KR20230083266A - 개선된 백신접종을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
제1 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 제1 mRNA 작제물을 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 제1 ORF는 항원을 암호화하며; 상기 제1 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 상기 UTR은 적어도 제1 기관 보호 서열(OPS)을 포함하고, 상기 제1 OPS는 적어도 2 개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하고, 상기 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화된다. 또한 ORF 및 OPS를 포함하는 mRNA 작제물을 포함하며, 상기 ORF가 전염증성 사이토카인을 암호화하는 것인 추가의 조성물, 및 병원성 질환과 같은 질환의 치료 및 예방을 위해 이들 조성물 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2020년 7월 31일 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/059,458; 및 2021년 2월 22일 출원된 PCT 출원 일련 번호 PCT/US21/19028에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 발명은 메신저 리보핵산(mRNA) 전달 기술, 및 다양한 치료적, 진단적 및 예방적 적응증에서 이러한 mRNA 전달 기술을 사용하는 방법에 관한 것이다.
특정 표적 조직 또는 기관에서 폴리펩티드와 같은 명시된 유전자 산물의 발현을 유도하는 능력은 종종 바람직하다. 많은 상황에서, 표적 조직 또는 기관은 하나 초과 유형의 세포를 포함할 것이며, 이러한 경우 또한 유전자 산물을 상이한 세포 유형에서 상이한 정도로 발현하는 것, 즉, 표적 조직에서 상이한 세포 유형 사이에 유전자 산물의 차등 발현을 제공하는 것이 종종 바람직하다. 예를 들어, 유전자 요법에서 돌연변이 및/또는 기능이 없는 유전자는 온전한 카피에 의해 표적 세포로 대체될 수 있지만, 또한 인근의 세포, 조직 및 기관의 표적외 단백질 생산을 최소화하는 데 유용하다. 마찬가지로, COVID-19의 스파이크 단백질과 같은 백신 항원에 대한 유전자 산물은 바람직하게는 최대 반응을 보장하기 위해 면역계의 수지상 세포 내 또는 주위에서 발현된다.
유전자 요법은 종종 코딩 폴리뉴클레오티드를 표적 세포에 도입하기 위해 바이러스 벡터에 의존하지만, 바이러스를 사용하지 않고 세포에 폴리뉴클레오티드를 전달하는 다른 기술이 존재한다. 바이러스의 장점은 상대적으로 높은 가능한 형질감염률, 뿐만 아니라 바이러스가 표적 세포에 들어감으로써 결합 단백질의 제어에 의해 바이러스를 특정 세포 유형에 표적하는 능력을 포함한다. 대조적으로, 코딩 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 비바이러스 방법은 낮은 형질감염률, 뿐만 아니라 특정 기관 및 세포 유형에 대한 발현을 표적화하기 위한 제한된 옵션을 갖는다는 문제를 가질 수 있다. 그러나, 바이러스 개입의 본질은 독성 및 염증의 위험을 가지고 있을 뿐만 아니라, 또한 도입된 인자의 발현 정도 및 지속기간에 대한 제어가 제한된다.
생물학적 접근법에 기반한 종양 요법은 예를 들어 그 중에서도 직접 세포 용해, 세포독성 면역 효과기 메커니즘 및 혈관 붕괴를 통해 암을 보다 정확하게 표적하고 파괴하는 수많은 다양한 메커니즘을 이용할 수 있기 때문화 전통적인 화학요법에 비해 장점을 갖는다. 결과적으로, 이러한 접근법의 가능성에 대한 임상 연구의 수가 유의하게 증가하였다. 그러나 다양한 범위의 치료적 활동으로 인해, 전임상 및 임상 연구가 복잡하고, 다중 매개변수가 이들의 치료적 가능성에 영향을 미칠 수 있으므로, 치료 실패의 원인 또는 치료적 활동을 향상시킬 수 있는 방법론을 정의하는 것이 어려울 수 있다. 표적 활동, 종양 특이성을 유지하고 부작용을 감소시키는 것이 또한 이러한 실험적이고 강력한 요법에 대한 주요 도전과제이다.
바이러스 기반 요법은 질환 치료의 많은 측면을 다루는 유망한 접근법으로 부상하였다. 비활성화 또는 약독화 바이러스에 기반한 암 백신은 치료가 어려운 암에 대한 상당한 가능성을 제공한다. 그러나, 치료적 바이러스의 효과는 종종 신체 자체의 면역 반응에 의해 방해받아 전신 투여를 피하기 위해 적용을 제한한다. 따라서, 현재 이용가능한 치료적 바이러스 접근법의 범위를 개선하고 향상시킬 수 있는 새로운 조성물 및 방법을 제공하는 것이 유리할 수 있다.
백신은 종종 감염성 질환에 대한 매우 효과적인 예방 개입이다. 그러나, 일부 적용 및 일부 상황에서, 백신 효능은 차선일 수 있다. 예를 들어, 전달된 항원에 대한 효과적인 반응의 발달은 대상체의 면역계 역량에 따라 달라진다. 모든 대상체에서, 면역은 시간이 지남에 따라 상실될 수 있고/있거나, 특정 항원에 대한 면역 반응은 불충분할 수 있다.
유사하게, 특정 유형 또는 부류의 병원체는 항면역 적응, 급격한 돌연변이, 또는 자연사로 인해 백신접종이 어려울 수 있다. 예를 들어, 바이러스, 세포내 박테리아 또는 단세포 진핵생물(예를 들어, 말라리아 기생충)과 같은 세포내 기생충은 종종 백신을 제공하는 것이 문제일 수 있다.
종종, 생 약독화 백신은 개선된 반응을 제공할 수 있지만, 수반되는 위험, 주로 약독화 병원체의 재활성화 위험을 갖는다. 기존 백신 기술의 다른 결점은 백신에 의해 촉발되는 면역 반응(예를 들어, 표적화된 항원을 코딩하는 유전자에서 돌연변이가 일어나는 경우); 시간 경과에 따른 면역 상실; 및 불완전한 저항 반응에 의해 효과적으로 퇴치되지 않는 병원체 변이체가 진화하는 '백신 탈출' 가능성을 포함한다.
따라서, 모든 이러한 이유로 백신은 종종 면역 반응을 증가시키기 위한 애쥬번트(adjuvant)와 함께 제공되지만, 이들은 증상 유도 및 자가면역 공격의 위험과 같은 그들 자신의 위험을 갖는다. 따라서 특히 백신접종이 더 어려운 병원체와 관련하여 보다 효과적이고 안전한 백신 및/또는 애쥬번트를 제공할 필요가 있다.
WO-2017/132552-A1은 마이크로-RNA 결합 부위를 포함하는 조작된 게놈을 갖는 재조합 종양용해 바이러스를 설명한다.
US-2013/156849-A1은 포유동물 세포 또는 조직에서 관심 폴리펩티드를 발현하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 포유동물 세포 또는 조직을 관심 폴리펩티드를 암호화하는 변형된 mRNA를 포함하는 제형과 접촉시키는 것을 포함한다. WO-2016/011306-A2는 마이크로-RNA 결합 부위를 포함할 수 있는 적어도 하나의 말단 변형을 포함하는 핵산의 설계, 준비, 제조 및/또는 제형화를 설명한다. 상기 언급된 선행 기술은 공동 투여된 치료제 또는 인자로 치료받은 대상체의 신체에서 단일 또는 다중 기관 유형의 효과적인 보호를 보장하는 문제를 다루지 않는다.
WO 2019/051100 A1 및 WO 2019/158955 A1은 표적 기관 또는 기관들 내에서 적어도 제1 및 제2 세포 유형에서 코딩 서열의 차등 발현을 허용하는 miRNA 결합 부위 서열을 포함하는, 하나 이상의 표적 기관 내에서 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 위한 mRNA 서열의 전달을 위한 조성물 및 방법을 설명한다.
특이적 기관 및/또는 조직에서 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하기 위한 추가로 개선되고 최적화된 방법 및 조성물을 추가로 개발할 필요가 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 예를 들어 백신 및/또는 애쥬번트 조성물로서 사용하기 위한, mRNA 작제물과 같은 뉴클레오티드-암호화된 생성물을 전달하기에 적합한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 전달된 조성물 중 하나 이상은 miRNA 결합 부위 서열의 포함, 특히, 기관 보호 서열의 제공에 의해 제어된 발현을 위해 채택된다. 본원에 기재된 모든 측면에서, 'mRNA 작제물'은 단백질 산물을 생성하도록 번역될 수 있는 환형 또는 환형화된 RNA 작제물을 포함함이 고려된다.
제1 측면에서, 제1 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 제1 mRNA 작제물을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 제1 ORF는 항원을 암호화한다. 제1 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되며, 여기서 UTR은 적어도 제1 기관 보호 서열(OPS)을 포함하고, 여기서 제1 OPS는 적어도 2 개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하며, 여기서 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화된다.
제1 mRNA 작제물은 생체내 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착될 수 있다. 항원은 병원성 미생물 단백질 및 종양 연관 항원, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 병원성 미생물 단백질은 바이러스 단백질; 박테리아 단백질; 진균 단백질; 기생충 단백질; 및 프리온(prion)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
항원은 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함할 수 있다. 항원은 코로나바이러스(coronavirus) 스파이크 단백질; 변종 코로나바이러스 스파이크 단백질; 적합하게 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 포함할 수 있다. 항원은 인플루엔자 단백질 또는 이의 변이체, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함할 수 있으며; 적합하게 여기서 인플루엔자 단백질은 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 매트릭스-2 및/또는 핵단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 인플루엔자 단백질은 A형 인플루엔자, B형 인플루엔자, 또는 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16의 A형 인플루엔자의 하위유형으로부터 선택될 수 있다. 항원은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 단백질, 또는 이의 변이체, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함할 수 있으며; 적합하게 여기서 호흡기 세포융합 바이러스의 단백질은 F 당단백질 또는 G 당단백질이다. 항원은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함할 수 있으며; 적합하게 여기서 HIV 단백질은 당단백질 120 중화 에피토프 또는 당단백질 145이다.
항원은 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 박테리아로부터의 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함할 수 있으며; 적합하게 여기서 마이코박테리움 투베르쿨로시스 박테리아로부터의 단백질은 ESAT-6, Ag85B, TB10.4, Rv2626 및/또는 RpfD-B로부터 선택된다.
항원은 종양 연관 항원일 수 있다. 종양 연관 항원은 결장직장 종양 항원; MUC 1; 및/또는 신생항원을 포함할 수 있다.
제1 mRNA 작제물은 추가의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 추가의 ORF는 제1 ORF에 의해 암호화된 항원과 상이한 항원을 암호화한다.
추가의 ORF는 박테리아 단백질, 바이러스 단백질, 또는 종양 연관 항원, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프로부터 선택될 수 있다. 추가의 항원은 제1 ORF에 의해 암호화된 항원의 동일성과 관계 없이, 제1 ORF에 의해 암호화된 항원에 대한 임의의 가능성과 유사할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 mRNA 작제물은 추가의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 추가의 ORF는 전염증성 사이토카인을 암호화한다. 전염증성 사이토카인은 IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-12; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택될 수 있다.
제1 OPS는 적어도 3 개, 적어도 4 개, 또는 적어도 5 개의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 제1 OPS는 모두 서로 상이한 적어도 3 개의 miRNA 표적을 포함할 수 있다. 제1 OPS의 임의의 miRNA 서열은 반복될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 OPS는 근육, 간, 뇌, 유방, 내피, 췌장, 결장, 신장, 폐, 비장 및 피부, 심장, 위장관 기관, 생식 기관, 및 식도로 이루어진 군으로부터, 보다 구체적으로, 근육, 간, 신장, 폐, 비장, 피부, 심장, 위장관 기관, 생식 기관, 및 식도로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기관 또는 조직을 보호하기 위해 선택된 miRNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 OPS는 miRNA-122; miRNA-125; miRNA-199; miRNA-124a; miRNA-126; miRNA-98; Let7 miRNA 패밀리; miRNA-375; miRNA-141; miRNA-142; miRNA-148a/b; miRNA-143; miRNA-145; miRNA-194; miRNA-200c; miRNA-203a; miRNA-205; miRNA-1; miRNA-133a; miRNA-206; miRNA-34a; miRNA-192; miRNA-194; miRNA-204; miRNA-215; miRNA-30 패밀리(예를 들어, miRNA-30 a, b, 또는 c); miRNA-877; miRNA-4300; miRNA-4720; 및/또는 miRNA-6761에 결합하는 하나 이상의 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 OPS는 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a, miRNA-203a, let7b, miRNA-126, 및/또는 miRNA-192와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 제1 OPS는 서열번호: 44-57 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 제1 OPS는 miRNA-1, miRNA133a, miRNA206, miRNA-122, miRNA203a, miRNA205, miRNA200c, miRNA30a, 및/또는 let7a/b와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 제1 OPS는 miRNA-1, miRNA-122, miR-30a 및/또는 miR-203a와; miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a 및 miRNA-203a와; miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a와; let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a와; miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 OPS는 miRNA-192, miRNA-30a, 및 miRNA-124와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열, 및 miRNA 122와 결합할 수 있는 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 제2 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 제2 mRNA 작제물을 추가로 포함하며, 여기서 제2 ORF는 전염증성 사이토카인을 암호화한다. 전염증성 사이토카인은 IL-12; IL-2; IL-6; IL-8; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 제2 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착될 수 있으며, 이는 제1 mRNA 작제물과 연관된 것과 동일하거나 상이할 수 있다. 전달 조성물(들)은 중합체성 입자와 같은 입자; 리포솜; 리피도이드 입자; 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 벡터를 포함할 수 있다.
제2 ORF는 IL-12 단백질, 또는 이의 서브유닛, 유도체, 단편, 작용제 또는 상동체를 코딩할 수 있다. 특히, 제2 ORF는 서열번호: 59와 적어도 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 ORF는 제2 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되며, 여기서 UTR은 제2 기관 보호 서열(OPS)을 포함하고 여기서 제2 OPS는 적어도 2 개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함한다. 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화될 수 있다. 제2 OPS는 상기 논의된 바와 같이, 제1 OPS의 임의의 변이체와 유사하게 정의될 수 있고, 제1 OPS의 동일성과 관계 없이 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 OPS는 적어도 3 개, 적어도 4 개, 또는 적어도 5 개의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 제2 OPS는 모두 서로 상이한 적어도 3 개의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 제2 OPS는 근육, 간, 뇌, 유방, 내피, 췌장, 결장, 신장, 폐, 비장 및 피부로 이루어진 군으로부터; 보다 구체적으로 근육, 간, 신장, 폐, 비장, 피부, 심장, 위장관 기관, 생식 기관, 및 식도로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기관 또는 조직을 보호하기 위해 선택된 miRNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 OPS는 miRNA-122; miRNA-125; miRNA-199; miRNA-124a; miRNA-126; miRNA-98; Let7 miRNA 패밀리; miRNA-375; miRNA-141; miRNA-142; miRNA-148a/b; miRNA-143; miRNA-145; miRNA-194; miRNA-200c; miRNA-203a; miRNA-205; miRNA-1; miRNA-133a; miRNA-206; miRNA-34a; miRNA-192; miRNA-194; miRNA-204; miRNA-215; miRNA-30 패밀리(예를 들어, miRNA-30 a, b, 또는 c) 패밀리(예를 들어, miRNA-30 a, b, 또는 c); miRNA-877; miRNA-4300; miRNA-4720; 및/또는 miRNA-6761에 결합하는 하나 이상의 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 OPS는 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a, miRNA-203a, let7b, miRNA-126, 및/또는 miRNA-192와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 제2 OPS는 서열번호: 44-57 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 제2 OPS는 miRNA-1, miRNA133a, miRNA206, miRNA-122, miRNA203a, miRNA205, miRNA200c, miRNA30a, 및/또는 let7a/b와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 제2 OPS는 miRNA-1, miRNA-122, miR-30a 및/또는 miR-203a와; miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a 및 miRNA-203a와; miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a와; let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a와; 및/또는 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 OPS는 miRNA-192, miRNA-30a, 및 miRNA-124와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열, 및 miRNA 122와 결합할 수 있는 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함한다.
제1 OPS는 제2 OPS와 적어도 하나의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함하는 포함할 수 있다. 제1 OPS 및 제2 OPS는 동일한 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 구현예에서, 제1 OPS는 miRNA-1, miRNA-122, miR-30a 및 miR-203a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하고; 제2 OPS는 miRNA-122, miRNA-192, 및/또는 miRNA 30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함한다.
조성물은 적어도 제3 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 제3 mRNA 작제물(제2 mRNA 작제물에 더하여 또는 대신에)을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 제3 ORF는 제1 ORF에 의해 암호화되고, 박테리아 단백질, 바이러스 단백질, 또는 종양 연관 항원, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프로부터 선택된 항원과 상이한 항원을 암호화한다. 제3 ORF는 적어도 제3 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 여기서 UTR은 적어도 제3 기관 보호 서열(OPS)을 포함하고, 여기서 제3 OPS는 다중 기관을 보호하고, 여기서 제3 OPS는 적어도 2 개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화된다. 제3 OPS는 상기 논의된 바와 같이, 제1 또는 제2 OPS의 임의의 변이체와 유사하게 정의될 수 있고, 제1 또는 제2 OPS의 동일성과 관계 없이 달라질 수 있다.
구현예에서, 제1 ORF는 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 코딩하고, 제3 ORF는 인플루엔자 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프, 또는 이의 변이체를 코딩한다.
조성물은 정맥내, 피하, 근육내, 비강내, 동맥내 및/또는 흡입을 통한 투여에 적합할 수 있다.
제2 측면에서, 적어도 제1 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 제1 mRNA 작제물; 및 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 제2 mRNA 작제물을 포한하는 제2 작제물을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 ORF는 전염증성 사이토카인을 암호화하고, 여기서 제2 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 여기서 UTR은 다중 기관을 보호하는 적어도 하나의 OPS를 포함하고, 여기서 OPS는 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화된다.
이 제2 측면의 조성물의 성분은 상기 정의된 바와 같이 제1 측면의 상응하는 인자의 임의의 변경과 유사하게 정의될 수 있고, 추가의 ORF 및 추가의 mRNA 작제물과 같은 추가의 성분이 또한 상기 기재된 바와 같이 포함될 수 있다. 예를 들어, 제1 mRNA 작제물의 ORF는 박테리아 단백질; 및/또는 바이러스 단백질로부터 선택된 항원을 암호화할 수 있고/있거나, 제1 측면에 대해 상기 기재된 바와 같이 정의될 수 있다. 조성물은 생체내 전달 조성물을 포함할 수 있고, 제1 및/또는 제2 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착될 수 있다. 전달 조성물은 중합체성 입자와 같은 입자; 리포솜; 리피도이드 입자; 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 벡터를 포함할 수 있다.
제2 mRNA 작제물의 ORF는 IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-12; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택된 전염증성 사이토카인을 암호화할 수 있고, IL-12 단백질, 또는 이의 유도체, 작용제 또는 상동체를 코딩할 수 있다.
제2 작제물의 OPS는 상기 제1 측면에 대해 기재된 임의의 OPS로 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, OPS는 근육, 간, 신장, 폐, 비장 및 피부로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기관을 보호하기 위해 선택된 miRNA 서열을 포함한다. OPS는 서열번호: 44-57 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. OPS는 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a, miRNA-203a, let7b, miRNA-126, 및/또는 miRNA-192와; miRNA-1, miRNA133a, miRNA206, miRNA-122, miRNA203a, miRNA205, miRNA200c, miRNA30a, 및/또는 let7a/b와; miRNA-1, miRNA-122, miR-30a 및/또는 miR-203a와; miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a 및 miRNA-203a와; miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a와; let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a와; 및/또는 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 구현예에서, OPS는 miRNA-192, miRNA-30a, 및 miRNA-124와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열, 및 miRNA-122와 결합할 수 있는 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함한다.
제1 mRNA 작제물에 의해 암호화된 항원은 병원성 미생물 단백질 및 종양 연관 항원, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 병원성 미생물 단백질은 바이러스 단백질; 박테리아 단백질; 진균 단백질; 기생충 단백질; 및 프리온으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
항원은 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함할 수 있다. 항원은 코로나바이러스 스파이크 단백질; 변종 코로나바이러스 스파이크 단백질; 적합하게 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 포함할 수 있다. 항원은 인플루엔자 단백질 또는 이의 변이체, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함할 수 있으며; 적합하게 여기서 인플루엔자 단백질은 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 매트릭스-2 및/또는 핵단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 인플루엔자 단백질은 A형 인플루엔자, B형 인플루엔자, 또는 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16의 A형 인플루엔자의 하위유형으로부터 선택될 수 있다. 항원은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 단백질, 또는 이의 변이체, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함할 수 있으며; 적합하게 여기서 호흡기 세포융합 바이러스의 단백질은 F 당단백질 또는 G 당단백질이다. 항원은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함할 수 있으며; 적합하게 여기서 HIV 단백질은 당단백질 120 중화 에피토프 또는 당단백질 145이다.
항원은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 박테리아로부터의 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함할 수 있으며; 적합하게 여기서 마이코박테리움 투베르쿨로시스 박테리아로부터의 단백질은 ESAT-6, Ag85B, TB10.4, Rv2626 및/또는 RpfD-B로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 상기 임의의 측면 또는 변경에 기재된 바와 같은 조성물은 병원성 질환의 예방 또는 치료 방법에 사용하기 위한 것이며, 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계; 및/또는 기재된 다양한 작제물을 이를 필요로 하는 대상체에게 공동 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 병원성 질환은 SARS-CoV-2 바이러스일 수 있는 코로나바이러스에 의해 유발될 수 있다.
추가의 구현예에서 상기 정의된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, Th1 면역 반응을 증가시키는 방법이 제공되며 특히 여기서 IL-12 단백질, 또는 이의 서브유닛, 유도체, 단편, 작용제 또는 상동체를 코딩하는 ORF가 포함된다.
제3 측면에서, 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 하나의 mRNA 작제물을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 적어도 하나의 ORF는 전염증성 사이토카인을 암호화하고, 여기서 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 여기서 UTR은 다중 기관을 보호하는 적어도 하나의 OPS를 포함하고, 여기서 OPS는 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화된다.
다시, 이 제3 측면의 조성물의 성분은 상기 정의된 바와 같이, 제1 또는 제2 측면의 상응하는 인자의 임의의 변경과 유사하게 정의될 수 있으며, 특히 제2 mRNA 작제물(들)은 그렇게 정의된다. 조성물은 생체내 전달 조성물을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착된다. 전달 조성물은 중합체성 입자와 같은 입자; 리포솜; 리피도이드 입자; 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 벡터를 포함할 수 있다. 전염증성 사이토카인은 IL-12; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택될 수 있고; IL-12 단백질, 또는 이의 유도체, 작용제 또는 상동체일 수 있다.
OPS는 상기 측면에 대해 기재된 임의의 OPS로 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, OPS는 근육, 간, 신장, 폐, 비장 및 피부로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기관을 보호하기 위해 선택된 miRNA 서열을 포함한다. OPS는 서열번호: 44-57 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.
OPS는 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a, miRNA-203a, let7b, miRNA-126, 및/또는 miRNA-192와; miRNA-1, miRNA133a, miRNA206, miRNA-122, miRNA203a, miRNA205, miRNA200c, miRNA30a, 및/또는 let7a/b와; miRNA-1, miRNA-122, miR-30a 및/또는 miR-203a와; miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a 및 miRNA-203a와; miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a와; let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a와; miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와; miRNA-192, miRNA-30a, 및 miRNA-124와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열, 및 miRNA-122와 결합할 수 있는 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다.
구현예에서, 기재된 바와 같은 조성물은 병원성 질환의 예방 방법에 사용하기 위한 것이며, 상기 방법은 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계; 및 백신 조성물을 대상체에게 공동 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 조성물은 톡소이드 백신, 재조합 백신, 접합 백신, RNA-기반 백신, DNA-기반 백신, 생 약독화 백신, 비활성화 백신, 재조합-벡터 기반 백신, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 백신을 추가로 포함한다.
제4 측면에서, 하나 이상의 병원성 질환을 치료 또는 예방하거나 면역 반응을 개선하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 적어도 제1 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 제1 mRNA 작제물을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 ORF는 박테리아 단백질, 또는 바이러스 단백질, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프로부터 선택된 항원을 암호화한다. 제1 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되며, 여기서 UTR은 적어도 제1 기관 보호 서열(OPS)을 포함하며, 여기서 OPS는 다중 기관을 보호하고, 여기서 제1 OPS는 적어도 2 개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열와 혼성화하도록 최적화되고; 생체내 전달 조성물; 여기서 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착된다. 전달 조성물은 중합체성 입자와 같은 입자; 리포솜; 리피도이드 입자; 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 벡터를 포함할 수 있다.
이 제4 측면에 사용된 조성물의 성분은 상기 정의된 바와 같은 측면의 상응하는 인자의 임의의 변경과 유사하게 정의될 수 있고, 상기 측면, 특히 제1 측면에 기재된 바와 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 제2 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 하나의 mRNA 작제물을 포함하는 조성물을 대상체에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제2 ORF는 IL-12; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택될 수 있는 전염증성 사이토카인을 암호화한다. 제2 ORF는 IL-12 단백질, 또는 이의 유도체, 작용제 또는 상동체를 코딩할 수 있다. 제2 ORF는 서열번호: 59와 적어도 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
제1 OPS는 제2 OPS와 상이한 miRNA 표적 서열 세트를 포함할 수 있다. 제1 OPS 및 제2 OPS는 동일한 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 제1 및/또는 제2 OPS는 독립적으로 상기 기재된 측면의 것과 유사하게 정의될 수 있다.
일부 구현예에서, 병원성 질환은 SARS-CoV-2 바이러스일 수 있는 코로나바이러스에 의해 유발된다. 항원은 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 변종 코로나바이러스 스파이크 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함할 수 있다. 코로나바이러스 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질일 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 mRNA 작제물은 추가의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 추가로 포함하며, 여기서 추가의 ORF는 제1 ORF에 의해 암호화된 항원과 상이한 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 제3 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 제3 mRNA 작제물을 대상체에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제3 ORF는 제1 ORF에 의해 암호화된 항원과 상이한 항원을 암호화한다.
제5 측면에서, 하나 이상의 병원성 질환을 예방하거나 면역 반응을 개선하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 백신 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계; 및 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 하나의 mRNA 작제물을 포함하되, 여기서 적어도 하나의 ORF는 전염증성 사이토카인을 암호화하고, 여기서 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 여기서 UTR은 다중 기관을 보호하는 적어도 하나의 OPS를 포함하고, 여기서 OPS는 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되는 것인 조성물을 공동 투여하는 단계; 및 생체내 전달 조성물을 포함하며, 여기서 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착된다.
다시, 이 제4 측면에 사용된 조성물의 성분은 상기 정의된 바와 같은 측면의 상응하는 인자의 임의의 변경과 유사하게 정의될 수 있고, 상기 측면에 기재된 바와 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다.
전염증성 사이토카인은 IL-12; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신 조성물은 톡소이드 백신, 재조합 백신, 접합 백신, RNA-기반 백신, DNA-기반 백신, 생 약독화 백신, 비활성화 백신, 재조합-벡터 기반 백신, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 백신 조성물은 적어도 제1 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하되, 여기서 제1 ORF는 항원을 암호화하는 것인 적어도 제1 mRNA 작제물; 및 생체내 전달 조성물을 포함하며, 여기서 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착된다. 항원은 임의의 전술한 측면에서와 같이 정의될 수 있다.
공동 투여는 백신 조성물 및 애쥬번트 조성물을 동시에 또는 연속적으로 어느 순서로든 투여하는 것을 포함할 수 있다. 백신 조성물 및/또는 애쥬번트 조성물은 정맥내, 피하, 근육내, 비강내, 동맥내 및/또는 흡입을 통해 투여될 수 있다.
제4 또는 제5 측면의 일부 구현예에서, 병원성 질환은 세포내 병원체에 의해 유발된다. 병원성 질환은 잠복 감염, 또는 활성 감염일 수 있다. 병원성 질환은 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스, SARS-CoV-2 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 수두 대상포진 바이러스(VZV), 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 박테리아에 의해 유발될 수 있다.
제6 측면에서, 암을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 적어도 제1 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 제1 mRNA 작제물을 포함하는 제1 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 ORF는 종양 연관 항원, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 암호화한다. 제1 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되며, 여기서 UTR은 적어도 제1 기관 보호 서열(OPS)을 포함하고, 여기서 OPS는 다중 기관을 보호하고, 여기서 제1 OPS는 적어도 2 개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되고; 생체내 전달 조성물, 여기서 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착된다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 제2 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 하나의 mRNA 작제물을 포함하는 제2 조성물을 대상체에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제2 ORF는 IL-12; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택될 수 있는 전염증성 사이토카인을 암호화한다. 제2 mRNA 작제물은 임의의 전술된 측면에 정의된 바와 같은 OPS를 포함할 수 있다. 공동 투여는 제1 조성물 및 제2 조성물을 동시에 또는 연속적으로, 어느 순서로든 투여하는 것을 포함할 수 있다.
제7 측면에서, 암을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 암 치료적 백신 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계; 및 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 하나의 mRNA 작제물을 포함하는 조성물을 대상체에게 공동 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 ORF는 IL-12; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택될 수 있는 전염증성 사이토카인을 암호화한다. ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되며, 여기서 UTR은 다중 기관을 보호하는 적어도 하나의 OPS를 포함하고, 여기서 OPS는 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열에 혼성화하도록 최적화되고; 생체내 전달 조성물; 여기서 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착된다.
일부 구현예에서, 암 치료적 백신 조성물은 종양 연관 항원을 대상체에게 전달한다. 종양 연관 항원은 아데노바이러스 벡터일 수 있는 바이러스 벡터를 사용하여 대상체에게 전달되고, 일부 구현예에서 ChAdOx1 또는 ChAdOx2이다.
제6 또는 제7 측면의 일부 구현예에서, 종양 연관 항원은 결장직장 종양 항원 및/또는 MUC1을 포함한다. 종양 연관 항원은 대상체에게 개인화될 수 있는 신생항원일 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 다양한 구현예 및 실시예에 추가로 예시되며, 이의 특징은 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같은 추가적인 구현예를 형성하도록 추가로 조합될 수 있다.
도 1은 본 발명의 구현예에 따른 기관 보호 서열(OPS)을 혼입하는 mRNA 작제물의 개략도(즉, 척도가 아님)를 도시한다.
도 2는 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 다양한 세포 유형에 투여한 후 리포터 유전자 mCherry의 발현을 결정하기 위해 수행된 프로토콜의 개략도를 도시하며, mCherry 신호 분석은 형광 현미경(Texas Red 및 DAPI 필터)로 수행되며, 세포 핵은 Hoechst 33342로 염색된다.
도 3은 상기 프로토콜에 따른 3 개의 간 세포 유형의 mCherry 신호를 도시하고, 대조군 mCherry mRNA로 형질감염 후 인간 간암 세포(Hep3B) 또는 정상 뮤린 간세포(AML12) 세포에서 발견된 신호와 비교하여, 다중 기관 보호 서열(MOP)을 함유하는 mRNA, mCherry-3MOP 또는 mCherry-5MOP mRNA로 형질감염될 때 정상 뮤린 및 인간 간세포 둘 다에서 세포 신호의 유의한 감소를 입증한다. 이미지는 Texas Red 및 DAPI 필터로 획득된 이미지의 중첩이며, mCherry 형광 신호 및 세포 핵 염색을 나타낸다.
도 4는 Cytation 기기(Biotek)를 사용하여 형질감염된 세포에서 mCherry 형광의 정량화를 도시한다.
도 5a-5b는 mCherry-3MOP 처리된 세포에서 신호의 감소를 도시한다. 도 5a는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 정상 인간 신장 세포에서 mCherry 신호를 나타내며, mCherry-3MOP 처리된 세포에서 신호의 감소를 나타내고, mCherry 번역의 감소를 나타낸다. 이미지는 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, mCherry 형광 신호 및 세포 핵 염색을 나타낸다. 도 5b는 Cytation 기기(Biotek)를 사용하여 형질감염된 정상 인간 신장 세포에서 mCherry 형광의 정량화를 나타낸다.
도 6a-6f는 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 간 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 AML12 뮤린 간세포에서 발현을 억제하지만 간암 세포(Hep3B)에서는 억제하지 않음을 입증한다. 각 사진 세트에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 6a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 Hep3B 세포(간암)를 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 6b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 Hep3B 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 6c) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 Hep3B 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호 (도 6d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 AML12 세포(정상 간)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 6e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 6f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타낸다.
도 7a-7f는 Let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 간 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 AML12 뮤린 간세포에서 발현을 억제하지만 간암 세포(Hep3B)에서는 억제하지 않음을 입증한다. 각 사진 세트에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 7a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 Hep3B 세포(간암)를 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 7b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 Hep3B 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 7c) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 Hep3B 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호 (도 7d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 AML12 세포(정상 간)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 7e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 7f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타낸다.
도 8a-8b는 1 회(1*), 2 회(2*) 또는 4 회(4*) 복제된 miRNA-122에 결합하는 완벽한 일치 다중화된 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 간 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, AML12 정상 간세포에서 mCherry 발현의 억제에서 일부 용량 의존성이 있지만(도 8a), Hep3B 암 세포에서는 훨씩 적다(도 8b)는 것을 나타낸다. (도 8a) 및 (도 8b) 각각에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. 주입된 mRNA가 없는 대조군은 mCherry에 대한 mRNA 뿐만 아니라 MOP 서열이 없는 것을 포함한다.
도 9a-9d는 miRNA122에 결합하는 완벽하지 않게 일치하는 이중체(duplex)(2*) MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 AML12 뮤린 간 간세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시한다. (도 9a), (도 9b), (도 9c) 및 (도 9d) 각각에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 9a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 AML12 세포(정상 간)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 9b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 9c) 2* 완벽하지 않게 일치하는 miRNA122 MOP 서열이 있는(비최적화) mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타내고, 하단 패널은 AML12 세포에서 mCherry의 검출가능한 발현이 있음, (도 9d) 2* 완벽한 일치 miRNA-122 MOP 결합 서열이 있는(최적화) mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타내며, 하단 패널은 AML12 세포에서 mCherry의 검출가능한 발현이 거의 없음을 나타낸다,
도 10a-10f는 Let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 신장 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 인간 신장 세포(hREC)에서 mCherry 발현을 억제하지만 암 세포(786-0)에서는 억제하지 않음을 입증한다. (도 10a), (도 10b), (도 10c), (도 10d), (도 10e) 및 (도 10f) 각각에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 10a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 786-0 인간 신장 세포 선암종 세포에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 10b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 786-0 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 10c) 발현 증거를 나타내는, MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 786-0 세포에서 세포 핵 및 mCherry 신호, (도 10d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 hREC 세포(정상 혼합 신장 상피 세포)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 10e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 hREC 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 10f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 hREC 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타내며, mCherry 신호 단독은 발현이 사실상 없음을 나타낸다.
도 11a-11f는 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 신장 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 인간 신장 세포(hREC)에서 mCherry 발현을 억제하지만 암 세포(786-0)에서는 억제하지 않음을 입증한다. (도 11a), (도 11b), (도 11c), (도 11d), (도 11e) 및 (도 11f) 각각에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 11a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 786-0 인간 신장 세포 선암종 세포에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 11b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 786-0 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 11c) 발현의 증거를 나타내는, MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 786-0 세포에서 세포 핵 및 mCherry 신호, (도 11d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 hREC 세포(정상 혼합 신장 상피 세포)에서 세포 핵 염색을 나타내며, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 11e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 hREC 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 11f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 hREC 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타내며, mCherry 신호 단독은 발현이 사실상 없음을 나타낸다.
도 12a-12b는 인간 PBMC 세포가 다음을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 일 구현예에 따른 실험 결과를 도시한다: (도 12a) 3 가지 수준의 투여량으로 인간 IL-12를 발현하며, IL-12의 발현은 miRNA-122 - miRNA-203a - miRNA-1 - miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 단일 쇄 재조합 IL-12 발현 mRNA인, 다음의 mRNA: NC(단일 쇄로부터의 비코딩 인간 재조합 IL-12 - ATG 코돈 없음), hdclL-12(개별 IL12A 및 IL12B mRNA의 1:1 혼합물로부터의 인간 재조합 IL-12), hscIL-12(단일 쇄로부터의 인간 재조합 IL-12), 및 hscIL-12-MOP(단일 쇄로부터의 인간 재조합 IL-12)로 형질감염 6시간 후에 기록된 것인, mRNA; (도 12b) 3 가지 수준의 투여량으로 인간 GM-CSF를 발현하며, GM-CSF의 발현은 miRNA-122 - miRNA-203a - miRNA-1 - miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 hGM-CSF 발현 mRNA인, 다음의 mRNA: NC(비코딩 GM-CSF mRNA - ATG 코돈 없음), hGM-CSF, 및 hGM-CSF-MOP로 형질감염 6시간 후 기록된 것인, mRNA.
도 13a-13f는 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 결장 상피 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 결장 상피 세포에서 발현을 억제하지만 결장암 세포(HCT-116)에서는 억제하지 않음을 입증한다. 각 사진 세트에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 13a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 결장 상피 세포를 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 13b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 결장 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 13c) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 결장 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호 (도 13d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 HCT-116 세포(결장암)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 13e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 HCT-116 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 13f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 HCT-116 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타낸다.
도 14a-14f는 miRNA-Let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 결장 상피 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 miRNA-Let7b 결합 부위의 존재로 인해, 정상 결장 세포 및 결장암 세포 둘 다에서 발현을 억제함으로써 기관 보호를 제공함을 입증한다. 각 사진 세트에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 14a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 결장 상피 세포를 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 14b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 결장 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 14c) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 결장 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호 (도 14d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 HCT-116 세포(결장암)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 14e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 HCT-116 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 14f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 HCT-116 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타낸다.
도 15a-15c는 miRNA-Let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 정상적인 건강한 폐 세포(BEAS-2B)에서 mCherry 신호를 도시하고, MOP 서열이 miRNA-Let7b 결합 부위의 존재로 인해, 건강한 폐 세포에서 발현을 억제함으로써 페에 대한 기관 보호를 제공함을 입증한다. 각 사진 세트에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 15a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 세포를 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 15b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 15c) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 폐 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타낸다.
도 16a-16b는 마우스에서의 생체내 생체분포 실험 결과를 도시하며, (도 16a) 본 발명의 조성물로 투여 후 3.5시간 후(T3.5h), 높은 수준의 루시퍼라제 발현을 MOP 함유 작제물(그룹 2 및 3) 및 MOP 작제물이 없는 대조군 그룹(그룹 1)을 포함하여 모든 그룹에서 전신 이미지를 통해 볼 수 있지만; 루시퍼라제 발현의 유의한 하향 조절을 24 시간 후(T24h) MOP 함유 조성물에서 볼 수 있음을 입증한다. (도 16b)에서 24시간 후 기관의 생체외 이미지는 그룹 1(MOP 없는 대조군)과 비교하여 그룹 2 및 3(MOP 함유 작제물)의 마우스에 대해 간, 폐, 비장, 및 신장에서 감소된 루시퍼라제 발현을 보여준다.
도 17a-17b는 피하 Hep3B 종양(인간 간암)을 보유하는 마우스에서의 생체분포 연구의 추가 결과를 도시한다. 각 마우스는 종양내 주사를 통해 본 발명의 특정 구현예에 따른 조성물을 받았다. 루시퍼라제 발현은 모든 그룹에서 24시간 후 생체외 이미지를 통해 종양 조직에서 볼 수 있는 반면, 간 보호는 그룹 2 및 3에 대한 MOP 서열에 의해 제공된다. 비히클 그룹은 포스페이트 완충 식염수를 받았다. 그룹 1은 루시퍼라제(MOP 없는 대조군)를 받았다.
도 18은 뮤린 IL-12 애쥬번트 존재가 있거나 없는 오브알부민에 대한 항원-특이적 면역 반응의 동물 연구 결과를 도시한다. mRNA의 투여된 투여량은 그래프 아래의 표에 제시된다. 반응은 면역화 14일 후 혈청에서 검출된 항-오브알부민 뮤린 IgG의 양에 관해 나타낸다.
도 19는 근육내 투여 후 마우스에서의 생체내 생체분포 실험 결과를 도시한다. 생체외 이미지 결과는 본 발명의 특정 구현예의 조성물로 투여후 4시간 후, MOP 없는 대조군(Luc)과 비교하여, MOP 함유 작제물(Luc-MOP1, Luc-MOP2, Luc-MOP3)을 갖는 그룹에서 마우스에 대해 다중 기관에서 루시퍼라제 발현이 감소됨을 입증한다. 주사 부위에서 발현은 Luc-MOP1을 제외한 모든 그룹에서 높게 유지되었다. 비히클 그룹은 포스페이트 완충 식염수를 받았다. 결과는 효과적인 기관 보호가 근육내 투여 경로를 통해 본 발명의 조성물을 사용하여 달성될 수 있음을 나타낸다.
