BR112021006941A2

BR112021006941A2 - Antígenos de câncer inovadores e métodos

Info

Publication number: BR112021006941A2
Application number: BR112021006941-0A
Authority: BR
Inventors: George KASSIOTIS; George Young; Jan ATTIG; Bram SNIJDERS; David Perkins; Fabio Marino; Nicola TERNETTE
Original assignee: The Francis Crick Institute Limited; Enara Bio Limited
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2021-08-31
Also published as: WO2020079448A1; CN112867501A; JP2022514116A; KR20210080372A; IL282308A; CA3112427A1; MX2021004453A; WO2020079448A9; AU2019360427A1; EP3866827A1; JP2023017853A; US20210353729A1; EA202191081A1

Abstract

antígenos de câncer inovadores e métodos. a presente invenção refere-se a, inter alia, de polipeptídeos e ácidos nucleicos que codificam os ditos polipeptídeos que são úteis no tratamento, prevenção e diagnóstico de câncer, particularmente melanoma, especialmente melanoma cutâneo e melanoma uveal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTÍ- GENOS DE CÂNCER INOVADORES E MÉTODOS".

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos antigênicos e polinucleotídeos correspondentes para uso no tratamento ou preven- ção de câncer, em particular para uso no tratamento ou prevenção de melanoma (por exemplo, melanoma cutâneo ou melanoma uveal). A presente invenção se refere ainda inter alia a composições farmacêuti- cas e imunogênicas compreendendo os ditos ácidos nucleicos e poli- peptídeos, células imunes carregadas com e/ou estimuladas pelos di- tos polipeptídeos e polinucleotídeos, anticorpos específicos para os ditos polipeptídeos e células (autólogas ou não) geneticamente modifi- cadas com moléculas que reconhecem os ditos polipeptídeos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Como parte da imunovigilância normal para micróbios pato- gênicos, todas as células degradam proteínas intracelulares para pro- duzir peptídeos que são carregados em moléculas do Complexo Prin- cipal de Histocompatibilidade (MHC) de Classe I que são expressas na superfície de todas as células. A maioria desses peptídeos, que são derivados da célula hospedeira, são reconhecidos como próprios e permanecem invisíveis para o sistema imunológico adaptativo. No en- tanto, os peptídeos estranhos (não próprios) são capazes de estimular a expansão de células T CD8+ virgens que codificam um receptor de células T (TCR) que se liga fortemente ao complexo MHC I-peptídeo. Essa população de células T expandida pode produzir células T CD8+ efetoras (incluindo linfócitos T citotóxicos - CTLs) que podem eliminar as células marcadas com antígeno estranho, bem como células T CD8+ de memória que podem ser amplificadas novamente quando as células marcadas com antígeno estranho aparecem posteriormente na vida do animal.

[003] As moléculas de MHC de classe II, cuja expressão é nor- malmente limitada a células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs), como células dendríticas (DCs), são geralmente carregadas com peptídeos que foram internalizados do ambiente exógeno. A liga- ção de um TCR complementar de uma célula T CD4+ virgem ao com- plexo MHC II-peptídeo, na presença de vários fatores, incluindo molé- culas de adesão de células T (CD54, CD48) e moléculas coestimulató- rias (CD40, CD80, CD86), induz a maturação de células T CD4+ em células efetoras (por exemplo, TH1, TH2, TH17, TFH, células Treg). Essas células T CD4+ efetoras podem promover a diferenciação de células B em células plasmáticas secretoras de anticorpos, bem como facilitar a diferenciação de CTLs CD8+ específicos de antígeno, ajudando assim a induzir a resposta imunológica adaptativa a antígenos estranhos, que incluem tanto funções efetoras de curto prazo como memória imu- nológica de longo prazo. As DCs podem realizar o processo de apre- sentação cruzada de antígenos peptídicos entregando antígenos deri- vados exogenamente (como um peptídeo ou proteína liberada de um patógeno ou uma célula tumoral) em suas moléculas MHC I, contribu- indo para a geração de memória imunológica, fornecendo uma via al- ternativa para estimular a expansão de células T CD8+ virgens.

[004] A memória imunológica (especificamente células B/anticorpos específicos do antígeno e CTLs específicos do antígeno) consiste em participantes críticos no controle de infecções microbia- nas, e a memória imunológica foi explorada para desenvolver várias vacinas que previnem as doenças causadas por micróbios patogêni- cos importantes. A memória imunológica é também conhecida por de- sempenhar uma função fundamental no controle da formação de tu- mor, porém muito poucas vacinas eficazes contra o câncer foram de- senvolvidas.

[005] O câncer é a segunda causa principal de morbidade, sendo responsável por quase 1 em 6 de todas as mortes no mundo. Dos 8,8 milhões de mortes causadas por câncer em 2015, os cânceres que provocaram mais mortes foram os carcinomas de pulmão (1,69 mi- lhões), fígado (788.000), colorretal (774.000), estômago (754.000) e mama (571.000). O impacto econômico do câncer em 2010 foi estima- do em US $ 1,16 trilhão, e espera-se que o número de novos casos aumente em cerca de 70% nas próximas duas décadas (World Health Organization Cancer Facts 2017).

[006] As terapias atuais para o melanoma cutâneo são variadas e altamente dependentes da localização do tumor e do estágio da doen- ça. O principal tratamento para um melanoma não metastático é a ci- rurgia para remover o tumor e o tecido circundante. Os melanomas em estágio avançado podem exigir tratamento compreendendo dissecção de linfonodos, radioterapia ou quimioterapia. Estratégias de bloqueio de ponto de verificação imunológico, incluindo o uso de anticorpos de alvejamento de reguladores imunológicos negativos, como PD-1/PD- L1 e CTLA4, revolucionaram recentemente os tratamentos para uma variedade de malignidades, incluindo melanoma (Ribas, A., & Wol- chok, JD (2018) Science, 359:1.350–1.355.). O valor extraordinário das terapias de bloqueio de ponto de verificação e a associação bem reconhecida de seu benefício clínico com as respostas imunológicas adaptativas do paciente (especificamente respostas imunológicas ba- seadas em células T) aos seus próprios antígenos de câncer revigorou a busca por vacinas eficazes contra câncer, modalidades de vacina e antígenos de vacina contra câncer.

[007] Retrovírus endógenos humanos (HERVs) são remanescen- tes de integrações ancestrais da linha germinativa de retrovírus infec- ciosos exógenos. Os HERVs pertencem ao grupo de retroelementos endógenos que são caracterizados pela presença de Repetições Ter- minais Longas (LTRs) flanqueando o genoma viral. Esse grupo inclui também os Retrotransposons LTR aparentes de Mamíferos (MaLRs) e são, portanto, conhecidos coletivamente como elementos LTR (aqui chamados coletivamente de ERV para significar todos os elementos LTR). Os ERVs constituem uma proporção considerável do genoma dos mamíferos (8%) e podem ser agrupados em aproximadamente 100 famílias com base na homologia de sequência. Muitas sequências de ERV codificam pró-vírus defeituosos que compartilham a estrutura genômica retroviral prototípica que consiste nos genes gag, pro, pol e env flanqueados por LTRs. Alguns ORFs de ERV intactos produzem proteínas retrovirais que compartilham características com proteínas codificadas por retrovírus infecciosos exógenos, como o HIV-1. Essas proteínas podem servir como antígenos para induzir uma resposta imunológica potente (Hurst & Magiorkinis, 2015, J. Gen. Virol 96:

1.207-1.218), sugerindo que polipeptídeos codificados por ERVs po- dem escapar dos processos de seleção do receptor de células T e B e da tolerância central e periférica. A reatividade imunológica a produtos de ERV pode ocorrer espontaneamente na infecção ou câncer, e os produtos de ERV têm sido implicados como a causa de algumas do- enças autoimunes (Kassiotis & Stoye, 2016, Nat. Rev. Immunol. 16: 207-219).

[008] Devido ao acúmulo de mutações e eventos de recombina- ção durante a evolução, a maioria das sequências derivadas de ERV perderam quadros de leitura abertos funcionais para alguns ou todos os seus genes e, portanto, sua capacidade de produzir vírus infeccio- sos. No entanto, esses elementos de ERV são mantidos no DNA da linha germinativa como outros genes e ainda têm o potencial de pro- duzir proteínas a partir de pelo menos alguns de seus genes. De fato, proteínas codificadas por HERV foram detectadas em uma variedade de cânceres humanos. Por exemplo, variantes de splicing do gene env de HERV-K, Rec e Np9, são encontradas exclusivamente em células germinativas testiculares malignas e não em células saudáveis (Ruprecht et. Al, 2008, Cell Mol Life Sci 65: 3.366-3.382). Níveis au- mentados de transcritos de HERV também foram observados em cân- ceres como os da próstata, em comparação com o tecido saudável (Wang-Johanning, 2003, Cancer 98: 187-197; Andersson et al., 1998, Int. J. Oncol, 12: 309-313). Além disso, a superexpressão de HERV-E e HERV-H demonstrou ser imunossupressora, o que também poderia contribuir para o desenvolvimento de câncer (Mangeney et al., 2001, J. Gen. Virol. 82: 2.515-2.518). No entanto, o mecanismo (ou mecanis- mos) exato pelo qual os HERVs poderiam contribuir para o desenvol- vimento ou patogenicidade do câncer permanece desconhecido.

[009] Além de desregular a expressão de genes hospedeiros vi- zinhos circundantes, a atividade e a transposição de elementos regu- ladores de ERV para novos sítios genômicos podem levar à produção de novos transcritos, alguns dos quais podem ter propriedades onco- gênicas (Babaian & Mager, Mob. DNA, 2016, Lock et al., PNAS, 2014, 111: 3.534-3.543).

[0010] Uma ampla gama de modalidades de vacinas é conhecida. Uma abordagem bem descrita envolve a entrega direta de um polipep- tídeo antigênico a um indivíduo com o objetivo de aumentar uma res- posta imunológica (incluindo respostas de células B e T) e estimular a memória imunológica. Alternativamente, um polinucleotídeo pode ser administrado ao indivíduo por meio de um vetor de modo que o poli- peptídeo imunogênico codificado por polinuceotídeo seja expresso in vivo. O uso de vetores virais, por exemplo vetores de adenovírus, tem sido bem explorado para a entrega de antígenos em estratégias de vacinação profilática e tratamento terapêutico contra o câncer (Wold et al. Current Gene Therapy, 2013, Adenovirus Vectors for Gene The- rapy, Vaccination and Cancer Gene Therapy, 13: 421–433). Peptídeos imunogênicos, polipeptídeos ou polinucleotídeos que codificam os mesmos, podem também ser usados para carregar células apresenta- doras de antígeno derivadas do paciente (APCs), que podem então ser infundidos no indivíduo como uma vacina que provoca uma res- posta imunológica terapêutica ou profilática. Um exemplo dessa abor- dagem é o Provenge, que é atualmente a única vacina anticâncer aprovada pela FDA.

[0011] Os antígenos de câncer podem também ser explorados no tratamento e prevenção de câncer, usando-os para criar uma varieda- de de modalidades terapêuticas não vacinais. Essas terapias se en- quadram em duas classes diferentes: 1) produtos biológicos de ligação ao antígeno, 2) terapias de células adotivas.

[0012] Os produtos biológicos de ligação ao antígeno tipicamente consistem em polipeptídeos multivalentes geneticamente modificados que reconhecem as células cancerosas decoradas com antígeno e fa- cilitam sua destruição. Os componentes de ligação ao antígeno desses produtos biológicos podem consistir em produtos biológicos à base de TCR, incluindo, porém sem limitação, TCRs, TCRs de alta afinidade e miméticos de TCR produzidos por várias tecnologias (incluindo aque- les baseados em tecnologias de anticorpos monoclonais). As porções químicas citolíticas desses tipos de produtos biológicos multivalentes podem consistir em produtos químicos citotóxicos, toxinas biológicas, motivos de alvejamento e/ou motivos de estimulação imunológica que facilitam o alvejamento e ativação de células imunes, qualquer um dos quais facilita a destruição terapêutica de células tumorais.

[0013] As terapias de células adotivas podem ser baseadas nas células T do próprio paciente que são removidas e estimuladas ex vivo com preparações de antígenos de vacina (cultivadas com células T na presença ou ausência de outros fatores, incluindo componentes celula- res e acelulares) (JCI Insight. 4 de outubro de 2018; 3(19). pii: 122467. doi: 10.1172/jci.insight.122467). Alternativamente, as terapias celula-

res adotivas podem ser baseadas em células (incluindo células deriva- das de pacientes ou não derivadas de paciente) que foram delibera- damente geneticamente modificadas para expressar polipeptídeos de ligação ao antígeno que reconhecem antígenos de câncer. Esses poli- peptídeos de ligação ao antígeno se enquadram nas mesmas classes descritas acima para os produtos biológicos de ligação ao antígeno. Dessa forma, os linfócitos (autólogos ou não autólogos), que foram geneticamente manipulados para expressar polipeptídeos de ligação ao antígeno de câncer, podem ser administrados a um paciente como terapias celulares adotivas para tratar seu câncer.

[0014] O uso de antígenos derivados de ERV para aumentar uma resposta imunológica eficaz ao câncer mostrou resultados promissores na promoção da regressão do tumor e um prognóstico mais favorável em modelos murinos de câncer (Kershaw et al., 2001, Cancer Res. 61:7.920-7.924; Slansky et al., 2000, Immunity 13:529-538). Dessa forma, os ensaios de imunoterapia centrada no antígeno de HERV fo- ram contemplados em seres humanos (Sacha et al., 2012, J. Immunol 189:1467-1479), embora o progresso tenha sido restrito, em parte, de- vido a uma limitação severa de antígenos de ERV específicos de tu- mor identificados.

[0015] O documento nº WO 2005/099750 identifica sequências ancoradas em vacinas existentes contra patógenos infecciosos, que são comuns no aumento de respostas imunológicas de reatividade cruzada contra o antígeno tumoral HERV-K Mel e conferem proteção ao melanoma.

[0016] O documento nº WO 00/06598 se refere à identificação de genes associados a tumores HERV-AVL3-B que são preferencialmen- te expressos em melanomas, e métodos e produtos para diagnosticar e tratar condições caracterizadas pela expressão dos ditos genes.

[0017] O documento nº WO 2006/119527 fornece polipeptídeos antigênicos derivados do retrovírus endógeno associado ao melanoma (MERV), e seu uso para a detecção e diagnóstico de melanoma, bem como o prognóstico da doença. O uso de polipeptídeos antigênicos como vacinas anticâncer também é divulgado.

[0018] O documento nº WO 2007/137279 divulga métodos e com- posições para detectar, prevenir e tratar cânceres de HERV-K+, por exemplo, com o uso de um anticorpo de ligação a HERV-K+ para pre- venir ou inibir a proliferação de células cancerosas.

[0019] O documento nº WO 2006/103562 divulga um método para o tratamento ou prevenção de cânceres em que a proteína Np9 imu- nossupressora do gene env de HERV-K é expressa. A invenção tam- bém se refere a composições farmacêuticas compreendendo ácido nucleico ou anticorpos com capacidade para inibir a atividade da dita proteína, ou imunógeno ou composição vacinal com capacidade para induzir uma resposta imunológica dirigida contra a dita proteína.

[0020] O documento nº WO 2007/109583 fornece composições e métodos para prevenir ou tratar doenças neoplásicas em um indivíduo mamífero, fornecendo uma composição que compreende uma popula- ção de células imunes enriquecida reativa a um antígeno HERV-E em uma célula tumoral.

[0021] Humer J, et al., 2006, Canc. Res., 66: 1.658-1.663 identifica um marcador de melanoma derivado de retrovírus endógenos associ- ados a melanoma.

[0022] Há uma necessidade de identificar sequências antigênicas associadas a HERV adicionais que possam ser usadas na imunotera- pia de câncer, particularmente melanoma, especialmente melanoma cutâneo e uveal.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0023] Os inventores constataram surpreendentemente certos transcritos de RNA que compreendem elementos LTR ou são deriva-

dos de sequências genômicas adjacentes a elementos LTR que são encontrados em níveis elevados em células de melanoma cutâneo, mas são indetectáveis ou encontrados em níveis muito baixos em teci- dos normais e saudáveis (consultar o Exemplo 1). Esses transcritos são chamados no presente documento de transcritos abrangendo o elemento LTR específico de câncer (CLTs). Além disso, os inventores mostraram que um subconjunto das sequências polipeptídicas poten- ciais (ou seja, quadros de leitura abertos (ORFs)) codificadas por es- ses CLTs é traduzido em células cancerosas, processado por compo- nentes do aparelho de processamento de antígeno e apresentado na superfície de células encontradas no tecido tumoral em associação ao complexo principal de histocompatibilidade classe I e classe II (MHC Classe I e MHC Classe II) e moléculas de antígeno leucocitário huma- no classe I e II (HLA Classe I, HLA Classe II) (consultar o Exemplo 2 ) Essas constatações demonstram que esses polipeptídeos (chamados no presente documento de antígenos CLT) são, ipso facto, antigêni- cos.

Dessa forma, espera-se que a apresentação de células cancero- sas de antígenos CLT torne essas células suscetíveis à eliminação por células T que carregam receptores de células T cognatos (TCRs) para os antígenos CLT, e espera-se que os métodos/regimes de vacinação baseados em antígenos CLT que amplificam as células T portadoras desses TCRs cognatos provoquem respostas imunológicas contra cé- lulas cancerosas (e tumores contendo as mesmas), particularmente melanoma, particularmente tumores de melanoma cutâneo.

As células T de indivíduos com melanoma são, de fato, reativas a peptídeos deri- vados de antígenos CLT divulgados no presente documento e amplifi- cam as células T e amplificam sequências do receptor de células T (consultar o Exemplo 3). Os inventores confirmaram que as células T específicas para antígenos CLT não foram deletadas do repertório de células T do indivíduo normal por tolerância central (consultar o Exem-

plo 4). A presença e atividade de extermínio de células T específicas de antígeno de CLT em culturas ex vivo de células T de dadores sau- dáveis foi determinada (consultar o Exemplo 5). Por fim, estudos de qRT-PCR confirmaram que CLTs são expressos especificamente em RNA extraído de linhagens celulares de melanoma em comparação com linhagens celulares de não melanoma (consultar o Exemplo 7).

[0024] Os inventores também constataram surpreendentemente que certos CLTs que codificam antígeno de CLT, além de serem supe- rexpressos no melanoma cutâneo, também são superexpressos no melanoma uveal. Espera-se que as sequências polipeptídicas de antí- geno de CLT codificadas por esses CLTs provoquem respostas imuno- lógicas contra células de melanoma uveal e tumores contendo as mesmas.

[0025] Os CLTs e os antígenos CLT que são o assunto da presen- te invenção não são sequências canonicais que podem ser facilmente derivadas de sequências de genoma de tumor conhecidas encontra- das no atlas do genoma do câncer. Os CLTs são transcritos resultan- tes de eventos complexos de transcrição e splicing conduzidos por se- quências de controle de transcrição de origem ERV. Uma vez que os CLTs são expressos em alto nível e uma vez que as sequências poli- peptídicas do antígeno de CLT não são sequências de proteínas hu- manas normais, espera-se que os mesmos sejam capazes de provo- car respostas imunológicas fortes e específicas (como, de fato, foi es- tabelecido - consultar os Exemplos 3 a 5) e são, portanto, adequados para uso terapêutico em um ambiente de imunoterapia contra câncer.

