CN116209771A - 用于改善疫苗接种的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种包括第一mRNA构建体的组合物，所述第一mRNA构建体包括第一开放阅读框(ORF)，其中所述第一ORF编码抗原；其中所述第一ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包括至少一个第一器官保护序列(OPS)，并且其中所述第一OPS包括至少两个微RNA(miRNA)靶序列，其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个被优化以与相应的miRNA序列杂交。还进一步提供了包括mRNA构建体的组合物，所述mRNA构建体包括ORF和OPS，其中所述ORF编码促炎细胞因子，以及包括这些组合物中的一种或两种用于治疗和预防疾病如致病性疾病的方法。

Description

用于改善疫苗接种的组合物和方法
相关申请
本申请要求2020年7月31日提交的序列号为63/059458的美国临时专利申请；以及2021年2月22日提交的序列号为PCT/US21/19028的PCT申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及信使核糖核酸(mRNA)递送技术，以及在多种治疗、诊断和预防用药指征中使用这些mRNA递送技术的方法。
背景技术
经常需要诱导特定基因产物如多肽在特定靶组织或器官中表达的能力。在许多情况下，靶组织或器官包括一种以上的细胞类型，并且在这种情况下，还经常需要在不同细胞类型中以不同程度表达基因产物，即，在靶组织中的不同细胞类型之间提供基因产物的差异表达。例如，在基因治疗中，可以用完整的拷贝在靶细胞中替换突变的和/或无功能的基因，但是最小化相邻细胞、组织和器官中的脱靶蛋白产生也是有用的。同样，疫苗抗原例如COVID-19的刺突蛋白的基因产物优选地在免疫系统的树突细胞中或其周围表达，以确保最大应答。
基因治疗通常依赖于病毒载体将编码多核苷酸引入靶细胞，但存在其它可以将多核苷酸递送到细胞而不使用病毒的技术。病毒的优点包括相对高的可能转染率，以及通过控制病毒进入靶细胞的结合蛋白将病毒靶向特定细胞类型的能力。相比之下，将编码多核苷酸引入细胞的非病毒方法具有转染率低的问题，以及在特定器官和细胞类型中靶向表达的选择有限。然而，病毒干预的性质带有毒性和炎症的风险，而且在控制引入因子的表达的持续时间和程度上具有限制。
基于生物学方法的肿瘤治疗具有优于传统化疗的优点，因为它们可以采用多种不同的机制来更精确地靶向和破坏癌症，例如通过定向细胞裂解、细胞毒性免疫效应机制和血管塌陷等。因此，临床研究数量显著增加了这些方法的潜力。然而，由于治疗的范围不同，临床前和临床研究是复杂的，因为多个参数可能影响其治疗潜力，因此可能难以确定治疗失败的原因或可能难以确定增强疗效的方法。维持靶向活动、肿瘤特异性和减少副作用也是此类实验性和有效治疗的主要挑战。
基于病毒的治疗已成为一种有前景的方法来解决疾病治疗的多个方面。基于灭活或减毒病毒的癌症疫苗对难以治疗的癌症具有相当大的潜力。然而，治疗性病毒的有效性通常受到人体自身免疫应答的阻挠，因此限制了其全身施用。因此，提供新的组合物和方法，将有利于改善和增强目前可用的治疗性病毒方法的范围。
疫苗通常是预防传染病的有效干预措施。然而，在某些应用和情况下，疫苗效力可能是次优的。例如，针对所递送的抗原的有效应答的产生取决于受试者免疫系统的能力。在所有受试者中，免疫可能随着时间的推移而丧失，和/或针对特定抗原的免疫应答可能并不充分。
类似地，由于抗免疫适应、快速突变或自然史，某些类型或类别的病原体可能难以对其进行疫苗接种。例如，细胞内寄生物，如病毒、细胞内细菌或单细胞真核生物(例如,疟疾寄生虫)，往往难以提供对应的疫苗。
通常，活的减毒疫苗可以提供更好的应答，但伴有风险，主要是减毒病原体重新激活的风险。现有疫苗技术的其他不足包括“疫苗逃逸”的可能性，其中病原体变体进化，但未被疫苗触发的免疫应答有效对抗(例如，如果靶向的抗原的编码基因中出现突变)；随着时间的推移，免疫丧失；以及不完全抗性。
由于所有这些原因，通常将疫苗和佐剂一起提供以增强免疫应答，但这些有自身的风险，如症状诱导和自身免疫攻击风险。因此，需要提供更有效的和更安全的疫苗和/或佐剂，特别是对于难以提供接种疫苗的病原体。
WO-2017/132552-A1描述了具有包括微RNA结合位点的工程化基因组的重组溶瘤病毒。
US-2013/156849-A1涉及在哺乳动物细胞或组织中表达目标多肽的方法，所述方法包括用包含编码目标多肽的修饰的mRNA的制剂接触所述哺乳动物细胞或组织。WO-2016/011306-A2描述了包括至少一种包括微RNA结合位点的末端修饰的核酸的设计、制备、制造和/或配方。上述现有技术没有解决确保对接受联合施用治疗剂或因子治疗的受试者体内单个或多个器官类型的有效保护的问题。
WO 2019/051100 A1和WO 2019/158955 A1描述了用于将表达一个或多个多肽的mRNA序列递送至一个或多个靶器官内的组合物和方法，包括miRNA结合位点序列，所述miRNA结合位点序列允许编码序列在靶器官或器官内至少第一和第二细胞类型间差异表达。
需要进一步开发用于调节多核苷酸序列(如mRNA)在特定器官和/或组织中表达的进一步改进和优化的方法和组合物。
发明内容
在多个实施方案中，本发明提供了适用于递送核苷酸编码产物(如mRNA构建体)的组合物和方法，例如用作疫苗和/或佐剂组合物。在一些实施方案中，通过包含miRNA结合位点序列，特别是通过提供器官保护序列，一种或多种递送的组合物适合于控制表达。在本文所描述的所有方面中，我们设想“mRNA构建体”包括可以被翻译成产生蛋白产物的环状或环状RNA构建体。
在第一个方面，提供了组合物，包括：包含第一开放阅读框(ORF)的第一mRNA构建体，其中所述第一ORF编码抗原。所述第一ORF可操作地与至少一个非翻译区(UTR)相连，其中所述UTR包括至少第一器官保护序列(OPS)，并且其中所述第一OPS包括至少两个微RNA(miRNA)靶序列，其中至少两个miRNA靶序列中的每一个都被优化以与相应的miRNA序列杂交。
所述第一mRNA构建体可以包含在体内递送组合物中或吸附到体内递送组合物上。所述抗原可选自：病原微生物蛋白和肿瘤相关抗原，或含有其片段的表位。所述病原微生物蛋白可选自：病毒蛋白、细菌蛋白、真菌蛋白、寄生虫蛋白和朊病毒。
所述抗原可以包括病毒蛋白或含有其片段的表位。所述抗原可以包括冠状病毒刺突蛋白、冠状病毒刺突蛋白变体、合适的SARS-CoV-2刺突蛋白。所述抗原可包括流感蛋白或其变体，或含有其片段的表位；适用地，其中所述流感蛋白选自血凝素、神经氨酸酶、基质-2和/或核蛋白。所述流感蛋白可选自甲型流感、乙型流感或甲型流感的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16亚型。所述抗原可包括呼吸合胞病毒(RSV)蛋白、其变体或含有其片段的表位；适用地，其中所述呼吸合胞病毒蛋白为F糖蛋白或G糖蛋白。所述抗原可包括人类免疫缺陷病毒(HIV)蛋白或含有其片段的表位；适用地，所述HIV蛋白是糖蛋白120中和表位或糖蛋白145。
所述抗原可包括来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的蛋白质或含有其片段的表位；适用地，所述来自结核分枝杆菌的蛋白质选自ESAT-6、Ag85B、TB10.4、Rv2626和/或RpfD-B。
所述抗原可以是肿瘤相关抗原。所述肿瘤相关抗原可以包括结直肠肿瘤抗原；MUC1；和/或肿瘤新抗原(neoantigen)。
所述第一mRNA构建体还可包括另一开放阅读框(ORF)，其中所述另一ORF编码与所述第一ORF编码的抗原不同的抗原。
所述另一ORF可以选自：细菌蛋白、病毒蛋白或肿瘤相关抗原，或包含其片段的表位。所述另一抗原可能类似于第一ORF编码的任何抗原；独立于所述第一ORF编码的抗原的身份(identity)。
在一些实施方案中，所述第一mRNA构建体还包括另一开放阅读框(ORF)，其中所述另一ORF编码促炎细胞因子。所述促炎细胞因子选自：IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF。
所述第一OPS包括至少3个、至少4个或至少5个miRNA靶序列。所述第一OPS包括至少3个互不相同的miRNA靶序列。所述第一OPS的任何miRNA序列都可以重复。在一些实施方案中，所述第一OPS包括所选的保护一个或多个器官或组织的miRNA序列，所述器官或组织选自肌肉、肝脏、脑、乳腺、内皮、胰腺、结肠、肾脏、肺、脾脏和皮肤、心脏、胃肠器官、生殖器官和食道，更具体地，选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏、皮肤、心脏、胃肠器官、生殖器官和食道。
在一些实施方案中，所述第一OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自一个或多个与miRNA-122、miRNA-125、miRNA-199、miRNA-124a、miRNA-126、miRNA-98、Let7 miRNA家族、miRNA-375、miRNA-141、miRNA-142、miRNA-148a/b、miRNA-143、miRNA-145、miRNA-194、miRNA-200c、miRNA-203a、miRNA-205、miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-206、miRNA-34a、miRNA-192、miRNA-194、miRNA-204、miRNA-215、miRNA-30家族(例如miRNA-30a、b或c)、miRNA-877、miRNA-4300、miRNA-4720和/或miRNA-6761结合的序列。在一些实施方案中，所述第一OPS包括至少两个miRNA靶序列,所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a、miRNA-203a、Iet7b、miRNA-126和/或miRNA-192结合的序列。所述第一OPS包括一个或多个选自SEQ ID NO:44-57的序列。所述第一OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA133a、miRNA206、miRNA122、miRNA203a、miRNA205、miRNA200c、miRNA30a和/或Iet7a/b结合的序列。所述第一OPS包括至少两个miRNA靶序列,所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和/或miR-203a；与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a和miRNA-203a；与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a；与Iet7b、miRNA-126和miRNA-30a；与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的序列。在一些实施方案中，所述第一OPS包括能够与miRNA-192、miRNA-30a和miRNA-124结合的miRNA靶序列，以及能够与miRNA 122结合的两个miRNA靶序列。
在一些实施方案中，所述组合物还包括包含第二开放阅读框(ORF)的第二mRNA构建体，其中所述第二ORF编码促炎细胞因子。所述促炎细胞因子选自：IL-12、IL-2、IL-6、IL-8、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα和GM-CSF。所述第二mRNA构建体可以包含在递送组合物中或吸附到递送组合物上，所述组合物与第一mRNA构建体相同或不同。所述递送组合物选自递送载体：颗粒(如聚合物颗粒)、脂质体、类脂质颗粒和病毒载体。
所述第二ORF编码IL-12蛋白、或其亚基、衍生物、片段、激动剂或同源物。特别地，所述第二ORF包括与SEQ ID NO:59至少90％相同的序列。
在一些实施方案中，所述第二ORF可操作地与第二非翻译区(UTR)结合，其中所述UTR包括第二器官保护序列(OPS)，并且其中所述第二OPS包括至少两个微RNA(miRNA)靶序列。所述至少两个miRNA靶序列可以被优化以与相应的miRNA序列杂交。所述第二OPS被定义为类似于上述第一OPS的任何变体，并且独立于第一OPS的身份而变化。
在一些实施方案中，所述第二OPS包括至少3个、至少4个或至少5个miRNA靶序列。所述第二OPS包括至少3个互不相同的miRNA靶序列。所述第二OPS包括所选的保护一个或多个器官或组织的miRNA序列，所述器官或组织选自肌肉、肝脏、脑、乳腺、内皮、胰腺、结肠、肾脏、肺、脾脏和皮肤，更具体地，选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏、皮肤、心脏、胃肠器官、生殖器官和食道。
在一些实施方案中，所述第二OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自一个或多个与miRNA-122、miRNA-125、miRNA-199、miRNA-124a、miRNA-126、miRNA-98、Let7 miRNA家族、miRNA-375、miRNA-141、miRNA-142、miRNA-148a/b、miRNA-143、miRNA-145、miRNA-194、miRNA-200c、miRNA-203a、miRNA-205、miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-206、miRNA-34a、miRNA-192、miRNA-194、miRNA-204、miRNA-215、miRNA-30家族(例如，miRNA-30a、b或c)家族(例如，miRNA-30a、b或c)、miRNA-877、miRNA-4300、miRNA-4720和/或miRNA-6761结合的序列。在一些实施方案中，所述第二OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a、miRNA-203a、Iet7b、miRNA-126和/或miRNA-192结合的序列。所述第二OPS包括一个或多个选自SEQ ID NO:44-57的序列。所述第二OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA133a、miRNA206、miRNA122、miRNA203a、miRNA205、miRNA200c、miRNA30a和/或Iet7a/b结合的序列。所述第二OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和/或miR-203a；与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a和miRNA-203a；与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a；与Iet7b、miRNA-126和miRNA-30a；和/或与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的序列。在一些实施方案中，所述第二OPS包括能够与miRNA-192、miRNA-30a和miRNA-124结合的miRNA靶序列，以及能够与miRNA 122结合的两个miRNA靶序列。
所述第一OPS包括至少一个与第二OPS不同的miRNA靶序列。所述第一OPS和所述第二OPS包括相同的miRNA靶序列。在一个实施方案中，所述第一OPS包括能够与miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和miR-203a结合的miRNA靶序列；所述第二OPS包括能够与miRNA-122、miRNA-192和/或miRNA 30a结合的miRNA靶序列。
所述组合物还包括包含至少第三开放阅读框(ORF)的至少第三mRNA构建体(除第二mRNA构建体外或代替第二mRNA构建体)，其中所述第三ORF编码与第一ORF编码的抗原不同的抗原，选自：细菌蛋白、病毒蛋白、肿瘤相关抗原或含有其片段的表位。所述第三ORF可操作地与至少与第三非翻译区(UTR)连接，其中所述UTR包括至少第三器官保护序列(OPS)，其中所述第三OPS保护多个器官，并且其中所述第三OPS包括至少两个微RNA(miRNA)靶序列，并且其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个都被优化以与相应的miRNA序列杂交。所述第三OPS被定义为类似于上述的第一或第二OPS的任何变体，并且独立于第一或二OPS的身份而变化。
在实施方案中，第一ORF编码冠状病毒刺突蛋白或含有其片段的表位，第三ORF编码病毒蛋白或含有其片段的表位，包括流感蛋白或其变体的全部或部分。
所述组合物可适用于静脉内、皮下、肌肉内、鼻内、动脉内和/或吸入施用。
在第二方面，提供了至少包括包含至少第一开放阅读框架(ORF)第一mRNA构建体的组合物；以及包括至少一个开放阅读框(ORF)的至少第二mRNA构建体的第二构建体，其中所述ORF编码促炎细胞因子，并且其中所述第二ORF可操作地与至少一个非翻译区(UTR)连接，并且其中所述UTR包括至少一个保护多个器官的OPS，其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个被优化以与相应的miRNA序列杂交。
第二方面的组合物的组分可以被定义为类似于上述第一方面的相应因素的任何变体，其他组分，例如另一ORF和另一mRNA构建体，也可以如上所述包括在内。例如，所述第一mRNA构建体的所述ORF可以编码抗原，选自：细菌蛋白、和/或病毒蛋白、和/或如上述第一方面所定义的抗原。所述组合物可以包括体内递送组合物，并且所述第一和/或第二构建体可以包括在递送组合物内或吸附在递送组合物上。所述递送组合物可包括递送载体，选自：颗粒(如聚合物颗粒)、脂质体、类脂质颗粒以及病毒载体。
所述第二mRNA构建体的ORF可编码促炎细胞因子，选自：IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF，可编码IL-12蛋白、或其衍生物、激动剂或同源物。
所述第二构建体的OPS可以被定义为上述第一方面所述的任何OPS。在一些实施方案中，所述OPS包括保护选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏和皮肤的一个或多个器官的miRNA序列。所述OPS可包括一个或多个选自SEQ ID NO:44-57的序列。所述OPS可包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a、miRNA-203a、Iet7b、miRNA-126和/或miRNA-192；与miRNA-1、miRNA133a、miRNA206、miRNA122、miRNA203a、miRNA205、miRNA200c、miRNA30a和/或Iet7a/b；与miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和/或miR-203a；与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a和miRNA-203a；与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a；与Iet7b、miRNA-126和miRNA-30a；和/或与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的序列。在实施方案中，所述OPS包括能够与miRNA-192、miRNA-30a和miRNA-124结合的miRNA靶序列，以及能够与miRNA-122结合的两个miRNA靶序列。
由所述第一mRNA构建体编码的抗原可选自：病原微生物蛋白和肿瘤相关抗原，或含有其片段的表位。所述病原微生物蛋白可选自：病毒蛋白、细菌蛋白、真菌蛋白、寄生虫蛋白和朊病毒。
所述抗原可以包括病毒蛋白或含有其片段的表位。所述抗原可以包括冠状病毒刺突蛋白、冠状病毒刺突蛋白变体、合适的SARS-CoV-2刺突蛋白。所述抗原可包括流感蛋白或其变体，或含有其片段的表位；适用地，所述流感蛋白选自血凝素、神经氨酸酶、基质-2和/或核蛋白。所述流感蛋白可选自甲型流感、乙型流感或甲型流感的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16亚型。所述抗原可包括呼吸合胞病毒(RSV)蛋白、其变体或含有其片段的表位；适用地，其中所述呼吸合胞病毒蛋白为F糖蛋白或G糖蛋白。所述抗原可包括人类免疫缺陷病毒(HIV)蛋白或含有其片段的表位；适用地，其中所述HIV蛋白是糖蛋白120中和表位或糖蛋白145。
所述抗原可包括来自结核分枝杆菌的蛋白或含有其片段的表位；适用地，所述来自结核分枝杆菌的蛋白选自ESAT-6、Ag85B、TB10.4、Rv2626和/或RpfD-B。
在进一步的实施方案中，上述任何方面或变体中描述的组合物用于预防或治疗致病性疾病的方法，其中包括将组合物施用于需要的受试者；和/或与所述的各种构建体共同施用于需要的受试者。所述致病性疾病可能由冠状病毒引起，冠状病毒可能是SARS-CoV-2病毒。
在进一步的实施方案中，提供了一种增加Th1免疫应答的方法，包括施用上述定义的组合物，特别地，其中包括编码IL-12蛋白或其亚基、衍生物、片段、激动剂或同源物的ORF。
在第三方面，提供了一种包括至少一个mRNA构建体的组合物，所述mRNA构建体包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述至少一个ORF编码促炎细胞因子，并且其中所述ORF可操作地与至少一个非翻译区(UTR)连接，其中所述UTR包括至少一个保护多个器官的OPS，并且其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，并且其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个被优化以与相应的miRNA序列杂交。
同样，第三方面的组合物的组分被定义为类似于上述第一或第二方面的相应因素的任何变体，特别是如此定义的第二mRNA构建体。所述组合物还包括体内递送组合物，其中所述mRNA构建体包含在递送组合物内或吸附在递送组合物上。所述递送组合物可包括递送载体，选自：颗粒(如聚合物颗粒)、脂质体、类脂质颗粒以及病毒载体。所述促炎细胞因子可选自：IL-12、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF；可能是IL-12蛋白、或其衍生物、激动剂或同源物。
所述OPS可被定义为上述任何方面所述的OPS。在一些实施方案中，所述OPS包括保护一个或多个器官的miRNA序列，所述一个或多个器官选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏和皮肤。所述OPS可包括一个或多个选自SEQ ID NO:44-57的序列。
所述OPS可包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a、miRNA-203a、Iet7b、miRNA-126和/或miRNA-192；与miRNA-1、miRNA133a、miRNA206、miRNA122、miRNA203a、miRNA205、miRNA200c、miRNA30a和/或Iet7a/b；与miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和/或miR-203a；与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a和miRNA-203a；与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a；与Iet7b、miRNA-126和miRNA-30a；与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a；与miRNA-192、miRNA-30a和miRNA-124结合的序列，以及能够与miRNA-122结合的两个miRNA靶序列。
在实施方案中，所述组合物用于预防致病性疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用所述组合物；并与疫苗组合物共同施用于所述受试者。
在另一实施方案中，所述组合物还包括疫苗，选自：类毒素疫苗、重组疫苗、结合疫苗、基于RNA的疫苗、基于DNA的疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、重组载体疫苗及其组合。
在第四方面，提供了一种治疗或预防一种或多种致病性疾病或改善免疫应答的方法，所述方法包括向需要的受试者施用组合物，所述组合物包括至少第一mRNA构建体，所述第一mRNA构建体包括至少第一开放阅读框(ORF)，其中所述第一ORF编码选自细菌蛋白、病毒蛋白或含有其片段的表位的抗原。所述第一ORF可操作地与至少一个非翻译区(UTR)连接，其中所述UTR包含至少第一器官保护序列(OPS)，其中所述OPS保护多个器官，并且其中所述第一OPS包含至少两个微RNA(miRNA)靶序列，并且其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个都被优化以与相应的miRNA序列杂交；以及体内递送组合物；其中所述mRNA构建体包含在递送组合物中或吸附在递送组合物上。所述递送组合物可包括递送载体，选自：颗粒(如聚合物颗粒)、脂质体、类脂质颗粒以及病毒载体。
第四方面中使用的组合物的组分被定义为类似于上述方面的相应因素的任何变体，并且可以包括上述方面，特别是第一方面中描述的其他组分。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者共同施用包括至少一个mRNA构建体的组合物，所述mRNA构建体包括至少第二开放阅读框(ORF)，其中所述第二ORF编码促炎细胞因子，所述促炎细胞因子选自：IL-12、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF。所述第二ORF可编码IL-12蛋白、或其衍生物、激动剂或同源物。所述第二ORF可包括与SEQ ID NO:59至少90％相同的序列。
所述第一OPS可包括与所述第二OPS不同的一组miRNA靶序列。所述第一OPS与所述第二OPS可包括相同的miRNA靶序列。
所述第一和/或第二OPS可以以类似于上述方面描述的形式被独立地定义。
在一些实施方案中，所述致病性疾病由冠状病毒引起，可以是SARS-CoV-2病毒。所述抗原可包括病毒蛋白或含有其片段的表位，其包括冠状病毒刺突蛋白或冠状病毒刺突蛋白变体的全部或部分。所述冠状病毒刺突蛋白可以是SARS-CoV-2刺突蛋白。
在一些实施方案中，所述第一mRNA构建体还包括另一开放阅读框(ORF)，其中所述另一ORF编码与第一ORF编码的抗原不同的抗原。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者共同施用第三mRNA构建体，所述第三mRNA构建体包括至少第三开放阅读框(ORF)，其中所述第三ORF编码与第一ORF编码的抗原不同的抗原。
在第五方面，提供了一种预防一种或多种致病性疾病或改善免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用疫苗组合物；并向所述受试者共同施用佐剂组合物，所述佐剂组合物包括至少一个mRNA构建体，所述至少一个mRNA构建体包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述至少一个ORF编码促炎细胞因子，并且其中所述ORF可操作地与至少一个非翻译区(UTR)连接，其中所述UTR包括至少一个保护多个器官的OPS，其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，并且其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个被优化以与相应的miRNA序列杂交；以及体内递送组合物；其中所述mRNA构建体包含在递送组合物中或吸附在递送组合物上。
同样，第四方面中使用的组合物的组分被定义为类似于上述方面相应因素的任何变体，并可以包括上述方面所述的其他组分。
所述促炎细胞因子可选自：IL-12、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF。
在一些实施方案中，所述疫苗组合物选自类毒素疫苗、重组疫苗、结合疫苗、基于RNA的疫苗、基于DNA的疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、重组载体疫苗及其组合。在一些实施方案中，所述疫苗组合物包括至少第一mRNA构建体，所述至少第一mRNA构建体包括至少第一开放阅读框(ORF)，其中所述第一ORF编码抗原；以及体内递送组合物，其中所述mRNA构建体包含在递送组合物内或吸附在递送组合物上。所述抗原可如任何先前方面被定义。
共同施用包括同时或按任何顺序连续地施用疫苗组合物和佐剂组合物。所述疫苗组合物和/或所述佐剂组合物可静脉内、皮下、肌肉内、鼻内、动脉内和/或吸入施用。
在第四或第五方面的一些实施方案中，所述致病性疾病是由细胞内病原体引起的。所述致病性疾病可能是潜伏感染或活动性感染。所述致病性疾病可由流感病毒、冠状病毒、SARS-CoV-2病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)或结核分枝杆菌引起。
在第六方面，提供了一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括对需要的受试者施用至少包括第一mRNA构建体的第一组合物，所述第一mRNA构建体至少包括第一开放阅读框(ORF)，其中所述第一ORF编码肿瘤相关抗原、或含有其片段的表位。所述第一ORF可操作地与至少一个非翻译区(UTR)连接，其中所述UTR包括至少第一器官保护序列(OPS)，其中所述OPS保护多个器官，并且其中所述第一OPS包括至少两个微RNA(miRNA)靶序列，并且其中至少两个miRNA靶序列中的每一个都被优化以与相应的miRNA序列杂交；以及体内递送组合物，其中所述mRNA构建体包含在递送组合物内或吸附在递送组合物上。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者共施用包括至少一个mRNA构建体的第二组合物，所述至少一个mRNA构建体包括至少第二开放阅读框(ORF)，其中所述第二ORF编码促炎细胞因子，选自：IL-12、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF。所述第二mRNA构建体可包括任何前述方面中定义的OPS。共同施用可包括同时或以任何顺序连续施用所述第一组合物和所述第二组合物。
在第七方面，提供了一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用癌症治疗性疫苗组合物；并向受试者共同施用包括至少一个mRNA构建体的组合物，所述至少一个mRNA构建体包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述至少一个ORF编码促炎细胞因子，选自IL-12、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF。所述ORF可操作地与至少一个非翻译区(UTR)连接，其中所述UTR包括至少一个保护多个器官的OPS，其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，并且其中所述至少两个miRNA靶序列的每一个被优化以与相应的miRNA序列杂交；以及体内递送组合物；其中所述mRNA构建体包含在递送组合物内或吸附在递送组合物上。
在一些实施方案中，所述癌症治疗性疫苗组合物向受试者递送肿瘤相关抗原。所述肿瘤相关抗原使用病毒载体递送至受试者，所述病毒载体可能是腺病毒载体，在一些实施方案中为ChAdOx1或ChAdOx2。
在第六或第七方面的一些实施方案中，所述肿瘤相关抗原包括结直肠肿瘤抗原和/或MUC1。所述肿瘤相关抗原可以是一种根据受试者个性化的新抗原。
在本文描述的各种实施方案和实施例中进一步举例说明本发明，如本领域技术人员所理解的，其特征可以被进一步组合以形成另外的实例方案。
附图说明
图1显示了根据本发明的实施方案纳入器官保护序列(OPS)的mRNA构建体的示意图(即，不按比例)。
图2显示了用于确定报告基因mCherry表达的方案的示意图。在向各种细胞类型施用本文所述组合物后，通过荧光显微镜(Texas Red和DAPI滤光片)进行mCherry信号分析，细胞核用Hoechst 33342染色。
图3显示了遵循上述方案的三种肝细胞类型的mCherry信号，并证明了与用对照mHerrymRNA转染后在人肝癌细胞(Hep3B)或正常小鼠肝细胞(AML12)细胞中发现的信号相比，当用含有多器官保护序列(MOP)、mCherry-3MOP或mCherry-5MOPmRNA的mRNA转染时，正常小鼠和人肝细胞的细胞信号显著降低。这些图像是用德克萨斯红和DAPI滤光片获得的图像的叠加，显示了mCherry荧光信号和细胞核染色。
图4显示了使用细胞成像多功能检测系统(Cytation instrument)(BioTeK)定量转染的细胞中的mCherry荧光。
