ES2321680B1 - Restauracion de las moleculas hla de clase i mediante terapia genica empleando vectores adenovirales portando el gen de la beta 2-microglobulina. - Google Patents
Restauracion de las moleculas hla de clase i mediante terapia genica empleando vectores adenovirales portando el gen de la beta 2-microglobulina. Download PDFInfo
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Abstract
Restauración de las moléculas HLA de clase I
mediante terapia génica empleando vectores adenovirales portando el
gen de la \beta2-microglobulina.
La invención se relaciona con la recuperación de
la capacidad de presentación antigénica de tumores in vivo
mediante la restauración de la expresión de moléculas HLA de clase
I empleando para ello vectores adenovirales. La misma será
realizada en aquellos tumores totalmente negativos para la
expresión de moléculas HLA de clase I debido a alteraciones en la
\beta2-microglobulina, implicando el diagnóstico
previo de la alteración presente en el tumor.
Description
Restauración de las moléculas HLA de clase I
mediante terapia génica empleando vectores adenovirales portando el
gen de la \beta2-microglobulina.
La presente invención se refiere a la generación
de vacunas adenovirales que restauren la expresión de moléculas HLA
de clase I en tumores generando un incremento de la capacidad de
presentación antigénica de la célula tumoral.
La presencia de antígenos específicos de tumor
fue en principio demostrada sometiendo a los animales a fuerte
dosis de carcinógenos químicos (Prehn, R.T., and J.M. Main.
1957. "Immunity to
methylcholantreno-induced sarcomas". J Natl
Cancer Inst 18:769), a virus oncogénicos (Klein, E and G. Klein.
1964. "Antigenic properties of lymphomas induced by Moloney
agent". J. Natl Inst. 32: 547) o a radiación ultravioleta
(Kripke, MI. 1974 "Antigenicity o murine skin tumors
induced by ultraviolet light". J. Natl Cancer Inst.
53:1333-1336). Estos y otros múltiples estudios
permitieron a Burnet generar la hipótesis de que el sistema inmune
reconoce y elimina tumores en desarrollo basado en el
reconocimiento de neoantígenos generados en el proceso de la
transformación maligna (Burnet, F.M. 1970. "The concept of
immunological surveillance". Prog. Exp. Tumor Res.
13:1-27).
Dada la existencia de los antígenos tumorales
capaces de ser reconocidos por el sistema inmune, una parte de las
investigaciones en los últimos años en el cáncer, han estado
enfocadas a conocer los mecanismos que conducen al sistema inmune a
evadir el reconocimiento tumoral o a adquirir una tolerancia
progresiva durante su desarrollo.
Los componentes efectores del sistema inmune
están implicados en la respuesta inmunológica desarrollada frente
al cáncer, siendo los mas destacado la respuesta citotóxica celular
llevada por linfocitos T citotóxicos (CTLs) y células NK. Esta
respuesta efectora va a ser generada en la medida que se produzca
el reconocimiento inmunológico de las células tumorales llevado a
cabo por los linfocitos T. Este proceso está condicionado a la
expresión de moléculas HLA de clase I por parte de la célula
tumoral. La función principal de estas moléculas es la presentación
de pequeños péptidos, producto de la degradación de proteínas del
interior celular, a los linfocitos T en contexto de su receptor
(TCR). La habilidad de los linfocitos T para reconocer epitopos
peptídicos derivados del citoplasma, proteínas nucleares, antígenos
tumorales en el contexto de las moléculas HLA de clase I, permite
el reconocimiento por parte del sistema inmune de alteraciones
celulares provocadas por el proceso maligno y la consecuente
respuesta efectora.
El hecho de que las moléculas del MHC desempeñan
un papel esencial en el reconocimiento de los antígenos proteicos
por las células T, (Doherty, P.,C., M.B. Dunlop, C.R. Parish, and
R.M. Zinkernagel. 1976. "Inflamatory process in murine
lymphocytic choriomeningitis is maximal in H-2K or
H-2D compatible interactions". J. Immunology.
117:187-190) llevó a muchos laboratorios a realizar
un enorme esfuerzo para aclarar la estructura de estas moléculas y
el fenómeno de la presentación antigénica.
Existen dos grandes vías de procesamiento y
presentación antigénica; una usada para la presentación de
moléculas extracelulares y moléculas asociadas a membranas de la
célula y otra para la presentación de péptidos generados a partir
de la degradación de macromoléculas presentes en el citosol celular
(vía endógena). La primera vía descrita genera péptidos que son
presentados mediante las moléculas MHC de clase II a linfocitos T
CD4+. La segunda vía genera péptidos para ser presentados por
moléculas pertenecientes al MHC de clase I que son reconocidos por
linfocitos T CD8+. Ambos tipo de moléculas, están localizadas en el
complejo mayor de histocompatibilidad, ubicados en el brazo corto
del cromosoma 6 (6p21.3) (Breuning, M.,H., E.M. van den
Berg-Loonen, L.F. Bernini, J.B. Bijlsma, E. van
Loghem, P. Meera Khan, L.E. Nijenhuis. 1977 "Localization
of HLA on short arm of chromosome 6". Hum Genet
37:131-139) constituido por un conjunto de cerca de
200 genes de los cuales aproximadamente 40 codifican para los
antígenos HLA. Las moléculas HLA de clase I presentan péptidos
derivados de proteínas citosólicas, sintetizadas en el interior
celular, para su reconocimiento por linfocitos T CD8, el antígeno
es procesado por la vía denominada endógena o biosintética. El
ensamble de las moléculas HLA de clase I es un proceso de
naturaleza secuencial, en un orden cronológico específico lo cual
permite un reporte continuo del contenido celular a los CTLs.