[0026] Os antígenos CLT encontrados nos transcritos altamente expressos que caracterizam as células tumorais, que antes da presen- te invenção não eram conhecidos por existir e produzir produtos pro- teicos no homem e por estimular respostas imunológicas, podem ser usados em vários formatos. Em primeiro lugar, os polipeptídeos de an-

tígeno de CLT da invenção podem ser entregues diretamente a um indivíduo como uma vacina que induz uma resposta imunológica tera- pêutica ou profilática a células tumorais. Em segundo lugar, os ácidos nucleicos da invenção, que podem ser otimizados por códons para aumentar a expressão de seus antígenos CLT codificados, podem ser administrados diretamente ou, então, inseridos em vetores para entre- ga in vivo para produzir os produtos de proteína codificada em um in- divíduo como uma vacina que provoca uma resposta imunológica te- rapêutica ou profilática a células tumorais. Em terceiro lugar, os poli- nucleotídeos e/ou polipeptídeos da invenção podem ser usados para carregar células apresentadoras de antígeno derivadas de paciente (APCs), que podem, então, ser infundidas no indivíduo como uma va- cina que induz uma resposta imunológica terapêutica ou profilática a células tumorais. Em quarto lugar, os polinucleotídeos e/ou polipeptí- deos da invenção podem ser usados para estimulação ex vivo das cé- lulas T de um indivíduo, produzindo uma preparação de células T es- timuladas que pode ser administrada a um indivíduo como uma terapia para tratar câncer. Em quinto lugar, moléculas biológicas, como recep- tores de células T (TCRs) ou miméticos de TCR que reconhecem antí- genos CLT complexados a moléculas MHC I e foram modificados para permitir o extermínio (ou facilitar o extermínio) de células cancerosas, podem ser administradas a um indivíduo como uma terapia para tratar câncer. Em sexto lugar, versões quiméricas de moléculas biológicas que reconhecem antígenos CLT complexados a células MHC podem ser introduzidas em células T (autólogas ou não autólogas) e as célu- las resultantes podem ser administradas a um indivíduo como uma te- rapia para tratar câncer. Essas e outras aplicações são descritas em mais detalhes abaixo.

[0027] Dessa forma, a invenção fornece, inter alia, um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência selecionada de:

(a) a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1 a 10 e (b) uma variante das sequências de (a); e (c) um fragmento imunogênico das sequências de (a) (mais adiante neste documento chamado de "um polipeptídeo da in- venção").

[0028] A invenção fornece também uma molécula de ácido nuclei- co que codifica um polipeptídeo da invenção (mais adiante neste do- cumento chamado de "um ácido nucleico da invenção").

[0029] Espera-se que os polipeptídeos da invenção e os ácidos nucleicos da invenção, bem como aspectos relacionados da invenção, sejam úteis em uma gama de modalidades na imunoterapia e profila- xia do câncer, particularmente imunoterapia e profilaxia do melanoma, conforme discutido em mais detalhes abaixo.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0030] Para cada uma das Figuras 1 a 15, o painel superior mostra um espectro de MS/MS extraído (com íons de fragmento atribuídos) de um peptídeo isolado de uma amostra de tumor de um paciente e o painel inferior mostra uma representação do espectro indicando as po- sições das sequências peptídicas lineares que foram mapeadas para os íons do fragmento.

[0031] Figura 1. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 11 iso- lado de uma amostra de tumor de Mel-3 de paciente.

[0032] Figura 2. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 12 iso- lado de uma amostra de tumor de Mel-3 de paciente.

[0033] Figura 3. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 13 iso- lado de uma amostra de tumor de Mel-5 de paciente.

[0034] Figura 4. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 13 iso- lado de uma amostra de tumor de Mel-16 de paciente.

[0035] Figura 5. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 15 iso- lado de uma amostra de tumor de Mel-26 de paciente.

[0036] Figura 6. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 16 iso- lado de uma amostra de tumor de Mel-20 de paciente.

[0037] Figura 7. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 17 iso- lado de uma amostra de tumor de Mel-35 de paciente.

[0038] Figura 8. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 19 iso- lado de uma amostra de tumor de Mel-3 de paciente.

[0039] Figura 9. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 21 iso- lado de uma amostra de tumor de Mel-27 de paciente.

[0040] Figura 10. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 20 isolado de uma amostra de tumor de Mel-27 de paciente.

[0041] Figura 11. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 22 isolado de uma amostra de tumor de Mel-27 de paciente.

[0042] Figura 12. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 23 isolado de uma amostra de tumor de Mel-27 de paciente.

[0043] Figura 13. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 24 isolado de uma amostra de tumor de Mel-27 de paciente.

[0044] Figura 14. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 25 isolado de uma amostra de tumor de Mel-16 de paciente.

[0045] Figura 15. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 26 isolado de uma amostra de tumor de Mel-41 de paciente.

[0046] A Figura 16 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 15 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 27

[0047] A Figura 17 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 10 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 29

[0048] A Figura 18 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 5 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 14

[0049] A Figura 19 mostra um espectro de espectrometria de mas-

sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 4 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 21

[0050] A Figura 20 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 18 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 31

[0051] A Figura 21 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 16 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 13

[0052] A Figura 22 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 3 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 19

[0053] A Figura 23 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 6 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 28

[0054] A Figura 24 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 18 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 18

[0055] A Figura 25 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 4 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 30

[0056] A Figura 26 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 4 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 20

[0057] A Figura 27 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de Mel- 20 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 16

[0058] A Figura 28 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica do pa- ciente Mel-3 atribuída a SEQ ID NO. 12

[0059] Para cada uma das Figuras 29 a 42, o painel superior mos-

tra um espectro de MS/MS extraído (com íons de fragmento atribuí- dos) de um peptídeo isolado de uma amostra de tumor de um paciente e o painel inferior mostra uma representação do espectro indicando as posições do sequências peptídicas lineares que foram mapeadas para os íons do fragmento.

[0060] Figura 29. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 51 isolado de uma amostra de tumor de Mel-40 de paciente.

[0061] Figura 30. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 51 isolado de uma amostra de tumor de Mel-41 de paciente.

[0062] Figura 31. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 52 isolado de uma amostra de tumor de Mel-27 de paciente.

[0063] Figura 32. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 52 isolado de uma amostra de tumor de Mel-39 de paciente.

[0064] Figura 33. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 13 isolado de uma amostra de tumor de 2MT3 de paciente.

[0065] Figura 34. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 13 isolado de uma amostra de tumor de 2MT10 de paciente.

[0066] Figura 35. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 12 isolado de uma amostra de tumor de 2MT3 de paciente.

[0067] Figura 36. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 16 isolado de uma amostra de tumor de 2MT4 de paciente.

[0068] Figura 37. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 17 isolado de uma amostra de tumor de 2MT3 de paciente.

[0069] Figura 38. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 53 isolado de uma amostra de tumor de 1Mt1de paciente.

[0070] Figura 39. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 51 isolado de uma amostra de tumor de 2MT3 de paciente.

[0071] Figura 40. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 19 isolado de uma amostra de tumor de 2MT3 de paciente.

[0072] Figura 41. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 19 isolado de uma amostra de tumor de 2MT1 de paciente.

[0073] Figura 42. Espectros para o peptídeo de SEQ ID NO. 54 isolado de uma amostra de tumor de 2MT12 de paciente.

[0074] Cada uma das Figuras 43 a 50 mostra um alinhamento de um espectro de MS/MS nativo de um peptídeo isolado de uma amostra de tumor de um paciente (superior) com o espectro nativo de um pep- tídeo sintético correspondente à mesma sequência (inferior).

[0075] A Figura 43 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de 2MT3 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 13

[0076] A Figura 44 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de 2MT3 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 12

[0077] A Figura 45 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de 2MT4 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 16

[0078] A Figura 46 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de 2MT3 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 17

[0079] A Figura 47 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de 1MT1 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 53

[0080] A Figura 48 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de 2MT3 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 51

[0081] A Figura 49 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de 2MT3 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 19

[0082] A Figura 50 mostra um espectro de espectrometria de mas- sa de um fragmento de peptídeo da análise imunopeptidômica de

2MT12 de paciente atribuída à SEQ ID NO. 54

[0083] A Figura 51, painéis A a C, mostra a amplificação de célu- las T específicas do antígeno tumoral de culturas de CMSP de pacien- tes em resposta ao cultivo com peptídeos derivados de antígeno tumo- ral específicos.

[0084] A Figura 52, painéis A a D, fornece um sumário de peptí- deos derivados do antígeno de CLT (SEQ ID NO.55 à SEQ ID NO. 72) que tiveram capacidade para amplificar células T portadoras de TCR específicas de CMSPs de pacientes com melanoma.

[0085] A Figura 53 mostra as respostas das células T CD8 de um doador de sangue normal a um peptídeo restrito a HLA-A*0201 (SEQ ID NO. 73) do Antígeno 1 CLT.

[0086] A Figura 54 mostra as respostas das células T CD8 de um doador de sangue normal ao peptídeo restrito a HLA-A*0201 (SEQ ID NO. 75) do Antígeno 2 de CLT.

[0087] A Figura 55 mostra as respostas das células T CD8 de um doador de sangue normal ao peptídeo restrito a HLA-A*0201 (SEQ ID NO. 76) do Antígeno 4 de CLT.

[0088] A Figura 56, painéis A a D, mostra a responsividade a pep- tídeos restritos a HLA-B*0702 (SEQ ID NO. 74 e 77) de Antígeno 1 de CLT e Antígeno 4 de CLT, respectivamente, em células T CD8 CD45RO-positivas de memória em comparação com células T CD8 CD45RO-negativas virgens do mesmo doador.

[0089] A Figura 57 mostra a coloração com pentâmero HLA de cé- lulas T CD8 normais específicas para um peptídeo (SEQ ID NO. 73) derivado de Antígeno 1 de CLT, um peptídeo (SEQ ID NO. 78) deriva- do de Antígeno 2 de CLT e um peptídeo (SEQ ID NO. 77) derivado de Antígeno 4 de CLT.

[0090] A Figura 58 mostra células T CD8 expandidas, classificadas por pentâmero que exterminam células alvo C1RB7 pulsadas com um peptídeo (SEQ ID NO. 77) derivado de Antígeno 4 de CLT.

[0091] A Figura 59, painéis A a C, mostra os resultados do ensaio qRT-PCR para verificar a transcrição do CLT que codifica o Antígeno 1 de CLT (SEQ ID NO. 33), o CLT que codifica o Antígeno 2 de CLT (SEQ ID NO. 34) e o CLT que codifica o Antígeno 3 e 4 de CLT (SEQ ID NO. 35) em linhagens celulares de câncer de melanoma.

DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0092] SEQ ID NO. 1 é a sequência polipeptídica de Antígeno 1 de

CLT

[0093] SEQ ID NO. 2 é a sequência polipeptídica de Antígeno 2 de

CLT

[0094] SEQ ID NO. 3 é a sequência polipeptídica de Antígeno 3 de

CLT

[0095] SEQ ID NO. 4 é a sequência polipeptídica de Antígeno 4 de

CLT

[0096] SEQ ID NO. 5 é a sequência polipeptídica de Antígeno 5 de

CLT

[0097] SEQ ID NO. 6 é a sequência polipeptídica de Antígeno 6 de

CLT

[0098] SEQ ID NO. 7 é a sequência polipeptídica de Antígeno 7 de

CLT

[0099] SEQ ID NO. 8 é a sequência polipeptídica de Antígeno 8 de

CLT

[00100] SEQ ID NO. 9 é a sequência polipeptídica de Antígeno 9 de

CLT

[00101] SEQ ID NO. 10 é a sequência polipeptídica de Antígeno 10 de CLT

[00102] SEQ ID NOs. 11 a 14 são sequências peptídicas derivadas de Antígeno 1 de CLT

[00103] SEQ ID NOs. 15 a 16 são sequências peptídicas derivadas de Antígeno 2 de CLT

[00104] SEQ ID NOs. 17 e 18 são sequências peptídicas derivadas de Antígeno 3 de CLT

[00105] SEQ ID NO. 19 é uma sequência de peptídeo derivada de Antígeno 4 de CLT

[00106] SEQ ID NOs. 20 a 22 são sequências de peptídeos deriva- das de Antígeno 5 de CLT

[00107] SEQ ID NOs. 23 e 24 são sequências peptídicas derivadas de Antígeno 6 de CLT

[00108] SEQ ID NO. 25 é uma sequência de peptídeo derivada de Antígeno 7 de CLT

[00109] SEQ ID NO. 26 é uma sequência de peptídeo derivada do Antígeno 8 de CLT

[00110] SEQ ID NOs. 27 a 29 são sequências de peptídeos deriva- das de Antígeno 9 de CLT

[00111] SEQ ID NOs. 30 a 32 são sequências peptídicas derivadas de Antígeno de CLT 10

[00112] SEQ ID NO. 33 é a sequência de cDNA do CLT que codifi- ca o Antígeno 1 de CLT

[00113] SEQ ID NO. 34 é a sequência de cDNA do CLT que codifi- ca o Antígeno 2 de CLT

[00114] SEQ ID NO. 35 é a sequência de cDNA do CLT que codifi- ca os Antígenos 3 e 4 do CLT

[00115] SEQ ID NO. 36 é a sequência de cDNA do CLT que codifi- ca o Antígeno 5 de CLT

[00116] SEQ ID NO. 37 é a sequência de cDNA do CLT que codifi- ca o Antígeno 6 de CLT

[00117] SEQ ID NO. 38 é a sequência de cDNA do CLT que codifi- ca os Antígenos 7 e 8 de CLT

[00118] SEQ ID NO. 39 é a sequência de cDNA do CLT que codifi-

ca o Antígeno 9 de CLT

[00119] SEQ ID NO. 40 é a sequência de cDNA do CLT que codifi- ca o Antígeno 10 de CLT

[00120] SEQ ID NO. 41 é uma sequência de cDNA que codifica o Antígeno 1 de CLT

[00121] SEQ ID NO. 42 é uma sequência de cDNA que codifica o Antígeno 2 de CLT

[00122] SEQ ID NO. 43 é uma sequência de cDNA que codifica o Antígeno 3 de CLT

[00123] SEQ ID NO. 44 é uma sequência de cDNA que codifica o Antígeno 4 de CLT

[00124] SEQ ID NO. 45 é uma sequência de cDNA que codifica o Antígeno 5 de CLT

[00125] SEQ ID NO. 46 é uma sequência de cDNA que codifica o Antígeno 6 de CLT

[00126] SEQ ID NO. 47 é uma sequência de cDNA que codifica o Antígeno 7 de CLT

[00127] SEQ ID NO. 48 é uma sequência de cDNA que codifica o Antígeno 8 de CLT

[00128] SEQ ID NO. 49 é uma sequência de cDNA que codifica o Antígeno 9 de CLT

[00129] SEQ ID NO. 50 é uma sequência de cDNA que codifica o Antígeno 10 de CLT

[00130] SEQ ID NOs. 51 a 52 são sequências peptídicas derivadas do Antígeno 4 de CLT

[00131] SEQ ID NO. 53 é uma sequência peptídica derivada de An- tígeno 3 de CLT

[00132] SEQ ID NO. 54 é uma sequência peptídica derivada de An- tígeno 4 de CLT

[00133] SEQ ID NOs. 55 a 57 são sequências peptídicas derivadas de Antígeno 1 de CLT

[00134] SEQ ID NOs. 58 a 66 são sequências peptídicas derivadas de Antígeno 2 de CLT

[00135] SEQ ID NOs. 67 a 69 são sequências peptídicas derivadas de Antígeno 3 de CLT

[00136] SEQ ID NOs. 70 a 72 são sequências peptídicas derivadas de Antígeno 4 de CLT

[00137] SEQ ID NOs. 73 a 74 são sequências peptídicas derivadas de Antígeno 1 de CLT

[00138] SEQ ID NO. 75 é uma sequência peptídica derivada de An- tígeno 2 de CLT

[00139] SEQ ID NOs. 76 a 77 são sequências peptídicas derivadas de Antígeno 4 de CLT

[00140] SEQ ID NO. 78 é uma sequência peptídica derivada de An- tígeno 2 de CLT Descrição Detalhada da Invenção

POLIPEPTÍDEOS

[00141] Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo" são usa- dos no presente documento de forma intercambiável e se referem a qualquer cadeia de aminoácidos ligada a péptido, independentemente do comprimento, modificação cotraducional ou pós-traducional.

[00142] O termo "aminoácido" se refere a qualquer um dentre os aminoácidos de ocorrência natural, bem como análogos de aminoáci- dos e miméticos de aminoácidos que funcionam de forma similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Aminoácidos de ocorrência natural são os 20 L-aminoácidos codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos, que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e O-fosfoserina. O termo "análogo de aminoácido" se refere a um composto que tem a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural, ou seja, um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, porém tem um grupo R modificado ou uma cadeia principal peptídica modificada em comparação com um amino- ácido natural. Os exemplos incluem homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio e norleucina. Miméticos de ami- noácido se referem a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, porém que funcionam de forma similar a um aminoácido de ocorrência natural. Adequadamente, um aminoácido é um aminoácido de ocorrência natu- ral ou um análogo de aminoácido, especialmente um aminoácido de ocorrência natural e em particular um daqueles 20 L-aminoácidos codi- ficados pelo código genético.

[00143] Os aminoácidos podem ser referidos no presente documen- to por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, de modo semelhante, podem ser referidos por seus códigos de uma letra comumente aceitos.

[00144] Dessa forma, a invenção fornece um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência selecionada de: (a) a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1 a 10; e (b) uma variante das sequências de (a); e (c) um fragmento imunogênico das sequências de (a)

[00145] A invenção fornece um polipeptídeo isolado que compreen- de uma sequência selecionada de: (a) a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1 a 10 menos o resíduo de metionina inicial; e (b) uma variante das sequências de (a); e (c) um fragmento imunogênico das sequências de (a)

[00146] Em geral, as variantes de sequências polipeptídicas da in-

venção incluem sequências com um alto grau de identidade de se- quência com as mesmas. Por exemplo, variantes têm adequadamente pelo menos cerca de 80% de identidade, com mais preferência, pelo menos cerca de 85% de identidade e, com a máxima preferência, pelo menos cerca de 90% de identidade (como pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%) com a se- quência de referência associada em todo o seu comprimento.

