CN115089588A

CN115089588A - 达沙布韦作为e3连接酶新型配体构建protac的应用

Info

Publication number: CN115089588A
Application number: CN202211003916.3A
Authority: CN
Inventors: 陈大华; 张贝贝; 徐鹏飞; 赵东波; 章文信; 高亚杰; 朱元祥; 程郢; 张国强
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2022-08-22
Filing date: 2022-08-22
Publication date: 2022-09-23
Also published as: CN115850264A

Abstract

本发明公开了达沙布韦（Dasabuvir）作为E3连接酶新型配体构建PROTAC在制备预防和/或治疗免疫疾病和癌症药物中的应用。达沙布韦（Dasabuvir）分子及其可能衍生物/结构类似物可结合E3连接酶，基于其构建蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）可使靶蛋白泛素化，通过泛素‑蛋白酶体降解靶蛋白，避免由于靶点突变产生的耐药性。本发明为构建蛋白降解靶向嵌合体提供了新选择，构建的蛋白降解靶向嵌合体在制备预防和/或治疗免疫疾病和癌症药物中有良好的应用。

Description

达沙布韦作为E3连接酶新型配体构建PROTAC的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及达沙布韦（Dasabuvir）及其可能的衍生物/结构类似物作为E3连接酶新型配体构建蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）在制备预防和/或治疗免疫疾病和癌症药物中的应用。

背景技术

蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimeric molecule, PROTAC)作为一类新的药物可降解多种与人类疾病相关的蛋白质，具有高效能，高选择性，以及靶向“不可成药”蛋白等优势。PROTAC技术可用于靶向多种癌症靶点，包括对抗实体瘤和恶性血癌的不同靶点，且以靶向依赖的方式显示出对某些肿瘤细胞的高效杀伤力，例如靶向BRD4、BTK、BCR-ABL和CDK-6等靶点的PROTACs已经显示了治疗白血病的潜能；而靶向AR、ER、FAK、P38的ROTACs正在被开发用于治疗多种不同的实体瘤；靶向BCL-XL和ALK 的PROTACs还显示出了广谱的抗肿瘤活性，在体外和异种移植模型中均能有效杀伤白血病和实体瘤细胞。

科学家在人类基因组中发现了600多个E3连接酶，包括CRBN、VHL、MDM2、IAPs、DCAF15、DCAF16、RNF4和RNF114 等。文献报道的应用到PROTAC中的E3连接酶主要有CRBN、VHL、cIAP和MDM2，而效果较好、使用频次最高的E3连接酶主要是CRBN和VHL两种。2010年，Handa及其同事的研究发现E3连接酶Cereblon(CRBN)为沙利度胺(thalidomide)的主要蛋白质靶点；Cereblon是由人类CRBN基因编码的蛋白，CRBN同源基因是高度保守的，这表明它在生理学中的重要性。

目前，常用的CRBN E3连接酶的配体为结构高度相似的沙利度胺(thalidomide)、来那度胺（lenalidomide）和泊马度胺（pomalidomide），而沙利度胺是一种致畸药物“反应停”，妊娠女性服用后可能导致胎儿出生缺陷，甚至死亡，具有较大的毒副作用。达沙布韦(Dasabuvir)（在我国上市的商品名为“易奇瑞”）属于非核苷类聚合酶抑制剂，具有抑制丙肝病毒NS5B聚合酶的作用，主要用来抑制丙肝病毒RNA的复制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小分子化合物达沙布韦（Dasabuvir）及其可能的衍生物/结构类似物作为E3连接酶CRBN新型配体构建蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）在预防、治疗免疫疾病和/或制备癌症药物中的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

达沙布韦（Dasabuvir）分子及其可能的衍生物/结构类似物作为E3连接酶CRBN新型配体构建蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）在制备预防和/或治疗免疫疾病和癌症药物中的应用，所述达沙布韦分子如式I：

进一步地，所述构建蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC），可降解蛋白包括但不限于癌症相关突变蛋白BCR-ABL或 FLT3-ITD或RAS等。BCR-ABL是一种融合癌蛋白, 具有高度酪氨酸激酶活性，细胞过度增殖而使细胞调控发生紊乱，进而致癌; ITD（内部串联重复）突变是受体酪氨酸激酶FLT3最常见的一类突变，导致自身抑制功能丧失，酪氨酸激酶活性增加，使得下游信号通路（RAS/MAPK、PI3K/AKT等）持续激活，导致细胞增殖失调，促进AML疾病；ras癌基因与人类肿瘤的发生发展密切相关，其突变可导致膀胱癌、乳腺症、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、及造血系统肿瘤等多种癌症。