La respuesta específica de linfocitos T
citotóxicos (CTLs) juega un papel predominante en el control del
crecimiento tumoral, la misma ha sido observada en ausencia de
respuesta clínica. La aparición de variantes menos antigénicas así
como interferencias con el proceso de presentación antigénica puede
afectar la capacidad de las células tumorales para ser dianas de
CTLs al modular la sensibilidad de las células tumorales a los
CTLs, como a la disminución de su actividad citotóxica.
Desde el último cuarto del siglo pasado es
ampliamente conocido el hecho de que las células tumorales pueden
perder la expresión de moléculas HLA de clase I por una gran
variedad de mecanismos, durante la progresión tumoral (Festenstein,
H. 1987. "The biological consequences of altered MHC
expression on tumours". Br Med Bull.
43:217-227).
Su estudio retomó interés nuevamente en el
inicio de la década de los 90, cuando fue puesto de manifiesto el
papel de los antígenos de clase I del MHC en el reconocimiento de
las células tumorales por CTLs (Crowley, N.,J., T.L. Darrow, M.A.
Quinn-Allen, H.F. Sigler. 1991.
"MHC-restricted recognition of autologous melanoma
by tumor-specific cytotoxic T cells". Evidence
for restriction by a dominant HLA-A allele. J
Immunol 146:1692-1699) y la implicación de estas
células efectoras en el establecimiento de la inmunoterapia
específica de células T en el tratamiento del cáncer (Boon, T, P.G.
Coulie, B. Van den Eynde. 1997. "Tumor antigens recognized
by T cells". Immunol Today 18:267-268).
Los estudios iniciales de las moléculas HLA
fueron difíciles de realizar, por la carencia de los reactivos
adecuados. El desarrollo de la metodología de hibridomas y
anticuerpos monoclonales conjuntamente con el advenimiento de las
técnicas inmunohistoquímicas ayudó a caracterizar mejor estas
alteraciones al poder analizar su expresión en tejidos
criopreservados. El uso de anticuerpos que reconocían determinantes
monomórficos, locus específicos y alelo específico en secciones
criopresevadas de tumores permitió la identificación de distintos
fenotipos de expresión alterada de moléculas HLA de clase I
(Garrido, F., F. Ruiz-Cabello, T. Cabrera, J.J.
Perez-Villar, M. Lopez-Botet, M.
Duggan-Keen, P.L. Stern. 1997.
"Implications for immunosurveillance of altered HLA class I
phenotypes in human tumors". Immunol Today
18:89-95), (Ferrone, S., and F.M. Marincola.
1995. "Loss of HLA class I antigen by melanoma cells:
Molecular mechanisms, functional significance and clinical
relevance". Immunol Today 16: 487-494).
Estos estudios permitieron la clasificación de
las alteraciones de las moléculas HLA clase I encontradas
comúnmente en tejidos y líneas celulares tumorales, en fenotipos HLA
alterados siendo los descritos hasta ahora el fenotipo I (pérdida
total de expresión de antígenos HLA de clase I); fenotipo II
(pérdida de haplotipo) fenotipo III (pérdida de expresión del
locus); fenotipo IV (pérdida de expresión de alelos individuales).
Algunos tumores pueden presentar fenotipos complejos que consisten
en la combinación de uno o varios de los mecanismos antes
mencionados (Fenotipo V) (Garrido, F., F.
Ruiz-Cabello, T. Cabrera, J.J.
Perez-Villar, M. Lopez-Botet, M.
Duggan-Keen, P.L. Stern. 1997.
"Implications for immunosurveillance of altered HLA class I
phenotypes in human tumors". Immunol Today
18:89-95). Recientemente han sido descritos dos
fenotipos nuevos: el fenotipo VI, en el que la célula tumoral es
resistente a la acción del IFN-\gamma y el
fenotipo VII caracterizado por baja regulación de moléculas HLA de
clase I y expresión de moléculas HLA no clásicas (Fig. 1).
Los mecanismos moleculares generadores de los
fenotipos alterados de las moléculas HLA de clase I son diversos,
probablemente como consecuencia de la inestabilidad genética
característica del proceso tumoral.
Las células tumorales exhiben frecuentemente
pérdida total de expresión de los antígenos HLA de clase I
(Fenotipo I) (12-40%), siendo encontrada en un 15%
de melanomas, 12% de carcinoma laringeo, 14% de carcinomas
colorectales, 40% de carcinomas de vejiga y un 25% de cáncer de
mama (Garrido, F., T. Cabrera, A. Concha, S. Glew, F.
Ruiz-Cabello, P.L. Stern. 1993. "Natural
history of HLA expression during tumour development". Immunol
Today 14: 491-499), (Garrido, F et al.
1995. "HLA class I antigens in human tumors". Adv Cancer
Research, 67:155-95) siendo rápidamente detectada
en la mayoría de los tumores mediante técnicas
inmunohistoquímicas.
La ausencia total de expresión de moléculas HLA
de clase I o Fenotipo I, puede estar asociado con defectos en la
síntesis de la molécula \beta2-microglobulina,
baja regulación de las proteínas LMP (low molecular weight protein)
y/o TAP, (Chen, H.,L., D. Gabrilovich, R. Tampe, K.,R., Girgis, S.,
Nadaf, D., Carbone. 1996. "A functionally defective allele
of TAP-1 results in loss of MHC class I antigen
presentation in a human lung cancer". Nat Genet. 13:
210-213); pérdida de factores de transcripción y
metilación de los genes HLA de clase I, lo que implica que todas las
moléculas que participan en las distintas etapas de su biosíntesis
son dianas probables para la generación de variantes tumorales HLA
negativas como mecanismo de escape durante la tumorogénesis (Sette,
A., R. Chesnut, J. Fikes. 2001. "HLA expression in cancer:
implications for T cell-based immunotherapy".
Immunogenetic 53:255-263); (Tait, B.,D. 2000.