[00147] Adequadamente, a variante é uma variante imunogênica. Uma variante é considerada uma variante imunogênica em que provo- ca uma resposta que é de pelo menos 20%, adequadamente pelo me- nos 50% e especialmente pelo menos 75% (como pelo menos 90%) da atividade da sequência de referência (ou seja, sequência da qual a variante é uma variante), por exemplo, em um ensaio de reestimulação in vitro de CMSP ou sangue total com o polipeptídeo como antígeno (por exemplo, reestimulação por um período de várias horas a até 1 ano, como até 6 meses, 1 dia a 1 mês ou 1 a 2 semanas), que mede a ativação das células por meio de linfoproliferação (por exemplo, proli- feração de células T), produção de citocinas (por exemplo, IFN-gama) no sobrenadante da cultura (medida por ELISA etc.) ou caracterização de respostas de células T por coloração intra e extracelular (por exem- plo, usando anticorpos específicos para marcadores imunes, como CD3, CD4, CD8, IL2, TNF-alfa, IFNg, IFN Tipo 1, CD40L, CD69 etc. ) seguido de análise com um citômetro de fluxo.

[00148] A variante pode, por exemplo, ser uma variante conservati- vamente modificada. Uma "variante conservativamente modificada" é aquela em que a alteração (ou alterações) resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido funcionalmente similar ou a substi- tuição/deleção/adição de resíduos que não impactam substancialmen- te a função biológica da variante. Tipicamente, tal função biológica das variantes será induzir uma resposta imunológica contra um melanoma,

por exemplo, um antígeno de câncer de melanoma cutâneo.

[00149] Tabelas de substituição conservativa que fornecem amino- ácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. As variantes podem incluir homólogos de polipeptídeos encontrados em outras espécies.

[00150] Uma variante de um polipeptídeo da invenção pode conter várias substituições, por exemplo, substituições conservativas (por exemplo, 1 a 25, como 1 a 10, em particular 1 a 5, e especialmente 1 resíduo (ou resíduos) de aminoácido pode ser alterado) em compara- ção com a sequência de referência. O número de substituições, por exemplo, substituições conservativas, pode ser de até 20%, por exem- plo, até 10%, por exemplo, até 5%, por exemplo, até 1% do número de resíduos da sequência de referência. Em geral, as substituições con- servativas se enquadram em um dos agrupamentos de aminoácidos especificados abaixo, embora em algumas circunstâncias, outras substituições sejam possíveis sem afetar substancialmente as proprie- dades imunogênicas do antígeno. Os oito grupos seguintes contêm, cada um, aminoácidos que são substituições tipicamente conservati- vas entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (consultar, por exemplo, Creighton, Proteins 1984).

[00151] Adequadamente, tais substituições não alteram a estrutura imunológica de um epítopo (por exemplo, as mesmas não ocorrem dentro da região do epítopo mapeada na sequência primária) e, por- tanto, não têm um impacto significativo nas propriedades imunogêni- cas do antígeno.

[00152] As variantes polipeptídicas incluem também aquelas em que aminoácidos adicionais são inseridos em comparação com a se- quência de referência, por exemplo, tais inserções podem ocorrer em 1 a 10 locais (como 1 a 5 locais, adequadamente 1 ou 2 locais, em particular 1 local) e podem, por exemplo, envolver a adição de 50 ou menos aminoácidos em cada local (como 20 ou menos, em particular 10 ou menos, especialmente 5 ou menos). Adequadamente, tais inser- ções não ocorrem na região de um epítopo e, portanto, não têm um impacto significativo nas propriedades imunogênicas do antígeno. Um exemplo de inserções inclui um pequeno trecho de resíduos de histidi- na (por exemplo, 2 a 6 resíduos) para auxiliar a expressão e/ou purifi- cação do antígeno em questão.

[00153] As variantes polipeptídicas incluem aquelas em que os aminoácidos foram deletados em comparação com a sequência de referência, por exemplo, tais deleções podem ocorrer em 1 a 10 locais (como 1 a 5 locais, adequadamente 1 ou 2 locais, em particular 1 lo- cal) e podem, por exemplo, envolver a deleção de 50 ou menos ami- noácidos em cada local (como 20 ou menos, em particular 10 ou me- nos, especialmente 5 ou menos). Adequadamente, tais deleções não ocorrem na região de um epítopo e, portanto, não têm um impacto sig- nificativo nas propriedades imunogênicas do antígeno.

[00154] O versado na técnica reconhecerá que uma variante de proteína específica pode compreender substituições, deleções e adi- ções (ou qualquer combinação das mesmas). Por exemplo, substitui- ções/deleções/adições podem aumentar (ou ter efeitos neutros) na li- gação às moléculas de HLA desejadas do paciente, aumentando po- tencialmente a imunogenicidade (ou deixando a imunogenicidade inal-

terada).

[00155] Os fragmentos imunogênicos de acordo com a presente invenção compreenderão tipicamente pelo menos 9 aminoácidos con- tíguos da sequência polipeptídica de comprimento total (por exemplo, pelo menos 9 ou 10), como pelo menos 12 aminoácidos contíguos (por exemplo, pelo menos 15 ou pelo menos 20 aminoácidos contíguos), em particular pelo menos 50 aminoácidos contíguos, como pelo menos 100 aminoácidos contíguos (por exemplo, pelo menos 200 aminoáci- dos contíguos) dependendo do comprimento do antígeno de CLT. Adequadamente, os fragmentos imunogênicos serão de pelo menos 10%, como pelo menos 20%, como pelo menos 50%, como pelo me- nos 70% ou pelo menos 80% do comprimento da sequência polipeptí- dica de comprimento total.

[00156] Fragmentos imunogênicos compreendem, tipicamente, pelo menos um epítopo. Os epítopos incluem células B e epítopos de célu- las T e fragmentos adequadamente imunogênicos compreendem pelo menos um epítopo de células T, como um epítopo de células T CD4+ ou CD8+.

[00157] Os epítopos de células T são trechos contíguos curtos de aminoácidos que são reconhecidos pelas células T (por exemplo, célu- las T CD4+ ou CD8+) quando ligados a moléculas de HLA. A identifi- cação de epítopos de células T pode ser alcançada através de expe- rimentos de mapeamento de epítopos que são bem conhecidos pelos versados na técnica (consultar, por exemplo, Paul, Fundamental Immunology, 3ª ed., 243-247 (1993); Beiβbarth et al., 2005, Bioinfor- matics, 21(Suppl. 1):i29-i37).

[00158] Como resultado do envolvimento crucial da resposta das células T em câncer, é prontamente evidente que fragmentos dos poli- peptídeos de comprimento total das SEQ ID NOs. 1 a 10 que contêm pelo menos um epítopo de célula T podem ser imunogênicos e podem contribuir para a imunoproteção.

[00159] Será entendido que em uma população não consanguínea diversa, como seres humanos, diferentes tipos de HLA significam que epítopos específicos podem não ser reconhecidos por todos os mem- bros da população. Consequentemente, para maximizar o nível de re- conhecimento e escala de resposta imunológica a um polipeptídeo, é geralmente desejável que um fragmento imunogênico contenha uma pluralidade de epítopos da sequência de comprimento total (adequa- damente todos os epítopos dentro de um antígeno de CLT).

[00160] Fragmentos específicos dos polipeptídeos das SEQ ID NOs. 1 a 10 que podem ser úteis incluem aqueles contendo pelo me- nos um epítopo de células T CD8+, adequadamente pelo menos dois epítopos de células T CD8+ e especialmente todos os epítopos de cé- lulas T CD8+, particularmente aqueles associados a uma pluralidade de alelos de HLA, por exemplo, aqueles associados a 2, 3, 4, 5 ou mais alelos). Fragmentos específicos dos polipeptídeos das SEQ ID NOs. 1 a 10 que podem ser úteis incluem aqueles contendo pelo me- nos um epítopo de células T CD4+, adequadamente pelo menos dois epítopos de células T CD4+ e especialmente todos os epítopos de cé- lulas T CD4+ (particularmente aqueles associados a uma pluralidade de alelos de HLA, por exemplo, aqueles associados a 2, 3, 4, 5 ou mais alelos). No entanto, um versado na técnica de concepção de va- cinas poderia combinar epítopos de células T CD4+ exógenos com epítopos de células T CD8+ dessa invenção e obter as respostas de- sejadas aos epítopos de células T CD8+ da invenção.

[00161] Quando um fragmento individual do polipeptídeo de com- primento total é usado, tal fragmento é considerado imunogênico em que o mesmo provoca uma resposta que é pelo menos 20%, adequa- damente pelo menos 50% e especialmente pelo menos 75% (como pelo menos 90 %) da atividade da sequência de referência (ou seja, a sequência da qual o fragmento é um fragmento), por exemplo, ativida- de em um ensaio de reestimulação in vitro de CMSP ou sangue total com o polipeptídeo como antígeno (por exemplo, reestimulação por um período entre várias horas a até 1 ano, como até 6 meses, 1 dia a 1 mês ou 1 a 2 semanas) que mede a ativação das células por meio de linfoproliferação (por exemplo, proliferação de células T), produção de citocinas (por exemplo , IFN-gama) no sobrenadante de cultura (medido por ELISA etc.) ou caracterização de respostas das células T por coloração intra e extracelular (por exemplo, usando anticorpos es- pecíficos para marcadores imunes, como CD3, CD4, CD8, IL2, TNF- alfa, IFN-gama, IFN Tipo 1, CD40L, CD69 etc.) seguido de análise com um citômetro de fluxo.

[00162] Em algumas circunstâncias, uma pluralidade de fragmentos do polipeptídeo de comprimento total (que pode ou não ser sobreposto e pode ou não cobrir a totalidade da sequência de comprimento total) pode ser usada para obter uma resposta biológica equivalente à pró- pria sequência de comprimento total. Por exemplo, pelo menos dois fragmentos imunogênicos (como três, quatro ou cinco) como descrito acima, que em combinação fornecem pelo menos 50%, adequada- mente pelo menos 75% e especialmente pelo menos 90% de atividade da sequência de referência em um ensaio de reestimulação in vitro de CMSP ou sangue total (por exemplo, um ensaio de proliferação de cé- lulas T e/ou produção de IFN-gama).

[00163] Exemplos de fragmentos imunogênicos de polipeptídeos das SEQ ID NOs. 1 a 10, e assim exemplos de peptídeos da invenção, incluem polipeptídeos que compreendem ou consistem nas sequên- cias das SEQ ID NOs. 11 a 32. Outros exemplos de fragmentos imu- nogênicos de polipeptídeos das SEQ ID NOs. 1 a 4, e assim exemplos de peptídeos da invenção, incluem polipeptídeos que compreendem ou consistem nas sequências das SEQ ID NOs. 51 a 78. As sequên-

cias das SEQ ID NOs. 11 a 17, 19 a 28, 30 a 31 e 51 a 54 foram identi- ficadas como estando ligadas a moléculas de HLA de Classe I a partir de análise imunopeptidômica (consultar os Exemplos 2 e 2.1). As se- quências das SEQ ID NOs. 18, 29 e 32 foram identificados como es- tando ligadas a moléculas de HLA de Classe II a partir da análise imu- nopeptidômica (consultar o Exemplo 2). As sequências das SEQ ID NOs 55 a 78 foram previstas pelo software NetMHC como estando li- gadas a moléculas de HLA de Classe I e foram usadas em ensaios de validação imunológica (consultar os Exemplos 3, 4 e 5).

ÁCIDOS NUCLEICOS

[00164] A invenção fornece um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo da invenção (chamado de um ácido nucleico da in- venção). Por exemplo, o ácido nucleico da invenção compreende ou consiste em uma sequência selecionada de SEQ ID NOs. 33 a 40 ou 41 a 50.

[00165] Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados indistintamente aqui e referem-se a uma macromolécula polimérica feita de monômeros de nucleotídeos, particularmente monômeros de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo. O termo engloba os ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeos conhecidos ou resíduos da cadeia principal ou ligações modificadas, os quais são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucleico de referência e que são metabo- lizados de um modo similar aos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, mas não se limitam a fosforotioatos, fosfo- ramidatos, fosfonatos de metil, fosfonatos de metil quirais, 2-O-metil- ribonucleotídeos, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs). Adequadamen- te, o termo "ácido nucleico" refere-se a polímeros de desoxirribonucle- otídeo ou monômeros de ribonucleotídeo de ocorrência natural. Ade- quadamente, as moléculas de ácido nucleico da invenção são recom-

binantes. Recombinante significa que a molécula de ácido nucleico é o produto de pelo menos uma das etapas de clonagem, restrição ou li- gação, ou outros procedimentos que resultam em uma molécula de ácido nucleico que é distinta de uma molécula de ácido nucleico en- contrada na natureza (por exemplo, no caso de cDNA). Em uma mo- dalidade, o ácido nucleico da invenção é uma sequência de ácido nu- cleico artificial (por exemplo, uma sequência de cDNA ou sequência de ácido nucleico com uso de códon de ocorrência não natural). Em uma modalidade, os ácidos nucleicos da invenção são DNA. Alternativa- mente, os ácidos nucleicos da invenção são RNA.

[00166] DNA (ácido desoxirribonucléico) e RNA (ácido ribonucleico) se referem a moléculas de ácido nucleico que têm uma cadeia princi- pal de porções químicas de açúcar que são porções químicas desoxir- ribosila e ribosila, respectivamente. As porções de açúcar podem ser ligadas a bases que são as 4 bases naturais (adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) no DNA e adenina (A), guanina (G), cito- sina (C ) e uracila (U) em RNA). Tal como aqui utilizado, um "RNA cor- respondente" é um RNA com a mesma sequência de um DNA de refe- rência, mas para a substituição de timina (T) no DNA por uracila (U) no RNA. As porções de açúcar também podem ser ligadas a bases não naturais, como inosina, xantosina, 7-metilguanosina, di-hidrouridina e 5-metilcitidina. As ligações fosfodiéster naturais entre as porções quí- micas de açúcar (desoxirribosila/ribosila) podem ser opcionalmente substituídas por ligações fosforotioatos. Adequadamente, os ácidos nucleicos da invenção consistem nas bases naturais ligadas a uma cadeia principal de açúcar desoxirribosila ou ribosila com ligações fos- fodiéster entre as porções químicas de açúcar.

[00167] Em uma modalidade, o ácido nucleico da invenção é um DNA. Por exemplo, o ácido nucleico compreende ou consiste em uma sequência selecionada de SEQ ID NOs. 33-40 ou 41-50. Também é fornecido um ácido nucleico que compreende ou consiste em uma va- riante de sequência selecionada de SEQ ID NOs. 33-40 ou 41-50 cuja variante codifica a mesma sequência de aminoácidos, mas possui um ácido nucleico diferente com base na degenerescência do código ge- nético.

[00168] Por causa da degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer proteína dada. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam a alanina de aminoácido. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o poli- peptídeo codificado. Essas variações de ácido nucleico levam a vari- antes "silenciosas" (às vezes referidas como "degeneradas" ou "sinô- nimas"), que são uma espécie de variações modificadas de forma con- servadora. Cada sequência de ácido nucleico neste documento que codifica um polipeptídeo também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucleico. Aqueles versados na técnica reconhecerão que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é geralmente o único códon para metionina, e UGG, que é geralmente o único có- don para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Nesse sentido, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[00169] Especificamente, substituições de códon degenerado po- dem ser atingidas ao se gerar sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resí- duos de base mistas e/ou desoxi-inosina (Batzer et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:2.605-

2.608; Rossolini et al., 1994, Mol. Cell. Probes 8:91-98).

[00170] Um ácido nucleico da invenção que compreende ou consis-

te em uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 33 a 40 ou 41 a 50 podem conter uma série de variações silenciosas (por exemplo, 1 a 50, como 1 a 25, em particular 1 a 5, e especialmente 1 códon (ou có- dons) pode ser alterado) em comparação com a sequência de referên- cia.

[00171] Em uma modalidade, o ácido nucleico da invenção é um RNA. São fornecidas sequências de RNA que correspondem a uma sequência de DNA fornecida no presente documento e têm uma ca- deia principal de ribonucleotídeo em vez de uma cadeia principal de desoxirribonucleotídeo e têm a base de cadeia lateral uracila (U) no lugar de timina (T).

[00172] Assim, um ácido nucleico da invenção compreende ou con- siste no equivalente de RNA de uma sequência de cDNA selecionada das SEQ ID NOs. 33 a 40 ou 41 a 50 e pode conter uma série de vari- ações silenciosas (por exemplo, 1 a 50, como 1 a 25, em particular 1 a 5, e especialmente 1 códon (ou códons) pode ser alterado) em compa- ração com a sequência de referência. Por "equivalente de RNA" en- tende-se uma sequência de RNA que contém as mesmas informações genéticas que a sequência de cDNA de referência (ou seja, contém os mesmos códons com uma cadeia principal de ribonucleotídeo em vez de uma cadeia principal de desoxirribonucleotídeo e tendo a base de cadeia lateral uracila (U) no lugar de timina (T)).

[00173] A invenção também compreende sequências que são com- plementares às sequências de cDNA e RNA acima mencionadas.

[00174] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos da invenção são otimizados por códons para expressão em uma célula hospedeira hu- mana.

[00175] Os ácidos nucleicos da invenção têm capacidade para se- rem transcritos e traduzidos em polipeptídeos da invenção no caso de ácidos nucleicos de DNA, e traduzidos em polipeptídeos da invenção no caso de ácidos nucleicos de RNA.

ÁCIDOS NUCLEICOS E POLIPEPTÍDEOS

[00176] Adequadamente, os polipeptídeos e ácidos nucleicos usa- dos na presente invenção são isolados. Um polipeptídeo ou ácido nu- cleico "isolado" é aquele que é removido de seu ambiente original. Por exemplo, um polipeptídeo ou ácido nucleico de ocorrência natural é isolado se for separado de alguns ou de todos os materiais coexisten- tes no sistema natural. Um ácido nucleico é considerado isolado se, por exemplo, for clonado em um vetor que não faz parte de seu ambi- ente natural.

[00177] "Ocorrência natural", quando usado com referência a um polipeptídeo ou sequência de ácido nucleico, significa uma sequência encontrada na natureza e não modificada sinteticamente.

[00178] "Artificial", quando usado com referência a um polipeptídeo ou sequência de ácido nucleico, significa uma sequência não encon- trada na natureza que é, por exemplo, uma modificação sintética de uma sequência natural ou contém uma sequência não natural.

[00179] O termo "heterólogo" quando usado com referência à rela- ção de um ácido ou polipeptídeo a outro ácido nucleico ou polipeptídeo indica que duas ou mais sequências não são encontradas na mesma relação entre si na natureza. Uma sequência "heteróloga" também po- de significar uma sequência que não é isolada, derivada de ou basea- da em um ácido nucleico ou sequência polipeptídica de ocorrência na- tural encontrada no organismo hospedeiro.

[00180] Como observado acima, as variantes do polipeptídeo têm, de preferência, pelo menos cerca de 80% de identidade, com mais preferência, pelo menos cerca de 85% de identidade e, com a máxima preferência, pelo menos cerca de 90% de identidade (como pelo me- nos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos pelo me- nos cerca de 99%) com a sequência de referência associada em todo o seu comprimento.