图5A-5B显示了mCherry-3MOP处理的细胞中信号的减弱。图5A显示用本文所述组合物转染的正常人肾脏细胞中的mCherry信号，显示mCherry-3MOP处理的细胞中信号减弱，表明mCherry翻译减少。这些图像是用德克萨斯红和DAPI滤光片立方体获得的图像的叠加，示出了mCherry荧光信号和细胞核染色。图5B显示了使用细胞成像多功能检测系统(BioTek)转染的正常人肾脏细胞中mCherry荧光的定量。
图6A-6F显示了用本文所述包括与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列的组合物转染的肝细胞中mCherry信号的比较，证明了所述MOP序列抑制在AML12小鼠肝细胞中的表达，但不抑制其在肝癌细胞(Hep3B)中的表达。对于每组图片，顶部图片是用德克萨斯红和DAPI滤光立方体获得的图像的叠加，显示细胞核染色和McHerry荧光。底部图片显示了用德克萨斯红滤光片立方体获取的图像，仅显示McHerry荧光。(图6A)顶部图片显示未用mRNA转染的对照Hep3B细胞(肝癌)，底部图片显示无mCherry信号；(图6B)用不含MOP序列的mRNA转染的Hep3B细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(图6C)用含MOP序列的mRNA转染的Hep3B细胞中细胞核染色和mCherry信号；(图6D)未用mRNA转染的对照AML12细胞(正常肝细胞)中细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(图6E)用不含MOP序列的mRNA转染的AML12细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(图6F)用含MOP序列的mRNA转染的AML12细胞中细胞核染色和mCherry信号。
图7A-7F显示了用本文所述的组合物转染的肝细胞中mCherry信号的比较，所述组合物包括与Let7b、miRNA-126和miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列，证明了所述MOP序列抑制在AML12小鼠肝细胞中的表达，但不抑制其在肝癌细胞(Hep3B)中的表达。对于每组图片，顶部图片是用德克萨斯红和DAPI滤光片立方体获得的图像的叠加，显示细胞核染色和mCherry荧光。底部图片显示了用德克萨斯州红滤光片立方体获取的图像，仅显示mCherry荧光。(图7A)顶部图片显示未用mRNA转染的对照Hep3b细胞(肝癌)，底部图片显示无mCherry信号；(图7B)用不含MOP序列的mRNA转染的Hep3B细胞的细胞核染色和mCherry信号；(图7C)用含MOP序列的mRNA转染的Hep3B细胞的细胞核染色和mCherry信号；(图7D)未用mRNA转染的对照AML12细胞(正常肝细胞)的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(图7E)用不含MOP序列的mRNA转染的AML12细胞的细胞核染色和mCherry的信号；(图7F)用含MOP序列的mRNA转染的AML12细胞的细胞核染色和mCherry信号。
图8A-8B显示了用本文所述的组合物转染的肝细胞中的mCherry信号的比较，其中所述组合物包括与重复一次(1*)、两次(2*)或四次(4*)的miRNA-122结合的完美匹配的多重MOP序列，并示出了其对正常肝细胞中mCherry表达的抑制存在一定剂量依赖性(图8A)，但在Hep3B癌细胞中几乎没有剂量依赖性(图8B)。对于(图8A)和(图8B)中的每一个，顶部图片是用德克萨斯红和DAPI滤光片立方体获取的图像的叠加，显示细胞核染色和mCherry荧光。底部图片显示了用德克萨斯州红滤光片立方体获取的图像，仅显示mCherry荧光。还包括对照(未注射的mRNA)，及不含MOP序列的mRNA的mCherry。
图9A-9D显示了用本文所述的组合物转染的AML12小鼠肝脏肝细胞中mCherry信号的比较，所述组合物包括与miRNA122结合的不完美匹配的双(2*)MOP序列。对于(图9A)、(图9B)、(图9C)和(图9D)中的每一个，顶部图片是用德克萨斯红和DAPI滤光片立方体获取的图像的叠加，显示细胞核染色和mCherry荧光。底部图片显示了用德克萨斯红滤光片立方体获取的图像，仅显示mCherry荧光。(图9A)顶部图片显示未用mRNA转染的对照AML12细胞(正常肝脏)中的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(图9B)用不含MOP序列的mRNA转染的AML12细胞的细胞核染色和mCherry的信号；(图9C)用含与2*miRNA122不完美匹配的MOP序列的mRNA转染的AML12细胞的细胞核染色和mCherry信号(未优化)，底部图片显示在AML12细胞中检测到mCherry的表达；(图9D)用含与2*miRNA122完美匹配的MOP序列的mRNA转染的AML12细胞的细胞核染色和mCherry信号(优化的)，底部图片显示在AML12细胞中几乎没有检测到mCherry的表达。
图10A-10F显示了用本文所述的组合物转染肾脏细胞中mCherry信号的比较，其中所述组合物包括与Let7b、miRNA-126和miRNA-30A结合的完美匹配的MOP序列，证明了所述MOP序列抑制mCherry在人肾脏细胞(hREC)中的表达，但不抑制在癌细胞(786-0)中的表达。对于(图10A)、(图10B)、(图10C)、(图10D)、(图10E)和(图10F)中的每一个，顶部图片是用德克萨斯红和DAPI滤光片立方体获取的图像的叠加，显示细胞核染色和mCherry荧光。底部图片显示了用德克萨斯红滤光片立方体获取的图像，仅显示mCherry荧光。(图10A)顶部图片显示未用mRNA转染的对照786-0人肾细胞腺癌细胞中的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(图10B)用不含MOP序列的mRNA转染的786-0细胞的细胞核染色和mCherry信号；(图10C)用含MOP序列的mRNA转染的786-0细胞的细胞核和mCherry信号；(图10D)未用mRNA转染的对照hREC细胞(正常混合肾上皮细胞)的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(图10E)用不含MOP序列的mRNA转染的hREC细胞的细胞核染色与mCherry信号；(图10F)用含MOP序列的mRNA转染的hREC细胞的细胞核染色与mCherry信号，所述mCherry信号本身显示几乎无表达。
图11A-11F显示了用本文所述的组合物转染的肾脏细胞的mCherry信号的比较，其中所述组合物包括与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列，证明了MOP序列抑制mCherry在人肾脏细胞(hREC)的表达，但不抑制其在癌细胞(786-0)中的表达。对于(图11A)、(图11B)、(图11C)、(图11D)、(图11E)和(图11F)中的每一个，顶部图片是用德克萨斯红和DAPI滤光片立方体获取的图像的叠加，显示细胞核染色和mCherry荧光。底部图片显示了用德克萨斯红滤光片立方体获取的图像，仅显示mCherry荧光。(图11A)顶部图片显示未用mRNA转染的对照786-0人肾细胞腺癌细胞的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(图11B)用不含MOP序列的mRNA转染的786-0细胞中的细胞核染色和mCherry信号；(图11C)用含有MOP序列的mRNA转染的786-0细胞中的细胞核和mCherry信号，其显示了表达的迹象；(图11D)未用mRNA转染的对照hREC细胞(正常混合肾上皮细胞)的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(图11E)用不含MOP序列的mRNA转染的hREC细胞的细胞核染色和mCherry信号；(图11F)用含有MOP序列的mRNA转染的hREC细胞的细胞核染色和mCherry信号，所述mCherry信号本身显示几乎无表达。
图12A-12B显示了根据一个实施方案进行实验的结果，其中用本文所述的组合物转染人PBMC细胞，所述组合物包括(图12A)在三个剂量水平上表达人IL-12的mRNA，在用以下mRNA：NC(源自单链的非编码人重组IL-12—无ATG密码子)、hdclL-12(源自IL12A和IL12BmRNA的1:1混合物的人重组IL-12)，hsclL-12(源自单链的人重组IL-12)和hdclL-12-MOP(源自单链人重组IL-12)转染6小时后记录IL-12表达，所述mRNA是包括与miRNA-122-miRNA-203a-miRNA-1-miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列的表达单链重组IL-12的mRNA；(图12B)在三个剂量水平上表达人GM-CSF的mRNA，用以下mRNA：NC(非编码GM-CSF mRNA—无ATG密码子)、hGM-CSF和hGM-CSF-MOP转染6小时后记录GM-CSF的表达，所述mRNA是包括与miRNA-122-miRNA-203a-miRNA-1-miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列的表达hGM-CSF的mRNA。
图13A-13F显示了用本文所述组合物转染的结肠上皮细胞的mCherry信号的比较，所述组合物包括与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列，证明了MOP序列抑制在结肠上皮细胞的表达，但不抑制其在结肠癌细胞(HCT-116)中的表达。对于每组图片，顶部图片是用德克萨斯红和DAPI滤光片立方体获得的图像的叠加，显示细胞核染色和mCherry荧光。底部图片显示了用德克萨斯红滤光片立方体获取的图像，仅显示mCherry荧光。(图13A)顶部图片显示未用mRNA转染的对照结肠上皮细胞，底部图片显示无mCherry信号；(图13B)用不含MOP序列的mRNA转染的结肠细胞的细胞核染色和mCherry信号；(图13C)用含MOP序列的mRNA转染的结肠细胞的细胞核染色和mCherry信号；(图13D)未用mRNA转染的对照HCT-116细胞(结肠癌)的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(图13E)用不含MOP序列的mRNA转染的HCT-116细胞的细胞核染色和mCherry的信号；(图13F)用含有MOP序列的mRNA转染的HCT-116细胞的细胞核染色和mCherry信号。
图14A-14F显示了用本文所述组合物转染的结肠上皮细胞的mCherry信号的比较，其中所述组合物包括与miRNA-let7b、miRNA-126和miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列，证明了所述MOP序列通过抑制正常结肠细胞和结肠癌细胞的表达提供器官保护，这归因于miRNA-let7b结合位点的存在。对于每组图片，顶部图片是用德克萨斯红和DAPI滤光片立方体获得的图像的叠加，显示细胞核染色和mCherry荧光。底部图片显示了用德克萨斯红滤光片立方体获取的图像，仅显示mCherry荧光。(图14A)顶部图片显示未用mRNA转染的对照结肠上皮细胞，底部图片显示无mCherry信号；(图14B)用不含MOP序列的mRNA转染的结肠细胞的细胞核染色和mCherry信号；(图14C)用含MOP序列的mRNA转染的结肠细胞的细胞核染色和mCherry信号；(图14D)未用mRNA转染的对照HCT-116细胞(结肠癌)的细胞核染色，底部图片显示无mCherry信号；(图14E)用不含MOP序列的mRNA转染的HCT-116细胞的细胞核染色和mCherry的信号；(图14F)用含MOP序列的mRNA转染的HCT-116细胞的细胞核染色和mCherry信号。
图15A-15C显示了用本文所述组合物转染的正常健康肺细胞(BEAS-2B)的mCherry信号，所述组合物包括与miRNA-let7b、miRNA-126和miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列，证明了所述MOP序列通过在抑制健康肺细胞的表达为肺提供器官保护，这归因于miRNA-let7b结合位点的存在。对于每组图片，顶部图片是用德克萨斯红和DAPI滤光片立方体获得的图像的叠加，显示细胞核染色和mCherry荧光。底部图片显示了用德克萨斯红滤光片立方体获取的图像，仅显示mCherry荧光。(图15A)顶部图片显示未用mRNA转染的对照细胞，底部图片显示无mCherry信号；(图15B)用不含MOP序列的mRNA转染的细胞的细胞核染色和mCherry的信号；(图15C)用含有MOP序列的mRNA转染的肺细胞的细胞核染色和mCherry信号。
图16A-16B显示了小鼠体内生物分布实验的结果，证明(图16A)在本发明的组合物施用3.5小时(T3.5h)后，通过全身成像，可以在所有组中看到高水平的荧光素酶表达，包括含有MOP的构建体(第2组和第3组)和对照组不含MOP的构建体(第1组)；但24小时(T24h)后，在含有MOP的组合物中观察到荧光素酶表达的显著下调。在(图16B)24小时后器官的离体成像中，与第1组(无MOP的对照)相比，第2组和第3组(包含MOP的构建体)小鼠的肝脏、肺、脾脏和肾脏中的荧光素酶表达减少。
图17A-17B显示了携带皮下Hep3B肿瘤(人类肝癌)的小鼠生物分布研究的进一步结果。根据本发明的某些实施方案，每只小鼠接受肿瘤内注射组合物处理。通过24小时后的离体成像，可以在所有组的肿瘤组织中观察到荧光素酶表达，同时通过组2和组3的MOP序列提供肝脏保护。空载组接受磷酸盐缓冲盐水处理。第1组接受荧光素酶(无MOP的对照)。
图18显示了存在或不存在小鼠IL-12佐剂时，对卵清蛋白的抗原特异性免疫应答的动物研究结果。mRNA的施用剂量在图表下方的表格中示出。所述应答以免疫14天后在血清中检测到的抗卵清蛋白小鼠IgG的数量来表示。
图19显示肌肉内施用后小鼠体内生物分布实验的结果。体外成像结果表明，与不含MOP的对照(Luc)相比，施用本发明的某些实施方案的组合物4小时后，含有MOP的构建体(Luc-MOP1、Luc-MOP2、Luc-MOP3)的组中小鼠的多个器官中荧光素酶表达减少。除了Luc-MOP1，所有组的注射部位均保持较高的表达。空载组接受磷酸盐缓冲盐水处理。结果表明，通过肌肉内施用本发明的组合物可以实现有效的器官保护。
图20显示静脉内施用后小鼠体内生物分布实验的结果。体外成像结果表明，与不含MOP的对照(Luc)相比，施用本发明的某些实施方案的组合物6小时后，含有MOP构建体(Luc-MOP1、Luc-MOP2、Luc-MOP3)的组中小鼠的多个器官中荧光素酶表达减少。空载组接受磷酸盐缓冲盐水处理。结果表明，通过静脉内施用本发明的组合物可以实现有效的器官保护。
图21显示了在存在或不存在小鼠IL-12mRNA佐剂的免疫刺激的情况下，对SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的特异性免疫应答的动物研究结果。图21显示了Balb/c小鼠在免疫42天后产生的对血清IgG的应答。
图22A-22B显示了根据一个实施方案进行实验的结果，其中用本文所述的组合物转染人PBMC细胞，所述组合物包括在三个剂量水平上表达人IL-12的mRNA。图22a显示了用以下mRNA：NC(源自单链的非编码人重组IL-12—无ATG密码子)、hscL-12(源自单链的人重组IL-12)和hsclL-12-MOPV(包括与miRNA-122-miRNA-203a-miRNA-1-miRNA-30a结合的完美匹配的表达单链重组IL-12的mRNA)，hsclL-12-MOPC(包括与miRNA-122-miRNA-192-miRNA-30a结合的完美匹配的MOP序列的表达单链重组IL-12的mRNA)定量的转染24小时后的IL-12的表达。图22b显示了表达人IL-12的mRNA转染的PBMC中IL-12介导的干扰素γ(IFN-γ)诱导。用所述mRNA转染72小时后测量人干扰素γ。数据显示了人IL-12的剂量依赖性表达(图22A)和IL-12介导的干扰素γ诱导(图22B)，IL-12是一种对先天免疫和适应性免疫都至关重要的免疫刺激细胞因子。
图23显示了根据一个实施方案进行实验的结果，其中用本文所述组合物转染人PBMC细胞，所述组合物包括含有MOP的表达SARS-CoV-2刺突mRNA的mRNA、含有MOP的表达人单链重组IL-12的mRNA(HSCLL-12-MOPV)和不含MOP的表达人单链重组IL-12的mRNA(HSCIL-12)的组合。所述MOP序列包括与miRNA-122-miRNA-203a-miRNA-1-miRNA-30a完美匹配的结合序列。结果表明，转染120小时后，在存在表达人IL-12的mRNA时，无论是否有MOP，干扰素γ(INF-γ)表达均增加。
具体实施方式
除非另有说明，本发明的实践使用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术和化学方法的常规技术，这些技术属于本领域普通技术人员的能力范围。文献中也解释了这些技术，例如，M.R.Green,J.Sambrook,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第四版,1-3册,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.等人(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Online ISSN:1934-3647)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak和James O'D.McGee,1990,In SituHybridisation:Principles and Practice,Oxford University Press；M.J.Gait(编辑),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods ofEnzymology:DNA Structure Part A:Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press；SyntheticBiology,Part A,Methods in Enzymology,Chris Voigt编辑,497卷,2-662页(2011)；Synthetic Biology,Part B,ComputerAided Design and DNAAssembly,Methods inEnzymology,Christopher Voigt编辑,498卷,2-500页(2011)；RNAInterference,Methodsin Enzymology,David R.Engelke和John J.Rossi,392卷,1-454页(2005)。这些通用文本中的每一个都通过引用并入本文。
在阐述本发明之前，提供了许多有助于理解本发明的定义。本文引用的所有参考文献均通过引用全部并入本文。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属技术领域的任何普通技术人员通常理解的含义相同。
如本文所用，术语“包括”一词是指必须包括所引用的任何元素，并任选地包括其他元素。“基本上由...组成”是指必须包括任何引用的元素，排除可能对所列元素的基本和新颖特征产生重大影响的元素，并任选地包括其他元素。“由……组成”是指排除所列元素以外的所有元素。这些术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
当应用于多核苷酸序列时，术语“分离的”是指所述序列已从其来源的天然生物体中移除，因此不含外来或不需要的编码或调控序列。所述分离的序列适用于重组DNA过程和基因工程化蛋白质合成系统。这些分离的序列包括cDNA、mRNA和基因组克隆。所述分离的序列可以仅限于蛋白质编码序列，或者还可以包括5′和3′调控序列，如启动子和转录终止子，或者非翻译序列(UTR)。在进一步阐述本发明之前，提供了许多有助于理解本发明的定义。
“多核苷酸”是核苷酸的单链或双链共价连接序列，其中每个核苷酸上的3′和5′末端由磷酸二酯键连接。所述多核苷酸可由脱氧核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基组成。多核苷酸包括DNA和RNA，可在体外合成或自天然来源分离。多核苷酸的大小通常表示为双链多核苷酸的碱基对数(bp)，或在单链多核苷酸情况下表示为核苷酸数(nt)。一千bp或nt等于一千碱基数(kb)。长度小于约40个核苷酸的多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”。本文所用术语“核酸序列”是核苷酸的单链或双链共价连接序列，其中每个核苷酸上的3′和5′末端由磷酸二酯键连接。所述多核苷酸可由脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基组成。核酸序列可包括DNA和RNA，可在体外合成或自天然来源分离。在本发明的具体实施方案中，所述核酸序列包括信使RNA(mRNA)。
核酸可进一步包括修饰的DNA或RNA，例如甲基化的DNA或RNA或翻译后修饰的RNA，例如用7-甲基鸟嘌呤5′端加帽，3′端处理，如切割、聚腺苷酸化和剪接。核酸还可包括合成核酸(XNA)，如己醇核酸(HNA)、环己烯核酸(CENA)、苏糖核酸(TNA)、甘油核酸(GNA)、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。
根据本发明，本文所述的核酸序列的同源性不限于简单的100％序列一致性。在这方面，与两个序列相关的所述术语“实质相似”是指序列至少具有70％、80％、90％、95％或100％的相似性。同样的，与两个序列相关的所述术语“实质上互补”是指序列是完全互补的，或者至少70％、80％、90％、95％或99％的碱基是互补的。也就是说，旨在杂交的序列的碱基之间可能出现错配，这可以发生在至少1％、5％、10％、20％或高达30％的碱基之间。然而，在某些情况下，可能需要区分可以相互杂交但包括一些错配(“不准确匹配”、“不完美匹配”或“不准确互补”)的两个序列，以及可以相互杂交而没有错配(“准确匹配”、“完美匹配”和“准确互补”)的两个序列。此外，还考虑了可能的错配程度。
如本文所述，术语“器官保护序列”(OPS)指的是包括多种天然或合成来源的微RNA(miRNA)靶序列的序列，以及任选地一个或多个辅助序列。如果OPS对多个器官提供保护，则其被当做多个或“多”器官保护(MOP)序列。所述术语“靶序列”是指包含在mRNA序列中的序列，例如在非翻译区(UTR)中的序列，其靶向与特定mRNA结合。结合通过miRNA和相应靶序列包括的互补碱基对之间的核酸杂交发生。结合作用可以被优化，使得在特定miRNA和靶序列之间不发生错配，或者限定错配在靶序列的长度上不超过单个碱基对错配。在本发明的一个实施方案中，单基错配仅限于靶序列的5′或3′端。优化的序列也可以被描述为与细胞中存在的靶miRNA完美匹配，并且可能与野生型结合序列相差两个或更多碱基对。包含两个以上天然发生的错配的野生型序列被认为与相应的互补miRNA序列不完全(un-perfectly)或不完美(im-perfectly)匹配。
当应用于核酸序列时，例如在表达构建体中，所述术语“可操作地与……连接”表明序列被排列以使得它们功能协同从而实现其预期目的。举例来说，在DNA载体中，启动子序列允许启动从连接的编码序列开始至终止序列的转录。在RNA序列的情况下，一个或多个非翻译区(UTR)可以相对于开放阅读框(ORF)的连接的多肽编码序列相关的方式排列。本文所述的给定mRNA可能包括不止一个ORF，即所谓的多顺反子RNA。如本领域已知的，mRNA可以编码多个多肽，并且作为结果，包括使得多功能产物产生所需的切位点或其他序列。UTR可包括通常在自然界中发现的mRNA序列中发现的序列，如任何或多个：Kozak共有序列、起始密码子、顺式作用翻译调控元件、非帽依赖性翻译起始序列、多聚A尾、内部核糖体进入位点(IRES)、调节mRNA稳定性和/或寿命的结构、指导mRNA定位的序列等。所述一个或多个UTR包括OPS或位于OPS附近或邻近。UTR可以包括提供对mRNA的翻译或稳定性控制的线性序列，如Kozak序列，或者它们还可以包括促进局部二级结构形成的一个或多个序列，特别是在5′UTR内。在本发明的一个实施方案中，具有低于平均GC含量的5′UTR可用于促进mRNA的有效翻译。
在本发明的上下文中，所述术语“表达多肽”是指编码多核苷酸序列的多肽的产生。通常，这涉及翻译所提供的mRNA序列(即ORF)，所述翻译通过序列递送至细胞的核糖体机制进行。
本文所用的术语“患病”一词，如“患病细胞”和/或“患病组织”，是指呈现异常、不健康或疾病病理学的组织、器官(或其部分)和细胞。例如，患病细胞可能感染病毒、细菌、朊病毒、真菌或真核寄生虫；可能包括致病突变；和/或可能是癌性的、癌前的、肿瘤性的或赘生物的。感染可能包括一个内化的病原体，并在其生命周期的很大一部分时间内驻留在细胞内。与其他正常或所谓的健康细胞相比，患病细胞可能包括改变的细胞内miRNA环境。在某些情况下，患病细胞可能病理正常，但包括代表疾病前体状态的改变的细胞内miRNA环境。疾病组织可能包括已被另一器官或器官系统的患病细胞浸润的健康组织。举例来说，许多炎症疾病包括其他受免疫细胞(如T细胞和中性粒细胞)浸润的健康器官的病理。再举一例，发生狭窄或硬化病变的器官和组织可包括相邻的健康细胞和患病细胞。
本文所用的术语“癌症”指组织中的肿瘤，包括恶性肿瘤，可能是始于特定组织的原发性癌症，或因其他地方的转移而扩散的继发性癌症。所述术语癌症、肿瘤和恶性肿瘤在本文互换使用。癌症可能导致位于肿瘤内或具有肿瘤相关性质的组织或细胞。肿瘤通常具有将其与正常组织和正常细胞区分开来的特征。这些特征包括但不限于：渐变程度、形态变化、形状不规则、细胞粘附性降低、转移能力和细胞增殖增加。与“癌症”相关且通常同义的术语包括肉瘤、癌症、恶性肿瘤、上皮瘤、白血病、淋巴瘤、转化、肿瘤等。如本文所用，“癌症”一词包括癌前病变和/或癌前肿瘤以及恶性肿瘤。
本文所用的如在“健康细胞”和/或“健康组织”中的术语“健康”，表示自身未患病的和/或近似于通常正常功能表型的组织、器官(或其部分)和细胞。可以理解，在本发明的上下文中，所述术语“健康”是相对的，例如，受肿瘤影响的组织中的非肿瘤细胞在绝对意义上不完全健康。因此，“非健康细胞”是指自身不是肿瘤性、癌性或癌前的，但可以是肝硬化、发炎的、感染的或其他疾病的细胞。类似地，“健康或非健康组织”是指无肿瘤(tumor)、肿瘤(neoplastic)、癌性或癌前细胞、或上述其他疾病的组织或其部分；不考虑整体健康状况。例如，在包括癌症和纤维化组织的器官背景下，纤维化组织内的细胞与癌症组织相比可能被认为相对“健康”。用于“健康”细胞近似正常功能表型的模型可包括在细胞功能和基因表达方面接近原始细胞的永生细胞系。
在替代实施方案中，细胞、细胞类型、组织和/或器官的健康状况由miRNA表达的定量决定。在某些疾病类型中，如癌症，特定miRNA种类的表达受到影响，与未受影响的细胞相比上调或下调。miRNA转录组中的这种差异可被用于识别健康的相对状态和/或跟踪健康细胞、细胞类型、组织和/或器官向疾病状态的进展。所述疾病状态可包括转化为肿瘤细胞的不同阶段。在本发明的实施方案中，利用给定器官或器官系统中包括的细胞类型的miRNA转录组的不同变异来控制不同细胞类型中的蛋白质表达。
如本文所用，术语“器官”与“器官系统”同义，指的是组织和/或细胞类型的组合，可在受试者体内进行比较，以提供生物功能，如生理、解剖学、稳态或内分泌功能。合适地，器官或器官系统可能意味着血管化的内脏，如肝脏或胰腺。通常，器官包括至少两种组织类型和/或呈现出器官表型特征的多种细胞类型。组织或组织系统可以相互配合，但不能被正式视为一个器官。例如，血液通常被视为组织，甚至是液体组织，但取决于所使用的定义，其严格意义上可能不被视为器官。然而，本发明的组合物和方法在某些情况下可用于显示对器官、组织和组织系统(包括血液、造血和淋巴组织)的保护作用。
本文所用术语“治疗性病毒”指的是一种能够感染和杀伤癌细胞的病毒，包括通过刺激宿主抗肿瘤应答间接杀伤。治疗性病毒还可包括可用于疫苗制剂中的减毒病毒或修饰的病毒。
表1-治疗性病毒及其亚型的实例
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在本发明的实施方案中，病毒可选自巴尔的摩病毒分类(组1-VII中的任何一组(Baltimore D(1971)."Expression ofanimal virus genomes".Bacteriol Rev.35(3):235-41)。在本发明具体实施方案中，合适的病毒可选自巴尔的摩组I，其特征为具有双链DNA病毒基因组；组II，其特征为具有阳性单链DNA基因组，组III，其特征为具有双链RNA病毒基因组，组IV，其具有单链阳性RNA基因组；和组V，其具有单链阴性RNA基因组。
本文所用术语“多肽”是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论是天然产生还是通过合成手段体外产生。长度小于约12个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”，长度介于约12和约30个氨基酸残基之间的多肽称为“寡肽”。本文所用术语“多肽”表示天然存在的多肽、前体形式或前蛋白的产物。多肽还可以经历成熟或翻译后修饰过程，包括但不限于：糖基化、蛋白质切割、脂质化、信号肽切割、前肽切割、磷酸化等。本文所用术语“蛋白质”是指包含一个或多个多肽链的大分子。
本文所用术语“基因产物”指本发明所述的mRNA构建体中包含的至少一个编码序列或开放阅读框(ORF)编码的肽或多肽。可以使用多顺反子mRNA构建体，其结果是产生由位于同一多核苷酸链上的多个ORF编码的多基因产物。值得注意的是，多个ORF可能导致多种产物(如蛋白质、肽或多肽)的原位生产，这些产物可以功能上相互配合，或形成具有不同的生物学和潜在的治疗效果的复合物和/或多聚蛋白。
由mRNA编码的基因产物通常是肽、多肽或蛋白质。如果特定蛋白质由多于一个亚基组成，mRNA可能编码一个或多个ORF中的一个或多个亚基。在替代方案中，第一mRNA可编码第一亚基，而第二联合施用的mRNA可编码第二亚基，当进行原位翻译时，使得多亚基蛋白基因产物组装。靶细胞内基因产物的翻译允许对待用的细胞类型进行适当的局部翻译后修饰。这些修饰可以调节基因产物的折叠、定位、相互作用、降解和活性。常见的翻译后修饰可包括剪切、再折叠和/或化学修饰，如甲基化、乙酰化或糖基化。
如果存在于分离的mRNA构建体上，并配制成与递送颗粒相连(如本文其他地方所述)，则可以共同配制，使得不同的mRNA构建体可以与相同的单个递送颗粒相连，或者分别配制，使得不同mRNA构建体可以与不同的递送颗粒相连。
将mRNA定向递送到允许定向且可控地翻译目标基因产物(例如细胞中的多肽和/或蛋白质)的细胞。提供不仅允许使用细胞表达调节机制，例如miRNA介导的控制(如以下具体实施方案中详述的)，还表示产品的有限且穷举的供应，而不是对靶细胞的转录组的潜在永久变化的特定mRNA，其可提供插入游离基因或基因组的DNA载体。
在本发明的实施方案中，提供了一种mRNA序列，其包括编码与一个或多个非翻译区(UTR)可操作地结合的至少一个多肽，所述非翻译区赋予核酸序列整体组织特异性及稳定性。“组织特异性”意味着mRNA编码的蛋白质产物的翻译根据UTR的存在进行调节。调节可包括允许、减少甚至阻断mRNA到蛋白质的可检测翻译。所述UTR可定向与mRNA顺式连接，即在同一多核苷酸链上。在另一替代方案中，提供了编码基因产物的第一序列和与第一序列的一部分杂交的另一个第二序列，所述第二序列包括赋予核酸序列整体的组织特异性的一个或多个UTR。在后一种情况下，UTR与编码反式基因产物的序列可操作地连接。
根据本发明的具体实施方案，提供了一种mRNA，其包括与之可操作的连接的必要的相关核酸序列，以防止或减少基因产物在非患病组织中，例如在健康肝细胞、中枢神经系统、肌肉、皮肤等中的表达。所述mRNA在此被称为“编码mRNA”。因此，提供了编码mRNA构建体或转录物，包括5′端帽，以及核糖体招募和组织和/或器官特异性表达所需的UTR(通常但不排他地定位在ORF的3′端)，以及分别定义一个或多个ORF的起始和终止密码子。当将构建体全身或局部施用于非患病肝脏、肺、胰腺、乳腺、脑/中枢神经系统、肾脏、脾脏、肌肉、皮肤和/或结肠胃肠道时，其阻止或减少了基因产物的表达。相比之下，包括在上述器官内的肿瘤或其他患病细胞通常不符合正常的非患病细胞表达模式，具有完全不同的miRNA转录组。由mRNA编码的多肽在这些异常细胞中特异性翻译，但在相邻的健康或非患病细胞中不翻译或翻译得更少。可以通过如本文所述的颗粒递送平台，或以任何本领域已知的合适方式实现将mRNA构建物递送到上述器官。细胞类型特异性表达可以通过微RNA调节机制介导，如下文更详细的描述。
根据本发明的另一实施方案，提供了一种mRNA，其包括与之可操作地连接的必要的相关核酸序列，以防止或减少组织或器官中基因产物表达，而不需要对抗原，例如在肝细胞、中枢神经系统、肌肉、皮肤、肾脏等中的抗原产生免疫应答。提供的编码mRNA构建体或转录物，包括或不包括5′端帽，一个或多个核糖体招募和组织和/或器官特异性表达所需的UTR(通常但不排他地定位在ORF的3′端)，以及分别定义一个或多个ORF的起始和终止密码子。当将所述构建体全身或通过局部施用于受试者时，其阻止或减少了免疫应答通常不需要的细胞和组织中基因产物的表达。相比之下，免疫细胞，如T细胞、B细胞或抗原呈递细胞(APC)，包括不同类型的树突状细胞(DC)，包括在体内或有不同的miRNA转录组的上述器官。由mRNA编码的多肽在这些免疫细胞中特异性翻译，但在相邻的健康细胞和组织中不翻译或翻译得更少。可通过本文所述的颗粒递送平台或本领域已知的任何合适方式实现将mRNA构建体递送至上述细胞和组织。