도 20은 정맥내 투여 후 마우스에서의 생체내 생체분포 실험 결과를 도시한다. 생체외 이미지 결과는 본 발명의 특정 구현예의 조성물로 투여후 6시간 후, MOP 없는 대조군(Luc)과 비교하여, MOP-함유 작제물(Luc-MOP1, Luc-MOP2, Luc-MOP3)을 갖는 그룹에서 마우스에 대해 다중 기관에서 루시퍼라제 발현이 감소됨을 입증한다. 비히클 그룹은 포스페이트 완충 식염수를 받았다. 결과는 효과적인 기관 보호가 정맥내 투여 경로를 통해 본 발명의 조성물을 사용하여 달성될 수 있음을 나타낸다.
도 21은 뮤린 IL-12 mRNA 애쥬번트로부터의 면역자극의 존재 또는 부재 하에 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질-특이적 면역 반응의 동물 연구 결과를 도시한다. 도 21은 면역접종 42일 후 생성된 혈청 IgG에 관한 Balb/c 마우스의 반응을 나타낸다.
도 22a-22b는 인간 PBMC 세포가 3 가지 수준의 투여량으로 인간 IL-12를 발현하는 mRNA를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 일 구현예에 따른 실험 결과를 도시한다. 도 22a는 다음 mRNA로 형질감염 24시간 후 정량화된 IL-12의 발현을 나타낸다: NC(단일 쇄로부터의 비코딩 인간 재조합 IL-12 - ATG 코돈 결여), hscIL-12(단일 쇄로부터의 인간 재조합 IL-12), 및 hscIL-12-MOPV(miRNA-122 -miRNA-203a - miRNA-1 - miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 단일 쇄 재조합 IL-12 발현 mRNA), hscIL-12-MOPC(miRNA-122 -miRNA-192- miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 단일 쇄 재조합 IL-12 발현 mRNA). 도 22b는 인간 IL-12를 발현하는 mRNA에 의해 형질감염된 PBMC에서 인터페론-감마(IFN-γ)의 IL-12-매개 유도를 나타낸다. 인간 인터페론-감마는 mRNA로 형질감염 72시간 후에 측정된다. 데이터는 인간 IL-12의 용량-의존적 발현(도 22a), 및 인터페론-감마의 IL-12-매개 유도(도 22b)를 나타내며, 선천성 및 적응성 면역 둘 다에 중요한 면역자극성 사이토카인이다.
도 23은 인간 PBMC 세포가 MOP가 있거나(hscIL-12-MOPV) MOP가 없는(hscIL-12) 인간 단일 쇄 재조합 IL-12 발현 mRNA와 조합하여 MOP가 있는 SARS-CoV-2 스파이크 mRNA를 발현하는 mRNA를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 일 구현예에 따른 실험 결과를 도시한다. MOP 서열은 miRNA-122 -miRNA-203a - miRNA-1 - miRNA-30a)에 대한 완벽한 일치 결합 서열을 포함한다. 결과는 형질감염 120시간 후, 인터페론-감마(INF-γ) 발현이 MOP가 있거나 없는 인간 IL-12를 발현하는 mRNA의 존재 하에 증가됨을 나타낸다.
도 2는 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 다양한 세포 유형에 투여한 후 리포터 유전자 mCherry의 발현을 결정하기 위해 수행된 프로토콜의 개략도를 도시하며, mCherry 신호 분석은 형광 현미경(Texas Red 및 DAPI 필터)로 수행되며, 세포 핵은 Hoechst 33342로 염색된다.
도 3은 상기 프로토콜에 따른 3 개의 간 세포 유형의 mCherry 신호를 도시하고, 대조군 mCherry mRNA로 형질감염 후 인간 간암 세포(Hep3B) 또는 정상 뮤린 간세포(AML12) 세포에서 발견된 신호와 비교하여, 다중 기관 보호 서열(MOP)을 함유하는 mRNA, mCherry-3MOP 또는 mCherry-5MOP mRNA로 형질감염될 때 정상 뮤린 및 인간 간세포 둘 다에서 세포 신호의 유의한 감소를 입증한다. 이미지는 Texas Red 및 DAPI 필터로 획득된 이미지의 중첩이며, mCherry 형광 신호 및 세포 핵 염색을 나타낸다.
도 4는 Cytation 기기(Biotek)를 사용하여 형질감염된 세포에서 mCherry 형광의 정량화를 도시한다.
도 5a-5b는 mCherry-3MOP 처리된 세포에서 신호의 감소를 도시한다. 도 5a는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 정상 인간 신장 세포에서 mCherry 신호를 나타내며, mCherry-3MOP 처리된 세포에서 신호의 감소를 나타내고, mCherry 번역의 감소를 나타낸다. 이미지는 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, mCherry 형광 신호 및 세포 핵 염색을 나타낸다. 도 5b는 Cytation 기기(Biotek)를 사용하여 형질감염된 정상 인간 신장 세포에서 mCherry 형광의 정량화를 나타낸다.
도 6a-6f는 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 간 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 AML12 뮤린 간세포에서 발현을 억제하지만 간암 세포(Hep3B)에서는 억제하지 않음을 입증한다. 각 사진 세트에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 6a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 Hep3B 세포(간암)를 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 6b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 Hep3B 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 6c) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 Hep3B 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호 (도 6d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 AML12 세포(정상 간)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 6e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 6f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타낸다.
도 7a-7f는 Let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 간 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 AML12 뮤린 간세포에서 발현을 억제하지만 간암 세포(Hep3B)에서는 억제하지 않음을 입증한다. 각 사진 세트에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 7a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 Hep3B 세포(간암)를 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 7b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 Hep3B 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 7c) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 Hep3B 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호 (도 7d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 AML12 세포(정상 간)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 7e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 7f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타낸다.
도 8a-8b는 1 회(1*), 2 회(2*) 또는 4 회(4*) 복제된 miRNA-122에 결합하는 완벽한 일치 다중화된 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 간 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, AML12 정상 간세포에서 mCherry 발현의 억제에서 일부 용량 의존성이 있지만(도 8a), Hep3B 암 세포에서는 훨씩 적다(도 8b)는 것을 나타낸다. (도 8a) 및 (도 8b) 각각에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. 주입된 mRNA가 없는 대조군은 mCherry에 대한 mRNA 뿐만 아니라 MOP 서열이 없는 것을 포함한다.
도 9a-9d는 miRNA122에 결합하는 완벽하지 않게 일치하는 이중체(duplex)(2*) MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 AML12 뮤린 간 간세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시한다. (도 9a), (도 9b), (도 9c) 및 (도 9d) 각각에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 9a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 AML12 세포(정상 간)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 9b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 9c) 2* 완벽하지 않게 일치하는 miRNA122 MOP 서열이 있는(비최적화) mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타내고, 하단 패널은 AML12 세포에서 mCherry의 검출가능한 발현이 있음, (도 9d) 2* 완벽한 일치 miRNA-122 MOP 결합 서열이 있는(최적화) mRNA로 형질감염된 AML12 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타내며, 하단 패널은 AML12 세포에서 mCherry의 검출가능한 발현이 거의 없음을 나타낸다,
도 10a-10f는 Let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 신장 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 인간 신장 세포(hREC)에서 mCherry 발현을 억제하지만 암 세포(786-0)에서는 억제하지 않음을 입증한다. (도 10a), (도 10b), (도 10c), (도 10d), (도 10e) 및 (도 10f) 각각에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 10a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 786-0 인간 신장 세포 선암종 세포에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 10b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 786-0 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 10c) 발현 증거를 나타내는, MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 786-0 세포에서 세포 핵 및 mCherry 신호, (도 10d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 hREC 세포(정상 혼합 신장 상피 세포)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 10e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 hREC 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 10f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 hREC 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타내며, mCherry 신호 단독은 발현이 사실상 없음을 나타낸다.
도 11a-11f는 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 신장 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 인간 신장 세포(hREC)에서 mCherry 발현을 억제하지만 암 세포(786-0)에서는 억제하지 않음을 입증한다. (도 11a), (도 11b), (도 11c), (도 11d), (도 11e) 및 (도 11f) 각각에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 11a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 786-0 인간 신장 세포 선암종 세포에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 11b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 786-0 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 11c) 발현의 증거를 나타내는, MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 786-0 세포에서 세포 핵 및 mCherry 신호, (도 11d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 hREC 세포(정상 혼합 신장 상피 세포)에서 세포 핵 염색을 나타내며, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 11e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 hREC 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 11f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 hREC 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타내며, mCherry 신호 단독은 발현이 사실상 없음을 나타낸다.
도 12a-12b는 인간 PBMC 세포가 다음을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 일 구현예에 따른 실험 결과를 도시한다: (도 12a) 3 가지 수준의 투여량으로 인간 IL-12를 발현하며, IL-12의 발현은 miRNA-122 - miRNA-203a - miRNA-1 - miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 단일 쇄 재조합 IL-12 발현 mRNA인, 다음의 mRNA: NC(단일 쇄로부터의 비코딩 인간 재조합 IL-12 - ATG 코돈 없음), hdclL-12(개별 IL12A 및 IL12B mRNA의 1:1 혼합물로부터의 인간 재조합 IL-12), hscIL-12(단일 쇄로부터의 인간 재조합 IL-12), 및 hscIL-12-MOP(단일 쇄로부터의 인간 재조합 IL-12)로 형질감염 6시간 후에 기록된 것인, mRNA; (도 12b) 3 가지 수준의 투여량으로 인간 GM-CSF를 발현하며, GM-CSF의 발현은 miRNA-122 - miRNA-203a - miRNA-1 - miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 hGM-CSF 발현 mRNA인, 다음의 mRNA: NC(비코딩 GM-CSF mRNA - ATG 코돈 없음), hGM-CSF, 및 hGM-CSF-MOP로 형질감염 6시간 후 기록된 것인, mRNA.
도 13a-13f는 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 결장 상피 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 결장 상피 세포에서 발현을 억제하지만 결장암 세포(HCT-116)에서는 억제하지 않음을 입증한다. 각 사진 세트에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 13a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 결장 상피 세포를 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 13b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 결장 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 13c) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 결장 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호 (도 13d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 HCT-116 세포(결장암)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 13e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 HCT-116 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 13f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 HCT-116 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타낸다.
도 14a-14f는 miRNA-Let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 결장 상피 세포에서 mCherry 신호의 비교를 도시하고, MOP 서열이 miRNA-Let7b 결합 부위의 존재로 인해, 정상 결장 세포 및 결장암 세포 둘 다에서 발현을 억제함으로써 기관 보호를 제공함을 입증한다. 각 사진 세트에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 14a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 결장 상피 세포를 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 14b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 결장 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 14c) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 결장 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호 (도 14d) mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 HCT-116 세포(결장암)에서 세포 핵 염색을 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 14e) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 HCT-116 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 14f) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 HCT-116 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타낸다.
도 15a-15c는 miRNA-Let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 정상적인 건강한 폐 세포(BEAS-2B)에서 mCherry 신호를 도시하고, MOP 서열이 miRNA-Let7b 결합 부위의 존재로 인해, 건강한 폐 세포에서 발현을 억제함으로써 페에 대한 기관 보호를 제공함을 입증한다. 각 사진 세트에 대해, 상단 패널은 Texas Red 및 DAPI 필터 큐브로 획득된 이미지의 중첩이며, 세포 핵 염색 및 mCherry 형광을 나타낸다. 하단 패널은 Texas Red 필터 큐브로 획득된 이미지를 나타내고 mCherry 형광만을 나타낸다. (도 15a) 상단 패널은 mRNA로 형질감염되지 않은 대조군 세포를 나타내고, 하단 패널은 mCherry 신호 없음, (도 15b) MOP 서열이 없는 mRNA로 형질감염된 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호, (도 15c) MOP 서열이 있는 mRNA로 형질감염된 폐 세포에서 세포 핵 염색 및 mCherry 신호를 나타낸다.
도 16a-16b는 마우스에서의 생체내 생체분포 실험 결과를 도시하며, (도 16a) 본 발명의 조성물로 투여 후 3.5시간 후(T3.5h), 높은 수준의 루시퍼라제 발현을 MOP 함유 작제물(그룹 2 및 3) 및 MOP 작제물이 없는 대조군 그룹(그룹 1)을 포함하여 모든 그룹에서 전신 이미지를 통해 볼 수 있지만; 루시퍼라제 발현의 유의한 하향 조절을 24 시간 후(T24h) MOP 함유 조성물에서 볼 수 있음을 입증한다. (도 16b)에서 24시간 후 기관의 생체외 이미지는 그룹 1(MOP 없는 대조군)과 비교하여 그룹 2 및 3(MOP 함유 작제물)의 마우스에 대해 간, 폐, 비장, 및 신장에서 감소된 루시퍼라제 발현을 보여준다.
도 17a-17b는 피하 Hep3B 종양(인간 간암)을 보유하는 마우스에서의 생체분포 연구의 추가 결과를 도시한다. 각 마우스는 종양내 주사를 통해 본 발명의 특정 구현예에 따른 조성물을 받았다. 루시퍼라제 발현은 모든 그룹에서 24시간 후 생체외 이미지를 통해 종양 조직에서 볼 수 있는 반면, 간 보호는 그룹 2 및 3에 대한 MOP 서열에 의해 제공된다. 비히클 그룹은 포스페이트 완충 식염수를 받았다. 그룹 1은 루시퍼라제(MOP 없는 대조군)를 받았다.
도 18은 뮤린 IL-12 애쥬번트 존재가 있거나 없는 오브알부민에 대한 항원-특이적 면역 반응의 동물 연구 결과를 도시한다. mRNA의 투여된 투여량은 그래프 아래의 표에 제시된다. 반응은 면역화 14일 후 혈청에서 검출된 항-오브알부민 뮤린 IgG의 양에 관해 나타낸다.
도 19는 근육내 투여 후 마우스에서의 생체내 생체분포 실험 결과를 도시한다. 생체외 이미지 결과는 본 발명의 특정 구현예의 조성물로 투여후 4시간 후, MOP 없는 대조군(Luc)과 비교하여, MOP 함유 작제물(Luc-MOP1, Luc-MOP2, Luc-MOP3)을 갖는 그룹에서 마우스에 대해 다중 기관에서 루시퍼라제 발현이 감소됨을 입증한다. 주사 부위에서 발현은 Luc-MOP1을 제외한 모든 그룹에서 높게 유지되었다. 비히클 그룹은 포스페이트 완충 식염수를 받았다. 결과는 효과적인 기관 보호가 근육내 투여 경로를 통해 본 발명의 조성물을 사용하여 달성될 수 있음을 나타낸다.
도 20은 정맥내 투여 후 마우스에서의 생체내 생체분포 실험 결과를 도시한다. 생체외 이미지 결과는 본 발명의 특정 구현예의 조성물로 투여후 6시간 후, MOP 없는 대조군(Luc)과 비교하여, MOP-함유 작제물(Luc-MOP1, Luc-MOP2, Luc-MOP3)을 갖는 그룹에서 마우스에 대해 다중 기관에서 루시퍼라제 발현이 감소됨을 입증한다. 비히클 그룹은 포스페이트 완충 식염수를 받았다. 결과는 효과적인 기관 보호가 정맥내 투여 경로를 통해 본 발명의 조성물을 사용하여 달성될 수 있음을 나타낸다.
도 21은 뮤린 IL-12 mRNA 애쥬번트로부터의 면역자극의 존재 또는 부재 하에 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질-특이적 면역 반응의 동물 연구 결과를 도시한다. 도 21은 면역접종 42일 후 생성된 혈청 IgG에 관한 Balb/c 마우스의 반응을 나타낸다.
도 22a-22b는 인간 PBMC 세포가 3 가지 수준의 투여량으로 인간 IL-12를 발현하는 mRNA를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 일 구현예에 따른 실험 결과를 도시한다. 도 22a는 다음 mRNA로 형질감염 24시간 후 정량화된 IL-12의 발현을 나타낸다: NC(단일 쇄로부터의 비코딩 인간 재조합 IL-12 - ATG 코돈 결여), hscIL-12(단일 쇄로부터의 인간 재조합 IL-12), 및 hscIL-12-MOPV(miRNA-122 -miRNA-203a - miRNA-1 - miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 단일 쇄 재조합 IL-12 발현 mRNA), hscIL-12-MOPC(miRNA-122 -miRNA-192- miRNA-30a에 결합하는 완벽한 일치 MOP 서열을 포함하는 단일 쇄 재조합 IL-12 발현 mRNA). 도 22b는 인간 IL-12를 발현하는 mRNA에 의해 형질감염된 PBMC에서 인터페론-감마(IFN-γ)의 IL-12-매개 유도를 나타낸다. 인간 인터페론-감마는 mRNA로 형질감염 72시간 후에 측정된다. 데이터는 인간 IL-12의 용량-의존적 발현(도 22a), 및 인터페론-감마의 IL-12-매개 유도(도 22b)를 나타내며, 선천성 및 적응성 면역 둘 다에 중요한 면역자극성 사이토카인이다.
도 23은 인간 PBMC 세포가 MOP가 있거나(hscIL-12-MOPV) MOP가 없는(hscIL-12) 인간 단일 쇄 재조합 IL-12 발현 mRNA와 조합하여 MOP가 있는 SARS-CoV-2 스파이크 mRNA를 발현하는 mRNA를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 형질감염된 일 구현예에 따른 실험 결과를 도시한다. MOP 서열은 miRNA-122 -miRNA-203a - miRNA-1 - miRNA-30a)에 대한 완벽한 일치 결합 서열을 포함한다. 결과는 형질감염 120시간 후, 인터페론-감마(INF-γ) 발현이 MOP가 있거나 없는 인간 IL-12를 발현하는 mRNA의 존재 하에 증가됨을 나타낸다.
달리 지시하지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업자의 능력 내에 있는 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 및 화학적 방법의 통상적인 기술을 이용한다. 이러한 기술은 또한 문헌, 예를 들어, M.R. Green, J. Sambrook, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제4판, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. 등 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Online ISSN:1934-3647); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridisation: Principles and Practice, Oxford University Press; M. J. Gait(Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; 및 D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Synthetic Biology, Part A, Methods in Enzymology, Edited by Chris Voigt, Volume 497, Pages 2-662(2011); Synthetic Biology, Part B, Computer Aided Design and DNA Assembly, Methods in Enzymology, Edited by Christopher Voigt, Volume 498, Pages 2-500(2011); RNA Interference, Methods in Enzymology, David R. Engelke, and John J. Rossi, Volume 392, Pages 1-454(2005)에 설명되어 있다. 이들 일반적인 텍스트 각각은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명을 제시하기 전에, 본 발명의 이해를 돕기 위해 다수의 정의가 제공된다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 속하는 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 '포함하는'은 임의의 언급된 요소가 반드시 포함되고 다른 요소가 또한 임의적으로 포함될 수 있음을 의미한다. '본질적으로 이루어진'은 임의의 언급된 요소가 반드시 포함되고, 나열된 요소의 기본 및 신규 특성에 중대한 영향을 미칠 수 있는 요소가 제외되고, 다른 요소가 임의적으로 포함될 수 있음을 의미한다. '이루어진'은 나열된 것 이외의 모든 요소가 제외됨을 의미한다. 이들 용어 각각에 의해 정의된 구현예는 본 발명의 범위 내에 있다.
용어 '단리된'은, 폴리뉴클레오티드 서열에 적용될 때, 서열이 그의 천연 유기체 기원으로부터 제거되었고, 따라서 이질적이거나 원치않은 코딩 또는 조절 서열이 없음을 나타낸다. 단리된 서열은 재조합 DNA 과정 및 유전적으로 조작된 단백질 합성 시스템 내에서 사용하기에 적합하다. 이러한 단리된 서열은 cDNA, mRNA 및 게놈 클론을 포함한다. 단리된 서열은 단백질 암호화 서열로만 제한될 수 있거나 또한 프로모터 및 전사 종결자와 같은 5' 및 3' 조절 서열, 또는 비번역 서열(UTR)을 포함할 수 있다. 본 발명을 추가로 제시하기 전에, 본 발명의 이해를 돕기 위해 다수의 정의가 제공된다.
'폴리뉴클레오티드'는 각 뉴클레오티드 상의 3' 및 5' 단부가 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드의 단일 또는 이중 가닥 공유-연결된 서열이다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 리보뉴클레오티드 염기로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA를 포함하고, 시험관 내에서 합성적으로 제조되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 크기는 전형적으로 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 경우 염기쌍(bp)의 수로, 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 경우 뉴클레오티드(nt)의 수로 표현된다. 1000 bp 또는 nt는 킬로베이스(kb)와 동일하다. 약 40 개 미만의 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 '올리고뉴클레오티드'라고 명명된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 '핵산 서열'은 각 뉴클레오티드 상의 3' 및 5' 단부가 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드의 단일 또는 이중 가닥 공유-연결된 서열이다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 리보뉴클레오티드 염기로 구성될 수 있다. 핵산 서열은 DNA 및 RNA를 포함할 수 있고, 시험관 내에서 합성적으로 제조되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 구체적 구현예에서 핵산 서열은 메신저 RNA(mRNA)를 포함한다.
핵산은 변형된 DNA 또는 RNA, 예를 들어 메틸화된 DNA 또는 RNA, 또는 번역후 변형, 예를 들어 7-메틸구아노신으로 5'-캡핑, 절단 및 폴리아데닐화와 같은 3'-처리, 및 스플라이싱을 겪은 RNA를 추가로 포함할 수 있다. 핵산은 또한 합성 핵산(XNA), 예컨대 헥시톨 핵산(HNA), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리세롤 핵산(GNA), 잠금 핵산(LNA) 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본원에 기재된 핵산 서열에 대한 상동성은 단순히 100% 서열 동일성에 제한되지 않는다. 이와 관련하여, 2 개 서열과 관련한 용어 "실질적으로 유사한"은 서열이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 유사성을 가짐을 의미한다. 마찬가지로, 2 개의 서열과 관련한 용어 "실질적으로 상보적"은 서열이 완전히 상보적이거나, 염기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%가 상보적임을 의미한다. 즉, 불일치가 혼성화하도록 의도된 서열의 염기 사이에 발생할 수 있으며, 이는 염기의 적어도 1%, 5%, 10%, 20% 또는 최대 30% 사이에 발생할 수 있다. 그러나, 일부 경우에 서로 혼성화할 수 있지만 일부 불일치, 즉, "부정확한 일치", "불완전한 일치", 또는 "부정확한 상보성"을 함유하는 2 개 서열 및 불일치가 없는, 즉, "정확한 일치", "완벽한 일치", 또는 "정확한 상보성"을 갖는 서로 혼성화할 수 있는 2 개 서열 사이를 구별하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 가능한 불일치 정도가 고려된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 '기관 보호 서열'('OPS')은 천연 또는 합성 기원의 복수의 마이크로RNA(miRNA) 표적 서열 및, 임의적으로, 하나 이상의 보조 서열로 구성된 서열을 지칭한다. OPS가 다중 기관에 보호를 부여하는 경우 다중 또는 '다중-'기관 보호(MOP) 서열로 지칭될 수 있다. 용어 '표적 서열'은 명시된 miRNA에 의한 결합을 표적화하는 mRNA 서열 내에, 예컨대 비번역 영역(UTR) 내에 포함된 서열을 지칭한다. 결합은 miRNA 내에 포함된 상보적인 염기 쌍과 상응하는 표적 서열 사이에 핵산 혼성화에 의해 발생한다. 결합 상호작용은 명시된 miRNA와 표적 서열 사이에 불일치가 발생하지 않거나, 또는 불일치가 표적 서열의 길이에 걸친 단일 염기 쌍 불일치에만 제한되도록 최적화될 수 있다. 본 발명의 구현예에서 단일 염기 불일치는 표적 서열의 5' 또는 3' 단부에 제한된다. 최적화된 서열은 또한 세포에 존재하는 표적 miRNA와 완벽하게 일치하는 것으로 설명될 수 있고 2 개 이상의 염기 쌍에 의해 야생형 결합 서열과 상이할 수 있다. 2 개 초과의 자연 발생 불일치를 포함하는 야생형 서열은 상응하는 상보적인 miRNA 서열에 완전하지 않게 또는 불완전하게 일치하는 것으로 간주된다.
용어 '작동가능하게 연결된'은, 예를 들어 발현 작제물에서 핵산 서열에 적용될 때, 서열이 의도된 목적을 달성하기 위해 협력적으로 기능하도록 배열되어 있음을 나타낸다. 예로서, DNA 벡터에서 프로모터 서열은 연결된 코딩 서열을 통해 종결 서열까지 진행하는 전사의 개시를 허용한다. RNA 서열의 경우, 하나 이상의 비번역 영역(UTR)은 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 지칭되는 연결된 폴리펩티드 코딩 서열과 관련하여 배열될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이 주어진 mRNA는 하나 초과의 ORF, 소위 폴리시스트로닉(polycistronic) RNA를 포함할 수 있다. mRNA는 하나 초과의 폴리펩티드를 암호화할 수 있고, 결과로서 당업계에 알려진 바와 같이, 다중 기능 산물의 생산을 초래하는 데 필요한 절단 부위 또는 다른 서열을 포함할 수 있다. UTR은 작동가능하게 연결된 코딩 서열 ORF와 관련하여 5' 또는 3'에 위치할 수 있다. UTR은 다음 중 임의의 하나 이상과 같이, 자연에서 발견되는 mRNA 서열에서 전형적으로 발견된 서열을 포함할 수 있다: Kozak 공통 서열, 개시 코돈, 시스(cis)-작용 번역 조절 요소, 캡(cap)-독립적 번역 개시자 서열, 폴리-A 꼬리, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), mRNA 안정성 및/또는 수명을 조절하는 구조, mRNA의 국소화를 지시하는 서열 등. mRNA는 동일하거나 상이한 다중 UTR을 포함할 수 있다. 하나 이상의 UTR은 OPS를 포함하거나 이에 근접하거나 인접하게 위치할 수 있다. UTR은 Kozak 서열과 같이, mRNA에 대한 번역 또는 안정성 제어를 제공하는 선형 서열을 포함할 수 있거나, 이들은 또한 특히 5' UTR 내에서 국소화된 2차 구조의 형성을 촉진하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 평균보다 낮은 GC 함량을 갖는 5' UTR은 mRNA의 효율적인 번역을 촉진하는 데 활용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 '폴리펩티드를 발현하는'은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 폴리펩티드의 생산을 지칭한다. 전형적으로, 이는 서열이 전달되는 세포의 리보솜 기구에 의한 공급된 mRNA 서열, 즉 ORF의 번역에 관여한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 '병적(diseased)'은, '병적 세포' 및/또는 '병적 조직'에서와 같이 비정상적이거나 건강하지 않거나 질환 병리를 나타내는 조직 및 기관(또는 이의 부분) 및 세포를 나타낸다. 예를 들면, 병적 세포는 바이러스, 박테리아, 프리온, 진균 또는 진핵생물 기생충으로 감염될 수 있고/있거나; 유해한 돌연변이를 포함할 수 있고/있거나; 암성, 전암성, 종양성 또는 신생물성일 수 있다. 감염은 내재화되고 생명 주기의 상당한 부분 동안 세포 내에 상주하는 병원체를 포함할 수 있다. 병적 세포는 달리 정상 또는 소위 건강한 세포와 비교할 때 변경된 세포내 mRNA 환경을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 병적 세포는 병리학적으로 정상일 수 있지만 질환에 대한 전구체 상태를 나타내는 변경된 세포내 miRNA 환경을 포함한다. 병적 조직은 또 다른 기관 또는 기관계로부터 병적 세포에 의해 침윤된 건강한 조직을 포함할 수 있다. 예로서, 많은 염증성 질환은 달리 건강한 기관이 T 세포 및 호중구와 같은 면역 세포로 침윤되는 병리를 포함한다. 추가의 예로서, 협착성 또는 경변성 병변에 적용된 기관 및 조직은 매우 근접한 건강한 세포 및 병적 세포를 둘 다 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 '암'은 특정 조직에서 시작하는 원발성 암, 또는 다른 곳으로부터 전이에 의해 퍼지는 속발성 암일 수 있는, 악성 종양을 포함하는 조직의 신생물을 지칭한다. 용어 암, 신생물 및 악성 종양은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 암은 신생물 내에 위치하거나 신생물과 연관된 특성을 갖는 조직 또는 세포를 나타낼 수 있다. 신생물은 전형적으로 정상 조직 및 정상 세포와 구별되는 특성을 보유한다. 이러한 특성 중에는 역형성 정도, 형태 변화, 모양 불규칙성, 세포 접착력 감소, 전이 능력, 및 세포 증식 증가를 포함하나 이에 제한되지 않는다. '암'과 관련하고 종종 동의어인 용어는 육종, 암종, 악성 종양, 상피종, 백혈병, 림프종, 형질전환, 신생물 등을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 '암'은 전악성, 및/또는 전암성 종양, 뿐만 아니라 악성 암을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 '건강한'은, '건강한 세포' 및/또는 '건강한 조직'에서와 같이 자체가 병적이 아니고/아니거나 전형적으로 정상적인 기능을 하는 표현형에 가까운 조직 또는 기관(또는 이의 부분) 및 세포를 나타낸다. 본 발명의 맥락에서 용어 '건강한'은 상대적인 것으로, 예를 들어, 종양에 의해 영향을 받은 조직의 비-신생물성 세포가 절대적인 의미에서 완전히 건강하지 않을 수 있는 것으로 인식될 수 있다. 따라서 '건강하지 않은 세포'는 자체가 신생물성, 암성 또는 전암성이 아니지만 예를 들어 경변성, 염증성, 또는 감염성이거나 달리 병적일 수 있는 세포를 의미한다. 유사하게, '건강한 또는 건강하지 않은 조직'은 전반적인 건강과 관계없이, 종양, 신생물성, 암성 또는 전암성 세포; 또는 상기 언급된 바와 같은 다른 질환이 없는 조직, 또는 이의 부분을 의미한다. 예를 들면, 암성 및 섬유증 조직을 포함하는 기관의 맥락에서, 섬유증 조직 내에 포함된 세포는 암성 조직과 비교하여 상대적으로 '건강한' 것으로 생각될 수 있다. '건강한' 세포에 대해 정상적인 기능을 하는 표현형에 가까운 것에 사용되는 모델은 세포 기능 및 유전자 발현 측면에서 원조 세포에 달리 가까운 불멸화 세포주를 포함할 수 있다.
대안적인 구현예에서, 세포, 세포 유형, 조직 및/또는 기관의 건강 상태는 miRNA 발현의 정량화에 의해 결정된다. 암과 같은 특정 질환 유형에서, 특정 miRNA 종의 발현은 영향을 받고, 영향을 받지 않은 세포와 비교하여 상향 또는 하향 조절될 수 있다. miRNA 전사체(transcriptome)에서 이 차이는 상대적 건강 상태를 식별하고/하거나, 질환 상태를 향한 건강한 세포, 세포 유형, 조직 및/또는 기관의 진행을 추적하는 데 사용될 수 있다. 질환 상태는 신생물성 세포로의 다양한 형질전환 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 구현예에서 주어진 기관 또는 기관계 내에 포함된 세포 유형의 miRNA 전사체에서 차등 변화는 상이한 세포 유형에서 단백질 발현을 제어하기 위해 활용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 '기관'은 '기관계'와 동의어이며 생리학적, 해부학적, 항상성 또는 내분비 기능과 같은 생물학적 기능을 제공하기 위해 대상체의 신체 내에서 구획화될 수 있는 조직 및/또는 세포 유형의 조합을 지칭한다. 적합하게, 기관 또는 기관계는 간 또는 췌장과 같은 혈관화된 내부 기관을 의미할 수 있다. 전형적으로, 기관은 적어도 2 개의 조직 유형, 및/또는 기관의 표현형 특성을 나타내는 복수의 세포 유형을 포함한다. 조직 또는 조직계는 협력할 수 있지만 공식적으로 기관으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 혈액은 일반적으로 조직, 또는 심지어 액체 조직으로 간주되지만, 사용되는 정의에 따라 엄격한 의미에서 기관으로 간주되지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 특정 구현예에서 본 발명의 조성물 및 방법은 혈액, 조혈 및 림프 조직을 포함하는 기관, 조직 및 조직계에 대한 보호 효과를 나타내는 역할을 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 '치료적 바이러스'는 숙주 항종양 반응의 자극에 의한 간접 사멸을 포함하는 암 세포를 감염시키고 사멸할 수 있는 바이러스를 지칭한다. 치료적 바이러스는 또한 백신 제형에서 유용한 약독화 또는 변형된 바이러스를 포함할 수 있다.
표 1 치료적 바이러스 및 이의 하위유형의 예
본 발명의 구현예에서 바이러스는 바이러스의 볼티모어(Baltimore) 분류 그룹 I - VII 중 임의의 하나로부터 선택될 수 있다(Baltimore D(1971). "Expression of animal virus genomes". Bacteriol Rev. 35(3): 235-41). 본 발명의 구체적 구현예에서 적합한 바이러스는 이중 가닥 DNA 바이러스 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 볼티모어 그룹 I; 양성 단일 가닥 DNA 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 그룹 II, 이중 가닥 RNA 바이러스 게놈을 갖는 것을 특징으로 하는 그룹 III, 단일 가닥 양성 RNA 게놈을 갖는 그룹 IV; 및 단일 가닥 음성 RNA 게놈을 갖는 그룹 V로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 '폴리펩티드'는 자연적으로 생성되든 합성 수단에 의해 시험관 내에서 생성되든, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 12 개 미만의 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드는 전형적으로 "펩티드"로 지칭되고 약 12 내지 약 30 개의 아미노산 잔기 길이를 갖는 것은 "올리고펩티드"로 지칭될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 자연 발생 폴리펩티드, 전구체 형태 또는 프로단백질의 생성물을 나타낸다. 폴리펩티드는 또한 글리코실화, 단백질분해 절단, 지질화, 신호 펩티드 절단, 프로펩티드 절단, 인산화 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는 성숙 또는 번역후 변형 과정을 겪을 수 있다. 용어 "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 거대분자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 '유전자 산물'은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 mRNA 작제물 내에 포함된 적어도 하나의 코딩 서열 또는 오픈 리딩 프레임(ORF)에 의해 암호화된 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리시스트로닉 mRNA 작제물이 사용될 수 있으며, 이는 동일한 폴리핵산 가닥 상에 위치한 다중 ORF에 의해 암호화된 다중 유전자 산물의 생산을 초래한다. 다중 ORF는 기능적으로 협력할 수 있거나, 다양한 생물학적 및 잠재적으로 치료적 효과를 갖는 복합체 및/또는 다량체 단백질을 형성할 수 있는 다양한 생성물, 예를 들어, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드의 동일반응계 생산으로 이어질 수 있음이 인식될 것이다.
mRNA에 의해 암호화된 유전자 산물은 전형적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이다. 특정 단백질이 하나 초과의 서브유닛으로 이루어지는 경우, mRNA는 하나 이상의 ORF 내에서 하나 또는 하나 초과의 서브유닛을 코딩할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 제1 mRNA는 제1 서브유닛을 코딩할 수 있는 반면, 제2 공동 투여된 mRNA는 동일반응계에서 번역될 때, 다중-서브유닛 단백질 유전자 산물의 조립으로 이어지는 제2 서브유닛을 코딩할 수 있다. 표적 세포 내에서 유전자 산물의 번역은 적용될 세포 유형에 적절한 국소화된 번역후 변형을 허용한다. 이러한 변형은 유전자 산물의 접힘, 국소화, 상호작용, 분해, 및 활성을 조절할 수 있다. 전형적인 번역후 변형은 절단, 재접힘 및/또는 화학적 변형 예컨대 메틸화, 아세틸화 또는 글리코실화를 포함할 수 있다.
개별 mRNA 작제물 상에 존재하고, 전달 입자(본원의 다른 곳에 기재된 바와 같음)와 회합되도록 제형화되는 경우, 이들은 상이한 mRNA 작제물이 동일한 개별 전달 입자와 회합되도록 공동 제형화될 수 있거나, 상이한 mRNA 작제물이 상이한 전달 입자와 회합되도록 개별적으로 제형화될 수 있다.
mRNA를 직접 세포에 전달하면 세포에서 폴리펩티드 및/또는 단백질과 같은 원하는 유전자 산물의 직접 제어가능한 번역을 허용한다. mRNA의 제공은 구체적으로 miRNA 매개 제어와 같은 세포 발현 조절 메커니즘의 사용을 허용할 뿐만 아니라(하기 구체적 구현예에서 상세히 설명된 바와 같음), 에피솜 또는 게놈적으로 삽입된 DNA 벡터를 제공할 수 있는 표적 세포의 전사체에 대한 잠재적으로 영구적인 변화보다 생성물의 유한하고 고갈가능한 공급을 나타낸다.
본 발명의 구현예에서, 전체로서 핵산 서열에 조직 특이성, 및 안정성을 부여할 수 있는 하나 이상의 비번역 영역(UTR)과의 작동적 조합으로 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 mRNA 서열이 제공된다. '조직 특이성'이란, mRNA에 의해 암호화된 단백질 산물의 번역이 UTR의 존재에 따라 조절됨을 의미한다. 조절은 mRNA의 단백질로의 검출가능한 번역을 허용하거나, 감소시키거나 심지어 차단하는 것을 포함할 수 있다. UTR은 시스로, 즉, 동일한 폴리뉴클레오티드 가닥 상에서 mRNA에 직접 연결될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 유전자 산물을 코딩하는 제1 서열이 제공되고, 전체로서 핵산 서열에 조직 특이성을 부여하는 하나 이상의 UTR을 포함하는, 제1 서열의 일부에 혼성화하는 추가의 제2 서열이 제공된다. 이 후자 구현예에서, UTR은 유전자 산물을 트랜스(trans)로 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 구체적 구현예에 따르면, 비병적 조직, 예를 들어 건강한 간세포, CNS, 근육, 피부 등에서 유전자 산물의 발현을 방지하거나 감소시키는 데 필요한 것으로 이에 작동가능하게 연결된 이러한 연관된 핵산 서열을 포함하는 mRNA가 제공된다. mRNA는 이하에서 '코딩 mRNA'로 지칭된다. 이와 같이, 5' 캡, 및 리보솜 모집 및 조직 및/또는 기관 특이적 발현(전형적으로, ORF에 대해 3'에 배타적으로 위치하지 않음)에 필요한 UTR, 뿐만 아니라 각각 하나 이상의 ORF를 정의하는 시작 및 정지 코돈을 포함하는 이 코딩 mRNA 작제물, 또는 전사체가 제공된다. 작제물이 전신으로 또는 국소화된 투여를 통해 비병적 간, 폐, 췌장, 유방, 뇌/CNS, 신장, 비장, 근육, 피부 및/또는 결장-GI관에 도입되는 경우, 유전자 산물의 발현이 방지되거나 감소된다. 대조적으로, 전술된 기관 내에 포함되는 신생물성 또는 달리 병적 세포는 전형적으로 다소 상이한 miRNA 전사체를 보유하는 정상적인 비병적 세포 발현 패턴에 순응하지 않는다. mRNA에 의해 암호화된 폴리펩티드(들)는 이러한 비정상적인 세포에서 특이적으로 번역되지만 이웃하는 건강한 세포 또는 비병적 세포에서는 번역되지 않거나 더 적은 정도로 번역된다. mRNA 작제물을 상기 언급된 기관에 전달하는 것은 본원에 기재된 바와 같은 미립자 전달 플랫폼을 통해, 또는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방식으로 달성될 수 있다. 세포 유형 특이적 발현은 하기에 보다 상세히 기재된 것들과 같은 마이크로RNA 조절 메커니즘을 통해 매개될 수 있다.