"HLA class I expression on human cancer cells: implications for
effective immunotherapy". Hum Immunol
61:158-165). La ausencia total de expresión es
observada en tumores con defectos de naturaleza transcripcional
(reversibles tras tratamientos de citoquinas) que conllevan a la
baja regulación de los componentes involucrados en el procesamiento
antigénico (TAP1, TAP2, LMP2, LMP7), observados en líneas celulares
tumorales de pulmón, próstata, y carcinomas renales. (Restifo N.P.,
F Esquivel, Y. Kawakami, J.W. Yewedell, J.J. Mule, S.A. Rosenberg,
J.R. Bennink. 1993. "Identification of human cancers
deficient in antigen processing". J Exp Med
177:265-272).
Uno de los mecanismos responsables mas
claramente implicados, lo constituyen las mutaciones en el gen de
la \beta2-microglobulina. Las mismas han sido
descritas en cáncer de colón, en carcinoma de pulmón y en melanoma
maligno metastásico (Bicknell D., C.,A., Rowan, WF Bodmer.
1994. Beta 2-microglobulin gene mutations: a
study of established colorectal cell lines and fresh tumor. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 91:4751); (Benitez R., D. Godelaine, M.A.
Lopez-Nevot, F. Brasseur, P. Jimenez, M. Marchand,
M.R. Oliva, N. van Baren, T. Cabrera, G. Andry, G. Landry, F.
Ruiz-Cabello, T. Boon, and Garrido F. 1998.
``Mutations of the \beta2microglobulin gene result in a lack of
HLA class I molecules on melanoma cells of two patients immunized
with MAGE peptides. Tissue Antigens. 52:
520-529).
Las alteraciones moleculares descritas para este
gen, van desde mutaciones puntuales (cambios en el patrón de
lectura y la introducción prematura de codones de terminación) hasta
deleciones, que afectan a ambas copias del mismo
(Ruiz-Cabello, F., T. Cabrera, M.A.
Lopez-Nevot, Garrido F. 2002. Impaired
surface antigen presentation in tumors: implications for T
cell-based immunotherapy''. Seminars in Cancer
Biology. 12:15-24).
\newpage
Lo mas importante a destacar de esta alteración
es su naturaleza de carácter irreversible a sustancias
inmunomoduladoras como el IFN-\gamma, no siendo
posible la recuperación de la expresión de las moléculas HLA de
clase I en la superficie celular tras tratamientos con estas
sustancias.
En estos casos, la restauración de la expresión
de las moléculas HLA de clase I solo puede realizarse mediante la
restauración de la copia normal de la
\beta2-microglobulina.
En cuanto a los demás fenotipos HLA alterados,
la pérdida de haplotipo(Fenotipo II) es probablemente el
mecanismo mas frecuente que origina alteraciones HLA de clase I.
Está ampliamente descrito en cáncer cervical con una frecuencia del
50% (Koopman, L.A., W.E. Corver, A.R. van der Slik, M.J. Giphart,
G.J. Fleuren. 2000. "Multiple genetic alterations cause
frequent and heterogeneous human histocompatibility leukocyte
antigen class I loss in cervical cancer". J Exp Med
191:961-76), así como en melanoma y en páncreas
(Marincola, F.M., P Shananuab, R. Alexander, J.R. Gnarra, R.
Turetskaya, S.A Nedospasov, T.B. Simonis, J.K, Taubenberger, J.
Yannelli, A. Mixon, N.P. Restifo, M. Herlyn and S.A. Rosernberg.
1994. "Loss of HLA haplotype and B locus down regulation
in melanoma cell lines". J Immunol
153:1225-1237); (Torres, M.J., F.
Ruiz-Cabello, A Skoudy, G Berrozpe, P Jiménez, A
Serrano, FX Real, F Garrido. 1996. "Loss of an HLA
haplotype in pancreas cancer tissue and its corresponding tumor
derived cell line". Tissue Antigens. 47,
372-381). Esta alteración es el resultado de la
pérdida de material genético, específicamente en el brazo corto del
cromosoma 6 (6p), que da origen a la pérdida de heterozigocidad o
LOH. La pérdida de material genético es debida a defectos en la
segregación de los cromosomas en la división celular ocasionando
pérdidas genéticamente variables e irreversibles de la region 6p21
(de Nooij-van Dalen, A.G., V.H. van
Buuren-van Seggelen, P.H. Lohman, M.
Giphart-Gassler. 1998 "Chromosome loss with
concomitant duplication and recombination both contribute most to
loss of heterozygosity in vitro" Genes Chromosomes Cancer
21:30-38); (Jimenez, P., Cantón, J., Collado, A.,
Cabrera, T., Serrano, A., Real, L.M., García, A., Ruiz- Cabello, F.,
Garrido F. 1999. "Chromosome loss is the most frequent
mechanism contributing to HLA haplotype loss in human tumors".
Int J Cancer. 83:91.
La pérdida de expresión selectiva de moléculas
HLA de clase I puede ocurrir también al nivel molecular de un solo
locus (Fenotipo III). Este fenotipo ha sido identificado en tejidos
de cáncer colorectal, gástrico, y carcinomas de laringe mediante el
empleo de anticuerpos locus específicos
(López-Nevot M.A., F. Esteban, A. Ferron, F.
Ruiz-Cabello, F. Garrido. 1989. "HLA class
I expression on human primary tumors and autologous metastases:
demostration of selective losses of HLA antigens on colorectal,
gastric and laryngeal carcinomas". Br. J Cancer 59:
221-226). La baja regulación del locus
HLA-B es frecuentemente reversible in vitro
por incubación de las líneas celulares con
IFN-\gamma, siendo el mecanismo molecular
responsable aun no bien conocido. (Soong TW and K.M, Hui. 1992.
"Locus specific transcriptional control of HLA genes". J
Immunol. 149:2008-2020.
Una de las alteraciones más comunes es la
pérdida específica de alelos HLA de clase I (Fenotipo IV). Entre
los mecanismos descritos responsables de estas alteraciones se
encuentran recombinación somática dentro del antígeno, mutaciones
sin sentido, mutaciones que causan splicing aberrante del
pre-mRNA, deleciones e inserciones (Serrano, A.,
C.S. Brady, P. Jimenez, M.F. Duggan-Keen, R.