本文所定义的“治疗成分”或“治疗剂”指的是作为治疗干预的一部分施用于个体人类或其他动物时，有助于对个体人类或其它动物产生治疗效果的分子、物质、细胞或生物体。所述治疗效果可能由治疗成分本身或治疗干预的另一成分引起。所述治疗成分可能是编码核酸成分，特别是mRNA。所述编码核酸成分可能编码治疗增强因子，如下所述。治疗成分还可包括药物、任选地化疗药物，如小分子或单克隆抗体(或其片段)。在本发明的其他实施方案中，所述治疗剂包括治疗性病毒，例如病毒载体。
所述术语“治疗效果”是指由包括的物质、分子、组合物、细胞或生物体药理学或治疗性活性剂施用于受试者引起的动物受试者(通常是人类)的局部或全身性效果。所述术语“治疗干预”是指施用此类物质、分子，组合物、细胞和生物体。因此，所述术语是指用于诊断、治愈(cure)、缓解、治疗(treatment)或预防疾病，或增强动物或人类受试者目标的身体或精神发育和状况的任何药剂。所述“有效治疗量”一词是指产生目标局部或全身效应的，具有适用于任何治疗的合理益处/风险比的药剂量。在某些实施方案中，药剂的有效治疗量取决于其治疗指数、溶解度等。例如，本发明的某些治疗剂可以以足够的量施用，以产生适用于这种治疗的合理益处/风险比。在包括传染病或癌症在内的疾病治疗的特定情况下，“治疗效果”可通过多种方式表现出来，包括但不限于传染病病原体滴度下降、有益细胞生物标志物增加(例如白细胞计数增加)、实体肿瘤体积减少、癌细胞数量减少、观察到的转移数量减少、预期寿命增加，癌细胞增殖减少、癌细胞存活减少、肿瘤细胞标志物表达减少和/或与疾病相关的各种生理症状改善。在治疗病毒、细菌或寄生虫感染的具体情况下，如通过疫苗接种进行预防，“治疗效果”可能表现为对病原体攻击的完全或部分抗性、人类或动物受试者中存在针对所述病原体的循环抗体或其他已知的疫苗有效性措施。
在一个实施方案中，所述接受治疗的受试者是哺乳动物(如啮齿动物、灵长类、非人哺乳动物、家养动物或牲畜，如狗、猫、兔子、豚鼠、牛、马、绵羊、山羊等)，并且适用于人类。在另一实施方案中，所述受试者是患病动物模型，如癌症。例如，所述动物模型可以是人源性癌症的异种原位移植动物模型，适用于肝脏、肺、胰腺、乳腺、脑、肾脏、肌肉、皮肤和/或结肠胃肠道癌症。在另一实施方案中，所述受试者是患传染病动物模型。例如，所述动物模型可能感染一种或多种病毒、细菌、真菌、朊病毒或真核寄生虫，或者可能将感染此类病原体。
在本发明所述方法的具体实施方式中，所述受试者尚未接受治疗处理，如治疗性病毒治疗、化疗、放射治疗、靶向治疗、疫苗接种和/或抗免疫检查点治疗。在另一实施方案中，所述受试者已经接受了如上述治疗的治疗处理。然而，在另一实施方案中，所述受试者接受了治疗性处理，如上述治疗。
在另一实施方案中，所述受试者进行了切除癌性或癌前组织的手术。在其他实施方案中，所述癌性组织未被切除，例如，所述癌性组织位于身体的不可手术区域，例如，如果接受手术干预，可能会危及受试者的生命的组织或器官，或手术程序将导致相当大的永久性伤害甚至致命的风险的区域。
在一些实施方案中，提供的编码mRNA构建体可编码“治疗性增强因子”。根据本发明，治疗性增强因子是基因产物或多肽，其可以增强或促进另一种共施用的治疗剂对给定细胞(特别是靶细胞)产生治疗效果的能力。当引入靶细胞或在靶细胞附近时，所述治疗性增强因子的表达可与共同施用的治疗剂协同作用，从而赋予或增强性治疗剂的治疗活性。在其他实施方案中，所述治疗性增强因子可作为共同或顺序施用的接种疫苗的佐剂。佐剂是可用于激活受试者先天免疫系统的药理学或免疫学物质。通过这种方式，他们使受试者的先天免疫系统能够更迅速地对病原体感染做出应答。佐剂还可用于刺激对特定感染因子(如病毒或细菌感染)特异的适应性免疫应答。一些佐剂在指导有效抗原呈递、刺激和增强T辅助型1(Th1)免疫应答方面也可能有效。可选地，所述治疗性增强因子可以作为共同施用或顺序施用的减毒病毒或修饰的病毒的佐剂，例如疫苗制剂中使用的修饰的腺病毒。灭活的病毒或活减毒的病毒疫苗通常需要佐剂以促进免疫应答。此外，基于重组蛋白亚基疫苗的固有免疫原性也相对较低，需要共同施用的佐剂。因此，在本发明的具体实施方案中，佐剂组合物的作用是增加通过免疫细胞对呈递的抗原的应答产生的中和抗体的水平。
根据本发明的具体实施方案，多种治疗性增强因子可组合在组合物中。在这些实施方案中，每个治疗性增强因子的编码序列可存在于分离的mRNA分子中。在一些实施方案中，在同一mRNA分子上可存在不止一种治疗性增强因子的序列。在这些情况下，聚顺反子mRNA分子还包括表达所有编码的序列所需的序列，如内部核糖体进入位点(IRES)。
在一个或多个递送系统中包含多个不同mRNA分子的实施方案中，设想每个递送系统，例如颗粒、脂质体、病毒载体系统，可以包括一种或多种类型的mRNA分子作为“有效载荷”；也就是说，并非每个特定实施方案中的递送有效载荷都必须包括上述实施方案中提供的所有mRNA分子。以这种方式，它也被认为可以使用如下所述的靶向药剂，将不同的递送系统及其相关序列导向不同的靶细胞。
类似地，在提供分离的mRNA构建体的任何实施方案中，以及在其与被配制为涉及递送颗粒的情况下(如本文其他地方所述)，其可以是共同配制的(即，在同一过程中，不同的mRNA可以与递送颗粒一起包装)，使得不同的mRNA构建体涉及相同的递送颗粒；或者单独配制，使得不同的mRNA构建体涉及不同的递送颗粒。
本发明某些方案的mRNA构建体可由多核苷酸表达构建体合成，例如DNA质粒。该表达构建体可包括转录起始所需的任何启动子序列和相应的终止序列，使得mRNA构建体的转录可以发生。这种多核苷酸表达构建体被设想为以其本身构成本发明的实施方案。
细胞因子
在本发明的实施方案中，所述mRNA构建体可以编码细胞因子(例如作为佐剂的细胞因子)的基因产物。
细胞因子是细胞信号传导中重要的一大类小蛋白。细胞因子已被证明作为免疫调节剂参与自分泌、旁分泌和内分泌信号传导。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。细胞因子由多种细胞产生，包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞等免疫细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞；给定的细胞因子可能由一种以上类型的细胞产生。它们通过细胞表面受体起作用，在免疫系统中特别重要；细胞因子调节体液和基于细胞的免疫应答之间的平衡，并调节特定细胞群体的成熟、生长和应答。细胞因子分为白细胞介素、淋巴因子、单核因子、干扰素、集落刺激因子和趋化因子。
白细胞介素(IL)是一组细胞因子(分泌蛋白和信号分子)，其首次被发现通过白细胞(leukocyte)表达。免疫系统的功能在很大程度上取决于白细胞介素，并且已经描述了其中一些的罕见缺陷，所有这些都表现为自身免疫疾病或免疫缺陷。大多数白细胞介素是由辅助CD4 T淋巴细胞以及单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成的。它们促进T和B淋巴细胞以及造血细胞的发育和分化。白细胞介素包括白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素9(IL-9)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素11(IL-11)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素13(IL-13)、白细胞介素14(IL-14)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素16(IL-16)、白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素19(IL-19)、白细胞介素20(IL-20)、白细胞介素21(IL-21)、白细胞介素22(IL-22)、白细胞介素23(IL-23)、白细胞介素24(IL-24)、白细胞介素25(IL-25)、白细胞介素26(IL-26)、白细胞介素27(IL-27)、白细胞介素28(IL-28)、白细胞介素29(IL-29)、白细胞介素30(IL-30)、白细胞介素31(IL-31)、白细胞介素32(IL-32)、白细胞介素33(IL-33)、白细胞介素35(IL-35)和白细胞介素36(IL-36)。
IL-1α和IL-1β是参与调节免疫应答、炎症反应和造血的细胞因子。IL-2是一种诱导反应性T细胞增殖的淋巴因子。此外，它通过受体特异性结合，作为生长因子和抗体产生刺激剂，作用于一些B细胞。IL-3是一种通过控制粒细胞和巨噬细胞的产生、分化和功能来调节造血的细胞因子。IL-4诱导B细胞的增殖和分化，及T细胞的增殖。IL-5调节嗜酸性粒细胞的生长和活化。IL-6在B细胞最终分化为免疫球蛋白分泌细胞中起着重要作用，如诱导骨髓瘤/浆细胞瘤生长、神经细胞分化和在肝细胞中诱导急性期反应蛋白。IL-7是一种细胞因子，作为B细胞和T细胞系早期淋巴细胞的生长因子。IL-8诱导中性粒细胞趋化性。IL-9是一种支持辅助T细胞IL-2独立和IL-4独立生长的细胞因子。IL-10是一种抑制许多细胞因子合成的蛋白质，包括由活化巨噬细胞和辅助T细胞产生的IFNγ、IL-2、IL-3、TNF和GM-CSF。IL-11刺激巨核细胞生成，导致血小板产量增加，同时激活破骨细胞，抑制上皮细胞增殖和凋亡，并抑制巨噬细胞介导剂产量。IL-12参与Th1细胞免疫应答的刺激和维持，包括对各种细胞内病原体的正常宿主防御。IL-13是一种多效性细胞因子，在炎症和免疫反应的调节中发挥重要作用。IL-14控制B细胞的生长和增殖并抑制Ig分泌。IL-15诱导自然杀伤细胞的产生。IL-16是一种CD4+趋化因子。IL-17是由激活的记忆T细胞产生的有效促炎细胞因子。IL-18诱导IFNG的产生并增加自然杀伤细胞活性。IL-20调节角质形成细胞的增殖和分化。IL-21共刺激CD8+T细胞的激活和增殖，增加NK细胞毒性，增加CD40驱动的B细胞增殖、分化和类转换，促进Th17细胞的分化。IL-22刺激上皮细胞产生防御素并激活STAT1和STAT3。IL-23参与维持产生IL-17的细胞，增加血管生成，但减少CD8 T细胞浸润。IL-24通过影响细胞存活、炎症细胞因子的表达在肿瘤抑制、伤口愈合和银屑病中发挥重要作用。IL-25诱导IL-4、IL-5和IL-13的产生，刺激嗜酸性粒细胞扩增。IL-26增强上皮细胞中IL-10和IL-8的分泌和CD54在上皮细胞的细胞表面的表达。IL-27调节B淋巴细胞和T淋巴细胞的活性。IL-28在免疫防御病毒中发挥作用。IL-29在宿主防御微生物方面发挥作用。IL-30形成IL-27的一条链。IL-31可能在皮肤炎症中起作用。IL-32诱导单核细胞和巨噬细胞分泌TNF-α、IL-8和CXCL2。IL-33诱导辅助T细胞产生2型细胞因子。IL-35诱导对T辅助细胞激活的抑制。IL-36调节DC和T细胞应答。
淋巴因子是由一类称为淋巴细胞的免疫细胞产生的细胞因子的亚群。它们是常见的T细胞产生的蛋白质介导剂(mediator)，通过细胞之间的信号传导定向免疫系统应答。淋巴因子具有许多作用，包括吸引其他免疫细胞(包括巨噬细胞和其他淋巴细胞)到感染部位，并随后将其激活，使其做好启动免疫应答的准备。淋巴因子和B细胞产生抗体。辅助T细胞分泌的重要淋巴因子包括IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和干扰素γ(IFNγ)。
GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。单核细胞退出循环并迁移到组织中，在组织中成熟为巨噬细胞和树突状细胞。因此，它是免疫/炎症级联的一部分，通过该级联，少量巨噬细胞的激活可以迅速导致其数量增加，这是对抗感染的关键过程。GM-CSF还增强中性粒细胞迁移并导致细胞表面表达的受体改变。IFNγ是对先天免疫和抗感染适应性免疫至关重要的细胞因子。IFNγ是巨噬细胞的激活剂和主要组织相容性复合物II类分子表达的诱导剂。IFNγ在免疫系统中的重要性部分在于其定向抑制病毒复制的能力，最重要的是其免疫刺激和免疫调节作用。
单核因子是主要由单核细胞和巨噬细胞产生的细胞因子。一些单核因子包括IL-1、肿瘤坏死因子α、α和β干扰素，以及集落刺激因子。肿瘤坏死因子(TNF)是细胞因子，用于细胞信号传导的免疫系统的小蛋白。作为感染的炎症应答的一部分，TNF被释放以招募其他免疫系统细胞。干扰素(IFN)是一组由宿主细胞产生和释放的信号传导蛋白，以对多种病毒的存在进行应答。IFN-α蛋白主要由浆细胞样树突状细胞(pDC)产生，主要参与抗病毒感染的先天免疫。IFN-β蛋白由成纤维细胞大量产生，并具有主要参与先天免疫应答的抗病毒活性。集落刺激因子(CSF)是分泌的糖蛋白，与造血干细胞表面的受体蛋白结合，从而激活细胞内信号传导通路，使得细胞增殖并分化为血细胞。
趋化因子是小细胞因子家族，具有在邻近反应性细胞中诱导定向趋化的能力。趋化因子在功能上分为稳态趋化因子和炎性趋化因子。稳态趋化因子在某些组织中组成性产生，并负责基础白细胞包括：CCL14、CCL19、CCL20、CCL21、CCL25、CCL27、CXCL12和CXCL13的迁移。炎性趋化因子在病理条件下形成，并积极参与炎性应答，吸引免疫细胞(包括CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、CXCL10)进入炎症部位。
干扰素(IFN)是一组由宿主细胞产生和释放的信号蛋白，以对多种病毒的存在进行应答。IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω与IFN-α/β受体复合物结合，并与靶细胞上的特异性受体结合，这使防止病毒产生和复制其RNA和DNA的蛋白质得以表达。IFN-γ由细胞毒性T细胞和1型T辅助细胞释放，但IFN-Y阻止2型T辅助细胞的增殖。
生长因子是天然存在的物质，能够刺激细胞增殖、伤口愈合并偶尔刺激细胞分化。生长因子包括肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(ANG)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP9、BMP10、BMP11、BMP12、BMP12、BMP14和BMP15)、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素-6(IL-6)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，表皮生长因子(EGF)、蝶素(Ephrin)A1、EphrinA2、EphrinA3、EphrinA4、EphrinA5、Ephrin B1、Ephrin B2、Ephrin B3、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、成纤维细胞生长因子3(FGF3)、成纤维细胞生长因子4(FGF4)、成纤维细胞生长因子5(FGF5)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子8(FGF8)、成纤维细胞生长因子9(FGF9)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、成纤维细胞生长因子11(FGF11)、成纤维细胞生长因子12(FGF12)、成纤维细胞生长因子13(FGF13)、成纤维细胞生长因子14(FGF14)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子16(FGF16)、成纤维细胞生长因子17(FGF17)、成纤维细胞生长因子18(FGF18)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、成纤维细胞生长因子22(FGF22)、成纤维细胞生长因子23(FGF23)、牛胎促生长激素(FBS)，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经递质、Persephin、神经鞘胚素、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞源生长因子(HDGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、角质形成细胞生长因子(KGF)、促移行因子(MSF)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP)、肌生长抑制素(GDF-8)、神经调节素1(NRG1)、神经调解素2(NRG2)、神经调节素3(NRG3)、神经调节素4(NRG4)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4(NT-4)、胎盘生长因子(PGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、肾酶(RNLS)-抗凋亡生存因子、T细胞生长因子(TCGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF)转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)，血管内皮生长因子(VEGF)和Wnt信号传导通路蛋白。
如上所述，白细胞介素12(IL-12)是免疫细胞(包括T细胞和NK细胞)的免疫刺激细胞因子。IL-12是异二聚体细胞因子，由吞噬细胞和抗原呈递细胞特异性产生，增强抗肿瘤免疫应答。IL-12有效免疫刺激特性的一个结果是，全身施用可能导致严重的副作用，限制了其在患者中的临床应用。工程化的NK92在肿瘤部位表达IL-12显示了嵌合抗原受体(CAR)-修饰的T细胞的抗肿瘤活性的增加(Luo等人，Front Oncol.(2019)12月19日；9:1448)。据信，IL-12诱导的IFNγ在肿瘤中的累积也促进T淋巴细胞或其他宿主免疫细胞(例如NK细胞)渗透到肿瘤中，从而增强治疗效果(Chinnasamy D.等人，Clin Cancer Res2012:18；Chmielewski M.等人，CancerRes 2011；71；Kerkar SP.等人，J Clin Invest2011；121；Jackson HJ.等人，Nat Rev Clin Oncol 2016；13)。
在本发明的实施方案中，本发明所述的组合物包括mRNA，所述mRNA至少包括一个编码功能性IL-12或其类似物或衍生物的ORF。由于野生型IL-12由35kDa IL-12A和40kDaIL-12B亚基的异二聚体组成，所述ORF可包括其中一个亚基，并与编码另一个亚基的mRNA联合施用，从而允许细胞中功能性IL-12的组装。可选地，功能性IL-12可以是IL-12的修饰的单链的形式，其中单个ORF包括IL-12A和IL-12B亚基(例如，参见SEQ ID NO:59)。
在本发明的一些实施方案中，所述编码mRNA在肿瘤微环境中瞬时表达。在其他实施方案中，所述编码mRNA编码参与调节APC或免疫细胞(例如激活的T细胞和NK细胞)存活、增殖和/或分化的细胞因子或其他基因产物。通过非限制性实例，所述编码mRNA可以编码本文公开的任何细胞因子，更具体地，编码IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-33、IL-35、TGFβ、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ等细胞因子，以任何其组合。
微RNA
微RNA(miRNA)是一类非编码RNA，每种包含约20至25个核苷酸，其中一些被认为通过与靶mRNA的3′非翻译区(3′UTR)中的互补靶序列结合，参与基因表达的转录后调控，导致其沉默。这些miRNA互补靶序列在本文也被称为miRNA结合位点或miRNA结合位点序列。某些miRNA在其表达上具有高度组织特异性；例如，miRNA-122及其变体在肝脏中大量存在，在其他组织中很少表达(Lagos-Quintana等人，Current Biology.2002；12:735-739)。
因此，miRNA系统提供了一个强大的平台，通过该平台，引入细胞的核酸可以在靶组织中选定的细胞类型中沉默，并在其他细胞中表达。通过将特定给定miRNA的靶序列纳入将引入靶细胞的mRNA构建体中，特别是UTR中，某些引入基因的表达可以在某些细胞类型中减少或基本上不表达，而在其他细胞类型中仍然存在(Brown和Naldini，Nat RevGenet.2009；10(8)：578-585)。
根据本发明的具体实施方式，设想在器官保护序列中可以包括多种这样的miRNA靶序列，然后其将包括在mRNA构建体中。如果存在多个miRNA靶序列，则该多个可能包括例如大于两个、大于三个、通常大于四个miRNA靶序列。这些miRNA靶序列可在mRNA构建体内的指定UTR内按顺序、串联或预定位置排列。多个miRNA靶序列可与辅助序列分离，辅助序列用于支持或促进器官保护序列作为整体的功能。例如，合适的辅助序列可以包括接头(linker)或间隔(spacer)序列，其可以是随机的，或者可以包括特定序列，例如“uuuaaa”，尽管也可以使用其他间隔序列。所述间隔序列的长度可以变化，并且可以包括间隔序列的重复，例如间隔序列“uuuaaa”可以在每个或任何相连的靶序列之间包括一次(即“uuuaaa”)、两次(即，“uuuaaauuaaa”-SEQ ID NO:1)、三次、四次、五次或六次。在一些实施方案中，结合位点序列之间可能不存在间隔序列。
尽管miRNA-122在健康非患病肝组织中含量丰富，但其在大多数肝癌和患病细胞中都会减少(Braconi等人，Semin Oncol.2011；1538(6):752-763；Brown and Naldini,NatRev Genet.2009；10(8):578-585)。通过上述方法，已经发现，当靶组织是肝脏时，通过在其3′UTR中包括miRNA-122靶序列(例如，SEQ ID NO:1)，可以促进引入的mRNA序列在癌肝细胞中的翻译，并在转染的健康细胞中减少翻译或基本上不翻译。
以类似的方式，通过使用其他miRNA靶序列，在其他器官中的癌细胞和健康细胞之间也可能进行这种mRNA的差异翻译。合适的候选物包括(但不限于)以下靶位点：miRNA-1、miRNA-125、miRNA-199、miRNA-124a、miRNA-126、miRNA-Let7、miRNA-375、miRNA-141、miRNA-142、miRNA-143、miRNA-145、miRNA-148、miRNA-194、miRNA-200c、miRNA-34a、miRNA-192、miRNA-194、miRNA-204、miRNA-215和miRNA-30家族(例如miRNA-30a、b或c)。
表2进一步证明(非限制性)miRNA序列的实例，其中在特定器官和/或组织中证明了表达，并且不同情况下在健康细胞和患病细胞之间证明了差异表达。
miRNA-1、miRNA-133a和miRNA-206已被描述为肌肉和/或心肌特异性miRNA的实例(Sempere等人，Genome Biology.2004；5:R13；Ludwig等人，Nucleic AcidsResearch.2016；44(8):3865-3877)。miRNA-1也已被证明在疾病中失调，例如，在梗死性心脏组织中检测到miRNA-1下调(Bostjancic E等人，Cardiology.2010；115(3):163-169)，而在横纹肌肉瘤细胞系中也检测到miRNA-1大幅减少(Rao，PrakashK等人，FASEB J.2010；24(9):3427-3437)。特别地，考虑了miRNA-1、miRNA-133a和miRNA-206的使用，其中根据本发明的组合物进行肌肉内施用，以减少其在局部正常肌细胞中的表达(如果需要)。
如表2所示，miRNA-125在多个组织中表达，并在多个实体瘤中下调，如肝细胞癌(Coppola等人，Oncotarget 2017；8)、乳腺癌(Mattie等人，Mol Cancer2006；5)、肺癌(Wang等人，Febs J 2009)、卵巢癌(Lee等人，Oncotarget 2016；7)、胃癌(Xu等人，Mol MedRep2014；10)、结肠癌(Tong等人，Biomed Pharmacother2015；75)和宫颈癌(Fan等人，Oncotarget 2015；6)、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤(Ferretti等人，Int J Cancer 2009；124)、胶质母细胞瘤(Cortez等人，Genes Chromosomes Cancer 2010；49)和视网膜母细胞瘤(Zhang等人，Cell signal 2016；28)。
与非患病脑细胞(例如神经元)相比，多形性胶质母细胞瘤细胞中几种miRNA也差异表达(Zhangh等人，J Miol Med 2009；87/Shi等人，Brain Res 2008；1236)，其中miRNA-124a是失调最严重的细胞之一(Karsy等人，Gene Cancer 2012；3；Riddick等人，Nat RevNeurol 2011；7；Gaur等人，CancerRes 2007；67；Silber等人，BMC Med 2008；6)。
在肺癌中，最近的Meta分析证实了非小细胞肺癌中Let-7(以及miRNA-148a和miRNA-148b)的下调(Lamichhane等人，Disease Markers 2018)。
类似地，与健康胰腺细胞相比，胰腺癌细胞中miRNA-375的表达被发现下调(Shiduo等人，Biomedical Reports 2013；1)。在胰腺中，miRNA-375的表达在正常胰腺细胞中较高，但在患病和/或癌组织中明显较低(Song，Zhou等人，2013)。这一表达已被证明与癌症阶段有关，随着癌症的进展，表达进一步减少。据认为，miRNA-375通过靶向3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(PDK1)mRNA参与胰腺β细胞中葡萄糖诱导的生物应答的调节，从而影响PI3激酶/PKB级联(El-Ouaamari等人，Diabetes 57:2708-2717,2008)。miRNA-375的抗增殖作用由这种假定的作用模式介导，这可能解释其在癌细胞中的下调。
表2讨论了可用于本发明实施方案的与特定器官和/或组织相关的miRNA的非限制性实例。应当理解，本发明不限于给定miRNA或miRNA类在给定器官或器官系统内第一细胞类型相对于第二细胞类型下调的情况。相反，仅要求细胞类型之间存在调节性miRNA的差异表达模式，例如在器官或器官系统内或不同器官或器官系统之间。可以使用本文所述的组合物和方法利用miRNA系统的差异表达，实现相应的细胞间蛋白质产物的差异翻译，从而减少不需要的脱靶效应。这特别适用于需要细胞类型或组织之间mRNA差异表达的情况。例如，如果用作佐剂，主要在免疫细胞中表达，但不在一个或多个不需要炎症增加的健康组织中，如皮肤、肝脏、肾脏或结肠中表达编码促炎细胞因子的mRNA可能是有利的。
癌症和相邻健康组织之间miRNA的差异表达代表了一个模型系统，其中可以识别和表征miRNA沉默mRNA的用途。在健康和癌细胞之间发现相似miRNA差异表达的证据的癌症示例包括乳腺癌(Nygaard等人，BMC Med Genomics,2009Jun9；2:35)、卵巢癌(Wyman等人，PloS One,2009；4(4):e5311)、前列腺癌(Watahiki等人，PloS One,2011；6(9):e24950)和宫颈癌(Lui等人，Cancer Research,2007Jui1；67(13):6031-43)。WO 2017/132552A1描述了在各种癌细胞中具有不同表达水平的多种miRNA。在皮肤中，还观察到健康组织和相邻黑色素瘤细胞之间miRNA的差异表达。
表2-与特定组织/器官类型相关的miRNA
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由于可能出现脱靶效应，用免疫疗法治疗患者可能存在安全问题。甚至通过提供编码mRNA序列来表达某些多肽也会对某些器官产生负面影响。因此，保护健康组织，例如肝、脑、乳腺、肺、胰腺、结肠/胃肠道、皮肤、肌肉和肾脏，对于成功的临床应用至关重要。诸如上述那些的miRNA可用于减少特定细胞、组织和/或器官类型中施用的mRNA的表达，以保护这些细胞、组织或器官免受任何脱靶效应的影响。例如，可以使用在特定组织中高度表达的特定miRNA的靶序列
以保护健康细胞，例如miRNA-1、miRNA-133a和/或miRNA-206以保护健康肌肉和/或心肌组织。结果显示，可能需要使用与患病和健康细胞中的差异表达不一定相关的miRNA靶序列。例如，miRNA-142和miRNA145在胰腺组织中有表达，而miRNA-9可用于脑和肺保护，因为其在这些组织中的高表达。
如果要保护多个组织，则使用多种miRNA靶序列的组合。例如，miRNA-122、miRNA-203a、miRNA-1和miRNA-30a的靶序列一起使用以保护肝脏、皮肤、肌肉和肾脏组织的细胞。
因此，本发明组合物可代表增强和促进迄今为止“实验性”细胞或病毒疗法的成功采用的可能技术平台。
如从本公开中显而易见的，本发明被设想为涉及治疗、递送平台(例如不同纳米粒子组合物)、治疗剂(例如药物、疫苗和/或病毒)、编码的多肽和靶细胞、组织或器官。每个及所有这些可能性对由所述mRNA序列提供的编码的多肽的最佳表达都有影响。
已经发现，miRNA靶序列的一个或多个特征的优化可以获得促进差异表达的特别有效性，从而保护健康的器官。同样，根据特定的背景，可以控制这些特征以增加或减少特定器官、组织或细胞类型中产生的差异表达。可能存在在各种不同细胞类型中需要多种表达水平的情况，并且预期可以通过改变本文所述的一个或多个特征来修饰靶序列以允许这样的结果。此外，miRNA靶位点序列可以被修饰，使其受到多个miRNA的调控，无论是在同一组织中还是在不同组织中。
序列匹配：靶序列与互补miRNA序列的精确匹配程度(即miRNA序列与结合位点序列之间的错配数量)已被证明会影响最终表达的沉默效果。例如，精确或完美的匹配已被证明会导致具有miRNA结合位点序列的序列更快地降解(Brown和Naldini，Nat RevGenet.2009；10(8):578-585)。因此，如果在特定细胞类型中需要特定多肽产物的完全或接近完全沉默，则可能需要选择与该细胞类型相关的miRNA序列完全匹配或最多不超过一个碱基对错配的miRNA靶序列。同样，如果在特定的细胞类型中希望表达减少但不是不表达，则可以选择错配数量增加的miRNA结合位点序列来实现。本文中提到的几种miRNA序列的实例，如下表3所示，包括茎环前miRNA与最终加工的成熟5P或3P miRNA的序列以及与添加下划线的前miRNA中的成熟miRNA形成双链的序列，以及成熟的miRNA序列和双链形成序列本身。在细胞中以显著水平表达的成熟miRNA(可以是5P和3P链之一或两者)被标记(*)。表4显示了在前miRNA中形成双链体的原始的、不完美匹配的靶序列，随后是成熟的miRNA序列和修饰的互补靶序列的形成，所述修饰的互补靶序列被设计为与过度表达的成熟miRNA序列完美匹配。传统5’至3’方向的所述修饰的靶序列以粗体显示。
表3通过测试5P与3P成熟结合序列(*来自RNA-Seq数据库http://www.mirbase.org的过度表达成熟miRNA)优化miRNA靶序列
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表4通过修饰核苷酸序列优化miRNA靶序列以获得与miRNA的完美匹配(*来自RNA-Seq数据库http://www.mirbase.org的过度表达成熟miRNA)
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众所周知，miRNA序列的变体和多态性被发现，并且miRNA家族具有相似的特性。在本发明中，可以设想在适当的情况下可以使用特定miRNA序列和相关结合位点的所有合适的变体和家族成员。另一方面，显然密切相关的miRNA序列可以具有差异表达谱(Sun等人，World J Gastroenterol.2017年11月28日)，因此在某些情况下，需要参考文献来确定特定替代物是否合适。例如，Let-7是更广泛的家族的一部分，具有许多相关的变体，可以表示为Let-7a至Let-7k等。如上所述，这些变体和多态性允许对于miRNA介导的沉默的效率不同，因此可以进行特定的选择以允许特定细胞类型中所需的沉默水平。
mRNA构建体中多个miRNA靶序列的存在使所提供的一种或多种多肽的差异表达的效率提高。不受理论约束，人们认为随着靶位点数量的增加，miRNA翻译抑制的可能性增加。多个miRNA靶位点可包含基本相同靶序列的多个拷贝，从而引入重复。可选地或附加地，所述多个靶序列可以包含实质上不同的序列，从而允许mRNA构建体被多种miRNA靶向。通过这种方式，所提供的mRNA构建体的差异表达可以在一种以上细胞类型和/或一个以上器官中实现，这从上文对器官及其相关的特异性miRNA表达的讨论中可以明显看出。这两种方法被认为在同一序列或多个序列内都是可能的。还设想了一种中间方法，其中包括旨在成为同一miRNA序列的靶点，但在结合同一家族的不同miRNA变体(例如Let7)方面存在差异的靶位点。
与使用多个靶位点相关的一些优点包括提高由本发明所述mRNA序列提供的多肽在单个器官内的差异表达的效率。不同的结合位点序列的使用，或适用于一种以上组织或器官类型的序列的使用，可以使在一种以上器官或组织中的不同细胞类型中实现差异表达。当将根据本发明的组合物的全身施用时，避免在多个器官中的脱靶效应是必需的。
即使是局部或靶向施用，所提供的mRNA构建体也可能在其非目标器官、组织和/或细胞中相遇或累积。特别地，由于这些器官的生理功能，肝脏和脾脏组织可能累积施用的组合物。在这些情况下，为了避免脱靶效应，所提供的构建体包含能使这些组织中的表达减少的miRNA靶序列可能是有利的。相反，可能需要在一些器官、组织和/或细胞类型中鼓励表达，但在其他类型中不鼓励表达，这可以通过相应地选择miRNA靶序列来实现。