본 발명의 추가의 구현예에 따르면, 항원에 대한 면역 반응을 생성하는 데 필요하지 않은 조직 또는 기관, 예를 들어 간세포, CNS, 근육, 피부, 신장 등에서 유전자 산물의 발현을 방지하거나 감소시키는 데 필요한 것으로 이에 작동가능하게 연결된 이러한 연관된 핵산 서열을 포함하는 mRNA가 제공된다. 5 캡, 뿐만 아니라 리보솜 모집 및 조직 및/또는 기관 특이적 발현(전형적으로, ORF에 대해 3'에 배타적으로 위치하지 않음)에 필요한 하나 이상의 UTR, 뿐만 아니라 각각 하나 이상의 ORF를 정의하는 시작 및 정지 코돈을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 코딩 mRNA 작제물, 또는 전사체가 제공된다. 작제물이 전신으로 또는 국소화된 투여를 통해 대상체에게 도입되는 경우, 유전자 산물의 발현은 전형적으로 면역 반응에 필요하지 않은 세포 및 조직에서 방지되거나 감소된다. 대조적으로, 체내에 또는 전술된 기관에 포함된 상이한 유형의 수지상 세포(DC)를 포함하는, T 세포, B 세포 또는 항원 제시 세포(APC)와 같은 면역 세포는 상이한 miRNA 전사체를 보유한다. mRNA에 의해 암호화된 폴리펩티드(들)는 이들 면역 세포에서 특이적으로 번역되지만 이웃하는 건강한 세포 및 조직에서 번역되지 않거나 더 적은 정도로 번역된다. mRNA 작제물을 상기 언급된 세포 및 조직에 전달하는 것은 본원에 기재된 바와 같은 미립자 전달 플랫폼을 통해, 또는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방식으로 달성될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은 '치료적 성분' 또는 '치료제'는 치료적 개입의 일부로서 개별 인간 또는 다른 동물에게 투여될 때, 해당 개별 인간 또는 다른 동물에 대한 치료적 효과에 기여하는 분자, 물질, 세포 또는 유기체를 지칭한다. 치료적 효과는 치료적 성분 그 자체, 또는 치료적 개입의 또 다른 성분에 의해 유발될 수 있다. 치료적 성분은 코딩 핵산 성분, 특히 mRNA일 수 있다. 코딩 핵산 성분(들)은 하기 정의된 바와 같이, 치료적 강화 인자를 코딩할 수 있다. 치료적 성분은 또한 약물, 임의적으로 화학요법 약물 예컨대 소분자 또는 단클론 항체(또는 이의 단편)을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 치료제는 바이러스 벡터와 같은 치료적 바이러스를 포함한다.
용어 '치료적 효과'는 대상체에게 투여된 물질, 분자, 조성물, 세포 또는 유기체를 포함하는 약학적 또는 치료적 활성제에 의해 유발되는 동물 대상체, 전형적으로 인간에서의 국소 또는 전신 효과를 지칭하고, 용어 '치료적 개입'은 이러한 물질, 분자, 조성물, 세포 또는 유기체의 투여를 지칭한다. 따라서 용어는 동물 또는 인간 대상체에서 질환의 진단, 치유, 경감, 치료 또는 예방 또는 원하는 신체적 또는 정신적 발달 및 상태의 향상에 사용하기 위해 의도된 임의의 제제를 의미한다. 어구 '치료적 유효량'은 임의의 치료에 적용가능한 합리적인 이익/위험 비로 원하는 국소 또는 전신 효과를 생성하는 이러한 제제의 양을 의미한다. 특정 구현예에서, 제제의 치료적 유효량은 치료적 지수, 용해도 등에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 본 발명의 특정 치료제는 이러한 치료에 적용가능한 합리적인 이익/위험 비를 생성하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 감염성 질환 또는 암을 포함하는 질환 치료의 구체적 맥락에서, '치료적 효과'는 감염성 병원성 유기체 역가 감소, 유익한 세포 바이오마커 증가(예를 들어 백혈구 수 증가), 고형 종양 부피 감소, 암 세포 수 감소, 관찰된 전이 수 감소, 기대 수명 증가, 암 세포 증식 감소, 암 세포 생존 감소, 종양 세포 마커 발현 감소, 및/또는 병태와 연관된 다양한 생리학적 증상 개선을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있다. 백신접종을 통한 예방에 의해서와 같이 바이러스, 박테리아 또는 기생충 감염의 치료에 대한 구체적 맥락에서, '치료적 효과'는 병원체 공격에 대한 전체 또는 부분 저항성, 인간 또는 동물 대상체에서 병원체에 대한 순환 항체의 존재, 또는 백신 효능의 다른 알려진 측정에 의해 나타날 수 있다.
일 구현예에서, 요법이 투여되는 대상체는 포유동물(예를 들어, 설치류, 영장류, 비인간 포유동물, 사육 동물 또는 가축, 예컨대 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 소, 말, 양, 염소 등)이고, 적합하게 인간이다. 추가의 구현예에서, 대상체는 암과 같은 질환의 동물 모델이다. 예를 들어, 동물 모델은 인간 유래 암, 적합하게 간, 폐, 췌장, 유방, 뇌, 신장, 근육, 피부 및/또는 결장-GI관 암의 동소 이종이식편 동물 모델일 수 있다. 추가의 구현예에서, 대상체는 감염성 질환의 동물 모델이다. 예를 들어, 동물 모델은 하나 이상의 바이러스, 박테리아, 진균, 프리온 또는 진핵생물 기생충으로 감염될 수 있거나, 이러한 병원체로 감염된 것일 수 있다.
본 발명의 방법의 구체적 구현예에서, 대상체는 치료적 바이러스 요법, 화학요법, 방사선 요법, 표적화 요법, 백신접종, 및/또는 항면역 체크포인트 요법과 같은 치료적 치료를 아직 겪지 않았다. 또한 또 다른 구현예에서, 대상체는 상기 언급된 요법과 같은 치료적 치료를 겪었다. 또한 추가의 구현예에서, 대상체는 상기 언급된 요법과 같은 치료적 치료를 겪고 있다.
추가의 구현예에서, 대상체는 암성 또는 전암성 조직을 제거하기 위해 외과적 처치를 받았다. 다른 구현예에서, 암성 조직은 제거되지 않았으며, 예를 들어, 암성 조직은 외과적 개입이 불가능한 신체 영역, 예컨대 외과적 개입이 적용된 경우 대상체의 생명을 위태롭게 할 수 있는 조직 또는 기관, 또는 외과적 절차가 영구적인 피해 또는 심지어 치명상의 상당한 위험을 유발할 수 있는 영역에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 코딩 mRNA 작제물은 '치료적 강화 인자'를 코딩할 수 있다. 본 발명에 따르면 치료적 강화 인자는 주어진 세포, 적합하게 표적 세포에 대한 치료적 효과를 발휘하기 위해, 또 다른 공동 투여된 치료제의 능력을 향상시키거나 가능하게 할 수 있는 유전자 산물 또는 폴리펩티드이다. 표적 세포에 또는 부근에 도입될 때, 치료적 강화 인자의 발현은 공동 투여된 치료제와 협력하여 제제의 치료적 활성을 가능하게 하거나 향상시킬 수 있다. 다른 구현예에서 치료적 강화 인자는 공동으로 또는 순차적으로 투여된 백신에 대한 애쥬번트로서 작용할 수 있다. 애쥬번트는 대상체의 선천성 면역계를 활성화시키는 데 사용될 수 있는 약리학적 또는 면역학적 물질이다. 이 방식으로 이들은 대상체의 선천성 면역계가 병원체로부터 감염에 보다 빠르게 반응할 수 있게 한다. 애쥬번트는 또한 바이러스 또는 박테리아 감염과 같은 특정 감염 인자에 특이적인 적응성 면역 반응을 자극하는 역할을 할 수 있다. 일부 애쥬번트는 또한 효과적인 항원 제시를 지시하고 T 헬퍼 유형-1(Th1) 면역 반응을 자극하고 향상시키는 데 효과적일 수 있다. 대안적으로, 치료적 강화 인자는 백신 제형에서 활용되는 변형된 아데노바이러스와 같은 공동으로 또는 순차적으로 투여된 약독화 또는 변형된 바이러스에 대한 애쥬번트로서 작용할 수 있다. 비활성화 바이러스 또는 생 약독화 바이러스 백신는 전형적으로 면역 반응을 촉진하기 위해 애쥬번트가 필요할 것이다. 또한, 재조합 단백질-기반 서브유닛 백신의 고유한 면역원성은 또한 상대적으로 낮고, 공동 투여된 애쥬번트가 바람직하다. 따라서, 본 발명의 구체적 구현예에서 애쥬번트 조성물의 역할은 제시된 항원에 반응하여 면역 세포에 의해 생성된 중화 항체의 수준을 증가시키는 것이다.
다중 치료적 강화 인자는 본 발명의 구체적 구현예에 따라 조성물에 조합될 수 있다. 이러한 구현예에서, 각 치료적 강화 인자에 대한 코딩 서열은 개별 mRNA 분자에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 치료적 강화 인자에 대한 서열은 동일한 mRNA 분자 상에 존재할 수 있다. 이러한 경우 폴리시스트로닉 mRNA 분자는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)와 같은 모든 코딩된 서열의 발현에 필요한 서열을 추가로 포함한다.
다중 상이한 mRNA 분자가 하나 이상의 전달 시스템에 포함되는 구현예에서, 각 전달 시스템, 예를 들어 입자, 리포솜, 바이러스 벡터 시스템은 '페이로드(payload)'로서 하나 또는 하나 초과 유형의 mRNA 분자를 포함할 수 있는 것으로 고려되며; 즉, 특정 구현예에서 모든 전달 페이로드가 반드시 상기 구현예에 제공된 모든 mRNA 분자를 포함하지 않을 것이다. 이 방식으로, 또한 상이한 전달 시스템 및 이들의 연관된 서열을 본원에 기재된 표적화제를 사용하여, 상이한 표적 세포에 지시하는 것이 가능한 것으로 간주된다.
유사하게, 개별 mRNA 작제물이 제공되고, 이들이 전달 입자와 회합되도록 제형화되는(본원의 다른 곳에 기재된 바와 같음) 임의의 구현예에서, 이러한 상이한 mRNA 작제물이 동일한 전달 입자와 회합될 수 있도록 공동 투여될 수 있거나(즉, 상이한 mRNA는 동일한 과정에서 전달입자와 함께 패키징될 수 있음), 상이한 mRNA 작제물이 상이한 전달 입자와 회합될 수 있도록 개별적으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예의 mRNA 작제물은 예를 들어 DNA 플라스미드일 수 있는 폴리뉴클레오티드 발현 작제물로부터 합성될 수 있다. 이 발현 작제물은 mRNA 작제물의 전사가 발생할 수 있도록, 전사 개시 및 상응하는 종결 서열에 필요한 임의의 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 발현 작제물은 자체적으로 본 발명의 구현예를 포함하는 것으로 고려된다.
사이토카인
본 발명의 구현예에서 mRNA 작제물은 사이토카인, 예를 들어, 애쥬번트로서 작용하는 사이토카인에 대한 유전자 산물을 암호화할 수 있다.
사이토카인은 세포 신호전달에 중요한 작은 단백질의 광범위한 범주이다. 사이토카인은 면역조절제로서 자가분비, 측분비 및 내분비 신호전달에 관여하는 것으로 나타났다. 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 및 종양 괴사 인자를 포함한다. 사이토카인은 대식세포, B 림프구, T 림프구 및 비만 세포와 같은 면역 세포, 뿐만 아니라 내피 세포, 섬유아세포, 및 다양한 기질 세포를 포함하는 광범위한 세포에 의해 생성되며; 주어진 사이토카인은 하나 초과의 세포 유형에 의해 생성될 수 있다. 이들은 세포 표면 수용체를 통해 작용하고 특히 면역계에 중요하며; 사이토카인은 체액성 및 세포-기반 면역 반응 사이의 균형을 조절하고, 이들은 특정 세포 집단의 성숙, 성장, 및 반응성을 조절한다. 사이토카인은 인터류킨, 림포카인, 모노카인, 인터페론, 콜로니 자극 인자 및 케모카인으로서 분류되었다.
인터류킨(IL)은 백혈구 세포(백혈구)에 의해 발현되는 것으로 처음 보여진 사이토카인(분비된 단백질 및 신호 분자) 그룹이다. 면역계의 기능은 대부분 인터류킨에 의존하고, 이들 중 다수의 드문 결핍이 설명되었으며, 모두 자가면역 질환 또는 면역 결핍을 특징으로 한다. 대부분의 인터류킨은 헬퍼 CD4 T 림프구, 뿐만 아니라 단핵구, 대식세포, 및 내피 세포를 통해 합성된다. 이들은 T 및 B 림프구, 및 조혈 세포의 발달 및 분화를 촉진한다. 인터류킨은 인터류킨 1(IL-1), 인터류킨 2(IL-2), 인터류킨 3(IL-3), 인터류킨 4(IL-4), 인터류킨 5(IL-5), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 7(IL-7), 인터류킨 8(IL-8), 인터류킨 9(IL-9), 인터류킨 10(IL-10), 인터류킨 11(IL-11), 인터류킨 12(IL-12), 인터류킨 13(IL-13), 인터류킨 14(IL-14), 인터류킨 15(IL-15), 인터류킨 16(IL-16), 인터류킨 17(IL-17), 인터류킨 18(IL-18), 인터류킨 19(IL-19), 인터류킨 20(IL-20), 인터류킨 21(IL-21), 인터류킨 22(IL-22), 인터류킨 23(IL-23), 인터류킨 24(IL-24), 인터류킨 25(IL-25), 인터류킨 26(IL-26), 인터류킨 27(IL-27), 인터류킨 28(IL-28), 인터류킨 29(IL-29), 인터류킨 30(IL-30), 인터류킨 31(IL-31), 인터류킨 32(IL-32), 인터류킨 33(IL-33), 인터류킨 35(IL-35) 및 인터류킨 36(IL-36)을 포함한다.
IL-1 알파 및 IL-1 베타는 면역 반응, 염증성 반응, 및 혈액생성의 조절에 참여하는 사이토카인이다. IL-2는 반응성 T 세포의 증식을 유도하는 림포카인이다. 또한, 이는 성장 인자 및 항체 생산 자극제로서 수용체-특이적 결합을 통해 일부 B 세포 상에서 작용한다. IL-3은 과립구 및 대식세포의 생산, 분화 및 기능을 제어함으로써 혈액생성을 조절하는 사이토카인이다. IL-4는 B 세포의 증식 및 분화 및 T 세포 증식을 유도한다. IL-5는 호산구 성장 및 활성화를 조절한다. IL-6은 B 세포d의 면역글로불린-분비 세포로의 최종 분화 뿐만 아니라, 골수종/형질세포종 성장, 신경 세포 분화, 및, 간세포에서 급성기 반응물을 유도하는 데 필수적인 역할을 한다. IL-7은 B- 및 T-세포 계통 둘 다의 초기 림프구 세포에 대한 성장 인자로서 역할을 하는 사이토카인이다. IL-8은 호중구 주화성을 유도한다. IL-9는 헬퍼 T 세포의 IL-2 독립적 및 IL-4 독립적 성장을 지원하는 사이토카인이다. IL-10은 활성화된 대식세포 및 헬퍼 T 세포에 의해 생성된 IFN-감마, IL-2, IL-3, TNF, 및 GM-CSF를 포함하는 다수의 사이토카인의 합성을 억제하는 단백질이다. IL-11은 거대핵세포형성을 자극하여, 혈소판 생성 증가, 뿐만 아니라 파골세포 활성화, 상피 세포 증식 및 세포자멸사 억제, 및 대식세포 매개자 생산 억제를 야기한다. IL-12는 다양한 세포내 병원체에 대한 정상적인 숙주 방어를 포함하여, Th1 세포 면역 반응의 자극 및 유지에 관여한다. IL-13은 염증 및 면역 반응 조절에 중요할 수 있는 다면 발현성 사이토카인이다. IL-14는 B 세포의 성장 및 증식을 제어하고 Ig 분비를 억제한다. IL-15는 자연 살해 세포의 생성을 유도한다. IL-16은 CD4+ 화학주성물질이다. IL-17은 활성화된 기억 T 세포에 의해 생성된 강력한 전염증성 사이토카인이다. IL-18은 IFNg 생산을 유도하고 자연 살해 세포 활성을 증가시킨다. IL-20은 각질세포의 증식 및 분화를 조절한다. IL-21은 CD8+ T 세포의 활성화 및 증식을 공동 자극하고, NK 세포독성을 증대시키고, CD40-구동된 B 세포 증식, 분화 및 이소형 전환을 증대시키고, Th17 세포의 분화를 촉진한다. IL-22는 상피 세포로부터 디펜신스(defensins)의 생성을 자극하고 STAT1 및 STAT3을 활성화시킨다. IL-23은 IL-17 생산 세포의 유지에 관여하고 혈관형성을 증가시키지만 CD8 T-세포 침윤을 감소시킨다. IL-24는 세포 성장, 염증성 사이토카인 발현에 영향을 미침으로써 종양 억제, 상처 치유 및 건선에서 중요한 역할을 한다. IL-25는 호산구 확장을 자극하는 IL-4, IL-5 및 IL-13 생산을 유도한다. IL-26은 IL-10 및 IL-8의 분비 및 상피 세포 상에서 CD54의 세포 표면 발현을 향상시킨다. IL-27은 B 림프구 및 T 림프구의 활성을 조절한다. IL-28은 바이러스에 대한 면역 방어에서 역할을 한다. IL-29는 미생물에 대한 숙주 방어에서 역할을 한다. IL-30은 IL-27의 하나의 쇄를 형성한다. IL-31은 피부의 염증에서 역할을 할 수 있다. IL-32는 단핵구 및 대식세포가 TNF-α, IL-8 및 CXCL2를 분비하도록 유도한다. IL-33은 헬퍼 T 세포가 유형 2 사이토카인을 생성하도록 유도한다. IL-35는 T 헬퍼 세포 활성화의 억제를 유도한다. IL-36은 DC 및 T 세포 반응을 조절한다.
림포카인은 림프구로서 알려진 면역 세포의 한 유형에 의해 생성되는 사이토카인의 하위세트이다. 이들은 전형적으로 T 세포에 의해 생성되어 세포 사이의 신호전달에 의해 면역계 반응을 지시하는 단백질 매개자이다. 림포카인은 대식세포 및 다른 림프구를 포함하는 다른 면역 세포를 감염된 부위로 유인하고 면역 반응을 일으키기 위한 후속 활성화할 준비를 포함하는 많은 역할을 한다. 림포카인은 B 세포가 항체를 생성하도록 돕는다. T 헬퍼 세포에 의해 분비되는 중요한 림포카인은 IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 인터페론 감마(IFNγ)를 포함한다.
GM-CSF는 줄기 세포를 자극하여 과립구(호중구, 호산구, 및 호염기구) 및 단핵구를 생성한다. 단핵구는 순환에서 빠져 나와 조직으로 이동하며, 그 결과 대식세포 및 수지상 세포로 성숙한다. 따라서, 이는 면역/염증 캐스케이드의 일부이며, 이에 의해 소수의 대식세포의 활성화는 감염과 싸우는 데 중요한 과정인 그들의 수 증가로 빠르게 이어질 수 있다. GM-CSF는 또한 호중구 이동을 향상시키고 세포 표면 상에서 발현된 수용체의 변경을 유발한다. IFNγ는 감염에 대한 선천성 및 적응성 면역에 중요한 사이토카인이다. IFNγ는 대식세포의 활성자 및 주요 조직적합성 복합체 클래스 II 분자 발현의 유도제이다. 면역계에서 IFNγ의 중요성은 부분적으로 바이러스 복제를 직접적으로 억제하는 능력으로부터 기인하고, 가장 중요하게는 면역자극성 및 면역조절 효과로부터 기인한다.
모노카인은 주로 단핵구 및 대식세포에 의해 생성되는 사이토카인의 한 유형이다. 일부 모노카인은 IL-1, 종양 괴사 인자-알파, 알파 및 베타 인터페론, 및 콜로니 자극 인자를 포함한다. 종양 괴사 인자(TNF)는 세포 신호전달을 위해 면역계에 의해 사용되는 작은 단백질인 사이토카인이다. TNF는 감염에 대한 염증 반응의 일부로서 다른 면역계 세포를 모집하도록 방출된다. 인터페론(IFN)은 여러 바이러스의 존재에 반응하여 숙주 세포에 의해 제조되고 방출되는 신호전달 단백질 그룹이다. IFN-α 단백질은 주로 형질세포양 수지상 세포(pDC)에 의해 생성되고 주로 바이러스 감염에 대한 선천성 면역에 관여한다. IFN-β 단백질은 섬유아세포에 의해 다량으로 생성되고 주로 선천성 면역 반응에 관여하는 항바이러스 활성을 갖는다. 콜로니-자극 인자(CSF)는 조혈 줄기 세포의 표면 상의 수용체 단백질에 결합하여, 세포를 증식시키고 혈액 세포로 분화할 수 있는 세포내 신호전달 경로를 활성화시키는 분비된 당단백질이다.
케모카인은 근처의 반응성 세포에서 지시된 주화성을 유도하는 능력을 갖는 작은 사이토카인 계열이다. 케모카인은 기능적으로 항상성인 것 및 염증성인 것으로 나눠진다. 항상성 케모카인은 특정 조직에서 구성적으로 생성되고 기저 백혈구 이동을 담당하며 CCL14, CCL19, CCL20, CCL21, CCL25, CCL27, CXCL12 및 CXCL13을 포함한다. 염증성 케모카인은 병리학적 조건 하에 형성되고 면역 세포를 염증 부위로 유인하는 염증성 반응에 능동적으로 참여하며 CXCL-8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, CXCL10을 포함한다.
인터페론(IFN)은 여러 바이러스의 존재에 반응하여 숙주 세포에 의해 만들어지고 방출되는 신호전달 단백질 한 그룹이다. IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ 및 IFN-ω는 IFN-α/β 수용체 복합체에 결합하고 표적 세포 상의 특이적 수용체에 결합하여, 바이러스가 RNA 및 DNA를 생산하고 복제하는 것을 방지하는 단백질의 발현을 야기한다. IFN-γ는 세포독성 T 세포 및 유형-1 T 헬퍼 세포에 의해 방출되지만, IFN-γ는 유형-2 T 헬퍼 세포의 증식을 차단한다.
성장 인자는 세포 증식, 상처 치유, 및 때때로 세포 분화를 자극할 수 있는 자연 발생 물질이다. 성장 인자는 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), 자가분비 운동성 인자, 골 형태발생 단백질(BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP9, BMP10, BMP11, BMP12, BMP12, BMP14 및 BMP15), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 억제 인자(LIF), 인터류킨-6(IL-6), 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 상피 성장 인자(EGF), 에프린(Ephrin) A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 에프린 B3, 에리트로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 섬유아세포 성장 인자 3(FGF3), 섬유아세포 성장 인자 4(FGF4), 섬유아세포 성장 인자 5(FGF5), 섬유아세포 성장 인자 6(FGF6), 섬유아세포 성장 인자 7(FGF7), 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8), 섬유아세포 성장 인자 9(FGF9), 섬유아세포 성장 인자 10(FGF10), 섬유아세포 성장 인자 11(FGF11), 섬유아세포 성장 인자 12(FGF12), 섬유아세포 성장 인자 13(FGF13), 섬유아세포 성장 인자 14(FGF14), 섬유아세포 성장 인자 15(FGF15), 섬유아세포 성장 인자 16(FGF16), 섬유아세포 성장 인자 17(FGF17), 섬유아세포 성장 인자 18(FGF18), 섬유아세포 성장 인자 19(FGF19), 섬유아세포 성장 인자 20(FGF20), 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21), 섬유아세포 성장 인자 22(FGF22), 섬유아세포 성장 인자 23(FGF23), 소 태아 소마토트로핀(FBS), 신경교 세포주-유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린(Neurturin), 퍼셉핀(Persephin), 아르테민(Artemin), 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간종양 유래 성장 인자(HDGF), 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 인슐린 유사 성장 인자-2(IGF-2), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, 각질세포 성장 인자(KGF), 이동-자극 인자(MSF), 대식세포-자극 단백질(MSP), 미오스타틴(Myostatin)(GDF-8), 뉴레굴린(Neuregulin) 1(NRG1), 뉴레굴린 2(NRG2), 뉴레굴린 3(NRG3), 뉴레굴린 4(NRG4), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀(Neutrophin)-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 태반 성장 인자(PGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 레날라제(RNLS) - 항-세포자멸사 생존 인자, T-세포 성장 인자(TCGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 Wnt 신호전달 경로 단백질을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 인터류킨 12(IL-12)는 T 세포 및 NK 세포를 포함하는 면역 세포에 대한 면역 자극 사이토카인이다. IL-12는 포식 세포 뿐만 아니라 항원-제시 세포에 의해 특이적으로 생성되고 항종양 면역 반응을 향상시키는 이종이량체성 사이토카인이다. IL-12의 강력한 면역 자극 특성의 결과는 전신 투여가 환자에서 임상 적용을 제한하는 심각한 부작용을 야기할 수 있다는 것이다. 종양 부위에서 조작된 NK92에 의한 IL-12의 발현은 키메라 항원 수용체(CAR)-변형된 T 세포의 항종양 활성을 증가시키는 것으로 나타났다(Luo 등 Front Oncol.(2019) Dec 19;9:1448). 종양에서 IL-12 유도된 IFNγ 축적은 또한 T-림프구 또는 다른 숙주 면역 세포(예를 들어 NK 세포)의 종양으로의 침투를 촉진하여, 치료적 효과를 향상시키는 것으로 여겨진다(Chinnasamy D. 등 Clin Cancer Res 2012:18 / Chmielewski M. 등 Cancer Res 2011;71 / Kerkar SP. 등 J Clin Invest 2011; 121 I Jackson HJ. 등 Nat Rev Clin Oncol 2016;13).
본 발명의 구현예에서 본 발명의 조성물은 기능적 IL-12 또는 이의 유사체 또는 유도체를 암호화하는 적어도 하나의 ORF를 포함하는 mRNA를 포함한다. 야생형 IL-12는 35kDa IL-12A 및 40 kDa IL-12B 서브유닛의 이종이량체로 구성되므로, ORF는 이러한 서브유닛 중 하나를 포함할 수 있고 다른 서브유닛을 암호화하는 또 다른 mRNA와 조합하여 투여되어 세포에서 기능적 IL-12의 조립을 허용할 수 있다. 대안적으로, 기능적 IL-12는 단일 ORF 내에 두 서브유닛을 포함하는 IL-12의 변형된 단일 쇄 버전 형태일 수 있다(예를 들어, 서열번호: 59 참조).
본 발명의 일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 종양 미세환경에서 일시적으로 발현된다. 다른 구현예에서, 코딩 mRNA는 APC 또는, 예를 들어, 활성화된 T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포의 생존, 증식, 및/또는 분화를 조절하는 데 관여하는 사이토카인 또는 다른 유전자 산물을 암호화한다. 비제한적인 예로서, 코딩 mRNA는 본원에 개시된 임의의 사이토카인, 보다 특히 IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17, IL-33, IL-35, TGF-베타, TNFα, TNFβ, IFNα, IFNβ, IFN감마, 및 이의 임의의 조합과 같은 사이토카인을 암호화할 수 있다.
마이크로RNA
마이크로RNA(miRNA)는 각각 약 20 내지 25 개의 뉴클레오티드를 함유하는 비코딩 RNA 부류이며, 이 중 일부는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역(3' UTR)에서 상보적인 표적 서열에 결합하여, 침묵으로 이어짐으로써 유전자 발현의 전사후 조절에 관여하는 것으로 여겨진다. 이러한 miRNA 상보적인 표적 서열은 또한 본원에서 miRNA 결합 부위, 또는 miRNA 결합 부위 서열로 지칭된다. 특정 miRNA는 발현 시 매우 조직-특이적이며; 예를 들어, miRNA-122 및 이의 변이체는 간에서 풍부하고 다른 조직에서 드물게 발현된다(Lagos-Quintana 등 Current Biology. 2002; 12: 735-739).
따라서 miRNA 시스템은 세포에 도입된 핵산이 표적 조직의 선택된 세포 유형에서 침묵되고, 다른 세포 유형에서 발현될 수 있는 강력한 플랫폼을 제공한다. 특정한 주어진 miRNA에 대한 표적 서열을 표적 세포에, 특히 UTR 내에 도입될 mRNA 작제물에 포함함으로써, 특정 도입된 유전자의 발현은 일부 세포 유형에서 감소되거나 실질적으로 제거될 수 있는 반면, 다른 세포 유형에서는 유지될 수 있다(Brown and Naldini, Nat Rev Genet. 2009; 10(8): 578-585).
본 발명의 구체적 구현예에 따르면 복수의 이러한 miRNA 표적 서열이 기관 보호 서열 내에 포함될 수 있으며, 이어서 mRNA 작제물에 포함되는 것으로 고려된다. 복수의 miRNA 표적 서열이 존재하는 경우, 이 복수는 예를 들어 2 개 초과, 3 개 초과, 전형적으로 4 개 초과의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 이러한 miRNA 표적 서열은 mRNA 작제물 내의 명시된 UTR 내에 순차적으로, 탠덤으로 또는 미리 결정된 위치에 배열될 수 있다. 다중 miRNA 표적 서열은 전체로서 기관 보호 서열의 기능을 지원하거나 가능하게 하는 역할을 하는 보조 서열로 분리될 수 있다. 예로서, 적합한 보조 서열은 링커 또는 스페이서 서열로 이루어질 수 있거나, 무작위 배정될 수 있거나, 특정 서열, 예를 들어, "uuuaaa"를 포함할 수 있지만, 다른 스페이서 서열이 또한 사용될 수 있다. 스페이서의 길이는 달라질 수 있고, 스페이서 서열의 반복을 포함할 수 있으며, 예를 들어 스페이서 "uuuaaa"는 연결될 각각의 표적 서열과 임의의 표적 서열 사이에 1 회(즉 "uuuaaa'"), 2 회(즉 "uuuaaauuuaaa" - 서열번호: 1), 3 회, 4 회, 5 회, 또는 6 회 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 결합 부위 서열 사이에 존재하지 않을 수 있다.
miRNA-122는, 건강한 비병적 간 조직에서의 풍부함에도 불구하고, 대부분의 간암 뿐만 아니라 병적 세포에서 감소된다(Braconi 등 Semin Oncol. 2011; 38(6): 752-763, Brown and Naldini, Nat Rev Genet. 2009;10(8): 578-585). 상기 언급된 방법에 의해, 표적 조직이 간인 경우, 그들의 3' UTR에 miRNA-122 표적 서열(예를 들어, 서열번호: 1)을 포함함으로써, 도입된 mRNA 서열의 번역이 암성 간 세포에서 가능하게 되고 형질감염된 건강한 세포에서 감소되거나 실질적으로 제거될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
유사한 방식으로, 다른 miRNA 표적 서열을 사용함으로써, 다른 기관에서 암 세포와 건강한 세포 사이에 이러한 mRNA의 차등 번역이 또한 가능하다. 적합한 후보는 다음에 대한 표적 부위를 포함한다(그러나 이에 제한되지 않음): miRNA-1, miRNA-125, miRNA-199, miRNA-124a, miRNA-126, miRNA-Let7, miRNA-375, miRNA-141, miRNA-142, miRNA-143, miRNA-145, miRNA-148, miRNA-194, miRNA-200c, miRNA-34a, miRNA-192, miRNA-194, miRNA-204, miRNA-215 및 miRNA-30 패밀리(예를 들어, miRNA-30 a, b, 또는 c).
표 2는 발현이 특정 기관 및/또는 조직에서 입증되었고, 여러 경우에 차등 발현이 건강한 세포와 병적 세포 사이에서 입증된 mRNA 서열의 추가의(비제한적인) 예를 입증한다.
miRNA-1, miRNA-133a 및 miRNA-206은 근육 및/또는 심근-특이적 miRNA의 예로서 기재되었다(Sempere 등 Genome Biology. 2004; 5:R13; Ludwig 등 Nucleic Acids Research. 2016; 44(8): 3865-3877). miRNA-1은 또한 질환에서 조절장애가 있는 것으로 입증되었으며, 예를 들어 miRNA-1의 하향조절이 경색된 심장 조직에서 검출되었지만(Bostjancic E, 등 Cardiology. 2010; 115(3): 163-169), miRNA-1의 급격한 감소가 또한 횡문근육종 세포주에서 검출되었다(Rao, Prakash K 등 FASEB J. 2010;24(9):3427-3437). miRNA-1, miRNA-133a 및 miRNA-206의 사용은 특히 본 발명에 따른 조성물이 근육내로 투여되어, 원하는 경우 국소 정상 근세포에서 발현을 감소시키는 경우에 고려될 수 있다.
miRNA-125는 표 2에 제시된 바와 같이 다수의 조직에서 발현되고, 간세포 암종(Coppola 등 Oncotarget 2017;8); 유방(Mattie 등 Mol Cancer 2006;5), 폐(Wang 등 FEBS J 2009), 난소(Lee 등 Oncotarget 2016;7), 위(Xu 등 Mol Med Rep 2014;10), 결장(Tong 등 Biomed Pharmacother 2015;75), 및 자궁경부암(Fan 등 Oncotarget 2015;6); 신경아세포종, 수모세포종(Ferretti 등 Int J Cancer 2009;124), 교아세포종(Cortez 등 Genes Chromosomes Cancer 2010;49), 및 망막모세포종(Zhang 등; Cell signal 2016;28)과 같은 여러 고형 종양에서 하향 조절된다.
여러 miRNA 종은 또한 비병적 뇌 세포(예를 들어 뉴런)와 비교하여 교아세포종 다형성 세포에서 차등적으로 발현되며(Zhangh 등 J Miol Med 2009;87 / Shi 등 Brain Res 2008;1236), miRNA-124a는 가장 조절장애가 심한 것 중 하나이다(Karsy 등 Gene Cancer 2012;3; Riddick 등 Nat Rev Neurol 2011;7; Gaur 등 Cancer Res 2007;67 / Silber 등 BMC Med 2008;6).
폐암에서, 최근 메타-분석은 비소세포 폐암에서 Let-7(뿐만 아니라 miRNA-148a 및 miRNA-148b)의 하향조절을 확인하였다(Lamichhane 등 Disease Markers 2018).
유사하게, miRNA-375 발현은 건강한 췌장 세포와 비교하여, 췌장 암 세포에서 하향조절되는 것으로 밝혀졌다(Shiduo 등 Biomedical Reports 2013;1). 췌장에서, miRNA-375 발현은 정상 췌장 세포에서 높지만 병적 및/또는 암성 조직에서 유의하게 낮은 것으로 나타났다(Song, Zhou 등 2013). 이 발현은 암의 단계와 관련되는 것으로 나타났으며, 발현은 암이 진행됨에 따라 추가로 감소하였다. miRNA-375는 3-포스포이노시티드-의존적 단백질 키나제-1(PDK1) mRNA를 표적하여 PI 3-키나제/PKB 캐스케이드에 영향을 미침으로써(El Ouaamari 등 Diabetes 57:2708-2717, 2008), 췌장 베타기포-세포에서 글루코스 유도된 생물학적 반응의 조절에 관여하는 것으로 생각된다. miRNA-375의 항증식 효과는 이러한 추정 작용 모드에 연루되어 있으며, 이는 암 세포에서 하향조절을 설명할 수 있다.
표 2는 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있는 특정 기관 및/또는 조직과 연관된 miRNA의 비제한적인 예를 논의한다. 본 발명은 주어진 miRNA 또는 miRNA 부류가 주어진 기관 또는 기관계 내에서 제2 세포 유형에 비해 제1 세포 유형에서 하향조절되는 경우에만 제한되지 않는다는 것으로 이해될 것이다. 반대로, 세포 유형 사이, 예를 들어 기관 또는 기관계 내에 포함되는 것들, 또는 상이한 기관 또는 기관계 사이에 조절 mRNA의 차등 발현 패턴이 존재한다는 것이 단지 요구된다. miRNA 시스템의 차등 발현은 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 이용되어 세포 사이에서 단백질 산물의 상응하는 차등 번역을 가능하게 하여, 바람직하지 않은 표적외 부작용을 감소시킬 수 있다. 이는 특히 세포 유형 또는 조직 사이에서 mRNA의 차등 발현이 바람직한 구현예에서 사용한다. 예를 들어, 염증 증가가 바람직하지 않은 하나 이상의 건강한 조직, 예컨대 피부, 간, 신장 또는 결장에서가 아니라 주로 면역 세포에서 애쥬번트로서 사용되는 경우, 전염증성 사이토카인을 암호화하는 mRNA를 발현하는 것이 유리할 수 있다.
암과 인접한 건강한 조직 사이에서 mRNA의 차등 발현은 mRNA의 miRNA 침묵의 사용을 식별하고 특성화할 수 있는 모델 시스템을 나타낸다. 건강한 세포와 암 세포 사이에서 유사한 차등 miRNA 발현에 대해 증거가 발견된 암의 예는 유방(Nygaard 등, BMC Med Genomics, 2009 Jun 9;2:35), 난소(Wyman 등, PloS One, 2009;4(4):e5311), 전립선(Watahiki 등, PloS One, 2011; 6(9):e24950), 및 자궁경부암(Lui 등 Cancer Research, 2007 Jul 1;67(13):6031-43)을 포함한다. WO 2017/132552 A1은 다양한 암 세포에서 발현 수준이 상이한 광범위한 miRNA를 기재한다. 피부에서, 건강한 조직과 인접한 흑색종 세포 사이에서 차등 발현 miRNA 발현이 또한 관찰된다.
표 2 - 특정 조직 / 기관 유형과 연관된 miRNA
면역요법으로 환자를 치료하는 것은 표적외 영향의 가능성으로 인해 안전성 문제가 있을 수 있다. 코딩 mRNA 서열의 제공에 의한 특정 폴리펩티드의 발현조차 특정 기관에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 건강한 조직, 예를 들어 간, 뇌, 유방, 폐, 췌장, 결장/GI-관, 피부, 근육, 및 신장을 보호하는 것은 성공적인 임상 적용을 위해 가장 중요하다. 상기 기재된 것과 같은 miRNA는 특정 세포, 조직 및/또는 기관 유형에서 투여된 mRNA의 발현을 감소시켜, 임의의 표적외 영향으로부터 이러한 세포, 조직 및/또는 기관을 보호하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 건강한 근육 및/또는 심근 조직을 보호하기 위한 miRNA-1, miRNA-133a 및/또는 miRNA-206과 같은, 특이적 조직에서 고도로 발현되는 특이적 miRNA에 대한 표적 서열은 건강한 세포를 보호하는 데 사용될 수 있다. 결과적으로, 병적 세포 및 건강한 세포에서 반드시 차등 발현과 연관되지 않은 miRNA 표적 서열을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, miRNA-142 및 miRNA 145는 췌장 조직에서 발현되는 반면, miRNA-9는 이러한 조직에서 높은 발현으로 인해 뇌 및 폐 보호에 사용될 수 있다.
하나 초과의 조직을 보호해야 하는 경우, 다중 miRNA 표적 서열의 조합이 사용된다. 예를 들면, miRNA-122, miRNA-203a, miRNA-1 및 miRNA-30a에 대한 표적 서열은 간, 피부, 근육 및 신장 조직의 세포를 보호하기 위해 함께 사용된다.
따라서, 본 조성물은 지금까지 '실험적' 세포 또는 바이러스 요법의 성공적인 채택을 향상시키고 가능하게 하기 위한 실행 기술 플랫폼을 나타낼 수 있다.
본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명은 요법, 전달 플랫폼(예컨대 상이한 나노입자 조성물), 치료제(예컨대 약물, 백신 및/또는 바이러스), 암호화된 폴리펩티드 및 표적 세포, 조직 또는 기관의 다수의 가능한 조합과 관련하여 구상된다. 이러한 각각 및 모든 가능성은 mRNA 서열에 의해 공급되는 암호화된 폴리펩티드에 대한 최적의 발현을 암시한다.
miRNA 표적 서열의 하나 이상의 특성을 최적화하는 것은 차등 발현을 촉진하여 건강한 기관 보호하는 특정 효능으로 이어질 수 있음이 밝혀졌다. 같은 이유로, 이러한 특성은 구체적 맥락에 따라, 특정 기관, 조직 또는 세포 유형에서 결과적인 차등 발현을 증가 또는 감소시키도록 제어될 수 있다. 다양한 상이한 세포 유형에서 다양한 발현 수준이 바람직한 상황이 있을 수 있고, 표적 서열이 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 특성을 변경시킴으로써, 이러한 결과를 허용하도록 변형될 수 있는 것으로 의도된다. 또한, miRNA 표적 부위 서열은 변형될 수 있으므로 동일한 조직 내에서 또는 상이한 조직에서 하나 초과의 miRNA에 의해 조절된다.