进一步地，所述构建蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC），靶向细胞蛋白免疫检查点包括但不限于PD-L1或PD-1或CD47等。

PD-L1全称为细胞程序性死亡-配体1，也叫做表面抗原分化素274，是人体内的一种蛋白质，有CD274基因编码。这是一种Ⅰ型跨膜蛋白，在体内与T细胞等免疫细胞表面表达的程序性死亡受体-1（PD-1）结合，传导免疫抑制的信号，降低淋巴结内CD8+T细胞的增生和活化，进而使得癌细胞得以免疫逃逸；CD47被广泛认为是一种“不要吃我”的信号，它有助于在生理条件下维持非恶性细胞的免疫耐受性，与信号调节蛋白α（SIRPα）结合的CD47启动抑制性信号通路，导致恶性细胞逃避巨噬细胞的吞噬作用。抑制癌细胞中CD47信号的疗法可能会促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，从而限制肿瘤生长。综上，降解或抑制这些免疫检查点蛋白，可为抗肿瘤治疗提供了可行的免疫靶点抑制。

本发明提供一种药物组合物，包含上述所述构建蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）和药学上可接受的辅料。

本发明所述免疫疾病为红斑狼疮、炎症性肠病、血管球性肾炎、自身免疫糖尿病类风湿性关节炎等；所述癌症为淋巴瘤、髓母细胞瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、滑膜细胞肉瘤、胃泌素瘤、类癌肿瘤、间皮瘤、胰岛细胞癌、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、听神经瘤、腺癌、白血病或淋巴样恶性肿瘤、上皮鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞癌、腺癌肺癌、腹膜癌、肺鳞癌、肝细胞癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌、食管癌、胆道肿瘤、头颈部癌等。

本发明具有以下优点：

1、本发明提供了一种与市场及科研领域常用的CRBN的配体沙利度胺(thalidomide)、来那度胺（lenalidomide）、泊马度胺（pomalidomide）等化学结构不同的E3连接酶新型配体达沙布韦（Dasabuvir）。

2、基于达沙布韦（Dasabuvir）或其衍生物/结构类似物构建一个双功能小分子（如蛋白降解靶向嵌合体PROTAC），分子一端结合靶蛋白，另一端通过达沙布韦（Dasabuvir）或其衍生物/结构类似物结合 E3连接酶，将靶蛋白和E3连接酶拉近使靶蛋白泛素化，通过泛素-蛋白酶体途径降解靶蛋白，可避免由于靶点突变产生的耐药性。

3、本发明提供了一种达沙布韦（Dasabuvir）（包含其可能的衍生物/结构类似物）作为E3连接酶新型配体为构建蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）提供了新选择。

4、本发明提供了一种含达沙布韦（Dasabuvir）或其可能的衍生物/结构类似物作为E3连接酶新型配体构建蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）的药物组合物。

附图说明

图1为实施例1采用均相时间分辨荧光法(HTRF)方法筛选化合物药库，经过多轮筛选，实验验证筛选获得E3连接酶Cereblon(CRBN) 新型配体达沙布韦（Dasabuvir）、常规的CRBN的配体沙利度胺(thalidomide)、来那度胺（lenalidomide）、泊马度胺（pomalidomide）等的筛选结果图；

图2为实施例1 在1 μM及10 μM的浓度下再次采用均相时间分辨荧光法(HTRF)方法验证达沙布韦（Dasabuvir）为Cereblon(CRBN)小分子新型配体图；

图3为实施例1达沙布韦（Dasabuvir）与常规的CRBN的配体沙利度胺(thalidomide)、来那度胺（lenalidomide）、泊马度胺（pomalidomide）的化学分子结构图；

图4为实施例2采用表面等离子共振（SPR）方法验证该小分子配体达沙布韦（Dasabuvir）与E3连接酶Cereblon(CRBN)的亲和力图；

图5为实施例3使用标准的量子化学方法B3LYP/6-311+G(d)优化的小分子CRBN配体达沙布韦（Dasabuvir）结构图；

图6为实施例3优化的小分子CRBN配体达沙布韦（Dasabuvir）结构和蛋白进行分子对接得到的复合物结构图；

图7为图6复合物结构的静电势图；

图8为实施例3小分子CRBN配体达沙布韦从复合物释放的自由能曲线；

图9为实施例4外源性表达的BCR-ABL质粒（含flag标签）转染HEK293T细胞后，给与PROTAC药物处理24小时（10 μM），BCR-ABL蛋白通过蛋白质印记法Western Blot检测其可被某些基于达沙布韦（Dasabuvir）分子或其可能的衍生物/结构类似物作为E3连接酶Cereblon(CRBN)的配体的特定PROTAC药物降解图；