miRNA靶位点的特定组合可能与靶器官的特定组合有关，这在不同的情况下可能特别有效。例如，施用的组合物可能在肝脏和脾脏中累积，因此使用与这些器官相关的miRNA靶序列可以对可能与组合物接触的健康细胞提供定向的保护。例如，所述结合位点序列可以为miRNA-122和miRNA-142中的每一个，或肝和脾相关miRNA序列的任何其他组合提供一个或多个靶点，例如表2中为这些器官所列示的任何组合。这样的组合可以包括，例如，选自miRNA-122、miRNA-125和miRNA-199(肝脏)的靶位点的至少一个拷贝；至少一个结合位点序列的至少一个拷贝，所述结合位点序列选自miRNA-192、miRNA-194、miRNA-204、miRNA-215和miRNA-30a、b、c(肾脏)；以及miRNA-142(脾脏)的结合位点的至少一个拷贝。
这种方法对于某些种类的递送纳米粒子可能特别有利。例如，基于脂质体的纳米粒子可能容易在肝脏、肾脏和脾脏中累积。其他纳米粒子类型或替代的施用方法可在不同器官或组织中累积，或组合物的靶向可导致特定器官或组织对表达进行调节的特别需求。例如，肌肉内施用可能导致肌肉组织中的累积，皮下施用可能会导致皮肤组织中的累积，从而影响哪些细胞类型将受益于保护。因此，可以选择包含在多个器官中提供广泛的保护以防止不期望的表达的miRNA结合位点序列的通用的、可能更长的序列，或者选择特定的miRNA结合位点序列以允许在特定情况下需要的一个或多个器官的特异性保护，和/或包含重复的结合位点序列(见下文)。以这种方式，所述递送的mRNA序列可以相对于递送模式进行优化(反之亦然)。
在一些情况下，器官保护序列中使用的miRNA靶序列可能与待治疗的组织或器官不相关，并且可能不被设计为使得所述组织和器官内健康细胞和患病细胞之间差异表达。选择miRNA结合序列是为了防止在不打算治疗的器官中产生脱靶效应。例如，根据本发明的组合物和方法可被设计用于治疗皮肤，例如用于治疗黑色素瘤。将组合物施用到皮肤上可以是局部的或瘤内的(IT)，例如通过定向注射到肿瘤中或定向引入肿瘤的血液供应中。然而，在这种情况下，组合物可被血液、淋巴系统或通过这些手段吸收，或以其他方式接触和/或在皮肤以外的器官，例如肝脏、肾脏和/或脾脏中累积。在这种情况下，可以选择miRNA靶序列以调节不期望的生物分布并防止编码的mRNA在这种非靶器官内表达。例如，可以选择使用与肝脏、肾脏和脾脏相关的miRNA靶序列，从而防止这些器官的健康细胞中的表达。上文列出了可能实现这一点的miRNA靶序列的潜在组合的示例。
还可以设想，由于miRNA介导的沉默不需要结合位点序列和miRNA序列之间的完美匹配，并且由于一些miRNA序列(特别是存在于类似细胞类型中的序列)具有相当大的相似性，因此可以设计出能够为多个miRNA序列提供靶点的序列。例如，miRNA-122和miRNA-199具有相似的结合位点序列，可以设计和包括与两种miRNA基本互补的序列作为miRNA靶序列，例如通过略微修饰的miRNA-122结合位点序列。通过这种方式，miRNA-122和miRNA-199都可以与这样的序列结合，增加了mRNA的降解。类似地，Let-7miRNA的靶序列可以作为Let-7家族其他成员的靶序列。不同miRNA的结合位点序列可以用任何合适的比对技术比对，并与共享核苷酸比较，因此可以设计包含这些共享核苷酸的结合位点序列。
在本发明的具体实施方案中，特定靶位点序列在mRNA内重复的次数可影响由结合位点序列介导的沉默的效率。例如，一个miRNA靶位点的重复次数的增加可以增加与相关miRNA的结合可能性，并且因此增加在发生翻译之前发生翻译抑制或降解的可能性。因此，如果在特定细胞类型中需要更完全的miRNA介导的沉默，则可以使用在那些细胞中表达的miRNA的合适靶序列的更多重复。同样，通过包括较少的结合位点序列，使用或不使用本文所讨论的任何其它方法，可实现表达减少但不是不表达。因此，相同的结合位点序列可以在mRNA中提供一次、两次、三次、四次、五次或更多，并且可以单独或与其它miRNA的靶位点序列组合提供。
根据某些实施方案，包含在mRNA序列内的miRNA靶位点的顺序可影响所得到的器官保护功效。例如，miRNA-122、let 7b、miRNA-375、miRNA-192、miRNA-142(存在于肝脏、肺、乳腺、胰腺、肾脏和脾脏细胞中)的靶序列可以按该顺序或以许多其它排列方式呈现，例如：
miRNA-122-miRNA-375-Let 7-miRNA-192-miRNA-142；
miRNA-122-miRNA-375-Let 7-miRNA-142-miRNA-192；或
miRNA-122-Let 7-miRNA-375-miRNA-142-miRNA-192。
作为另一实例，miRNA-122、Let 7a、miRNA-142、miRNA-30a、miRNA-143(存在于肝脏、肺/结肠、脾脏/造血细胞、肾脏和结肠细胞中)的靶序列可以按该顺序或以许多其它排列方式呈现，例如：
miRNA-122-Let 7a-miRNA-142-miRNA-30a-miRNA-143；
miRNA-122-miRNA-142-Let 7a-miRNA-143-miRNA-30a；或
miRNA-122-miRNA-30a-Let 7a-miRNA-143-miRNA-142。
在以下更详细描述的本发明的具体实施方案中，miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a(存在于肝脏、结肠和肾脏中)的靶序列可以以多种组合来呈现，例如：
miRNA-122-miRNA-192-miRNA-30a；
miRNA-122-miRNA-30a-miRNA-192；或
miRNA-192-miRNA-122-miRNA-30a。
在以下更详细描述的本发明的进一步的实施方案中，Let 7b、miRNA-126和miRNA-30a(存在于肝脏、结肠、脾脏、肺和肾脏中)的靶序列可以以多种组合来呈现，例如：
Let 7b-miRNA-126-miRNA-30a；
Let 7b-miRNA-30a-miRNA-126；或
miRNA-126-Let 7b-miRNA-30a。
这样的组合可用于保护可能受到施用组合物影响的组织，所述组合物被设计用于治疗某些癌症或疫苗或佐剂表达系统，如本文所述。
作为另一实例，miRNA-122、miRNA-203a、miRNA-1、miRNA-30a(存在于肝脏、皮肤、肌肉/心肌和肾脏中)的靶序列可以按该顺序或以许多其它排列方式呈现，例如：
miRNA-122-miRNA-203a-miRNA-1-miRNA-30a；
miRNA-122-miRNA-1-miRNA-203a-miRNA-30a；或
miRNA-122-miRNA-30a-miRNA-1-miRNA-203a。
如下文关于疫苗、佐剂和类似方法所讨论的，这样的组合可用于保护可能受设计成诱导免疫应答的组合物的施用影响的组织。
因此，本发明允许根据被mRNA递送的编码序列及细胞类型选择不同方法。换句话说，本发明所允许的差异表达是“可配置的”，以便允许需要的任何水平的表达或减少的表达。
在另一实施方案中，所述递送的mRNA可以编码免疫刺激或抗免疫抑制蛋白，或者以另一种方式用于诱导免疫应答。在这种情况下，期望在靶向患病细胞中具有编码的产物的最大表达，但在靶器官周围的健康组织中具有减少的但仍存在的表达。另一方面，需要在某些组织(例如脑或其它神经组织)中完全避免表达这种免疫刺激产物，和/或用于在组合物有可能累积的细胞、组织和器官中减少表达，以防止脱靶的免疫应答和可能的全身反应。因此，在一个实例中，所述miRNA靶序列可以通过上文讨论的方法中的一种或多种来确定，以允许在靶向患病细胞中完全表达，部分减少在靶器官的健康细胞中的表达，更完全地减少在神经组织中和累积位点的表达。
在一些实施方案中，可以在单个组合物中提供一个以上的不同mRNA序列。这些不同的序列可以编码不同的多肽和/或不同的miRNA靶位点。以这种方式，单个组合物可以允许表达多种不同的多肽。通过在分离的mRNA序列中使用miRNA靶序列的不同组合，根据所需目的，不同的细胞类型或靶器官可以表达或防止某些多肽的表达。例如，如果必须保护肝脏和脑中的健康细胞不表达多肽“A”，但是希望在健康脑中表达多肽“B”，在肝脏中不表达多肽“B”，则第一mRNA序列可以包括具有miRNA-122、miRNA-125a和miRNA-124a的靶位点的“A”的序列，而第二mRNA序列可以包含具有miRNA-122和miRNA-125a的结合位点的“B”序列。
可以理解，本领域技术人员将能够设计miRNA靶位点、多肽序列和多个mRNA序列的组合，以在在给定的一组器官和细胞类型中实现表达的任何组合。关于这些序列的相关器官和组织类型如上文和表2所讨论。图1示出了根据本发明的一些实施方案的mRNA构建体的示意图。ORF以起始密码子为先导，并终止于终止密码子，并且在3'UTR中存在一系列高达五个或更多个结合位点序列。如图1所示，定义OPS的miRNA靶位点(BS1至BS5)可以被间隔子分离，或者优选地，没有间隔子。所述ORF可以编码例如本文所述的多肽。在任何实施方案中终止密码子的可变性均是可预期的，并且在所有实施方案中在ORF和结合位点序列之间可以没有终止密码子。
本发明提供的mRNA序列的UTR可被选择为与在靶器官内的一个细胞类型中表达的部分或全部UTR序列具有相似性，例如大于90％相似性。特定的细胞类型具有表达上调或下调的基因，并且所述UTR序列可以介导这种调节，例如通过促进相关mRNA序列的稳定性或降解。
作为实例，与已知在癌细胞中上调的基因相关的UTR可具有一个或多个特征，例如miRNA结合位点序列，其促进它们在这些癌细胞中的稳定性和翻译。通过将类似的序列结合到所提供的mRNA序列中，可以在癌细胞而不是非癌或健康细胞中改善稳定性和翻译。
在某些情况下，可能存在针对miRNA序列的多个的候选者，其在靶组织中的不同细胞类型中呈现差异表达。在这种情况下，mRNA构建体中包括多个miRNA靶序列，并且这些序列可以是实质上不同的序列可能是有利的。然而，还设想多个miRNA靶序列中的每一个可以是实质上相同的序列。
细胞因子的组合
可以预期的是，本文所述的组合物和方法可以起到诱导针对病原微生物的疾病或感染的免疫应答的作用。特别地，可以诱导针对癌细胞的免疫应答。癌变的过程通常涉及癌细胞试图规避免疫系统的方式，涉及由这些细胞产生和显示的抗原的变化。
在一些实施方案中，本发明提供的mRNA包含编码蛋白的至少一种多核苷酸，所述蛋白是双特异性T细胞接合子(BiTE)、抗免疫抑制蛋白或免疫原性试剂。本文所用的术语“抗免疫抑制蛋白”是抑制免疫抑制途径的蛋白质。
本文所用术语“免疫原性试剂”是指增加炎性或免疫原性免疫应答的蛋白。在特定实施方案中，所述抗免疫抑制剂和免疫原性试剂诱导抗肿瘤免疫应答。此类试剂的实例包括结合并抑制免疫检查点受体(例如CTLA4、LAG3、PD1、PDL1等)的抗体或其抗原结合片段、促炎细胞因子(例如IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8、GM-CSF等)、或结合并激活活化受体(例如FcγRI、Fcγlla、Fcγllla、共刺激受体等)的蛋白。在特定实施方案中，所述蛋白质选自EpCAM、IFNβ、抗CTLA-4、抗PD1、抗PDL1、A2A、抗FGF2、抗FGFR/FGFR2b、抗SEMA4D、CCL5、CD137、CD200、CD38、CD44、CSF-1R、CXCL10、CXCL13、内皮素B受体、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-35、ISRE7、LFA-1、NG2(也称为SPEG4)、SMAD、STING、TGFβ、VEGF和VCAM1。
本发明包括将基于细胞的治疗中使用的，将编码功能性大分子的mRNA提供给靶向细胞群的组合物。在一些实施方案中，所述靶向的细胞群是基因工程化的T细胞群。
所述编码mRNA可用于将免疫细胞群或免疫细胞群的组合吸引到受试者的特定部位。在一些实施方案中，所述编码mRNA和所述递送的颗粒用于将免疫细胞吸引到肿瘤微环境。在一些实施方案中，所述编码mRNA和所述递送的颗粒用于克服免疫细胞向肿瘤微环境的不充分迁移。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞或树突状细胞，或其任何组合。在一些实施方案中，所述编码mRNA和所述递送的颗粒用于将T细胞吸引到肿瘤微环境。
所述编码mRNA可用于克服T细胞向肿瘤微环境的不充分迁移。在一些实施方案中，所述递送的颗粒特异性靶向肿瘤微环境，并且所述编码mRNA编码将T细胞吸引或以其他方式招募到肿瘤微环境的基因产物。在一些实施方案中，所述编码mRNA表达趋化因子。作为非限制性示例，所述编码mRNA可以编码吸引T细胞(例如CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL22、CCL28、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、XCL1及其任何组合)的趋化因子。在需要反向作用的情况下，例如在自身免疫性疾病中，所述编码mRNA可以表达上述因子的阻断剂、拮抗剂和/或抑制剂。
所述编码mRNA可被递送到肿瘤微环境中并在肿瘤微环境内瞬时表达。在一些实施方案中，所述编码mRNA编码参与调节肿瘤应答中免疫细胞(例如活化的T细胞和NK细胞)的存活、增殖和/或分化的细胞因子或其他基因产物。作为非限制性实例，所述编码mRNA可编码细胞因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-17、IL-33、IL-35、TGF-β及其任何组合。同样，在需要反向作用的情况下，例如在自身免疫性疾病中，所述编码mRNA可以表达上述因子的阻断剂、拮抗剂和/或抑制剂，例如TGF-β抑制剂。
提供mRNA的组合物可以被设计成靶向特定的细胞亚型，并在与它们结合时刺激受体介导的内吞作用，从而将它们携带的合成mRNA引入细胞，细胞现在可以表达合成mRNA。因为不需要转基因的核运输和转录，所以这个过程是快速有效的。
在一些实施方案中，所述编码mRNA可编码与免疫细胞(例如共刺激物)或免疫途径相关的受体或其他细胞表面蛋白，或编码靶向此类受体的分子。例如，所述编码mRNA可编码靶向以下细胞受体及其配体的分子，所述细胞受体及其配体选自CD40、CD40L、CD160、2B4、Tim-3、GP-2、B7H3和B7H4中的一种或多种。类似地，所述编码mRNA可编码选自GM-CSF、TLR7和TLR9中的一种或多种的树突状细胞激活剂。在一个实施方案中，所述编码mRNA编码一种或多种T细胞膜蛋白3抑制剂。在一个实施方案中，所述编码mRNA编码一种或多种NF-κB抑制剂。
Toll样受体(TLR)家族参与病原体识别和先天免疫的激活。TLR8尤其能够识别单链RNA，因此通过转录因子NF-κB的活化和抗病毒应答在识别ssRNA病毒中发挥作用。因此，所述编码mRNA编码TLR家族成员(例如TLR8)的实施方案在需要抗病毒应答时被考虑。
在一些实施方案中，所述mRNA递送系统可用于递送编码一种或多种试剂的mRNA，所述试剂将T细胞编程为所需的表型。在一些实施方案中，mRNA纳米粒子递送组合物可用于诱导作为所需T细胞表型特征的标记物和转录模式。在一些实施方案中，所述mRNA纳米粒子递送组合物可用于促进CD26L+中央记忆T细胞(Tcm)的发育。在一些实施方案中，组合物提供编码一种或多种转录因子的mRNA以控制靶细胞群中的细胞分化。在一些实施方案中，所述转录因子是Foxo1，其控制CD8 T细胞中发育效应到记忆的转变。
在一些实施方案中，所述mRNA递送组合物包括对T细胞标记物(例如T细胞上发现的表面抗原)特异的表面锚定靶向结构域。在一些实施方案中，所述表面锚定靶向结构域对抗原是特异的，所述抗原选择性地将纳米粒子结合到T细胞并启动受体诱导的内吞作用以内化mRNA纳米粒子递送组合物。在一些实施方案中，所述表面锚定的靶向结构域选择性地结合CD3、CD8或其组合。在一些实施方案中，所述表面锚定靶向结构域是选择性结合CD3、CD8或其组合的抗体或衍生自选择性结合CD3、CD8或其组合的抗体。
递送平台
将编码核苷酸序列引入靶细胞通常需要使用递送剂或“体内递送组合物”将所需物质从胞外空间转移到细胞内环境。通常，这样的递送剂/组合物可以包括递送颗粒。递送颗粒可经历吞噬作用和/或与靶细胞融合。递送颗粒可通过包封或通过将所述物质包含在基质或结构内而包含所需物质。
本文所用术语“递送颗粒”是指药物或生物分子递送系统，其包含可通过封装、保持在基质内、形成复合物、表面吸附或其他方式包含治疗组分的颗粒。这些系统可以将如编码核酸序列的治疗组分递送到靶细胞中。与直接施用分子或物质相比，使用递送颗粒不仅可以通过控制在作用部位递送的物质的量、时间和/或释放动力学来提高递送的效率，而且可以提高安全性。递送颗粒系统也擅长穿过生物膜，使物质或药物到达所需的治疗靶向位置。递送颗粒可能是微观尺度的，在特定实施方案中通常是纳米级的，即纳米粒子。纳米粒子的尺寸通常为至少50nm(纳米)，合适地，至少约100nm，通常至多150nm、200nm，尽管任选地，直径可达300nm。在本发明的一个实施方案中，所述纳米粒子具有大约至少60nm的平均直径。这些尺寸的优点是，这意味着颗粒低于网状内皮系统(单核吞噬细胞系统)清除的阈值，即颗粒足够小，不会被吞噬细胞作为机体防御机制的一部分而破坏。这有利于本发明组合物使用静脉内递送途径。在以下情况下，用于施用并将递送颗粒内的活性物质递送至其靶组织的途径是治疗疾病，特别是传染病的高度相关的因素。这些途径取决于其应用方式，可能具有不同的功效水平。在本发明的具体实施方案中，递送颗粒的施用通常是全身性的，例如通过皮下、静脉内或动脉内施用。偶尔地，由于疾病的类型或严重程度，递送颗粒可定向应用于受影响的器官或组织，例如通过肿瘤内给药。
纳米粒子组合物的替代可能性包括聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯、脂质或磷脂基颗粒，如脂质体或外泌体；基于蛋白质和/或糖蛋白的颗粒如胶原蛋白、白蛋白、明胶、弹性蛋白、醇溶蛋白、角蛋白、豆球蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆蛋白、乳蛋白如酪蛋白等(Lohcharoenkal等人，BioMed Research International；Volume2014(2014))；胶体纳米粒子；以及基于金属或金属化合物(例如金、银、铝、铜氧化物、金属有机环和笼(MOC)等)的颗粒。在特定实施方案中，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)由于其高生物相容性和生物降解性，可用作本发明的递送颗粒。PLGA于1989年被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于临床。从那时起，它就被广泛用于药物和生物分子的缓释制剂。PLGA可以与聚乙烯醇(PVA)共同配制，以产生基于胶束的纳米粒子。胶束也可以使用PLGA和PEG的二嵌段共聚物或PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物制备。
特别地，已经研究了包含聚乙烯亚胺(PEI)的聚合物用于递送核酸。由聚(β氨基酯)(PBAE)组成的纳米粒子载体也已被证明适合于核酸递送，特别是在与聚乙二醇(PEG)的共同配制时(Kaczmarek JC等人，Angew Chem lnt Ed Engl.2016；55(44):13808-13812)。也可以考虑使用树枝状物。这种共同制备的颗粒已被用于将mRNA输送到肺部。
还考虑了基于多糖及其衍生物的颗粒，如纤维素、几丁质、环糊精和壳聚糖。壳聚糖是通过几丁质的部分脱乙酰化获得的阳离子线性多糖，含有该物质的纳米粒子具有良好的药物递送特性，如生物相容性、低毒性和小尺寸(Felt等人，Drug Development andIndustrial Pharmacy,第24卷,1998-第11期)。可以设想，可以使用上述成分之间的组合。在本发明的具体实施方案中，所述纳米粒子包含壳聚糖，其表现出优异的粘膜粘附和渗透性能，这使其成为黏膜内生物分子缓释递送的理想选择。
递送颗粒可以包括基于脂质的，例如niosomal或脂质体的纳米粒子递送系统。脂质纳米粒子是多组分脂质系统，通常含有磷脂、可电离脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。颗粒表面的聚乙二醇化脂质有助于减少颗粒聚集并延长体内循环时间。合适的脂质体制剂可包括L-α磷脂酰胆碱和PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)。包含特别适合于递送核酸的可电离脂质的替代脂质体制剂可包含DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱)和Dlin-MC3-DMA(4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯,(6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraene-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate)。脂质基纳米粒子效力的另一个决定因素是脂质pKa。递送mRNA细胞货载(Cargo)的最佳脂质pKa在6.6-6.8的范围内。
递送颗粒可以包括氨基醇脂质。这些化合物可用于形成颗粒，包括纳米粒子、脂质体和胶束，其特别适合于核酸的递送。根据本发明的一些实施方案，生产包含氨基醇脂质颗粒的纳米制剂的说明性实例可在实施例中找到。在本发明的实施方案中，由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇和二油酰甘油磷酸-二乙烯二胺结合物(DOP-DEDA)组成的脂质纳米粒子(LNP)在pH 6.0时带正电，在pH 7.4时为中性，在pH8.0时带负电。该递送系统在血液中是中性的，以尽量减少血浆蛋白的降解，并保护包裹的mRNA细胞货载。当在体内递送时，这些LNP载体在其疏水脂质区与载脂蛋白(例如，apoE3)结合，这可以促进细胞摄取，尤其是肿瘤细胞摄取。
所述递送颗粒可以靶向靶组织的细胞。这种靶向可以由递送颗粒表面上的靶向剂介导，所述靶向剂可以是蛋白质、肽、碳水化合物、糖蛋白、脂质、小分子、核酸等。靶向剂可用于靶向特定细胞或组织，或可用于促进颗粒的内吞或吞噬作用。靶向剂的实例包括但不限于抗体、抗体片段、低密度脂蛋白(LDL)、转铁蛋白、asialycoprotein、人类免疫缺陷病毒(HIV)的gp120包膜蛋白、碳水化合物、受体配体、唾液酸、适配体等。经活性靶向配体修饰的靶向的脂质体可以通过增加在靶组织/器官/细胞处累积而不将细胞货载(例如mRNA)释放到其他部位。
基于脂质的纳米粒子本身也可以有利地充当佐剂。据报道，大量的脂质具有强烈的固有佐剂活性。阳离子脂质如二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)显示抗原在注射部位的沉积以及细胞抗原内化的增强。DDA构建的固体脂质纳米粒子显示出高抗原吸附效率、体外抗原转运、体内分布和高抗体应答(Anderluzzi等人，Control Release 2020,330,933-944)。因此，在使用LNP作为递送系统的mRNA递送疫苗中，提高佐剂性能的努力往往集中于工程化用于纳米粒子的脂质。然而，如上所述，脂质性质与包裹mRNA作为细胞货载的适宜性之间以及在生物分布、释放动力学和细胞摄取方面存在权衡。
当向受试者施用时，治疗组分作为体内递送组合物的一部分适当地施用，并且可以进一步包含药学上可接受的载体，以制备药物组合物。可接受的药物载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的液体，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。所述药物载体可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。此外，还可使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。当向受试者施用时，所述药学上可接受的载体优选地是无菌的。当静脉注射本发明化合物时，水是合适的载体。盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别地，用于注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，药物组合物也可以含有少量的润湿剂或乳化剂或缓冲剂。
本发明的药物和药物组合物可以采取液体、溶液、悬浮液、凝胶、改性释放制剂(例如缓(slow)释或缓(sustained)释)、乳剂、胶囊(例如含有液体或凝胶的胶囊)、脂质体、微粒、纳米粒子或本领域公知的任何其他合适的制剂的形式。合适的药物载体的其他实例见Remington，(Pharmaceutical Sciences,Alfonso R.Gennaro ed.,Mack PublishingCo.Easton,Pa.,第19版,1995,参见例如第1447-1676页)。
对于本文所述的任何化合物或组合物，所述有效治疗量最初可从体外细胞培养测定中确定。目标浓度将可以是使用本文所述或本领域已知的方法测量的那些能够实现本文所述方法的活性组分的浓度。
如本领域公知的，用于人类受试者的有效治疗量也可以从动物模型中确定。例如，对人的剂量可以被配制为对动物有效的浓度。如上所述，可以通过监测化合物的有效性向上或向下调整剂量来调整人体的剂量。基于上述方法和完全在本领域普通技术人员的能力范围内的其他方法调整剂量以在人体中实现最大功效。
预期本发明的实施方案可以包括配制药物用途的组合物。因此，本发明所述的组合物可悬浮在生物相容性溶液中，以形成可靶向细胞上、组织内或患者或动物体内的位置的组合物(即，该组合物可在体外、离体或体内使用)。适当地，所述生物相容性溶液可以是磷酸盐缓冲盐水或任何其他药学上可接受的载体溶液。一种或多种另外的药学上可接受的载体(例如稀释剂、佐剂、赋形剂或载体)可以在药物组合物中与本发明所述的组合物组合。合适的药物载体描述于E.W.Martin的《Remington’s pharmaceutical Sciences》中。本发明的药物制剂和组合物被配制为符合法规标准，并且可以口服、静脉内、局部、肿瘤内、皮下或通过其他标准途径施用。施用可以是全身或局部或鼻内或鞘内施用。特别地，根据本发明的组合物可以静脉内、病灶内、肿瘤内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内、动脉内和/或通过吸入施用。
进一步的目的是将本发明的一些实施方案所述的组合物单独施用或与替代抗肿瘤或其他抗癌治疗成分组合施用的实施方案。这些成分可以包括溶瘤病毒、小分子药物、化疗药物、放射治疗药物、治疗性疫苗或生物制剂。所述组分可以与本发明所述的组合物同时施用，并且可以包含在递送颗粒内，或者可以在施用本发明所述组合物之前或之后通过任何合适的方式单独施用。
还可以设想，本发明的一些实施方案的组合物可以用于体外和/或离体的方法，例如在实验室环境中。体外方法的一个实例是，将包含递送系统的组合物施用于靶向体外细胞，所述递送系统包含本文所述mRNA序列，并且包含在mRNA序列中的miRNA结合位点序列允许在靶向体外细胞内的不同细胞类型中mRNA的编码序列的差异表达。类似地，我们设想了一种方法，其中组合物包括递送系统和mRNA序列，被用于从动物中提取的目标体外样本，包含于所述mRNA序列的miRNA结合位点序列允许mRNA编码序列在目标样本内不同细胞类型中差异表达。
疫苗
本文所述的mRNA构建体和组合物可用于疫苗疗法，增强常规疫苗的功效，和/或用作针对传染性病原体(例如病毒、细菌、真菌、原生动物、朊病毒和寄生虫(蠕虫))使用的新型疫苗形式；或用于治疗如癌症等疾病。我们设想如本文所述的mRNA构建体可通过5'和3'末端的(直接或间接)连接成环，并且此类环形或环状的RNA构建体被认为包括在本文所用的术语“mRNA构建体”中；此类构建体已被显示为作为基于RNA的疫苗潜在有效，例如针对SARS-CoV-2(Qu L.等人,bioRxiv 2021.03.16.435594；https://doi.org/10.1101/2021.03.16.435594)。因此，本文所述的mRNA构建体包括可在细胞中翻译的环形或环状RNA构建体。
因此，本发明的组合物可用于预防或治疗感染性致病性疾病，通过包含在疫苗制剂中或以佐剂(例如，以合适的细胞因子)的形式与疫苗组合施用。
感染性菌剂的实例包括橙黄醋酸杆菌、鲍曼不动杆菌、布氏放线菌、放射性土壤杆菌、根癌农杆菌、嗜吞噬细胞无形体、茎瘤固氮根瘤菌(Azoorhizobium caulinodans)，棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、草绿色链球菌(Viridans Streptococci)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、短杆菌(Bacillus brevis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、梭状芽胞杆菌(Bacillusfusiformis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、脆弱类杆菌、牙龈类杆菌、产黑素拟杆菌、产黑素普雷沃菌、汉赛巴尔通体、五日热巴尔通体、支气管败血波氏杆菌、百日咳杆菌、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克氏菌、洋葱伯克霍尔德菌、肉芽肿荚膜杆菌、大肠弯曲杆菌、胎儿弯曲菌、空肠弯曲菌、幽门弯曲杆菌、衣原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热嗜衣原体、鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)、肉毒杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、魏氏梭菌(Clostridium welchii)、破伤风梭菌、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒状杆菌、贝氏柯克斯体、查菲埃立克体、尤因埃立克体、侵蚀艾肯菌、阴沟肠杆菌、鸟肠球菌、耐久肠球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、Enterococcus maloratus、大肠杆菌、坏死梭杆菌、具核梭杆菌、阴道加德纳氏菌、杜克莱氏嗜血菌、流感杆菌、副流感杆菌、百日咳嗜血杆菌、阴道嗜血杆菌、胃螺杆菌、肺炎克氏杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌、侵肺军团菌、杜氏利什曼原虫、肾脏钩端螺旋体、野口氏钩端螺旋体、李斯特菌、外生甲烷杆菌(Methanobacteriumextroquens)、多形微杆菌、藤黄微球菌、卡他莫拉菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、白喉棒状杆菌(Mycobacterium diphtheriae)、胞内分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鼠麻风分支杆菌、草分支杆菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、生殖支原体、人型支原体、穿透支原体、肺炎支原体、墨西哥支原体(Mycoplasma mexican)、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、巴氏杆菌、土拉巴斯德氏菌、消化链球菌属、牙龈红棕色单胞菌、产黑素普雷沃菌、产黑素类杆菌(Bacteroides melaninogenicus)、绿脓杆菌、放射性根瘤菌、普氏立克次氏体、鹦鹉热立克次氏体(Rickettsiapsittaci)、五日热立克次氏体、立克次氏体、沙眼立克次(氏)体(Rickettsia trachomae)、亨氏罗卡利马氏体菌、五日热罗卡利马氏体菌、龋齿罗氏菌、肠炎沙门菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾埃伯泽氏菌、纡回螺菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、链球菌、无乳链球菌、鸟链球菌、牛链球菌、大鼠链球菌、面链球菌(Streptococcus faceium)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、野生链球菌、鸡链球菌、乳酸链球菌、温和链球菌、缓症链球菌、变形链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、鼠链球菌、唾液链球菌、血链球菌、远缘链球菌、梅毒螺旋体、解脲支原体、霍乱杆菌、逗号弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫巴斯德氏菌和假结核巴斯德氏菌。