Méndez, P. Stern, F. Garrido, F. Ruiz-Cabello.
2000. "A mutations determining the loss of
HLA-A2 antigen expression in a cervical carcinoma
reveals novel splicing of human MHC class I classical transcripts
both in tumoral and normal cells". Immunogenetics
51:1047-1052). Con excepción del Fenotipo III que es
de naturaleza transcripcional, las demás alteraciones solo pueden
recuperarse introduciendo la copia normal del gen alterado.
La generación de una respuesta inmune efectiva
requiere un complejo número de eventos que involucran tanto el
brazo humoral como el brazo celular de la respuesta inmune. Tal como
hemos descrito anteriormente, la pérdida de los antígenos HLA de
clase I en células tumorales impide el reconocimiento por parte de
los CTLs. En el caso de las pérdidas alélicas, este tipo de
alteración permite que el tumor escape del reconocimiento
antigénico debido a una respuesta inmunodominante restringida por
una sola molécula HLA de clase I y a su vez inhibir la respuesta de
las células NK (Sette A, R Chesnut., J Fikes. 2001. "HLA
expression in cancer: implications for T cell-based
immunotherapy". Immunogenetic 53:255-63).
Varias estrategias han sido empleadas para
incrementar la respuesta inmune contra las células tumorales de
melanoma. En un principio se demostró que era posible generar una
reactividad inmune específica mediante la inyección de células
tumorales conjuntamente con bacterias o virus. Posteriormente, la
identificación de péptidos provenientes de diferentes tumores
humanos ha provisto las bases para la inmunoterapia activa antígeno
específica y ha facilitado el diseño de nuevos esquemas de
inmunoterapia (Renkvist, N., C. Castelli, P.F. Robbins, G. Parmiani.
2001. "A listing of human tumor antigens recognized by T
cells". Cancer Immunol Immunother 50:3-15). La
inmunoterapia activa tiene su fundamento en que los antígenos
asociados a tumores pueden ser reconocidos por el sistema inmune de
manera que al ser inyectados en pacientes con cáncer serian capaces
de inducir una respuesta efectora tumor-específica,
que pueda lograr la destrucción del cáncer, bien por la generación
de una respuesta inmunológica o por la
re-estimulación de la ya existente hacia el
antígeno, mediante la generación o inducción de una expansión y/o
activación clonal de células T y B.
\newpage
Algunos de los métodos utilizados para el
tratamiento del cáncer se basan en péptidos tumorales reconocidos
de manera específica por las células T. Sin embargo en ensayos
clínicos en pacientes con melanoma, la falta de respuesta al
tratamiento con péptidos MAGE se correlaciona con la presencia de
mutaciones en el gen de la \beta2-microglobulina y
la pérdida de moléculas HLA de clase I en la superficie de la
célula tumoral (Benitez R., D. Godelaine, M.A.
Lopez-Nevot, F. Brasseur, P. Jimenez, M. Marchand,
M.R. Oliva, N. van Baren, T. Cabrera, G. Andry, G. Landry, F.
Ruiz-Cabello, T. Boon, and Garrido F. 1998.
``Mutations of the \beta2microglobulin gene result in a lack of
HLA class I molecules on melanoma cells of two patients immunized
with MAGE peptides. Tissue Antigens. 52: 520-29).
La ausencia de expresión o la baja regulación de antígenos HLA de
clase I en las células tumorales puede llevar a la ausencia de un
respuesta clínica de esta inmunoterapia con péptidos.
El éxito en el establecimiento de la
inmunoterapia como tratamiento del cáncer requiere la comprensión
de las relaciones establecidas entre el sistema inmune y el tumor en
sus distintas etapas de transformación, invasión y generación de
metástasis (Pardoll D. 2003. "Does the immune system see
tumor as foreign or self". Annu. Rev Immunol.
21:807-39).
Hasta el momento, las vacunas de melanomas son
las que han recibido más atención. Entre las vacunas que se
utilizan en ensayos clínicos podemos encontrar: lisados celulares
íntegros (Melacine) Sosman, JA, V.K. Sondak. 2003.
"Melacine: an allogeneic melanoma tumor cell lysate vaccine".
Expert Review of Vaccines 2:353-68), células de
melanoma autólogas tratadas con haptenos (M-Vax)
(Berd D. 2002. "M-Vax: an autologous,
hapten-modified vaccine for human cancer".
Expert opin Biol Ther 2:335-42), y células
alogénicas irradiadas (CancerVax) (Morton DL, LJ Foshag, DS Hoon, JA
Nizze, E Famatiga, LA Wanek, C Chang, DG Davtyan, RK Gupta, R
Elashoff, et al. 1992. "Prolongation of survival in
metastatic melanoma after active specific immunotherapy with a new
polyvalente melanoma vaccine". Ann Surg.
216:463-82).
No obstante, en numerosos protocolos llevados a
cabo en inmunoterapia con gran número de pacientes, la respuesta
obtenida al tratamiento ha sido aproximadamente de apenas de un 3%.
(Rosenberg, S., Yang, J.C., and Restifo, N.P. 2004 Cancer
immunotherapy: moving beyond current vaccines. Nat Med. 10:
909-915).
Este resultado puede ser debido a la generación
de mecanismos de escape al sistema inmune generados por el tumor.
(Marincola, F.,M., E. Jaffee, D. Hicklin, S. Ferrone. 2000.
"Escape of Human Solid Tumors from T-Cell
Recognition: Molecular Mechanisms and Functional Significance".
Advances in Immunology 74:181-273).