[00181] Com os propósitos de comparação de duas sequências po- lipeptídicas ou polinucleotídicas intimamente relacionadas, a "% de identidade de sequência" entre uma primeira sequência e uma segun- da sequência pode ser calculada. Diz-se que as sequências polipeptí- dicas são iguais ou idênticas a outras sequências polipeptídicas, se compartilharem 100% de identidade de sequência em todo o seu com- primento. Os resíduos nas sequências são numerados da esquerda para a direita, isto é, da terminação N à C para os polipeptídeos. Os termos "idêntica" ou porcentagem de "identidade," no contexto de duas ou mais sequências de polipeptídeos, se referem a duas ou mais se- quências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos que são iguais (ou seja, 70% de identidade, opcionalmente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade em uma região especificada), quando comparadas e alinhadas para a máxima correspondência em uma janela de compa- ração. Adequadamente, a comparação é realizada em uma janela cor- respondente a todo o comprimento da sequência de referência.

[00182] Para comparação de sequências, uma sequência atua co- mo uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de se- quência, o teste e as sequências de referência são inseridos em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se ne- cessário, e os parâmetros do programa de algoritmo da sequência são designados. Parâmetros de programa padrão podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de compa- ração de sequência, então, calcula a porcentagem de identidades de sequência para a sequência de teste em relação à sequência de refe- rência, com base nos parâmetros do programa.

[00183] Uma "janela de comparação", como usada no presente do-

cumento, se refere a um segmento em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências estarem idealmente ali- nhadas. Métodos de alinhamento de sequências para a comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, pelo método de busca por similaridade de Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, por im- plementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Gene- tics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou por alinha- mento manual e inspeção visual (consultar, por exemplo, Current Pro- tocols in Molecular Biology (Ausubel et al., suplemento eds. 1995)).

[00184] Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de sequência múltipla de um grupo de sequências re- lacionadas usando alinhamentos em pares progressivos. O mesmo também pode plotar uma árvore mostrado as relações de agrupamen- to usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360. o método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. O programa pode alinhar até 300 sequências, cada uma de um comprimento máximo de 5.000 nucleotí- deos ou aminoácidos. O procedimento de alinhamento múltiplo come- ça com o alinhamento de pares das duas sequências mais semelhan- tes, produzindo um agrupamento de duas sequências alinhadas. Este grupo é, então, alinhado à próxima sequência mais relacionada ou grupo de sequências alinhadas. Dois grupos de sequências são ali- nhados por uma extensão simples do alinhamento de pares de duas sequências individuais. O alinhamento final é obtido por uma série de alinhamentos progressivos de pares. O programa é executado desig- nando sequências específicas e suas coordenadas de aminoácidos para regiões de comparação de sequências e designando os parâme- tros do programa. Com o uso de PILEUP, uma sequência de referên- cia é comparada com outras sequências de teste para determinar a relação de porcentagem de identidade de sequência usando os se- guintes parâmetros: peso de lacuna padrão (3,00), peso de compri- mento de lacuna padrão (0,10) e lacunas finais ponderadas. PILEUP pode ser obtido a partir do pacote de software para análise de sequên- cias GCG, por exemplo, versão 7.0 (Devereaux et al., 1984, Nuc. Acids Res. 12: 387-395).

[00185] Outro exemplo de algoritmo que é adequado para determi- nar a porcentagem de sequência e a similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., 1977, Nuc. Acids Res. 25: 3.389-3.402 e Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. O software para realização de análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (no site da web www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiramente a identi- ficação de pares de sequência de alta semelhança (HSPs) por meio da identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação T com limiar de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência do banco de dados. T é referido co- mo o limiar de pontuação de palavra próxima (Altschul et al., supra). Esses acertos iniciais de palavra próxima atuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que os contenham. Os acertos de palavras são estendidos em ambas as direções ao lon- go de cada sequência, tanto quanto a pontuação de alinhamento cu-

mulativo possa ser aumentada. As pontuações cumulativas são calcu- ladas usando, sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontua- ção de recompensa para um par de resíduos de correspondência; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não corres- pondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A exten- são dos acertos de palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de pontuação negativa; ou o final de cada sequência é alcançado. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra de 3, expectativa (E) de 10, e os alinha- mentos (B) de matriz de pontuação BLOSUM62 de 50 (consultar Heni- koff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915), expectati- va (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação entre ambos os filamen- tos.

[00186] O algoritmo BLAST executa também uma análise estatísti- ca da similaridade entre duas sequências (consultar, por exemplo, Kar- lin & Altschul, 1993, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90: 5.873-5.787). Uma medição de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabi- lidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nu- cleotídeos ou aminoácidos poderia ocorrer por acaso.

[00187] Uma "diferença" entre as sequências se refere a uma inser- ção, deleção ou substituição de um único resíduo em uma posição da segunda sequência, em comparação com a primeira sequência. Duas sequências podem conter uma, duas ou mais dessas diferenças. As inserções, deleções ou substituições em uma segunda sequência que é de outra forma idêntica (100% de identidade de sequência) a uma primeira sequência resultam em % de identidade de sequência reduzi- da. Por exemplo, se as sequências idênticas tiverem 9 resíduos de comprimento, uma substituição na segunda sequência resulta em uma identidade de sequência de 88,9%. Se as sequências idênticas tiverem 17 resíduos de aminoácidos de comprimento, duas substituições na segunda sequência resultam em uma identidade de sequência de 88,2%.

[00188] Alternativamente, com o propósito de comparar uma primei- ra sequência de referência com uma segunda sequência de compara- ção, o número de adições, substituições e/ou deleções feitas na pri- meira sequência para produzir a segunda sequência pode ser deter- minado. Uma adição é a adição de um resíduo à primeira sequência (incluindo a adição em qualquer terminação da primeira sequência). Uma substituição é a substituição de um resíduo na primeira sequên- cia por um resíduo diferente. Uma deleção é a deleção de um resíduo da primeira sequência (incluindo deleção em qualquer terminação da primeira sequência).

PRODUÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO

[00189] Os polipeptídeos da invenção podem ser obtidos e manipu- lados utilizando as técnicas divulgadas, por exemplo, em Green e Sambrook 2012 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4a Edição Cold Spring Harbor Laboratory Press. Em particular, a síntese de ge- nes artificiais pode ser usada para produzir polinucleotídeos (Nambiar et al., 1984, Science, 223:1.299-1.301, Sakamar e Khorana, 1988, Nucl. Acids Res., 14:6.361-6.372, Wells et al. , 1985, Gene, 34:315- 323 e Grundstrom et al., 1985, Nucl. Acids Res., 13:3.305-3.316) se- guido de expressão em um organismo adequado para produzir poli- peptídeos. Um gene que codifica um polipeptídeo da invenção pode ser produzido sinteticamente, por exemplo, por síntese de DNA em fase sólida. Genes inteiros podem ser sintetizados de novo, sem a ne-

cessidade de DNA modelo precursor. Para obter o oligonucleotídeo desejado, os blocos de construção são sequencialmente acoplados à cadeia de oligonucleotídeo em crescimento na ordem exigida pela se- quência do produto. Após a conclusão da montagem da cadeia, o pro- duto é liberado da fase sólida para a solução, desprotegido e coletado. Os produtos podem ser isolados por cromatografia líquida de alto de- sempenho (HPLC) para obter os oligonucleotídeos desejados em alta pureza (Verma e Eckstein, 1998, Annu. Rev. Biochem. 67: 99-134). Esses segmentos relativamente curtos são prontamente montados usando uma variedade de métodos de amplificação de genes (Me- thods Mol Biol., 2012; 834:93-109) em moléculas de DNA mais longas, adequadas para uso em inúmeros sistemas de expressão baseados em DNA recombinante. No contexto dessa invenção, um versado na técnica entenderia que as sequências polinucleotídicas que codificam os antígenos polipeptídicos descritos nessa invenção podem ser pron- tamente usadas em uma variedade de sistemas de produção de vaci- nas, incluindo, por exemplo, vetores virais.

[00190] Com os propósitos de produção de polipeptídeos da inven- ção em um hospedeiro microbiológico (por exemplo, bacteriano ou fúngico), os ácidos nucleicos da invenção compreenderão sequências regulatórias e de controle adequadas (incluindo promotores, sinais de terminação, etc.) e sequências para promover a secreção de polipeptí- deos adequados para produção de proteínas no hospedeiro. De modo similar, os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos transdu- zindo-se culturas de células eucarióticas (por exemplo, células de ová- rio de hamster chinês ou células S2 de drosófila) com ácidos nucleicos da invenção que foram combinados com sequências regulatórias e de controle adequadas (incluindo promotores, sinais de terminação, etc. ) e sequências para promover a secreção de polipeptídeos adequados para a produção de proteínas nessas células.

[00191] O isolamento aprimorado dos polipeptídeos da invenção produzidos por meios recombinantes pode ser opcionalmente facilitado através da adição de um trecho de resíduos de histidina (comumente conhecido como etiqueta His) em direção a uma extremidade do poli- peptídeo.

[00192] Os polipeptídeos podem também ser produzidos sintetica- mente.

VETORES

[00193] Em modalidades adicionais, os construtos genéticos com- preendendo um ou mais dos ácidos nucleicos da invenção são intro- duzidos nas células in vivo de modo que um polipeptídeo da invenção seja produzido in vivo induzindo uma resposta imune. O ácido nucleico (por exemplo, DNA) pode estar presente em qualquer um de uma vari- edade de sistemas de entrega conhecidos pelos versados na técnica, incluindo sistemas de expressão de ácido nucleico, bactérias e alguns sistemas de expressão viral. Várias técnicas de entrega de genes são bem conhecidas na técnica, como as descritas por Rolland, 1998, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198 e referências citadas no mesmo. Várias dessas abordagens são descritas a seguir com o propósito de ilustração.

[00194] Consequentemente, é fornecido um vetor (também chama- do no presente documento de um ‘construto de expressão de DNA’ ou ‘construto’) que compreende uma molécula de ácido nucleico da in- venção.

[00195] Adequadamente, o vetor compreende ácido nucleico que codifica elementos reguladores (como um promotor adequado e sinal de terminação) adequados para permitir a transcrição de uma molécu- la de RNA traducionalmente ativa em uma célula hospedeira humana. Uma "molécula de RNA ativa na tradução" é uma molécula de RNA capaz de ser traduzida em uma proteína pelo aparelho de tradução de uma célula humana.

[00196] Consequentemente, é fornecido um vetor que compreende um ácido nucleico da invenção (no presente documento após um "ve- tor da invenção").

[00197] Em particular, o vetor pode ser um vetor viral. O vetor viral pode ser um adenovírus, vírus adeno-associado (AAV) (por exemplo, AAV tipo 5 e tipo 2), alfavírus (por exemplo, vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), vírus Sindbis (SIN), vírus da Floresta Semliki ( SFV)), vírus do herpes, arenavírus (por exemplo, vírus da coriomenin- gite linfocítica (LCMV)), vírus do sarampo, poxvírus (como vaccinia Ancara modificada (MVA)), paramixovírus, lentivírus ou rabdovírus (como vírus da estomatite vesicular (VSV)) vetor, ou seja, o vetor pode ser derivado de qualquer um dos vírus acima mencionados. Os ade- novírus são particularmente adequados para uso como um vetor de transferência de genes devido ao seu genoma de tamanho médio, faci- lidade de manipulação, alto título, ampla faixa de células-alvo e alta infectividade. Ambas as extremidades do genoma viral contêm repeti- ções invertidas de 100 a 200 pares de bases (ITRs), que são elemen- tos cis necessários para a replicação e empacotamento do DNA viral. As regiões iniciais (E) e tardias (L) do genoma contêm diferentes uni- dades de transcrição que são divididas pelo início da replicação do DNA viral. A região E1 (E1A e E1B) codifica proteínas responsáveis pela regulação da transcrição do genoma viral e de alguns genes celu- lares. A expressão da região E2 (E2A e E2B) resulta na síntese das proteínas para replicação do DNA viral. Essas proteínas estão envolvi- das na replicação de DNA, expressão gênica tardia e desligamento da célula hospedeira (Renan, 1990). Os produtos dos genes tardios, in- cluindo a maioria das proteínas capsidiais virais, são expressos ape- nas após o processamento significativo de um único transcrito primário emitido pelo promotor tardio principal (MLP). O MLP é particularmente eficiente durante a fase tardia de infecção, e todos os mRNAs transcri- tos a partir desse promotor possuem uma sequência líder 5 ‘tripartida (TPL) que os torna mRNAs preferidos para tradução. Adenovírus com deficiência de replicação, que são criados a partir de genomas virais que são deletados para um ou mais dos genes iniciais, são particular- mente úteis, uma vez que têm replicação limitada e menos possibilida- de de disseminação patogênica dentro de um hospedeiro vacinado e para contatos do hospedeiro vacinado.

ENTREGA DE OUTRO POLINUCLEOTÍDEO

[00198] Em certas modalidades da invenção, o construto de ex- pressão que compreende uma ou mais sequências polinucleotídicas pode consistir simplesmente em plasmídeos de DNA recombinante nu. Consultar Ulmer et al., 1993, Science 259: 1.745-1.749 e revisado por Cohen, 1993, Science 259: 1.691-1.692. A transferência do construto pode ser realizada, por exemplo, por qualquer método que permeabili- za física ou quimicamente a membrana celular. Isso é particularmente aplicável para transferência in vitro, porém pode também ser aplicado para uso in vivo. Prevê-se que o DNA que codifica um gene de inte- resse também pode ser transferido de maneira similar in vivo e ex- pressar o produto do gene. Vários sistemas de entrega têm sido usa- dos para entregar moléculas de DNA em modelos animais e no ho- mem. Alguns produtos baseados nessa tecnologia foram licenciados para uso em animais e outros estão em testes clínicos de fase 2 e 3 no homem.

ENTREGA DE RNA

[00199] Em outras modalidades da invenção, o construto de ex- pressão compreendendo uma ou mais sequências polinucleotídicas pode consistir em moléculas de RNA derivadas de DNA recombinante nu (Ulmer et al., 2012, Vaccine 30: 4.414-4.418). Quanto aos constru- tos de expressão baseados em DNA, uma variedade de métodos pode ser utilizada para introduzir moléculas de RNA em células in vitro ou in vivo. Os construtos baseados em RNA podem ser projetados para imi- tar moléculas simples de RNA mensageiro (mRNA), de modo que a molécula biológica introduzida seja diretamente traduzida pela maqui- naria de tradução da célula hospedeira para produzir seu polipeptídeo codificado nas células às quais foi introduzido. Alternativamente, as moléculas de RNA podem ser projetadas de maneira que lhes permita autoamplificar dentro das células nas quais são introduzidas, incorpo- rando em sua estrutura genes para polimerases de RNA dependentes de RNA virais. Dessa forma, esses tipos de moléculas de RNA, co- nhecidas como moléculas de mRNA de autoamplificação (SAMTM) (Geall et al. 2012, PNAS, 109: 14.604-14.609), compartilham proprie- dades com alguns vetores virais baseados em RNA. Tanto os RNAs baseados em mRNA quanto em SAMTM podem ser modificados poste- riormente (por exemplo, pela alteração de suas sequências ou pelo uso de nucleotídeos modificados) para aumentar a estabilidade e a tradução (Schlake et al., RNA Biology, 9: 1.319-1.330), e ambos os tipos de RNAs podem ser formulados (por exemplo, em emulsões (Bri- to et al., Molecular Therapy, 2014 22: 2.118–2.129) ou nanopartículas lipídicas (Kranz et al., 2006, Nature, 534: 396-401)) para facilitar esta- bilidade e/ou entrada nas células in vitro ou in vivo. Inúmeras formula- ções de RNAs modificados (e não modificados) foram testadas como vacinas em modelos animais e no homem, e várias vacinas baseadas em RNA estão sendo usadas em ensaios clínicos em andamento.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00200] Os polipeptídeos, ácidos nucleicos e vetores da invenção podem ser formulados para entrega em composições farmacêuticas, como composições imunogênicas e composições de vacina (todas mais adiante neste documento denominadas "composições da inven- ção"). As composições da invenção compreendem adequadamente um polipeptídeo, ácido nucleico ou vetor da invenção juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00201] Dessa forma, em uma modalidade, é fornecida uma com- posição farmacêutica imunogênica que compreende um polipeptídeo, ácido nucleico ou vetor da invenção juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00202] Em outra modalidade, é fornecida uma composição de va- cina que compreende um polipeptídeo, ácido nucleico ou vetor da in- venção juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável. A preparação de composições farmacêuticas é geralmente descrita em, por exemplo, Powell & Newman, eds., Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach), 1995. As composições da invenção podem tam- bém conter outros compostos, que podem ser biologicamente ativos ou inativos. Adequadamente, a composição da invenção é uma com- posição estéril adequada para administração parenteral.

[00203] Em certas modalidades preferidas da presente invenção, são fornecidas composições farmacêuticas da invenção que compre- endem um ou mais (por exemplo, um) polipeptídeos da invenção em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00204] Em certas modalidades preferidas da presente invenção, as composições da invenção são fornecidas compreendendo um ou mais (por exemplo, um) ácidos nucleicos da invenção ou um ou mais (por exemplo, um) vetores da invenção em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00205] Em uma modalidade, as composições da invenção podem compreender um ou mais (por exemplo, um) polinucleotídeo e um ou mais (por exemplo, um) componentes polipeptídicos. Alternativamente, as composições podem compreender um ou mais (por exemplo, um) vetor e um ou mais (por exemplo, um) componentes polipeptídicos. Alternativamente, as composições podem compreender um ou mais

(por exemplo, um) vetor e um ou mais (por exemplo, um) componentes polinucleotídicos. Essas composições podem fornecer uma resposta imunológica intensificada.

SAIS FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS

[00206] Será evidente que uma composição da invenção pode con- ter sais farmaceuticamente aceitáveis dos ácidos nucleicos ou polipep- tídeos fornecidos no presente documento. Tais sais podem ser prepa- rados a partir de bases não tóxicas farmaceuticamente aceitáveis, in- cluindo bases orgânicas (por exemplo, sais de aminas primárias, se- cundárias e terciárias e aminoácidos básicos) e bases inorgânicas (por exemplo, sódio, potássio, lítio, amônio, sais de cálcio e magnésio). CARREADORES FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS:

[00207] Embora muitos carreadores farmaceuticamente aceitáveis conhecidos dos versados na técnica possam ser empregados nas composições da invenção, o tipo de carreador ideal usado variará de- pendendo do modo de administração. As composições da presente invenção podem ser formuladas para qualquer maneira adequada de administração, incluindo, por exemplo, administração parenteral, tópi- ca, oral, nasal, intravenosa, intracraniana, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular, de preferência parenteral, por exemplo, administra- ção intramuscular, subcutânea ou intravenosa. Para administração pa- renteral, o carreador compreende, de preferência, água e pode conter tampões para controle de pH, agentes estabilizadores, por exemplo, tensoativos e aminoácidos e agentes modificadores de tonicidade, por exemplo, sais e açúcares. Se a composição se destinar a ser fornecida em forma liofilizada para diluição no ponto de uso, a formulação pode conter um lioprotetor, por exemplo, açúcares como a trealose. Para administração oral, qualquer um dos carreadores acima ou um carrea- dor sólido, como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, saca- rina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, e carbonato de magné-

sio, pode ser empregado.