病毒作为传染源的示例包括：腺相关病毒、Aichi病毒、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒、BK多瘤病毒、博那病毒、巴马森林病毒、布尼安维拉病毒、拉格罗斯布尼亚病毒(BunyavirusLaGrosse)、雪鞋山病毒(Bunyavirus snowshoe hare)、猴疱疹病毒、金迪普拉病毒、基孔肯亚病毒、CosavirusA、牛痘病毒、柯萨奇病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、登革病毒、多里病毒(Dhori virus)、达格毕病毒(Dugbe virus)、杜文黑基病毒、东方马脑炎病毒、埃博拉病毒、埃可病毒、脑心肌炎病毒、EB病毒、欧洲蝙蝠狂犬病毒、GB病毒C/庚型肝炎病毒、汉坦病毒、亨德拉病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、马痘病毒、人腺病毒、人星状病毒、人冠状病毒、人类巨细胞病毒、人肠道病毒68型、人肠道病毒70型、人疱疹病毒1型、人疱疹病毒2型、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒7型、人疱疹病毒8型、人免疫缺陷病毒、人类乳突病毒1、人类乳突病毒2、人类乳突病毒16、人类乳突病毒18、人类副流感病毒、人类细小病毒B19、人呼吸道合胞病毒、人类鼻病毒、人SARS冠状病毒、人唾液逆转录病毒、人类嗜T淋巴细胞病毒、人环曲病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、伊斯法罕病毒(Isfahan virus)、JC多瘤病毒科、日本脑炎病毒、阿根廷出血热嵌沙样病毒(Junin arenavirus)、Kl多瘤病毒、昆津病毒、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos batvirus)、维多利亚湖马尔堡病毒、兰加特病毒、拉沙病毒、洛兹达雷病毒(Lordsdalevirus)、羊跳跃病病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、马秋博病毒(Machupo virus)、马雅罗病毒(Mayaro virus),中东呼吸综合征冠状病毒、麻疹病毒、门戈脑心肌炎病毒、梅克尔多元癌细胞病毒、莫克拉病毒(Mokola virus)、传染性软疣病毒、猴痘病毒、腮腺炎病毒、墨累山谷脑炎(Murray valley encephalitis virus)、纽约病毒、尼帕病毒、诺如病毒、阿良良病毒(O'nyong-nyong virus)、口疮病毒、奥罗普切病毒(Oropouche virus)、皮钦德病毒(Pichinde virus)、脊髓灰质炎病毒、庞塔托鲁病毒、普马拉病毒(Puumala virus)、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、裂谷热病毒、RosavirusA、罗斯河病毒、轮状病毒A、轮状病毒B、轮状病毒C、风疹病毒、鹫山病毒、Salivirus A、白蛉热西西里病毒、札幌病毒、SARS冠状病毒2(COVID)、塞母利基森林病毒、汉城病毒、猴泡沫病毒、猴病毒5、辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)、南安普顿病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱传Powassan病毒(Tick-bornepowassanvirus)、鸡贫血病毒、托斯卡纳病毒(Toscana virus)、乌卡勒米病毒、牛痘病毒、水痘带状疱疹病毒、天花病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水泡性口炎病毒、西方马脑炎病毒、WU多瘤病毒、西尼罗病毒、亚巴猴肿瘤病毒、亚巴样病病毒、黄热病毒和寨卡病毒。
真菌作为传染源的示例包括：金黄裸柄伞属、乳酪状红金钱菌、独生黄韧伞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、松露、栗色博氏牛肝菌、根际属(Rhizosphere spp.)、Herpotrichiellaceae属、瓦氏被核衣属、珊瑚地钱菌属、Minimedusa属、Marchandiobasidium aurantiacu、珊瑚地钱菌、Marchandiomyces lignicola、布尔喀霉属、蛛丝细薄菌(Athelia arachnoidea)、链格孢菌、链格孢属、牛肝菌、橙黄疣柄牛肝菌、变色栓菌、栓菌属、Sympodiomycopsis属、雪黄岛衣、白粉寄生孢属、双型裸脚伞、裸脚菇属、绒柄裸脚菇、橘黄裸伞(Gymnopus spongiosus)、金线菌属readii、微皮伞属stenophyllus、枝杆微皮伞(Marasmiellus ramealis)、蒜头状小皮伞(Marasmius scorodonius)、Collybiamarasmioides、空基微皮伞、Caripia montagnei、Rhodocollybia属、砖红炭褶菌、炭褶菌、Anthracophyllum属、平革菌属、粟酒裂殖酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黄曲霉、黑曲霉、曲霉属、鳞盖口蘑、油口蘑、Tomentellasublilacina、根须腹菌属、蜡蘑属、丝盖伞属、粘滑菇属、丝膜菌属、锁瑚菌属、牛肝菌属、鹅膏属、蜡叶散囊菌、Edyuillia athecia、Warcupiella spinulosa、Hemicarpentelesparadoxus、棘孢半内果菌(Hemicarpenteles acanthosporus)、半内果菌属、Chaetosartorya cremea、石座菌属、Graphium tectonae、Diplolaimelloides属、杆线虫属、瓣状亚侧耳(Hohenbueheliapetalodes)、禾谷炭疽菌(Glomerella graminicola)、树状隐球菌(Cryptococcus arboriformis)、新型隐球菌、隐球菌属、Gamsylellaparvicollis、坚粘孢单顶孢(Monacrosporium haptotylum)、四川单孢菌(Monacrosporiumsichuanense)、单顶孢属、Monacrosporiumgephyropagum、单顶孢属、Drechslerellacoelobrocha、捕食线虫真菌(Drechslerella dactyloides)、Drechslerella属、弯孢节丛孢菌、鞭式节丛孢、Arthrobotrys hertziana、少孢节丛孢、蠕虫生节丛孢、节丛孢属、掘氏单顶孢(Monacrosporium drechsleri)、Vermispora属、波氏霉样菌(Pseudallescheriaboydii(尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)))、Scedosporium inflatum、Geosmithia属、檬果炭疽病菌、云杉散斑壳、亚洲镰孢菌、镰刀菌属、阿魏侧耳、Cintractiasorghi-vulgaris、格氏蝇头菌、波多耳属、木耳属、Puccinia bartholomaei、柄锈菌属、菜豆间座壳、Melanconis stilbostoma、炭角菌属、马毛癣菌、断发癣菌、紫色毛癣菌、深红色发癣菌、趾间发癣菌、舍恩莱发癣菌、毛癣菌属、伞菌状青褶伞、土生空团菌、柔膜菌目、Rhizoscyphus ericae、绒边乳菇、乳菇属、梭形革菌、褐环乳牛肝菌、毒蝇鹅膏菌、口蘑属、双色蜡蘑(Laccaria cfbicolour)、紫色丝膜菌、五隔盘单毛孢属、蒙大略氏端隔孢壳菌、紫小韧革菌、Botryobasidium subcoronatum、小条孢牛肝菌、牛肝菌属、Hypocreafarinose、肉座菌属、Sarcostroma restionis、Sarcostroma属、Truncatella betulae、狭窄平截盘多毛孢属、Pestalotiopsis matildae、拟盘多毛孢属、茎点霉属、班尼小克银汉霉(Cunninghamella bainieri)、灰色小克银汉霉(Cunninghamella bertholletiae)、鸡油菌、Apiospora bambusae、Apiospora属、Discostroma botan、Cercophora caudate、日规壳属ribicola、Faurelina elongate、菌根真菌、毡状金孢霉、鬼伞属、枝顶孢菌属、生赤壳属、正果茎点霉、Tetracladium属、被孢霉属、美孢胶膜菌、瘤菌根菌属、美孢胶膜菌、Antarctomycespsychrotrophicus、黑盘孢科、拟茎点霉属、木霉属、拟盘多毛孢属、拟盘多毛孢属、发菌目(Trichocomaceaespp.)、锥毛壳属、银耳目、座囊菌目、黑痣菌科、酵母目、Herpotrichiellaceae属、百合纲、丝孢酵母目、解毒毛孢酵母(Trichosporonmycotoxinivorans)、毛孢子菌属、小穴壳菌科、肉座菌目、球腔菌科、锁掷酵母目、麦角科、格孢腔菌属、黑粉菌科、黑痣菌科、毛霉科、粪壳菌目、线黑粉菌目、红厚壳科、麦角科、毛霉目、Herpotrichiellaceae属、微座孢属、黑痣菌科、Zopfiaceae属、葡萄座腔菌科、柔膜菌科、生赤壳科、茸瑚菌科、Dipodascaceae科、蕨藻科、Microstromatales属、多孔菌目、蒙塔腔菌、裸子囊科、Cryphonectriaceae科、炭角菌目、蒙塔腔菌、毛壳菌科、丽石黄衣、根霉属、Penicillium属、Cetraria aculeate、Nephromopsis laureri、绿色土可曼衣、Cetrariaericetorum、冰岛衣属、卷黄岛衣、Kaernefeltia merrillii、Amorosia littoralis、蓝色刺孢霉(Quambalaria cyanescens)、红座虫草、虫草属、红菇属、锁瑚菌属、Tuberquercicola、裸腹菌属、Tetrachaetum elegans、Anguillospora longissima、肉座菌属、Sirococcus conigenus、瑰色须腹菌、Rhizopogon olivaceotinctus、黑根须腹菌、小果豆马勃、Rhizoscyphus ericae、蓝绿丝膜菌、桩菇属、杂色乳牛肝菌(Suillusvariegates)、嗜气焦杆菌(Pyrobaculum aerophilum)、胶膜菌属、亚侧耳属、新月弯孢霉(Cochliobolus lunatus)、波状拟褶尾菌、紫杉邦氏菌、耳状小塔氏菌、Tapinella属、Austropaxillus属、红铆钉菇、铅色短孢牛肝菌、Phylloporus pelletieri、Chamonixiacaespitose、Porphyrellus porphyrosporus、Truncocolumella citrina、黑毛小塔氏菌、Scleroderma leave、杂色乳牛肝菌(Suillus variegates)、乳牛肝菌属、Porphyrellusporphyrosporus、豆包菌(Pisolithus arrhizus)、Phaeogyroporusportentosus、Melanogastervariegates、柔软白圆炷菌、Hydnomerulius pinastri、红铆钉菇、铅色短孢牛肝菌、黄空柄牛肝菌、胡椒牛肝菌、Chamonixia caespitose、紫杉邦氏菌、Dendryphiellatriticicola、球座菌属、竹黄属、枝孢属、拟茎点霉属、间座壳菌目、拟盘多毛孢属、扁孔腔菌属、厚孢轮枝菌、淡紫拟青霉、宛氏拟青霉、拟青霉属、Ceratorhiza oryzae-sativae、深海真菌(Geosmithiapallida)、Geosmithia属、梨形管囊霉(Geosiphonpyriformis)、Agonimia属、Pyrgillus javanicus、皮炎外瓶霉、嗜鱼外瓶霉、外瓶霉属、Ramichloridiumanceps、枝氯霉属、多毛刺壳腔菌(Caproniapilosella)、lsariafarinose、萨克拉普奇尼亚菌、刀孢蜡蚧菌(Lecanicilliumpsalliotae)、座囊菌纲(Dothideomycetespp.)、锤舌菌纲、Ustilaginoidea vixens、Hyphozyma lignicola、Coniochaeta malacotricha、锥毛壳属、裂虫壳(Torrubiella confragosa)、lsaria tenuipes、犬小孢子菌、奥杜盎小孢子菌(Microsporum audouinii)、小孢癣菌属、Epicoccumfloccosum、玫瑰红巨孢囊霉、巨孢囊霉属、灵芝属、古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)、专性寄生霜霉菌(Hyaloperonosporaparasitica)、Plectophomella属、黑酵母菌(Aureobasidiumpullulans)、深褐褶菌(Gloeophyllum sepiarium)、褐褶菌属、董氏孔菌(Donkioporia expansa)、波状薄孔菌(Antrodia sinuosa)、白木香内生真菌(Phaeoacremonium rubrigenum)、Phaeoacremonium属、Albertiniella polyporicola、Cephalotheca sulfurea、Fragosphaeria renifbrmis、Fragosphaeria属、Phialemoniumdimorphosporum、单胞瓶霉属、Pichia norvegensis、毕赤属、白假丝酵母(Candidaalbicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、念珠菌属、Gondawanamyces属、青凤蝶属、虫道真菌属(Ambrosiellaspp.)、小舌菌属/新胶鼓菌、霍氏盘菌日本亚种(Holwaya mucida)、Chlorovibrissea属、绿杯菌属、Thaxterogaster属、丝膜菌属、Setchelliogaster属、Timgrovea属、盘状菌属、豆粒层腹菌、Quadrispora tubercularis、Quadrispora属、Protoglossum violaceum、Ceratostomella pyrenaica、Ceratosphaeria lampadophora、佩德罗索氏产色芽生菌(Fonsecaea pedrosoi)、槭射脉革菌(Phlebia acerina)、白腐菌属、拟盘多毛孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis disseminata)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、Racospermyces koae、Endoraecium acaciae、Uromycladium tepperianum、Uromycladium属、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、伞菌属、Psilocybe quebecensis、粪生裸盖菇(Psilocybe merdaria)、裸盖菇属、黄褶裸伞(Gymnopilus luteofolius)、条缘裸伞(Gymnopilus liquiritiae)、裸伞属、瘤核垂幕菇(Hypholoma tuberosum)、Melanotus hartii、Panaeolus uliginosus、大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)、Dermocybe semisanguinea、Dermocybe属、Helicomamonth*pes、蜗孢属、Tubeufia helicomyces、Tubeufia属、Leohumicola verrucosa、雷公根叶斑病菌(Leptosphaerulina chartarum)、大茎点属(Macrophoma spp.)、蔷薇盘二孢(Marssonina rosae)、富克葡萄孢盘菌(Botryotiniafuckeliana)、拟盘多毛孢属、Chrysosporium carmichaelii、金孢子菌属、尖孢隔指孢(Dactylella oxyspora)、Dactylellina lobatum、葫芦科、Chrysophyllum sparsiflorum、星苹果属、禾本科布氏白粉菌(Blumeriagraminis)、多裂叉钩丝壳(Sawadaeapolyfida)、叉钩丝壳属、Parauncinulaseptata、桑白粉菌(Erysiphe mori)、白粉菌属、日本棒丝壳、高氏白粉病菌(Golovinomyces orontii)、高氏白粉菌属(Golovinomyces spp.)、单囊壳白粉菌(Podosphaera xanthii)、叉丝单囊壳属、穆氏节丝壳(Arthrocladiella mougeotii)、黄鼠狼花白粉菌(Neoerysiphegaleopsidis)、柿生球针壳(Phyllactinia kakicola)、球针壳属、Cyphellophora laciniata、Sphaerographium tenuirostrum、车轴草白粉菌(Microsphaera trifolii)、Sphaerotheca spiraeae、单丝壳属、南方小钩丝壳(Uncinuliella australiana)、伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、犁头霉属、地霉属、Nectria curta、Anamika lactariolens、Hebeloma velutipes、Stropharia ambigua、田头菇(Agrocybepraecox)、红齿菌(Hydnum rufescens)、齿菌属、Meliniomyces variabilis、Rhizoscyphus ericae、Cryptosporiopsis ericae、明枝霉属、Leptographiumlundbergii、细粘囊孢属、蚁巢伞属、波萨达斯球孢子菌(Coccidioides posadasii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、拟茎点霉属、黑僵菌(Metarhizium anisopliae)、虫草属、华盛顿腥掷孢菌(Tilletiopsiswashingtonensis)、齿毛菌(Cerrena unicolor)、黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、Phaeococcomyces nigricans、橡胶灵芝(Ganodermaphilippii)、灵芝属、深褐褶菌(Gloeophyllum sepiarium)、绵毛离壁壳(Cystotheca lanestris)、鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)、梣球针壳(Phyllactiniafraxini)、Varicosporium elodeae、Rhinocladiella basitonum、Melanchlenus oligospermus、葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)、根霉属、Phizomucor属、毛霉属、冠状虫霉(Conidiobolus coronatus)、Conidobolus属、蛙粪霉菌(Basidiobolus ranarum)、蛙粪霉属、Ochronis属、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、组织胞浆菌属、威氏盘菌(Wilcoxina mikolae)、Lasiodiplodia属、兰灰蜈蚣衣(Physcia caesia)、蜈蚣衣属、Brachyconidiellopsis属、乳白锥盖伞(Conocybe lacteal)、Gastrocybe lateritia、Gastrocybe属、半圆田头菇(Agrocybe semiorbicularis)、李外囊菌(Taphrinapruni)、外囊菌属、Asterophoraparasitica、星形菌属、阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyi)、Tricladium splendens、疣孢黄枝瑚菌(Ramariaflava)、枝瑚菌属、Laccaria fraternal、盾巨孢囊霉属、lllosporiumcarneum、Hobsonia christiansenii、珊瑚地钱菌(Marchandiomyces corallinus)、Fusicoccum luteum、葡萄座腔菌(Botryosphaeria ribis)、假酶麦蚜(Pseudozymaaphidis)、Pseudozyma属、Pesotum erubescens、毛柄钉灰包(Battarrea stevenii)、钉灰包属、Harposporium Janus、钩丝孢属、食线虫真菌(HirsuteIla rhossiliensis)、西费里节丝皮菌(Arthroderma ciferrii)、节皮菌属(Arthroderma spp.)、Pucciniastrumgoeppertianum、Cronartium occidentale、Cronartium arizonicum、柱锈属、克氏周皮菌(Peridermium harknessii)、被孢锈菌属(Peridermium spp.)、云杉帚锈病菌(Chrysomyxaarctostaphyli)、Holleya sinecauda、针孢酵母属(Holleya spp.)、根虫瘟霉(Zoophthoraradicans)、Smittium culisetae、Auxarthron zuffianum、Renispora flavissima、锯齿栉孔菌(Ctenomyces serratus)和申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)。
寄生虫作为传染源的示例包括寄生虫(蠕虫)选自：绦虫，例如裸头绦虫属、复孔[绦]虫属、裂头属、棘球属、蒙尼[绦虫]属、条虫(属)；吸虫，例如双腔属、片形属、同盘属、裂体吸虫属；或线虫,例如钩口属、板口线虫属、禽蛔属、蛔虫属、布鲁线虫属、仰口属、毛细线虫属、夏伯特线虫属、古柏属、盅口属、杯环属、双冠属、杯冠线虫属、盆口属、网尾属、棘唇[线]虫、恶丝虫属、龙线属、蛲虫属、类丝线虫属、丽线虫属、血矛属、异刺属、猪圆属、后圆属、Meullerius属、板口属、细颈属、日圆属、结节线虫属、盘尾属、胃线虫属、尖尾线虫属、副蛔属、冠尾属、圆线虫属、比翼属、弓蛔虫属、类圆线虫属、背带线虫属、弓蛔线虫属、毛线虫属、鞭虫属、毛圆线虫属、三齿线虫属、钩虫属和/或吴策线虫属。
作为感染剂的寄生物种的实例可包括选自以下的原生动物：利什曼原虫属物种，包括锥虫、多诺万利什曼虫、疟原虫属，包括但不限于恶性疟原虫；卡氏肺孢子虫、隐孢子虫、鞭毛虫、志贺氏菌属阿米巴原虫(Shigella amoeba)和Cyclosporanga canetenensis。
本文所讨论的疫苗组合物和方法并非专门用于治疗和预防可能已知对疫苗接种敏感的疾病，特别是在已知有效免疫原蛋白的情况下。
表5(下文)提供了选择用于本发明的组合物和方法的抗原的说明性实例，对于该抗原需要免疫应答。本领域技术人员可以容易地从公共数据库和出版物中获得类似的抗原/靶标，并得到本发明的组合物。应当理解，根据疾病状态，可以向受试者递送一种以上的抗原，例如，在感染之前预防性感染与活动性感染。例如，对于患有活动性结核病的受试者，可以递送编码活动期(例如ESAT6Ag85B)、潜伏期(Rv2626)和/或复苏期(RPfB-D)的TB蛋白的TB抗原。通过这种方式，活动性结核病可以被治疗，特别地，当需要施用引发Th1应答的佐剂时。
在本发明的一个方面，本文所述的组合物与标准疗法组合施用，例如，对于活性细菌或病毒感染，可以施用本领域已知的用于治疗此类疾病的抗微生物剂或抗病毒剂。这些药剂可以在本发明组合物治疗之前、同时(单独或作为固定剂量组合)或之后施用。
在一些实施方案中，所述编码mRNA可编码需要免疫应答的抗原。这种抗原的递送可用于诱导如上所述的局部免疫应答，或用于激发对抗原本身的适应性免疫应答，即，诱导针对该抗原的免疫，类似于疫苗。在这种情况下，本发明所述的组合物可与佐剂组合以促进免疫应答的产生。适当地，一种或多种促炎细胞因子可用作佐剂，例如选自：IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF或其激动剂和同系物的细胞因子。任选地，所述一种或多种促炎细胞因子特别地选自IL-2、IL-12、IFNγ、TNFα和GM-CSF。在特定实施方案中，一种或多种促炎细胞因子选自：IL-12、IFNγ和GM-CSF。在特定实施方案中，促炎细胞因子充当同时或连续施用的疫苗组合物的佐剂。
预防传染病或病原体感染的预防性疫苗
例如，所述编码mRNA可编码完全或部分引发所需免疫反应的细菌、病毒或其他微生物蛋白。在本讨论中，此类编码产物被称为“抗原产物”或“抗原”。在某些情况下，免疫只能针对细菌、病毒或其他微生物蛋白的一部分(“表位”或“抗原决定簇”)产生，因此也可以设想仅对这些部分进行编码。特别地，可以选择外部显示的微生物蛋白质的部分作为免疫识别的可能靶标。因此，编码的抗原可以是细菌、病毒或其他微生物蛋白，但可以是其部分序列、部分或其片段，特别是其“含表位片段”。我们设想，可以在相同或不同的mRNA构建体中提供针对特定微生物或病原体的一种以上的抗原。
本文所讨论的疫苗组合物和方法并非专门用于治疗和预防已知易受疫苗接种影响的疾病，特别地，在已知有效免疫原性蛋白的情况下，如表5所述。结果表明，本文的组合物和方法可以使用编码一种或多种下述免疫原性蛋白或其变体的mRNA构建体。
表5：感染性疾病的示例性疫苗抗原
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本文所讨论的疫苗适合(但不限于)定向于细胞内病原体，无论是胞质还是囊泡。在这方面，胞内细胞质病原体的示例有病毒、衣原体属、立克次氏体属、单核细胞增多性李斯特菌和原生动物。寄生虫例如疟原虫。囊泡胞内病原体的实例包括分枝杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、利什曼原虫属、李斯特菌属、锥虫属、嗜肺军团菌、新生隐球菌、组织胞浆菌和鼠疫耶尔森菌。
在一些实施方案中，所述编码mRNA可以编码严重急性呼吸综合征冠状病毒的一个或多个病毒蛋白，如严重急性呼吸综合症冠状病毒2型(SARS-CoV-2)，即导致新冠肺炎大流行的病毒。这种病毒有四种结构蛋白，S(刺突)、E(包膜)、M(膜)和N(核衣壳)蛋白。在一些实施方案中，所述编码mRNA编码全部或部分SARS-CoV-2的刺突蛋白。在一些实施方案中，所述mRNA编码S蛋白外结构域的预融合形式(氨基酸1至1208，残基986和987处具有脯氨酸取代；GenBank MN908947)。在一些实施方案中，所述mRNA编码刺突蛋白的受体结合结构域或RBD(残基319至591；GenBank MN908947)。作为这种蛋白质的外部部分，这可能是免疫系统识别表位的位置。在一些实施方案中，所述mRNA编码SARS-CoV-2变体(例如，α、β、γ、ε、δ、κ或η变体)的刺突蛋白的全部或部分。在一些实施方案中，所述mRNA包括下文表6A(SEQ ID NO:62至67)中的一个或多个序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相似性的序列。在一些实施方案中，刺突蛋白或其部分的编码mRNA已被密码子优化以在人或其他哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，mRNA中使用的一种或多种核苷被其同分异构体取代。作为一个实例，mRNA构建体中的尿苷核苷的一个、多个或全部被假尿苷核苷取代。在一个实施方案中，所述mRNA编码SARS-CoV-2δ变体的刺突蛋白，并且所述mRNA的器官保护MOP序列包括miRNA 122、miRNA 192和miRNA 30a中的每一个的靶位点，并且在另一实施方案中，还包括miRNA let7b的靶位点。在下文更详细描述的本发明的其他实施方案中，所述mRNA编码SARS-CoV-2的融合前刺突蛋白，其选自未密码子优化或人密码子优化的武汉株、β变体或α变体，具有或不具有MOP序列。所述mRNA的MOP序列包含miRNA 122、miRNA 192和miRNA 30a的miRNA结合序列的每一个；并且在另一实施方案中还包含miRNA let7b的靶位点。在下文更详细描述的本发明的其他实施方案中，所述mRNA编码SARS-CoV-2的融合前刺突蛋白，其选自未密码子优化或人密码子优化的武汉株、β变体或α变体，具有或不具有MOP序列。所述MOP序列可以选自以下miRNA结合序列组合的一种：miRNA 122、miRNA 192和miRNA 30a；以及let7b、miRNA 126和miRNA 30a；miRNA 122、miRNA 1、miRNA203a和miRNA30a。应当理解，可以根据需要器官保护的特定环境来选择其他MOP序列。如本文所述，所选择的MOP序列可包含miRNA结合序列，其进一步被优化以确保与体内相应的靶miRNA序列完美匹配杂交。
表6A-适用于疫苗组合物的一系列SARS-CoV-2刺突蛋白变体的示例性mRNA构建体
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在一些实施方案中，所述编码mRNA可编码人类α-疱疹病毒3型(HHV-3)的一种或多种病毒蛋白，也称为水痘-带状疱疹病毒(VZV)。在具体实施方案中，所述编码mRNA可编码VZV的一种或多种糖蛋白，例如糖蛋白E(VZVgE)
在一些实施方案中，所述编码mRNA可编码流感病毒(引起流行季节性流感的甲型和乙型)的一种或多种免疫原性病毒蛋白，例如血凝素、神经氨酸酶、基质-2和/或核蛋白。血凝素在流感的组、类型甚至亚型之间是高度可变的，这是开发通用流感疫苗的困难之处。血凝素的头部域是高度可变的，但是血凝素的膜近侧茎域在组内相对保守，但是是免疫亚显性的。因此，一些疫苗策略使用没有头部域的减少的HA，可以预期在本发明的实施方案中可以提供这种减少的HA。
本申请被认为提供了一种或多种来自任何组、类型或亚型的流感的免疫原性病毒蛋白，例如来自甲型流感第1组：H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17、H18亚型和N1、N4、N5、N8亚型；来自甲型流感第2组：H3、H4、H7、H10、H14、H15亚型+N2、N3、N6、N7、N9亚型；乙型流感病毒不分为亚型，而是进一步分为两个谱系：B/Yamagata和B/Victoria。
神经氨酸酶的漂移速度比血凝素慢，而且抗神经氨酸酶抗体在一个亚型中具有交叉保护作用。与血凝素相比，神经氨酸酶具有免疫亚显性。基质-2和/或核蛋白比血凝素更保守，但具有免疫亚显性。
每年，世界卫生组织根据预测推荐四价或三价流感疫苗。因此，特别地，可以提供编码一种以上流感抗原的组合物和构建体，以提供广泛的保护。
在一些实施方案中，所述编码mRNA可编码呼吸道合胞病毒的一种或多种免疫原性病毒蛋白，例如F糖蛋白和/或G糖蛋白。使用Mclellan等人2013年所述的修饰，A2菌株的F糖蛋白可以稳定在预融合构象，这诱导了对RSVA(Long)和RSVB(18537)菌株的交叉保护。
在一些实施方案中，所述编码mRNA可编码人类免疫缺陷病毒的一种或多种免疫原性病毒蛋白，例如糖蛋白120中和表位(例如CD4BS 421-433表位)或糖蛋白145的全长或部分。来自HIV的抗原如gag、pol、env和nef已作为可能的候选疫苗在各种载体中表达(IPNascimento和LCC Leite，Braz J Med Biol Res.2012doi:10.1590/S0100-879X201207007142)。
在一些实施方案中，所述编码mRNA可编码来自分枝杆菌属细菌的一种或多种免疫原性细菌蛋白或其部分。特别地，所述编码mRNA可以编码来自结核分枝杆菌和/或麻风分枝杆菌细菌的一种或多种细菌蛋白。在一些实施方案中，所述编码mRNA可编码来自结核分枝杆菌活性和/或潜伏期和/或复苏期的一种或多种蛋白质。例如，所述mRNA可能编码一种或多种结核分枝杆菌选自ESAT-6、Ag85B、TB10.4、Rv2626和/或RpfD-B的蛋白或其部分。
下文表6B显示了编码多种不同潜在病原体抗原的ORF的实例，其可用于本发明。如本文所述，这些ORF可与其它RNA序列(最特别地，OPS)一起存在，和/或与其它mRNA构建体组合使用。类似于上述讨论，在一些实施方案中，所述RNA包括下文表6中的一个或多个序列(SEQ ID NO:69-84)，或其含有表位的片段，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相似性的序列。在一些实施方案中，针对所述抗原或其部分的编码mRNA已被密码子优化以在人或其他哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，所述mRNA中使用的一种或多种核苷被其同分异构体取代。作为一个示例，所述mRNA构建体中的尿苷核苷的一个、多个或全部被假尿苷核苷取代。
表6B-适用于在疫苗组合物中使用的几种病原体的抗原的ORF示例，未针对人类细胞表达进行优化或含有MOP序列。