서열 일치: 표적 서열이 상보적인 miRNA 서열과 정확히 일치하는 정도(즉, miRNA 서열과 결합 부위 서열 사이의 불일치 수)는 결과적인 발현 침묵의 효능에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 예를 들어, 정확하거나 완벽한 일치는 miRNA 결합 부위 서열을 보유하는 서열의 보다 빠른 분해를 야기하는 것으로 나타났다(Brown and Naldini, Nat Rev Genet. 2009; 10(8): 578-585. 따라서, 특정 폴리펩티드 산물의 완전하거나, 거의 완전한 침묵이 특정 세포 유형에서 요구되는 경우, 해당 세포 유형과 연관된 miRNA 서열과 정확히 일치하거나, 기껏해야 하나 초과의 염기 쌍 불일치를 갖는 miRNA 표적 서열을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 마찬가지로, 감소되지만 부재하지 않은 발현이 특정 세포 유형에서 바람직한 경우, 이를 허용하기 위해 불일치 수가 증가된 miRNA 결합 부위 서열이 선택될 수 있다. 최종 처리된 성숙 5P 또는 3P miRNA가 있는 줄기-루프 프리-miRNA의 서열 및 밑줄 친 프리-miRNA에서 성숙 miRNA와 이중체를 형성하는 서열, 뿐만 아니라 성숙 miRNA 서열 및 이중체 형성 서열 자체를 포함하는 본원에 언급된 여러 miRNA 서열의 예는 하기 표 3에 나타낸다. 세포에서 유의한 수준으로 발현되는 성숙 miRNA(5P 및 3P 가닥 중 하나 또는 둘 다일 수 있음)는 표시된다(*). 표 4는 프리-miRNA에서 이중체를 형성하는 원래의 불완전하게 일치하는 표적 서열, 이어서 성숙 miRNA 서열 및 변형된 상보적인 표적 서열의 발달을 나타내며, 이는 과발현된 성숙 miRNA 서열과 완벽하게 일치하도록 설계된다. 통상적인 5'에서 3' 방향으로 변형된 표적 서열은 굵은 글씨로 나타낸다.
표 3. 5P 대 3P 성숙 결합 서열을 테스트하여 miRNA 표적 서열의 최적화(*RNA-Seq 데이터베이스 http://www.mirbase.org에서의 과발현된 성숙 miRNA)
표 4. miRNA와의 완벽한 일치를 수득하기 위해 뉴클레오티드 서열을 변형시킴으로써 miRNA 표적 서열의 최적화(*RNA-Seq 데이터베이스 http://www.mirbase.org에서의 과발현된 성숙 miRNA)
miRNA 서열의 변이체 및 다형성이 발견될 수 있고, 유사한 특성을 갖는 miRNA 패밀리가 존재하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서, 특정 miRNA 서열 및 연관된 결합 부위의 모든 적합한 변이체 및 패밀리 구성원은 적절한 경우 사용될 수 있는 것으로 구상된다. 반면에, 분명히 밀접하게 관련된 miRNA 서열은 상이한 발현 프로파일을 가질 수 있으므로(Sun 등, World J Gastroenterol. 2017 Nov 28), 일부 상황에서 문헌을 참조하여, 특이적 치환이 적절한지 여부를 결정할 필요가 있을 것이다. 예를 들어, Let-7은 Let-7a 내지 Let-7k 등으로 표시될 수 있는 다수의 관련 변이체를 갖는 넓은 패밀리의 일부이다. 상기 논의된 바와 같이, 이러한 변이체 및 다형성은 miRNA-매개 침묵을 허용할 때 효능이 달라질 수 있고, 따라서 특정 선택이 특정 세포 유형에서 원하는 침묵 수준을 허용하도록 이루어질 수 있는 것으로 의도된다.
mRNA 작제물에서 복수의 miRNA 표적 서열의 존재는 공급된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 차등 발현의 효능을 개선시킨다. 이론에 얽매이지 않고, 표적 부위의 수가 증가하면, miRNA에 의한 번역 억제 가능성이 증가하는 것으로 생각된다. 다중 miRNA 표적 부위는 실질적으로 동일한 표적 서열의 다중 카피를 포함하여, 중복성을 도입할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 다중 표적 서열은 실질적으로 상이한 서열을 포함하여, mRNA 작제물이 miRNA의 하나 초과의 종에 의해 표적화되게 할 수 있다. 이 방식으로, 공급된 mRNA 작제물의 차등 발현이 하나 초과의 세포 유형, 및/또는 하나 초과의 기관에서 달성될 수 있으므로, 상기 기관 및 이들의 연관된 특이적 miRNA 발현에 대한 논의에서 자명하다. 두 접근법은 동일한 서열 또는 다중 서열 내에서 가능한 것으로 간주된다. 동일한 miRNA 서열에 대한 표적이 되도록 의도되지만, 동일한 패밀리의 상이한 miRNA 변이체, 예를 들어 Let7에 결합하기 위해 차이를 갖는 표적 부위가 포함되는 중간 접근법이 또한 구상된다.
다중 표적 부위의 사용과 연관된 일부 장점은 단일 기관 내에서, 본 발명의 mRNA 서열에 의해 공급되는 폴리펩티드의 차등 발현 효율의 증가를 포함한다. 상이한 결합 부위 서열, 또는 하나 초과의 조직 또는 기관 유형에 적용가능한 서열의 사용은 하나 초과의 기관 또는 조직의 상이한 세포 유형에서 차등 발현이 달성되게 할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 조성물의 전신 투여가 사용되는 경우 바람직할 수 있고, 하나 초과의 기관에서 표적외 효과를 피하는 것이 필요하다.
국소화 또는 표적화 투여조차도, 공급된 mRNA 작제물이 의도되지 않은 기관, 조직, 및/또는 세포에서 발생하거나 축적될 수 있는 것이 가능하다. 특히, 간 및 비장 조직은 이들 기관의 생리학적 기능으로 인해 투여된 조성물을 축적할 수 있다. 이러한 경우에, 표적외 효과를 피하기 위해, 공급된 작제물이 이들 조직에서 발현 감소를 가능하게 할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 반대로, 발현이 일부 기관, 조직 및/또는 세포 유형에서 권장되지만 다른 유형에서는 그렇지 않은 것이 바람직할 수 있으며, 따라서 miRNA 표적 서열의 선택에 의해 달성될 수 있다.
miRNA 표적 부위의 특정 조합은 표적 기관의 특정 조합과 관련될 수 있으며, 상이한 맥락에서 특히 효과적일 수 있다. 예를 들어, 투여된 조성물은 간 및 비장에 축적될 수 있고, 따라서 이러한 기관과 연관된 miRNA 표적 서열의 사용은 조성물과 접촉할 수 있는 건강한 세포에 대한 지시된 보호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 결합 부위 서열은 miRNA-122 및 miRNA-142 각각에 대한 하나 이상의 표적, 또는 간 및 비장 연관된 miRNA 서열의 임의의 다른 조합, 예를 들어 표 2에서 이러한 기관에 대해 나열된 것들의 임의의 조합을 제공할 수 있다. 이러한 조합은 예를 들어, miRNA-122, miRNA-125, 및 miRNA-199(간)로부터 선택된 적어도 하나의 표적 부위의 적어도 하나의 카피; miRNA-192, miRNA-194, miRNA -204, miRNA -215, 및 miRNA-30 a,b,c(신장)로부터 선택된 적어도 하나의 결합 부위 서열의 적어도 하나의 카피; 및 miRNA-142(비장)에 대한 결합 부위의 적어도 하나의 카피를 포함할 수 있다.
이러한 접근법은 전달 나노입자의 특정 변형에 특히 유리할 수 있다. 예를 들면, 리포솜-기반 나노입자는 간, 신장 및 비장에서 축적되는 경향이 있을 수 있다. 다른 나노입자 유형 또는 대안적인 투여 접근법은 상이한 기관 또는 조직에 축적될 수 있거나, 조성물의 표적화는 특정 기관 또는 조직이 특히 발현의 조절을 필요로 하게 할 수 있다. 예를 들어, 근육내 투여는 근육 조직에 축적을 야기할 수 있고, 피하 투여는 피부 조직에 축적을 야기할 수 있으며, 보호로부터 이익을 얻을 수 있는 세포 유형에 영향을 미친다. 따라서 다중 기관에서 원치않은 발현으로부터 광범위한 보호를 제공하는 miRNA 결합 부위 서열을 포함하는 일반적이고 아마도 더 긴 서열을 선택하거나, 특정 miRNA 결합 부위 서열을 선택하여 특정 상황에서 요구되는 하나 이상의 기관에서 특이적 보호를 허용하는 것이 가능하며, 이는 더 짧은 서열, 및/또는 반복된 결합 부위 서열 포함시킬 수 있다(하기 참조). 이러한 방식으로, 전달된 mRNA 서열은 전달 모드와 관련하여 최적화될 수 있다(또는 그 반대의 경우).
일부 경우에, 기관 보호 서열에 사용되는 miRNA 표적 서열은 치료될 조직 또는 기관과 연관되지 않을 수 있고, 상기 조직 및 기관 내의 건강한 세포와 병적 세포 사이에 차등 발현을 야기하도록 설계되지 않을 수 있다. miRNA 결합 서열은 오히려 치료하도록 의도되지 않은 기관에서 표적외 효과를 방지하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물 및 방법은 피부의 치료, 예를 들면, 흑색종의 치료를 위해 설계될 수 있다. 피부에 조성물의 적용은 종양에 직접적으로 주사하거나 종양으로 직접적으로 이어지는 혈액 공급에 의한 것과 같이 국소적 또는 종양내(IT)일 수 있다. 그러나, 이러한 경우에, 조성물은 혈류, 림프계에 의해, 또는 이러한 수단에 의해 흡수되거나 달리 간, 신장 및/또는 비장과 같은 피부 이외의 기관에서 접촉 및/또는 축적될 수 있다. 이러한 경우, miRNA 표적 서열은 바람직하지 않은 생체분포를 수용하고 이러한 표적외 기관 내에서 암호화된 mRNA의 발현을 방지하도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 간, 신장 및 비장과 연관된 miRNA 표적 서열의 사용이 선택되어, 이러한 기관 내에 포함된 건강한 세포 내에서의 발현을 방지할 수 있다. 이를 허용할 수 있는 miRNA 표적 서열의 잠재적인 조합의 예는 상기 제시되어 있다.
또한 결합 부위 서열과 miRNA 서열 사이의 완벽한 일치는 miRNA-매개 침묵이 발생하는 데 필요하지 않고, 일부 miRNA 서열(특히 유사한 세포 유형 내에 존재하는 서열)은 상당한 유사성을 가지므로, 하나 초과의 miRNA 서열에 대한 표적을 제공할 수 있는 서열을 고안할 가능성이 있는 것으로 구상된다. 예를 들어, miRNA-122 및 miRNA-199는 유사한 결합 부위 서열을 가지며, 두 miRNA에 실질적으로 상보적인 서열이 설계되고 예를 들어 miRNA-122 결합 부위 서열을 약간 변형시킴으로써, miRNA 표적 서열로서 포함될 수 있다. 이 방식으로, 두 miRNA-122 및 miRNA-199는 이러한 서열에 결합하여, mRNA의 분해를 증가시킬 수 있다. 유사하게, Let-7 miRNA에 대한 표적 서열은 Let-7 패밀리의 다른 구성원에 대한 표적 서열로서 역할을 할 수 있다. 상이한 miRNA에 대한 결합 부위 서열은 임의의 적합한 정렬 기술로 정렬되고 공유된 뉴클레오티드에 대해 비교될 수 있으며, 그 결과 이러한 공유된 뉴클레오티드를 포함하는 결합 부위 서열이 설계될 수 있다.
본 발명의 구체적 구현예에서, 특정 표적 부위 서열이 mRNA 내에서 반복되는 횟수는 결합 부위 서열에 의해 매개되는 침묵의 효능에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 하나의 miRNA 표적 부위의 증가된 반복 수는 관련 miRNA가 이에 결합할 가능성을 증가시킬 수 있으므로, 번역 억제 또는 번역 전에 분해 가능성이 발생한다. 결과적으로, 보다 완전한 miRNA-매개 침묵이 특성 세포 유형에서 필요한 경우, 이들 세포에서 발현되는 miRNA에 적합한 표적 서열의 보다 많은 반복이 사용될 수 있다. 마찬가지로, 감소되지만 부재하지 않은 발현은 본원에 논의된 임의의 다른 접근법을 사용하거나 사용하지 않고, 더 적은 수의 결합 부위 서열을 포함함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 동일한 결합 부위 서열이 mRNA에 1 회, 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 또는 그 이상 제공될 수 있고, 단독으로 또는 다른 miRNA에 대한 표적 부위 서열과 조합하여 제공될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, mRNA 서열 내에 포함되는 miRNA 표적 부위의 순서는 결과적인 기관 보호 효능에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, miRNA-122, let 7b, miRNA-375, miRNA-192, miRNA-142에 대한 표적 서열, (간, 폐, 유방, 췌장, 신장, 및 비장 세포에 존재)은 이 순서로, 또는 예를 들어 다음과 같은 다수의 다른 순열로 제시될 수 있다:
miRNA-122 - miRNA-375 - Let 7 - miRNA-192 - miRNA-142;
miRNA-122 - miRNA-375 - Let 7 - miRNA-142 - miRNA-192; 또는
miRNA-122 - Let 7 - miRNA-375 - miRNA-142 - miRNA-192.
또 다른 예로서, miRNA-122, Let 7a, miRNA-142, miRNA-30a, miRNA-143에 대한 표적 서열, (간, 폐/결장, 비장/조혈 세포, 신장, 및 결장 세포에 존재)은 이 순서로, 또는 예를 들어 다음과 같은 다수의 다른 순열로 제시될 수 있다:
miRNA-122 - Let7a - miRNA-142 - miRNA-30a - miRNA-143;
miRNA-122 - miRNA-142 - Let7a - miRNA-143 - miRNA-30a; 또는
miRNA-122 - miRNA-30a - Let7a - miRNA-143 - miRNA-142
하기에 보다 상세히 기재된 본 발명의 구체적 구현예에서 miRNA-122, miRNA-192 및 miRNA-30a에 대한 표적 서열(간, 결장 및 신장에 존재)은 다음과 같은 다양한 조합으로 제시될 수 있다:
miRNA-122 - miRNA-192 - miRNA-30a;
miRNA-122 - miRNA-30a - miRNA-192; 또는
miRNA-192 - miRNA-122 - miRNA-30a
하기에 보다 상세히 기재된 본 발명의 추가의 구현예에서 Let7b, miRNA-126 및 miRNA-30a에 대한 표적 서열(간, 결장, 비장, 폐 및 신장에 존재)은 다음과 같은 다양한 조합으로 제시될 수 있다:
Let7b - miRNA-126 - miRNA-30a;
Let7b - miRNA-30a - miRNA-126; 또는
miRNA-126 - Let7b - miRNA-30a
이러한 조합은 본원에 논의된 바와 같이, 특정 암에 대한 치료 또는 백신 또는 애쥬번트 발현 시스템에서 사용되도록 설계된 조성물의 투여에 의해 영향을 받을 가능성이 있는 조직을 보호하는 데 유용할 수 있다.
추가의 예로서, miRNA-122, miRNA-203a, miRNA-1, miRNA-30a에 대한 표적 서열(간, 피부, 근육/심근, 및 신장에 존재)은 이 순서로, 또는 예를 들어 다음과 같은 다수의 다른 순열로 제시될 수 있다:
miRNA-122 - miRNA-203a - miRNA-1 - miRNA-30a;
miRNA-122 - miRNA-1 - miRNA-203a - miRNA-30a; 또는
miRNA-122 - miRNA-30a - miRNA-1 - miRNA-203a
이러한 조합은 백신, 애쥬번트 및 유사한 접근법과 관련하여 하기 논의된 바와 같이, 면역 반응을 유도하도록 설계된 조성물의 투여에 의해 영향을 받을 가능성이 있는 조직을 보호하는 데 유용할 수 있다.
따라서 본 발명은 mRNA에 의해 전달되는 코딩 서열, 및 세포 유형에 대해 조정가능한 상이한 접근법이 선택될 수 있게 한다. 즉, 본 발명에 의해 허용되는 차등 발현은 발현 수준 또는 감소된 발현이 요구되든 허용하기 위해 '구성가능하다'.
또 다른 구현예에서, 전달된 mRNA는 면역자극성 또는 항면역억제성 단백질을 코딩할 수 있거나, 또 다른 방식으로 면역 반응을 유도하도록 작용할 수 있다. 이러한 경우, 표적 병적 세포에서 암호화된 생성물의 최대 발현을 갖는 것이 바람직할 수 있지만, 또한 표적 기관의 주변 건강한 조직에서 발현은 감소되었지만 여전히 존재한다. 반면에, 특정 조직(예컨대 뇌 또는 다른 신경 조직)에서 이러한 면역-자극 생성물의 발현을 완전히 피하고/피하거나, 조성물이 축적될 가능성이 있는 세포, 조직 및 기관에서 발현을 감소시켜 표적외 면역 반응 및 가능한 전신 반응을 방지하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일 예에서 miRNA 표적 서열은 표적 병적 세포에서 완전한 발현을 허용하고, 표적 기관의 건강한 세포에서 발현을 부분적으로 감소시키지만, 신경 조직 및 축적 부위에서 발현을 보다 완전히 감소시키도록 상기 논의된 접근법 중 하나 이상에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 초과의 상이한 mRNA 서열은 단일 조성물에 제공될 수 있다. 이러한 상이한 서열은 상이한 폴리펩티드, 및/또는 상이한 miRNA 표적 부위를 암호화할 수 있다. 이 방식으로, 단일 조성물은 다중 상이한 폴리펩티드가 발현되게 할 수 있다. 개별 mRNA 서열에서 miRNA 표적 서열의 상이한 조합을 사용함으로써, 상이한 세포 유형 또는 표적 기관은 원하는 목적에 따라, 특정 폴리펩티드를 발현하거나, 발현으로부터 보호할 수 있다. 예를 들면, 간 및 뇌의 건강한 세포가 폴리펩티드 'A'의 발현으로부터 보호되어야 하지만, 간이 아닌 건강한 뇌에서 폴리펩티드 'B'를 발현하는 것이 바람직한 경우, 제1 mRNA 서열은 miRNA-122, miRNA-125a 및 miRNA-124a에 대한 표적 부위가 있는 'A'의 서열을 포함할 수 있지만, 제2 mRNA 서열은 miRNA-122 및 miRNA-125a에 대한 결합 부위를 갖는 'B'의 서열을 포함할 수 있다.
당업자는 주어진 기관 및 세포 유형 세트에서 발현의 임의의 조합을 달성하기 위해 miRNA 표적 부위, 폴리펩티드 서열 및 다중 mRNA 서열의 조합을 고안할 수 있음이 이해될 수 있다. 이러한 서열과 관련한 관련 기관 및 조직 유형은 상기 및 표 2에 논의된다. 도 1은 본 발명의 일부 구현예에 따른 mRNA 작제물의 개략도를 나타낸다. ORF는 시작 코돈에 선행하고 정지 코돈으로 종결되며, 이후 일련의 최대 5 개 이상의 결합 부위 서열이 3'UTR에 존재한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, OPS를 정의하는 miRNA 표적 부위(BS1 내지 BS5)는 스페이서에 의해 분리되거나, 바람직한 경우 스페이서가 전혀 없을 수 있다. ORF는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 정지 코돈의 변동성은 임의의 구현예에서 구상되며, 모든 구현예에서 ORF와 결합 부위 서열 사이에 정지 코돈이 없을 수 있다.
본 발명에 의해 공급되는 mRNA 서열의 UTR은 표적 기관 내의 세포 유형 중 하나에서 발현되는 UTR 서열의 일부 또는 전부에 대해 유사성, 예를 들어 90% 초과의 유사성을 갖도록 선택될 수 있다. 특정 세포 유형은 발현 시 상향 또는 하향 조절되는 유전자를 가질 수 있고, UTR 서열은 예를 들면 관련 mRNA 서열의 안정성 또는 분해를 장려하는 것을 통해 이 조절을 매개할 수 있다.
예로서, 암 세포에서 상향조절되는 것으로 알려진 유전자와 연관된 UTR은 이러한 암 세포에서 안정성 및 번역을 장려하는 miRNA 결합 부위 서열과 같은 하나 이상의 특성을 가질 수 있다. 유사한 서열을 공급된 mRNA 서열에 혼입함으로써, 안정성 및 번역이 암성 세포에서 개선될 수 있지만 비암성 또는 건강한 세포에서는 그렇지 않을 수 있다.
특정 상황에서, 표적 조직의 상이한 세포 유형에서 차등 발현을 나타내는 miRNA 서열에 대한 하나 초과의 후보가 존재할 수 있는 것이 가능하다. 이러한 경우, 복수의 miRNA 표적 서열이 mRNA 작제물에 포함되고, 이러한 서열이 실질적으로 상이한 서열일 수 있다는 것이 유리할 수 있다. 그러나, 복수의 miRNA 표적 서열 각각이 실질적으로 동일한 서열일 수 있다는 것이 추가로 구상된다.
사이토카인과의 조합
본원에 기재된 바와 같은 조성물 및 방법은 병원성 유기체로부터의 질환 또는 감염에 대한 면역 반응을 유도하도록 작용할 수 있음이 고려된다. 특히, 면역 반응은 암 세포에 대해 유도될 수 있다. 발암 과정은 빈번하게 암 세포가 면역계를 피하려고 시도하는 방식에 관여하여, 이러한 세포에 의해 생성되고 표시되는 항원에 대한 변화에 관여한다,
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 mRNA는 이중특이적 T-세포 관여자(engager)(BiTE), 항면역억제성 단백질, 또는 면역원성 제제인 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항면역억제 단백질"은 면역억제 경로를 억제하는 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역원성 제제"는 염증성 또는 면역원성 면역 반응을 증가시키는 단백질을 지칭한다. 특정 구현예에서, 항면역억제성 및 면역원성 제제는 항종양 면역 반응을 유도한다. 이러한 제제의 예는 면역 체크포인트 수용체(예를 들어 CTLA4, LAG3, PD1, PDL1, 및 기타), 전염증성 사이토카인(예를 들어, IFNγ, IFNα, IFNβ, TNFα, IL-12, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF, 및 기타), 또는 활성화 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγIIa, FcγIIIa, 공자극 수용체, 및 기타)에 결합하고 활성화시키는 단백질에 결합하고 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 EpCAM, IFNβ, 항-CTLA-4, 항-PD1, 항-PDL1, A2A, 항-FGF2, 항-FGFR/FGFR2b, 항-SEMA4D, CCL5, CD137, CD200, CD38, CD44, CSF-1R, CXCL10, CXCL13, 엔도텔린 B 수용체, IL-12, IL-15, IL-2, IL-21, IL-35, ISRE7, LFA-1, NG2(SPEG4로도 알려짐), SMAD, STING, TGFβ, VEGF 및 VCAM1로부터 선택된다.
본 발명은 기능적 거대분자를 코딩하는 mRNA를 세포-기반 요법에 사용되는 표적화된 세포 집단에 공급하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화된 세포 집단은 유전적으로 조작된 T 세포 집단이다.
코딩 mRNA는 면역 세포 집단 또는 면역 세포 집단의 조합을 대상체의 특정 부위로 유인하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 mRNA 및 전달 입자는 면역 세포를 종양 미세환경으로 유인하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 코딩 mRNA 및 전달 입자는 면역 세포의 종양 미세환경으로의 불충분한 이동을 극복하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, B 세포, 항원-제시 세포(APC) 예컨대 대식세포 또는 수지상 세포, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 코딩 mRNA 및 전달 입자는 T 세포를 종양 미세환경으로 유인하는 데 사용된다.
코딩 mRNA는 T 세포의 종양 미세환경으로의 불충분한 이동을 극복하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전달 입자는 종양 미세환경을 특이적으로 표적하고, 코딩 mRNA는 T 세포를 종양 미세환경으로 유인하거나 달리 모집하는 유전자 산물을 암호화한다. 일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 케모카인을 발현한다. 비제한적인 예로서, 코딩 mRNA는 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL20, CCL22, CCL28, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1, 및 이의 임의의 조합과 같은 T-세포를 유인하는 케모카인을 암호화할 수 있다. 자가면역 질환에서와 같이 역효과가 바람직한 상황에서, 코딩 mRNA는 상기 언급된 인자의 차단제, 길항제 및/또는 억제제를 발현할 수 있다.
코딩 mRNA는 종양 미세환경으로 전달되고 종양 미세환경 내에서 일시적으로 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 예를 들어, 활성화된 T 세포 및 NK 세포와 같은 종양 반응에서 면역 세포의 생존, 증식, 및/또는 분화를 조절하는 데 관여하는 사이토카인 또는 다른 유전자 산물을 암호화한다. 비제한적인 예로서, 코딩 mRNA는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-17, IL-33, IL-35, TGF-베타, 및 이의 임의의 조합과 같은 사이토카인을 암호화할 수 있다. 다시, 자가면역 질환에서와 같이 역효과가 바람직한 상황에서, 코딩 mRNA는 상기 언급된 인자의 차단제, 길항제 및/또는 억제제, 예를 들어, TGF-베타의 억제제를 발현할 수 있다.
mRNA를 공급하는 조성물은 특정 세포 하위유형을 표적하고, 이들에 결합할 때, 수용체-매개 세포내이입을 자극하여, 이들이 운반하는 합성 mRNA를 세포에 도입하도록 설계될 수 있으며, 이제 합성 mRNA를 발현할 수 있다. 이식유전자의 핵 수송 및 전사가 필요하지 않기 때문에, 이 과정은 빠르고 효율적이다.
일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 면역 세포(예컨대 공동 자극인자) 또는 면역 경로와 연관된 수용체 또는 다른 세포 표면 단백질, 또는 이러한 수용체를 표적하는 분자를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 코딩 mRNA는 CD40, CD40L, CD160, 2B4, Tim-3, GP-2, B7H3 및 B7H4 중 하나 이상으로부터 선택된 하기 세포 수용체 및 이들의 리간드를 표적화하는 분자를 코딩할 수 있다. 유사하게, 코딩 mRNA는 GM-CSF, TLR7 및 TLR9 중 하나 이상으로부터 선택된 수지상 세포 활성자를 코딩할 수 있다. 일 구현예에서, 코딩 mRNA는 하나 이상의 T-세포 막 단백질 3 억제제를 코딩한다. 일 구현예에서, 코딩 mRNA는 NF-κB의 하나 이상의 억제제를 코딩한다.
Toll-유사 수용체(TLR) 패밀리는 병원체 인식 및 선천성 면역의 활성화에 관여한다. TLR8은 특히 단일 가닥 RNA를 인식하고 따라서 전사 인자 NF-κB의 활성화 및 항바이러스 반응에 의한 ssRNA 바이러스의 인식에서 역할을 할 수 있다. 따라서, 코딩 mRNA가 TLR 패밀리의 구성원, 예를 들어 TLR8을 암호화하는 구현예는 항바이러스 반응이 바람직한 경우 고려된다.
일부 구현예에서, mRNA 전달 시스템은 T 세포를 원하는 표현형으로 프로그래밍하는 하나 이상의 제제를 코딩하는 mRNA를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 나노입자 전달 조성물은 원하는 T 세포 표현형을 특징으로 하는 마커 및 전사 패턴을 유도하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 나노입자 전달 조성물은 CD26L+ 중추 기억 T 세포(Tcm)의 발달을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 표적 세포 집단에서 세포 분화를 제어하기 위해 하나 이상의 전사 인자를 암호화하는 mRNA를 공급한다. 일부 구현예에서, 전사 인자는 CD8 T-세포에서 효과기 대 기억 전이 발달을 제어하는 Foxo1이다.
일부 구현예에서, mRNA 전달 조성물은 예를 들어, T 세포 상에서 발견되는 표면 항원과 같은 T 세포 마커에 특이적인 표면-고정 표적화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 표면-고정 표적화 도메인은 나노입자가 T-세포에 선택적으로 결합하고 수용체-유도 세포내이입을 개시하여 mRNA 나노입자 전달 조성물을 내재화하는 항원에 특이적이다. 일부 구현예에서, 표면-고정 표적화 도메인은 CD3, CD8, 또는 이의 조합에 선택적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 표면-고정 표적화 도메인은 CD3, CD8, 또는 이의 조합에 선택적으로 결합하는 항체이거나 항체로부터 유도된다.
전달 플랫폼
코딩 뉴클레오티드 서열을 표적 세포에 도입하는 것은 종종 원하는 물질을 세포외 공간에서 세포내 환경으로 전달하기 위해 전달제 또는 '생체내 전달 조성물'의 사용을 필요로 한다. 빈번하게, 이러한 전달제/조성물은 전달 입자를 포함할 수 있다. 전달 입자는 포식작용을 겪고/거나 표적 세포와 융합할 수 있다. 전달 입자는 캡슐화에 의해 또는 물질을 매트릭스 또는 구조 내에 포함함으로써 원하는 물질을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 '전달 입자'는 캡슐화, 매트릭스 내에서 유지, 복합체 형성, 표면 흡착에 의해 또는 다른 수단에 의해 치료적 성분을 포함할 수 있는 입자를 포함하는 약물 또는 생물학적 분자 전달 시스템을 지칭한다. 이들 시스템은 코딩 핵산 서열과 같은 치료적 성분을 표적 세포에 전달할 수 있다. 분자 또는 물질의 직접 투여와 비교하여, 전달 입자의 사용은 작용 부위에 전달될 물질의 양, 시간 및/또는 방출 동역학을 제어함으로써, 전달의 효능 뿐만 아니라 안정성을 개선시킬 수 있다. 전달 입자 시스템은 또한 물질 또는 약물이 원하는 치료적 표적 위치에 도달하게 하도록 생물학적 막을 가로지르는 데 능숙하다. 전달 입자는 마이크로 규모일 수 있지만, 구체적 구현예에서 전형적으로 나노규모, 즉 나노입자일 수 있다. 나노입자는 전형적으로 적어도 50 nm(나노미터), 적합하게 적어도 대략 100 nm, 전형적으로 최대 150nm, 200 nm 크기이지만, 임의적으로 최대 300 nm 직경이다. 본 발명의 일 구현예에서 나노입자는 대략 적어도 60 nm의 평균 직경을 갖는다. 이러한 크기의 장점은 입자가 세망내피계(단핵 포식세포계) 제거율에 대한 임계값 미만임을 의미하는 것이며, 즉 입자는 신체 방어 메커니즘의 일부로서 포식 세포에 의해 파괴되지 않을만큼 충분히 작다. 이는 본 발명의 조성물에 대한 정맥내 전달 경로의 사용을 가능하게 한다. 전달 입자 내에 포함된 활성 물질을 표적 조직으로 전달하고 투여하는 데 사용되는 경로는 질환, 특히 감염성 질환을 치료할 때 매우 관련된 인자이다. 이러한 경로는 적용되는 방법에 따라 상이한 수준의 효능을 가질 수 있다. 본 발명의 구체적 구현예에서 전달 입자의 투여는 정상적으로 피하, 정맥내 또는 동맥내 투여를 통해서와 같이 전신 투여이다. 때때로, 질환의 유형 또는 중증도로 인해 전달 입자는 종양내 투여를 통해 이러한 이환된 기관 또는 조직에 직접 적용될 수 있다.
나노입자의 조성물에 대한 대안적 가능성은 폴리락트산(PLA), 폴리(락트-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤, 지질- 또는 인지질-기반 입자 예컨대 리포솜 또는 엑소솜; 단백질 및/또는 당단백질에 기반한 입자 예컨대 콜라겐, 알부민, 젤라틴, 엘라스틴, 글리아딘, 케라틴, 레구민, 제인, 대두 단백질, 우유 단백질 예컨대 카제인, 및 기타(Lohcharoenkal 등 BioMed Research International; Volume 2014(2014)); 콜로이드성 나노입자; 및 금속 또는 금속성 화합물에 기반한 입자 예컨대 금, 은, 알루미늄, 산화구리, 금속-유기 사이클 및 케이지(MOC) 등을 포함한다. 구체적 구현예에서 폴리(락트-코-글리콜산)(PLGA)은 높은 생체적합성 및 생분해성으로 인해 본 발명의 전달 입자에 사용될 수 있다. PLGA는 1989년에 미국 식품의약국(US Food and Drug Administration; FDA)에 의해 임상 용도로 승인되었다. 그 이후 광범위한 약물 및 생체분자의 지속 방출 제형이 선호되었다. PLGA는 또한 미셸(micelle) 기반 나노입자를 생성하기 위해 폴리비닐 알코올(PVA)와 함께 공동 제형화될 수 있다. 미셸은 또한 PLGA 및 PEG의 이중블록 공중합체, 또는 PEG-PLGA-PEG 삼중블록 공중합체를 사용하여 제조될 수 있다.
특히, 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하는 중합체를 핵산의 전달에 대해 조사하였다. 폴리(β-아미노 에스테르)(PBAE)로 구성된 나노입자 벡터는 또한 특히 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 공동 제형에서 핵산 전달에 적합한 것으로 나타났다(Kaczmarek JC 등 Angew Chem Int Ed Engl. 2016; 55(44): 13808-13812). 덴드리머(Dendrimer)가 또한 사용을 위해 고려된다. 이러한 공동 제형의 입자는 mRNA를 폐로 전달하는 데 사용되었다.
또한 셀룰로스, 키틴, 사이클로덱스트린, 및 키토산과 같은 다당류 및 이들의 유도체에 기반한 입자가 간주된다. 키토산은 키틴의 부분적 탈아세틸화에 의해 수득되는 양이온성 선형 다당류이며, 나노입자는 생체적합성, 낮은 독성 및 작은 크기와 같은 약물 적달을 위한 유망한 특성을 보유하는 이 물질을 포함한다(Felt 등, Drug Development and Industrial Pharmacy, Volume 24, 1998 - Issue 11). 상기 구성성분 사이의 조합이 사용될 수 있음이 구상된다. 본 발명의 구체적 구현예에서 나노입자는 점막에서 지속 방출 생체분자 전달에 이상적이게 만드는 뛰어난 점막부착 및 침투 특성을 나타내는 키토산을 포함한다.
전달 입자는 니오솜 또는 리포솜과 같은 지질-기반, 나노입자 전달 시스템을 포함할 수 있다. 지질 나노입자는 전형적으로 인지질, 이온화가능 지질, 콜레스테롤, 및 PEG화 지질을 함유하는 다중성분 지질 시스템이다. 입자 표면 상의 PEG화 지질은 입자 응집을 감소시키고 생체내 순환 시간을 연장하는 데 도움을 줄 수 있다. 적합한 리포솜 제형은 L-α-포스파티딜콜린 및 PEG-DMG(1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 특히, 핵산의 전달에 적합한 이온화가능 지질을 포함하는 대안적 리포솜 제형은 DSPC(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린) 및 Dlin-MC3-DMA(6Z, 9Z, 28Z, 31Z)-헵타트리아콘트-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트를 포함할 수 있다. 지질-기반 나노입자의 효능에 대한 또 다른 결정인자는 지질 pKa이다. mRNA 화물(cargo)의 전달을 위한 최적의 지질 pKa는 6.6-6.8 범위이다.
전달 입자는 아미노알코올 리피도이드를 포함할 수 있다. 이들 화합물은 나노입자, 리포솜 및 미셸을 포함하는 입자의 형성에 사용될 수 있으며, 특히 핵산의 전달에 적합하다. 본 발명의 일부 구현예에 따른 아미노알코올 리피도이드 입자를 포함하는 나노제형의 생산에 대한 예시적인 예는 실시예에서 찾을 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 콜레스테롤, 및 디올레일글리세로포스페이트-디에틸렌디아민 접합체(DOP-DEDA)로 구성된 지질 나노입자(LNP)는 pH 6.0에서 양으로 하전되고, pH 7.4에서 중성이고 8.0에서 음으로 하전된다. 이 전달 시스템은 혈장 단백질에 의한 분해를 최소화하고 캡슐화된 mRNA 화물을 보호하기 위해 혈류에서 중성이다. 생체내에서 전달될 때 이들 LNP 비히클은 소수성 지질 영역에서 아포지단백질(예를 들어, apoE3)에 결합하며, 특히 종양 세포에 의한 세포 흡수를 촉진할 수 있다.
전달 입자는 표적 조직의 세포에 표적화될 수 있다. 이 표적화는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 당단백질, 지질, 소분자, 핵산 등일 수 있는, 전달 입자의 표면 상의 표적화제에 의해 매개될 수 있다. 표적화제는 특이적 세포 또는 조직을 표적하는 데 사용될 수 있거나 입자의 세포내이입 또는 포식작용을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 표적화제의 예는 항체, 항체의 단편, 저밀도 지단백질(LDL), 트랜스페린, 아시알리코단백질, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 gp120 외피 단백질, 탄수화물, 수용체 리간드, 시알산, 압타머 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 활성 표적화 리간드에 의해 변형된 표적화된 리포솜은 mRNA와 같은 화물을 다른 부위로 방출하지 않고 표적 조직/기관/세포에서 축적을 증가시킴으로써 리포솜 용량을 유의하게 개선할 수 있다.
지질-기반 나노입자는 또한 유리하게는 그 자체로 애쥬번트로서 작용할 수 있으며, 광범위한 지질이 강력한 고유의 애쥬번트 활성을 보유하는 것으로 보고된다. 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA)와 같은 양이온성 지질은 주사 부위에서 항원의 침착 뿐만 아니라 세포 항원 내재화의 향상을 나타낸다. DDA에 의해 구조화된 고체 지질 나노입자는 높은 항원 흡착 효율, 시험관내 항원 트래피킹(trafficking), 생체내 분포, 및 높은 항체 반응을 입증한다(Anderluzzi 등 J. Control Release 2020, 330, 933-944). 결과적으로, LNP를 전달 시스템으로 활용하는 mRNA 전달 백신의 보조제를 개선하려는 노력은 나노입자에서 사용되는 지질을 조작하는 데 초점을 맞추는 경향이 있다. 그러나, 상기 언급된 바와 같이, 화물로서 mRNA의 캡슐화 뿐만 아니라 생체분포, 방출 동역학 및 세포 흡수 측면에서 지질 특성과 적합성 사이에 상호보완적이다.
대상체에게 투여될 때, 치료적 성분은 생체내 전달 조성물의 일부로서 적합하게 투여되고 약제학적 조성물을 생성하기 위해 약제학적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 허용되는 약제학적 비히클은 액체, 예컨대 물 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등일 수 있다. 약제학적 비히클은 식염수, 아카시아 검, 젤라틴, 전분 페이스트, 활석, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 우레아 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 대상체에게 투여될 때, 약제학적으로 허용되는 비히클은 바람직하게는 식염수이다. 물은 본 발명의 화합물이 정맥내로 투여될 때 적합한 비히클이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 비히클로서, 특히 주사용 용액으로 이용될 수 있다. 적합한 약제학적 비히클은 또한 부형제 예컨대 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 약제학적 조성물은 원하는 경우 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 완충제를 또한 함유할 수 있다.
본 발명의 약제 및 약제학적 조성물은 액체, 용액, 현탁액, 겔, 변형된-방출 제형(예컨대 느린 또는 지속 방출), 에멀젼, 캡슐(예를 들어, 액체 또는 겔을 함유하는 캡슐), 리포솜, 마이크로입자, 나노입자 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 적합한 제형의 형태로 취할 수 있다. 적합한 약제학적 비히클의 다른 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, Pa., 19th ed., 1995에 기재되어 있으며, 예를 들어 1447-1676 페이지를 참조한다.
본원에 기재된 임의의 화합물 또는 조성물에 대해, 치료적 유효량은 시험관내 세포 배양 검정으로부터 초기에 결정될 수 있다. 표적 농도는 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 방법을 사용하여 측정된 바와 같이, 본원에 기재된 방법을 달성할 수 있는 활성 성분(들)의 농도일 것이다.
당업계에 잘 알려진 바와 같이, 인간 대상체에서 사용하기 위한 치료적 유효량은 또한 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 인간에 대한 용량은 동물에서 효과적인 것으로 밝혀진 농도를 달성하기 위해 제형화될 수 있다. 인간에서 투여량은 상기 기재된 바와 같이, 화합물 유효성을 모니터링하고 투여량을 상향 또는 하향 조정함으로써 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 다른 방법에 기반하여 인간에서 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.