[00208] Dessa forma, as composições da invenção podem compre- ender tampões (por exemplo, solução salina tamponada neutra ou so- lução salina tamponada com fosfato), carboidratos (por exemplo, gli- cose, manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, polipeptí- deos ou aminoácidos, como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes como EDTA ou glutationa, solutos que tornam a formulação isotônica, hipotônica ou fracamente hipertônica com o san- gue de um receptor, agentes de suspensão, agentes espessantes e/ou conservantes. Alternativamente, as composições da invenção podem ser formuladas como um liofilizado.

IMUNOESTIMULANTES

[00209] As composições da invenção também podem compreender um ou mais imunoestimulantes. Um imunoestimulante pode ser qual- quer substância que intensifique ou potencialize uma resposta imuno- lógica (mediada por anticorpo e/ou células) a um antígeno exógeno. Exemplos de imunoestimulantes, que são muitas vezes chamados de adjuvantes no contexto de formulações de vacinas, incluem sais de alumínio, como gel de hidróxido de alumínio (alúmen) ou fosfato de alumínio, saponinas incluindo QS21, oligonucleotídeos imunoestimula- dores, como CPG, emulsão de óleo em água (por exemplo, em que o óleo é esqualeno), aminoalquil glicosaminida 4-fosfatos, lipopolissaca- rídeo ou um derivado dos mesmos, por exemplo, monofosforil lipídeo A 3-de-O-acilado (3D-MPL) e outros ligantes de TLR4, ligantes TLR7, ligantes TLR8, ligantes TLR9, IL-12 e interferons. Dessa forma, adequadamente, o um ou mais imunoestimulantes da composição da invenção são selecionados de sais de alumínio, saponinas, oligonu- cleotídeos imunoestimuladores, emulsões de óleo em água, aminoal- quil glicosaminida 4-fosfatos, lipopolissacarídeos e derivados dos mesmos e outros ligantes TLR4, ligantes TLR7, Ligantes TLR8 e ligan-

tes TLR9. Os imunoestimulantes podem também incluir anticorpos monoclonais que interagem especificamente com outros componentes imunes, por exemplo, anticorpos monoclonais que bloqueiam a intera- ção de receptores de ponto de verificação imunes, incluindo PD-1 e CTLA4.

[00210] No caso de métodos de entrega de ácido nucleico recombi- nante (por exemplo, DNA, RNA, vetores virais), os genes que codifi- cam imunoestimulantes à base de proteínas podem ser prontamente entregues juntamente com os genes que codificam os polipeptídeos da invenção.

LIBERAÇÃO SUSTENTADA

[00211] As composições descritas no presente documento podem ser administradas como parte de uma formulação de liberação susten- tada (ou seja, uma formulação como uma cápsula, esponja, adesivo ou gel (composto de polissacarídeos, por exemplo)) que efetua uma liberação lenta/sustentada de composto após a administração.

ARMAZENAMENTO E EMBALAGEM

[00212] As formulações dos compostos podem ser apresentadas em recipientes de dose única ou recipiente de doses múltiplas veda- dos, como ampolas ou frascos. Tais recipientes são, de preferência, vedados hermeticamente para preservar a esterilidade da formulação até o uso. Em geral, as formulações podem ser armazenadas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos. Alternativamente, uma composição da invenção pode ser armazenada em uma condição liofilizada que exige apenas a adição de um carrea- dor líquido estéril (como água ou solução salina para injeção) imedia- tamente antes do uso.

DOSAGEM

[00213] A quantidade de ácido nucleico, polipeptídeo ou vetor em cada composição da invenção pode ser preparada de tal forma que uma dosagem adequada para uso terapêutico ou profilático será obti- da. Fatores como solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida biológica, via de administração, prazo de validade do produto, bem como outras considerações farmacológicas, serão contemplados por um versado na técnica de preparação de tais composições e, como tal, uma varie- dade de dosagens e regimes de tratamento podem ser desejados.

[00214] Tipicamente, as composições que compreendem uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz entregam cerca de 0,1 ug a cerca de 1.000 ug de polipeptídeo da invenção por adminis- tração, mais tipicamente cerca de 2,5 ug a cerca de 100 ug de polipep- tídeo por administração. Se entregues sob a forma de peptídeos lon- gos sintéticos curtos, as doses podem estar na faixa de 1 a 200 ug/peptídeo/dose. Em relação a composições polinucleotídicas, essas tipicamente entregam cerca de 10 ug a cerca de 20 mg do ácido nu- cleico da invenção por administração, mais tipicamente cerca de 0,1 mg a cerca de 10 mg do ácido nucleico da invenção por administração.

DOENÇAS A SEREM TRATADAS OU PREVENIDAS

[00215] Conforme observado em outro lugar, as SEQ ID NOs. 1 a 10 são sequências polipeptídicas correspondentes a antígenos de CLT que são superexpressos no melanoma cutâneo.

[00216] Em uma modalidade, a invenção fornece um polipeptídeo, ácido nucleico, vetor ou composição da invenção para uso em medici- na.

[00217] Outros aspectos da invenção se referem a um método para aumentar uma resposta imunológica em um ser humano que compre- ende a administração ao dito ser humano do polipeptídeo, ácido nu- cleico, vetor ou composição da invenção.

[00218] A presente invenção fornece também um polipeptídeo, áci- do nucleico, vetor ou composição da invenção para uso no aumento de uma resposta imunológica em um ser humano.

[00219] Também é fornecida a utilização de um polipeptídeo, ácido nucleico, vetor ou composição da invenção para a fabricação de um medicamento para uso no aumento de uma resposta imunológica em um ser humano.

[00220] Adequadamente, a resposta imune é gerada contra um tu- mor canceroso que expressa uma sequência correspondente selecio- nada a partir de SEQ ID NOs. 1 a 10 e variantes e fragmentos imuno- gênicos de qualquer um dos mesmos. Por "correspondente", neste contexto, entende-se que se o tumor expressar, digamos, a SEQ ID NO. A (sendo A uma das SEQ ID NOs. 1 a 10) ou uma variante ou fra- gmento imunogênico do mesmo, então o polipeptídeo, ácido nucleico, vetor ou composição da invenção e medicamentos envolvendo esses serão baseados na SEQ ID NO. A ou uma variante ou fragmento imu- nogênico do mesmo.

[00221] Adequadamente, a resposta imunológica compreende célu- las T CD8 +, uma célula T CD4+ e/ou uma resposta de anticorpos, particularmente a resposta de células T citolíticas CD8+ e uma respos- ta de células T auxiliares CD4+.

[00222] Adequadamente, a resposta imunológica é gerada contra um tumor, particularmente um que expressa uma sequência selecio- nada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e variantes do mesmo e fragmentos imunogênicos do mesmo.

[00223] Em uma modalidade preferida, o tumor é um tumor de me- lanoma, por exemplo, um tumor de melanoma cutâneo.

[00224] O tumor pode ser um tumor primário ou um tumor metastá- tico.

[00225] Outros aspectos da invenção se referem a um método de tratamento de um paciente humano que sofre de câncer, em que as células do câncer expressam uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, ou para prevenir que um ser humano sofra de câncer cujo câncer poderia expressar uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, cujo método compreende a administração ao dito ser humano um polipeptídeo, ácido nucleico, vetor ou composição corres- pondente da invenção.

[00226] A presente invenção fornece também um polipeptídeo, áci- do nucleico, vetor ou composição da invenção para uso no tratamento ou prevenção de câncer em um ser humano, em que as células do câncer expressam uma sequência correspondente selecionada das de SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos de qualquer um dos mesmos.

[00227] Os transcritos correspondentes às SEQ ID NOs. 33, 35, 36 e 40 foram também superexpressos no melanoma uveal. Consequen- temente, em uma modalidade alternativa, o tumor é um tumor de me- lanoma uveal e/ou o tumor expressa uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1, 3, 4, 5 e 10.

[00228] Dessa forma, a invenção fornece um método ou um poli- peptídeo, ácido nucleico, vetor ou composição para uso de acordo com a invenção, em que o polipeptídeo compreende uma sequência selecionada de: (a) a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1, 3, 4, 5 e 10; e (b) uma variante das sequências de (a); e (c) um fragmento imunogênico das sequências de (a). e, por exemplo, o polipeptídeo compreende ou consiste em uma se- quência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs. 11 a 14, 17 a 18, 19, 20 a 22, 30 a 32, 51 a 57, 67 a 74 e 76 a 77 e, por exemplo, o ácido nucleico compreende ou consiste em uma sequência seleciona- da de qualquer uma das SEQ ID NOs. 33, 35, 36 ou 40 ou selecionada de qualquer uma de 41, 43, 44, 45 e 50; e em que o câncer é melanoma uveal.

[00229] As palavras "prevenção" e "profilaxia" são usadas de forma intercambiável no presente documento.

REGIMES DE TRATAMENTO E VACINAÇÃO

[00230] Um regime terapêutico pode envolver a entrega simultânea (como coadministração) ou sequencial (como um estímulo inicial) de (i) um polipeptídeo, ácido nucleico ou vetor da invenção com (ii) um ou mais polipeptídeos adicionais , ácidos nucleicos ou vetores da inven- ção e/ou (iii) um componente adicional, como uma variedade de outros compostos ou moléculas terapeuticamente úteis, como proteínas anti- gênicas, opcionalmente administradas simultaneamente com adjuvan- te. Exemplos de coadministração incluem coadministração homolateral e coadministração contralateral. A administração "simultânea" se refe- re adequadamente a todos os componentes que são entregues duran- te a mesma rodada de tratamento. Adequadamente, todos os compo- nentes são administrados ao mesmo tempo (como administração si- multânea de DNA e proteína), no entanto, um componente poderia ser administrado dentro de alguns minutos (por exemplo, na mesma con- sulta médica ou visita do médico) ou dentro de algumas horas.

[00231] Em algumas modalidades, uma "iniciação" ou primeira ad- ministração de um polipeptídeo, ácido nucleico ou vetor da invenção, é seguido de uma ou mais administrações de "reforço" ou subsequentes de um polipeptídeo, ácido nucleico ou vetor da invenção ("método de "iniciação e reforço" ("prime and boost")). Em uma modalidade, o poli- peptídeo, ácido nucleico ou vetor da invenção é usado em um regime de vacinação de iniciação-reforço. Em uma modalidade, tanto a inicia- ção quanto o reforço são de um polipeptídeo da invenção, o mesmo polipeptídeo da invenção em cada caso. Em uma modalidade, tanto a iníciação quanto o reforço são de um ácido nucleico ou vetor da inven-

ção, o mesmo ácido nucleico ou vetor da invenção em cada caso. Al- ternativamente, a iniciação pode ser realizada usando um ácido nu- cleico ou vetor da invenção e o reforço realizado usando um polipeptí- deo da invenção ou a iniciação pode ser realizada usando um polipep- tídeo da invenção e o reforço realizado usando um ácido nucleico ou vetor da invenção. Normalmente, a primeira administração ou "inicia- ção" e a segunda administração ou "reforço" são administradas cerca de 1 a 12 semanas depois, ou até 4 a 6 meses depois. As administra- ções de "reforço" subsequentes podem ser administradas tão frequen- temente como a cada 1 a 6 semanas ou podem ser administradas mui- to depois (até anos depois).

COMBINAÇÕES DE ANTÍGENOS

[00232] Os polipeptídeos, ácidos nucleicos ou vetores da invenção podem ser usados em combinação com um ou mais outros polipeptí- deos ou ácidos nucleicos, vetores da invenção e/ou com outros poli- peptídeos antigênicos (ou polinucleotídeos ou vetores que codificam os mesmos) que causam uma resposta imunológica que será gerada contra melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo ou uveal. Esses outros polipeptídeos antigênicos poderiam ser derivados de diversas fontes, os mesmos podem incluir antígenos associados ao melanoma bem descritos, como GPR143, PRAME, MAGE-A3 ou pMel (gp100). Alternativamente, os mesmos podem incluir outros tipos de antígenos de melanoma, incluindo neoantígenos específicos do paciente (Lauss et al. (2017). Nature Communications, 8 (1), 1738. Http://doi.org/10.1038/s41467-017-01460-0), neoantígenos de íntron retido (Smart et al. (2018). Nature Biotechnology. http://doi.org/10.1038/nbt.4239), neoantígenos variantes emendados (Hoyos et al., Cancer Cell, 34 (2), 181-183. http://doi.org/10.1016/j.ccell. 2018.07.008; Kahles et al. (2018). Cancer Cell, 34 (2), 211-224.e6. http://doi.org/10.1016/j.ccell.2018.07.001),

antígenos de melanoma que se enquadram na categoria conhecida como antígenos que codificam epítopos de células T associados ao processamento de peptídeo prejudicado (TIEPPs; Gigoux, M., & Wol- chok, J. (2018). JEM, 215, 2233, Marijt et al. (2018). JEM 215, 2325), ou neoantígenos a serem encontrados (incluindo antígenos CLT). Além disso, os peptídeos antigênicos dessas várias fontes podem também ser combinados com (i) espécies imunoestimulan- tes/adjuvantes não específicas e/ou (ii) um antígeno, por exemplo, compreendendo epítopos auxiliares CD4 universais, conhecidos por desencadear células T auxiliares CD4 fortes (entregues como polipep- tídeos, ou como polinucleotídeos ou vetores que codificam esses antí- genos CD4), para amplificar as respostas específicas antimelanoma provocadas por antígenos coadministrados.

[00233] Diferentes polipeptídeos, ácidos nucleicos ou vetores po- dem ser formulados na mesma formulação ou em formulações sepa- radas. Alternativamente, os polipeptídeos podem ser fornecidos como proteínas de fusão nas quais um polipeptídeo da invenção é fundido a um segundo ou outro polipeptídeo (consultar abaixo).

[00234] Podem ser fornecidos ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão acima mencionadas.

[00235] Mais geralmente, quando dois ou mais componentes são utilizados em combinação, os componentes podem ser apresentados, por exemplo: (1) como dois ou mais componentes polipeptídicos antigê- nicos individuais; (2) como uma proteína de fusão compreendendo ambos (ou mais) componentes polipeptídicos; (3) como um ou mais polipeptídeos e um ou mais compo- nentes polinucleotídicos; (4) como dois ou mais componentes polinucleotídicos indi-

viduais; (5) como um único polinucleotídeo que codifica dois ou mais componentes polipeptídicos individuais; ou (6) como um único polinucleotídeo que codifica uma proteí- na de fusão compreendendo ambos (ou mais) componentes polipeptí- dicos.

[00236] Por conveniência, é frequentemente desejável que, quando vários componentes estão presentes, os mesmos estejam contidos em uma única proteína de fusão ou um polinucleotídeo que codifica uma única proteína de fusão (consultar abaixo). Em uma modalidade da invenção, todos os componentes são fornecidos como polipeptídeos (por exemplo, dentro de uma única proteína de fusão). Em uma moda- lidade alternativa da invenção, todos os componentes são fornecidos como polinucleotídeos (por exemplo, um único polinucleotídeo, como um que codifica uma única proteína de fusão).

OS POLIPEPTÍDEOS DE FUSÃO

[00237] Como uma modalidade da discussão acima de combina- ções de antígenos, a invenção também fornece um polipeptídeo isola- do de acordo com a invenção fundido a um segundo ou outro polipep- tídeo da invenção (aqui após um "polipeptídeo de combinação da in- venção"), através da criação de nucleicos construções de ácido que fundem as sequências que codificam os antígenos individuais. Espera- se que os polipeptídeos de combinação da invenção tenham as utili- dades aqui descritas para polipeptídeos da invenção e possam ter a vantagem de atividade imunogênica ou de vacina superior ou efeito profilático ou terapêutico (incluindo o aumento da amplitude e profun- didade das respostas) e podem ser especialmente valiosos em uma população exangue. As fusões de polipeptídeos da invenção também podem fornecer o benefício de aumentar a eficiência de construção e fabricação de antígenos de vacina e / ou vacinas vetorizadas (incluin-

do vacinas de ácido nucleico).

[00238] Conforme descrito acima na seção de Combinações de An- tígeno, os polipeptídeos da invenção e os polipeptídeos de combina- ção da invenção também podem ser fundidos a sequências polipeptí- dicas que não são polipeptídeos da invenção, incluindo um ou mais de: (a) outros polipeptídeos que são antígenos associados a melanoma e, portanto, potencialmente úteis como sequências imuno- gênicas em uma vacina (por exemplo, GPR143, PRAME, MAGE-A3 e pMel (gp100) referidos supra); e (b) sequências polipeptídicas que são capazes de aumentar uma resposta imune (isto é, sequências imunoestimulantes). (c) As sequências polipeptídicas, por exemplo, compreen- dendo epítopos auxiliares CD4 universais, que têm capacidade para fornecer CD4+ forte, ajudam a aumentar as respostas das células T CD8+ aos epítopos do antígeno de CLT.

[00239] Polipeptídeos de fusão exemplificativos compreendem duas ou mais (por exemplo, duas, três ou quatro) sequências selecionadas das sequências das SEQ ID NOs. 1, 2, 3 e 4; ou, em relação a cada uma das ditas sequências, uma variante da sequência ou um fragmen- to imunogênico da sequência.

[00240] Um polipeptídeo de fusão exemplificativo compreende: (i) uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 1; e (b) uma variante da sequência de (a); e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a), por exemplo, selecionado das SEQ ID NOs. 11 a 14, 55 a 57 e 73 a 74; e (ii) uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 2; e (b) uma variante da sequência de (a); e

(c) um fragmento imunogênico da sequência de (a), por exemplo, selecionado das SEQ ID NOs. 15 a 16, 58 a 66, 75 e 78; e (iii) uma sequência selecionada a partir de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 3; e (b) uma variante da sequência de (a); e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a), por exemplo, selecionado das SEQ ID NOs. 17 a 18, 53 e 67 a 69; e (iv) uma sequência selecionada de: (a) a sequência de SEQ ID NO. 4; e (b) uma variante da sequência de (a); e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a), por exemplo, selecionado das SEQ ID NOs. 19, 51 a 52, 54, 70 a 72 e 76 a 77.

[00241] Por exemplo, o polipeptídeo de fusão compreende as se- quências de SEQ ID NOs. 1, 2, 3 e 4.

[00242] Outro polipeptídeo de fusão exemplificativo compreende: (i) uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 1; e (b) uma variante da sequência de (a); e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a), por exemplo, selecionado das SEQ ID NOs. 11 a 14, 55 a 57 e 73 a 74; e (ii) uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 2; e (b) uma variante da sequência de (a); e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a), por exemplo, selecionado das SEQ ID NOs. 15 a 16, 58 a 66, 75 e 78; e (iii) uma sequência selecionada a partir de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 4; e (b) uma variante da sequência de (a); e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a), por exemplo, selecionado das SEQ ID NOs. 19, 51 a 52, 54, 70 a 72 e 76 a 77.

[00243] Por exemplo, o polipeptídeo de fusão compreende as se- quências de SEQ ID NOs. 1, 2 e 4.