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特别地，我们设想提供包含编码一种以上抗原的mRNA的组合物，包括药物组合物，例如，编码来自一种以上SARS-CoV-2刺突蛋白的刺突蛋白。如本文其他地方所述，多种抗原可通过相同或不同的mRNA构建体提供。在一个实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含编码来自野生型SARS-CoV-2、β(南非)变体SARS-CoV-2和δ变体SARS-CoV-2中的至少两种、适当地全部三种刺突蛋白的mRNA构建体。这些可能存在于相同或不同的mRNA构建体上。如本文其他地方所述，编码这些抗原的mRNA构建体可能缺乏一个或多个OPS，适当地所有这些构建体都具有OPS。在一些实施方案中，所述OPS可包含能够与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a结合的序列；或能够与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的序列。如下文进一步讨论的，在任何这些实施方案中，所述组合物还包括编码免疫调节剂的mRNA。特别地，如本文其他地方所述，所述组合物还可包含编码IL-12的mRNA。所述免疫调节剂mRNA可缺乏OPS，或可包含本文其他地方所述的OPS。在一些实施方案中，所述OPS可包含能够与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a结合的序列；或能够与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的序列。在具体实施方案中，如上所述，所述编码抗原(例如两种或多种变体SARS-CoV-2刺突蛋白)的mRNA构建体可能缺乏OPS，而编码免疫调节剂(例如IL-12)的mRNA构建体可能包括OPS。
在一些实施方案中，我们设想可以提供包含编码SARS-CoV-2(或其变体)和流感中每一种病毒蛋白的mRNA的组合物，例如，以提供针对这些病毒中的一种或两种的季节性、新的或正在出现的变体的多价或联合疫苗接种。如其他地方所述，不同的抗原可提供在相同或不同的mRNA构建体内，并且这些mRNA构建体可缺乏OPS，或可包含如其他地方所述的OPS/MOP。如下文进一步讨论的，所述组合物可进一步包含编码免疫调节剂(如IL-12)的mRNA。如上所述，该mRNA还可包含OPS。
在各种实施方案中，编码抗原产物的mRNA另外包含至少一个保护多个器官的OPS(即多器官保护序列或“MOP”)，其中所述OPS序列包括至少三个(例如，至少第一、第二和第三)微RNA(miRNA)靶序列。靶序列之一可以是能够与miRNA-1结合的序列。所述靶序列可以包括能够与miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-206、miRNA-122、miRNA-192、miRNA-203a、miRNA205、miRNA-200c、miRNA-30a/b/c和/或Let7a/b的一个或多个结合的序列，适当地可以与其全部结合。
在任何编码抗原的mRNA的各种实施方案中，所述OPS可包括能够与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a结合的序列；能够与Let7b、miRNA-126和miRNA-30a结合的序列；能够与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的序列；或能够与miRNA-192、miRNA-30a和miRNA-124结合的序列，其中两个序列能够与miRNA 122结合。任何OPS(如本文所述)可进一步包括能够与miRNA-124结合以保护脑组织的序列，和/或能够与Let7b结合的序列。OPS中靶序列的顺序(即，它们的5'到3'排列)并不重要，可以考虑任何排列。
可以理解，上述方法特别适合于制备类似于通常的“类毒素”疫苗的疫苗治疗组合物，其中针对由细菌或其他生物体、或“亚单位”疫苗产生的灭活毒素诱导免疫应答，其中针对靶微生物的片段诱导免疫应答。
尽管本文所述的本发明的任何实施方案可以具有血液或其子部分(例如造血细胞、淋巴细胞等)作为所提出的靶组织，但特别地，我们认为血液及其子部分在目的是诱导免疫应答，其中针对由编码mRNA编码的产物诱导免疫应答和/或任选地其目的是提供疫苗治疗的实施方案中可能特别合适。特别地，外周血单个核细胞(PBMC)被认为是此类方法的靶点，并且适宜的是抗原呈递细胞(APC)。
常规疫苗至少部分地通过将病原体特异性抗原(外源抗原)呈递给免疫系统而发挥作用，从而可以诱导针对它的免疫反应，并且在下次遇到这种外源性抗原时可以识别和快速对抗。所谓的抗原呈递细胞(APC)是这一过程的关键。虽然所有有核细胞都可以向细胞毒性T细胞(CD8+)提供内源性抗原，但某些细胞是“专职性”APC，包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞，具有检测和呈递外源抗原的能力。这些细胞内化并加工外源抗原，将其或其片段(免疫显性表位)呈现在表面，与主要组织相容性复合物II型(MHC-11)结合，并且通常与共刺激分子，以形成增强的T细胞应答，如CD4+辅助T细胞，它们在启动B细胞驱动的抗体产生(适应性免疫)中起关键作用。
先前的研究表明，编码流感蛋白的mRNA可以在脂质纳米粒子中施用，使得免疫细胞的募集以及单核细胞和树突状细胞对mRNA进行翻译(Liang等人，Efficient Targetingand Activation of Antigen-Presenting Cells In Vivo after Modified mRNAVaccineAdministration in Rhesus Macaques.Mo/Ther.2017)。因此，用本文所述编码外源抗原或其表位的mRNA构建体或组合物转染专职性APC(如单核细胞和树突状细胞)，预期允许抗原呈递并诱导针对该抗原的长期适应性免疫。然而，抗原在专职性APC中的表达是非必要的，并且由其他组织表达的抗原可以有效地诱导所需的免疫应答，因为所产生的抗原可以在产生后由专职性APC以正常方式摄取和加工。
除此之外或作为替代，本文所述的mRNA构建体或组合物可用于递送和表达与疫苗诱导免疫过程相关的产物，例如细胞因子、趋化因子、共刺激分子或主要组织相容性复合物。在本讨论中，此类编码产物被称为“免疫刺激剂”、“免疫调节产物”或“免疫调节剂”，或者，当用于刺激对共同施用的疫苗组合物的应答时，称为“佐剂”。如果施用同时编码抗原和其他(免疫调节)成分的mRNA，则可将其配制成单独的mRNA构建体，或一起配制在相同的多顺反子mRNA上，如上所述。当单独的mRNA构建体用于这些产物时，所述单独的构建体可以各自包含相同组miRNA结合位点序列(即，它们可以各自包含相同OPS)，或者可以包含不同的miRNA结合位点序列(不同OPS)，如下文进一步讨论的。在某些情况下，一种或另一种mRNA构建体可能完全缺乏miRNA结合位点序列。可以理解，与疫苗诱导免疫过程相关的mRNA编码产物可以与本领域技术人员已知的任何类型的疫苗组合使用，即，与蛋白基(类毒素、重组、结合疫苗)、RNA、mRNA和DNA基疫苗(包括如上所述环形或环化RNA构建体)、减毒活疫苗、灭活疫苗或基于重组载体的疫苗(例如MVA或腺病毒平台)。
通过这种方式，可以以可控的、多种方式增强对共同施用的mRNA编码抗原或其他类型疫苗的免疫应答。这种方法的另一个优点是期望通过施用免疫调节剂来增强免疫应答，在单一组合物中提供多种多肽是可能的。
例如，巨噬细胞需要T细胞分泌干扰素γ(IFN-γ)来激活，以表达MHC-I1。因此，通过用所述mRNA构建体和组合物转染诱导IFN-γ表达可以增强疫苗诱导的免疫应答的诱导，无论是由于常规疫苗方法还是使用本文所述mRNA构建体和组合物诱导抗原表达的方法。类似地，还可以使用本文所述的mRNA构建体和组合物来诱导免疫原性过程中涉及的细胞受体，例如TLR，适当地是如上所述的TLR8。
Th1和Th2免疫应答之间的主要区别在于，Th1免疫应答是一种促炎反应，它杀死细胞内寄生虫并使自身免疫应答持续，而Th2免疫应答促进特异反应性的lgE和嗜酸性粒细胞应答，并产生抗炎应答，从而杀死大型细胞外寄生虫，如蠕虫。此外，关键的Th1细胞因子是干扰素γ(IFN-γ)，而Th2细胞因子包括白介素4、5、6、10和13。Th1免疫应答是Th1细胞对细胞内寄生虫如细菌和病毒产生的免疫应答。通常，所述细胞因子IL-12通过激活Th1细胞来触发Th1免疫应答。此外，活化的Th1细胞分泌细胞因子，如干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素-2(IL-2)。Th1免疫应答是导致细胞介导免疫的促炎应答。因此，它激活巨噬细胞以及CD8T细胞、lgG B细胞和IFN-γCD4 T细胞。Th1细胞产生的细胞因子包括干扰素γ(INF-γ)、白介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子β(TNF-β)介导Th1免疫应答，而Th2细胞产生的细胞因子如白介素(IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13)介导Th2免疫应答。
IL-12由树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和人类B淋巴细胞样细胞对抗原刺激的应答产生，并参与T细胞的刺激和生长。IL-12是一种促刺激和促炎细胞因子，在辅助T细胞的Th1亚群的发育中起关键作用。IL-12最初被发现是因为它能够诱导干扰素γ(IFN-γ)的产生、细胞增殖以及自然杀伤细胞和T细胞介导的细胞毒性。现已证实，如上所述，IL-12在Th1应答的发展中也起着关键作用，使得IFN-γ和IL-2的产生。这些细胞因子反过来可以促进细胞毒性T细胞应答和巨噬细胞活化。
在另一个实施方案中，可能需要施用导致IL-12表达的mRNA构建体和/或组合物，以增强疫苗效力或增强疫苗诱导的免疫应答，无论由于常规疫苗方法还是使用本文所述的mRNA构建体和组合物诱导外源性抗原表达的方法产生。以这种方式，IL-12作为佐剂存在，特别地，以在接受者中提供针对同时或大约同时递送的抗原的免疫刺激应答。如前所述，IL-12诱导Th1应答的有利生物活性促进IFN-γ和IL-2的产生。总之，这些细胞因子可以反过来促进细胞毒性T细胞免疫，以对所施用的抗原产生应答。这种类型的疫苗治疗的接受者的免疫原性应答特别地适合治疗或预防由细胞内病原体如SARS-CoV-2、流感、HIV和RSV等病毒，甚至细胞内细菌病原体如结核分枝杆菌引起的传染病。
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF或CSF2；GenBank 25AAA52578)是由多种细胞类型(包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞和脂肪细胞)产生的免疫调节剂。GM-CSF还调节抗原呈递细胞的功能，并参与树突状细胞活化的增强和单核吞噬细胞成熟的增强。GM-CSF先前已被用于疫苗中以刺激应答(Yu等人，Novel GM-CSF-basedvaccines:One small step in GM-CSF gene optimization,one giant leap for humanvaccines.Hum Vaccin lmmunother.2016)。特别地，GM-CSF已被证明可以提高疫苗对细菌性疾病或感染的应答，包括但不限于白喉预防(Grasse M等人，GM-CSF improves theimmune response to the diphtheria-component in a multivalentvaccine.Vaccine.2018)和结核病预防(Wang等人，Enhanced immunogenicity ofBCGvaccine by using a viral-based GM-CSF transgene adjuvantformulation.Vaccine.2002)。在病毒疾病或病毒感染的疫苗方法中使用GM-CSF的类似的改进已经被发现或理论化，所述病毒包括但不限于冠状病毒、流感病毒(Liu等人，Influenza virus-like particles composed of conserved influenza proteins andGPl-anchored CCL28/GM-CSF fusion proteins enhance protective immunity againsthomologous and heterologous viruses.lnt lmmunopharmaco/.2018)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Yu等人，Construction and in vitro evaluation ofa recombinant liveattenuated PRRSV expressing GM-CSF.Viral J.2014)。
因此，使用本文所述的mRNA构建体或组合物引入GM-CSF的编码mRNA可用于通过抗体和细胞免疫应答增强疫苗免疫原性。因此，这些方法可以作为疫苗佐剂、增强剂或免疫增强剂以及预防性和治疗性疫苗类型用于人类和其他受体。对于其他CSF类型的蛋白，如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF或CSF1；GenBank BC021117)和粒细胞集落刺激素(G-CSF或CSF3；GenBank BC033245)，也可以看到类似的作用。
如上所述，IFN-α和IFN-β主要参与抵抗病毒感染的先天免疫，并且如本文所述，使用本文所述的mRNA构建体或组合物引入这些试剂中的一种或两种可用于增加免疫原性。
已知IFN-γ合成会影响适应性免疫应答的强度和质量。免疫后IFN-γ的早期合成(在出现适应性免疫应答之前发生)是针对疫苗的高质量免疫应答的标志。先天免疫细胞早期释放IFN-γ影响树突状细胞成熟，从而影响CD4+T细胞向Th1谱系的分化。
如本文所述的，IFN-γ和IL-2也由活化的CD4+Th1细胞产生，并且这些试剂中的一种或两种的引入被认为能够增加相关应答。类似地，本文其他地方所述的TNFα作为对感染的炎症应答的一部分被释放以招募其他免疫系统细胞，因此，使用本文所述的mRNA构建体或组合物提供TNFα可用于增强抗病毒免疫原性。
IL-6参与B细胞向免疫球蛋白分泌细胞的最终分化，使用本文所述的mRNA构建体或组合物引入IL-6可提高免疫原性。
当如本文所述施用时，IL-8的引入旨在改善中性粒细胞趋化性，从而提高免疫原性。
可使用本文所述的mRNA构建体或组合物诱导的与疫苗诱导免疫过程相关的产物的其他示例包括核因子NF-κB途径的调节剂，其已参与开发对结核(BCG)疫苗的疫苗应答(Shey等人，Maturation of innate responses to mycobacteria overthe first ninemonths oflife.J lmmunol.2014)。
选择特定免疫调节剂用于共同施用的能力，例如上述那些，允许促进特定类型的免疫应答，这对于诱导针对特定病原体的有效免疫是有益的。例如，由于所讨论的IL-12在Th1应答过程中起着关键作用，使得IFN-γ和IL-2的产生，因此在针对这种细胞内病原体接种疫苗时联合施用这种细胞因子可能是有益的。其他Th1相关细胞因子，例如IFN-γ、TNF-β、IL-2和IL-10，也可以或可选地用于促进此类反应。
根据上述讨论的mRNA构建体和组合物，无论是编码抗原还是免疫调节剂，都可以包含本文所述的任何器官保护序列。然而，在特定实施方案中，器官保护序列被选择以保护肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏和皮肤中的一个或多个(例如，使用miRNA-1、miRNA-122、miRNA-192、miRNA-30a和/或miRNA-203a的靶序列)。在一些实施方案中，miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a和miRNA-203a的共同靶序列包括在所述器官保护序列中。这种组合被认为对保护肌肉组织(因为组合物可以肌肉内施用)以及肝脏和肾脏组织有效。特别地，根据表2，在需要保护肌肉组织的任何实施方案中，可以包括miRNA 133a和/或miRNA 206的靶序列来替代miRNA 1或排除miRNA 1。例如，这种OPS可以包括miRNA-133a、miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a的靶序列；或miRNA-206、miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a的靶序列。皮下或皮内施用也很常见，一种或多种与皮肤相关的miRNA靶序列(见表2)也可用于保护皮肤细胞。
据认为，某些疫苗可能具有与内皮组织相互作用相关的副作用。在Goldman M，Hermans C((2021)PLoS Med 18(5):e1003648.https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1003648)中，提出了以下机制：肌肉注射后，疫苗腺病毒感染内皮细胞，诱导其产生SARS-CoV-2刺突蛋白。硫酸乙酰肝素PG可在内皮细胞的管腔侧与刺突蛋白结合或被受损细胞释放。刺突蛋白通过ACE2依赖和ACE2非依赖机制激活血小板。活化血小板释放的PF4在与内皮细胞脱落的硫酸乙酰肝素PG结合后会变得具有免疫原性。
因此，在一些实施方案中，可能需要包括miRNA靶序列以保护内皮组织。如表2中所述，miRNA-98和/或miRNA-126靶序列可包含在OPS中。这种类型的保护被认为适用于任何施用模式，尤其地，在使用血管内施用(静脉内、动脉内等)或肌肉内施用的情况下。
在其他实施方案中，靶序列可以包括来自以上表3或4的一个或多个序列的任何适当组合。在具体的实施方案中，包含在编码免疫调节剂的mRNA构建体中的OPS可以包括能够与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a；Let7b、miRNA-126和miRNA-30a；miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的序列；或能够与miRNA-192、miRNA-30a和miRNA-124结合的序列，其中两个序列能够与miRNA 122结合。
在这种构建体和组合物中避免使用miRNA-142靶序列也被认为是有利的，因为这种miRNA在造血源细胞和免疫细胞中大量存在，因此可能使得其在预期介导疫苗介导应答的细胞中的表达减少。
在其中施用同时编码抗原和免疫调节成分的mRNA的实施方案中，这些可作为分离的mRNA构建体提供，其可共同配制或单独配制。在一些实施方案中，一个或其他mRNA构建体可能完全缺乏miRNA结合位点序列。在其他情况下，如本文所述，每个mRNA构建体可包含一个或多个的器官保护序列。对于每个mRNA构建体，这些器官保护序列可能相同，也可能不同。考虑到抗原和免疫调节剂产物的不同目的和潜在脱靶效应，对这些产物中的每一种使用不同的器官保护序列可能是有益的，以便支持这些产物的不同表达模式，和/或将对每种产物的保护扩展到不同组织或细胞类型中。
例如，抗原组分主要由肌细胞以及APC表达可能是有利的，因此编码这些产物的mRNA中包含的器官保护序列可以被选择以使其能够在这些细胞类型中表达，同时保护其他健康组织。在一些情况下，所述抗原组分可能优选具有器官保护序列，所述器官保护序列包括针对miRNA-122、miRNA-192和/或miRNA30a的靶序列，或同时针对这三者靶序列。
如IL-12等免疫调节剂具有产生脱靶效应的潜力，因此如上所述可以选择编码这些因子的mRNA以对肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏和/或皮肤提供最大保护(例如，针对miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a和/或miRNA-203a的靶序列，或同时针对这四者的靶序列)，而编码所述抗原组分的mRNA可以包含更少的miRNA结合位点序列，以增加表达的范围。
在一个实施方案中，根据本发明实施方案施用的免疫调节剂提高了基于蛋白的疫苗的免疫原性。
在一个实施方案中，根据本发明实施方案施用的免疫调节剂提高了基于病毒的疫苗的免疫原性。
治疗性疫苗(或主动免疫治疗)
除了常规的预防性(prevenntive)或预防性(prophylatic)疫苗接种之外，一个较新的领域是治疗性疫苗，其目的是针对体内已经存在的靶点激发免疫应答，例如针对持续感染或癌症。事实证明，这更具挑战性，因为在这种情况下，免疫应答往往被下调或以其他方式受到耐受机制的抑制，这些耐受机制起到保护疾病免受正常免疫应答影响的作用(Melief等人，Therapeutic cancer vaccines JCI2015)。
因此，在一个实施方案中，提供了如本文所述的编码肿瘤抗原的mRNA构建体，用于在肿瘤细胞中翻译。如前所述，这旨在诱导对癌症细胞的免疫应答。通过选择性使用根据本发明的器官保护序列而显而易见的是，在除靶肿瘤组织以外的细胞类型、组织和/或器官中，无论是相同或不同组织类型的肿瘤周围组织中的健康细胞，还是可能受施用作用或系统扩散影响的其他器官，表达都可以降低。
这种施用可以与治疗性疫苗结合使用，以改善产生的免疫应答，或才其自身可以是治疗性疫苗，如免疫系统对引入的增强剂作出反应，以便对肿瘤产生应答。
与治疗性病毒组合作为疫苗治疗癌症(治疗性癌症疫苗作为基于病毒的免疫疗法)
癌症治疗疫苗，也称为治疗性疫苗，是一种免疫疗法，可以增强免疫系统识别和破坏携带癌症特异性抗原(肿瘤相关抗原和/或新抗原)的细胞，而这些抗原在健康细胞上是不存在的。例如，结肠直肠新抗原包括MUC1，其通常在结肠直肠肿瘤细胞上发现。其他新抗原可能对患者肿瘤具有特异性。在后一种情况下，所述癌症治疗疫苗将是个性化的新抗原疫苗。癌症治疗疫苗用于已被诊断患有癌症的患者。这种疗法可以破坏癌症细胞，阻止肿瘤生长和扩散，或者在其他治疗结束后阻止癌症复发。癌症疫苗可能含有需要免疫应答的抗原以及增强免疫应答的佐剂。
常规癌症疫苗接种策略可包括选择合适的载体，将肿瘤相关抗原递送至免疫系统的主要抗原呈递细胞，例如，树突状细胞，其能够产生持久的抗肿瘤免疫应答。在某些实施方案中，腺病毒(Ad)载体可以用作递送新抗原基因的载体，因为其高效及插入突变风险低。腺病毒载体，如ChAdOx1或ChAdOx2载体，是一种很有前途的基因疫苗平台，因为它们能迅速引发针对转基因产物和Ad衣壳蛋白的强烈体液和细胞免疫应答。这已经在体外和体内通过被编码肿瘤新抗原的Ad载体感染的树突状细胞产生抗肿瘤T细胞应答来证明。因此，在一个实施方案中，如本文所述编码一个或多个免疫调节剂的mRNA构建体可用于引发和激活治疗性癌症疫苗产生的细胞应答。本文所述的合适的免疫调节剂可包括IL-12及其衍生物(例如单链形式)及其同系物。这样的mRNA构建体可包含一个或多个器官保护序列，其可被选择以保护例如肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏和皮肤中的一个或更多个(例如，使用针对miRNANA-1、miRNANA-122、miRNA-30a和/或miRNA-203a；let7b、miRNANA-126和/或miRNA-30a；或miRNA-122、miRNA-192和/或microNA-30a的靶序列)。
与前面讨论的在预防性(prevenntive)/预防性(prophylatic)疫苗中的潜在作用类似，GM-CSF也被确定为治疗性疫苗的潜在佐剂(Yan等人，Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.lmmunotherapy.2017；Zhao等人，Revisiting GM-CSF asan adjuvant fortherapeutic vaccines.CellMo/lmmunol.2018)。类似地，CD40配体(CD40L)作为基于病毒的疫苗的一部分被递送，以增强针对癌症的抗原特异性免疫，已被证明可提高免疫应答和诱导自然杀伤(NK)细胞活化和扩增(Medina-Echeverz等人，Synergistic cancer immunotherapy combines MVA-CD40L induced innate andadaptive immunity with tumortargeting antibodies.Nat Commun.2019)。因此，本文所述的mRNA构建体和组合物可用于诱导GM-CSF或CD40L的表达，以增强在癌症治疗疫苗使用之前、期间或之后的抗肿瘤免疫应答。
它还可以诱导针对患者特异性抗原的免疫应答，包括“新抗原”，这是癌症细胞因突变而产生的新抗原(Lichty等人，Going viral with cancer immunotherapy.NatRevCancer.2014)。因此，在另一个实施方案中，可以设计如本文所述的mRNA构建体和/或组合物，其包含编码患者的肿瘤相关抗原和/或新抗原的mRNA。在一些实施方案中，本发明的mRNA构建体可编码选自甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、前列腺特异性抗原(PSA)、人表皮生长因子受体2(HER2)、ras异常产物或p53中的一种或多种的抗原。
这些可以与编码免疫调节剂、免疫增强剂和其他效应化合物的任何其他mRNA结合，如上所述，在相同或不同的mRNA构建体中。这些方法旨在诱导肿瘤细胞产生效应增强的抗原蛋白，使免疫系统更好地识别这些肿瘤细胞。这种针对肿瘤细胞的细胞应答也可以通过进一步诱导癌症细胞表达免疫调节剂来增强。正如上述关于预防性疫苗的讨论，其中使用分离的mRNA构建体来同时提供肿瘤相关抗原(或新抗原)和免疫调节成分，在一些实施方案中，一个或另一个mRNA构建体可能完全缺乏miRNA结合位点序列。在其他情况下，每个mRNA构建体可包含一个或多个如本文所述的器官保护序列。对于每个mRNA构建体，这些器官保护序列可能相同，也可能不同。在器官保护序列不同的情况下，可以选择这些序列以支持这些产物不同模式的差异表达，和/或将对每个产物的保护扩展到不同组织或细胞类型。
因此，根据本发明的具体实施方案，提供了如本文所述的mRNA，其编码治疗增强因子，例如免疫刺激或免疫调节蛋白或多肽，用于与癌症免疫治疗(例如癌症疫苗)结合使用。所述癌症疫苗可包含治疗性病毒，例如修饰的人类或灵长类腺病毒，且所述免疫刺激或免疫调节蛋白或多肽可包含生物活性IL-12和/或GM-CSF。
在另一个实施方案中，提供如本文所述的编码NF-κB途径的调节剂和/或抑制剂的mRNA构建体和/或组合物，用于在肿瘤细胞中或通过肿瘤细胞表达，如本文所讨论的。
本发明的组合物和方法由以下实施例举例说明，但不限于以下实施例。
实施例
mRNA构建体
所有mRNA构建体均通过TrilinkBiotechnologies(加利福尼亚州圣地亚哥)从生成的DNA序列合成。这些mRNA类似于完全加工的、加帽的和聚腺苷化的mRNA，并可被核糖体翻译。
制剂
将所有mRNA构建体配制成可电离脂质样材料C12-200、磷脂DOPE、胆固醇和脂锚定聚乙二醇C14-PEG2000-DMPE混合物的多组分纳米粒子。C12-200:mRNA的这种特定组成和特定质量比(10:1)以及脂质样材料、磷脂、胆固醇和PEG的摩尔[％]组成被优化以在体内获得高转染效率(Kauffman K.J.，Nano Letter.2015,15,7300-7306)，并被称为DMPCTx_mRNA。为了制备所述制剂，将脂质组分溶解在乙醇中，并使用T型混合装置以1:3的比例与在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 3)中稀释的mRNA混合。在室温下，将制剂在20kDa膜透析盒中用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)透析4小时。必要时，使用Amicon Ultra离心过滤装置(100kDa截留)浓缩制剂。随后，将制剂转移到新管中，准备进行表征。根据制造商的说明，使用RibogreenRNA检测(lnvitrogen)测量mRNA包封和浓度的效果。使用动态光散射(ZetasizerNano ZS，Malvern)测量脂质纳米粒子的多分散指数(PDI)和尺寸(Zave)。
如图2所示，制剂用于在多孔板测定中转染细胞。将制剂适当稀释至约1.5pmol/孔DMPCTx_mRNA。通过mCherry荧光检测mRNA的表达对测定进行读数，用Hoechst 33342染色剂(NucBlue Liver ReadyProbes试剂，Life Technologies)染色细胞核并测定细胞密度。在转染后24小时使用荧光显微镜(来自BIOTEK的Cytation Systems或来自ThermofishScientific的EVOS FL Auto)对mCherry荧光进行定量。
这些制剂也用于在动物体内研究中转染细胞。
细胞培养和转染
所有细胞在37℃、5％CO2存在下生长。培养细胞(Hep3B、AML12、786-0、hREC、HCT-116)的体外单次转染如下：转染前一天，将细胞接种在96孔组织培养处理的微孔板中，使用推荐的完全培养基，且细胞密度列于表7。第二天，通过将mRNA-DMPcTx直接添加到孔中的培养基中，用1.5pmol DMPCTx_mRNA在200μl减血清培养基(Opti-MEM培养基，Gibco)中转染细胞，并根据需要将培养的细胞轻轻混合。孵育4小时后，移除Opti-MEM培养基并用完全培养基代替。
表7：用于DMPCTx_mRNA体外转染的培养基和细胞密度
Figure BDA0004113465670001271
为了转染人正常肝细胞(Sigma产品号MTOXH1000)，使用Sigma推荐的解冻、完全补充的铺板和培养基(参MED-HHTM、MED-HHPM、MED-HHPMSP、MED-HHCM、MED-HHCMSP)，将细胞以每毫升250000个细胞的细胞密度铺板于24孔胶原包被板中。在含有5％FBS的培养基中进行mRNADMPCTx的转染。孵育4小时后，除去mRNA混合物，并将完全补充的培养基加回孔中。
对于正常成人结肠上皮细胞(CellApplications公司，参考732Cn-05a)的转染，使用GI上皮细胞解冻液和GI上皮细胞限定培养基(CellApplications公司，参考716DC-50和716T-20)对细胞进行解冻、铺板和培养。用GI上皮细胞包被溶液(CellApplications公司，参考025-05)预处理96个孔微板孔，每个孔接种60000个细胞。第二天，通过将mRNA DMPCTx直接添加到孔中的培养基中，用1.5pmol DMPCTx_mRNA在200μL减少的血清培养基(Opti-MEM培养基，Gibco)中转染细胞，并根据需要将培养的细胞轻轻混合。培养4小时后，移除Opti-MEM培养基并用培养基代替。
对于正常人肺/支气管细胞(BAES-2B细胞，ATCC CRL-9609)的转染，细胞在添加了BEGM Bronchial Epithelial SingleQuots试剂盒的BEGM培养基(Lonza)中生长。将细胞以每毫升75000个细胞的密度接种在胶原I包被的微孔板中。第二天，通过将DMPCTx_mRNA直接添加到孔中的培养基中，将1.5pmol的DMPCTx_mRNA转染到200μL的减血清培养基(Opti-MEM培养基，Gibco)中，并根据需要将培养的细胞轻轻混合。培养4小时后，移除Opti-MEM培养基并用培养基代替。
荧光显微镜
转染24小时后，使用Hoechst 33342染料(来自lnvitrogen的NucBlueTMLiveReadyProbesTM试剂)对细胞核进行染色。使用荧光显微镜(Biotek的Cytation仪器或Thermofisher Scientific的
Figure BDA0004113465670001281
FL成像系统)在活细胞中检测细胞核染色和mCherry荧光。使用Texas Red和DAPI滤光片立方体和20倍物镜获取图像。
实施例1：未优化与优化的miRNA靶序列(不匹配与匹配)
为了研究本发明成功转染具有mRNA构建体的靶细胞的潜力，并随后驱动比未修饰的miRNA靶序列更好的蛋白差异表达，首先使用人类癌症细胞系和每个器官的正常原代细胞在体外模型中评估用miRNA结合位点修饰的DMPCTx mRNA平台。纯化的mCherry mRNA用于追踪培养的细胞中的转染和翻译效率。
例如，miRNA-122是一种大量存在的肝脏特异性miRNA，其在人类原发性肝癌(HCC)和HCC衍生细胞系如Hep3B中的表达显著降低。本实施例研究的目的是证明通过插入优化的miRNA-122靶序列(例如变体2)来修饰mRNA序列的3'-非翻译区(UTR)可能导致正常肝细胞中外源mRNA的更高的翻译抑制，但在测试的HCC细胞系中没有这种情况。为此，对mCherrymRNA构建体进行修饰，以在3'-UTR中包含至少一个未优化的miRNA-122靶序列(变体1)或至少一个优化的完全匹配靶序列(变体2)。将mRNA构建体转染小鼠AML12正常肝细胞，已知其表达高水平的miRNA-122。不含miRNA靶序列的mCherry mRNA构建体用作阳性对照。单次转染mCherry mRNA构建体24小时后，使用荧光显微镜(Thermofisher Scientific的EVOSFLAuto)检测到mCherry荧光。可使用替代的定量方法来验证所递送的构建体的表达，包括蛋白质印迹或蛋白质组分析技术，如质谱。
变体1[SEQ ID NO:4]：5'-AACGCCAUUAUCACACUAAAUA-3'(不匹配的miRNA-122靶序列)
变体2[SEQ ID NO:44]：5'-CAAACACCAUUGUCACACUCCA-3'(完美匹配的miRNA-122靶序列)
结果
如图9B所示，不含MOP的mCherrymRNA在AML12细胞中强表达。当单个不完全匹配的miRNA-122靶序列(变体1)包含在3'UTR中时，mCherry的表达仍然很明显(见图9C。使用变体2的完美匹配效果很明显，mCherry表达明显减少，如图9D右图。
实施例2：比较miRNA靶序列重复数的影响
为了研究本发明通过增加mRNA构建体中靶序列的数量来驱动更好差异表达的潜力，mCherrymRNA被修饰为在3'-UTR中包含一个、两个或四个优化的miRNA-122miRNA靶序列并在体外评估和比较了人类Hep3B癌症细胞系和相应的正常AML12原代细胞中其的翻译效率。不含miRNA靶序列的mCherry mRNA构建体用作阳性对照。如图1所示，miRNA-122靶序列使用特定核苷酸(如uuuaaa)连接。在单次转染mCherry mRNA构建体后24小时，通过荧光显微镜(Thermofisher Scientific的EVOS FLAuto)检测mCherry荧光。可使用替代的定量方法来验证递送的构建体的表达，包括蛋白质印迹或蛋白质组分析技术，例如质谱。