图10为实施例4 PROTAC药物用药24小时处理K562癌细胞后（10 μM）靶蛋白降解图；

图11为实施例4癌细胞K562用药48小时处理后（10 μM）细胞活力图；

图12为实施例4 PROTAC药物处理外源性表达耐药性癌蛋白BCR-ABL-T315I质粒（含flag标签）转染HEK293T细胞24小时后（10 μM）癌蛋白降解图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

采用均相时间分辨荧光法（HTRF）的筛选方法，对E3连接酶Cereblon(CRBN)新型配体达沙布韦（Dasabuvir）的筛选及确认，具体步骤为：

采用CEREBLON BINDING KITS（Cisbio,64BDCRBNPEG）及Molecular Devices多功能酶标仪iD5对2697种获得上市批准的原料药进行多轮筛选，第一轮筛选采用cocktail鸡尾酒混合筛选法，将2697种原料药分成146种药物组合（每个药物浓度2.5μM）；第二轮筛选基于第一轮筛选进行单药筛选（每个药物浓度为12.5μM）；第三轮筛选基于第二轮筛选进行前15个单药进行再次筛选和确认（每个药物浓度为12.5μM）。经过实验验证，最终获得E3泛素连接酶Cereblon (CRBN)小分子新型配体达沙布韦（Dasabuvir），同时筛选得到了市场上常规的CRBN的配体沙利度胺(thalidomide)、来那度胺（lenalidomide）、泊马度胺（pomalidomide），验证了该方法的可靠性，如图1所示。进一步地，1μM及10μM的浓度处理再次验证达沙布韦（Dasabuvir）为Cereblon(CRBN)小分子新型配体，如图2所砂。如图3所示，达沙布韦（Dasabuvir）与常规的CRBN的配体沙利度胺(thalidomide)、来那度胺（lenalidomide）、泊马度胺（pomalidomide）的化学分子结构完全不同。本发明通过基于均相时间分辨荧光法（HTRF）筛选获得了一种新型的E3连接酶配体达沙布韦（Dasabuvir）。

实施例2

采用SPR方法验证达沙布韦（Dasabuvir）与E3连接酶Cereblon (CRBN)的亲和力。采用基于光学表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR）原理的BiacoreX100 生物大分子相互作用分析仪，CM5芯片，缓冲液（1 x PBS+ 0.05% Tween 20），1M NaCl，醋酸钠（pH5.5, 5.0, 4.5，4.0 ）等对达沙布韦（Dasabuvir）与E3连接酶Cereblon (CRBN)的亲和力进行验证，具体步骤为：

（1）、配体预富集：将CRBN蛋白用醋酸钠（pH5.5, 5.0, 4.5，4.0）分别稀释到 10 μg/ml，各准备100 μL，通过预富集实验，确定 pH5.0 作为最佳蛋白偶联条件；

（2）、固定蛋白：由前确定的使用pH5.0的醋酸钠进行Cereblon(CRBN)蛋白固定，将配体达沙布韦（Dasabuvir）溶液稀释至 20 μg/ml，200 uL 进行正式偶联。由下面公式Rmax=(analyte MW/ligand MW) X RL X Sm 计算芯片表面最大结合容量，在小分子测试中通常代入 100RU。analyte MW 和 ligand MW 分别为小分子和蛋白的分子量，以此来确定固定蛋白量，因实际蛋白质量不一定完全一致，故本次固定蛋白量为8000RU。

（3）、检测：将固定相设为20 μg/ml Cereblon(CRBN)蛋白，流动相为待检测的达沙布韦（Dasabuvir）不同浓度小分子溶液，主要是看小分子药物经过流动相看与配体蛋白结合强弱，首先将小分子药物用流动相Buffer进行梯度稀释，从3.125 μM两倍稀释，直到零浓度，并以空白流动池为对照，将小分子药物以30µl/min的流速注探针表面结合2 min，在运行缓冲液中解离2 min。运行程序跑完分析结果，如图4所示，达沙布韦（Dasabuvir）配体与E3连接酶Cereblon (CRBN)蛋白的亲和力较高，平衡解离常数KD值约为677 nM。

实施例3

通过计算化学及分子对接等方法理论上验证达沙布韦（Dasabuvir）与E3连接酶Cereblon(CRBN)的结合，具体步骤为：

（1）、使用标准的量子化学方法B3LYP/6-311+G(d)优化小分子配体结构，计算使用Gaussian16软件完成，如图5所示。

（2）、将第一步的优化的小分子配体结构和蛋白进行分子对接所得到的复合物结构，计算使用AutoDock软件完成，如图6所示。然后第二步复合物结构的静电势图，其可视化使用PyMol完成，计算使用其中的APBS插件完成，如图7所示。