[00244] A invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos de fusão mencionados acima e outros aspectos da invenção (vetores, composições, células, etc.) mutatis mutandis quan- to aos polipeptídeos da invenção.

POLIPEPTÍDEOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DE CLT

[00245] Os polipeptídeos de ligação ao antígeno que são imunoes- pecíficos para antígenos expressos por tumor (polipeptídeos da inven- ção) podem ser projetados para recrutar células citolíticas para células tumorais decoradas com antígeno, mediando sua destruição. Um tal mecanismo de recrutamento de células citolíticas por polipeptídeos de ligação a antígeno é conhecido como citotoxicidade mediada por célu- las dependente de anticorpos (ADCC). Dessa forma, a invenção forne- ce um polipeptídeo de ligação ao antígeno que é imunoespecífico para um polipeptídeo da invenção. Polipeptídeos de ligação ao antígeno, incluindo anticorpos, como anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos, por exemplo, anticorpos de domínio, fragmentos Fab, frag- mentos Fv e fragmentos VHH que podem ser produzidos em uma es- pécie animal não humana (por exemplo, roedor ou camelídeo) e hu- manizados ou podem ser produzidos em uma espécie não humana (por exemplo, roedor geneticamente modificado para ter um sistema imunológico humano).

[00246] Os polipeptídeos de ligação ao antígeno podem ser produ- zidos por métodos bem conhecidos por um versado na técnica. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando tecnologia de hibridoma, pela fusão de uma célula B produtora de anti- corpo específico com uma célula de mieloma (câncer de célula B) que é selecionada por sua capacidade de crescer em cultura de tecidos e pela ausência de síntese de cadeia de anticorpo (Köhler e Milstein, 1975, Nature 256 (5517): 495-497 e Nelson et al., 2000 (Jun), Mol Pathol. 53 (3): 111-7 incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade).

[00247] Um anticorpo monoclonal direcionado contra um determi- nado antígeno pode, por exemplo, ser obtido por: a) imortalizar linfócitos obtidos do sangue periférico de um animal (incluindo um ser humano) previamente imunizado/exposto com um determinado antígeno, com uma célula imortal e, de preferên- cia, com células de mieloma, a fim de formar um hibridoma, b) cultivar as células imortalizadas (hibridoma) formadas e recuperar as células que produzem os anticorpos com a especificidade desejada.

[00248] Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por um pro- cesso que compreende as etapas de: a) clonar em vetores, especialmente em fagos e mais parti- cularmente bacteriófagos filamentosos, sequências de DNA ou cDNA obtidas de linfócitos, especialmente linfócitos de sangue periférico de um animal (adequadamente previamente imunizado com determinados antígenos), b) transformar as células procarióticas com os vetores aci- ma em condições que permitem a produção dos anticorpos, c) selecionar os anticorpos submetendo-os à seleção de afinidade de antígeno, d) recuperar os anticorpos com a especificidade desejada e) expressar moléculas de ácido nucleico que codificam an- ticorpos obtidas de células B de pacientes expostos a antígenos, ou animais experimentalmente imunizados com antígenos.

[00249] Os anticorpos selecionados podem, então, ser produzidos usando tecnologia de produção de proteína recombinante convencio- nal (por exemplo, a partir de células CHO geneticamente modificadas).

[00250] A invenção fornece um polipeptídeo de ligação ao antígeno isolado que é imunoespecífico para um polipeptídeo da invenção. Adequadamente, o polipeptídeo de ligação ao antígeno é um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo.

[00251] Em certas modalidades, o polipeptídeo de ligação ao antí- geno é acoplado a uma porção química citotóxica. Exemplos de por- ções químicas citotóxicas incluem o domínio Fc de um anticorpo, que irá recrutar células portadoras do receptor Fc que facilitam ADCC. Al- ternativamente, o polipeptídeo de ligação ao antígeno pode ser ligado a uma toxina biológica ou um produto químico citotóxico.

[00252] Outra classe importante de polipeptídeos de ligação ao an- tígeno incluem moléculas derivadas do receptor de células T (TCR) que se ligam a fragmentos dos antígenos exibidos por HLA dessa in- venção. Nessa modalidade, produtos biológicos baseados em TCR (incluindo TCRs derivados diretamente de pacientes, ou especifica- mente manipulados, TCRs de alta afinidade) que reconhecem antíge- nos de CLT (ou derivados dos mesmos) na superfície de células tumo- rais podem também incluir uma porção química de alvejamento que reconhece um componente em uma célula T (ou outra classe de célula imune) que atrai essas células imunes aos tumores, proporcionando benefício terapêutico. Em algumas modalidades, a porção química de alvejamento pode também estimular atividades benéficas (incluindo atividades citolíticas) das células imunes redirecionadas.

[00253] Dessa forma, em uma modalidade, o polipeptídeo de liga- ção ao antígeno é imunoespecífico para um polipeptídeo ligado a HLA que é ou faz parte de um polipeptídeo da invenção. Por exemplo, o polipeptídeo de ligação ao antígeno é um receptor de células T.

[00254] Em uma modalidade, um polipeptídeo de ligação ao antíge-

no da invenção pode ser acoplado a outro polipeptídeo que tem capa- cidade para se ligar a células citotóxicas ou outros componentes imu- nes em um indivíduo.

[00255] Em uma modalidade, o polipeptídeo de ligação ao antígeno serve para uso em medicina.

[00256] Em outra modalidade, é fornecida uma composição farma- cêutica que compreende um polipeptídeo de ligação ao antígeno da invenção juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável. Tal composição pode ser uma composição estéril adequada para ad- ministração parenteral. Consultar, por exemplo, a divulgação de com- posições farmacêuticas supra.

[00257] É fornecido pela invenção um método de tratamento de um ser humano que sofre de câncer, em que as células do câncer expres- sam uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmen- tos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, ou de pre- venção de um ser humano de sofrer de câncer, em que as células do câncer poderiam expressar uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, que compreende a administração ao dito ser humano de um polipeptídeo de ligação ao antígeno ou composição compreenden- do o dito polipeptídeo de ligação ao antígeno da invenção.

[00258] Em uma modalidade, é fornecido um polipeptídeo de liga- ção ao antígeno da invenção, que pode ser acoplado a uma porção química citotóxica, ou composição que compreende o dito polipeptídeo de ligação ao antígeno da invenção para uso no tratamento ou pre- venção de câncer em um ser humano, em que as células do câncer expressam uma sequência correspondente selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos de qualquer um dos mesmos.

[00259] Adequadamente, em qualquer uma das modalidades ante- riores, o câncer é melanoma, particularmente melanoma cutâneo.

[00260] Em uma modalidade, é fornecido um método ou um poli- peptídeo de ligação ao antígeno ou composição para uso de acordo com a invenção, em que o polipeptídeo compreende uma sequência selecionada de: (a) a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1, 3, 4, 5 e 10; e (b) uma variante das sequências de (a); e (c) um fragmento imunogênico das sequências de (a). e, por exemplo, o polipeptídeo compreende ou consiste em uma se- quência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs. 11 a 14, 17 a 18, 19, 20 a 22, 30 a 32, 51 a 57, 67 a 74 e 76 a 77 e, por exemplo, o ácido nucleico compreende ou consiste em uma sequência seleciona- da de qualquer uma das SEQ ID NOs. 33, 35, 36 ou 40 ou selecionada de qualquer uma de 41, 43, 44, 45 e 50; e em que o câncer é melanoma uveal.

[00261] Polipeptídeos de ligação ao antígeno (como anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ser administrados em uma dose de, por exemplo, 5 a 1.000 mg, por exemplo, 25 a 500 mg, por exemplo, 100 a 300 mg, por exemplo, cerca de 200 mg. Terapias Celulares para facilitar a Apresentação do Antígeno in vivo

[00262] Qualquer um de uma variedade de veículos de entrega ce- lular pode ser empregado em composições farmacêuticas para facilitar a produção de uma resposta imunológica específica ao antígeno. Des- sa forma, a invenção fornece uma célula que é uma célula apresenta- dora de antígeno isolada modificada por carregamento ex vivo com um polipeptídeo da invenção ou geneticamente modificada para expressar o polipeptídeo da invenção (mais adiante no presente documento chamado de "APC da invenção"). Células apresentadoras de antígeno (APCs), como células dendríticas, macrófagos, células B, monócitos e outras células que podem ser geneticamente modificadas para serem

APCs eficientes. Essas células podem, mas não precisam, ser geneti- camente modificadas para aumentar a capacidade de apresentar o antígeno, para melhorar a ativação e/ou manutenção da resposta das células T e/ou para serem imunologicamente compatíveis com o re- ceptor (ou seja, haplótipo de HLA compatível). As APCs podem geral- mente ser isoladas de qualquer um de uma variedade de fluidos e ór- gãos biológicos e podem ser células autólogas, alogênicas, singênicas ou xenogênicas.

[00263] Certas modalidades preferidas da presente invenção usam células dendríticas ou progenitores das mesmas como APCs. Dessa forma, em uma modalidade, a APC da invenção é uma célula dendríti- ca. As células dendríticas são APCs altamente potentes (Banchereau & Steinman, 1998, Nature, 392: 245-251) e mostraram ser eficazes como um adjuvante fisiológico para elicitar imunidade profilática ou te- rapêutica (consultar Timmerman & Levy, 1999, Ann. Rev. Med. 50: 507-529). Em geral, as células dendríticas podem ser identificadas com base em sua forma típica (estrelada in situ, com processos cito- plasmáticos marcados (dendritos) visíveis in vitro), sua capacidade de absorver, processar e apresentar antígenos com alta eficiência e sua capacidade para ativar respostas de células T virgens. As células den- dríticas podem, naturalmente, ser projetadas para expressar recepto- res ou ligantes de superfície celular específicos que não são comu- mente encontrados em células dendríticas in vivo ou ex vivo, e tais cé- lulas dendríticas modificadas são contempladas pela presente inven- ção. Como uma alternativa às células dendríticas, vesículas secreta- das carregadas com antígeno (chamadas exossomos) podem ser usa- das dentro de uma composição imunogênica (consultar Zitvogel et al., 1998, Nature Med. 4: 594-600). Dessa forma, em uma modalidade, é fornecido um exossoma carregado com um polipeptídeo da invenção.

[00264] As células dendríticas e progenitoras podem ser obtidas de sangue periférico, medula óssea, nódulos linfáticos, baço, pele, san- gue do cordão umbilical ou qualquer outro tecido ou fluido adequado. Por exemplo, as células dendríticas podem ser diferenciadas ex vivo pela adição de uma combinação de citocinas, como GM-CSF, IL-4, IL- 13 e/ou TNF, a culturas de monócitos coletados de sangue periférico. Alternativamente, as células positivas para CD34 colhidas de sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou medula óssea podem ser diferenciadas em células dendríticas pela adição ao meio de cultura de combinações de GM-CSF, IL-3, TNF, ligante de CD40, LPS, ligante flt3 e/ou outro composto (ou compostos) que induzem a diferenciação, maturação e proliferação de células dendríticas.

[00265] As células dendríticas são convenientemente categorizadas como células "imaturas" e "maduras", o que permite uma maneira sim- ples de discriminar entre dois fenótipos bem caracterizados. No entan- to, esta nomenclatura não deve ser interpretada para excluir todos os estágios intermediários possíveis de diferenciação. As células dendríti- cas imaturas são caracterizadas como APCs com alta capacidade de absorção e processamento de antígenos, o que se correlaciona com a alta expressão doγ receptor Fc e receptor de manose. O fenótipo ma- duro é tipicamente caracterizado por uma expressão mais baixa des- ses marcadores, porém uma alta expressão de moléculas de superfí- cie celular responsáveis pela ativação de células T, como MHC de classe I e classe II, moléculas de adesão (por exemplo, CD54 e CD11) e moléculas coestimulatórias (por exemplo, CD40, CD80, CD86 e 4- 1BB).

[00266] APCs também podem ser geneticamente modificadas, por exemplo, transfectadas com um polinucleotídeo que codifica uma pro- teína (ou porção ou outra variante da mesma) de modo que o polipep- tídeo seja expresso na superfície da célula. Tal transfecção pode ocor- rer ex vivo, e uma composição farmacêutica que compreende tais cé-

lulas transfectadas pode, então, ser usada, como descrito no presente documento. Alternativamente, um veículo de entrega de gene que tem como alvo uma célula dendrítica ou outra célula apresentadora de an- tígeno pode ser administrado a um paciente, resultando em transfec- ção que ocorre in vivo. A transfecção in vivo e ex vivo de células den- dríticas, por exemplo, pode geralmente ser realizada usando quaisquer métodos conhecidos na técnica, como aqueles descritos no documen- to nº WO 97/24447, ou a abordagem de arma de gene descrita por Mahvi et al., 1997, Immunology and Cell Biology 75: 456-460. O carre- gamento de antígenos de células dendríticas pode ser alcançado incu- bando células dendríticas ou células progenitoras com o polipeptídeo, DNA (por exemplo, um vetor plasmídeo) ou RNA; ou com bactérias ou vírus recombinantes que expressam antígeno (por exemplo, um ade- novírus, vírus adeno-associado (AAV) (por exemplo, AAV tipo 5 e tipo 2), alfavírus (por exemplo, vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), vírus Sindbis (SIN) , vírus da Floresta de Semliki (SFV), vírus do herpes, arenavírus (por exemplo, vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV)), vírus do sarampo, poxvírus (como vaccinia Ankara modifica- da (MVA) ou varíola), paramixovírus, lentivírus ou rabdovírus (como vírus da estomatite vesicular (VSV)). Antes do carregamento do poli- peptídeo, os polipeptídeos podem ser conjugados covalentemente a um parceiro imunológico que fornece ajuda de células T (por exemplo, uma molécula carreadora). Alternativamente, uma célula dendrítica pode ser pulsada com um parceiro imunológico não conjugado, sepa- radamente ou na presença do polipeptídeo ou vetor.

[00267] A invenção fornece a entrega de fragmentos de antígenos polipeptídicos codificados por epítopos sintetizados quimicamente, projetados especificamente para células apresentadoras de antígeno. Os versados na técnica perceberão que esses tipos de moléculas, também conhecidos como peptídeos longos sintéticos (SLPs) forne-

cem uma plataforma terapêutica para o uso de polipeptídeos antigêni- cos dessa invenção para estimular (ou carregar) células in vitro (Gor- nati et al., 2018, Front. Imm, 9: 1484), ou como um método de introdu- ção de antígeno polipeptídico em células apresentadoras de antígeno in vivo (Melief & van der Burg, 2008, Nat Rev Cancer, 8: 351-60).

[00268] Em uma modalidade, é fornecida uma composição farma- cêutica que compreende uma célula apresentadora de antígeno da invenção, que é adequadamente uma célula dendrítica, juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável. Tal composição pode ser uma composição estéril adequada para administração parenteral. Consultar, por exemplo, a divulgação de composições farmacêuticas supra.

[00269] Em uma modalidade, é fornecida uma célula apresentadora de antígeno da invenção, que é adequadamente uma célula dendrítica, para uso em medicina.

[00270] Também é fornecido um método de tratamento de um ser humano que sofre de câncer, em que as células do câncer expressam uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, ou de preven- ção de um ser humano de sofrer de câncer, em que as células do cân- cer expressariam uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, que compreende a administração ao dito ser humano da dita célula apresentadora de antígeno da invenção, que é adequadamente uma célula dendrítica, ou composição que compreende a dita célula apre- sentadora de antígeno da invenção.

[00271] Em uma modalidade, é fornecida uma célula apresentadora de antígeno da invenção, que é adequadamente uma célula dendrítica, ou composição que compreende a dita célula apresentadora de antí- geno da invenção para uso no tratamento ou prevenção de câncer em um ser humano, em que as células do câncer expressam uma se- quência correspondente selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e frag- mentos imunogênicos de qualquer uma das mesmas.

[00272] Em certas modalidades, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um exossoma da invenção juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável. Tal com- posição pode ser uma composição estéril adequada para administra- ção parenteral. Consultar, por exemplo, a divulgação de composições farmacêuticas supra. As composições podem compreender opcional- mente imunoestimulantes - consultar divulgação de imunoestimulantes supra.

[00273] Em uma modalidade, é fornecido um exossoma da inven- ção para uso em medicina.

[00274] Também é fornecido um método de tratamento de um ser humano que sofre de câncer, em que as células do câncer expressam uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, ou de preven- ção de um ser humano de sofrer de câncer, em que as células do cân- cer poderiam expressar uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, que compreende a administração ao dito ser humano um exossoma se a invenção ou composição compreender o dito exosso- ma da invenção.

[00275] Em uma modalidade, é fornecido um exossoma da inven- ção ou composição compreendendo o dito exossoma da invenção pa- ra uso no tratamento ou prevenção de câncer em um ser humano, em que as células do câncer expressam uma sequência correspondente selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos de qualquer um dos mesmos.

[00276] Em qualquer uma das modalidades anteriores, adequada-

mente o câncer é melanoma, particularmente melanoma cutâneo.

TERAPIAS COM CÉLULAS T ESTIMULADAS

[00277] Além da produção mediada por APC in vivo ou ex vivo de células T imunoespecíficas para polipeptídeos da invenção, células T autólogas ou não autólogas podem ser isoladas de um indivíduo, por exemplo, de sangue periférico, sangue do cordão umbilical e/ou por aférese, e estimuladas na presença de antígenos associados a tumor que são carregados em moléculas de MHC (sinal 1) de células APC, para induzir a proliferação de células T com um TCR imunoespecífico para esse antígeno.

[00278] A ativação bem-sucedida de células T exige a ligação das moléculas de superfície coestimulatórias B7 e CD28 em células apre- sentadoras de antígenos e células T, respectivamente (sinal 2). Para atingir a ativação ideal de células T, ambos os sinais 1 e 2 são neces- sários. Por outro lado, a estimulação do peptídeo antigênico (sinal 1) na ausência de coestimulação (sinal 2) não pode induzir a ativação completa das células T e pode resultar em tolerância das células T. Além de moléculas coestimulatórias, também há moléculas inibitórias, como CTLA-4 e PD-1, que induzem sinais para prevenir a ativação de células T.

[00279] As células T autólogas ou não autólogas podem, portanto, ser estimuladas na presença de um polipeptídeo da invenção e ex- pandidas e transferidas de volta para o paciente em risco de ou so- frendo de câncer cujas células cancerosas expressam um polipeptídeo correspondente da invenção fornecido que os TCRs específicos do antígeno reconhecerão o antígeno apresentado pelo MHC do paciente, em que irão alvejar e induzir o extermínio das células do dito câncer que expressam o dito polipeptídeo correspondente.

[00280] Em uma modalidade, é fornecido um polipeptídeo, ácido nucleico, vetor ou composição da invenção para uso na estimulação ex vivo e/ou amplificação de células T derivadas de um ser humano que sofre de câncer, para reintrodução subsequente das ditas células T estimuladas e/ou amplificadas no dito ser humano para o tratamento do dito câncer no dito ser humano.