Dentro de estos mecanismos de escape se
encuentran las alteraciones HLA de clase I. Estas alteraciones se
han clasificado de acuerdo al grado de reversibilidad dada la
repercusión que pueden tener en las opciones de tratamiento
incluida la inmunoterapia. En el caso de las alteraciones
reversibles, con trastornos en la transcripción, estas pueden ser
revertidas administrando citocinas tales como los interferones. En
el caso de alteraciones HLA de clase I generadas a partir de daños
estructurales, éstas solo pueden ser restauradas mediante la
corrección del daño genético y solamente, ser recuperadas mediante
la restitución del gen salvaje que codifica las moléculas HLA. Por
todo ello, los métodos de terapia génica podrían aplicarse en el
complejo tratamiento del cáncer incrementando las opciones de
tratamiento en la inmunoterapia.
En este sentido, hace ya tiempo que se esta
intentando restaurar la expresión normal de proteínas HLA de clase
I en diferentes células tumorales. Los primeros hallazgos se
presentaron en los años 80 y se hicieron en los primeros modelos
murinos en los que se habían descrito defectos en el MHC. La
primera descripción de una pérdida de una especificidad privada
H-2Kk se produjo en el linfoma Gardener, derivado
de un ratón C3H (Garrido F and Festenstein. Further evidence for
depression of H-2 and Ia-like
specificities of foreign haplotypes in mouse tumour cell lines.
Nature, 1976, 261:705-07).
En líneas celulares humanas resultados similares
fueron encontrados en líneas celulares negativas para la expresión
de molecular HLA de clase I producto de una alteración de las dos
copias del gen de la \beta2-microglobulina. Al
transfectar con este gen las células tumorales recobraban la
capacidad de presentar peptidos antigénicos y de ser reconocidos de
manera especifica por linfocitos T citotóxicos (Paschen A, R.M.
Méndez, P. Jiménez, A. Sucker, F. Ruiz-Cabello, M.
Song, F. Garrido, D. Schadendorf. Int J Cancer.
103:759-67). Estos ensayos han sido realizados in
vitro con plásmidos, que tienen el incoveniente de ser bastante
inespecíficos para la terapia génica dirigida al tumor y son menos
eficientes que los vectores virales.
En esta invención el objeto es diseñar una
vacuna que pueda ser empleada especificamente en tumores humanos,
estudiando previamente las alteraciones de los genes HLA presentes
en el tumor, ya que la pérdida de estas moléculas compromete la
inmunogenicidad y sensibilidad de la célula tumoral frente al
sistema inmune. El objetivo principal de esta invención es la
restauración de la capacidad antigénica en tumores con pérdida
total de moléculas HLA de clase I debida a mutaciones en la
\beta2-microglobulina, mediante la restitución de
este gen a través del uso de vectores adenovirales portadores del
gen de la \beta2-microglobulina.
Los vectores virales son sistemas biológicos
derivados de virus desarrollados naturalmente capaces de transferir
su material genético a las células huésped. Muchos virus, incluyendo
retrovirus, adenovirus, herpes simple (HSV), lentivirus y pox virus
han sido modificados para eliminar su toxicidad y mantener su alta
capacidad de transferir genes.
\newpage
Las células eucarióticas pueden, bajo
condiciones optimas, tomar DNA exógeno, parte del cual comienza a
localizarse en el núcleo. Este proceso es, sin embargo, generalmente
insuficiente para la terapia génica, dirigida al tumor. Los
adenovirus son candidatos atractivos para las aplicaciones en la
terapia génica, siendo como vectores seguros y ademas de que pueden
realizarse purificaciones con altas dosis o altos títulos de virus
recombinantes purificados, los cuales pueden infectar
eficientemente un amplio rango de células in vitro e in
vivo (Curiel DT. et al. 1996. "Gene therapy
approaches for inherited and acquired lung diseases". Am J Respir
Cell Mol Biol. 14:1-18). El adenovirus es un virus
con DNA de doble cadena, que contiene un genoma de 36 kb que consta
de genes que codifican proteínas reguladoras tempranas y proteínas
estructurales tardías (Dobbelstein, M. 2004. "Replication
adenoviruses in cancer therapy". Curr Top Microbiol Immunol.;
273:291-334).
A la primera generación de adenovirus
recombinantes se le quita la región reguladora temprana El, cuya
función, normalmente, es activar otros genes virales. Esto
inhabilita al virus para replicarse. Generalmente también se
elimina la región E3, para obtener espacio para el inserto (Trapnell
BC, Gorziglia. 1994. M Gene therapy using adenoviral
vectors. Curr Opin Biotechnol.,
5(6):617-625).
Esta ingenieria conlleva el reemplazar la parte
codificante de las proteínas estructurales del genoma viral con
genes marcadores (ej. \beta-gal, GFP) o genes
terapéuticos de cDNA. El virus no se integra dentro del cromosoma,
sino que permanece como un episoma en el núcleo. Se ha creado una
segunda y tercera generación de adenovirus. En estos vectores, se
eliminan más proteínas codificadas por la región que tiene la
secuencia E4 (y posiblemente la E2), para reducir la expresión de
las proteínas virales. Los adenovirus humanos se han usado para la
transferencia génica en humanos in vivo en células nasales y
pulmonares (CFTR cDNA), células endoteliales, de riñón, de corazón,
de hígado, del sistema nervioso central, de músculo, hematopoyéticas
y cancerosas. (Puumalainen AM et al., 1998.
Beta-galactosidase gene transfer to human malignant
glioma in vivo using replication-deficient
retroviruses and adenoviruses. Hum Gene Ther.
9:1769-74).
Figura 1. Fenotipos alterados de expresión de
las moléculas HLA de clase I descritos en tumores. Una célula
normal expresa 6 alelos diferentes de las moléculas HLA de clase I.
En los procesos de transformación tumoral, estas moléculas pueden
desaparecer. Según este patrón se han descrito 7 fenotipos
diferentes. El fenotipo I corresponde a la pérdida total de
expresión en la superficie celular de las moléculas HLA de clase I.