结果
多重结合位点序列的结果如图8所示。AML12正常肝细胞中mCherry表达的抑制存在一定的剂量依赖性(a)，结合位点序列的两次和四次重复显示出对mCherry的高水平抑制。然而，对Hep3B癌症细胞的影响不太明显(b)，其中mCherry的表达水平在miRNA结合位点的一到两次重复中基本保持一致，而四倍多重序列的表达仅略有减少。
实施例3：体外多器官保护方法构思的证明
为了研究本发明在多种不同受体细胞类型中显示特定ORF差异表达的潜力，mCherry mRNA被修饰为在3'UTR中包含三个或五个miRNA靶序列。在第一mRNA序列中，提供了miRNA-122、Let7b和miRNA-192的靶序列(mCherry-3MOP)，在第二mRNA序列中提供了miRNA-122、miRNA-124a、Let7b、miRNA-375和miRNA-192的靶序列(mCherry-5MOP)。还使用了不含miRNA靶序列的对照mCherrymRNA序列。
如上所述，制备的mRNA序列是纳米配制的。将制备的纳米粒子转染到对应于人正常肝细胞(Sigma产品号MTOXH1000)、小鼠正常肝细胞(来自ATCC的AML12)和人肝癌细胞(来自ATCC的Hep3B)的细胞系(图2)中。此外，用mCherry-3MOP mRNA和对照mCherry RNA转染对应于正常人肾细胞的细胞系(来自ATCC的hREC)。将细胞接种在24孔板中。每孔转染0.5μg的mRNA，并在转染后24小时用Cystation 5仪器(Biotek)进行成像。
图3显示了三种肝细胞类型中的mCherry信号，并证实了与转染了对照mCherrymRNA人类肝癌细胞(Hep3B)或正常细胞中的信号相比，转染了mCherry-3MOP或mCherry-5MOP mRNA的正常小鼠和人类肝细胞中的细胞信号显著减少。这表明由于miRNA靶序列的加入，正常细胞中mCherry翻译减少。图4显示了使用Biotek的Gen5成像软件对转染细胞中mCherry荧光的定量。已减去背景信号。值表示每个细胞荧光信号的平均值和标准偏差。与对照组相比，评估的mRNA的统计学显著差异显示为*P<0.05，**P<0.005。结果表明，当使用3MOP或5MOP miRNA靶序列时，正常肝细胞(人和小鼠)中的蛋白质表达减少约80％，而肿瘤细胞中的蛋白质减少较少。
图5A显示了转染的正常人肾细胞(hREC ATCC-PCS-400-012)中的mCherry信号。在用mCherry-3MOP处理的细胞中可见信号减少，表明mCherry翻译减少。这在图5B中使用Biotek的Gen5成像软件进行了量化，其同样显示在用mCherry-3MOP转染后，正常肾细胞中mCherry信号降低了约60％。在图5B中，已减去背景信号，值表示每个细胞荧光信号的平均值和标准偏差。与对照组相比，评估的mRNA的统计学显著差异显示为*P<0.05。
图6显示了使用3MOP序列的替代配置在肝细胞中的实验结果。在这种情况下，所述3MOP序列包括与miRNA122、miRNA192和miRNA30a完美匹配的miRNA结合位点。与其中未发现明显的表达的图6(f)的小鼠AML12肝细胞相比，图6(c)中可以清楚地看到Hep3B癌症细胞中的表达。
图7显示了3MOP序列的另一种替代配置的结果。在这种情况下，所述3MOP序列包括与Let7b、miRNA126和miRNA30a完美匹配的miRNA结合位点。同样，与其中没有可识别的表达的图7(f)的小鼠AML12肝细胞相比，图7(c)中可以清楚地看到Hep3B癌症细胞中的mCherry的表达。
图10示出了与图7的实验相同的3MOP序列(miRNAlet7b-miRNA126-miRNA30a)在肾脏中组织和器官特异性保护的效果。mCherry的表达在hREC人肾细胞中几乎完全被抑制(图10(f))，但在786-0肾细胞腺癌细胞中没有被抑制(图10(c))。在图11中，测试了替代3MOP序列(miRNA122-miRNA192-miRNA30a)。图10和图11测试的MOP序列均包含与miRNA30a的完美匹配结合序列，其对肾脏具有保护作用，然而，后者3MOP还包含一个完美匹配的miRNA-192结合位点，其提供了假定的双层肾脏保护(见上表2)。在图11中，mCherry的表达在hREC人肾细胞中不可见(图11(f))，但在786-0肾腺癌细胞中明显可见(图11(c))。
图13示出了与图11的实验相同的3MOP序列(miRNA122-miRNA192-miRNA30a)在结肠中组织和器官特异性保护的效果。在人结肠上皮细胞mCherry的表达几乎完全被抑制(图13(c))，但在HCT-116细胞中并非如此(图13(f))。在图14中，测试了替代3MOP序列(miRNAlet7b-miRNA126-miRNA30a)。图14中测试的MOP序列包含与Let7b完美匹配的结合序列，广泛保护结肠组织。在图14中，mCherry在结肠上皮细胞中的表达大幅减少(图14(c))，在HCT-116细胞中也大幅减少(图14(f))。
图15示出了使用包括miRNAlet7b、miRNA126和miRNA30a结合位点的MOP序列在肺中组织和器官特异性保护的效果。与上述其他测定类似，选择了一种支气管上皮细胞系，该细胞系与健康的非癌性人肺组织(BEAS-2B细胞系)最接近。虽然BEAS-2B细胞通过感染复制缺陷的SV40/腺病毒12杂交体而永生，但这是为了改进处理和克隆。这些细胞作为正常功能肺上皮的模型用于检测鳞状细胞的分化。在图15(c)中，与不存在MOP相比，存在MOP序列使得mCherry表达的抑制水平非常高。
图7(f)、图10(f)、图14(c)和图15(c)所示的结果表明，miRNAlet7b-miRNA126-miRNA30a MOP序列的包含可有效保护健康肝脏、肾脏、结肠和肺部免受相关ORF表达的影响。图6(f)、11(f)和13(c)的结果表明，包括miRNA122-miRNA 192-miRNA30a结合序列的替代MOP为健康的肝脏、肾脏和结肠组织提供有效保护。
该实施例表明，包括多种不同miRNA靶序列的器官保护序列也可用于驱动在源自多种不同器官的细胞中的差异表达，并可在多个组织中区分正常细胞和肿瘤细胞。
实施例4：用IL-12和GM-CSF mRNA转染人PBMC
IL-12和/或GM-CSF是免疫调节细胞因子，其可与抗肿瘤治疗联合使用，例如与治疗性病毒联合使用，或作为佐剂与疫苗组合物共同施用。在本实验中，具有或不具有MOP序列的DMPCTx hGM CSF(人GM-CSF)和hdclL-12(双链人IL-12p70)或hscIL-12(单链人IL-12p70)以一定的剂量范围在体外施用于人PBMC。hsceIL-12p70和hGMCSF的非编码mRNA也用作阴性对照(NC)。细胞内蛋白质的表达显示其与mRNA的施用剂量有关。
LNP免疫调节剂IL-12和GM-CSF的体外转染效率和毒性
从AIICells获得来自5个不同供体(18-55岁)的PBMC细胞，并在37℃，5％CO2中在AIM V培养基(Gibco)中悬浮培养。在圆底96孔板中每孔接种300000个PBMC细胞，并用DMPCTx配制的mRNA转染，所述mRNA编码IL-12单链或双链变体或GM-CSF，具有或不具有MOP序列(见下表8)。进行用于验证PBMC功能正常的阳性对照，含有300000个PBMC细胞的孔中，培养基加入LPS(ThermoFisher，00-4976)，终浓度为100ng/ml。阴性对照是平行进行的，不含PBMC细胞也无LNP转染(BG-C)，仅含150000个未转染的PBMC细胞(LC)的孔和有300000个未转染PBMC细胞的孔(HC)。
转染4小时后，加入人AB热灭活血清(Sigma)至终浓度为1％。转染6小时后，将每个孔的60μL上清液转移到新的96孔板中，通过离心去除细胞，并将上清液在-80℃下冷冻，以进行MSD测定。转染21小时后，将吐温-20以1.1％的最终浓度添加到HC孔中。转染24小时后，通过离心收集每个孔的所有上清液。60μL上清液在-80℃下冷冻用于MSD测定，剩余130μL在-80°F下冷冻用于LDH测定。
使用U-PLEX分析(Meso-Scale Discovery)并按照制造商的说明书进行人细胞因子IL-12p70和GM-CSF分析的MSD分析。使用graph Pad Prism将数据绘制成条形图。
使用Roche(4744926001)的细胞毒性检测试剂盒PLUS(LDH)并按照制造商的说明书进行LDH测定。
结果
图12显示了转染后6h从含MOP的构建体中检测到的人IL-12p70和GM-CSF的水平。所述MOP在mRNA中的存在使肝脏、皮肤、肌肉和肾脏组织中的脱靶表达最小化。LDH测定显示，编码IL-12单链或双链变体或GM-CSF的DMPCTx mRNA没有在PBMC中诱导显著高于阴性对照的细胞毒性。24小时后再次检查结果一致(数据未显示)。
表8IL-12MOP和GM-CSF MOP的ORF和3'UTR
Figure BDA0004113465670001331
/>
Figure BDA0004113465670001341
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Figure BDA0004113465670001351
/>
Figure BDA0004113465670001361
实施例5：具有MOP序列的表达荧光素酶mRNA的DMPCTx的体内生物分布
为了研究本发明的潜力，证明特定ORF在体内的差异表达，如实施例3中那样修饰萤火虫荧光素酶(Fluc)mRNA，以在mRNA构建体的3'UTR中包括三个miRNA靶序列的两种不同组合。第一mRNA MOP序列包括Let7b、miRNA-126和miRNA-30a的靶序列(组2)。第二mRNA MOP序列包括miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a的靶序列(组3)。所有MOP构建体都包含与相应miRNA完全匹配的靶序列。不含MOP序列的构建体的对照Fluc mRNA序列(组1)也使用了。空载组接受磷酸盐缓冲盐水。
制剂如上所述制备，并具有以下特征：
表9用于体内生物分布的递送制剂
Figure BDA0004113465670001371
动物。所有实验均在英国诺丁汉Crown Biosciences根据所有当地法规进行。所有小鼠均从Charles River获得。
非肿瘤生物分布研究。将7-9周龄的健康雌性balb/c小鼠通过推注尾静脉注射1mg/kg制剂(DMPCTx_mRNA)，所述制剂编码具有或不具有MOP序列的萤火虫荧光素酶(Fluc)。给药前(0小时)、给药后3.5小时和24小时拍摄全身图像，并使用Living Image Software(Caliper LS，美国)对荧光素酶信号量进行量化。在成像前15分钟，向小鼠注射(皮下)150mg/kg d-Luciferin,，然后在10分钟后麻醉并置于成像室中进行发光检测(腹侧和背侧视图)。在24小时的时间点，取下肝脏、肾脏、脾脏和肺，并进行离体成像。
肿瘤生物分布研究。将人肝癌细胞(Hep3B细胞)(2×106细胞)植入8-10周龄FoxChase SCID小鼠的左侧皮下。根据肿瘤负荷的卡尺测量，将小鼠分为研究组，选择肿瘤大小约为100mm3的小鼠。然后以1mg/kg的剂量在肿瘤内注射编码具有或不具有MOP序列的萤火虫荧光素酶(Fluc)的制剂(DMPCTx_mRNA)。给药前(0小时)、给药后3.5小时和24小时拍摄全身图像，并使用Living Image软件(Caliper LS，美国)对荧光素酶信号量进行量化。在成像前15分钟，向小鼠注射(皮下)150mg/kg d-Luciferin，然后在10分钟后麻醉并置于成像室中进行发光检测(腹侧和背侧视图)。在24小时的时间点，取下肿瘤、肝脏、肾脏、脾脏和肺，并进行离体成像。
结果
图16(a)显示，静脉施用3.5小时后，通过全身成像，在所有组中都可以看到高水平的荧光素酶表达，包括含有MOP的构建体(组2和组3)和不含MOP构建体的对照组(组1)。然而，使用两种含MOP的构建体的蛋白表达量减少了1-2个数量级。这一趋势在24小时后仍然存在，在24小时后，所有组中的总体蛋白表达略有减少。
MOP的存在在最小化肝脏、肺、脾脏和肾脏组织中的体内脱靶表达方面非常有效。在图16(b)中，器官的离体成像显示，与组1(不含MOP的对照)相比，组2和组3(含MOP的构建体)小鼠的肝脏(miRNA-122)、肺(let7b，miRNA-126，miR30a)、脾脏(Let7b，miRNA-126)和肾(miRNA-192，miRNA-30a)的荧光素酶表达降低，证实了两种含MOP构建体都从ORF的表达中提供了有价值的多器官保护。
尽管最小化健康组织中的脱靶效应很重要，但确保蛋白在靶组织(如肿瘤)中仍有表达也很重要。表10显示，当存在Hep3B肝肿瘤时，三组的蛋白质表达全部都保持在相同的数量级。此外，如在非荷瘤体内研究中所见，无论是否存在MOP，健康肝脏中的荧光素酶表达降低2-3个数量级。
表10离体成像中获得的BLI值(光子/秒)
Figure BDA0004113465670001381
图17显示，施用24小时后，通过离体成像，在所有组的肿瘤组织中都可以看到高水平的荧光素酶表达，包括含有MOP的构建体(组2和组3)和不含MOP构建体的对照组(组1)。图17(a)显示各组小鼠的肿瘤体积相似。图17(b)显示，施用24小时后，在健康肝组织(正常肝)中，使用不含MOP构建体的对照组(组1)中可见高荧光素酶表达，使用含有MOP的构建体(组2和组3)，其表达降低了2-3个数量级。在其他器官中几乎未见表达(数据未显示)。
实施例6：肌肉内(IM)施用含有MOP序列的荧光素酶表达mRNA后DMPCTx的体内生物分布
该实验与实施例5中采用的方法类似。然而，由于大多数疫苗组合物是通过肌肉内注射(IM)施用的，因此有必要证明生物分布使得IM施用后体内Fluc ORF的差异表达。如实施例5中那样对mRNA进行修饰，但这次在mRNA构建体的3'UTR中包括三种不同的miRNA靶序列组合。第一mRNA MOP序列包括Let7b、miRNA-126和miRNA-30a的靶序列(Luc-MOP1)。第二mRNA MOP序列包括miRNA-122、miRNA-192、miRNA-30a的靶序列(Luc-MOP2)。第三mRNA MOP序列包括miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a、miRNA-30a的靶序列(Luc-MOP3)。所有MOP构建体都包括与相应细胞miRNA完全匹配的靶序列。不含MOP序列的对照Fluc mRNA序列也被用于构建体(Luc)。还包括一个没有mRNA货载的对照组，其中小鼠接受磷酸盐盐水缓冲液(空载)。
制剂如上所述制备，并具有以下特征：
表11通过IM施用的用于体内生物分布的递送制剂
Figure BDA0004113465670001391
通过IM注射，对7-9周龄的健康雌性balb/c小鼠注射10μg编码具有或不具有MOP序列的萤火虫荧光素酶(Fluc)的制剂(DMPCTx_mRNA)。在成像前15分钟，向小鼠(皮下)注射150mg/kg d-Luciferin，然后在10分钟后麻醉并置于成像室中进行发光检测(腹侧和背侧视图)。在4小时的时间点，取下注射部位的肝脏、肾脏、脾脏、肌肉和皮肤，并进行离体成像。
结果
在图19中，器官的离体成像显示，所有组的肝脏(miRNA-122)中荧光素酶表达均降低。在脾脏(Let7b、miRNA-126)中，Luc-MOP1显示出最大的作用。在肾脏(miRNA-192、miRNA-30a)中，所有含有MOP的mRNA都显示出表达降低的趋势。在注射部位，Luc-MOP1减少了荧光素酶的产量，但其他MOP并非如此。结果证实，不同的MOP构建体从ORF的表达中提供了有价值的多器官保护，并可根据需要变化。
实施例7：静脉内(IV)施用含有MOP序列的表达荧光素酶mRNA后DMPCTx的体内生物分布
该实验与实施例5中采用的方法类似。为了评估多器官保护，我们静脉注射DMPCTx制剂，以确保器官中的高递送和信号。如实施例6中那样修饰mRNA。第一mRNAMOP序列包括Let7b、miRNA-126和miRNA-30a的靶序列(Luc-MOP1)。第二mRNAMOP序列包括miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a的靶序列(Luc-MOP2)。第三mRNAMOP序列包括miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a、miRNA-30a的靶序列(Luc-MOP3)。所有MOP构建体都包含与相应细胞miRNA完全匹配的靶序列。不含MOP序列的对照Fluc mRNA序列也被用于构建体(Luc)。还包括一个没有mRNA细胞货载的对照组，其中小鼠接受磷酸盐缓冲盐水(空载)。
制剂如上所述制备，并具有以下特征：
表12通过IV施用的用于体内生物分布的递送制剂
Figure BDA0004113465670001401
通过推注尾静脉注射，对7-9周龄的健康雌性balb/c小鼠注射1mg/kg编码具有或不具有MOP序列的萤火虫荧光素酶(Fluc)的制剂(DMPCTx_mRNA)。施用6小时后拍摄全身图像，并使用Living Image软件(Caliper LS，美国)量化荧光素酶信号量。在成像前15分钟，向小鼠注射(皮下)150mg/kg d-Luciferin，然后在10分钟后麻醉并置于成像室中进行发光检测(腹侧和背侧视图)。在6小时的时间点，取下肝脏、肾脏、脾脏、心脏、胰腺和肺，并进行离体成像。
结果
MOP的存在再次令人惊讶地有效地减少了肝脏、肺、脾脏、胰腺、心脏和肾脏组织的体内的脱靶表达。在图20中，器官的离体成像显示，与Luc(不含MOP对照)组相比，使用含MOP的构建体(Luc-MOP1,Luc-MOP2,Luc-MOP3)组小鼠肝脏(miRNA-126、miR30a)、脾脏(Let7b,miRNA-126)、胰腺(miRNA-30家族、Let7家族、miRNA-122)、心脏(miRNA-30家族、miRNA-126、Let7家族)和肾脏(miRNA-192、miRNA-30a)中的荧光素酶表达降低，证实了所有MOP构建体均能从ORF的表达中提供有价值的多器官保护。
实施例8：抗原特异性免疫应答的体内评估
为了研究根据本发明的组合物作为疫苗的能力并证明共同施用的细胞因子的辅助作用，在体内进行了研究以产生针对特定外源抗原的抗体应答，在本案中为卵清蛋白(OVA)，一种蛋清蛋白。
对于本实验，mRNA构建体被包封在纳米粒子组合物DMPCTx中，如前所述。所使用的组合物是包括编码卵清蛋白的mRNA(DMPCTx_OVA)的纳米粒子组合物，和包括编码含有MOP序列的小鼠单链IL-12蛋白的mRNA的纳米粒子组合物(DMPCTx_msclL-12-MOP)。所使用的MOP序列包括miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a、miRNA-30a的完美匹配的结合位点(参见SEQ IDNO:68)。
表13 IL-12的ORF和3'UTR
Figure BDA0004113465670001411
/>
Figure BDA0004113465670001421
制剂如上所述制备，并具有以下特征：
表14用于体内OVA免疫原性研究的递送制剂
Figure BDA0004113465670001422
/>
Figure BDA0004113465670001431
6-8周龄Balb/c雌性小鼠在研究第1天按体重随机分为4组。第0天，小鼠接受左大腿肌肉注射50μl：
3μg DMPCTx_OVA(组2，LNP-OVA)；
3μg DMPCTx_OVA和DMPCTx_msclL-12，剂量为5μg IL-12构建体(组3，LNP-OVA+IL12)；
10μg DMPCTx_OVA(组4，LNP-OVA)(
对照组1仅在研究第0天在接受左大腿肌肉注射50μl空白试剂磷酸盐缓冲盐水。
在研究第14天，通过终末心脏穿刺采集血液，离心分离血清(90秒，RT，10.000×g)，并冷冻等分试样。根据制造商的说明书(Chondrex)处理收集的血清以检测小鼠抗OVAIgG。
结果
图18显示了实验结果。在3μg mRNA的低剂量下，DMPCTx_OVA(卵清蛋白)仅诱导一只小鼠应答者的弱应答。通过将mRNA剂量增加三倍以上至10μg，可显著增加。然而，低剂量卵清蛋白与促炎细胞因子IL12作为佐剂的共同施用显著提高了应答者的数量。这表明，共同施用IL-12可增强体内低剂量抗原应答。
这些结果表明，可以针对给定靶点诱导IgG抗体应答。鉴于卵清蛋白不是病原体特异性抗原，这也证明了该结果是干预的结果，并且应适用于任何提供的外源性多肽抗原。结果更令人惊讶，因为IL-12的体内施用不是全身性的，并且受MOP序列控制，从而减少了促炎分子的脱靶表达。
实施例9：SARS-CoV-2刺突蛋白特异性免疫应答的体内评估
为了进一步研究根据本发明的组合物作为针对特定致病性靶点的疫苗的能力，即激发针对病毒抗原的体内免疫应答，小鼠被注射包括编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA的纳米粒子组合物，以及被注射包括编码免疫调节细胞因子IL-12的mRNA的纳米粒子组合物(如先前实施例8中所述)。测试小鼠对组合物的体液免疫应答。
对于本实验，mRNA构建体如前所述被包封在纳米粒子组合物中。所使用的组合物是包括编码如SEQ ID NO:63所示SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA作为抗原的纳米粒子组合物(DMPCTx_Spike-CoV)，以及包含编码如SEQ ID NO:68所示小鼠单链IL-12蛋白的mRNA(DMPcTx-msclL-12)作为佐剂的纳米粒子组合物。两者都包含位于3'UTR的MOPV(miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a、miRNA-30a)序列。
制剂如上所述制备，并具有以下特征：
表15用于体内免疫原性研究的递送制剂
Figure BDA0004113465670001441
Balb/c雌性小鼠在研究第0天按体重随机分为三组。在第0天和第14天，在小鼠左大腿肌肉注射50μl DMPCTx_Spike-CoV(第0天LNP-刺突剂量1μg，第14天增强的10μg-所谓的1/10剂量方案)；
或DMPCTx_Spike-CoV(第0天LNP-刺突剂量1μg，第14天增强的10μg-所谓的1/10剂量方案)和IL-12构建体DMPCTx_mscIL12(第0天和第14天1μg)。对照组在研究第0天和第14天接受在左大腿肌肉注射50μl空白试剂磷酸盐缓冲盐水。
在研究的第42天(初免42天后和增强28天后)，通过终末心脏穿刺从所有组收集血液，通过离心分离血清(90秒，RT，10.000×g)，并将等分试样冷冻并储存在-80℃。为了检测收集的血清中的抗刺突抗体，根据制造商的说明书使用小鼠抗-SARS-CoV-2IgG抗体ELISA试剂盒(AcroBiosystems，目录号RAS-T023)。
结果
图21显示，随着IL12的加入，lgG的产量明显增加以应答刺突蛋白。
这些结果表明，在体内中加入IL-12免疫调节细胞因子作为佐剂有利于产生对SARS-CoV-2刺突蛋白抗原的免疫应答。即使当在MOP序列的控制下以mRNA的形式施用抗原和佐剂时，这种应答也令人惊讶的保持良好，MOP序列减少了抗原和佐剂的全身/脱靶产生。结合实施例4中显示的体外数据(见图12(a))，该数据表明，在施用后的6小时，人PBMC中可产生IL-12，这清楚地进一步表明，在施用疫苗和佐剂后的相对短的时间，疫苗以及包含MOP序列的佐剂组合物可产生保护性免疫应答。
实施例10：用人IL-12体外转染人PBMC
为了进一步研究根据本发明的组合物作为疫苗佐剂的能力，我们用含有/不含有MOP的DMPCTx_hsclL-12转染人外周血单个核细胞(PBMC)，并测量IL-12介导的对干扰素γ的诱导。
从StemCell Technologies获得来自四个不同供体的PBMC细胞，并在37℃、大气5％CO2下在AIM V培养基(Gibco)中悬浮培养。在圆底96孔板中每孔接种300000个PBMC细胞，并用含有或不含MOP序列的DMPCTx_hsclL-12单体转染。第一mRNAMOP序列包括miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a、miRNA-30a(MOPV)的靶序列。第二mRNAMOP序列包括miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a(MOPC)的靶序列。所有MOP构建体都包括与相应细胞miRNA完美匹配的靶序列。使用了三个剂量的DMPCTx_hsclL-12(含或不含MOP)。阴性对照平行进行，PBMC未转染或PBMC转染人单链IL-12非编码mRNA(hll-12NC-无ATG起始密码子)。将板在37℃、5％CO2下孵育4小时。
制剂如上所述制备，并具有以下特征：
表16-IL-12体外转染人PBMC的递送制剂
Figure BDA0004113465670001451
转染4小时后，加入人AB热灭活血清(Valley Biomedical)至终浓度为5％。转染24小时后，将每个孔的100μL上清液转移到新的96孔板中，通过离心去除细胞，并将上清液在-80℃下冷冻，用于人IL-12 ELISA测定(lnvitrogen，目录号88-7126)。转染72小时后，将每个孔的100μL上清液转移到新的96孔板中，通过离心去除细胞，并将上清液在-80℃下冷冻，用于干扰素-γELISA测定(Biolegend目录号430116)。人IL-12p70和人干扰素γ的ELISA测定遵循制造商的说明书。使用GraphPad Prism将数据绘制成条形图。
结果
图22a显示了用DMPCTx_hsclL-12产物转染的人PBMC中人IL-12的剂量依赖性表达。图22b(分别显示了每个供体)显示了IL-12介导的对IFN-γ的诱导，IFN-γ是一种对先天免疫和适应性免疫至关重要的免疫刺激性细胞因子。尽管不同供体之间IL-12介导的IFN-γ表达的程度不同，但IL-12的存在与IFN-γ的表达之间存在明显的相关性。
实施例11：用人IL-12和SARS-CoV-2刺突蛋白体外转染人PBMC
为了进一步研究根据本发明的组合物激活先天性和适应性免疫应答(即诱导干扰素γ)的能力，使用包括编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA的纳米粒子组合物，以及包含编码免疫调节剂IL-12的mRNA的纳米粒子组合物转染外周血单个核细胞(PBMC)。
对于本实验，如上所述，mRNA构建体被包封在纳米粒子组合物中。所用的组合物是包括含有MOP序列的编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA(DMPCTx_SCoV-MOPV)的纳米粒子组合物，以及包括编码人单链IL-12蛋白的mRNA(DMPCTx_hsclL-12)的纳米粒子组合物，含有或不含有MOP序列(DMPCTx_hsclL-12-MOPV)。所使用的MOP序列包括miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a、miRNA-30a(MOPV)的靶序列。
制剂如上所述制备，并具有以下特征：
表17用IL-12和SARS-CoV-2刺突蛋白体外转染人PBMC的递送制剂
mRNA 浓度(mg/ml) 包封效率(％) Zave(nm) PDI
刺突-MOPV 0.384 95.3 63.4 0.125
hsclL-12 0.382 94.7 60.7 0.077
hsclL-12-MOPV 0.343 93.7 61.7 0.123
用DMPCTx_SCoV-MOP，以及含或不含DMPCTx_hsclL-12和DMPCTx_hsclL-12-MOPV转染5个健康供体PBMC。将所有PBMC接种在抗CD3包被板上，并用可溶性抗CD28单克隆抗体处理以诱导普通T细胞活化。转染后5天，收集上清液，通过ELISA进行IFN-γ定量。
在第0天，接种PMBC(300000个细胞)并添加纳米粒子组合物或无菌PBS。将板在37℃、5％CO2下孵育4小时。加入10μI人AB血清(hAB)，总体积为200μ1，hAB血清总浓度为5％。
第5天，按如下方式收获上清液。将板在室温下以300×g离心5分钟。将上清液转移到V底96孔板中，并在室温下以400×g离心15分钟。将上清转移到新鲜V底96孔板并在-80℃下储存。根据制造商的说明书，通过Meso-Scale Discovery(MSD目录号K151TTK-2)对IFN-γ表达进行读数。
结果
图23显示，在含有或不含MOP的表达人IL-12的mRNA存在的情况下，干扰素γ(IFN-γ)表达同样增加。免疫后IFN-γ的早期合成(在出现适应性免疫应答之前发生)是针对疫苗的高质量免疫应答的标志，因为其早期释放有助于树突状细胞成熟，从而使CD4+T细胞分化为TH1谱系。
尽管在此详细公开了本发明的特定实施方案，但这是通过示例的方式并且仅出于说明的目的而完成的。上述实施方案不旨在限制如下所附权利要求的范围。发明人预期，在不脱离权利要求书所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种替换、改变和修改。根据本发明实施方案的构建体和载体中包含的任何非人核酸和/或多肽序列都是从英国、美国和欧盟的来源获得的。据本发明人所知，在本发明的创造中没有使用将受制于获取和利益共享协议的遗传资源或相关的传统知识。

Claims (157)

1.一种组合物，所述组合物包括：
包括第一开放阅读框(ORF)的第一mRNA构建体，其中所述第一ORF编码抗原；
其中所述第一ORF可操作地连接到至少一个非翻译区(UTR)，其中所述UTR包括至少一个第一器官保护序列(OPS)，并且其中所述第一OPS包括至少两个微RNA(miRNA)靶序列，其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个被优化以与相应的miRNA序列杂交。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一mRNA构建体包括在体内递送组合物内或吸附在体内递送组合物上。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述抗原选自：病原微生物蛋白和肿瘤相关抗原，或含有其片段的表位。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述病原微生物蛋白选自：病毒蛋白、细菌蛋白、真菌蛋白、寄生虫蛋白和朊病毒。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，还包括第二mRNA构建体，所述第二mRNA构建体包括第二开放阅读框(ORF)，其中所述第二ORF编码促炎细胞因子。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述促炎细胞因子选自：IL-12、IL-2、IL-6、IL-8、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα和GM-CSF。
7.根据权利要求5或6所述的组合物，其中所述第二mRNA构建体包含在递送组合物内或吸附在递送组合物上。
8.跟权利要求5至7中任一项所述的组合物，其中所述第二ORF编码IL-12蛋白或其亚基、衍生物、片段、激动剂或同系物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述第二ORF包括与SEQ ID NO:59至少90％相同的序列。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物，其中所述第二ORF与第二非翻译区(UTR)可操作地连接，其中，所述UTR包括第二器官保护序列(OPS)，并且其中所述第二OPS包括至少两个微RNA(miRNA)靶序列。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述至少两个miRNA靶序列被优化以与相应的miRNA序列杂交。
12.根据权利要求10或11所述的组合物，其中所述第一OPS包括至少一个与所述第二OPS不同的miRNA靶序列。