[00281] A invenção fornece um método de tratamento de câncer em um ser humano, em que as células do câncer expressam uma se- quência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogê- nicos e variantes de qualquer um dos mesmos, que compreende cole- tar do dito ser humano uma população de leucócitos compreendendo pelo menos células T opcionalmente com células apresentadoras de antígeno, estimulando e/ou amplificando as ditas células T na presen- ça de um polipeptídeo, ácido nucleico, vetor ou composição corres- pondente da invenção e reintroduzindo alguns ou todos os ditos glóbu- los brancos compreendendo pelo menos células T estimuladas e/ou amplificadas no ser humano.

[00282] Adequadamente, em qualquer uma das modalidades ante- riores, o câncer é melanoma, particularmente melanoma cutâneo.

[00283] Em uma modalidade, é fornecido um processo para a pre- paração de uma população de células T que é citotóxica para células cancerosas que expressam uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos que compreendem (a) obter células T e células apresen- tadoras de antígeno de um paciente com câncer e (ii) estimular e am- plificar a população de células T ex vivo com um polipeptídeo corres- pondente, nucleico ácido, vetor ou composição da invenção.

[00284] Por "correspondente", nesse contexto, entende-se que se as células cancerosas expressam, digamos, a SEQ ID NO. A (sendo A uma das SEQ ID NOs. 1 a 10) ou uma variante ou fragmento imuno- gênico do mesmo, então a população de células T é estimulada e am- plificada ex vivo com a SEQ ID NO. A ou uma variante ou fragmento imunogênico da mesma sob a forma de um polipeptídeo, ácido nuclei- co ou vetor, ou uma composição contendo um dos anteriores.

[00285] Por exemplo, em tais processos, a cultura e a expansão são realizadas na presença de células dendríticas. As células dendríti- cas podem ser transfectadas com uma molécula de ácido nucleico ou com um vetor da invenção e expressar um polipeptídeo da invenção.

[00286] A invenção fornece uma população de células T que pode ser obtida por qualquer um dos processos mencionados anteriormente (mais adiante neste documento uma população de células T da inven- ção).

[00287] Em uma modalidade, é fornecida uma célula que é uma cé- lula T que foi estimulada com um polipeptídeo, ácido nucleico, vetor ou composição da invenção (mais adiante neste documento uma célula T da invenção).

[00288] Em uma modalidade, é fornecida uma composição farma- cêutica que compreende uma população de células T ou uma célula T da invenção juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitá- vel. Tal composição pode, por exemplo, ser uma composição estéril adequada para administração parenteral.

[00289] Em uma modalidade, é fornecida uma população de células T ou células T da invenção para uso em medicina.

[00290] Também é fornecido um método de tratamento de um ser humano que sofre de câncer, em que as células do câncer expressam uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, ou de preven- ção de um ser humano de sofrer de câncer, em que as células do cân- cer poderiam expressar uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, que compreende a administração ao dito ser humano da dita população de células T ou células T da invenção ou composição com-

preendendo a dita população de células T ou células T da invenção.

[00291] Em uma modalidade, é fornecida uma população de células T da invenção, células T da invenção ou composição compreendendo a dita população de células T ou células T da invenção para uso no tratamento ou prevenção de câncer em um ser humano, em que as células do câncer expressam uma sequência correspondente selecio- nada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos de qualquer um dos mesmos. Em qualquer uma das modalidades anteriores, ade- quadamente o câncer é melanoma, particularmente melanoma cutâ- neo.

[00292] Em uma modalidade, é fornecido um processo, um método ou uma população de células T, células T, células apresentadoras de antígenos, exossomas ou composições para uso de acordo com a in- venção, em que o polipeptídeo compreende uma sequência selecio- nada de: (a) a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1, 3, 4, 5 e 10; e (b) uma variante das sequências de (a); e (c) um fragmento imunogênico das sequências de (a). e, por exemplo, o polipeptídeo compreende ou consiste em uma se- quência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs. 11 a 14, 17 a 18, 19, 20 a 22, 30 a 32, 51 a 57, 67 a 74 e 76 a 77 e, por exemplo, o ácido nucleico compreende ou consiste em uma sequência seleciona- da de qualquer uma das SEQ ID NOs. 33, 35, 36 ou 40 ou selecionada de qualquer uma de 41, 43, 44, 45 e 50; e em que o câncer é melanoma uveal.

TERAPIAS COM CÉLULAS IMUNOLÓGICAS GENETICAMENTE MODIFICADAS

[00293] Derivados de todos os tipos de polipeptídeos de ligação ao antígeno de CLT descritos acima, incluindo TCRs ou miméticos de

TCR (consultar Dubrovsky et al., 2016, Oncoimmunology) que reco- nhecem peptídeos derivados do antígeno de CLT complexados a mo- léculas de HLA humanas, podem ser geneticamente modificados para serem expressos na superfície de células T (autólogas ou não autólo- gas), que podem então ser administradas como terapias de células T adotivas para tratar câncer.

[00294] Esses derivados se enquadram na categoria de "receptores de antígenos quiméricos (CARs)", que, conforme usado no presente documento, podem se referir a receptores de células T artificiais, re- ceptores de células T quiméricos ou imunorreceptores quiméricos, por exemplo, e abrangem receptores geneticamente modificados que en- xertam uma especificidade artificial em uma célula imune efetora es- pecífica. Os CARs podem ser empregados para conferir a especifici- dade de um anticorpo monoclonal a uma célula T, permitindo assim que um grande número de células T específicas seja gerado, por exemplo, para uso em terapia de células adotivas. Os CARs podem direcionar a especificidade da célula para um antígeno associado ao tumor, um polipeptídeo da invenção, em que o polipeptídeo é ligado a HLA.

[00295] Outra abordagem para tratar o câncer em um paciente é modificar geneticamente as células T para alvejar os antígenos ex- pressos nas células tumorais, por meio da expressão de receptores de antígenos quiméricos (CARs). Essa tecnologia é revisada em Wendell & June, 2017, Cell, 168: 724-740 (incorporado a título de referência em sua totalidade).

[00296] Essas células T CAR podem ser produzidas pelo método de obtenção de uma amostra de células do indivíduo, por exemplo, de sangue periférico, sangue do cordão umbilical e/ou por aférese, em que a dita amostra compreende células T ou progenitores de células T, e transfecção das ditas células com um ácido nucleico que codifica um receptor de células T quimérico (CAR) que é imunoespecífico para o polipeptídeo da invenção, em que o polipeptídeo está ligado a HLA. Tal ácido nucleico terá capacidade para integração no genoma das células, e as células podem ser administradas em uma quantidade efi- caz ao indivíduo para fornecer uma resposta de células T contra célu- las que expressam um polipeptídeo da invenção. Por exemplo, a amostra de células do indivíduo pode ser coletada.

[00297] Entende-se que as células usadas para produzir as ditas células T que expressam CAR podem ser autólogas ou não autólogas.

[00298] As células T que expressam CAR transgênicas podem ter a expressão de um receptor de células T endógeno e/ou HLA endógeno inativado. Por exemplo, as células podem ser geneticamente modifica- das para eliminar a expressão de receptor de células T alfa/beta endó- geno (TCR).

[00299] Os métodos de transfecção de células são bem conhecidos na técnica, mas podem ser empregados métodos de transfecção alta- mente eficientes, como a eletroporação. Por exemplo, os ácidos nu- cleicos ou vetores da invenção que expressam os construtos CAR po- dem ser introduzidos nas células usando um aparelho de nucleofec- ção.

[00300] A população de células para células T que expressam CAR pode ser enriquecida após a transfecção das células. Por exemplo, as células que expressam o CAR podem ser classificadas daquelas que não o fazem (por exemplo, via FACS) pelo uso de um antígeno ligado pelo CAR ou um anticorpo de ligação ao CAR. Alternativamente, a etapa de enriquecimento compreende a depleção das células não T ou a depleção das células desprovidas de expressão de CAR. Por exem- plo, células CD56+ podem ser depletadas de uma população de cultu- ra.

[00301] A população de células transgênicas que expressam CAR pode ser cultivada ex vivo em um meio que aumenta seletivamente a proliferação de células T que expressam CAR. Portanto, as células T que expressam CAR podem ser expandidas ex vivo.

[00302] Uma amostra de células CAR pode ser preservada (ou mantida em cultura). Por exemplo, uma amostra pode ser criopreser- vada para expansão ou análise posterior.

[00303] As células T que expressam CAR podem ser empregadas em combinação com outras terapêuticas, por exemplo, inibidores de ponto de verificação incluindo antagonistas de PD-L1.

[00304] Em uma modalidade, é fornecida uma célula citotóxica que foi geneticamente modificada para expressar qualquer um dos polipep- tídeos de ligação ao antígeno acima em sua superfície. Adequada- mente, a célula citotóxica é uma célula T.

[00305] Em uma modalidade, é fornecida uma célula citotóxica, que é adequadamente uma célula T, geneticamente modificada para ex- pressar qualquer um dos polipeptídeos de ligação ao antígeno acima em sua superfície, para uso em medicina

[00306] A invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma célula citotóxica da invenção, que é adequadamente uma célula T.

[00307] É fornecido um método de tratamento de um paciente hu- mano que sofre de câncer, em que as células do câncer expressam uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, ou para pre- venir que um ser humano sofra de câncer cujo câncer poderia expres- sar uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos e variantes de qualquer um dos mesmos, cujo método compreende a administração ao dito ser humano de uma célula citotó- xica da invenção, que é adequadamente uma célula T.

[00308] Em uma modalidade, a célula citotóxica da invenção, que é adequadamente uma célula T, serve para uso no tratamento ou pre- venção do câncer em um ser humano, em que as células do câncer expressam uma sequência correspondente selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imunogênicos de qualquer um dos mesmos.

TERAPIAS DE COMBINAÇÃO

[00309] Métodos de tratamento de câncer, de acordo com a inven- ção, podem ser realizados em combinação com outras terapias, espe- cialmente inibidores de ponto de verificação e interferons.

[00310] Os polipeptídeos, ácidos nucleicos, vetores, polipeptídeos de ligação ao antígeno e terapias de células adotivas (APC e basea- das em células T) podem ser usados em combinação com outros componentes projetados para intensificar sua imunogenicidade, por exemplo, para aprimorar a magnitude e/ou amplitude da resposta imu- nológica induzida ou fornecer outras atividades (por exemplo, ativação de outros aspectos da resposta imunológica inata ou adaptativa ou destruição de células tumorais).

[00311] Consequentemente, a invenção fornece uma composição da invenção (ou seja, uma composição imunogênica, vacina ou farma- cêutica) ou um kit de várias dessas composições compreendendo um polipeptídeo, ácido nucleico ou vetor da invenção juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável; e (i) um ou mais polipeptídeos imunogênicos ou imunoestimulantes adicionais (por exemplo, interfe- rons, IL-12, moléculas de bloqueio de ponto de verificação ou ácidos nucleicos que codificam tais, ou vetores compreendendo tais ácidos nucleicos), (ii) moléculas pequenas (por exemplo, inibidores de HDAC ou outros fármacos que modificam o perfil epigenético de células can- cerosas) ou biológicos (entregues como polipeptídeos ou ácidos nu- cleicos que codificam tais, ou vetores que compreendem tais ácidos nucleicos) que irão aumentar a tradução e/ou apresentação dos produ- tos polipeptídicos que são o assunto dessa invenção.

[00312] Os inibidores de ponto de verificação, que bloqueiam as proteínas normais nas células cancerosas, ou as proteínas nas células T que respondem às mesmas, podem ser uma classe particularmente importante de fármacos a serem combinados com terapias baseadas no antígeno de CLT, uma vez que esses inibidores procuram superar uma das principais defesas contra um ataque do sistema imunológico.

[00313] Assim, um aspecto da invenção inclui a administração de um polipeptídeo, ácido nucleico, vetor, polipeptídeo de ligação ao antí- geno, composição, célula T, população de células T ou célula apresen- tadora de antígeno da presente invenção em combinação com um ini- bidor de ponto de verificação Exemplos de inibidores de ponto de veri- ficação são selecionados de inibidores de PD-1, como pembrolizuma- be, (Keytruda) e nivolumabe (Opdivo), inibidores de PD-L1, como ate- zolizumabe (Tecentriq), avelumabe (Bavencio) e durvalumabe (Imfinzi) e CTLA-4 inibidores como ipilimumabe (Yervoy).

[00314] Interferons (por exemplo, alfa, beta e gama) são uma famí- lia de proteínas que o corpo produz em quantidades muito pequenas. Os interferões podem retardar ou parar a divisão das células cancero- sas, reduzir a capacidade de as células cancerígenas se protegerem do sistema imunológico e/ou aumentar vários aspectos do sistema imunitário adaptativo. Os interferons são tipicamente administrados como uma injeção subcutânea, por exemplo na coxa ou abdômen.

[00315] Assim, um aspecto da invenção inclui a administração de um polipeptídeo, ácido nucleico, vetor, polipeptídeo de ligação ao antí- geno ou composição da presente invenção em combinação com inter- feron, por exemplo, interferon alfa.

[00316] Diferentes modos da invenção podem também ser combi- nados, por exemplo, polipeptídeos, ácidos nucleicos e vetores da in- venção podem ser combinados com um APC, uma célula T ou uma população de células T da invenção (discutido infra).

[00317] Um ou mais modos da invenção podem também ser combi- nados com quimioterapia anticâncer convencional e/ou radiação.

DIAGNÓSTICO

[00318] Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para usar um ou mais dos polipeptídeos ou ácido nucleico da invenção para di- agnosticar câncer, particularmente melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo, ou para diagnosticar indivíduos humanos adequados para tratamento por polipeptídeos, ácidos nucleicos, vetores, polipeptídeos de ligação ao antígeno, terapias celulares adotivas ou composições da invenção.

[00319] Dessa forma, a invenção fornece um método para diagnos- ticar que um ser humano sofre de câncer, compreendendo as etapas de: determinar se as células do dito câncer expressam uma sequência polipeptídica selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e fragmentos imu- nogênicos ou variantes de qualquer um dos mesmos (por exemplo, selecionados das sequências das SEQ ID NOs. 11 a 32 e 51 a 78); ou um ácido nucleico que codifica a dita sequência polipeptídica (por exemplo, selecionada das sequências de SEQ ID NOs. 33 a 40 e SEQ ID NOs. 41 a 50), e diagnosticar o dito ser humano como sofrendo de câncer se o dito polipeptídeo ou ácido nucleico correspondente for su- perexpresso nas ditas células cancerosas.

[00320] A invenção fornece um método para diagnosticar que um ser humano sofre de câncer que é melanoma cutâneo, compreenden- do as etapas de: determinar se as células do dito câncer expressam uma sequência polipeptídica selecionada das SEQ ID NO. 2, 6, 7, 8 e 9 e fragmentos imunogênicos ou variantes dos mesmos; ou um ácido nucleico que codifica a dita sequência polipeptídica, e diagnosticar o dito ser humano como sofrendo de câncer que é melanoma cutâneo se o dito polipeptídeo ou ácido nucleico correspondente for superex- presso nas ditas células cancerosas.

[00321] Conforme usado no presente documento, "superexpresso" em células cancerosas significa que o nível de expressão em células cancerosas é maior do que em células normais.

[00322] A invenção fornece um método para diagnosticar que um ser humano que sofre de câncer que é melanoma cutâneo ou mela- noma uveal, compreendendo as etapas de: determinar se as células do dito câncer expressam uma sequência polipeptídica selecionada das SEQ ID Nos. 1, 3, 4, 5 e 10 e fragmentos imunogênicos ou varian- tes de qualquer um dos mesmos; ou um ácido nucleico que codifica a dita sequência polipeptídica, e diagnosticar o dito ser humano como sofrendo de câncer que é melanoma cutâneo ou melanoma uveal se o dito polipeptídeo ou ácido nucleico correspondente for superexpresso nas ditas células cancerosas.

[00323] A superexpressão pode ser determinada a título de referên- cia ao nível do ácido nucleico ou polipeptídeo da invenção em um indi- víduo humano controle conhecido por não ter o câncer. Dessa forma, a superexpressão indica que o ácido nucleico ou polipeptídeo da inven- ção é detectado em um nível significativamente mais alto (por exem- plo, um nível que é 30%, 50%, 100% ou 500% mais alto) no indivíduo de teste do que no indivíduo controle. No caso de o indivíduo humano controle ter um nível indetectável do ácido nucleico ou polipeptídeo da invenção, então o diagnóstico pode ser feito pela detecção do ácido nucleico ou polipeptídeo da invenção.

[00324] A invenção também fornece um método de tratamento de um ser humano que sofre de câncer, compreendendo as etapas de: (a) determinar se as células do dito câncer expressam uma sequência polipeptídica selecionada das SEQ ID NOs. 1 a 10 e frag- mentos imunogênicos ou variantes de qualquer um dos mesmos (por exemplo, selecionados das sequências das SEQ ID NOs. 11 a 32 e 51 a 78) ou um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo (por exem-

plo, selecionado das sequências das SEQ ID NOs. 33 a 40 e 41 a 50); e se (b) administrar ao dito ser humano um polipeptídeo, ácido nucleico, vetor, composição, população de células T, célula T, célula apresentadora de antígeno, polipeptídeo de ligação ao antígeno ou célula citotóxica correspondente da invenção.

[00325] Também é fornecido o uso de um polipeptídeo compreen- dendo uma sequência selecionada de: (a) a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1 a 10; ou (b) uma variante das sequências de (a); e (c) um fragmento imunogênico das sequências de (a) isola- das do tumor de um ser humano que sofre de câncer, ou o uso de um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo, como um biomarcador para a determinação de se o dito ser humano seria adequado para o tratamento por uma vacina compreendendo um polipeptídeo, ácido nucleico, vetor, composição, população de células T, célula T, célula apresentadora de antígeno, polipeptídeo de ligação ao antígeno ou célula citotóxica correspondente da invenção.

[00326] Adequadamente, o câncer é melanoma, particularmente melanoma cutâneo.

[00327] A invenção fornece também um método ou uso de acordo com a invenção, em que o polipeptídeo compreende uma sequência selecionada de: (a) a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1, 3, 4, 5 e 10; e (b) uma variante das sequências de (a); e (c) um fragmento imunogênico das sequências de (a). e, por exemplo, o polipeptídeo compreende ou consiste em uma se- quência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs. 11 a 14, 17 a

18, 19, 20 a 22, 30 a 32, 51 a 57, 67 a 74 e 76 a 77 e, por exemplo, o ácido nucleico compreende ou consiste em uma sequência seleciona- da de qualquer uma das SEQ ID NOs. 33, 35, 36 ou 40 ou selecionada de qualquer uma de 41, 43, 44, 45 e 50; e em que o câncer é melanoma uveal.

[00328] Adequadamente, o polipeptídeo da invenção tem uma se- quência selecionada das SEQ Id NOs. 1 a 10 ou um fragmento do mesmo, como um fragmento imunogênico do mesmo (por exemplo, selecionado das sequências das SEQ ID NOs. 11 a 32 e 51 a 78).