El fenotipo II se caracteriza por la pérdida de expresión de un
haplotipo HLA de clase I. El fenotipo III consiste en la pérdida de
un locus (A, B o C). En el fenotipo IV se pierde solamente un alelo
HLA de clase I. El fenotipo V o compuesto se caracteriza por la
combinación de dos fenotipos. El fenotipo VI es la ausencia de
incremento de las moléculas HLA de clase por resistencia al IFN
gamma. El fenotipo VII consiste en la baja regulación de moleculas
HLA de clase I y la sobre expresión de moléculas no clásicas
(HLA-G o HLA-E).
Figura 2. Esquema del vector adenoviral (AdCMV
b2m) construido mediante el sistema Cre-lox. El
vector adenoviral AdCMVb2m fue generado mediante el sistema
Cre-lox, portando la secuencia del gen de la b2
microglobulina indispensable para la expresión de moléculas HLA de
clase I. Con este virus se infectó la línea celular de melanoma
E-109. Esta línea posee una ausencia total de
expresión de las moléculas HLA de clase I debido a mutaciones en el
gen de la \beta2 microglobulina. La línea celular recuperó la
expresión de moléculas HLA de clase I a las 48 horas. El máximo
nivel de expresión se obtuvo a las 96. Esta expresión se mantuvo
hasta el noveno día, decreciendo lentamente hasta el día 12 y
siendo negativa el día 17.
La identificación de las alteraciones HLA de
clase I será realizada en el tumor del paciente, empleando técnicas
previamente estandarizadas que permitiran evaluar rápidamente y de
manera sistemática, la expresión de las moléculas HLA en la célula
tumoral. En primer lugar se utilizarán anticuerpos monoclonales
(técnica de inmuhistoquímica) en tejidos criopreservados.
La metodología molecular es desarrollada en
varios pasos:
El análisis se realizará sobre células
tumorales. El RNA celular total se obtendrá con Ultraspec (Biotex
Laboratories, Houston, Texas), siendo posteriormente utilizado para
los estudios de expresión mediante la síntesis de cDNA. Esta se
realizará con Kit Reverse Transcription System (Promega) y
mRNA (2 \mug) La reacción es incubada en un termociclador a 42ºC
durante 60 minutos y a 95ºC durante 5 minutos, amplificándose
posteriormente por RT-PCR usando primeros
específicos para la \beta2-micrglobulina humana.
El DNA genómico del tumor y de los linfocitos sanguíneos se aislará
utilizando extracción con fenol y proteinasa K y precipitación
salina. El DNA se amplificarán por PCR utilizando primers
específicos que incluyen la región codificante del gen de la
\beta2-microglobulina.
Como ejemplo del procedimiento estandar de
generación de adenovirus se describe la producción del
Ad-CMV \beta2-microglobulina, bajo
el control del promotor de CMV y empleando el sistema de
recombinación Cre-lox (Hardy, S., M. Kitamura, T.
Harris-Stansil, Y. Dai, and M. L. Phipps.
1997. "Construction of adenovirus vectors through
Cre-lox recombination". J Virol
71:1842-49). Para la donación del gen de la
\beta2-microglobulina el RNA celular total se
obtuvo con el método de Ultraspec (Biotecx Laboratories, TX, USA)
de PBLs humanos normales positivos para la expresión de moléculas
HLA clase I. A partir de 2 \mug se realizó la técnica de
transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR) utilizando un termociclador (MJ research)
para obtener y amplificar el ADN complementario de la
\beta-2 microglobulina. El ARN total fue
transcrito (60 minutos a 42ºC) con 400 unidades de
M-MuLV transcriptasa reversa (Promega) en un volumen
final de 20 \mul. Después de desnaturalizar la transcriptasa
reversa (95ºC 1 minuto), el ADN complementario se diluyo a un
cuarta con agua pentadestilada y 2 \mul de esta solución fueron
empleados para la amplificación de la
(32-microglobulina, con primers específicos
diseñados para el cDNA de este gen y que tenían incorporados los
sitios de restricción de las enzimas de restricción HindIII y Bam
HI. (Primer Fw:
5'-aagcttgccaccatgtctcgctccgtggccttag-3',
Primer Bw:
5'-ggatcctgcggcatcttcaaacctccatg-3').
40 \mul del producto de PCR fueron separados mediante
electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% (p/v) teñido con bromuro
de etidio. La banda obtenida se visualizó con una lámpara de luz
ultravioleta, se comprobó su tamaño, se cortó y extrajo del gel, y
el producto de la PCR se purificó mediante el kit de purificación de
DNA, GENECLEAN (Q.BIO gene). El fragmento de 415 pares de bases
correspondiente al cDNA de la \beta-2
microglobulina (Secuencia I) se clonó en el plásmido
pCR4-TOPO (TOPO TA cloning Kit), directamente a
partir de la PCR purificada según las indicaciones del KIT. Con el
resultado de dicha ligación se transformaron bacterias competentes
E. coli DH5\alpha-T1 (Invitrogen,
Carlsbad), las bacterias transformadas se seleccionaron por su
crecimiento en placas de Petri con medio LB con ampicilina, ya que
el vector contiene un gen de resistencia a este antibiótico. Se
extrajo el DNA plasmídico de las bacterias positivas mediante la
técnica de MiniPrep (Qiagen, Alemania) para, posteriormente,
digerir 2 \mug de dicho plásmido con las enzimas HindIII y BamHI
(Roche Diagnostics) y separar por electroforesis el resultado de
dicha digestión en un gel de agarosa al 1,5% para comprobarla
presencia del inserto. Los plásmidos con el fragmento de 415 pares
de bases esperado se secuenciaron para descartar errores en la
amplificación en un secuenciador automático ABIPRISM 310 (Perkin
Elmer, Foster, CA, USA), utilizando el kit de secuenciación Dye
RhodamineTerminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer) coincidiendo
con lo reportado en la bibliografia. Una vez comprobada la
presencia del inserto adecuado, con 2 \mug de dicho plásmido se
realizó una digestión con las enzimas de restricción HindIII y BamHI
(RocheDiagnostics), el producto de la digestión se analizó en un
gel de agarosa al 1,5%, la banda conteniendo el fragmento con el
cDNA de h\beta-2 microglobulina se purificó con el
Kit de purificación de DNA Ultrafree-DA
(Amicon-Milipore). El cDNA obtenido se subclonó por
debajo de la secuencia del promotor de CMV y por encima de la señal
de poli-A en el plásmido pAdlox que contiene la
señal de empaquetamiento del adenovirus (\Psi5) y el sitio loxP.