（3）采用分子动力学模拟结合增强采样方法（ABF），得到小分子配体从复合物释放的自由能曲线，如图8所示。势能面上的最高点和最低点之间的差值代表小分子配体和蛋白结合的强弱。基于复合物的结构构建溶液盒子，这步使用基于网页版的CHARMM-GUI实现；其中蛋白质使用CHARMM36m力场，水分子使用TIP3P势函数；在NPT（p = 1 atm, T = 300 K）系统下，溶液体系充分平衡了100 ns，使用的积分步长是 2 fs。计算结果表明，在模拟的时间内，小分子配体依然结合在蛋白的“口袋”处。采用ABF增强采样技术，使用外力让小分子远离蛋白的结合口袋，本实施例选取蛋白和小分子配体的质心之间的距离作为反应坐标，在反应路径上的各个窗口充分采样，以3A为间隔，将整条反应路径划分为6段，每一段平衡100ns；ABF的计算重复3次，所有的分子动力学计算使用NAMD GPU版本完成。如图5、6 、7 、8所示，达沙布韦（Dasabuvir）与E3连接酶Cereblon(CRBN)蛋白具有较强的结合。

实施例4

达沙布韦（Dasabuvir）作为E3连接酶新型配体构建蛋白降解靶向嵌合体在制备预防和/或治疗免疫疾病和癌症药物中的用途，具体的应用实施例包括但不限于以下：

以达沙布韦（Dasabuvir）或其可能的衍生物/结构类似物为E3连接酶Cereblon(CRBN)的配体，伊马替尼 (Imatinib)或达沙替尼 (Dasatinib)等为BCR-ABL靶蛋白配体，构建靶向癌蛋白BCR-ABL的PROTAC药物。外源性表达的BCR-ABL质粒（含flag标签）转染HEK293T细胞后，给与PROTAC药物处理24小时（10 μM），BCR-ABL蛋白通过蛋白质印记法Western Blot检测发现其可被某些基于达沙布韦（Dasabuvir）分子或其可能的衍生物/结构类似物作为E3连接酶Cereblon (CRBN)的配体的特定PROTAC药物明显降解，如图9所示。类似地，表达内源性BCR-ABL的白血病细胞系K562的内源性BCR-ABL蛋白用某些基于达沙布韦（Dasabuvir）分子或其可能的衍生物/结构类似物作为E3连接酶Cereblon (CRBN)的配体的特定PROTAC药物用药24小时处理后（10 μM），靶蛋白也被显著降解，如图10所示。同时癌细胞用药48小时处理后（10 μM），细胞活力显著降低，如图11所示。综上，以达沙布韦（Dasabuvir）为E3连接酶Cereblon (CRBN)的配体，构建的某些特定的PROTAC药物可显著降解靶向蛋白，起到抗癌效果。此外，对于耐药性的点突变癌蛋白（如BCR-ABL-T315I），基于达沙布韦（Dasabuvir）分子或其可能的衍生物/结构类似物作为E3连接酶Cereblon(CRBN)配体的某些特定PROTAC药物处理细胞24小时后（10 μM），也可以起到良好的癌蛋白降解效果，如图12所示。上述数据表明达沙布韦（Dasabuvir）分子或其可能的衍生物/结构类似物作为一种新的E3连接酶Cereblon (CRBN)的配体，可用于制备包含但不限于靶向BCR-ABL等癌蛋白的蛋白降解靶向嵌合体或组合物药物。

Claims

1.达沙布韦作为E3连接酶新型配体构建PROTAC的应用，其特征在于，所述应用包括预防、治疗免疫疾病和/或制备癌症药物，所述达沙布韦分子如式I：

。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述构建PROTAC，可降解蛋白包括癌症相关突变癌蛋白BCR-ABL或 FLT3-ITD或RAS。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述构建PROTAC，靶向细胞蛋白免疫检查点包括PD-L1或PD-1或CD47。

4.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述构建PROTAC和药学上可接受的辅料。

5.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于，所述免疫疾病为红斑狼疮、炎症性肠病、血管球性肾炎、自身免疫糖尿病类风湿性关节炎；所述癌症为淋巴瘤、髓母细胞瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、滑膜细胞肉瘤、胃泌素瘤、类癌肿瘤、间皮瘤、胰岛细胞癌、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、听神经瘤、腺癌、白血病或淋巴样恶性肿瘤、上皮鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞癌、腺癌肺癌、腹膜癌、肺鳞癌、肝细胞癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌、食管癌、胆道肿瘤、头颈部癌。