본 발명의 구현예는 의학에 사용하기 위해 제형화된 조성물을 포함할 수 있음이 고려된다. 이와 같이, 본 발명의 조성물은 생체적합성 용액에 현탁되어 세포, 조직 내 또는 환자 또는 동물의 신체 내 위치에 표적화될 수 있는 조성물을 형성할 수 있다(즉 조성물은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 사용될 수 있음). 적합하게, 생체적합성 용액은 포스페이트 완충 식염수 또는 임의의 다른 약제학적으로 허용되는 담체 용액일 수 있다. 하나 이상의 추가적인 약제학적으로 허용되는 담체(예컨대 희석제, 애쥬번트, 부형제 또는 비히클)는 약제학적 조성물에서 본 발명의 조성물과 조합될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 E. W. Martin의 'Remington's Pharmaceutical Sciences'에 기재되어 있다. 본 발명의 약제학적 제형 및 조성물은 규제 표준을 따르도록 제형화되고 경구, 정맥내, 국소, 종양내, 또는 피하, 또는 다른 표준 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 또는 비강내 또는 척추강내 투여일 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 정맥내, 병변내, 종양내, 피하, 근육내, 비강내, 척추강내, 동맥내 및/또는 흡입을 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 조성물이 개별적으로 또는 대안적인 항종양성 또는 달리 항암 치료적 성분과 조합하여 투여되는 구현예가 추가로 의도된다. 이들 성분은 종양용해 바이러스, 소분자 약물, 화학요법제, 방사선요법제, 치료적 백신 또는 생물제제를 포함할 수 있다. 성분은 본 발명의 조성물과 동시에 투여될 수 있고, 전달 입자 내에 포함될 수 있거나, 임의의 적합한 수단에 의해, 본 발명의 조성물의 투여 전에 또는 후에 개별적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 조성물은 예를 들어 실험실 설정에서 시험관내 및/또는 생체외 방법으로 사용될 수 있음이 또한 고려된다. 시험관내 방법의 예는 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 서열을 포함하는 전달 시스템을 포함하는 조성물이 시험관내 세포를 표적하도록 투여하고, mRNA 서열에 포함된 miRNA 결합 부위 서열이 표적 시험관내 세포 내의 상이한 세포 유형의 mRNA 코딩 서열의 차등 발현을 허용하는 것이다. 유사하게, 본원에 기재된 바와 같은 전달 시스템 및 mRNA 서열을 포함하는 조성물이 동물로부터 취한 표적 생체외 샘플에 투여하고, mRNA 서열에 포함된 miRNA 결합 부위 서열이 표적 샘플 내의 상이한 세포 유형의 mRNA 코딩 서열의 차등 발현을 허용하는 방법이 고려된다.
백신
본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 및 조성물은 백신 용법에서, 통상적인 백신의 효능 향상에서, 및/또는 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물, 프리온, 및 기생충(벌레)과 같은 감염성 병원체에 대해 사용하거나; 암과 같은 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 신규 백신 형태로서 사용될 수 있다. 기재된 바와 같은 mRNA 작제물은 5' 및 3' 단부의 (직접 또는 간접) 연결에 의해 환형화될 수 있고 이러한 환형 또는 환형화된 RNA 작제물은 본원에 사용된 바와 같은 용어 'mRNA 작제물'에 의해 포함되는 것으로 간주되며; 이러한 작제물은 예를 들어 SARS-CoV-2에 대한 RNA-기반 백신으로 잠재적으로 효과적인 것으로 나타났음이 고려된다(Qu L. 등, bioRxiv 2021.03.16.435594; https://doi.org/10.1101/2021.03.16.435594). 결과적으로, 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물은 세포에서 번역될 수 있는 환형 또는 환형화된 RNA 작제물을 포함한다.
따라서, 본 발명의 조성물은 백신 제형 내에 포함되거나 백신과 조합하여 투여되는 애쥬번트의 형태로 (예를 들어, 적절한 사이토카인과 함께) 감염성 병원성 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
감염성 박테리아 요인의 예는 다음을 포함한다: 아세토박터 아우란티우스(Acetobacter aurantius), 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 악티노마이세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii), 아고박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 아고박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아나플라스마 파고사이토필룸(Anaplasma phagocytophilum), 아조리조비움 카울리노단스(Azorhizobium caulinodans), 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii), 비리단스 스트렙토콕시(viridans streptococci), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 푸시포르미스(Bacillus fusiformis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 깅발리스(Bacteroides gingivalis), 박테로이데스 멜라니노게니쿠스(Bacteroides melaninogenicus), 프레보텔라 멜라니노게니카(Prevotella melaninogenica), 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae), 바르토넬라 퀸타나(Bartonella quintana), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 페르투스시스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 부르콜리데리아 말레이(Burkholderia mallei), 부르콜리데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 부르콜리데리아 세파시안(Burkholderia cepacian), 칼림마토박테리움 그라눌로마티스(Calymmatobacterium granulomatis), 캄필로박터 콜리(Campylobacter coli), 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 파일로리(Campylobacter pylori), 클라미디아(Chlamydia), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니아에(Chlamydophila pneumoniae), 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae), 클라미도필라 피타시(Chlamydophila psittaci), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 웰치이(Clostridium welchii), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 푸시포르메(Corynebacterium fusiforme), 콕시엘라 부르네티드(Coxiella burnetiid), 에를리키아 샤펜시스(Ehrlichia chaffeensis), 에를리키아 에윙기이(Ehrlichia ewingii), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 엔테로코쿠스 아비움(Enterococcus avium), 엔테로코쿠스 두란스(Enterococcus durans), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패시움(Enterococcus faecium), 엔테로코쿠스 갈리나룸(Enterococcus gallinarum), 엔테로코쿠스 말로라투스(Enterococcus maloratus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 푸조박테리움 네크로포룸(Fusobacterium necrophorum), 푸조박테리움 누클아툼(Fusobacterium nucleatum), 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 인플루자에(Haemophilus influenzae), 헤모필루스 파라인플루자에(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 페르투시스(Haemophilus pertussis), 헤모필루스 바기날리스(Haemophilus vaginalis), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 크렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophila), 레이쉬마니아 도노바니(Leishmania donovani), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 렙토스피라 노구치이(Leptospira noguchii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 메타노박테리움 엑스트로쿠엔스(Methanobacterium extroquens), 마이코박테리움 멀티포름(Microbacterium multiforme), 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 디프테리다에(Mycobacterium diphtheriae), 마이코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 레프라에무리움(Mycobacterium lepraemurium), 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코플라스마 페르멘탄스(Mycoplasma fermentans), 마이코플라스마 게니탈리움(Mycoplasma genitalium), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 마이코플라스마 페네트란스(Mycoplasma penetrans), 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라스마 멕시칸(Mycoplasma mexican), 네이세리아 고노르호아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스퇴렐라 툴라렌시스(Pasteurella tularensis), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 멜라니노게니카, 박테로이데스 멜라니노게니쿠스, 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter), 리케치아 프로바체키이(Rickettsia prowazekii), 리케치아 시타시(Rickettsia psittaci), 리케치아 퀸타나(Rickettsia quintana), 리케치아(Rickettsia), 리케치아 트라코매(Rickettsia trachomae), 로칼리매아 헨셀라에(Rochalimaea henselae), 로칼리매아 퀸타나(Rochalimaea quintana), 로치아 덴토카노사(Rothia dentocanosa), 살로넬라 엔텐티디스(Salmonella ententidis), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 시겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 스피릴룸 볼루탄스(Spirillum volutans), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 아비움(Streptococcus avium), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 크리세투스(Streptococcus cricetus), 스트렙토코쿠스 파세이움(Streptococcus faceium), 스트렙토코쿠스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코쿠스 갈리나룸(Streptococcus gallinarum), 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 스트렙토코쿠스 미티오르(Streptococcus mitior), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 라투스(Streptococcus rattus), 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코쿠스 상기스(Streptococcus sanguis), 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 트레포네마(Treponema), 우레아플라스마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 비브리오 콤마(Vibrio comma), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) 및 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis).
바이러스 감염 요인의 예는 다음을 포함한다: 아데노 연관 바이러스; 아이치(Aichi) 바이러스, 호주 박쥐 리싸바이러스; BK 폴리오마바이러스; 바나(Banna) 바이러스; 바마 포레스트(Barmah forest) 바이러스; 부니암웨라(Bunyamwera) 바이러스; 분냐바이러스 라 크로스(Bunyavirus La Crosse); 분냐바이러스 눈덧신토끼; 세르코피테신(Cercopithecine) 헤르페스바이러스; 찬디푸라(Chandipura) 바이러스; 치쿤구냐(Chikungunya) 바이러스; 코사바이러스 A; 우두 바이러스; 콕사키바이러스; 크림-콩고(Crimean-Congo) 출혈열 바이러스; 뎅기(Dengue) 바이러스; 도리(Dhori) 바이러스; 두그베(Dugbe) 바이러스; 두벤하그(Duvenhage) 바이러스; 동무 말 뇌염 바이러스; 에볼라바이러스; 에코바이러스; 뇌심근염 바이러스; 엡스타인 바(Epstein-Barr) 바이러스; 유럽 박쥐 리싸바이러스; GB 바이러스 C/G형 간염 바이러스; 한탄 바이러스; 헨드라 바이러스; A형 간염 바이러스; B형 간염 바이러스; C형 간염 바이러스; E형 간염 바이러스; 델타 간염 바이러스; 마두 바이러스; 인간 아데노바이러스; 인간 아스트로바이러스; 인간 코로나바이러스; 인간 사이토메갈로바이러스; 인간 장내바이러스 68, 70; 인간 헤르페스바이러스 1; 인간 헤르페스바이러스 2; 인간 헤르페스바이러스 6; 인간 헤르페스바이러스 7; 인간 헤르페스바이러스 8; 인간 면역결핍 바이러스; 인간 유두종바이러스 1; 인간 유두종바이러스 2; 인간 유두종바이러스 16,18; 인간 파라인플루엔자; 인간 파보바이러스 B19; 인간 호흡기 세포융합 바이러스; 인간 리노바이러스; 인간 SARS 코로나바이러스; 인간 스푸마레토바이러스; 인간 T-림프친화 바이러스; 인간 토로바이러스; 인플루엔자 A 바이러스; 인플루엔자 B 바이러스; 인플루엔자 C 바이러스; 이스파한(Isfahan) 바이러스; JC 폴리오마바이러스; 일본 뇌염 바이러스; 후닌 아레나바이러스; KI 폴리오마바이러스; 쿤진(Kunjin) 바이러스; 라고스 박쥐 바이러스; 빅토리아 호수 마르부르그바이러스; 란갓(Langat) 바이러스; 라싸(Lassa) 바이러스; 로드스데일(Lordsdale) 바이러스; 도약병 바이러스; 림프구성 맥락수막염 바이러스; 마추포(Machupo) 바이러스; 마야로(Mayaro) 바이러스, MERS 코로나바이러스; 홍역 바이러스; 멩고(Mengo) 뇌심근염 바이러스; 메르켈 세포 폴리오마 바이러스; 모콜라(Mokola) 바이러스; 전염성 연속종 바이러스; 원숭이 두창 바이러스; 볼거리 바이러스; 머레이 밸리 뇌염 바이러스; 뉴욕(New York) 바이러스; 니파(Nipah) 바이러스; 노워크(Norwalk) 바이러스; 오니오니옹(O'nyong-nyong) 바이러스; Orf 바이러스; 오로퓨스(Oropouche) 바이러스; 피친데(Pichinde) 바이러스; 폴리오바이러스; 푼타 토로 플레보바이러스(Punta toro phlebovirus); 푸우말라(Puumala) 바이러스; 라비(Rabies) 바이러스; 호흡기 세포융합 바이러스; 리프트 밸리열 바이러스; 로사바이러스 A; 로스 리버 바이러스; 로타바이러스 A; 로타바이러스 B; 로타바이러스 C; 풍진 바이러스; 사기야마(Sagiyama) 바이러스; 살리바이러스 A; 샌드플라이 열 시실리안(Sandfly fever Sicilian) 바이러스; 삿포로(Sapporo) 바이러스; SARS 코로나바이러스 2(COVID); 셈리키 삼림열 바이러스; 서울 바이러스; 유인원 거품 바이러스; 유인원 바이러스 5; 신드비스 바이러스; 사우샘프턴 바이러스; 세인트 루이스 뇌염 바이러스; 진드기 매개 포와센(Tick-borne powassan) 바이러스; 토르크 테노(Torque teno) 바이러스; 토스카나 바이러스; 우우쿠니에미(Uukuniemi) 바이러스; 백시니아 바이러스; 수두 대상포진 바이러스; 두창 바이러스; 베네수엘라 말 뇌염 바이러스; 수포성 구내염 바이러스; 서부 말 뇌염 바이러스; WU 폴리오마바이러스; 웨스트 나일(West Nile) 바이러스; 야바 원숭이 종양 바이러스; 야바-유사 질환 바이러스; 황열 바이러스; 및 지카 바이러스.
진균 감염 요인의 예는 다음을 포함한다: 짐노푸스 종(Gymnopus spp.), 로도콜리비아 부티라세아(Rhodocollybia butyracea), 하이폴로마 파시쿨라레(Hypholoma fasciculare), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 투베르 종(Tuber spp.), 보티아 카스타넬라(Bothia castanella), 리조스피어 종, 헬포트리키엘라세아에 종(Herpotrichiellaceae spp.), 베루카리아세아에 종(Verrucariaceae spp.), 마르칸드 이오마이세스 종(Marchand iomyces spp.), 미니메두사 종(Minimedusa spp.), 마르탄디오바시디움 아우란티아쿰, 마르칸디오마이세스 코랄리누스(Marchandiomyces corallinus), 마르칸디오마이세스 리그니콜라(Marchandiomyces lignicola), 부르고아 종(Burgoa spp.), 아텔리아 아라크노이데아, 알테르나리아 알테르나타, 알테르나리아 종(Alternaria spp.), 볼레투스 에둘리스(Boletus edulis), 레시눔 아우란티아쿰(Leccinum aurantiacum), 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 트라메테스 종(Trametes spp.), 심포디오마이콥시스 종(Sympodiomycopsis spp.), 플라보세트라리아 니발리스(Flavocetraria nivalis), 암펠로마이세스 종(Ampelomyces spp.), 짐노푸스 비포르미스(Gymnopus biformis), 짐노푸스 종, 짐노푸스 콘플루엔스(Gymnopus confluens), 짐노푸스 스폰기오수스(Gymnopus spongiosus), 콜리비아 리디이(Collybia readii), 마라스미엘루스 스테노필루스(Marasmiellus stenophyllus), 마라스미엘루스 라메알리스(Marasmiellus ramealis), 마라스미우스 스코로도니우스(Marasmius scorodonius), 콜리비아 마라스미오이데스(Collybia marasmioides), 마이크로팔레 브라시콜렌스(Micromphale brassicolens), 카리피아 몬타그네이(Caripia montagnei), 로도콜리비아 종(Rhodocollybia spp.), 안트라코필룸 라테리티움(Anthracophyllum lateritium), 안트라코필룸 아르케리(Anthracophyllum archeri), 안트라코필룸 종(Anthracophyllum spp.), 파네로캐테 종(Phanerochaete spp.), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지아에, 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 종(Aspergillus spp.), 트리콜로마 임브리카툼(Tricholoma imbricatum), 트리콜로마 플라보비렌스(Tricholoma flavovirens), 토멘텔라 서브리라시나(Tomentella sublilacina), 리조포곤 종(Rhizopogon spp.), 라카리아 종(Laccaria spp.), 이노시베 종(Inocybe spp.), 헤벨로마 종(Hebeloma spp.), 코르티나리우스 종(Cortinarius spp.), 클라불리나 종(Clavulina spp.), 제로코무스 종(Xerocomus spp.), 아마니타 종(Amanita spp.), 유로티움 헤르바리오룸(Eurotium herbariorum), 에듀일리아 아테시아(Edyuillia athecia), 와르쿠피엘라 스피눌로사, 헤미카르펜텔레스 파라독수스(Hemicarpenteles paradoxus), 헤미카르펜텔레스 아칸토스포루스(Hemicarpenteles acanthosporus), 헤미카르펜텔레스 종(Hemicarpenteles spp.), 채토사르토리아 크레메아(Chaetosartorya cremea), 페트로마이세스 종(Petromyces spp.), 그라피움 텍토나에(Graphium tectonae), 디플로라이멜로이데스 종(Di plolaimelloides spp.), 랍돌라이무스 종(Rhabdolaimus spp.), 호헨부엘리아 페탈로데스(Hohenbuehelia petalodes), 글로메렐라 그라미니콜라(Glomerella graminicola), 크립토코쿠스 아르보리포르미스(Cryptococcus arboriformis), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코쿠스 종(Cryptococcus spp.), 감시엘라 파르비콜리스(Gamsylella parvicollis), 모나크로스포리움 합토틸룸, 모나크로스포리움 시쿠아넨세(Monacrosporium sichuanense), 모나크로스포리움 종, 모나크로스포리움 게피로파굼(Monacrosporium gephyropagum), 모나크로스포리움 종, 드렉슬레렐라 코엘로부로카(Drechslerella coelobrocha), 드렉슬레렐라 닥틸로이데스(Drechslerella dactyloides), 드렉슬레렐라 종(Drechslerella spp.), 아르트로보트리스 무시포르미스(Arthrobotrys musiformis), 아르트로보트리스 플라그란스(Arthrobotrys flagrans), 아르트로보트리스 헤르트지아나(Arthrobotrys hertziana), 아르트로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora), 아르트로보트리스 베르미콜라(Arthrobotrys vermicola), 아르트로보트리스 종(Arthrobotrys spp.), 모나크로스포리움 드렉슬레리(Monacrosporium drechsleri), 베르미스포라 종(Vermispora spp.), 슈달레스케리아 보이디이(Pseudallescheria boydii)(세도스포리움 아피오스페르뭄(Scedosporium apiospermum)), 세도스포리움 안플라툼(Scedosporium inflatum), 게오스미티아 종(Geosmithia spp.), 글로메렐라 신굴라타(Glomerella cingulata), 로포데리미움 피세아에(Lophodermium piceae), 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum), 푸사리움 종(Fusarium spp.), 플레우로투스 에린기이(Pleurotus eryngii), 신트락티아 소르기-불가리스(Cintractia sorghi-vulgaris), 칸타로시베 그루베리(Cantharocybe gruberi), 보우르도티아 종(Bourdotia spp.), 아우리쿨라리아 종(Auricularia spp.), 푸시니아 마르톨로마에이(Puccinia bartholomaei), 푸시니아 종(Puccinia spp.), 디아포르테 파세올로룸(Diaporthe phaseolorum), 멜란코니스 스틸보스토마(Melanconis stilbostoma), 자일리아 종(Xylaria spp.), 트리코피톤 에퀴눔(Trichophyton equinum), 트리코피톤 톤수란스(Trichophyton tonsurans), 트리코피툼 비올라세움(Trichophytum violaceum), 트리코피툼 루브룸(Trichophytum rubrum), 트리코피툼 인테르디기탈레(Trichophytum interdigitale), 트리코피툼 스코엔레인니이(Trichophytum schoenleinii) 트리코피톤 종(Trichophyton spp.), 클로로필룸 아간코이데스(Chlorophyllum agancoides), 세노코쿰 게오필룸(Cenococcum geophilum), 헬로티알레스 종(Helotiales spp.), 리조사이푸스 엔카에(Rhizoscyphus encae), 락타리우스 푸베센스(Lactarius pubescens), 락타리우스 종(Lactarius spp.), 필로데르마 팔락스(Piloderma fallax), 수일루스 루테우스(Suillus luteus), 아마니타 무스카리아(Amanita muscaria), 트리콜로마 종(Tricholoma spp.), 라카리아 cf 비콜로우르(Laccaria cf bicolour), 코르티나리우스 푸르푸라센스(Cortinarius purpurascens), 세리디움 종(Seiridium spp.), 아피오스포라 몬타그네이, 콘드로스테레움 푸르푸레움(Chondrostereum purpureum), 보트리오바시디움 서브코로나툼(Botryobasidium subcoronatum), 볼레텔루스 시키아누스(Boletellus shichianus), 볼레텔루스 종(Boletellus spp.), 하이포크레아 파리노스(Hypocrea farinose), 하이포크레아 종(Hypocrea spp.), 사르코스트로마 레스티오니스(Sarcostroma restionis), 사르코스트로마 종(Sarcostroma spp.), 트룬카텔라 베툴라에(Truncatella betulae), 트룬카텔라 종(Truncatella spp.), 페스탈로티옵시스 마틸다에(Pestalotiopsis matildae), 파라코니오티리움 종(Paraconiothyrium spp.), 포마 종(Phoma spp.), 쿤닝하멜라 바이니에리(Cunninghamella bainieri), 쿤닝하멜라 베르톨레티아에(Cunninghamella bertholletiae), 칸타렐루스 시바리우스(Cantharellus cibarius), 아피오스포라 밤부사에(Apiospora bambusae), 아피오스포라 종(Apiospora spp.), 디스코스트로마 보탄(Discostroma botan), 세로코포라 카우데이트(Cercophora caudate), 그노모니아 리비콜라(Gnomonia ribicola), 파우렐리나 엘론게이트(Faurelina elongate), 마이코리자(Mycorrhiza) 진균, 지오마이세스 판노룸(Geomyces pannorum), 코프리누스 종(Coprinus spp.), 아크레모니움 종(Acremonium spp.), 클로노스타키스 종(Clonostachys spp.), 포마 에우피레나(Phoma eupyrena), 테트라클라디움 종(Tetracladium spp.), 모르티엘라 종(Mortierella spp.), 툴라스넬라 칼로스포라(Tulasnella calospora), 에풀로리자 종(Epulorhiza spp.), 툴라스넬라 칼로스포라, 안타르토마이세스 피크로트로피쿠스(Antarctomyces psychrotrophicus), 암피스파에리아세아에 종(Amphisphaeriaceae spp.), 포몹시스 종(Phomopsis spp.), 트리코더마 종(Trichoderma spp.), 페스탈로티옵시스 종(Pestalotiopsis spp.,), 페스탈로티옵시스 종, 트리코코마세아에 종(Trichocomaceae spp.), 코니오카에탈레스 종(Coniochaetales spp.), 트레멜라레스 종(Tremellales spp.), 도티데알레스 종(Dothideales spp.), 필라코라세아에 종(Phyllachoraceae spp.), 사카로마이세탈레스 종(Saccharomycetales spp.), 헬포트리키엘라세아에 종, 릴롭시다 종(Liliopsida spp.), 트리코스포로날레스 종(Trichosporonales spp.), 트리코스포론 마이코톡시니보란스(Trichosporon mycotoxinivorans), 트리코스포론 종(Trichosporon spp.), 도티오라세아에 종(Dothioraceae spp.), 하이포크레알레스 종(Hypocreales spp.), 마이코스파에렐라세아에 종(Mycosphaerellaceae spp.), 스포리디오볼라레스 종(Sporidiobolales spp.), 클라비시피타세아에 종(Clavicipitaceae spp.), 플레오스포랄레스 종(Pleosporales spp.), 우스틸라기나세아에 종(Ustilaginaceae spp.), 필라코라세아에 종, 무코라세아에 종(Mucoraceae spp.), 소르다리알레스 종(Sordariales spp.), 필로바시디알레스 종(Filobasidiales spp.), 칼로스파에리아세아에 종(Calosphaeriaceae spp.), 클라비시피타세아에 종, 무코랄레스 종(Mucorales spp.), 헬포트리키엘라세애 종, 마이크로도치움 종(Microdochium spp.), 필라코라세아에 종, 조피아세아에 종(Zopfiaceae spp), 보트리오스파에리아세아에 종(Botryosphaeriaceae spp.), 헬로티아세아에 종(Helotiaceae spp.), 비오넥트리아세아에 종(Bionectriaceae spp.), 라크로클라디아세아에 종(Lachnocladiaceae spp.), 디 포다스카세아에 종(Di podascaceae spp.), 카울레파세아에 종(Caulerpaceae spp.), 마이크로스트로마탈레스 종(Microstromatales spp.), 아필로포랄레스 종(Aphyllophorales spp.), 몬타그눌라세아에 종(Montagnulaceae spp.), 짐노아스카세아에 종(Gymnoascaceae spp.), 크리포넥트리아세아에 종(Cryphonectriaceae spp.), 자일라리알레스 종(Xylariales spp.), 몬타그눌라세아에 종, 채토미아세아에 종(Chaetomiaceae spp.), 잔토리아 엘레간스(Xanthoria elegans), 리조푸스 종(Rhizopus spp.), 페니실리움 종(Penicillium spp.), 세트라리아 아쿨레에이트(Cetraria aculeate), 네프로몹시스 라우레리(Nephromopsis laureri), 투케르만놉시스 클로로필라(Tuckermannopsis chlorophylla), 세트라리아 에리세토룸(Cetraria ericetorum), 세트라리아 종(Cetraria spp.), 플라보세트라리아 쿠쿨라타(Flavocetraria cucullata), 카에르네펠티아 메릴리이(Kaernefeltia merrillii), 아모로시아 리토랄리스(Amorosia littoralis), 쿰발라리아 시아네센스(Quambalaria cyanescens), 코르디셉스 로세오스트로마타(Cordyceps roseostromata), 코르디셉스 종(Cordyceps spp.), 루술라 종(Russula spp.), 클라불리나 종, 투베르 케르시콜라(Tuber quercicola), 짐노미세스 종(Gymnomyces spp.), 테트라캐툼 엘레강스(Tetrachaetum elegans), 안귈로스포라 롱기시마(Anguillospora longissima), 하이포크레아 종, 시로코쿠스 코니게누스, 리조포곤 로세올루스, 리조포곤 올리바세오틴크투스(Rhizopogon olivaceotinctus), 리조포곤 종, 피솔리투스 마이크로카르푸스(Pisolithus microcarpus), 리조사이푸스 에리카에(Rhizoscyphus ericae), 코르티나리우스 글라우코푸스(Cortinarius glaucopus), 팍실루스 종(Paxillus spp.), 수일루스 바리에가테스(Suillus variegates), 피로바쿨룸 아에로피룸(Pyrobaculum aerophilum), 툴라스넬라 종(Tulasnella spp.), 호헨부에헬리아 종(Hohenbuehelia spp.), 코클리오볼루스 루나투스(Cochliobolus lunatus), 플리카투롭시스 크리스파(Plicaturopsis crispa), 본다르세보마이세스 탁시(Bondarcevomyces taxi), 타피넬라 파누오이데스(Tapinella panuoides), 타피넬라 종(Tapinella spp.), 아우스트로팍실루스 종(Austropaxillus spp.), 곰피디우스 로세우스(Gomphidius roseus), 기로돈 리비두스(Gyrodon lividus), 필로포루스 펠레티에리(Phylloporus pelletieri), 카모닉시아 카에스피토세(Chamonixia caespitose), 포르필렐루스 포르필로스포루스(Porphyrellus porphyrosporus), 트룬코콜루멜라 시트리나(Truncocolumella citrina), 타피넬라 아트로토멘토사(Tapinella atrotomentosa), 스클레로더마 리브(Scleroderma leave), 수일루스 바리에가테스, 수일루스 종(Suillus spp.,), 포르필렐루스 포르필로스포루스, 피솔리투스 아르히주스(Pisolithus arrhizus), 파에오기로포루스 포르텐토수스(Phaeogyroporus portentosus), 멜라노가스테르 바리에가테스(Melanogaster variegates), 뉴코기로파나 몰루스카(Leucogyrophana mollusca), 하이드노메룰리우스 피나스트리(Hydnomerulius pinastri), 곰피디우스 로세우스, 기로돈 리비두스, 기로포루스 시아네센스(Gyroporus cyanescens), 크날시포루스 피페라투스(Cnalciporus piperatus), 카모닉시아 카에스피토세, 본다르세보마이세스 탁시, 덴드리피엘라 트리티시콜라(Dendryphiella triticicola), 귀나르디아 종(Guignardia spp.), 시라이아 종(Shiraia spp.), 클라도스포리움 종(Cladosporium spp.), 포몹시스 종, 디아포르탈레스 종(Diaporthales spp.), 페스탈로티옵시스 종, 로피오스토마 종(Lophiostoma spp.), 베르티실룸 클라미도스포리움(Verticillium chlamydosporium), 파에실로마이세스 릴라시누스(Paecilomyces lilacinus), 파에실로마이세스 바리오티(Paecilomyces varioti), 파에실로마이세스 종, 세라토리자 오리자에-사티바에(Ceratorhiza oryzae-sativae), 게오스미티아 팔리다(Geosmithia pallida), 게오스미티아 종, 게오시폰 피리포르미스(Geosiphon pyriformis), 아고미니아 종(Agonimia spp.), 피르길루스 자바니쿠스, 엑소피알라 더마티티디스(Exophiala dermatitidis), 엑소피알라 피시필라(Exophiala pisciphila), 엑소피알라 종(Exophiala spp.), 라미클로리디움 안셉스(Ramichloridium anceps), 라미클로리디움 종(Ramichloridium spp.), 카프로니아 필로셀라(Capronia pilosella), 이사리아 파리노세(Isaria farinose), 코포니아 수칼스포리아(Pochonia suchlasporia), 레카니실리움 프살리오타에(Lecanicillium psalliotae), 도티데오마이세테 종(Dothideomycete spp.), 레오티오마이세테 종(Leotiomycete spp.), 우스틸라기노이데아 빅센스(Ustilaginoidea vixens), 하이포지마 리그니콜라(Hyphozyma lignicola), 코니오차에타 말라코트리차(Coniochaeta malacotricha), 코니오차에타 종(Coniochaeta spp.), 토루비엘라 콘프라고사(Torrubiella confragosa), 이사리아 테누이페스(Isaria tenuipes), 마이크로스포룸 카니스(Microsporum canis), 마이크로스포룸 아우도우이니이(Microsporum audouinii), 마이크로스포룸 종(Microsporum spp.), 에피코쿰 플로코숨(Epicoccum floccosum), 기가스포라 로지아(Gigaspora rosea), 기가스포라 종, 가노더마 종(Ganoderma spp.), 슈도페로노스포라 쿠벤시스(Pseudoperonospora cubensis), 히알로페로노스포라 파라시티카(Hyaloperonospora parasitica), 플렉토포멜라 종(Plectophomella spp.), 아우레오바시디움 풀룰란스(Aureobasidium pullulans), 글로에오필룸 세피아리움(Gloeophyllum sepiarium), 글로에오필룸 종(Gloeophyllum spp.), 돈키오포리아 익스판사(Donkioporia expansa), 안트로디아 시누오사(Antrodia sinuosa), 파에오아크레모니움 루브리게눔(Phaeoacremonium rubrigenum), 파에오아크레모니움 종(Phaeoacremonium spp.), 알베르티니엘라 폴리포리콜라(Albertiniella polyporicola), 세팔로테카 술푸레아(Cephalotheca sulfurea), 플라고스파에리아 레니프브르미스(Fragosphaeria renifbrmis), 플라고스파에리아 종(Fragosphaeria spp.), 피알레모니움 디모르포스포룸(Phialemonium dimorphosporum), 피알레모니움 종(Phialemonium spp.), 피키아 노르베겐시스(Pichia norvegensis), 피키아 종(Pichia spp.), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 종(Candida spp.), 곤다와나마이세스 종(Gondawanamyces spp.), 그라피움 종(Graphium spp.), 암브로시엘라 종(Ambrosiella spp.), 마이크로글로숨 종(Microglossum spp.), 네오불가리아 푸라(Neobulgaria pura), 홀와야 무키다(Holwaya mucida), 클로로비브리세아 종(Chlorovibrissea spp.), 클로로시보리아 종(Chlorociboria spp.), 탁스테로그 아스테르 종(Thaxterog aster spp.), 코르티나리우스 종, 셋켈리오가스테르 종(Setchelliogaster spp.), 팀그로베아 종(Timgrovea spp.), 데스코미세스 종(Descomyces spp.), 하이메노가스테르 아레나리우스(Hymenogaster arenarius), 콰드리스포라 투베르쿨라리스(Quadrispora tubercularis), 콰드리스포라 종(Quadrispora spp.), 프로토글로숨 비올라세움(Protoglossum violaceum), 세라토스토멜라 피레나이카(Ceratostomella pyrenaica), 세라토스파에리아 람파도포라(Ceratosphaeria lampadophora), 폰세카에아 페드로소이(Fonsecaea pedrosoi), 플레비아 아세리나(Phlebia acerina), 플레비아 종(Phlebia spp.), 페스탈로티옵시스 디세미나타(Pestalotiopsis disseminata), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 라코스페르미세스 코아에(Racospermyces koae), 엔도라에시움 아카시아에(Endoraecium acaciae), 우로마이클라디움 테페리아눔(Uromycladium tepperianum), 우로마이클라디움 종(Uromycladium spp.), 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus), 아가리쿠스 종(Agaricus spp.), 실로시베 퀴베센시스(Psilocybe quebecensis), 실로시베 메르다리아(Psilocybe merdaria), 실로시베 종(Psilocybe spp.), 짐노필루스 루테오폴리우스(Gymnopilus luteofolius), 짐노필루스 리퀴리티아에(Gymnopilus liquiritiae), 짐노필루스 종(Gymnopilus spp.), 하이폴로마 투베로숨(Hypholoma tuberosum), 멜라노투스 하르티이(Melanotus hartii), 파나에올루스 울리기노수스(Panaeolus uliginosus), 스트로파리아 루고소아눌라타(Stropharia rugosoannulata), 데르모시베 세미산귀네아(Dermocybe semisanguinea), 데르모시베 종(Dermocybe spp.), 헬리코마 몬트* 페스(Helicoma month* pes), 헬리코마 종(Helicoma spp.), 투뷰피아 헬리코마이세스(Tubeufia helicomyces), 투뷰피아 종(Tubeufia spp.), 레오후미콜라 베루코사(Leohumicola verrucosa), 렙토스파에룰리나 차르타룸(Leptosphaerulina chartarum), 마르코포마 종(Macrophoma spp.), 마르소니나 로사에(Marssonina rosae), 보트리오티니아 푸켈리아나(Botryotinia fuckeliana), 페스탈로티옵시스 종, 크리소스포리움 카르미차엘리이(Chrysosporium carmichaelii), 크리소스포리움 종(Chrysosporium spp.), 닥틸렐라 옥시스포라(Dactylella oxyspora), 닥틸렐리나 로바툼(Dactylellina lobatum), 쿠쿠르비타세아에 종(Cucurbitaceae spp.), 크리소필룸 스파르시플로룸(Chrysophyllum sparsiflorum), 크리소필룸 종(Chrysophyllum spp.), 블루메리아 그라미니스(Blumeria graminis), 사와다에아 폴리피다(Sawadaea polyfida), 사와다에아 종(Sawadaea spp.), 파라운시눌라 셉타타(Parauncinula septata), 에리시페 모리(Erysiphe mori), 에리시페 종(Erysiphe spp.), 티풀로차에타 자포니카(Typhulochaeta japonica), 골로비노마이세스 오론티이(Golovinomyces orontii), 골로비노마이세스 종(Golovinomyces spp.), 포도스파에라 크산티이(Podosphaera xanthii), 포도스파에라 종(Podosphaera spp.), 아르트로클라디엘라 모게오티이(Arthrocladiella mougeotii), 네오에리시페 갈레옵시디스(Neoerysiphe galeopsidis), 필락티니아 카키콜라(Phyllactinia kakicola), 필락티니아 종(Phyllactinia spp.), 사이펠로포라 라시니아타(Cyphellophora laciniata), 스파에로그라피움 테누이로스트룸(Sphaerographium tenuirostrum), 마이크로스파에라 트리폴리이(Microsphaera trifolii), 스파에로테카 스피라에아에(Sphaerotheca spiraeae), 스파에로테카 종(Sphaerotheca spp.), 운시눌리엘라 아우스트랄리아나(Uncinuliella australiana), 압시디아 코림비페라(Absidia corymbifera), 압시디아 종(Absidia spp.), 지오트리쿰 종(Geotrichum spp.), 네크트리아 쿠르타(Nectria curta), 아나미카 락타놀렌스(Anamika lactanolens), 헤벨로마 벨루티페스(Hebeloma velutipes), 스트로파나 암비구아(Strophana ambigua), 아그로시베 프라에콕스(Agrocybe praecox), 하이드눔 루페센스(Hydnum rufescens), 하이드눔 종(Hydnum spp.), 멜리니오마이세스 바리아빌리스(Meliniomyces variabilis), 리조사이푸스 에리카에, 크립토스포리옵시스 에리카에(Cryptosporiopsis ericae), 히알로덴드론 종(Hyalodendron spp.), 렙토그라피움 룬드베르기이(Leptographium lundbergii), 렙토그라피움 종(Leptographium spp.), 테르미토마이세스 종(Termitomyces spp.), 콕시디오이데스 포사다시이(Coccidioides posadasii), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 슬레로티니아 스레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 포몹시스 종, 메타리지움 아니소플리아에(Metarhizium anisopliae), 코르디셉스 종, 틸레티옵시스 워싱토넨시스(Tilletiopsis washingtonensis), 세레나 우니콜로르(Cerrena unicolor), 스타키보트리스 차르타룸(Stachybotrys chartarum), 파에오코코마이세스 니그리칸스(Phaeococcomyces nigricans), 가노더마 필리피이(Ganoderma philippii), 가노더마 종, 글로에오필룸 세피아리움, 시스토테카 라네스트리스(Cystotheca lanestris), 레베일룰라 타우리카(Leveillula taurica), 필락티니아 프락시니(Phyllactinia fraxini), 바리코스포리움 엘로데아에(Varicosporium elodeae), 리노클라디엘라 바시토눔(Rhinocladiella basitonum), 멜란클레누스 올리고스페르무스(Melanchlenus oligospermus), 클라시브포라 루시타니아에(Clavispora lusitaniae), 리조푸스 종, 피조무코르 종(Phizomucor spp.), 무코르 종(Mucor spp.), 코니디오볼루스 코로나투스(Conidiobolus coronatus), 코니디오볼루스 종(Conidobolus spp.,), 바시디오볼루스 라나룸(Basidiobolus ranarum), 바시디오볼루스 종(basidiobolus spp.), 오크로니스 종(Ochronis spp.), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 히스토플라스마 종(histoplasma spp.), 윌콕시나 미콜라에(Wilcoxina mikolae), 라시오디플로디아 종(Lasiodiplodia spp.), 피지시아 카에시아(Physcia caesia), 피지시아 종(Physcia spp.), 브란키코니디엘롭시스 종(Brachyconidiellopsis spp.), 코노시베 락테알(Conocybe lacteal), 가스트로시베 라테리티아(Gastrocybe lateritia), 가스트로시베 종(Gastrocybe spp.), 아그로시베 세미오르비쿨라리스(Agrocybe semiorbicularis), 타프리나 프루니(Taphrina pruni), 타프리나 종(Taphrina spp.), 아스테로포라 파라시티카(Asterophora parasitica), 아스테로포라 종(Asterophora spp.), 에레모테시움 아쉬비(Eremothecium ashbyi), 트리클라디움 스플렌덴스(Tricladium splendens), 라마리아 플라바(Ramaria flava), 라마리아 종, 라카리아 프라테르날(Laccaria fraternal), 스쿠텔로스포라 종(Scutellospora spp.), 일로스포리움 카르네움(Illosporium carneum), 홉소니아 크리스티안세니이(Hobsonia christiansenii), 마르찬디오마이세스 코랄리누스(Marchandiomyces corallinus), 푸시코쿰 루테움(Fusicoccum luteum), 보트리오스파에리아 리비스(Botryosphaeria ribis), 슈도지마 아피디스(Pseudozyma aphidis), 슈도지마 종(Pseudozyma spp.), 페소툼 에루베센스(Pesotum erubescens), 바타레아 스테베니이(Battarrea stevenii), 바타레아 종(Battarrea spp.), 하르포스포리움 야누스(Harposporium Janus), 하르포스포리움 종(Harposporium spp.), 히르수텔라 로실리엔시스(Hirsutella rhossiliensis), 아르트로더마 시페리이(Arthroderma ciferrii), 아르트로더마 종(Arthroderma spp.), 푸시니아스트룸 고에페르티아눔(Pucciniastrum goeppertianum), 크로나르티움 옥시덴탈레(Cronartium occidentale), 크로나르티움 아리조니쿰(Cronartium arizonicum), 크로나르티움 종, 페리데르미움 하르크네시이(Peridermium harknessii), 페리데르미움 종(Peridermium spp.), 크리소믹사 아르크토스타필리(Chrysomyxa arctostaphyli), 홀레야 시네카우다(Holleya sinecauda), 홀레야 종(Holleya spp.), 주프토라 라디칸스(Zoophthora radicans), 스미티움 쿨리세타에(Smittium culisetae), 아우자르트론 주피아눔(Auxarthron zuffianum), 레니스포라 프라비시마(Renispora flavissima), 크테노마이세스 세라투스(Ctenomyces serratus), 및 스포로트릭스 센키이(Sporothrix schenckii).