13.根据权利要求10或11所述的组合物，其中所述第一OPS和所述第二OPS包括相同的miRNA靶序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括递送组合物，所述递送组合物包括递送载体，所述递送载体选自：颗粒，例如聚合物颗粒；脂质体；脂质颗粒和病毒载体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括至少三个、至少四个或至少五个miRNA靶序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括至少三个彼此不同的miRNA靶序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括miRNA序列，所述miRNA序列被选择来保护一个多个器官或组织，所述一个或多个器官或组织选自肌肉、肝脏、脑、乳腺、内皮、胰腺、结肠、肾脏、肺、脾脏和皮肤、心脏、胃肠器官、生殖器官和食道。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自与miRNA-122、miRNA-125、miRNA-199、miRNA-124a、miRNA-126、miRNA-98、Let7miRNA家族、miRNA-375、miRNA-141、miRNA-142、miRNA-148a/b、miRNA-143、miRNA-145、miRNA-194、miRNA-200c、miRNA-203a、miRNA-205、miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-206、miRNA-34a、miRNA-192、miRNA-194、miRNA-204、miRNA-215、miRNA-30家族、miRNA-877、miRNA-4300、miRNA-4720和/或miRNA-6761结合的一条或多条序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括miRNA序列，所述miRNA序列被选择来保护一个或多个选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏、皮肤、心脏、胃肠器官、生殖器官和食道的器官。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a、miRNA-203a、let7b、miRNA-126和/或miRNA-192结合的序列。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括选自SEQ IDNO:44-57的一条或多条序列。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA133a、miRNA206、miRNA-122、miRNA203a、miRNA205、miRNA200c、
miRNA30a和/或let7a/b结合的序列。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和/或miR-203a结合的序列。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述第一OPS包括能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a和miRNA-203a结合的miRNA靶序列。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括能够与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
26.根据要求1-25中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括能够与let7b、miRNA-126和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括能够与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括能够与miRNA-192、miRNA-30a和miRNA-124结合的miRNA靶序列，以及能够与miRNA122结合的两个miRNA靶基因序列。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述抗原包括病毒蛋白或含有其片段的表位。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述抗原包含冠状病毒刺突蛋白。
31.根据权利要求29所述的组合物，其中所述抗原包含冠状病毒刺突蛋白变体。
32.根据权利要求30或31所述的组合物，其中所述冠状病毒刺突蛋白是SARS-CoV-2刺突蛋白。
33.根据权利要求29所述的组合物，其中所述抗原包括流感蛋白或其变体，或含有其片段的表位。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述流感蛋白选自血凝素、神经氨酸酶、基质-2和/或核蛋白。
35.根据权利要求33所述的组合物，其中所述流感蛋白选自甲型流感、乙型流感、或甲型流感的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16亚型。
36.根据权利要求29所述的组合物，其中所述抗原包括呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白或其变体或含有其片段的表位。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述呼吸道合胞病毒的蛋白是F糖蛋白或G糖蛋白。
38.根据权利要求29所述的组合物，其中所述抗原包括人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白或含有其片段的表位。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述HIV蛋白是糖蛋白120中和表位或糖蛋白145。
40.根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述抗原包括来自结核分枝杆菌的蛋白或含有其片段的表位。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述来自结核分枝杆菌的蛋白选自ESAT-6、Ag85B、TB10.4、Rv2626和/或RpfD-B。
42.根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述抗原是包括结肠直肠癌抗原的肿瘤相关抗原。
43.根据权利要求1至28中任一项的组合物，其中所述抗原是肿瘤相关抗原MUC1。
44.根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤相关抗原新抗原。
45.根据权利要求1至4或14至44中任一项所述的组合物，其中所述第一mRNA构建体还包括第二开放阅读框(ORF)，其中所述第二ORF编码促炎细胞因子，选自：IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF。
46.根据权利要求1至44中任一项所述的组合物，其中所述第一mRNA构建体还包括另一开放阅读框(ORF)，其中所述另一ORF编码与所述第一ORF编码的抗原不同的抗原。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中由所述另一ORF编码的抗原选自：细菌蛋白、病毒蛋白或肿瘤相关抗原，或含有其片段的表位。
48.根据权利要求10至13中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括至少三个、至少四个或至少五个miRNA靶序列。
49.根据权利要求10至13或48中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括至少三个彼此完全不同的miRNA靶序列。
50.根据权利要求10至13或48至49中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括miRNA序列，所述miRNA序列被选择以保护一个或多个器官或组织，所述器官或组织选自肌肉、肝脏、脑、乳腺、内皮、胰腺、结肠、肾脏、肺、脾脏和皮肤。
51.根据权利要求10至13或48至50中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-122、miRNA-125、miRNA-199、miRNA-124a、miRNA-126、miRNA-98、Let7miRNA家族、miRNA-375、miRNA-141、miRNA-142、miRNA-148a/b、miRNA-143、miRNA-145、miRNA-194、miRNA-200c、miRNA-203a、miRNA-205、miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-206、miRNA-34a、miRNA-192、miRNA-194、miRNA-204、miRNA-215、miRNA-30家族、miRNA-877、miRNA-4300、miRNA-4720和miRNA-6761结合的一条或多条序列。
52.根据权利要求10至13或48至51中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括miRNA序列，所述miRNA序列被选择以保护一个或多个选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏、皮肤、心脏、胃肠器官、生殖器官和食道的器官。
53.根据权利要求10至13或48至52中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括选自SEQ ID NO:44-57的一条或多条的序列。
54.根据权利要求10至13或48至53中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a、miRNA-203a、let7b、miRNA-126和/或miRNA-192结合的序列。
55.根据权利要求10至13或48至54中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA133a、miRNA206、miRNA-122、miRNA203a、miRNA205、miRNA200c、miRNA30a和/或let7a/b结合的序列。
56.根据权利要求10至13或48至55中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和/或miR-203a结合的序列。
57.根据权利要求10至13或48至56中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a和miRNA-203a结合的miRNA靶序列。
58.根据权利要求10至13或48至57中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括能够与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
59.根据权利要求10至13或48至58中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括能够与let7b、miRNA-126和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
60.根据权利要求10至13或48至59中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括能够与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
61.根据权利要求10至13或48至60中任一项所述的组合物，其中所述第二OPS包括能够与miRNA-192、miRNA-30a和miRNA-124结合的miRNA靶序列，以及能够与miRNA-122结合的两个miRNA靶基因序列。
62.根据权利要求10至13或48至61中任一项所述的组合物，其中所述第一OPS包括能够与miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和/或miR-203a结合的miRNA靶序列；第二OPS包括能够与miRNA-122、miRNA-126、miRNA-192和/或miRNA30a结合的miRNA靶序列。
63.根据权利要求1至62中任一项所述的组合物，还包括至少第三mRNA构建体，所述第三RNA构建体包括至少第三开放阅读框(ORF)，其中所述第三ORF编码与所述第一ORF编码的抗原不同的抗原，所述抗原选自：细菌蛋白、病毒蛋白或肿瘤相关抗原，或含有其片段的表位。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述第三ORF与至少第三非翻译区(UTR)可操作地连接，其中所述UTR包括至少第三器官保护序列(OPS)，其中所述第三OPS保护多个器官，并且其中所述第三OPS包括至少两个微RNA(miRNA)靶序列，并且其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个被优化以与相应的miRNA序列杂交。
65.根据权利要求63或64所述的组合物，其中所述第一ORF编码冠状病毒刺突蛋白或含有其片段的表位，所述第三ORF编码病毒蛋白或其含有其片段的表位，所述含有其片段的表位包括流感蛋白或其变体的全部或一部分。
66.根据权利要求1至65中任一项所述的组合物，其中所述组合物适合于静脉内、皮下、肌肉内、鼻内、动脉内和/或通过吸入施用。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的组合物，用于预防或治疗致病性疾病的方法。
68.根据权利要求67所述用途的组合物，其中所述方法包括将所述组合物施用于需要的受试者。
69.根据权利要求67或68所述用途的组合物，其中所述致病性疾病由冠状病毒引起。
70.根据权利要求69所述用途的组合物，其中所述致病性疾病由SARS-CoV-2病毒引起。
71.一种增加Th1免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用根据权利要求8或9中任一项所述的组合物。
72.一种组合物，所述组合物包括：
至少第一mRNA构建体，所述第一mRNA构建体包括至少第一开放阅读框(ORF)，其中所述第一ORF编码抗原，选自：细菌蛋白和/或病毒蛋白；和
包括至少第二mRNA构建体的第二构建体，所述第二mRNA构建体包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述ORF编码促炎细胞因子，选自：IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF，并且其中所述第二ORF与至少一个非翻译区(UTR)可操作地连接，其中所述UTR包括保护多个器官的至少一个OPS，并且其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列中的每一个被优化以与相应的miRNA序列杂交；和
体内递送组合物；
其中所述第一和第二构建体包含在所述递送组合物内或吸附在所述递送组合物上。
73.根据权利要求72所述的组合物，其中所述ORF编码IL-12蛋白或其衍生物、激动剂或同系物。
74.根据权利要求72或73所述的组合物，其中所述递送组合物包括载体，选自：颗粒，例如聚合物颗粒；脂质体；脂质颗粒和病毒载体。
75.根据权利要求72至74中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括miRNA序列，所述miRNA序列被选择以保护一个或多个选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏和皮肤的器官。
76.根据权利要求72至75中任一项所述的组合物，其中所述OPS包含选自SEQ IDNO:44-57的一条或多条序列。
77.根据权利要求72至76中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a、miRNA-203a、let7b、miRNA-126和/或miRNA-192结合的序列。
78.根据权利要求72至77中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-206、miRNA-122、miRNA-203a、miRNA-205、miRNA-200c、miRNA30a和/或let7a/b结合的序列。
79.根据权利要求72至78中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和/或miR-203a结合的序列。
80.根据权利要求72至79中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a和miRNA-203a结合的miRNA靶序列。
81.根据权利要求72至80中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括能够与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
82.根据权利要求72至81中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括能够与let7b、miRNA-126和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
83.根据权利要求72至82中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括能够与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
84.根据权利要求72至83中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括能够与miRNA-192、miRNA-30a和miRNA-124结合的miRNA靶序列，以及能够与miRNA-122结合的两个miRNA靶基因序列。
85.根据权利要求72至84中任一项所述的组合物，其中所述抗原包括病毒蛋白或含有其片段的表位。
86.根据权利要求85所述的组合物，其中所述抗原包括冠状病毒刺突蛋白。
87.根据权利要求85的组合物，其中所述抗原包括冠状病毒刺突蛋白变体。
88.根据权利要求86或87所述的组合物，其中所述冠状病毒刺突蛋白是SARS-CoV-2刺突蛋白。
89.根据权利要求85所述的组合物，其中所述抗原包括流感蛋白或其变体，或含有其片段的表位。
90.根据权利要求89所述的组合物，其中所述流感蛋白选自血凝素、神经氨酸酶、基质-2和/或核蛋白。
91.根据权利要求89所述的组合物，其中所述流感蛋白选自甲型流感、乙型流感或甲型流感的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16亚型。
92.根据权利要求85所述的组合物，其中所述抗原包括呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白或其变体或含有其片段的表位。
93.根据权利要求92所述的组合物，其中所述呼吸道合胞病毒的蛋白是F糖蛋白或G糖蛋白。
94.根据权利要求85所述的组合物，其中所述抗原包括人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白或含有其片段的表位。
95.根据权利要求94所述的组合物，其中所述HIV蛋白是糖蛋白120中和表位或糖蛋白145。
96.根据权利要求72至84中任一项所述的组合物，其中所述抗原包括来自结核分枝杆菌的蛋白或含有其片段的表位。
97.根据权利要求96所述的组合物，其中所述来自结核分枝杆菌的蛋白选自ESAT-6、Ag85B、TB10.4、Rv2626和/或RpfD-B。
98.根据权利要求72至96中任一项所述的组合物，用于预防致病性疾病的方法。
99.一种增加Th1免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用根据权利要求73所述的组合物。
100.一种组合物，所述组合物包括：
至少一个包含至少一个开放阅读框(ORF)的mRNA构建体，其中所述至少一个ORF编码促炎细胞因子，选自；IL-12、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF，并且其中所述ORF与至少一个非翻译区(UTR)可操作地连接，其中所述UTR包括保护多个器官的至少一个OPS，并且其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列中的每一个都被优化以与相应的miRNA序列杂交；
和
体内递送组合物；
其中所述mRNA构建体包含在所述递送组合物内或吸附在所述递送组合物上。
101.根据权利要求100所述的组合物，其中所述ORF编码IL-12蛋白或其衍生物、激动剂或同系物。
102.根据权利要求100或101所述的组合物，其中所述递送组合物包括递送载体，选自：颗粒，例如聚合物颗粒；脂质体；脂质颗粒和病毒载体。
103.根据权利要求100至102中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括miRNA序列，所述miRNA序列被选择以保护一个或多个选自肌肉、肝脏、肾脏、肺、脾脏和皮肤的器官。
104.根据权利要求100至104中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括选自SEQ IDNO:44-57的一条或多条序列。
105.根据权利要求100至104中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a、miRNA-203a、let7b、miRNA-126和/或miRNA-192结合的序列。
106.根据权利要求100至105中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA133a、miRNA206、miRNA-122、miRNA203a、miRNA205、miRNA200c，miRNA30a和/或let7a/b结合的序列。
107.根据权利要求100至106中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，所述至少两个miRNA靶序列选自能够与miRNA-1、miRNA-122、miR-30a和/或miR-203a结合的序列。
108.根据权利要求107所述的组合物，其中所述OPS包括能够与miRNA-1、miRNA-122、miRNA-30a和miRNA-203a结合的miRNA靶序列。
109.根据权利要求100至108中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括能够与miRNA-122、miRNA-1、miRNA-203a和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
110.根据权利要求100至109中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括能够与let7b、miRNA-126和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
111.根据权利要求100至110中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括能够与miRNA-122、miRNA-192和miRNA-30a结合的miRNA靶序列。
112.根据权利要求100至111中任一项所述的组合物，其中所述OPS包括能够与miRNA-192、miRNA-30a和miRNA-124结合的miRNA靶序列，以及能够与miRNA-122结合的两个miRNA靶序列。
113.根据权利要求100至112中任一项所述的组合物，用于预防致病性疾病的方法，所述方法包括：
将所述组合物施用于有需要的受试者；以及
向受试者共施用疫苗组合物。
114.一种增加Th1免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用根据权利要求101所述的组合物。
115.一种组合物，包括权利要求100至112中任一项所述的组合物和疫苗，所述疫苗选自类毒素疫苗、重组疫苗、结合疫苗、基于RNA的疫苗、基于DNA的疫苗、活减毒疫苗、灭活疫苗、基于重组载体的疫苗及其组合。
116.一种治疗或预防一种或多种致病性疾病或改善免疫应答的方法，所述方法包括
向有需要的受试者施用包括至少第一mRNA构建体的组合物，所述第一mRNA构建体包括至少第一开放阅读框(ORF)，其中所述第一ORF编码选自细菌蛋白或病毒蛋白或包含其片段的表位的抗原；其中所述第一ORF与至少一个非翻译区(UTR)可操作地连接，其中所述UTR包含至少第一器官保护序列(OPS)，其中所述OPS保护多个器官，并且其中所述第一OPS包括至少两个微RNA(miRNA)靶序列，并且其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个被优化以与相应的miRNA序列杂交；和
体内递送组合物；
其中所述mRNA构建体包含在所述递送组合物内或吸附在所述递送组合物上。
117.根据权利要求116所述的方法，还包括向所述受试者共施用包括至少一个mRNA构建体的组合物，所述mRNA构建体包括至少第二开放阅读框(ORF)，其中所述第二ORF编码促炎细胞因子，选自：IL-12、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF。
118.根据权利要求116或117所述的方法，其中所述第二ORF编码IL-12蛋白或其衍生物、激动剂或同系物。
119.根据权利要求116至118中任一项所述的方法，其中所述第二ORF包括与SEQ IDNO:59至少90％相同的序列。
120.根据权利要求116至119中任一项所述的方法，其中所述第二ORF与至少一个非翻译区(UTR)可操作地连接，其中所述UTR包含保护多个器官的至少第二OPS，并且其中第二OPS包括至少两个miRNA靶序列，并且其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个被优化以与相应的miRNA序列杂交。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述第一OPS与所述第二OPS包括不同的miRNA靶序列组。
122.根据权利要求120所述的方法，其中所述第一OPS和所述第二OPS包括相同的miRNA靶序列。
123.根据权利要求116至122中任一项所述的方法，其中所述递送组合物包括递送载体，选择：颗粒，例如聚合物颗粒；脂质体；脂质颗粒和病毒载体。
124.根据权利要求116至123中任一项所述的方法，其中所述致病性疾病由冠状病毒引起。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述致病性疾病由SARS-CoV-2病毒引起。
126.根据权利要求124或125所述的方法，其中所述抗原包括病毒蛋白或含有其片段的表位，所述含有其片段的表位包含冠状病毒刺突蛋白的全部或部分。
127.根据权利要求124或125所述的方法，其中所述抗原包括病毒蛋白或其或含有其片段的表位，所述含有其片段的表位包含变异冠状病毒刺突蛋白的全部或部分。
128.根据权利要求126或127所述的方法，其中所述冠状病毒刺突蛋白是SARS-CoV-2刺突蛋白。
129.根据权利要求116至128中任一项所述的方法，其中所述第一mRNA构建体还包括另一开放阅读框(ORF)，其中所述另一ORF编码与所述第一ORF编码的抗原不同的抗原。
130.根据权利要求116至128中任一项所述的方法，还包括向所述受试者共同施用包括至少第三开放阅读框(ORF)的第三mRNA构建体，其中所述第三ORF编码与所述第一ORF编码的抗原不同的抗原。
131.一种预防一种或多种致病性疾病或改善免疫应答的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用疫苗组合物；和
向所述受试者共同施用包含至少一种mRNA构建体的佐剂组合物，所述mRNA构建体包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述至少一个ORF编码促炎细胞因子，选自：IL-12、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF，以及
其中所述ORF与至少一个非翻译区(UTR)可操作地连接，其中所述UTR包括保护多个器官的至少一个OPS，并且其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，并且其中所述至少两个miRNA靶序列的每一个都被优化以与相应的miRNA序列杂交；以及体内递送组合物；其中所述mRNA构建体包含在所述递送组合物内或吸附在所述递送组合物上。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述疫苗组合物选自：类毒素疫苗、重组疫苗、结合疫苗、基于RNA的疫苗、基于DNA的疫苗、活减毒疫苗、灭活疫苗、基于重组载体的疫苗及其组合。
133.根据权利要求131或132所述的方法，其中所述疫苗组合物包括至少第一mRNA构建体，所述至少第一mRNA构建体包括至少第一开放阅读框(ORF)，其中所述第一ORF编码抗原，选自：细菌蛋白或其部分、病毒蛋白或其部分、新抗原或其部分；体内递送组合物，其中所述mRNA构建体包含在所述递送组合物内或吸附在所述递送组合物上。
134.根据权利要求117至133中任一项所述的方法，其中共同施用包括同时或连续地以任一顺序施用所述疫苗组合物和所述佐剂组合物。
135.根据权利要求116至134中任一项所述的方法，其中所述疫苗组合物和/或所述佐剂组合物通过静脉内、皮下、肌肉内、鼻内、动脉内和/或通过吸入施用。
136.根据权利要求116至135中任一项所述的方法，其中所述致病性疾病由细胞内病原体引起。
137.根据权利要求116至136中任一项所述的方法，其中所述致病性疾病是潜在性感染。
138.根据权利要求116至136中任一项所述的方法，其中所述致病性疾病是活动性感染。
139.根据权利要求116至135中任一项所述的方法，其中所述致病性疾病由流感病毒引起。
140.根据权利要求116至135中任一项所述的方法，其中所述致病性疾病由冠状病毒引起。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述致病性疾病由SARS-CoV-2病毒引起。
142.根据权利要求116至135中任一项所述的方法，其中所述致病性疾病由呼吸道合胞病毒(RSV)引起。
143.根据权利要求116至135中任一项所述的方法，其中所述致病性疾病由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起。
144.根据权利要求116至135中任一项所述的方法，其中所述致病性疾病由水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起。
145.根据权利要求116至135中任一项所述的方法，其中所述致病性疾病由结核分枝杆菌引起。
146.一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括
向有需要的受试者施用包括至少第一mRNA构建体的第一组合物，所述第一mRNA构建体包括至少第一开放阅读框(ORF)，其中所述第一ORF编码肿瘤相关抗原或含其片段的表位；其中所述第一ORF与至少一个非翻译区(UTR)可操作地连接，其中所述UTR包括至少一个第一器官保护序列(OPS)，其中所述OPS保护多个器官，并且其中所述第一OPS包括至少两个微RNA(miRNA)靶序列，并且其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个被优化以与相应的miRNA序列杂交；和
体内递送组合物；
其中所述mRNA构建体包含在所述递送组合物内或吸附在所述递送组合物上。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原包括结肠直肠癌抗原。
148.根据权利要求146所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是MUC1。
149.根据权利要求146所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是新抗原。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述新抗原是所述受试者个性化的。
151.根据权利要求146至150中任一项所述的方法，还包括向所述受试者共同施用包括至少一种mRNA构建体的第二组合物，所述mRNA构建体包括至少第二开放阅读框(ORF)，其中所述第二ORF编码促炎细胞因子，选自：IL-12、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF。
152.根据权利要求151所述的方法，其中共同施用包括以任一顺序同时或连续地施用所述第一组合物和所述第二组合物。
153.一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者施用癌症治疗性疫苗组合物；和
向受试者共同施用包括至少一种mRNA构建体的组合物，所述mRNA构建体包括至少一个开放阅读框(ORF)，其中所述至少一个ORF编码促炎细胞因子，选自；IL-12、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF，并且其中所述ORF与至少一个非翻译区(UTR)可操作地连接，其中所述UTR包括保护多个器官的至少一个OPS，并且其中所述OPS包括至少两个miRNA靶序列，并且其中所述至少两个miRNA靶序列中的每一个都被优化以与相应的miRNA序列杂交；以及体内递送组合物；其中所述mRNA构建体包含在所述递送组合物内或吸附在所述递送组合物上。
154.根据权利要求153所述的方法，其中所述癌症治疗性疫苗组合物向受试者递送肿瘤相关抗原。
155.根据权利要求154所述的方法，其中使用病毒载体将所述肿瘤相关抗原递送至所述受试者。
156.根据权利要求155所述的方法，其中所述载体是腺病毒载体。
157.根据权利要求156所述的方法，其中所述腺病毒载体是ChAdOx1或ChAdOx2。
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