Para ello, el plásmido pAdLox, fue previamente digerido con las
enzima HindIII y BamHI, (Roche Diagnostics), cuyos sitios de corte
se encuentran presentes en las posiciones 1163 y 1193 del vector
pAdlox y tratado con fosfatasa alcalina (Roche Diagnogtics),
mediante una ligación de extremos cohesivos a temperatura ambiente
durante 5 minutos con la T4 DNA ligasa y el Kit de ligación de
Invitrogen. Con el resultado se transformaron bacterias competentes
E. coli DH5\alpha-T1 (Clontech, Palo Alto,
CA, USA) se seleccionaron las resistentes a ampicilina y se
purificó el DNA plasmídico de colonias seleccionadas siguiendo las
técnicas descritas anteriormente. Se realizó un screening mediante
una nueva digestión con las enzimas de restricción HindIII y BamHI
(Roche Diagnostics) y el producto se separo en un gel de agarosa al
1,5% para comprobar la presencia y orientación del inserto (cDNA de
\beta2-microglobulina humana).
El adenovirus recombinante Ad CMV
b2-microglobulina, se generó por cotransfección de
pAdloxb2m y \Psi5 (DNA adenoviral defectuoso en
El-E3) en la línea celular que expresa 293 la
recombinasa Cre (CRE8). La línea celular selectiva CRE8 tiene un
cassette de expresión conducido por la actividad de la
\beta-actina dando lugar al gen de la recombinasa
Cre con una señal N-terminal de localización
nuclear establemente integrada en las células 293 (células de riñón
embrionario humano transformadas con El adenoviral) Qian, C., M.
Idoate, R. Bilbao, B. Sangro, 0. Bruna, J. Vazquez, and J. Prieto.
1997. "Gene transfer and therapy with adenoviral vector in
rats with diethylnitrosamine-induced hepatocellular
carcinoma". Hum Gene Ther 8:349-58).
La recombinasa Cre cataliza la recombinación del
sitio loxP que generó AdCMV-b2 microglobulina. Las
células CRE8 se cotransfectaron con CaPO4 con el
pAdlox/b2-microglobulina previamente digerido con la
enzima SfiI y el ADN viral procedente del \Psi5.
Pasados 10 días, el lisado de las células
cotransfectadas se usó para infectar las células CRE8 llevando a
cabo varios pases, con el objeto de eliminar la contaminación con el
virus \Psi5 que no se haya recombinado. El lisado celular del
último pase se clonó por dilución límite en placas de 96 pocillo en
monocapas de células 293 para obtener una sola partícula viral. Para
ello se empleará el método de dilución límite, utilizando el
pocillo donde se observe una única placa lítica por la acción del
virus en las células 293. Esta única partícula será expandida en
estas mismas células hasta un total de 20-40 placas
(15 cm de diámetro) para amplificar el AdCMVb2 microglobulina
correspondiente. El DNA viral empaquetado se preparará como se
describe en Hardy et al., 1997. (Hardy, S., M.
Kitamura, T. Harris-Stansil, Y. Dai, and M. L.
Phipps.1997. "Construction of adenovirus vectors through
Cre-lox recombination". J Virol
71:1842-49).
Brevemente, una vez seleccionado el pocillo con
un único virus, se expandirán en células 293. La purificación del
virus se realizará por ultracentrifugación en gradiente doble de
cloruro de cesio (Qian, C., M. Idoate, R. Bilbao, B. Sangro, O.
Bruna, J. Vazquez, and J. Prieto. 1997. "Gene transfer and
therapy with adenoviral vector in rats with
diethylnitrosamine-induced hepatocellular
carcinoma". Hum Gene Ther 8:349-58).
Los virus purificados se dializarán en 10 mM
Tris/1 mM MgCl2 y se almacenarán a -80ºC hasta su uso en
experimentos de transfección. Los adenovirus empleados para terapia
serán elaborados con todos los requerimientos de bioseguridad
establecidos. El adenovirus que contiene los genes control
humanizados GFP bajo el control del promotor de CMV (AdCMVhGFP), así
como pAdloxGFP, se producirán como vectores control.
El medicamento derivado de la presente invención
se destina al tratamiento de un cáncer en los mamíferos, más
particularmente en el hombre. Puede permitir el tratamiento de
tumores secundarios que son unas complicaciones frecuentes
presentadas en numerosos tipos de cáncer y para las que actualmente
no existe una terapia satisfactoria. El medicamento puede
administrarse por inyección directa en el lugar del tumor mediante
seguimiento ecográfico. De una forma general, la administración
puede producirse en una dosis única o repetida, uno o varia veces
después de un determinado intervalo de tiempo.
Según una forma de realización preferida de la
invención, el medicamento comprenderá, además una cantidad
terapéuticamente eficaz de dicho vector viral, un soporte aceptable
desde un punto de vista farmacéutico. Puede asimismo comprender un
vehículo, un diluyente o un adyuvante aceptable desde un punto de
vista farmacéutico y presentarse en forma líquida o liofilizada.