감염 요인으로서 기생충 종의 예는 다음으로부터 선택될 수 있는 기생충(벌레)을 포함할 수 있다: 조충류: 예를 들어 아나플로세팔라 종(Anaplocephala spp.); 디필리디움 종(Dipylidium spp.); 디필로보트리움 종(Diphyllobothrium spp.); 에키노코쿠스 종(Echinococcus spp.); 모니에지아 종(Moniezia spp.); 타에니아 종(Taenia spp.); 흡충류 예를 들어 디크로코엘리움 종(Dicrocoelium spp.); 파시올라 종(Fasciola spp.); 파람피스토뭄 종(Paramphistomum spp.); 스키스토소마 종(Schistosoma spp.); 또는 선충류, 예를 들어; 안실로스토마 종(Ancylostoma spp.); 아네카토르 종(Anecator spp.); 아스카리디아 종(Ascaridia spp.); 아스카리스 종(Ascaris spp.); 브루기아 종(Brugia spp.); 부노스토뭄 종(Bunostomum spp.); 카필라리아 종(Capillaria spp.); 차베르티아 종(Chabertia spp.); 쿠페리아 종(Cooperia spp.); 시아토스토뭄 종(Cyathostomum spp.); 실리코시클루스 종(Cylicocyclus spp.); 실리코돈토포루스 종(Cylicodontophorus spp.); 실리코스테파누스 종(Cylicostephanus spp.); 크라테로스토뭄 종(Craterostomum spp.); 딕티오카울루스 종(Dictyocaulus spp.); 디페탈로네마 종(Dipetalonema spp); 디로필라리아 종(Dirofilaria spp.); 드라쿤쿨루스 종(Dracunculus spp.); 엔테로비우스 종(Enterobius spp.); 필라로이데스 종(Filaroides spp.); 하브로네마 종(Habronema spp.); 해몬쿠스 종(Haemonchus spp.); 헤테라키스 종(Heterakis spp.); 하이오스트롱길루스 종(Hyostrongylus spp.); 메타스트롱길루스 종(Metastrongylus spp.); 메울레리우스 종(Meullerius spp.) 네카토르 종(Necator spp.); 네마토디루스 종(Nematodirus spp.); 니포스트롱길루스 종(Nippostrongylus spp.); 외소파고스토뭄 종(Oesophagostomum spp.); 온코세르카 종(Onchocerca spp.); 오스테르타기아 종(Ostertagia spp.); 옥시우리스 종(Oxyuris spp.); 파라스카리스 종(Parascaris spp.); 스테파누루스 종(Stephanurus spp.); 스트롱길루스 종(Strongylus spp.); 신가무스 종(Syngamus spp.); 톡소카라 종(Toxocara spp.); 스트롱길로이데스 종(Strongyloides spp.); 텔라도르사기아 종(Teladorsagia spp.); 톡사스카리스 종(Toxascaris spp.); 트리키넬라 종(Trichinella spp.); 트리쿠리스 종(Trichuris spp.); 트리코스트롱길루스 종(Trichostrongylus spp.); 트리오돈토포로우스 종(Triodontophorous spp.); 운시나리아 종(Uncinaria spp.), 및/또는 우케레리아종(Wuchereria spp.).
감염 요인으로서 기생충 종의 예는 다음으로부터 선택되는 원생동물을 포함할 수 있다: 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum); 뉴모사이스티스 카리니(Pneumocystis carini), 크립토스포리디움 파룸(Cryptosporidium parum), 럼블 플라겔레이fp(Rumble flagellate), 쉬겔라 아모에바(Shigella amoeba), 및 사이클로스포란가 카네테넨시스(Cyclosporanga canetenensis)를 포함하나 이에 제한되지 않는 트리파노소마(Trypanosoma), 도노반 리슈만니아(Donovan Leishmania), 말라리아원충(Plasmodium) 종을 포함하는 리슈만편모충(Leishmania) 종.
본원에 논의된 바와 같은 백신 조성물 및 방법은 특히 효과적인 면역원성 단백질이 알려진 경우 백신접종에 민감한 것으로 이미 알려져 있을 수 있는 질환의 치료 및 예방을 위해 비배타적으로 고려된다.
표 5(하기)는 면역 반응이 바람직한 경우, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위해 선택된 항원의 예시적인 예를 제공한다. 당업자는 공개 데이터베이스 및 간행물로부터 유사한 항원/표적을 용이하게 수득할 수 있고 본 발명의 조성물을 생성할 수 있다. 하나 초과의 항원이 질환의 상태, 예를 들어, 활성 감염에 비해 감염 전의 예방에 따라 대상체에게 전달될 수 있음이 이해되어야 한다. 예로서, 활성 결핵 질환이 있는 대상체의 경우, 활동기(예를 들어, ESAT6 Ag85B), 잠복기(Rv2626), 및/또는 소생기(RPfB-D)로부터의 TB 단백질을 코딩하는 TB 항원을 전달할 수 있다. 이 방식으로, 특히 Th1 반응을 도출하는 애쥬번트를 투여하는 것이 바람직한 경우, 활성 결핵이 치료될 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 본원에 기재된 조성물은 예를 들어, 활성 박테리아 또는 바이러스 감염에 대한 표준 요법과 조합하여 투여되며, 이러한 질환을 치료하는 분야에 알려진 항미생물제 또는 항바이러스제가 투여될 수 있다. 이러한 제제는 본 발명의 조성물로 치료하기 전에, 치료와 동시에(단독으로 또는 고정 용량 조합으로) 또는 치료 후에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 면역 반응이 바람직한 항원을 코딩할 수 있다. 이러한 항원의 전달은 상기 논의된 바와 같은 국소 면역 반응을 유도하거나, 항원 그 자체에 대한 적응성 면역 반응을 유발하기 위해, 즉, 백신과 유사하게 해당 항원에 대한 면역을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우, 본 발명에 따른 조성물은 면역 반응 생성을 장려하기 위해 애쥬번트와 조합될 수 있다. 적합하게, 예를 들어 IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-12; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF, 또는 이의 작용제 및 상동체로부터 선택된 하나 이상의 전염증성 사이토카인이 애쥬번트로서 활용될 수 있다. 임의적으로, 하나 이상의 전염증성 사이토카인은 특히 IL-2; IL-12; IFNγ; TNFα 및 GM-CSF로부터 선택된다.
구체적 구현예에서, 하나 이상의 전염증성 사이토카인은 IL-12, IFNγ 및 GM-CSF로부터 선택된다. 구체적 구현예에서 전염증성 사이토카인은 공동으로 또는 연속으로 투여되는 백신 조성물에 대한 애쥬번트로서 작용한다.
감염성 질환을 예방하거나 병원체 감염을 예방하기 위한 예방적 백신
예를 들어, 코딩 mRNA는 박테리아, 바이러스 또는 달리 면역 반응이 바람직한 미생물 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 암호화할 수 있다. 이러한 암호화된 생성물은 이 논의에서 '항원 생성물' 또는 '항원'으로 지칭된다. 일부 경우에, 면역은 박테리아, 바이러스 또는 달리 미생물 단백질('에피토프' 또는 '항원 결정기')의 일부에 대해서만 생성될 수 있으므로, 해당 부분만 암호화하는 것도 구상된다. 특히, 외부로 나타난 미생물 단백질 부분은 면역 인식을 위한 가능한 표적으로 선택될 수 있다. 결과적으로, 암호화된 항원은 박테리아, 바이러스 또는 달리 미생물 단백질일 수 있지만, 이의 부분적 서열, 부분 또는 단편, 특히, 이의 '에피토프 함유 단편'일 수 있다. 특정 미생물 또는 병원체에 대한 하나 초과의 항원은 동일하거나 상이한 mRNA 작제물에 제공될 수 있는 것으로 구상된다.
본원에 논의된 바와 같은 백신 조성물 및 방법은 특히 표 5에 기재된 것과 같은 효과적인 면역원성 단백질이 알려진 경우, 백신접종에 민감한 것으로 이미 알려져 있는 질환의 치료 및 예방을 위해 비배타적으로 고려된다. 결과적으로, 본원의 조성물 및 방법은 하기 기재된 면역원성 단백질, 또는 이의 변이체 중 하나 이상을 암호화하는 mRNA 작제물을 사용할 수 있다.
표 5: 감염성 질환에 대한 예시적인 백신 항원
본원에 논의된 바와 같은 백신은 적합하게(배타적이지는 않음), 세포질이든 소포이든 세포내 병원체를 향한 방향으로 구상된다. 이와 관련한 세포내 세포질 병원체의 예는 바이러스, 플라미디아 종(Chlamydia spp.), 리케치아 종(Rickettsia spp.), 리스테리아 모노사이토게네스, 및 원생동물 기생충 예컨대 플라스모디움 종(Plasmodium spp.)이다. 소포성 세포내 병원체의 예는 마이코박테리아, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 레이슈마니아 종(Leishmania spp.), 리스테리아 종(Listeria spp.), 트리파노소마 종(Trypanosoma spp.), 레지오넬라 뉴모필리아, 크립토코쿠스 네오포르만스, 히스토플라스마(Histoplasma), 및 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)를 포함한다.
일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 바이러스(SARS-CoV-2)와 같은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스의 하나 이상의 바이러스 단백질, 즉, Covid-19 팬데믹의 원인이 되는 바이러스를 암호화할 수 있다. 이 바이러스는 4 개의 구조적 단백질인 S(스파이크), E(외피), M(막), 및 N(뉴클레오캡시드) 단백질을 갖는다. 일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 전부 또는 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 S 단백질 엑토도메인의 융합전 형태(잔기 986 및 987에서 프롤린 치환을 갖는 아미노산 1 내지 1208; GenBank MN908947)를 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 또는 RBD(잔기 319 내지 591; GenBank MN908947)를 암호화한다. 이 단백질의 외부 부분으로서, 이는 면역계에 의해 인식될 수 있는 에피토프에 대한 가능한 위치이다. 일부 구현예에서, mRNA는 SARS-CoV-2의 변이체, 예를 들어, 알파, 베타, 감마, 엡실론, 델타, 카파, 또는 에타 변이체의 스파이크 단백질의 전부 또는 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 하기 표 6A에 언급된 서열(서열번호: 62 내지 67), 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 유사성을 갖는 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 스파이크 단백질 또는 이의 일부에 대한 코딩 mRNA는 인간 또는 다른 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 일부 구현예에서, mRNA에 사용되는 뉴클레오시드 중 하나 이상은 이의 이성질체에 의해 대체되었다. 예로서, mRNA 작제물에서 우리딘 뉴클레오시드의 하나 이상 또는 전부가 슈도우리딘 뉴클레오시드에 의해 대체된다. 일 구현예에서, mRNA는 SARS-CoV-2 델타 변이체의 스파이크 단백질을 암호화하고, mRNA의 기관 보호 MOP 서열은 miRNA 122, miRNA 192 및 miRNA 30a 각각에 대한 표적 부위를 포함하고, 또 다른 구현예에서 miRNA let7b에 대한 표적 부위를 추가로 포함한다. 하기에 보다 상세히 기재된 본 발명의 다른 구현예에서, mRNA는 MOP 서열이 있거나 없는 비코돈 최적화 또는 인간 코돈 최적화 우한(Wuhan) 균주, 베타 변이체 또는 알파 변이체로부터 선택된 SARS-CoV-2의 융합전 스파이크 단백질을 암호화한다. MOP 서열은 miRNA 결합 서열의 다음 조합을 포함하는 것으로부터 선택될 수 있다: miRNA 122, miRNA 192 및 miRNA 30a; 및 let7b, miRNA 126, 및 miRNA 30a; miRNA 122, miRNA 1, miRNA 203a, 및 miRNA 30a. 다른 MOP 서열은 기관 보호가 필요한 특정 상황에 따라 선택될 수 있음이 이해될 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 선택된 MOP 서열은 체내에서 각각의 표적 miRNA 서열과 완벽한 일치 혼성화를 보장하도록 추가로 최적화된 miRNA 결합 서열을 포함할 수 있다.
표 6A - 백신 조성물에 사용하기에 적합한 다양한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 변이체에 대한 예시적인 mRNA 작제물
일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 수두 대상포진 바이러스(VZV)로도 알려진 인간 알파-헤르페스바이러스 3(HHV-3)의 하나 이상의 바이러스 단백질을 암호화할 수 있다. 특정 구현예에서, 코딩 mRNA는 VZV의 하나 이상의 당단백질, 예를 들어, 당단백질 E(VZVgE)를 암호화할 수 있다.
일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 매트릭스-2 및/또는 핵단백질과 같은 인플루엔자 바이러스(유행성 계절 독감을 유발하는 A형 및 B형)의 하나 이상의 면역원성 바이러스 단백질을 암호화할 수 있다. 헤마글루티닌은 인플루엔자의 그룹, 유형 및 심지어 하위유형 간에도 매우 가변적이며, 보편적인 독감 백신 개발이 어려운 인자이다. 헤마글루티닌의 헤드(Head) 도메인은 매우 가변적이지만 헤마글루티닌의 막 근위 줄기 도메인은 그룹 내에서 비교적 잘 보존되어 있지만, 면역차상위우성이다. 따라서 일부 백신 전략은 헤드 도메인이 없는 환원된 HA를 사용하고 따라서 이러한 환원된 HA가 본 발명의 구현예에서 제공될 수 있음이 고려된다.
인플루엔자의 임의의 그룹, 유형 또는 하위유형, 예를 들어, 인플루엔자 A 그룹 1: H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, H18 하위유형 및 N1, N4, N5, N8 하위유형; 인플루엔자 A 그룹 2: H3, H4, H7, H10, H14, H15 하위유형 + N2, N3, N6, N7, N9 하위유형; 또는 인플루엔자 B로부터 하나 이상의 면역원성 바이러스 단백질을 제공하는 것이 고려된다. 인플루엔자 B 바이러스는 하위유형으로 나누지 않지만, 대신 2 가지 계통: B/Yamagata 및 B/Victoria로 추가로 분류된다.
뉴라미니다제는 헤마글루티닌보다 더 느리게 이동하며, 뉴라미니다제에 대한 항체는 하위유형 내에서 교차 보호하는 것으로 나타났다. 뉴라미니다제는 헤마글루티닌과 비교하여 면역차상위우성이다. 매트릭스-2 및/또는 핵단백질은 헤마글루티닌보다 더 보존되지만 면역차상위우성이다.
매년, WHO는 예측에 기반하여 4가 또는 3가 인플루엔자 백신을 권고한다. 결과적으로, 광범위한 보호를 제공하기 위해, 하나 초과의 인플루엔자 항원을 암호화하는 조성물 및 작제물을 제공하는 것이 특히 구상된다.
일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 F 당단백질 및/또는 G 당단백질과 같은 호흡기 세포융합 바이러스의 하나 이상의 면역원성 바이러스 단백질을 암호화할 수 있다. A2 균주로부터의 F 당단백질은 RSV A(Long) 및 RSV B(18537) 균주에 대한 교차 보호를 유도하는 McLellan 등, 2013에 의해 기재된 변형을 사용하여 융합전 형태로 안정화될 수 있다.
일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 당단백질 120 중화 에피토프(예컨대 CD4BS 421-433 에피토프) 또는 당단백질 145의 전장 또는 일부와 같은 인간 면역결핍 바이러스의 하나 이상의 면역원성 바이러스 단백질을 암호화할 수 있다. gag, pol, env, 및 nef와 같은 HIV로부터의 항원은 가능한 백신 후보로서 다양한 벡터에서 발현되었다(IP Nascimento and LCC Leite, Braz J Med Biol Res. 2012 doi: 10.1590/S0100-879X2012007500142).
일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 마이코박테리움 속으로부터의 박테리아의 하나 이상의 면역원성 박테리아 단백질, 또는 이의 일부를 암호화할 수 있다. 특히, 코딩 mRNA는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 및/또는 마이코박테리움 레프라에 박테리아로부터의 하나 이상의 박테리아 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 mRNA는 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 활동기 및/또는 잠복기 및/또는 소생기로부터의 하나 이상의 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들어, mRNA는 ESAT-6, Ag85B, TB10.4, Rv2626 및/또는 RpfD-B로부터 선택된 엠. 투베르쿨로시스 단백질, 또는 이의 일부 중 하나 이상을 암호화할 수 있다
하기 표 6B는 본 발명에 사용될 수 있는 다수의 상이한 잠재적 병원체에 대한 항원을 암호화하는 ORF의 예를 나타낸다. 이들 ORF는 본원에 기재된 바와 같이, 추가의 RNA 서열, 가장 특히 OPS와 함께 존재할 수 있고/있거나, 추가의 mRNA 작제물와 조합하여 사용될 수 있다. 상기 논의와 유사하게, 일부 구현예에서, RNA는 하기 표 6에 언급된 서열(서열번호: 69 내지 84), 또는 이의 에피토프-함유 단편, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 유사성을 갖는 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 또는 이의 일부에 대한 코딩 mRNA는 인간 또는 다른 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 일부 구현예에서, mRNA에 사용되는 뉴클레오시드 중 하나 이상은 이의 이성질체에 의해 대체되었다. 예로서, mRNA 작제물에서 우리딘 뉴클레오시드 중 하나 이상 또는 전부가 슈도우리딘 뉴클레오시드에 의해 대체된다.
표 6B - 인간 세포 발현에 대해 최적화되거나 MOP 서열을 함유하지 않는 백신 조성물에서 사용하기에 적합한 여러 병원체에 대한 항원의 ORF 예.
특히 예를 들어, 하나 초과의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질로부터의 스파이크 단백질을 암호화하는 하나 초과의 항원을 암호화하는 mRNA를 포함한 약제학적 조성물을 포함하는 조성물이 구상된다. 다중 항원은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 동일하거나 상이한 mRNA 작제물에 의해 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 야생형 SARS-CoV-2, 베타(남아프리카) 변이체 SARS-CoV-2, 및 델타 변이체 SARS-CoV-2 중 적어도 2 개, 적합하게 3 개 모두로부터의 스파이크 단백질을 암호화하는 mRNA 작제물을 포함하는 조성물이 제공된다. 이들은 동일하거나 상이한 mRNA 작제물 상에 존재할 수 있다. 이들 항원을 암호화하는 mRNA 작제물(들)은 OPS가 결여될 수 있거나, 이들 중 하나 이상, 적합하게 모두는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 OPS를 갖는다. 일부 구현예에서, OPS는 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 서열; 또는 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 임의의 이들 구현예에서, 조성물은 또한 하기에 추가로 논의된 바와 같이, 면역조절제를 코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 특히, 조성물은 또한 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같이, IL-12를 암호화하는 mRNA를 포함할 수 있다. 면역조절제 mRNA는 OPS가 결여될 수 있거나, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 OPS를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, OPS는 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 서열; 또는 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 구체적 구현예에서, 항원(예를 들어, 2 개 이상의 변이체 SARS-CoV-2 스파이크 단백질)을 암호화하는 mRNA 작제물(들)은 OPS가 결여될 수 있는 반면, 면역조절제(예를 들어, IL-12)를 암호화하는 mRNA 작제물(들)은 기재된 바와 같이, OPS를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, SARS-CoV-2(또는 이의 변이체) 및 인플루엔자 각각으로부터의 바이러스 단백질을 암호화하는 mRNA 포함하는 조성물은, 예를 들어, 이들 바이러스 중 하나 또는 둘 다의 계절성, 신규, 또는 새로 생겨난 변이체에 대한 다가 또는 공동 백신접종을 제공하기 위해 제공될 수 있는 것으로 구상된다. 다른 곳에 기재된 바와 같이, 상이한 항원이 동일하거나 상이한 mRNA 작제물 상에 제공될 수 있고, 이들 mRNA 작제물(들)은 OPS가 결여될 수 있거나, 다른 곳에 기재된 바와 같은 OPS/MOP를 포함할 수 있다. 조성물은 하기에 추가로 논의된 바와 같이, IL-12와 같은 면역조절제를 코딩하는 mRNA를 추가로 포함할 수 있다. 이 mRNA는 또한 기재된 바와 같이, OPS를 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 항원 생성물을 코딩하는 mRNA는 다중 기관을 보호하는 적어도 하나의 OPS(즉 다중-기관 보호 서열 또는 "MOP")를 추가적으로 포함하며, 여기서 OPS 서열은 적어도 3 개(예를 들어, 적어도 제1, 제2 및 제3) 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함한다. 표적 서열 중 하나는 miRNA-1과 결합할 수 있는 서열일 수 있다. 표적 서열은 miRNA-1, miRNA-133a, miRNA-206, miRNA-122, miRNA-192, miRNA-203a, miRNA-205, miRNA-200c, miRNA-30a/b/c, 및/또는 Let7a/b 중 하나 이상, 적합하게 이들 모두와 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있다.
임의의 항원-암호화 mRNA의 다양한 구현예에서, OPS는 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 서열; Let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 서열; miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 서열; 또는 miRNA-192, miRNA-30a, 및 miRNA-124와 결합할 수 있는 서열, miRNA 122와 결합할 수 있는 2 개의 서열을 포함할 수 있다. 여기에 기재된 것과 같은 임의의 OPS는 뇌 조직 보호를 위해 miRNA-124와 결합할 수 있는 서열, 및/또는 Let7b와 결합할 수 있는 서열을 추가로 포함할 수 있다. OPS 내의 표적 서열의 순서(즉, 5'에서 3'으로 배열)는 중요한 것으로 고려되지 않고, 임의의 순열이 고려될 수 있다.
상기 언급된 접근법은 면역 반응이 박테리아 또는 다른 유기체에 의해 생성된 비활성화 독소에 대해 유도되는 전형적인 '톡소이드' 백신, 또는 면역 반응이 표적 미새물의 단편에 대해 유도되는 '서브유닛' 백신과 유사한 백신 치료적 조성물을 제조하는 데 특히 적합한 것으로 이해될 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 임의의 구현예는 제안된 표적 조직으로서, 혈액 또는 이의 세분(예컨대 조혈 세포, 림프계 세포 등)을 가질 수 있지만, 혈액 및 이의 세분은 면역 반응을 유도하는 것이 목적이고/이거나, 면역 반응이 코딩 mRNA에 의해 암호화된 생성물에 대해 유도되어야 하고/하거나, 임의적으로 백신 요법을 제공하는 것이 목적인 구현예에서 특히 적절할 수 있는 것으로 특히 간주된다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 및 적합하게, 항원 제시 세포(APC)가 특히 이러한 접근법에 대한 표적으로 고려된다.
통상적인 백신은 적어도 부분적으로, 병원체-특이적 항원를 면역계(외인성 항원)에 제시하여, 면역 반응이 이에 대해 유도될 수 있고, 이 외인성 항원을 다음에 마주쳤을 때 인식하고 빠르게 대응할 수 있도록 함으로써 기능한다. 소위 항원 제시 세포(APC)는 이 과정에서 핵심이다. 모든 유핵 세포가 내인성 항원을 세포독성 T 세포(CD8+)에 제시할 수 있지만, 특정 세포는 외인성 항원을 검출하고 제시하는 능력을 갖는 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포를 포함한 '전문' APC이다. 이들 세포는 외인성 항원을 내재화하고 처리하며, 이들 또는 이들의 단편(면역우세 에피토프)을 주요 조직적합성 복합체 유형 II(MHC-II), 및 종종 공동 자극 분자와 함께 표면 상에 제시하여, B 세포 구동된 항체 생산(적응성 면역)을 시작하는 데 중추적인 역할을 하는 CD4+ 헬퍼 T 세포와 같은 향상된 T 세포 반응을 형성한다.
이전 노력은 인플루엔자 단백질을 암호화하는 mRNA가 지질 나노입자에 투여되어, 면역 세포 모집 및 단핵구 및 수지상 세포에 의한 mRNA의 번역을 야기할 수 있음을 입증하였다(Liang 등 Efficient Targeting and Activation of Antigen-Presenting Cells In Vivo after Modified mRNA Vaccine Administration in Rhesus Macaques. Mol Ther. 2017). 따라서, 외인성 항원 또는 이의 에피토프를 암호화하는 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 구성 및 조성물로 전문 APC(예컨대 단핵구 및 수지상 세포)의 형질감염은 항원 제시, 및 해당 항원에 대한 오래 지속되는 적응성 면역의 유도를 허용하기 위해 고려된다. 그러나, 전문 APC 내에서 항원의 발현은 반드시 필요하지 않고, 생성된 항원은 생성 후 정상적인 방식으로 전문 APC에 의해 흡수되고 처리될 수 있으므로, 다른 조직에 의한 항원의 발현은 원하는 면역 반응을 유도하는 데 효과적일 수 있디.
이에 더하여 또는 대신에, 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 구성 또는 조성물은 사이토카인, 케모카인, 공동 자극 분자, 또는 주요 조직적합성 복합체와 같은 백신-유도 면역 과정과 연관된 생성물을 전달하고 발현하는 데 사용될 수 있다. 이러한 암호화된 생성물은 이 논의를 위해 '면역자극제', '면역조절 생성물' 또는 '면역조절제'로 언급되거나, 공동 투여된 백신 조성물에 대한 반응을 자극하는 데 사용될 때, '애쥬번트'로 언급된다. 항원 및 추가의 (면역조절) 성분 둘 다를 코딩하는 mRNA가 투여되는 경우, 이들은 개별 mRNA 작제물로서, 또는 상기 기재된 바와 같이, 동일한 폴리시스트로닉 mRNA 상에 함께 제형화될 수 있다. 개별 mRNA 작제물이 이러한 생성물에 대해 사용되는 경우, 개별 작제물은 각각 동일한 miRNA 결합 부위 서열 세트를 포함할 수 있거나(즉, 이들은 각각 동일한 OPS를 포함할 수 있음), 하기에 추가로 논의된 바와 같이, 상이한 miRNA 결합 부위 서열 세트(상이한 OPS)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, mRNA 작제물 중 하나 또는 다른 것은 miRNA 결합 부위 서열이 완전히 결여될 수 있다. 백신-유도 면역 과정과 연관된 생성물을 암호화하는 mNRA는 당업자에게 알려진 바와 같은 임의의 유형의 백신과의 조합, 즉 단백질-기반(톡소이드, 재조합, 접합 백신), RNA, mRNA 및 DNA-기반 백신(상기 기재된 바와 같은 환형 또는 환형화된 RNA 작제물 포함), 생 약독화 백신, 비활성화 백신, 또는 재조합-벡터 기반 백신(예를 들어 MVA 또는 아데노바이러스 플랫폼)과의 조합으로 사용될 수 있음이 이해될 수 있다.
이 방식으로, 공동 투여된 mRNA-암호화 항원 또는 다른 유형의 백신에 대한 면역 반응은 제어가능한 다양한 방식으로 향상될 수 있다. 이 접근법에 대한 또 다른 장점은 면역 반응을 향상시키기 위한 면역조절제의 투여로 단일 조성물에서 다중 폴리펩티드를 제공할 가능성이 있다는 기대이다.
예를 들어, 대식세포는 MHC-II를 발현하기 위해 인터페론 감마(IFN-γ)의 T-세포 분비에 의한 활성화를 필요로 한다. 따라서, 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 및 조성물로의 형질감염에 의한 IFN-γ 발현의 유도는 통상적인 백신 접근법으로 생겨나든 항원 발현을 유도하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 및 조성물을 사용하는 접근법으로 생겨나든, 백신-유도된 면역 반응의 우도를 향상시킬 수 있다. 유사하게, 상기 논의된 바와 같은 TLR, 적합하게 TLR8과 같은 면역원성 과정에 관여하는 세포 수용체의 유도는 또한 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 및 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.
Th1과 Th2 면역 반응 사이의 주요 차이는 Th1 면역 반응이 세포내 기생충을 사멸시키고 자가면역 반응을 영구화하는 전염증성 반응인 반면, Th2 면역 반응이 아토피에서 IgE 및 호산구성 반응을 촉진하고 기생충과 같은 큰 세포외 기생충을 사멸시키는 항-염증성 반응을 생성한다는 점이다. 더욱이, 핵심 Th1 사이토카인은 인터페론 감마(IFN-γ)인 반면 Th2 사이토카인은 인터류킨 4, 5, 6, 10, 및 13을 포함한다. Th1 면역 반응은 박테리아 및 바이러스와 같은 세포내 기생충에 대해 Th1 세포에 의해 생성된 면역 반응이다. 일반적으로, 사이토카인 IL-12는 Th1 세포를 활성화시킴으로써 Th1 면역 반응을 촉발하는 역할을 한다. 더욱이, 활성화된 Th1 세포는 인터페론-감마(IFN-γ) 및 인터류킨-2(IL-2)와 같은 사이토카인을 분비한다. Th1 면역 반응은 세포-매개 면역으로 이어지는 전염증성 반응이다. 따라서, 대식세포 뿐만 아니라 CD8 T 세포, IgG B 세포, 및 IFN-γ CD4 T 세포를 활성화시킨다. 인터페론-감마(INF-γ), 인터류킨-2(IL-2), 및 종양 괴사 인자-베타(TNF-β)를 포함하는 Th1 세포에 의해 생성된 사이토카인은 Th1 면역 반응을 매개하는 반면, 인터류킨(IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, 및 IL-13)과 같은 Th2 세포에 의해 생성된 사이토카인은 Th2 면역 반응을 매개한다.
IL-12는 항원성 자극에 대한 반응으로 수지상 세포, 대식세포, 호중구, 및 인간 B-림프아구성 세포에 의해 생성되고, T 세포의 자극 및 성장에 관여한다. IL-12는 헬퍼 T 세포의 Th1 서브세트 발달에서 핵심 역할을 하는 친-자극성 및 친-염증성 사이토카인이다. IL-12는 원래 인터페론-감마(IFN-γ) 생산, 세포 증식, 및 자연 살해 세포 및 T 세포에 의해 매개되는 세포독성을 유도하는 능력으로 인해 발견되었다. 이제 IL-12는 또한 상기 기재된 바와 같이 Th1 반응의 개발에서 핵심 역할을 하여, IFN-γ 및 IL-2 생산을 야기하는 것으로 확립된다. 이들 사이토카인은 결과적으로 세포독성 T-세포 반응 및 대식세포 활성화를 촉진할 수 있다
또 다른 구현예에서, 통상적인 백신 접근법으로 생겨나든 외인성 항원 발현을 유도하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 및 조성물을 사용하는 접근법으로 생겨나든, 백신 효능을 향상시키거나 백신-유도 면역 반응을 향상시키기 위해 IL-12 발현을 야기하는 mRNA 작제물 및/또는 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이 방식으로 IL-12는 동시에 또는 거의 동시에 전달되는 항원에 대해 특히 표적화된 수용자에게 면역자극성 반응을 제공하기 위해 애쥬번트로서 존재한다. 이전에 언급된 바와 같이, Th1 반응을 유도하는 IL-12의 유리한 생물학적 활성은 IFN-γ 및 IL-2 생산을 촉진한다. 함께, 이들 사이토카인은 결과적으로 투여된 항원에 반응하여 세포독성 T-세포 면역을 촉진할 수 있다. 이 유형의 백신 요법의 수용자에서 면역원성 반응은 몇 가지 예를 들면 SARS-CoV-2, 인플루엔자, HIV 및 RSV를 포함하는 바이러스와 같은 세포내 병원체; 또는 심지어 마이코박테리움 투베르쿨로시스와 같은 세포내 박테리아 병원체로부터 비롯된 감염성 질환의 치료 또는 예방에 특히 적합하다.
과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF 또는 CSF2; GenBank AAA52578)는 T 세포, B 세포, 대식세포, 비만세포, 내피 세포, 섬유아세포, 및 지방세포를 포함하는 다양한 세포 유형에 의해 생성된 면역조절제이다. GM-CSF는 또한 항원 제시 세포의 기능을 조절하고 수지상 세포 활성화 향상, 및 단핵 포식세포 성숙 향상에 관여한다. GM-CSF는 반응을 자극하기 위해 백신에서 이전에 사용되었다(Yu 등 Novel GM-CSF-based vaccines: One small step in GM-CSF gene optimization, one giant leap for human vaccines. Hum Vaccin Immunother. 2016). 특히, GM-CSF는 디프테리아 예방(Grasse M 등 GM-CSF improves the immune response to the diphtheria-component in a multivalent vaccine. Vaccine. 2018), 및 결핵 예방(Wang 등, Enhanced immunogenicity of BCG vaccine by using a viral-based GM-CSF transgene adjuvant formulation. Vaccine. 2002)을 포함하나 이에 제한되지 않는 박테리아 질환 또는 감염에 대한 백신 반응을 개선시키는 것으로 나타났다. 유사한 개선이 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스(Liu 등 Influenza virus-hke particles composed of conserved influenza proteins and GPI-anchored CCL28/GM-CSF fusion proteins enhance protective immunity against homologous and heterologous viruses. Int Immunopharmacol. 2018), 및 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(Yu 등 Construction and in vitro evaluation of a recombinant live attenuated PRRSV expressing GM-CSF. Virol J. 2014)를 포함하나 이에 제한되지 않는 바이러스 질환 또는 바이러스 감염에 대한 백신 접근법에서 GM-CSF를 사용하여 발견되거나 이론화되었다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 또는 조성물을 사용하여 GM-CSF에 대한 코딩 mRNA의 도입은 항체 및 세포 면역 반응 둘 다를 통해 백신 면역원성을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 따라서 이러한 접근법은 인간 및 다른 수용자, 및 예방적 및 치료적 백신 유형 둘 다에서 백신 애쥬번트, 인핸서, 또는 면역학적 부스터로서 사용될 수 있다. 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF 또는 CSF1; GenBank BC021117) 및 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF 또는 CSF3; GenBank BC033245)와 같은 다른 CSF 유형 단백질에 대해 유사한 효과를 볼 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, IFN-α 및 IFN-β는 주로 바이러스 감염에 대한 선천성 면역에 관여하고, 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 또는 조성물을 사용하여 이들 제제 중 하나 또는 둘 다의 도입은 기재된 바와 같이, 면역원성을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
IFN-γ 합성은 적응성 면역 반응의 강도 및 품질에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 적응성 면역 반응이 나타나기 전에 발생하는 면역화 후 IFN-γ의 초기 합성은 백신에 대한 고품질 면역 반응의 신호이다. 선천성 면역 세포에 의한 IFN-γ의 이러한 초기 방출은 수지상 세포 성숙에 영향을 미치고 결과적으로 Th1 계통에 대한 CD4+ T 세포의 분극화에 영향을 미친다.
IFN-γ 및 IL-2는 또한 논의된 바와 같은 활성화된 CD4+ Th1 세포에 의해 생성되고, 이들 제제 중 하나 또는 둘 다의 도입은 관련 반응을 증가시킬 수 있는 것으로 고려된다. 유사하게, 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같은 TNFα는 감염에 대한 염증성 반응의 일부로서 다른 면역계 세포를 모집하도록 방출되고, 따라서 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 또는 조성물을 사용한 이의 제공은 항바이러스 면역원성을 향상시키는 데 사용될 수 있다.
IL-6은 B 세포의 면역글로불린-분비 세포로의 최종 분화에 관여하고, 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 또는 조성물을 사용한 이의 도입은 면역원성을 개선하도록 구상된다.
IL-8의 도입은 본원에 기재된 바와 같이 투여될 때 호중구 주화성을 개선하여 면역원성을 개선하는 것으로 고려된다.
본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 또는 조성물을 사용하여 유도될 수 있는 백신-유도 면역 과정와 연관된 생성물의 다른 예는 결핵(BCG) 백신에 대한 백신 반응의 발달에 연루된 핵 인자 NF-κB 경로의 조절제를 포함한다(Shey 등 Maturation of innate responses to Mycobacterium over the first nine months of life. J Immunol. 2014).
상기 기재된 것과 같은 공동 투여를 위한 특정 면역조절제를 선택하는 능력은 특정 유형의 면역 반응의 촉진을 허용하며, 특정 병원체에 대한 효과적인 면역을 유도하는 데 유익할 수 있다. 예로서, 논의된 바와 같은 IL-12는 Th1 반응 개발에서 핵심 역할을 하여, IFN-γ 및 IL-2 생성을 야기하므로, 이러한 세포내 병원체에 대해 백신접종할 때 이 사이토카인을 공동 투여하는 것이 유익할 수 있다. IFN-γ, TNF-β, IL-2 및 IL-10과 같은 다른 Th1-연관 사이토카인이 또한 또는 대안적으로 이러한 반응을 촉진하는 데 유용할 수 있다.
상기 논의에 따른 mRNA 작제물 및 조성물은, 항원을 암호화하든 면역조절제를 암호화하든, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 기관 보호 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 기관 보호 서열은 근육, 간, 신장, 폐, 비장, 및 피부 중 하나 이상을 보호하기 위해 선택된다(예를 들어, miRNA-1, miRNA-122, miRNA-192, miRNA-30a 및/또는 miRNA-203a에 대한 표적 서열 사용). 일부 구현예에서, miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a 및 miRNA-203a의 4 개 모두에 대한 표적 서열은 기관 보호 서열에 포함된다. 이러한 조합은 근육 조직(조성물은 근육내 투여될 수 있음), 뿐만 아니라 간 및 신장 조직을 보호하는 데 효과적인 것을 생각된다. 근육 조직의 보호가 바람직한 임의의 구현예에서, miRNA 133a 및/또는 miRNA 206에 대한 표적 서열이 표 2에 따라 miRNA 대신에 또는 이에 더하여 포함될 수 있는 것으로 특히 간주된다. 예를 들어, 이러한 OPS는 miRNA-133a, miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a에 대한; 또는 miRNA-206, miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a에 대한 표적 서열을 포함할 수 있다. 피하 또는 피내 투여가 또한 통상적이고, 피부와 연관된 miRNA 표적 서열(표 2 참조) 중 하나 이상이 또한 피부의 세포를 보호하는 데 사용될 수 있다.
특정 백신은 내피 조직과의 상호작용과 연관된 부작용을 가질 수 있는 것으로 생각된다. Goldman M, Hermans C(2021) PLoS Med 18(5): e1003648. https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1003648에서, 하기 메커니즘이 제안되었다: 근육내 주사 후, 백신 아데노바이러스는 내피 세포를 감염시켜, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 생산을 유도한다. 헤파란 술페이트 PG는 내피 세포의 루미날 측 상의 스파이크 단백질에 결합하거나 손상된 세포에 의해 방출될 수 있다. 스파이크 단백질은 ACE2-의존적 및 ACE2-독립적 메커니즘을 통해 혈소판을 활성화시킬 것이다. 활성화된 혈소판에 의해 방출된 PF4는 내피 세포로부터 나온 헤파란 술페이트 PG에 결합한 후 면역원성이 될 것이다.
따라서, 일부 구현예에서, 내피 조직을 보호하기 위해 miRNA 표적 서열을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 표 2에 논의된 바와 같이, miRNA-98 및/또는 miRNA-126 표적 서열은 OPS에 포함될 수 있다. 이 유형의 보호는 임의의 투여 방식, 및 특히 혈관(정맥내, 동맥내 등)에 투여 또는 근육내 투여가 사용되는 경우 사용하는 것으로 생각된다.
다른 구현예에서 표적 서열은 상기 표 3 또는 4로부터의 하나 이상의 서열의 임의의 적절한 조합을 포함할 수 있다. 구체적 구현예에서, 면역조절제를 암호화하는 mRNA 작제물 내에 포함되는 OPS는 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a; Let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a; miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 서열; 또는 miRNA-192, miRNA-30a, 및 miRNA-124와 결합할 수 있는 서열, miRNA 122와 결합할 수 있는 2 개의 서열을 포함할 수 있다.
또한, 이러한 작제물 및 조성물에서 miRNA-142 표적 서열의 사용을 피하는 것이 유리한 것으로 간주될 수 있으므로, 이 miRNA는 조혈 기원의 세포 및 면역 세포에서 풍부하고, 따라서 백신-매개 반응을 매개할 것으로 예상되는 세포에서 발현 감소로 이어질 수 있다.
항원 및 면역조절 성분 둘 다를 코딩하는 mRNA가 투여되는 구현예에서, 이들은 공동제형화되거나, 개별적으로 제형화될 수 있는 개별 mRNA 작제물로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서 mRNA 작제물 중 하나 또는 다른 것은 miRNA 결합 부위 서열이 완전히 결여될 수 있다. 다른 경우에 각 mRNA 작제물은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 기관 보호 서열을 포함할 수 있다. 이들 기관 보호 서열은 각 mRNA 작제물에 대해 동일할 수 있거나, 상이할 수 있다. 항원 및 면역조절제 생성물의 표적외 효과에 대한 상이한 목적 및 잠재력을 고려하면, 이들 생성물에 대한 차등 발현의 상이한 패턴을 지원하고/하거나, 각 생성물에 대한 상이한 조직 또는 세포 유형에 대한 보호를 확장하기 위해, 이들 생성물 각각에 대한 상이한 기관 보호 서열을 사용하는 것이 유익할 수 있는 것으로 고려된다.
예를 들어, 항원 성분이 주로 근세포 뿐만 아니라 APC에 의해 발현되는 것이 유리할 수 있으므로, 이들 생성물을 암호화하는 mRNA에 포함된 기관 보호 서열은 다른 건강한 조직을 보호하면서, 이들 세포 유형에서 발현을 가능하게 하도록 선택될 수 있다. 일부 경우에, 항원 성분이 miRNA-122, miRNA-192, 및/또는 miRNA 30a, 또는 이들 3 개 모두에 대한 표적 서열을 포함하는 기관 보호 서열이 있는 것이 바람직할 수 있다.
