 효능, Sonoporation 효과를 융합하여 실제 암세포 모델에 대하여 복합치료 효능이 충분히 발생하는지에 대한 세포 생존율을 측정한 결과이다. 도 10을 통해 암세포에 대한 복합치료 효능을 검증할 수 있다.
미처리 대조군, DOX-나노입자와 Ce6를 포함하지 않은 마이크로 버블 복합체(DOX-NPs/MBs), DOX를 함유하지 않은 나노입자와 Ce6를 함유하는 마이크로 버블(NPs/Ce6-MBs), DOX와 Ce6을 모두 함유하는 마이크로 버블-나노입자 복합체(DOX-NPs/Ce6-MBs)에 대해 레이저, 초음파, 레이저+초음파 처리를 한 경우의 세포 생존율을 조사하였다.
Ce6 농도는 1μDOX 약물 농도는 100μ이며, 레이저는 671 nm, 1.0 J/cm2으로 30초씩, 초음파는 0.2 W/cm2,50% duty cycle로 5초씩 처리해 주었다. 세포주는 MIA-paca-2 인간 췌장암 세포주이며, 총 48시간 배양하였다.
도 10을 참고하면, 본원발명의 마이크로 버블-나노입자 복합체(DOX-NPs/Ce6-MBs)가 레이저+초음파를 조사한 경우에 다른 입자들에 비해 전반적으로 세포사멸 효율이 높았다. 이는, 단일 치료법에 비하여 복합치료의 경우가 항암효능이 더욱 높아진다는 것을 검증해준다. 또한, 본원발명의 마이크로 버블-나노입자 복합체(DOX-NPs/Ce6-MBs)가 레이저 및 초음파를 모두 가해주지 않거나 한 종류만 가해주었을 때에 비하여, 레이저/초음파를 동시에 가해준 경우가 두 가지 치료효능을 모두 유도함으로써 세포사멸 효율을 가장 높일 수 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 본원발명의 마이크로 버블-나노입자 복합체(DOX-NPs/Ce6-MBs)가 모든 다른 군에 비하여 최소 10% 수치 이상의 세포사멸 효율 향상을 확인하였다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로, 본 발명의 구체적인 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.
본 발명의 복합체는 초음파 조영제, 광역학 치료제 및 화학적 약물 치료제로 사용할 수 있다.

Claims (16)

  1. 광감작제와 초음파 조영제용 가스가 충진된 마이크로 버블 ; 및
    상기 마이크로 버블 표면에 복 수개 부착되고 약물을 함유하는 나노입자 ;를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로버블은 인지질 기반의 리포좀에 상기 광감작제와 가스가 충진되어 마이크로 크기의 버블화 된 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 조영제용 가스는 마이크로 버블 코어 영역에 충진되고, 상기 광감작제는 소수성 유기 꼬리 부분이 구성하는 중간층에 충진되는 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로버블은 1~10㎛인 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로 버블은 조사된 초음파의 세기에 따라 초음파를 반사시키거나 버블 구조가 파괴되는 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 마이크로버블이 초음파에 의해 버블 구조가 파괴되면, 상기 마이크로버블 보다 작은 크기의 마이셀(Micelle) 또는 리포좀 (Liposome) 형태로 변형되고, 상기 광감작제는 상기 마이셀 또는 리포좀의 소수성 영역에 담지되는 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 마이크로버블이 초음파에 의해 버블 구조가 파괴되면, 상기 조영제용 가스는 버블 구조 파괴와 동시에 압력파를 제공하여 초음파와 같이 상기 광감작제, 마이셀, 리포좀 또는 나노입자를 병변 조직 내부로 강제 주입하는 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체.
  8. 제 6항에 있어서, 레이저광이 상기 마이셀 내지 리포좀에 조사되면, 상기 마이셀 내지 리포좀에 부착되어 있는 광감작제가 여기하여 활성산소나 라디칼 상태의 산소를 발생시키는 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 광감작제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 광감작제는 hematoporphyrin, 5-Aminolevulinic acid (ALA), Purpurin, Benzoporphyrin, Phthalocyanine로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 나노입자는 알부민을 포함하여, 자기 집합체(self-aggregates)를 형성하고, 그 직경이 100~300nm인 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체.
  12. 광감작제와 가스가 충진되는 마이크로 버블과 약물을 함유하는 나노입자를 각각 제조하는 단계 ; 및
    상기 나노입자와 상기 마이크로버블을 소정 비율로 물에 혼합하여 반
    응시키는 단계를 포함하는 마이크로버블-나노입자 복합체의 제조방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 마이크로버블을 제조하는 단계는
    지질과 NHS를 구비하는 지질 유도체를 용매와 혼합하여 지질 용액을 제조하는 단계와 광감작제를 용매에 넣어 광감작제 용액을 각각 제조하는 단계 ;
    상기 두 개의 용액을 혼합시켜 불활성 가스를 가해준 후 소정 시간 동안 방치하여 용매를 증발시키는 단계 ; 및
    건조된 지질막과 광감작제의 혼합물을 물에 넣어 수화시키고, 여기에 가스를 고압으로 주입하여 초음파 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체의 제조방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 지질용액은 지질 : NHS를 구비하는 지질유도체의 몰비를 7~9 : 1~3 범위로 넣어주는 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체의 제조방법.
  15. 제 12항에 있어서, 상기 방법은 상기 지질(지질+NHS를 구비하는 지질유도체의 합) 100중량부 대비 상기 광감작제를 10~20중량부 사용하는 것을 특징으로 하는 마이크로버블-나노입자 복합체의 제조방법.
  16. 광감작제와 초음파 조영제용 가스가 충진된 마이크로 버블 ; 및
    상기 마이크로 버블 표면에 복 수개 부착되고 약물을 함유하는 나노입자를 포함하되,
    상기 마이크로 버블은 조사된 초음파를 반사시켜 영상을 제공하고, 상기 마이크로 버블은 초음파에 의해 버블 구조가 파괴되면, 광감작제가 부착된 수십 나노미터의 마이셀(Micelle) 또는 리포좀(Liposome)으로 변형되어 암세포로 소노포레이션(sonoporation)되어 이동하고, 및 레이저가 상기 광감작제에 조사되면 활성산소나 라디칼 상태의 산소를 발생시켜 상기 암세포를 파괴하고,
    상기 나노입자는 상기 초음파에 의해 암세포로 소노포레이션(sonoporation)되어 선택적으로 이동하고, 소정 시간동안 항암 약물을 방출하는 것을 특징으로 하는 항암 치료제
PCT/KR2018/007145 2017-06-26 2018-06-25 광감작제를 포함한 마이크로버블-나노입자 복합체 및 이를 포함하는 항암 치료제 WO2019004669A2 (ko)

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