Se han realizado ensayos in vitro en
líneas celulares tumorales previamente estudiadas en nuestro
laboratorio en las que se conoce con precisión el tipo alteración
HLA que presentan. Varios ejemplos de las mismas están constituidos
por: las líneas celulares E-038, (Benítez R, y
cols., Tissue Antigens, 52:520, 1998) y E-109
(UKRV-me12) (Paschen et al, Int. J. Cáncer,
103:759, 2003) que presentan pérdida total de moléculas HLA de
clase I (fenotipo I) debido a mutaciones y a LOH de la
\beta2microglobulina. Estas líneas celulares se transfectaron con
el gen salvaje de la \beta2m recuperándose la expresión de las
moléculas HLA de clase I en las mismas (Fig. 2).
Las líneas celulares tumorales provenientes de
diferentes estirpes celulares, son previamente sembradas en placas
de 6 pocillos a una confluencia de un 70-80%. Las
líneas fueron infectadas a una MOI de 100 (100 partículas virales
por célula), en medio RPMI o Dulbeco al 2% de suero fetal. Tras 48
horas de infección las células fueron levantadas mediante lavado con
PBS-EDTA y se analizó la expresión de la
\beta2-microglobulina u otra molécula HLA de clase
I en la superficie celular mediante el uso de anticuerpos
monoclonales específicos para esta molécula y para la expresión de
HLA de clase I tales como el GRH-1 y el W6/32
respectivamente. Se realizará mediante la técnica de
inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo empleando un
amplio panel de AcMos contra antígenos HLA de clase I. Para
estudiar la expresión de los alelos será imprescindible conocer con
anterioridad el tipaje HLA de clase I.
Un resultado positivo es representado en la
figura 2 donde la célula de melanoma UKRV-mel 1
inicialmente negativa para la expresión de moléculas HLA de clase I,
pasa a expresar estas moléculas tras 48 horas manteniendo la
expresión de las mismas hasta 12 días tras ser infectado con el
virus Ad CMV \beta2-microglobulina.
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BIOSANITARIA DE ANDALUCÍA ORIENTAL - ALEJANDRO OTERO
\hskip1cmGARRIDO, FEDERICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> RESTAURACIÓN DE LAS MOLÉCULAS HLA DE
CLASE I MEDIANTE TERAPIA GÉNICA EMPLEANDO VECTORES ADENOVIRALES
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<130> HLA clase I
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<140> 200701222/7
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<141>
2009-02-18
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<150> 200701222/7
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<151>
2007-04-26
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<160> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(364)
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<300>
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<308> NM_004048
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<309>
2009-02-01
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<313> (26)..(364)
\newpage
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 113
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 34
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipaagcttgcca ccatgtctcg ctccgtggcc ttag
\hfill34
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipggatcctgcg gcatcttcaa acctccatg
\hfill29
Claims (5)
1. Construcción génica recombinante para
estimular la respuesta antitumoral citotóxica que consiste en un
sistema de expresión el cual incluye un vector viral portador de una
secuencia polinucleotídica que codifica el gen de la
\beta2-microglobulina, caracterizado porque
el vector viral es un adenoviruso un virus
adeno-asociado y porque la secuencia
polinucleotídica presenta al menos un 85% de homología con la
secuencia SEQ ID NO 1.
2. Construcción génica recombinante para
estimular la respuesta antitumoral citotóxica según la
reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia
polinucleotídica presenta al menos un 90% de homología con la
secuencia SEQ ID NO 1.
3. Construcción génica recombinante para
estimular la respuesta antitumoral citotóxica según la
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la secuencia
polinucleotídica presenta al menos un 95% de homología con la
secuencia SEQ ID NO 1.
4. Construcción génica recombinante para
estimular la respuesta antitumoral citotóxica según la
reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la
secuencia polinucleotídica es la SEQ ID NO 1.
5. Uso de la construcción génica recombinante
según las reivindicaciones 1-4 para la preparación
de una vacuna antitumoral que consiste en una cantidad
terapéuticamente efectiva de dicha construcción génica recombinante
y un soporte farmacéuticamente aceptable.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| ES200701222A ES2321680B1 (es) | 2007-04-26 | 2007-04-26 | Restauracion de las moleculas hla de clase i mediante terapia genica empleando vectores adenovirales portando el gen de la beta 2-microglobulina. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200701222A ES2321680B1 (es) | 2007-04-26 | 2007-04-26 | Restauracion de las moleculas hla de clase i mediante terapia genica empleando vectores adenovirales portando el gen de la beta 2-microglobulina. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2321680A1 ES2321680A1 (es) | 2009-06-09 |
| ES2321680B1 true ES2321680B1 (es) | 2010-03-05 |
Family
ID=40732130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200701222A Withdrawn - After Issue ES2321680B1 (es) | 2007-04-26 | 2007-04-26 | Restauracion de las moleculas hla de clase i mediante terapia genica empleando vectores adenovirales portando el gen de la beta 2-microglobulina. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007506764A (ja) * | 2003-09-26 | 2007-03-22 | ユニバーシティ オブ マイアミ | 腫瘍ワクチン |
| WO2007002527A2 (en) * | 2005-06-24 | 2007-01-04 | Ciphergen Biosystems, Inc. | BIOMARKERS FOR OVARIAN CANCER: β-2 MICROGLOBULIN |
| DK1760089T3 (da) * | 2005-09-05 | 2009-11-16 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Tumor-associeret peptides bindende til human leukocyte antigen (HLA) class I eller II molecules og relateret anti-cancer vaccine |
-
2007
- 2007-04-26 ES ES200701222A patent/ES2321680B1/es not_active Withdrawn - After Issue
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MINE T et al. Immunological evaluation of CTL precursor-oriented vaccines for advanced lung cancer patiens. Cancer Science. 2003, Vol 94(6), páginas 548-556, todo el documento. * |
| SCHEFFER GL et al. Increased expression of beta 2-microglobulin in multidrug-resistant tumor cells. British Journal of Cancer. 2002, Vol 86, páginas 1943-1950, todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2321680A1 (es) | 2009-06-09 |
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