IL-12와 같은 면역조절제는 표적외 효과를 생성할 가능성이 있으므로, 이들 인자를 암호화하는 mRNA는 상기 논의된 바와 같은 근육, 간, 신장, 폐, 비장 및/또는 피부에 대한 최대 보호를 제공하기 위해 선택될 수 있지만(예를 들어 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a 및/또는 miRNA-203a, 또는 이들 4 개 모두에 대한 표적 서열을 가짐), 항원 성분을 암호화하는 mRNA는 발현 폭을 증가시키기 위해 적은 수의 miRNA 결합 부위 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 구현예에 따라 투여되는 면역조절제는 단백질-기반 백신 면역원성을 개선한다.
일 구현예에서, 본 발명의 구현예에 따라 투여되는 면역조절제는 바이러스-기반 백신 면역원성을 개선한다.
치료적 백신(또는 활성 면역요법)
통상적인 예방 또는 예방적 백신접종 이외에, 더 새로운 분야는 신체에 이미 존재하는 표적, 예를 들어, 지속적인 감염 또는 암에 대한 면역 반응을 유발하는 것을 목표로 하는 치료적 백신 분야이다. 이러한 경우에 면역 반응이 종종 하향조절되거나 달리 정상 면역 반응으로부터 질환을 보호하도록 작용하는 내성 메커니즘에 의해 제한되기 때문에, 이는 훨씬 더 어려운 것으로 입증되었다(Melief 등 Therapeutic cancer vaccines JCI 2015).
따라서, 일 구현예에서, 종양 세포에서의 번역을 위한 종양성 항원을 코딩하는 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물이 제공된다. 이는 이전에 논의된 바와 같은 암 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 목표로 한다. 본 발명에 따른 기관 보호 서열을 선택적으로 사용함으로써 지금까지 명백해진 바와 같이, 동일하거나 상이한 조직 유형의 종양을 둘러싸는 조직에서 건강한 세포든, 투여 용도 또는 전신 확산에 의해 영향을 받을 수 있는 다른 기관이든, 발현은 표적 종양 조직 이외의 세포 유형, 조직 및/또는 기관에서 감소될 수 있다.
이러한 투여는 생성된 면역 반응을 개선하기 위해 치료적 백신과 조합하여 발생할 수 있거나, 그 자체가 치료적 백신일 수 있으므로, 면역계는 종양에 대한 반응을 일으키기 위해 도입된 인핸서에 반응한다.
암을 치료하기 위한 백신으로서 치료적 바이러스와의 조합(바이러스 기반 면역요법으로서 치료적 암 백신)
치료적 백신이라고도 하는 암 치료 백신은 면역계가 건강한 세포에서 발견되지 않는 암 특이적 항원(종양 연관 항원, 및/또는 신생항원)을 운반하는 세포를 인식하고 파괴하도록 부스팅하는 면역요법 유형이다. 예를 들면, 결장직장 신생항원은 결장직장 종양 세포에서 통상적으로 발견되는 MUC1을 포함한다. 다른 신생항원은 환자 종양에 특이적일 수 있다. 이 후자 경우에, 암 치료 백신은 개인화된 신생항원 백신일 것이다. 암 치료 백신은 이미 암으로 진단받은 환자에서 사용된다. 요법은 암 세포를 파괴하거나, 종양 성장 및 확산을 중지시키거나, 다른 치료가 끝난 후 암이 재발하는 것을 예방할 수 있다. 암 백신은 면역 반응이 바람직한 항원, 뿐만 아니라 면역 반응을 강화하는 애쥬번트를 함유할 수 있다.
전형적인 암 백신접종 전략은 종양 연관 항원을 오래 지속되는 항종양 면역 반응을 생성할 수 있는 면역계의 주요 항원 제시 세포, 예를 들어 수지상 세포에 전달하기 위해 적합한 벡터를 선택하는 것을 수반할 수 있다. 특정 구현예에서, 아데노바이러스(Ad) 벡터는 높은 효율 및 낮은 삽입 돌연변이유발 위험으로 인해 신생항원 유전자의 전달을 위한 비히클로서 사용될 수 있다. ChAdOx1 또는 ChAdOx2 벡터와 같은 아데노바이러스 벡터는 유망한 유전자 백신 플랫폼이므로, 이들은 이식유전자 산물에 대한 강력한 체액성 및 세포성 면역 반응 및 Ad 캡시드 단백질을 빠르게 생성한다. 이는 종양성 신생항원-암호화 Ad 벡터에 의해 감염된 수지상 세포를 통해 시험관내 및 생체내 둘 다에서 항종양 T-세포 반응의 생성에 의해 입증되었다. 따라서, 일 구현예에서, 하나 이상의 면역조절제를 코딩하는 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물은 치료적 암 백신에 의해 생성되는 세포 반응을 유인하고 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 적합한 면역조절제는 IL-12, 뿐만 아니라 유도체(예를 들어 단일 쇄 형태), 및 이의 상동체를 포함할 수 있다. 이러한 mRNA 작제물은 예를 들어, 근육, 간, 신장, 폐, 비장, 및 피부 중 하나 이상을 보호하기 위해 선택될 수 있는 하나 이상의 기관 보호 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, miRNANA-1, miRNANA-122, miRNA-30a 및/또는 miRNA-203a; let7b, miRNANA-126, 및/또는 miRNA-30a; 또는 miRNA-122, miRNA-192, 및/또는 miRNA-30a에 대한 표적 서열 사용).
이전에 논의된 바와 같은 예방/예방적 백신에서의 잠재적 역할과 유사하게, GM-CSF가 또한 치료적 백신에 대한 잠재적인 애쥬번트로서 식별되었다(Yan 등 Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 2017; Zhao 등 Revisiting GM-CSF as an adjuvant for therapeutic vaccines. Cell Mol Immunol. 2018). 유사하게, 암에 대한 항원-특이적 면역을 향상시키기 위한 바이러스-기반 백신의 일부로서 전달된 CD40 리간드(CD40L)는 면역 반응 및 자연 살해(NK) 세포 활성화 및 확장 유도를 개선하는 것으로 나타났다(Medina-Echeverz 등 Synergistic cancer immunotherapy combines MVA-CD40L induced innate and adaptive immunity with tumor targeting antibodies. Nat Commun. 2019). 따라서 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 및 조성물은 GM-CSF 또는 CD40L의 발현을 유도하여, 암 치료 백신 전에, 도중에 또는 후에 항종양 면역 반응을 향상시키는 데 사용될 수 있다.
또한 돌연변이의 결과로서 암 세포에 의해 생성된 신규 항원인 '신생항원'을 포함하는 환자-특이적 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 것이 바람직할 수 있다(Lichty 등 Going viral with cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2014). 따라서, 또 다른 구현예에서, 환자의 종양 연관 항원 및/또는 신생항원을 코딩하는 mRNA를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 및/또는 조성물이 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 mRNA 작제물은 알파태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원(ETA), 티로시나제, 흑색종 연관 항원(MAGE), 전립선-특이적 항원(PSA), 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), ras의 비정상적인 생성물, 또는 p53 중 하나 이상으로부터 선택된 종양 연관 항원을 암호화할 수 있다.
이들은 동일하거나 상이한 mRNA 작제물에서, 상기 논의된 바와 같이, 면역조절제, 면역 인핸서, 및 다른 효과기 화합물을 코딩하는 임의의 다른 mRNA와 함께 존재할 수 있다. 이러한 접근법은 종양 세포가 향상된 효과의 항원성 단백질을 생성하도록 유도하여, 면역계가 이들 종양 세포를 더 잘 인식하게 하는 것을 목표로 한다. 종양 세포에 대한 이 세포 반응은 또한 암 세포에 의한 면역조절제의 발현을 추가로 유도함으로써 향상될 수 있다. 개별 mRNA 작제물이 종양 연관 항원(또는 신생항원) 및 면역조절 성분 둘 다를 제공하는 데 사용되는 예방적 백신에 대한 상기 논의에서와 같이, 일부 구현예에서 mRNA 작제물 중 하나 또는 다른 것은 miRNA 결합 부위 서열이 완전히 결여될 수 있다. 다른 경우에 각 mRNA 작제물은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 기관 보호 서열을 포함할 수 있다. 이들 기관 보호 서열은 각 mRNA 작제물에 대해 동일할 수 있거나, 상이할 수 있다. 기관 보호 서열이 상이한 경우, 이들은 이들 생성물에 대한 상이한 차등 발현 패턴을 지원하고/하거나, 각 생성물에 대한 상이한 조직 또는 세포 유형에 대한 보호를 확장하기 위해 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명의 구체적 구현예에 따르면 암 백신과 같은 암 면역요법제와 조합하여 사용하기 위한, 면역자극성 또는 면역조절성 단백질 또는 폴리펩티드와 같은 치료적 강화 인자를 암호화하는 본원에 기재된 바와 같은 mRNA가 제공된다. 암 백신은 변형된 인간 또는 영장류 아데노바이러스와 같은 치료적 바이러스를 포함할 수 있고, 면역자극성 또는 면역조절성 단백질 또는 폴리펩티드는 생물학적으로 활성인 IL-12 및/또는 GM-CSF를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, NF-κB 경로의 조절제 및/또는 억제제를 코딩하는 본원에 기재된 바와 같은 mRNA 작제물 및/또는 조성물이 전체에 걸쳐 논의된 바와 같이, 종양성 세포에서 또는 이에 의한 발현을 위해 제공된다.
본 발명의 조성물 및 방법은 하기 실시예에 의해 예시되지만 결코 제한되지는 않는다.
실시예
mRNA 작제물
모든 mRNA 작제물은 생성된 DNA 서열로부터 Trilink Biotechnologies(캘리포니아주 샌디에고)에 의해 합성된다. 이들 mRNA는 완전히 처리되고, 캡핑되고 폴리아데닐화된 mRNA와 비슷하고 리보솜에 의해 번역될 준비가 되어 있다.
제형
모든 mRNA 작제물은 이온화가능 지질-유사 물질 C12-200, 인지질 DOPE, 콜레스테롤 및 지질-고정화 폴리에틸렌 글리콜 C14-PEG2000-DMPE 혼합물의 다중-성분 나노입자로 제형화된다. 지질-유사 물질, 인지질, 콜레스테롤 및 PEG의 이 특정 조성물 및 C12-200:mRNA의 특정 중량비(10:1) 및 몰[%] 조성은 생체내에서 높은 형질감염 효율을 위해 최적화되었고(Kauffman K.J., Nano Letter. 2015, 15, 7300-7306) DMPCTx-mRNA로서 언급된다. 제형을 제조하기 위해, 지질 성분을 에탄올에 용해시키고 T 접합 혼합 장치를 사용하여 10 mM 시트레이트 완충액(pH 3)에 희석된 mRNA와 1:3 비율로 혼합하였다. 제형을 실온에서 4시간 동안 포스페이트 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 대해 20 kDa 막 투석 카세트에서 투석하였다. 이어서 필요한 경우, 제형을 Amicon Ultra 원심분리 여과 장치(100 kDa 컷오프)를 사용하여 농축하였다. 후속적으로, 제형을 특성화할 준비가 된 새로운 튜브로 옮겼다. mRNA 캡슐화의 효율 및 농도는 제조업체의 프로토콜에 따라 Ribogreen RNA 검정(Invitrogen)을 사용하여 측정한다. 지질 나노입자의 다분산 지수(PDI) 및 크기(Zave)는 동적 광 산란(Zetasizer Nano-ZS, Malvern)을 사용하여 측정한다.
제형을 도 2에 도시된 바와 같이 다중-웰 플레이트 검정에서 세포를 형질감염시키는 데 사용한다. 제형을 DMPCTx-mRNA의 약 1.5 pmol/웰로 적합하게 희석한다. 검정의 판독은 mCherry 형광을 통해 mRNA의 발현을 검출하는 것이며, Hoechst 33342 염색(NucBlue Liver ReadyProbes Reagent, Life Technologies)으로 세포 핵을 염색하고 세포 밀도를 결정한다. mCherry 형광은 형광 현미경(BIOTEK의 Cytation Systems 또는 Thermofisher Scientific의 EVOS FL Auto)을 사용하여 형질감염 24시간 후 정량화하였다.
이들 제형을 또한 생체내 동물 연구에서 세포를 형질감염시키는 데 사용한다.
세포 배양 및 형질감염
모든 세포를 5% CO2의 존재 하에 37℃에서 성장시켰다. 배양된 세포(Hep3B, AML12, 786-0, hREC, HCT-116)의 시험관내 단일 형질감염을 다음과 같이 수행하였다: 형질감염 1일 전에, 세포를 표 7에 나열된 권고된 완전 배지 및 세포 밀도로 96-웰 조직 배양 처리된 마이크로웰 플레이트에 시딩하였다. 다음 날, mRNA-DMPCTx를 웰의 배지에 직접 첨가하여 세포를 환원된 혈청 배지(Opti-MEM 배지, Gibco) 200 uL 중 1.5 pmol의 DMPCTx-mRNA로 형질감염시켰으며, 필요에 따라 배양된 세포를 부드럽게 혼합하였다. 4시간 인큐베이션 후, Opti-MEM 배지를 제거하고 완전 배지로 교체하였다.
표 7: DMPCTx-mRNA의 시험관내 형질감염에 사용되는 배지 및 세포 밀도
인간 정상 간세포(Sigma Product 참조 번호 MTOXH1000)의 형질감염을 위해, 세포를 24-웰 콜라겐 코팅된 플레이트에서 Sigma 권장 해동, 완전히 보충된 플레이팅 및 배양 배지(참조 MED-HHTM, MED-HHPM, MED-HHPMSP, MED-HHCM, MED-HHCMSP)를 사용하여 mL 당 250,000 개 세포의 세포 밀도로 플레이팅하였다. mRNA-DMPCTx의 형질감염을 5% FBS를 함유하는 배양 배지에서 수행하였다. 4시간 인큐베이션 후, mRNA 혼합물을 제거하고, 완전히 보충된 배지를 웰에 다시 첨가하였다.
정상 상피 성인 결장 세포(Cell Applications, Inc., 참조 732Cn-05a)의 형질감염을 위해, 세포를 해동시키고, 플레이팅하고 Gl 상피 세포 해동 용액 및 Gl 상피 세포 한정 배양 배지(Cell Applications Inc., 참조 716DC-50 및 716T-20)를 사용하여 배양하였다. 96-웰 마이크로플레이트 웰을 Gl 상피 세포 코팅 용액(Cell Applications, Inc., 참조 025-05)으로 전처리하고 웰 당 60,000 개 세포를 시딩하였다. 다음 날, mRNA-DMPCTx를 웰의 배지에 직접 첨가하여 세포를 환원된 혈청 배지(Opti-MEM 배지, Gibco) 200 uL 중 1.5 pmol의 DMPCTx-mRNA로 형질감염시켰으며, 필요에 따라 배양된 세포를 부드럽게 혼합하였다. 4시간 인큐베이션 후, Opti-MEM 배지를 제거하고 배양 배지로 교체하였다.
정상 인간 폐/기관지 세포(BAES-2B 세포, ATCC CRL-9609)의 형질감염을 위해, 세포를 BEGM 기관지 상피 SingleQuots 키트(Lonza)가 보충된 BEGM 배지(Lonza)에서 성장시켰다. 세포를 콜라겐 I 코팅된 마이크로웰 플레이트에 mL 당 75,000 개 세포의 밀도로 시딩하였다. 다음 날, DMPCTx-mRNA를 웰의 배지에 직접 첨가하여 세포를 환원된 혈청 배지(Opti-MEM 배지, Gibco) 200 uL 중 1.5 pmol의 DMPCTx-mRNA로 형질감염시켰으며, 필요에 따라 배양된 세포를 부드럽게 혼합하였다. 4시간 인큐베이션 후, Opti-MEM 배지를 제거하고 배양 배지를 교체하였다.
형광 현미경
형질감염 24시간 후, 세포 핵을 Hoechst 33342 염료(Invitrogen의 NucBlue™ Live ReadyProbesTM 시약)를 사용하여 염색하였다. 핵 염색 및 mCherry 형광을 형광 현미경(Biotek의 Cytation 기기 또는 Thermofisher Scientific의 EVOS® FL Imaging Systems)을 사용하여 살아있는 세포에서 검출하였다. 이미지는 필터 큐브 Texas Red 및 DAPI 및 20x 대물렌즈로 획득하였다.
실시예 1: 비최적화 대 최적화 miRNA 표적 서열(불일치 대 일치)
표적 세포를 작제물 mRNA로 성공적으로 형질감염시키고 후속적으로 비변형된 miRNA 표적 서열보다 우수한 단백질 차등 발현을 구동하는 본 발명의 가능성을 조사하기 위해, miRNA 결합 부위로 변형된 DMPCTx mRNA 플랫폼을 먼저 각 기관에 대한 인간 암 세포주 및 정상 1차 세포를 사용하여 시험관내 모델에서 평가한다. 정제된 mCherry mRNA는 배양된 세포에서 형질감염 및 번역 효율을 추적하는 데 사용한다.
예를 들면, miRNA-122는 풍부한 간-특이적 miRNA이며, 이의 발현은 인간 원발성 간암종(HCC) 및 Hep3B와 같은 HCC 유래 세포주에서 유의하게 감소한다. 이 실시예 연구의 목적은 최적화 miRNA-122 표적화된 서열의 삽입에 의한 mRNA 서열의 3'-비번역 영역(UTR)의 변형(예를 들어, 변이체 2)이 정상 간세포에서 외인성 mRNA의 더 높은 번역 억제를 초래할 수 있지만, 테스트된 HCC 세포주에서는 그렇지 않음을 입증하는 것이다. 그 목적을 위해, mCherry mRNA 작제물을 3'-UTR에 적어도 하나의 비최적화 miRNA-122 표적 서열(변이체 1) 또는 적어도 하나의 최적화 완벽한 일치 표적 서열(변이체 2)을 포함하도록 변형시켰다. mRNA 작제물을 높은 수준의 miRNA-122를 발현하는 것으로 알려진 뮤린 AML12 정상 간세포에 형질감염시킨다. miRNA 표적 서열이 없는 mCherry mRNA 작제물을 양성 대조군으로 사용하였다. mCherry 형광을 형광 현미경(Thermofisher Scientific의 EVOS FL Auto)을 사용하여 mCherry mRNA 작제물의 단일 형질감염 24시간 후에 검출하였다. 웨스턴 블롯(Western blot) 또는 질량 분광법과 같은 프로테옴 분석 기술을 포함한 대체 정량화 방법론을 사용하여 전달된 작제물의 발현을 확인할 수 있다.
변이체 1 [서열번호: 4]: 5'-AACGCCAUUAUCACACUAAAUA-3'(불일치 miRNA-122 표적 서열)
변이체 2 [서열번호: 44]: 5'-CAAACACCAUUGUCACACUCCA-3'(완벽한 일치 miRNA-122 표적 서열)
결과
도 9b에 나타낸 바와 같이 MOP가 없는 mCherry mRNA의 발현은 AML12 세포에서 강하다. 단일 불완전하게 일치하는 miRNA-122 표적 서열(변이체 1)이 3' UTR에 포함되는 경우, mCherry의 발현은 분명하게 유지된다(도 9c 참조. 변이체 2를 사용한 완벽한 일치의 효과는 도 9d, 오른쪽 패널에서 보이는 훨씬 감소된 mCherry 발현으로 분명하다.
실시예 2: miRNA 표적 서열의 반복 수의 효과 비교
mRNA 작제물에서 표적 서열의 수를 증가시킴으로써 더 나은 차등 발현을 구동하는 본 발명의 가능성을 조사하기 위해, mCherry mRNA를 3'-UTR에 1, 2 또는 4 개의 최적화 miRNA-122 miRNA 표적 서열을 포함하도록 변형시키고 번역 효율을 평가하고 인간 Hep3B 암 세포주 및 상응하는 정상 AML12 1차 세포에서 시험관 내에서 비교하였다. miRNA 표적 서열이 없는 mCherry mRNA 작제물을 양성 대조군으로 사용하였다. miRNA-122 표적 서열은 도 1에 나타낸 바와 같이 특이적 뉴클레오티드(예컨대 uuuaaa)를 사용하여 연결된다. mCherry 형광을 형광 현미경(Thermofisher Scientific의 EVOS FL Auto)에 의해 mCherry mRNA 작제물의 단일 형질감염 24시간 후에 검출하였다. 또한 웨스턴 블롯 또는 질량 분광법과 같은 프로테옴 분석 기술을 포함한 대체 정량화 방법론을 사용하여 전달된 작제물의 발현을 확인할 수 있다.
결과
결합 부위 서열을 다중화한 결과를 도 8에 나타낸다. AML12 정상 간세포(a)에서 mCherry 발현의 억제 시 약간 용량 의존적이며, 결합 부위 서열의 2 및 4 회 반복은 높은 수준의 mCherry 억제를 나타낸다. 그러나, 효과는 Hep3B 암 세포(b)에 대해 덜 분명하며, 여기서 mCherry 발현 수준은 miRNA 결합 부위의 1 또는 2 회 반복에 대해 대체로 일정하게 유지되며, 4-배 다중화된 서열에 대한 발현에서 약간만 감소한다.
실시예 3: 시험관내에서 다중-기관 보호 방법의 개념 증명
다중 상이한 수용자 세포 유형에서 특정 ORF의 차등 발현을 입증하기 위한 본 발명의 가능성을 조사하기 위해, mCherry mRNA를 3'UTR에 3 또는 5 개의 miRNA 표적 서열을 포함하도록 변형시켰다. 제1 mRNA 서열에서 miRNA-122, Let7b 및 miRNA-192에 대한 표적 서열을 제공하고(mCherry-3MOP), 제2 mRNA 서열에서 miRNA-122, miRNA-124a, Let7b, miRNA-375, 및 miRNA-192에 대한 표적 서열을 제공한다(mCherry-5MOP). 대조군 mCherry mRNA 서열을 또한 miRNA 표적 서열 없이 사용하였다.
제조된 mRNA 서열을 상기 기재된 바와 같이 나노제형화하였다. 제조된 나노입자를 인간 정상 간세포(Sigma 제품 참조 번호 MTOXH1000); 뮤린 정상 간세포(ATCC의 AML12), 및 인간 간암종 세포(ATCC의 Hep3B)에 상응하는 세포주에 형질감염시켰다(도 2). 또한, 정상 인간 신장 세포(ATCC의 hREC)에 상응하는 세포주를 mCherry-3MOP mRNA, 및 대조군 mCherry RNA로 형질감염시켰다. 세포를 24-웰 플레이트에 시딩하였다. mRNA 0.5 ug을 웰 당 형질감염시키고 Cytation 5 기기(Biotek)를 사용하여 형질감염 24시간 후 이미지화를 수행하였다.
도 3은 3 가지 간 세포 유형에서 mCherry 신호를 나타내며, 인간 간암 세포(Hep3B) 또는 대조군 mCherry mRNA로 형질감염 후 정상 세포에서 발견된 신호와 비교하여, mCherry-3MOP 또는 mCherry-5MOP mRNA로 형질감염될 때 정상 뮤린 및 인간 간세포 둘 다에서 세포 신호의 유의한 감소를 입증한다. 이는 miRNA 표적 서열의 포함에 대한 결과로서 정상 세포에서 mCherry 번역의 감소를 나타낸다. 도 4는 Biotek의 Gen5 Imaging Software를 사용한 형질감염된 세포에서의 mCherry 형광에 대한 정량화를 나타낸다. 배경 신호를 차감하였다. 값은 세포 당 형광 신호의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 대조군과 비교하여 평가된 mRNA에 대한 통계적으로 유의한 차이는 * P < 0.05, ** P < 0.005로 표시된다. 결과는 3MOP 또는 5MOP miRNA 표적 서열이 사용될 때 정상 간 세포(인간 및 뮤린)에서 단백질 발현의 대략 80%가 감소한 반면, 종양성 세포에서 감소가 덜 나타남을 입증한다.
도 5a는 형질감염된 정상 인간 신장 세포(hREC ATCC-PCS-400-012)에서 mCherry 신호를 나타낸다. 신호의 감소는 mCherry-3MOP 처리된 세포에서 볼 수 있으며, 이는 mCherry 번역의 감소를 나타낸다. 이것은 Biotek의 Gen5 Imaging Software를 사용하여 도 5b에 정량화되어 있으며, 마찬가지로 mCherry-3MOP로 형질감염 후 정상 신장 세포에서 mCherry 신호의 약 60% 감소를 나타낸다. 도 5b에서, 배경 신호를 차감하였고, 값은 세포 당 형광 신호의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 대조군과 비교하여 평가된 mRNA에 대한 통계적으로 유의한 차이는 * P < 0.05로 표시된다.
도 6에서는 3MOP 서열의 대체 구성을 사용한 간 세포 실험 결과를 나타낸다. 이 경우 3MOP 서열은 miRNA122, miRNA192 및 miRNA30a와 완벽하게 일치한 miRNA 결합 부위를 포함한다. Hep3B 암 세포에서 발현은 도 6(f)에서 뮤린 AML12 간세포와 비교할 때 도 6(c)에서 분명하게 보였으며, 여기서 식별가능한 발현은 보이지 않는다.
도 7은 3MOP 서열의 또 다른 대체 구성 결과를 나타낸다. 이 경우 3MOP 서열은 Let7b, miRNA126 및 miRNA30a와 완벽하게 일치한 miRNA 결합 부위를 포함한다. 다시, Hep3B 암 세포에서 mCherry 발현은 도 7(f)에서 뮤린 AML12 간세포와 비교할 때 도 7(c)에서 분명하게 보였으며, 여기서 식별가능한 발현은 보이지 않는다.
도 10은 도 7에 대한 실험에 사용된 것과 동일한 3MOP 서열(miRNAlet7b-miRNA126-miRNA30a)에 대해 신장에서 조직 및 기관 특이적 보호의 효과를 입증한다. mCherry의 발현은 hREC 인간 신장 세포에서 거의 완전히 억제되지만(도 10(f)) 786-0 신장 선암종 세포에서는 그렇지 않다(도 10(c)). 도 11에서 대체 3MOP 서열을 테스트하였다(miRNA122-miRNA192-miRNA30a). 도 10 및 11에 대해 테스트된 두 MOP 서열은 신장을 보호하는 miRNA30a에 대한 완벽한 일치 결합 서열을 포함하지만, 후자의 3MOP는 추정되는 이중층의 신장 보호를 제공하는 완벽한 일치 miRNA-192 결합 부위를 추가로 포함한다(상기 표 2 참조). 도 11에서 mCherry의 발현은 hREC 인간 신장 세포에서 볼 수 없지만(도 11(f)) 786-0 신장 선암종 세포에서 분명하게 명백하다(도 11(c)).
도 13은 도 11에 대한 실험에 사용된 것과 동일한 3MOP 서열(miRNA122-miRNA192-miRNA30a)에 대해 결장에서 조직 및 기관 특이적 보호 효과를 입증한다. mCherry의 발현은 인간 결장 상피 세포에서 거의 완전히 억제되지만(도 13(c)) HCT-116 세포에서는 그렇지 않다(도 13(f)). 도 14에서 대체 3MOP 서열을 테스트하였다(miRNAlet7b-miRNA126-miRNA30a). 도 14에 대해 테스트된 MOP 서열은 결장 조직을 광범위하게 보호하는 Let7b에 대한 완벽한 일치 결합 서열을 포함한다. 도 14에서 mCherry의 발현은 결장 상피 세포에서 매우 감소되고(도 14(c)) HCT-116 세포에서도 그러하다(도 14(f)).
도 15는 miRNAlet7b, miRNA126, 및 miRNA30a에 대한 결합 부위를 포함하는 MOP 서열을 사용하여 폐에서 조직 및 기관 특이적 보호 효과를 입증한다. 상기 기재된 다른 검정과 유사하게, 건강한 비암성 인간 폐 조직의 가장 근접한 근사치를 나타내는 기관지 상피 세포주인 BEAS-2B 세포주를 선택하였다. BEAS-2B 세포는 복제-결함 SV40/아데노바이러스 12 하이브리드로의 감염을 통해 불멸화되는 반면, 이것은 개선된 취급 및 클로닝을 가능하게 한다. 세포를 정상 기능화 폐 상피의 모델로서 편평 세포의 분화를 연구하기 위한 검정에서 사용한다. 도 15(c)에서, MOP 서열의 존재는 MOP의 부재와 비교하여 매우 높은 수준의 mCherry 발현 억제를 초래한다.
도 7(f), 10(f), 14(c) 및 15(c)에 나타낸 결과는 miRNAlet7b-miRNA126-miRNA30a MOP 서열의 포함이 건강한 간, 신장, 결장 및 폐에서 연관된 ORF 발현으로부터 효과적인 보호를 제공함을 나타낸다. 도 6(f), 11(f), 및 13(c)에 대한 결과는 miRNA122-miRNA192-miRNA30a 결합 서열을 포함하는 대체 MOP가 건강한 간, 신장 및 결장 조직에 대한 효과적인 보호를 제공함을 나타낸다.
이 실시예는 다중 상이한 miRNA 표적 서열을 포함하는 기관 보호 서열이 또한 다중 상이한 기관으로부터 유래된 세포에서 차등 발현을 구동하도록 작용할 수 있고, 다중 조직에서 정상 세포와 종양 세포 사이를 구별할 수 있음을 입증한다.
실시예 4: IL-12 및 GM-CSF mRNA로 인간 PBMC의 형질감염
IL-12 및/또는 GM-CSF는 치료적 바이러스와의 조합과 같이 항-종양 요법과 조합하여, 또는 백신 조성물과 공동 투여된 애쥬번트로서 활용될 수 있는 면역조절 사이토카인이다. 이 실험에서, MOP 서열이 있거나 없는, DMPCTx hGM-CSF(인간 GM-CSF) 및 hdclL-12(이중 쇄 인간 IL-12 p70) 또는 hscIL-12(단일 쇄 인간 IL-12 p70)를 다양한 투여량으로 인간 PBMC에 시험관 내에서 투여하였다. hscIL-12 p70 및 hGMCSF에 대한 비코딩 mRNA를 본 발명자들은 또한 음성 대조군(NC)으로 사용하였다. 세포 내에서 단백질의 발현은 투여된 mRNA 용량과 관련되는 것으로 나타났다.
LNP-면역조절제 IL-12 및 GM-CSF의 시험관내 형질감염 효율 및 독성
5 명의 상이한 공여자(18-55 세)로부터의 PBMC 세포를 AllCells에서 수득하고 5% CO2 분위기 하에 37℃에서 AIM V 배지(Gibco)에 현탁액으로 배양하였다. 300,000 개의 PBMC 세포를 둥근-바닥 96-웰 플레이트에 웰 당 시딩하고 MOP 서열이 있거나 없는 IL-12 단일 또는 이중 쇄 변이체 또는 GM-CSF를 암호화하는 DMPCTx 제형화된 mRNA로 형질감염시켰다(하기 표 8 참조). PBMC가 정상적으로 기능하는지 검증하기 위한 양성 대조군은 LPS(ThermoFisher, 00-4976)가 100 ng/mL의 최종 농도로 배지에 첨가된 300,000 개의 PBMC 세포를 함유하는 웰로 수행하였다. 음성 대조군은 PBMC 세포도 LNP 형질감염도 없는 웰(BG-C), 150,000 개의 형질감염되지 않은 PBMC 세포만 있는 웰(LC), 및 300,000 개의 형질감염되지 않은 PBMC 세포가 있는 웰(HC)로 동시에 수행하였다.
형질감염 4시간 후, 인간 AB 열-비활성화 혈청(Sigma)을 1%의 최종 농도로 첨가하였다. 형질감염 6시간 후, 각 웰의 상청액 60 μL를 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고, 세포를 원심분리로 제거하고 상청액을 MSD 검정을 위해 -80℃에서 동결시켰다. 형질감염 21시간 후, Tween-20을 HC 웰에 1.1%의 최종 농도로 첨가하였다. 형질감염 24시간 후, 각 웰의 모든 상청액을 원심분리로 수집하였다. 상청액 60 μL를 MSD 검정을 위해 -80℃에서 동결시키고 나머지 130 μL를 LDH 검정을 위헤 -80℃에서 동결시켰다.
인간 사이토카인 IL-12p70 및 GM-CSF 분석을 위한 MSD 검정을 U-PLEX 검정(Meso Scale Discovery)을 사용하고 제조업체의 설명서에 따라 수행하였다. 데이터를 Graph Pad Prism을 사용하여 막대 그래프로 플롯팅하였다.
LDH 검정을 Roche의 세포독성 검출 KitPLUS(LDH)(4744926001)를 사용하고 제조업체의 설명서에 따라 수행하였다.
결과
도 12는 형질감염 6시간 후 작제물을 함유하는 MOP에서 인간 IL-12 p70 및 GM-CSF 둘 다의 검출가능한 수준을 나타낸다. mRNA에서 MOP의 존재는 간, 피부, 근육 및 신장 조직에서 표적외 발현을 최소화한다. LDH 검정은 IL-12 단일 또는 이중 쇄 변이체 또는 GM-CSF를 암호화하는 DMPCTx mRNA가 음성 대조군 위의 PBMC에서 유의한 세포 세포독성을 유도하지 않았음을 나타내었다. 결과는 24시간 후 다시 확인하였을 때와 일치하였다(데이터는 제시되지 않음).
표 8 IL-12 MOP 및 GM-CSF MOP에 대한 ORF 및 3' UTR
실시예 5: MOP 서열이 있는 루시퍼라제 발현 mRNA의 DMP
CTx
의 생체내 생체분포
생체내에서 특정 ORF의 차등 발현을 입증하기 위한 본 발명의 가능성을 조사하기 위해, 파이어플라이 루시퍼라제(FLuc) mRNA를 실시예 3에서와 같이 mRNA 작제물의 3' UTR에 3 개의 miRNA 표적 서열의 2 개의 상이한 조합을 포함하도록 변형시켰다. 제1 mRNA MOP 서열은 Let7b, miRNA-126 및 miRNA-30a에 대한 표적 서열을 함유한다(그룹 2). 제2 mRNA MOP 서열은 miRNA-122, miRNA-192, miRNA-30a에 대한 표적 서열을 함유한다(그룹 3). 모든 MOP 작제물은 상응하는 miRNA에 대한 완벽한 일치 표적 서열을 함유하였다. 대조군 FLuc mRNA 서열은 또한 작제물에서 MOP 서열 없이 사용하였다(그룹 1). 비히클 그룹은 포스페이트 완충 식염수를 받았다.
제형은 상기 기재된 바와 같이 제조하였고 하기 특성을 가졌다:
표 9 생체내 생체분포를 위한 전달 제형
동물. 모든 실험은 모든 지역 규칙 및 규정에 따라 영국 노팅엄의 Crown Biosciences에서 수행하였다. 모든 마우스는 Charles River에서 수득하였다.
비-종양성 생체분포 연구. 7-9주령의 건강한 암컷 balb/c 마우스에 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 MOP 서열이 있거나 없는 파이어플라이 루시퍼라제(FLuc)를 암호화하는 1 mg/kg 제형(DMPCTx-mRNA)을 주사하였다. 전신 이미지를 투여 전(0시간), 및 투여 후 3.5시간, 및 24시간에 촬영하고 루시퍼라제 신호의 양을 Living Image Software(Caliper LS, 미국)를 사용하여 정량화하였다. 이미지화 15분 전에, 마우스에 150 mg/kg d-루시페린을 주사(피하)한 다음, 10분 후에 마취하고 발광 검출용 이미징 챔버에 배치하였다(복측 및 배측). 24시간 시점에서, 간, 신장, 비장, 및 폐를 제거하고 생체외에서 이미지화하였다.
종양성 생체분포 연구. 인간 간암 세포(Hep3B 세포)(2x106 개 세포)를 8-10 주령의 Fox Chase SCID 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스를 종양 부담의 캐리퍼 측정에 기반하여 연구 그룹으로 분류하였으며, 대략 100 mm3의 종양 크기를 선택하였다. 그런 다음 MOP 서열이 있거나 없는 파이어플라이 루시퍼라제(FLuc)를 암호화하는 제형(DMPCTx-mRNA)을 1 mg/kg의 용량으로 종양내 주사하였다. 전신 이미지를 투여 전(0시간), 및 투여 후 3.5시간, 및 24시간에 촬영하고 루시퍼라제 신호의 양을 Living Image Software(Caliper LS, 미국)를 사용하여 정량화하였다. 이미지화 15분 전에, 마우스에 150 mg/kg d-루시페린을 주사(피하)한 다음, 10분 후 마취하고 발광 검출용 이미징 챔버에 배치하였다(복측 및 배측). 24시간 시점에서, 종양, 간, 신장, 비장, 및 폐를 제거하고 생체외에서 이미지화하였다.
결과
도 16(a)는 정맥내 투여를 통한 투약 후 3.5시간 후에, 높은 수준의 루시퍼라제 발현을 전신 이미지를 통해 MOP 함유 작제물(그룹 2 및 3) 및 MOP 작제물이 없는 대조군 그룹(그룹 1)을 포함하여, 모든 그룹에서 볼 수 있음을 나타낸다. 그러나, 2 개의 MOP 함유 작제물을 사용하면 단백질 발현이 1-2 자릿수 더 적다. 이 경향은 24시간 후 유지되며, 모든 그룹에서 전반적인 단백질 발현이 약간 적다.
MOP의 존재는 놀랍게도 간, 폐, 비장, 및 신장의 조직에서 생체내 표적외 발현을 최소화하는 데 효과적이다. 도 16(b)에서, 기관의 생체외 이미지화는 그룹 1(MOP 없는 대조군)과 비교하여 그룹 2 및 3(MOP 함유 작제물)의 마우스에 대해 간(miRNA-122), 폐(let7b, miRNA-126, miR30a), 비장(Let7b, miRNA-126), 및 신장(miRNA-192, miRNA-30a)에서 감소된 루시퍼라제 발현을 나타내며, 이는 두 MOP 작제물이 ORF의 발현으로부터 가치있는 다중 기관 보호를 제공함을 확인시켜 준다.
건강한 조직에서 표적외 효과를 최소화하는 것이 중요하지만, 단백질 발현이 종양에서와 같은 표적화된 조직에서 여전히 발생하는 것을 보장하는 것이 또한 중요하다. 표 10은 Hep3B 간 종양이 존재하였을 때, 단백질 발현이 모든 3 개 그룹에 대해 동일한 자릿수로 유지되었음을 나타낸다. 추가적으로, 건강한 간에서 루시퍼라제 발현은 비종양 보유 생체내 연구에서 볼 수 있는 바와 같이 MOP가 존재할 때 2-3 자릿수 감소한다.
표 10. 생체외 이미지화로 수득된 BLI 값(광자/S)
도 17은 투여 후 24시간 후에, 높은 수준의 루시퍼라제 발현을 생체외 이미지화를 통해 MOP 함유 작제물(그룹 2 및 3) 및 MOP 작제물이 없는 대조군 그룹(그룹 1)을 포함하여, 모든 그룹의 종양 조직에서 볼 수 있음을 나타낸다. 도 17(a)는 마우스의 종양 부피가 각 그룹에서 유사하였음을 나타낸다. 도 17(b)는 투약 후 24시간 후에, 높은 루시퍼라제 발현을 건강한 간 조직(정상 간)에서 MOP 작제물이 없는 대조군 그룹(그룹 1)에 대해 볼 수 있으며, 발현이 MOP 함유 작제물(그룹 2 및 3)을 사용하여 2-3 자릿수만큼 감소됨을 나타낸다. 다른 기관에서는 발현을 거의 볼 수 없다(제이터는 제시되지 않음).
실시예 6: 근육내(IM) 투여 후 MOP 서열이 있는 루시퍼라제 발현 mRNA의 DMP
CTx
에 대한 생체내 생체분포
이 실험은 실시예 5에서 취한 접근법과 유사하다. 그러나, 대부분의 백신 조성물이 근육내 주사(IM)를 통해 투여되므로, IM 투여 후 생체내에서 FLuc ORF의 차등 발현을 야기하는 생체분포를 입증하는 것이 필요하였다. mRNA를 실시예 5에서와 같이 변형시켰지만, 이번에는 mRNA 작제물의 3' UTR에 miRNA 표적 서열의 3 가지 상이한 조합을 포함시켰다. 제1 mRNA MOP 서열은 Let7b, miRNA-126 및 miRNA-30a에 대한 표적 서열을 함유한다(Luc-MOP1). 제2 mRNA MOP 서열은 miRNA-122, miRNA-192, miRNA-30a에 대한 표적 서열을 함유한다(Luc-MOP2). 제3 mRNA MOP 서열은 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, miRNA-30a에 대한 표적 서열을 함유한다(Luc-MOP3). 모든 MOP 작제물은 상응하는 세포 miRNA에 대한 완벽한 일치 표적 서열을 함유하였다. 대조군 FLuc mRNA 서열은 또한 작제물에 MOP 서열 없이 사용하였다(Luc). mRNA 화물이 없는 대조군 그룹을 또한 포함하였으며, 여기서 마우스는 포스페이트 염수 완충액(비히클)을 받았다.
제형은 상기 기재된 바와 같이 제조하였고 하기 특성을 가졌다:
표 11. IM 투여로 생체내 생체분포를 위한 전달 제형
7-9주령의 건강한 암컷 balb/c 마우스에 IM 주사를 통해 MOP 서열이 있거나 없는 파이어플라이 루시퍼라제(FLuc)를 암호화하는 제형(DMPCTx-mRNA) 10 ug을 주사하였다. 이미지화 15분 전에, 마우스에 150 mg/kg d-루시페린을 주사(피하)한 다음, 10분 후 마취하고 발광 검출용 이미징 챔버에 배치하였다(복측 및 배측). 4시간 시점에서, 주사 부위에서 간, 신장, 비장, 및 근육 및 피부를 제거하고 생체외에서 이미지화하였다.
결과
도 19에서, 기관의 생체외 이미지화는 모든 그룹에 대해 간(miRNA-122)에서 루시퍼라제 발현이 감소됨을 나타낸다. 비장(Let7b, miRNA-126)에서, Luc-MOP1은 가장 큰 효과를 나타내었다. 신장(miRNA-192, miRNA-30a)에서, mRNA를 함유하는 모든 MOP는 발현이 감소되는 경향을 나타내었다. 주사 부위에서, Luc-MOP1은 루시퍼라제의 생산을 감소시켰지만 다른 MOP는 그렇지 않았다. 결과는 상이한 MOP 작제물이 필요에 따라 달라질 수 있는 ORF의 발현으로부터 가치있는 다중 기관 보호를 제공함을 확인시켜 준다.
실시예 7: 정맥내(IV) 투여 후 MOP 서열이 있는 루시퍼라제 발현 mRNA의 DMP
CTx
에 대한 생체내 생체분포
이 실험은 실시예 5에서 취한 접근법과 유사하다. 다중 기관 보호를 평가하기 위해, 본 발명자들은 기관에서 높은 전달 및 신호를 보장하기 위해 DMPCTx 제형을 정맥내로 투여하였다. mRNA를 실시예 6에서와 같이 변형시켰다. 제1 mRNA MOP 서열은 Let7b, miRNA-126 및 miRNA-30a에 대한 표적 서열을 함유한다(Luc-MOP1). 제2 mRNA MOP 서열은 miRNA-122, miRNA-192, miRNA-30a에 대한 표적 서열을 함유한다(Luc-MOP2). 제3 mRNA MOP 서열은 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, miRNA-30a에 대한 표적 서열을 함유한다(Luc-MOP3). 모든 MOP 작제물은 상응하는 세포 miRNA에 대한 완벽한 일치 표적 서열을 함유하였다. 대조군 FLuc mRNA 서열은 또한 작제물에 MOP 서열 없이 사용하였다(Luc). mRNA 화물이 없는 대조군 그룹을 또한 포함하였으며, 여기서 마우스는 포스페이트 염수 완충 식염수(비히클)를 받았다.
제형은 상기 기재된 바와 같이 제조하였으며 하기 특성을 가졌다:
표 12. IV 투여로 생체내 생체분포를 위한 전달 제형
7-9주령의 건강한 암컷 balb/c 마우스에 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 MOP 서열이 있거나 없는 파이어플라이 루시퍼라제(FLuc)를 암호화하는 1 mg/kg 제형(DMPCTx-mRNA)을 주사하였다. 전신 이미지를 투약 6시간 후 촬영하였고 루시퍼라제 신호의 양을 Living Image Software(Caliper LS, 미국)를 사용하여 정량화하였다. 이미지화 15분 전에, 마우스에 150 mg/kg d-루시페린을 주사(피하)한 다음, 10분 후 마취하고 발광 검출용 이미징 챔버에 배치하였다(복측 및 배측). 6시간 시점에서, 간, 신장, 비장, 심장, 췌장 및 폐를 제거하고 생체외에서 이미지화하였다.
결과
MOP의 존재는 다시 놀랍게도 간, 폐, 비장, 췌장, 심장, 및 신장의 조직에서 생체내에서 표적외 발현을 최소화하는 데 효과적이다. 도 20에서, 기관의 생체외 이미지화는 그룹 Luc(MOP 없는 대조군)와 비교하여 MOP 함유 작제물(Luc-MOP1, Luc-MOP2, 및 Luc-MOP3)을 투여받은 그룹의 마우스에 대해 간(miRNA-miRNA-126, miR30a), 비장(Let7b, miRNA-126), 췌장(miRNA-30 패밀리, Let7 패밀리, miRNA-122), 심장(miRNA-30 패밀리, miRNA-126, Let7 패밀리) 및 신장(miRNA-192, miRNA-30a)에서 루시퍼라제 발현 감소를 나타내며, 이는 모든 MOP 작제물이 ORF의 발현으로부터 가치있는 다중 기관 보호를 제공함을 확인시켜 준다.
실시예 8: 항원-특이적 면역 반응의 생체내 평가
백신으로서 작용하는 본 발명에 따른 조성물의 능력을 조사하고 공동 투여된 사이토카인의 애쥬번트 효과를 입증하기 위해, 연구를 특정 외인성 항원, 이 경우, 계란 흰자 단백질인 오브알부민(OVA)에 대한 항체 반응을 생성하기 위해 생체내에서 수행하였다.
이 실험을 위해, mRNA 작제물을 이전에 기재된 바와 같은 나노입자 조성물, DMPCTx에 캡슐화하였다. 사용된 조성물은 오브알부민 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하는 나노입자 조성물(DMPCTx-OVA), 및 MOP 서열이 있는 뮤린 단일 쇄 IL-12 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하는 나노입자 조성물(DMPCTx-msclL-12-MOP)이었다. MOP 서열은 사용되는 경우 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, miRNA-30a에 대한 완벽한 일치 결합 부위를 포함하였다(서열번호: 68 참조).
표 13 IL-12에 대한 ORF 및 3' UTR
제형은 상기 기재된 바와 같이 제조하였고 하기 특성을 가졌다:
표 14. 생체내 OVA 면역원성 연구를 위한 전달 제형
6-8주령의 Balb/c 암컷 마우스를 연구 -1일에 체중에 의해 4 개 그룹으로 각각 무작위 배정하였다. 0일째에, 마우스는 다음으로 왼쪽 허벅지에 50μl의 근육내 주사를 받았다:
3 μg의 DMPCTx-OVA(그룹 2, LNP-OVA);
5 μg의 IL-12 작제물의 용량으로 3 μg의 DMPCTx-OVA 및 DMPCTx-msclL-12 (그룹 3; LNP-OVA+IL12);
10 μg의 DMPCTx-OVA(그룹 4; LNP-OVA)(
대조군 그룹 1은 연구 0일째에만 왼쪽 허벅지에 비히클 포스페이트 완충 식염수 50μl의 근육내 주사를 받았다.
연구 14일째에, 혈액을 원심분리(90 sec, RT, 10.000xg)의해 단리된 혈청에 대해 말단 심장 천자를 통해 수집하고, 분취량을 동결시켰다. 수집된 혈청을 제조업체의 설명서(Chondrex)에 따라 마우스 항-OVA IgG의 검출을 위해 처리하였다.
결과
도 18은 실험 결과를 나타낸다. 3 μg mRNA의 저용량에서, DMPCTx-OVA(오브알부민)는 단지 1 마리의 마우스 응답자로 약한 반응을 유도하였다. 이는 mRNA의 투여량을 10 μg으로 3-배 초과로 증가시킴으로써 실질적으로 증가한다. 그러나, 저용량의 오브알부민을 애쥬번트로서 염증 촉진 사이토카인 IL12와 함께 공통 투여하여 응답자 수의 상당한 개선을 초래하였다. 이는 저용량 항원 반응이 공동 투여된 IL-12의 존재에 의해 생체내에서 부스팅될 수 있음을 나타낸다.
이들 결과는 IgG 항체 반응이 주어진 표적에 대해 유도될 수 있음을 입증한다. 오브알부민이 병원체-특이적 항원이 아니라는 점을 고려하면, 이는 또한 이 결과가 개입의 결과이고, 임의의 제공된 외인성 폴리펩티드 항원에 적용가능할 수 있어야 한다는 것을 입증한다. 결과는 IL-12의 생체내 투여가 전신이 아니고 MOP 서열에 의해 제어됨으로써 전염증성 분자의 표적외 발현을 감소시키기 때문에 또한 놀라운 일이다.
실시예 9: SARS-CoV-2 스파이크 단백질-특이적 면역 반응의 생체내 평가
특이적 병원성 표적에 대한 백신으로서 작용하는, 즉, 바이러스 항원에 대한 생체내 면역 반응을 유발하는 본 발명에 따른 조성물의 능력을 추가로 조사하기 위해, 마우스에 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하는 나노입자 조성물, 및 면역조절 사이토카인 IL-12을 암호화하는 mRNA를 포함하는 나노입자 조성물(이전 실시예 8에 기재된 바와 같음)을 주사하였다. 조성물에 대한 마우스의 체액성 면역 반응을 테스트하였다.
이 실험을 위해, mRNA 작제물을 이전에 기재된 바와 같은 나노입자 조성물에 캡슐화하였다. 사용된 조성물은 항원으로서 서열번호: 63에 제시된 바와 같은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하는 나노입자 조성물(DMPCTx-스파이크 CoV), 및 애쥬번트로서 서열번호: 68에 제시된 바와 같은 뮤린 단일 쇄 IL-12 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하는 나노입자 조성물(DMPCTx-msclL-12)이었다. 둘 다 3' UTR에 MOPV(miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, miRNA-30a) 서열을 포함한다.
제형은 상기 기재된 바와 같이 제조하였고 하기 특성을 가졌다:
표 15. 생체내 면역원성 연구를 위한 전달 제형
Balb/c 암컷 마우스를 연구 0일째에 체중에 의해 3 개 그룹으로 각각 무작위 배정하였다. 0일 및 14일째에, 마우스는 다음으로 왼쪽 허벅지에 50μl의 근육내 주사를 받았다:
DMPCTx-스파이크 CoV(0일에 LNP-스파이크 용량 1 μg 및 14일에 10 μg으로 부스트 - 소위 1/10 투여량 레지멘);
또는 DMPCTx-스파이크 CoV(0일에 LNP-스파이크 용량 1 μg 및 14일에 10 μg으로 부스트 - 소위 1/10 투여량 레지멘) 및 IL-12 작제물 DMPCTx-msclL12(0일 및 14일에 1 ug). 대조군 그룹은 연구 0 및 14일째에 왼쪽 허벅지에 비히클 포스페이트 완충 식염수 50ul를 근육내 주사로 받았다.
연구 42일째에(프라임 후 42일 및 부스트 후 28일), 혈액을 모든 그룹에서 말단 심장 천자를 통해 수집하고 혈청을 원심분리(90 sec, RT, 10.000xg)에 의해 단리하고, 분취량을 동결시키고 -80℃에서 저장하였다. 수집된 혈청에서 항-스파이크 항체를 검출하기 위해, 마우스 항-SARS-CoV-2 IgG 항체 ELISA Kit(AcroBiosystems, 카탈로그 #RAS-T023)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하였다.
결과
도 21은 IL12가 첨가됨에 따라 스파이크 단백질에 반응하여 IgG 생산에서 확실한 증가가 있음을 나타낸다.
이들 결과는 생체내에서 애쥬번트로서 IL-12 면역조절 사이토카인의 첨가가 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 항원에 대한 면역 반응의 생성에 유리함을 입증한다. 이 반응은 항원 및 애쥬번트 둘 다가 항원 및 애쥬번트 둘 다의 전신/표적외 생산을 감소시키는 MOP 서열의 제어 하에 mRNA로서 투여될 때조차 놀랍게도 잘 유지된다. IL-12가 투여로부터 최소 6 시간 내에 인간 PBMC에서 생성될 수 있음을 나타내는 실시예 4에 나타낸 시험관내 데이터와 조합하여(도 12(a) 참조), 이것은 보호 면역 반응이 백신 및 애쥬번트의 투여로부터 비교적 단시간 내에 MOP 서열을 포함하는 백신 및 애쥬번트 조성물로부터 생성될 수 있음을 명확히 추가로 나타낸다.
실시예 10: 인간 IL-12로 인간 PBMC의 시험관내 형질감염
백신 애쥬번트로서 작용하는 본 발명에 따른 조성물의 능력을 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 MOP가 있거나 없는 DMPCTx-hscIL-12로 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 형질감염시키고 인터페론-감마의 IL-12-매개 유도를 측정하였다.
4 명의 상이한 공여자로부터의 PBMC 세포를 StemCell Technologies로부터 수득하고 5% CO2 분위기 하에 37℃에서 AIM V 배지(Gibco)에 현탁액으로 배양하였다. 300,000 개의 PBMC 세포를 둥근-바닥 96-웰 플레이트에 웰 당 시딩하고 MOP 서열이 있거나 없는 DMPCTx-hscIL-12 단일로 형질감염시켰다. 제1 mRNA MOP 서열은 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, miRNA-30a에 대한 표적 서열을 함유한다(MOPV). 제2 mRNA MOP 서열은 miRNA-122, miRNA-192, miRNA-30a에 대한 표적 서열을 함유한다(MOPC). 모든 MOP 작제물은 상응하는 세포 miRNA에 대한 완벽한 일치 표적 서열을 함유하였다. 3 가지 용량의 DMPCTx-hscIL-12(MOP가 있거나 없음)를 사용하였다. 음성 대조군은 형질감염되지 않은 PBMC 또는 인간 단일 쇄 IL-12 비코딩 mRNA로 형질감염된 PBMC(hlL-12 NC - ATG 시작 코돈 없음)로 동시에 수행하였다. 플레이트를 37°C, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
제형은 상기 기재된 바와 같이 제조하였고 하기 특성을 가졌다:
표 16. IL-12로 인간 PBMC의 생체내 형질감염을 위한 전달 제형
형질감염 4시간 후, 인간 AB 열-비활성화 혈청(Valley Biomedical)을 5%의 최종 농도로 첨가하였다. 형질감염 24시간 후, 각 웰의 상청액 100 μL를 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고, 세포를 원심분리로 제거하고 상청액을 인간 IL-12 ELISA 검정(Invitrogen, 카탈로그 88-7126)을 위해 -80℃에서 동결시켰다. 형질감염 72시간 후, 각 웰의 상청액 100 μL를 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고, 세포를 원심분리로 제거하고 상청액을 인터페론-감마 ELISA 검정(Biolegend 카탈로그 430116)을 위해 -80℃에서 동결시켰다. 인간 IL-12p70 및 인간 인터페론-감마에 대한 ELISA 검정은 제조업체의 설명서에 따랐다. 데이터는 Graph Pad Prism을 사용하여 막대 그래프로 플롯팅하였다.
결과
도 22a는 DMPCTx-hscIL-12 생성물로 형질감염된 인간 PBMC에서 인간 IL-12의 용량-의존적 발현을 나타낸다. 도 22b(각 공여자에 따라 개별적으로 제시됨)는 선천성 및 적응성 면역 둘 다에 중요한 면역자극성 사이토카인인 IFN-γ의 IL-12-매개 유도를 나타낸다. IL-12-매개 IFN-γ 발현의 진폭은 공여자마다 달라질 수 있지만, IL-12 존재와 IFN-γ 발현 사이에 분명한 상관관계가 있다.
실시예 11: 인간 IL-12 및 SARS-CoV-2 스파이크로 인간 PBMC의 시험관내 형질감염
선천성 및 적응성 면역 반응을 활성화시키는, 즉, 인터페론-감마를 유도하는 본 발명에 따른 조성물의 능력을 추가로 조사하기 위해, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하는 나노입자 조성물, 및 면역조절제 IL-12를 암호화하는 mRNA를 포함하는 나노입자 조성물을 사용하여 형질감염시켰다.
이 실험을 위해, mRNA 작제물을 상기 기재된 바와 같은 나노입자 조성물에 캡슐화하였다. 사용된 조성물은 MOP 서열이 있는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하는 나노입자 조성물(DMPCTx-SCoV-MOPV), 및 MOP 서열이 있거나 없는 인간 단일 쇄 IL-12 단백질을 암호화하는 mRNA를 포함하는 나노입자 조성물(DMPCTx-hscIL-12), (DMPCTx-hscIL-12-MOPV)이었다. MOP 서열은 사용된 경우 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, miRNA-30a에 대한 표적 서열을 포함하였다(MOPV).
제형은 상기 기재된 바와 같이 제조하였고 하기 특성을 가졌다:
표 17. IL-12 및 SARS-CoV-2 스파이크로 인간 PBMC의 시험관내 형질감염을 위한 전달 제형
5 명의 건강한 공여자 PBMC를 DMPCTx-SCoV-MOP 및 DMPCTx-hscIL-12 및 DMPCTx-hscIL-12-MOPV로 또는 없이 형질감염시켰다. 모든 PBMC를 항-CD3 코팅된 플레이트 위에 시딩하고 일반적인 T 세포 활성화를 유도하기 위해 가용성 항-CD28 단클론 항체로 처리하였다. 형질감염 5 일 후, 상청액을 ELISA에 의한 IFN-γ 정량화를 위해 수확하였다.
0일째에, PMBC(300 000 개 세포)를 시딩하고 나노입자 조성물 또는 멸균 PBS를 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인간 AB 혈청(hAB) 10 μl를 총 부피 200μl 및 총 hAB 혈청 농도 5%가 되도록 첨가하였다.
5일째에, 상청액을 다음과 같이 수확하였다. 플레이트를 RT에서 5분 동안 300 x g로 회전 다운시켰다. 상청액을 V-바닥 96 웰 플레이트로 옮기고 RT에서 5분 동안 400 x g로 회전시켰다. 상청액을 새로운 V-바닥 96 웰 플레이트로 옮기고 -80℃에서 저장하였다. Meso-Scale Discovery(MSD 카탈로그 K151TTK-2)에 의한 IFN-감마 발현에 대한 판독을 제조업체의 설명서에 따라 수행하였다.
결과
도 23은 인터페론-감마(IFN-γ) 발현이 MOP가 있거나 없는 인간 IL-12를 발현하는 mRNA의 존재 하에 유사하게 증가함을 나타낸다. 적응성 면역 반응의 출현 전에 발생하는 면역접종 후 IFN-γ의 초기 합성은 백신에 대한 고품질 면역 반응의 신호이므로, 이의 초기 방출은 수지상 세포 성숙을 돕고 결과적으로 TH1 계통에 대한 CD4+ T 세포의 분극화를 도울 것이다.
본 발명의 특정 구현예가 본원에 상세하게 개시되었지만, 이는 단지 예로서예시의 목적으로 수행되었다. 상기 언급된 구현예는 뒷따르는 첨부된 청구범위의 범위에 대하여 제한하려는 것으로 의도되지 않는다. 다양한 치환, 변경, 및 변형이 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 대해 이루어질 수 있음이 본 발명자들에 의해 고려된다. 본 발명의 구현예에 따른 작제물 및 벡터에 포함된 임의의 비인간 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열은 영국, 미국 및 유럽 연합 내의 공급처로부터 획득되었다. 발명자들이 아는 한, 접근 및 이익 공유 계약에 적용될 수 있는 유전자원, 또는 연관된 전통적인 지식은 본 발명의 생성에 활용되지 않았다.
Claims (157)
- 조성물로서,
제1 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 제1 mRNA 작제물을 포함하되, 상기 제1 ORF는 항원을 암호화하며;
상기 제1 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 상기 UTR은 적어도 제1 기관 보호 서열(OPS)을 포함하고, 상기 제1 OPS는 적어도 2 개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하고, 상기 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되는 것인, 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 제1 mRNA 작제물이 생체내 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착되는 것인, 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항원이 병원성 미생물 단백질 및 종양 연관 항원, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 병원성 미생물 단백질이 바이러스 단백질; 박테리아 단백질; 진균 단백질; 기생충 단백질; 및 프리온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 제2 mRNA 작제물을 추가로 포함하되, 상기 제2 ORF는 전염증성 사이토카인을 암호화하는 것인, 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 전염증성 사이토카인이 IL-12; IL-2; IL-6; IL-8; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 제2 mRNA 작제물이 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착되는 것인, 조성물.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 ORF가 IL-12 단백질, 또는 이의 서브유닛, 유도체, 단편, 작용제 또는 상동체를 코딩하는 것인, 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 제2 ORF가 서열번호: 59와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 ORF가 제2 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되되, 상기 UTR은 제2 기관 보호 서열(OPS)을 포함하고 상기 제2 OPS는 적어도 2 개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열이 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되는 것인, 조성물.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제1 OPS가 제2 OPS와 적어도 하나의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제1 OPS 및 제2 OPS가 동일한 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 중합체성 입자와 같은 입자; 리포솜; 리피도이드 입자; 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 벡터를 포함하는 전달 조성물을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 적어도 3 개, 적어도 4 개, 또는 적어도 5 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 모두 서로 상이한 적어도 3 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 근육, 간, 뇌, 유방, 내피, 췌장, 결장, 신장, 폐, 비장 및 피부, 심장, 위장관 기관, 생식 기관, 및 식도로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기관 또는 조직을 보호하기 위해 선택된 miRNA 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 miRNA-122; miRNA-125; miRNA-199; miRNA-124a; miRNA-126; miRNA-98; Let7 miRNA 패밀리; miRNA-375; miRNA-141; miRNA-142; miRNA-148a/b; miRNA-143; miRNA-145; miRNA-194; miRNA-200c; miRNA-203a; miRNA-205; miRNA-1; miRNA-133a; miRNA-206; miRNA-34a; miRNA-192; miRNA-194; miRNA-204; miRNA-215; miRNA-30 패밀리; miRNA-877; miRNA-4300; miRNA-4720; 및/또는 miRNA-6761에 결합하는 하나 이상의 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 근육, 간, 신장, 폐, 비장, 피부, 심장, 위장관 기관, 생식 기관, 및 식도로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기관을 보호하기 위해 선택된 miRNA 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a, miRNA-203a, let7b, miRNA-126, 및/또는 miRNA-192와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 서열번호: 44-57 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 miRNA-1, miRNA133a, miRNA206, miRNA-122, miRNA203a, miRNA205, miRNA200c, miRNA30a, 및/또는 let7a/b와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miR-30a 및/또는 miR-203a와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 제1 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a 및 miRNA-203a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 miRNA-192, miRNA-30a, 및 miRNA-124와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열, 및 miRNA 122와 결합할 수 있는 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 조성물.
- 제29항에 있어서, 상기 항원이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 포함하는 것인, 조성물.
- 제29항에 있어서, 상기 항원이 변종 코로나바이러스 스파이크 단백질을 포함하는 것인, 조성물.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질이 SARS-CoV-2 스파이크 단백질인, 조성물.
- 제29항에 있어서, 상기 항원이 인플루엔자 단백질 또는 이의 변이체, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 인플루엔자 단백질이 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 매트릭스-2 및/또는 핵단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 인플루엔자 단백질이 A형 인플루엔자, B형 인플루엔자, 또는 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H1 1, H12, H13, H14, H15 또는 H16의 A형 인플루엔자의 하위유형으로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제29항에 있어서, 상기 항원이 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 단백질, 또는 이의 변이체, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 조성물.
- 제36항에 있어서, 상기 호흡기 세포융합 바이러스의 단백질이 F 당단백질 또는 G 당단백질인, 조성물.
- 제29항에 있어서, 상기 항원이 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 조성물.
- 제38항에 있어서, 상기 HIV 단백질이 당단백질 120 중화 에피토프 또는 당단백질 145인, 조성물.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 마이코박테리움 투베르쿨로시스 박테리아로부터의 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 조성물.
- 제40항에 있어서, 상기 마이코박테리움 투베르쿨로시스 박테리아로부터의 단백질이 ESAT-6, Ag85B, TB10.4, Rv2626 및/또는 RpfD-B로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 결장직장 종양 항원을 포함하는 종양 연관 항원인, 조성물.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 MUC1인 종양 연관 항원인, 조성물.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 신생항원인 종양 연관 항원인, 조성물.
- 제1항 내지 제4항 또는 제14항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 mRNA 작제물이 제2 오픈 리딩 프레임(ORF)을 추가로 포함하되, 상기 제2 ORF는 IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-12; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택된 전염증성 사이토카인을 암호화하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 mRNA 작제물이 추가의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 추가로 포함하되, 상기 추가의 ORF는 제1 ORF에 의해 암호화된 항원과 상이한 항원을 암호화하는 것인, 조성물.
- 제46항에 있어서, 상기 추가의 ORF에 의해 암호화된 항원이 박테리아 단백질, 바이러스 단백질, 또는 종양 연관 항원, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 적어도 3 개, 적어도 4 개, 또는 적어도 5 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 모두 서로 상이한 적어도 3 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 근육, 간, 뇌, 유방, 내피, 췌장, 결장, 신장, 폐, 비장 및 피부로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기관 또는 조직을 보호하기 위해 선택된 miRNA 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 miRNA-122; miRNA-125; miRNA-199; miRNA-124a; miRNA-126; miRNA-98; Let7 miRNA 패밀리; miRNA-375; miRNA-141; miRNA-142; miRNA-148a/b; miRNA-143; miRNA-145; miRNA-194; miRNA-200c; miRNA-203a; miRNA-205; miRNA-1; miRNA-133a; miRNA-206; miRNA-34a; miRNA-192; miRNA-194; miRNA-204; miRNA-215; miRNA-30 패밀리; miRNA-877; miRNA-4300; miRNA-4720; 및 miRNA-6761과 결합할 수 있는 하나 이상의 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 근육, 간, 신장, 폐, 비장, 피부, 심장, 위장관 기관, 생식 기관, 및 식도로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기관을 보호하기 위해 선택된 miRNA 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 서열번호: 44-57 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a, miRNA-203a, let7b, miRNA-126, 및/또는 miRNA-192와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 miRNA-1, miRNA133a, miRNA206, miRNA-122, miRNA203a, miRNA205, miRNA200c, miRNA30a, 및/또는 let7a/b와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miR-30a 및/또는 miR-203a와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a 및 miRNA-203a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 OPS가 miRNA-192, miRNA-30a, 및 miRNA-124와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열, 및 miRNA-122와 결합할 수 있는 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제10항 내지 제13항 또는 제48항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miR-30a 및/또는 miR-203a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하고;
제2 OPS가 miRNA-122, miRNA-126, miRNA-192, 및/또는 miRNA 30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물. - 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제3 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 제3 mRNA 작제물을 추가로 포함하되, 상기 제3 ORF는 제1 ORF에 의해 암호화된 항원과 상이한 항원을 암호화하고, 박테리아 단백질, 바이러스 단백질, 또는 종양 연관 항원, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제63항에 있어서, 상기 제3 ORF가 적어도 제3 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 상기 UTR은 적어도 제3 기관 보호 서열(OPS)을 포함하고, 상기 제3 OPS는 다중 기관을 보호하고, 상기 제3 OPS는 적어도 2 개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하고, 상기 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되는 것인, 조성물.
- 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 제1 ORF가 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 코딩하고, 제3 ORF가 인플루엔자 단백질, 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부를 포함하는 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 코딩하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내, 피하, 근육내, 비강내, 동맥내 및/또는 흡입을 통한 투여에 적합한 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 병원성 질환의 예방 또는 치료 방법에 사용하기 위한, 조성물.
- 제67항에 있어서, 상기 방법이 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인, 사용하기 위한 조성물.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 병원성 질환이 코로나바이러스에 의해 유발되는 것인, 사용하기 위한 조성물.
- 제69항에 있어서, 상기 병원성 질환이 SARS-CoV-2 바이러스에 의해 유발되는 것인, 사용하기 위한 조성물.
- 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, Th1 면역 반응을 증가시키는 방법.
- 조성물로서,
적어도 제1 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하되, 상기 제1 ORF는 박테리아 단백질; 및/또는 바이러스 단백질로부터 선택된 항원을 암호화하는 것인, 적어도 제1 mRNA 작제물; 및
적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 제2 mRNA 작제물을 포함하되, 상기 ORF는 IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-12; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택된 전염증성 사이토카인을 암호화하고, 상기 제2 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 상기 UTR은 다중 기관을 보호하는 적어도 하나의 OPS를 포함하고, 상기 OPS는 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 상기 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되는 것인, 제2 작제물;
및
생체내 전달 조성물을 포함하며;
상기 제1 및 제2 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착되는 것인, 조성물. - 제72항에 있어서, 상기 ORF가 IL-12 단백질, 또는 이의 유도체, 작용제 또는 상동체를 코딩하는 것인, 조성물.
- 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 전달 조성물이 중합체성 입자와 같은 입자; 리포솜; 리피도이드 입자; 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 벡터를 포함하는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 근육, 간, 신장, 폐, 비장 및 피부로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기관을 보호하기 위해 선택된 miRNA 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 서열번호: 44-57 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a, miRNA-203a, let7b, miRNA-126, 및/또는 miRNA-192와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-1, miRNA133a, miRNA206, miRNA-122, miRNA203a, miRNA205, miRNA200c, miRNA30a, 및/또는 let7a/b와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miR-30a 및/또는 miR-203a와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a 및 miRNA-203a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-192, miRNA-30a, 및 miRNA-124와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열, 및 miRNA-122와 결합할 수 있는 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 조성물.
- 제85항에 있어서, 상기 항원이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 포함하는 것인, 조성물.
- 제85항에 있어서, 상기 항원이 변종 코로나바이러스 스파이크 단백질을 포함하는 것인, 조성물.
- 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질이 SARS-CoV-2 스파이크 단백질인, 조성물.
- 제85항에 있어서, 상기 항원이 인플루엔자 단백질 또는 이의 변이체, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 조성물.
- 제89항에 있어서, 상기 인플루엔자 단백질이 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 매트릭스-2 및/또는 핵단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제89항에 있어서, 상기 인플루엔자 단백질이 A형 인플루엔자, B형 인플루엔자, 또는 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16의 A형 인플루엔자의 하위유형으로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제85항에 있어서, 상기 항원이 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 단백질, 또는 이의 변이체, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 조성물.
- 제92항에 있어서, 상기 호흡기 세포융합 바이러스의 단백질이 F 당단백질 또는 G 당단백질인, 조성물.
- 제85항에 있어서, 상기 항원이 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 조성물.
- 제94항에 있어서, 상기 HIV 단백질이 당단백질 120 중화 에피토프 또는 당단백질 145인, 조성물.
- 제72항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 마이코박테리움 투베르쿨로시스 박테리아로부터의 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 조성물.
- 제96항에 있어서, 상기 마이코박테리움 투베르쿨로시스 박테리아로부터의 단백질이 ESAT-6, Ag85B, TB10.4, Rv2626 및/또는 RpfD-B로부터 선택되는 것인, 조성물.
- 제72항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 병원성 질환의 예방 방법에 사용하기 위한 조성물.
- 제73항에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, Th1 면역 반응을 증가시키는 방법.
- 조성물로서,
적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하되, 상기 적어도 하나의 ORF는 IL-12; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택된 전염증성 사이토카인을 암호화하고, 상기 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 상기 UTR은 다중 기관을 보호하는 적어도 하나의 OPS를 포함하고, 상기 OPS는 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 상기 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되는 것인, 적어도 하나의 mRNA 작제물;
및
생체내 전달 조성물을 포함하며;
상기 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착되는 것인, 조성물. - 제100항에 있어서, 상기 ORF가 IL-12 단백질, 또는 이의 유도체, 작용제 또는 상동체를 코딩하는 것인, 조성물.
- 제100항 또는 제101항에 있어서, 상기 전달 조성물이 중합체성 입자와 같은 입자; 리포솜; 리피도이드 입자; 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 벡터를 포함하는 것인, 조성물.
- 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 근육, 간, 신장, 폐, 비장 및 피부로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기관을 보호하기 위해 선택된 miRNA 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 서열번호: 44-57 중 하나 이상으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a, miRNA-203a, let7b, miRNA-126, 및/또는 miRNA-192와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제100항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-1, miRNA133a, miRNA206, miRNA-122, miRNA203a, miRNA205, miRNA200c, miRNA30a, 및/또는 let7a/b와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제100항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miR-30a 및/또는 miR-203a와 결합할 수 있는 서열로부터 선택된 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제107항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-1, miRNA-122, miRNA-30a 및 miRNA-203a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제100항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-122, miRNA-1, miRNA-203a, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제100항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 let7b, miRNA-126, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제100항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-122, miRNA-192, 및 miRNA-30a와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제100항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 OPS가 miRNA-192, miRNA-30a, 및 miRNA-124와 결합할 수 있는 miRNA 표적 서열, 및 miRNA-122와 결합할 수 있는 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 조성물.
- 제100항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 병원성 질환의 예방 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 방법은
조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계; 및
백신 조성물을 대상체에게 공동 투여하는 단계
를 포함하는 조성물. - 제101항에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, Th1 면역 반응을 증가시키는 방법.
- 제100항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 조성물; 및
톡소이드 백신, 재조합 백신, 접합 백신, RNA-기반 백신, DNA-기반 백신, 생 약독화 백신, 비활성화 백신, 재조합-벡터 기반 백신, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 백신을 포함하는, 조성물. - 하나 이상의 병원성 질환을 치료 또는 예방하거나 면역 반응을 개선하는 방법으로서,
적어도 제1 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하되, 상기 제1 ORF는 박테리아 단백질, 또는 바이러스 단백질, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프로부터 선택된 항원을 암호화하고; 상기 제1 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 상기 UTR은 적어도 제1 기관 보호 서열(OPS)을 포함하고, 상기 OPS는 다중 기관을 보호하고, 상기 제1 OPS는 적어도 2 개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하고, 상기 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되는 것인 적어도 제1 mRNA 작제물; 및
생체내 전달 조성물;
을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
상기 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착되는 것인 방법. - 제116항에 있어서, 적어도 제2 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 하나의 mRNA 작제물을 포함하는 조성물을 대상체에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 제2 ORF는 IL-12; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택된 전염증성 사이토카인을 암호화하는 것인, 방법.
- 제116항 또는 제117항에 있어서, 상기 제2 ORF가 IL-12 단백질, 또는 이의 유도체, 작용제 또는 상동체를 코딩하는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 ORF가 서열번호: 59와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 ORF가 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되되, 상기 UTR은 다중 기관을 보호하는 적어도 제2 OPS를 포함하고, 상기 제2 OPS는 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 상기 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되는 것인, 방법.
- 제120항에 있어서, 상기 제1 OPS가 제2 OPS와 상이한 miRNA 표적 서열 세트를 포함하는 것인, 방법.
- 제120항에 있어서, 상기 제1 OPS 및 제2 OPS가 동일한 miRNA 표적 서열을 포함하는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전달 조성물이 중합체성 입자와 같은 입자; 리포솜; 리피도이드 입자; 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 벡터를 포함하는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원성 질환이 코로나바이러스에 의해 유발되는 것인, 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 병원성 질환이 SARS-CoV-2 바이러스에 의해 유발되는 것인, 방법.
- 제124항 또는 제125항에 있어서, 상기 항원이 코로나바이러스 스파이크 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 방법.
- 제124항 또는 제125항에 있어서, 상기 항원이 변종 코로나바이러스 스파이크 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함하는 것인, 방법.
- 제126항 또는 제127항에 있어서, 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질이 SARS-CoV-2 스파이크 단백질인, 방법.
- 제116항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 mRNA 작제물이 추가의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 추가로 포함하되, 상기 추가의 ORF는 제1 ORF에 의해 암호화된 항원과 상이한 항원을 암호화하는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제3 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 제3 mRNA 작제물을 대상체에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 제3 ORF는 제1 ORF에 의해 암호화된 항원과 상이한 항원을 암호화하는 것인, 방법.
- 하나 이상의 병원성 질환을 예방하거나 면역 반응을 개선하는 방법으로,
백신 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계; 및
적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하되, 상기 적어도 하나의 ORF는 IL-12; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택된 전염증성 사이토카인을 암호화하고, 상기 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 상기 UTR은 다중 기관을 보호하는 적어도 하나의 OPS를 포함하고, 상기 OPS는 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 상기 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되는 것인 적어도 하나의 mRNA 작제물; 및 생체내 전달 조성물을 포함하는 애쥬번트 조성물을 상기 대상체에게 공동 투여하는 단계를 포함하며; 상기 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착되는 것인, 방법. - 제131항에 있어서, 상기 백신 조성물이 톡소이드 백신, 재조합 백신, 접합 백신, RNA-기반 백신, DNA-기반 백신, 생 약독화 백신, 비활성화 백신, 재조합-벡터 기반 백신, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제131항 또는 제132항에 있어서, 상기 백신 조성물이 적어도 제1 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하되, 상기 제1 ORF는 박테리아 단백질 또는 이의 일부, 바이러스 단백질 또는 이의 일부, 및 신생항원 또는 이의 일부로부터 선택된 항원을 암호화하는 것인, 적어도 제1 mRNA 작제물; 및 생체내 전달 조성물을 포함하며, 상기 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착되는 것인, 방법.
- 제117항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공동 투여 단계가 백신 조성물 및 애쥬번트 조성물을 동시에 또는 연속적으로, 어느 순서로든 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신 조성물 및/또는 애쥬번트 조성물이 정맥내, 피하, 근육내, 비강내, 동맥내 및/또는 흡입을 통해 투여되는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원성 질환이 세포내 병원체에 의해 유발되는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원성 질환이 잠복 감염인, 방법.
- 제116항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원성 질환이 활성 감염인, 방법.
- 제116항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원성 질환이 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원성 질환이 코로나바이러스에 의해 유발되는 것인, 방법.
- 제140항에 있어서, 상기 병원성 질환이 SARS-CoV-2 바이러스에 의해 유발되는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원성 질환이 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 의해 유발되는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원성 질환이 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 의해 유발되는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원성 질환이 수두 대상포진 바이러스(VZV)에 의해 유발되는 것인, 방법.
- 제116항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원성 질환이 마이코박테리움 투베르쿨로시스 박테리아에 의해 유발되는 것인, 방법.
- 암을 치료 또는 예방하는 방법으로,
적어도 제1 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하되, 상기 제1 ORF는 종양 연관 항원, 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 암호화하며; 상기 제1 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 상기 UTR은 적어도 제1 기관 보호 서열(OPS)을 포함하고, 상기 OPS는 다중 기관을 보호하고, 상기 제1 OPS는 적어도 2 개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하고, 상기 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되는 것인 적어도 제1 mRNA 작제물; 및
생체내 전달 조성물을 포함하는 제1 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며;
상기 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착되는 것인, 방법. - 제146항에 있어서, 상기 종양 연관 항원이 결장직장 종양 항원을 포함하는 것인, 방법.
- 제146항에 있어서, 상기 종양 연관 항원이 MUC1인, 방법.
- 제146항에 있어서, 상기 종양 연관 항원이 신생항원인, 방법.
- 제149항에 있어서, 상기 신생항원이 대상체에게 개인화되는 것인, 방법.
- 제146항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 적어도 하나의 mRNA 작제물을 포함하는 제2 조성물을 대상체에게 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 제2 ORF는 IL-12; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택된 전염증성 사이토카인을 암호화하는 것인, 방법.
- 제151항에 있어서, 상기 공동 투여 단계가 제1 조성물 및 제2 조성물을 동시에 또는 연속적으로, 어느 순서로든 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
- 암을 치료 또는 예방하는 방법으로,
암 치료적 백신 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계; 및
적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하되, 상기 적어도 하나의 ORF는 IL-12; IFNγ; IFNα; IFNβ; TNFα; IL-2; IL-6; IL-8; 및 GM-CSF로부터 선택된 전염증성 사이토카인을 암호화하고, 상기 ORF는 적어도 하나의 비번역 영역(UTR)에 작동가능하게 연결되고, 상기 UTR은 다중 기관을 보호하는 적어도 하나의 OPS를 포함하고, 상기 OPS는 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 상기 적어도 2 개의 miRNA 표적 서열 각각은 상응하는 miRNA 서열과 혼성화하도록 최적화되는 것인, 적어도 하나의 mRNA 작제물; 및 생체내 전달 조성물을 포함하는 조성물을 대상체에게 공동 투여하는 단계를 포함하며; 상기 mRNA 작제물은 전달 조성물 내에 포함되거나 이에 흡착되는 것인, 방법. - 제153항에 있어서, 상기 암 치료적 백신 조성물이 종양 연관 항원을 대상체에게 전달하는 것인, 방법.
- 제154항에 있어서, 상기 종양 연관 항원이 바이러스 벡터를 사용하여 대상체에게 전달되는 것인, 방법.
- 제155항에 있어서, 상기 벡터가 아데노바이러스 벡터인, 방법.
- 제156항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터가 ChAdOx1 또는 ChAdOx2인, 방법.
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