[00329] Adequadamente, o ácido nucleico da invenção tem ou compreende uma sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs. 33 a 40 ou 41 a 50 ou um fragmento da mesma, como um frag- mento imunogênico da mesma.

[00330] Os kits para detectar a presença de ácidos nucléicos são bem conhecidos. Por exemplo, kits compreendendo pelo menos dois oligonucleotídeos que hibridizam a um polinucleotídeo podem ser usa- dos em uma reação de PCR em tempo real (RT-PCR) para permitir a detecção e semiquantificação de ácidos nucleicos específicos. Esses kits podem permitir a detecção de produtos de PCR pela geração de um sinal fluorescente como resultado de Forster Resonance Energy Transfer (FRET) (por exemplo, kits TaqMan®), ou mediante ligação de DNA de fita dupla (por exemplo, kits SYBR® Green ) Alguns kits (por exemplo, aqueles que contêm sondas TaqMan® que abrangem os éxons do DNA alvo) permitem a detecção e quantificação de mRNA, por exemplo, transcritos que codificam ácidos nucleicos da invenção. Os ensaios que usam certos kits podem ser configurados em um for- mato multiplex para detectar vários ácidos nucleicos simultaneamente dentro de uma reação. Podem também ser usados kits para a detec- ção de DNA ativo (ou seja, DNA que carrega assinaturas epigenéticas específicas indicativas de expressão). Os componentes adicionais que podem estar presentes em tais kits incluem um reagente de diagnósti- co ou repórter para facilitar a detecção de um ácido nucleico da inven- ção.

[00331] Os ácidos nucleicos da invenção podem também ser detec- tados por meio de biópsia líquida, usando uma amostra de sangue de um paciente. Esse procedimento oferece uma alternativa não invasiva às biópsias cirúrgicas. O plasma de tais amostras de sangue pode ser isolado e analisado quanto à presença de ácidos nucleicos da inven- ção.

[00332] Os polipeptídeos da invenção podem ser detectados por meio de anticorpos específicos do antígeno em um ensaio do tipo ELI- SA para detectar polipeptídeos da invenção em preparações homoge- neizadas de amostras de tumor de pacientes. Alternativamente, os po- lipeptídeos da invenção podem ser detectados por meio de análises imunohistoquímicas, que identificam a presença dos antígenos poli- peptídicos usando microscopia de luz para inspecionar seções de amostras de tumor de pacientes que foram coradas usando prepara- ções de anticorpos adequadamente marcadas. Como outra alternativa, os polipeptídeos da invenção podem ser detectados por meio de análi- ses imunohistoquímicas, que identificam a presença dos antígenos polipeptídicos usando microscopia de luz para inspecionar seções de amostras de tumor de pacientes que foram coradas usando prepara- ções de anticorpos adequadamente marcadas.

[00333] Os polipeptídeos da invenção podem também ser detecta- dos determinando se os mesmos são capazes de estimular células T geradas contra o dito polipeptídeo.

[00334] As células do câncer ou tumor, por exemplo, o melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo, podem ser obtidas por exemplo de uma biópsia do câncer, por exemplo, o melanoma, por exemplo, mela- noma cutâneo.

[00335] Um método de tratamento de câncer, particularmente me- lanoma, por exemplo, melanoma cutâneo, em um ser humano com- preende (i) detectar a presença de um ácido nucleico ou polipeptídeo de acordo com a invenção e (ii) administrar ao indivíduo um ácido nu- cleico, polipeptídeo , vetor, célula, célula T ou população de células T ou composição de acordo com a invenção (e de preferência adminis- trar o mesmo ácido nucleico ou polipeptídeo ou fragmento do mesmo que foi detectado).

[00336] Um método de tratamento de câncer, particularmente me- lanoma, por exemplo, melanoma cutâneo, em um ser humano com- preende também a administração ao indivíduo de um ácido nucleico, polipeptídeo, vetor, célula, célula T ou população de células T ou com- posição de acordo com a invenção, em que a presença de um (e de preferência o mesmo) ácido nucleico ou polipeptídeo foi detectada no indivíduo de acordo com a invenção.

[00337] Em particular, o câncer a ser diagnosticado e, se adequado, tratado é melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo.

[00338] Quando um polipeptídeo da invenção das SEQ ID NOs. 1, 3, 4, 5 ou 10 ou um fragmento do mesmo é detectado, então o câncer pode ser melanoma cutâneo ou melanoma uveal.

MODALIDADES ESPECÍFICAS

[00339] Em uma modalidade, o polipeptídeo do antígeno de CLT compreende ou consiste na SEQ ID NO. 1. Fragmentos exemplificati- vos compreendem ou consistem em qualquer uma das SEQ ID NOs. 11 a 14. Outros fragmentos exemplificativos compreendem duas, três ou quatro das SEQ ID NOs. 11 a 14. Outros fragmentos exemplificati- vos compreendem ou consistem em qualquer uma das SEQ ID NOs. 55 a 57 ou 73 a 74. Outros fragmentos exemplificativos compreendem todas as SEQ ID NOs. 11 a 14, 55 a 57 e 73 a 74 (levando-se em con- sideração a possível sobreposição de sequência, de modo que qual-

quer sequência de sobreposição não precise estar presente mais de uma vez). Ácidos nucleicos exemplificativos que codificam a dita se- quência polipeptídica compreendem ou consistem na SEQ ID NO 33 ou SEQ ID NO. 41 São fornecidos ácidos nucleicos correspondentes (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, célu- las citocóticas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresenta- doras de antígeno e exossomas como descrito supra. Os ditos ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de célu- las T, células citotóxicas, polipeptídeos de ligação ao antígeno, células apresentadoras de antígeno e exossomas podem ser usados no tra- tamento de câncer, especialmente melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo ou melanoma uveal. Métodos relacionados de diagnóstico são também fornecidos.

[00340] Em uma modalidade, o polipeptídeo do antígeno de CLT compreende ou consiste em SEQ ID NO. 2. Fragmentos exemplificati- vos compreendem ou consistem em SEQ ID NO. 15 ou SEQ ID NO. 16 Outros fragmentos exemplificativos compreendem SEQ ID NO. 15 e SEQ ID NO. 16 Outros fragmentos exemplificativos compreendem ou consistem em qualquer uma das SEQ ID NOs. 58 a 66, 75 e 78. Outros fragmentos exemplificativos compreendem todas as SEQ ID NOs. 15 a 16, 58 a 66, 75 e 78 (levando-se em consideração uma possível sobreposição de sequência, de modo que qualquer sequência de sobreposição não precise estar presente mais de uma vez). Ácidos nucleicos exemplificativos que codificam a dita sequência polipeptídica compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 34 ou SEQ ID NO. 42 São fornecidos ácidos nucleicos correspondentes (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, células citocóticas, poli- peptídeos de ligação a antígeno, células apresentadoras de antígeno e exossomas como descrito supra. Os ditos ácidos nucleicos (por exem- plo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, células citotóxi-

cas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresentadoras de antígeno e exossomas podem ser usados no tratamento de câncer, especialmente melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo. Métodos relacionados de diagnóstico são também fornecidos.

[00341] Em uma modalidade, o polipeptídeo do antígeno de CLT compreende ou consiste na SEQ ID NO. 3. Fragmentos exemplificati- vos compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 17 ou SEQ ID NO. 18, Outros fragmentos exemplificativos compreendem a SEQ ID NO. 17 e a SEQ ID NO. 18 Outros fragmentos exemplificativos compreen- dem ou consistem em qualquer uma das SEQ ID NOs. 53 e 67 a 69. Outros fragmentos exemplificativos compreendem SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18 e SEQ ID NO. 53. Outros fragmentos exemplificativos compreendem todas as SEQ ID NOs. 17 a 18, 53 e 67 a 69 (levando- se em consideração a possível sobreposição de sequência, de modo que qualquer sequência de sobreposição não precise estar presente mais de uma vez). Ácidos nucleicos exemplificativos que codificam a dita sequência polipeptídica compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 35 ou SEQ ID NO. 43 São fornecidos ácidos nucleicos correspon- dentes (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, células citocóticas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresentadoras de antígeno e exossomas como descrito supra. Os ditos ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA), células T, popula- ções de células T, células citotóxicas, polipeptídeos de ligação ao an- tígeno, células apresentadoras de antígeno e exossomas podem ser usados no tratamento de câncer, especialmente melanoma, por exem- plo, melanoma cutâneo ou melanoma uveal. Métodos relacionados de diagnóstico são também fornecidos.

[00342] Em uma modalidade, o polipeptídeo do antígeno de CLT compreende ou consiste na SEQ ID NO. 4. Fragmentos exemplificati- vos compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 19 Outros fragmentos exemplificativos compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 51 ou SEQ ID NO. 52 Outros fragmentos exemplificativos compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 54 Outros fragmentos exemplificativos com- preendem ou consistem em qualquer uma das SEQ ID NOs. 70 a 72 e 76 a 77. Outros fragmentos exemplificativos compreendem SEQ ID NO. 19 e SEQ ID NO. 51 ou SEQ ID NO. 52 Outros fragmentos exem- plificativos compreendem SEQ ID NO. 54 e SEQ ID NO. 51 ou SEQ ID NO. 52 Outros fragmentos exemplificativos compreendem todas as SEQ ID NOs. 19, 51 a 52, 54, 70 a 72 e 76 a 77 (levando-se em consi- deração uma possível sobreposição de sequência de modo que qual- quer sequência de sobreposição não precise estar presente mais de uma vez). Ácidos nucleicos exemplificativos que codificam a dita se- quência polipeptídica compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 35 ou SEQ ID NO. 44 São fornecidos ácidos nucleicos correspondentes (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, célu- las citocóticas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresenta- doras de antígeno e exossomas como descrito supra. Os ditos ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de célu- las T, células citotóxicas, polipeptídeos de ligação ao antígeno, células apresentadoras de antígeno e exossomas podem ser usados no tra- tamento de câncer, especialmente melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo ou melanoma uveal. Métodos relacionados de diagnóstico são também fornecidos.

[00343] Em uma modalidade, o polipeptídeo do antígeno de CLT compreende ou consiste na SEQ ID NO. 5. Fragmentos exemplificati- vos compreendem ou consistem em qualquer uma das SEQ ID NOs. 20 a 22. Ácidos nucleicos exemplificativos que codificam a dita se- quência polipeptídica compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 36 ou SEQ ID NO. 45 São fornecidos ácidos nucleicos correspondentes (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, célu-

las citocóticas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresenta- doras de antígeno e exossomas como descrito supra. Os ditos ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de célu- las T, células citotóxicas, polipeptídeos de ligação ao antígeno, células apresentadoras de antígeno e exossomas podem ser usados no tra- tamento de câncer, especialmente melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo ou melanoma uveal. Métodos relacionados de operação tam- bém são providos.

[00344] Em uma modalidade, o polipeptídeo do antígeno de CLT compreende ou consiste na SEQ ID NO. 6. Fragmentos exemplificati- vos compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 23 ou SEQ ID NO. 24, Ácidos nucleicos exemplificativos que codificam a dita sequência polipeptídica compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 37 ou SEQ ID NO. 46 São fornecidos ácidos nucleicos correspondentes (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, células citocóticas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresentado- ras de antígeno e exossomas como descrito supra. Os ditos ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de célu- las T, células citotóxicas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresentadoras de antígeno e exossomas podem ser usados no tra- tamento de câncer, especialmente melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo. Métodos relacionados de operação também são providos.

[00345] Em uma modalidade, o polipeptídeo do antígeno de CLT compreende ou consiste na SEQ ID NO. 7. Fragmentos exemplificati- vos compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 25 Ácidos nucleicos exemplificativos que codificam a dita sequência polipeptídica compre- endem ou consistem na SEQ ID NO. 38 ou SEQ ID NO. 47 São forne- cidos ácidos nucleicos correspondentes (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, células citocóticas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresentadoras de antígeno e exosso-

mas como descrito supra. Os ditos ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, células citotóxicas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresentadoras de antí- geno e exossomas podem ser usados no tratamento de câncer, espe- cialmente melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo. Métodos rela- cionados de diagnóstico são também fornecidos.

[00346] Em uma modalidade, o polipeptídeo do antígeno de CLT compreende ou consiste na SEQ ID NO. 8. Fragmentos exemplificati- vos compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 26 Ácidos nucleicos exemplificativos que codificam a dita sequência polipeptídica compre- endem ou consistem na SEQ ID NO. 38 ou SEQ ID NO. 48 São forne- cidos ácidos nucleicos correspondentes (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, células citocóticas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresentadoras de antígeno e exosso- mas como descrito supra. Os ditos ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, células citotóxicas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresentadoras de antí- geno e exossomas podem ser usados no tratamento de câncer, espe- cialmente melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo. Métodos rela- cionados de operação também são providos.

[00347] Em uma modalidade, o polipeptídeo do antígeno de CLT compreende ou consiste em SEQ ID NO. 9. Fragmentos exemplificati- vos compreendem ou consistem em qualquer uma das SEQ ID NOs. 27 a 29. Ácidos nucleicos exemplificativos que codificam a dita se- quência polipeptídica compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 39 ou SEQ ID NO. 49. São fornecidos ácidos nucléicos correspondentes (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, célu- las citotóxicas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresenta- doras de antígeno e exossomas conforme descrito supra. Os ditos áci- dos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, células citotóxicas, polipeptídeos de ligação a antígeno, cé- lulas apresentadoras de antígeno e exossomas podem ser usados no tratamento de câncer, especialmente melanoma, por exemplo, mela- noma cutâneo. Métodos relacionados de diagnóstico são também for- necidos.

[00348] Em uma modalidade, o polipeptídeo do antígeno de CLT compreende ou consiste na SEQ ID NO. 10 Fragmentos exemplificati- vos compreendem ou consistem em qualquer uma das SEQ ID NOs. 30 a 32. Ácidos nucleicos exemplificativos que codificam a dita se- quência polipeptídica compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 40 ou SEQ ID NO. 50 São fornecidos ácidos nucleicos correspondentes (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de células T, célu- las citocóticas, polipeptídeos de ligação a antígeno, células apresenta- doras de antígeno e exossomas como descrito supra. Os ditos ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA), células T, populações de célu- las T, células citotóxicas, polipeptídeos de ligação ao antígeno, células apresentadoras de antígeno e exossomas podem ser usados no tra- tamento de câncer, especialmente melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo ou melanoma uveal. Métodos relacionados de diagnóstico são também fornecidos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 - IDENTIFICAÇÃO CLT

[00349] O objetivo era identificar transcritos específicos do câncer que consistem total ou parcialmente em elementos LTR.

[00350] Como uma primeira etapa, foi montado de novo um trans- criptoma abrangente de pan-cancer. Para conseguir isso, o sequenci- amento de RNA lê a partir de 768 amostras de pacientes, obtidas do consórcio The Cancer Genome Atlas (TCGA) e que representam uma ampla variedade de tipos de câncer (24 amostras equilibradas por gê- nero de cada um dos 32 tipos de câncer (31 melanomas primários e 1 metastático); Tabela S1), foram usados para montagem guiada por genoma.

As amostras equilibradas por gênero (excluindo tecidos es- pecíficos de gênero) foram ordenadas em adaptadores e qualidade (Q20) e filtradas por comprimento (ambas as leituras do par ≥35 nu- cleotídeos) usando cutadapt (v1.13) (Marcel M., 2011, EMBnet J., 17:3) e normalizadas por khmer (k = 20) usando khmer (v2.0) (Crusoe et al., 2015, F1000Res., 4: 900) para profundidades máximas e míni- mas de 200 e 3, respectivamente.

As leituras foram mapeadas para GRCh38 usando STAR (2.5.2b) com configurações idênticas às usa- das em TCGA e passadas para Trinity (v2.2.0) (Trinity, Grabherr, MG, et al., 2011, Nat.

Biotechnol., 29: 644 -52) para uma montagem guiada por genoma com normalização de profundidade in silico embutida de- sativada.

A maioria dos processos de montagem foi concluída com 256 GB de RAM em nós HPC de 32 núcleos, com processos com fa- lha executados novamente usando nós de 1,5 TB de RAM.

Os contigs resultantes foram ordenados em poli (A) (trimpoly em SeqClean v110222) e filtrados por entropia (≥0,7) para remover contigs de baixa qualidade e artefatuais (bbduk em BBMap v36.2). Por tipo de câncer, as 24 amostras originais foram quase mapeadas para a montagem limpa usando Salmon (v0.8.2 ou v0.9.2) (Patro, R., et al., 2017, Nat.

Methods, 14:417-419), com contigs encontrados expressos em <0,1 transcrito por milhão (TPM) sendo removidos.

Os restantes foram ma- peados para GRCh38 usando GMAP (v161107) (Wu et al., 2005, Bioinf., 21: 1.859-1.875), e contigs não alinhados com ≥85% de identi- dade acima de ≥85% de seu comprimento foram removidos da monta- gem.

Finalmente, os conjuntos para todos os tipos de câncer juntos foram achatados e mesclados nos transcritos contínuos mais longos usando gffread (Cufflinks v2.2.1) (Trapnell et al., 2010, Nat.

Biotech., 28: 511-515). Como esse processo de montagem foi projetado especi- ficamente para permitir a avaliação de elementos repetitivos, os trans-

critos monoexônicos foram mantidos, porém sinalizados. A integridade e a qualidade da montagem dos transcritos foram avaliadas por com- paração com GENCODE v24basic e MiTranscriptome1 (Iyer et al. 2015, Nat. Genet., 47: 199-208). Foi compilada a lista de sítios de spli- cing exclusivos representados no GENCODE e a presença de sítio de splicing na montagem do transcriptoma foi testada em uma janela de 2 nucleotídeos. Esse processo resultou na identificação de 1.001.931 transcritos, 771.006 dos quais foram submetidos a splicing e 230.925 monoexônicos.

[00351] Separadamente, os contigs montados foram sobrepostos com uma anotação de sequência de repetição genômica para identifi- car transcritos que contêm um elemento LTR. Elementos LTR e não LTR foram anotados conforme descrito anteriormente (Attig et al., 2017, Front. Em Microbiol., 8: 2489). Brevemente, modelos de Markov ocultos (HMMs) representando famílias de repetições humanas co- nhecidas (biblioteca Dfam 2.0 v150923) foram usados para anotar GRCh38 usando RepeatMasker Open-3.0 (Smit, A., R. Hubley, e P. Green, http://www.repeatmasker.org, 1.996-2.010), configurado com nhmmer (Wheeler et al., 2013, Bioinform., 29:2.487-2.489). A varredu- ra baseada em HMM aumenta a precisão da anotação em compara- ção com métodos baseados em BLAST (Hubley et al., 2016, Nuc. Acid. Res., 44: 81-89). RepeatMasker anota LTR e regiões internas separadamente, portanto, as saídas tabulares foram analisadas para mesclar anotações adjacentes para o mesmo elemento. Este processo rendeu 181.967 transcritos que continham um ou mais elementos LTR completos ou parciais.

[00352] Os transcritos por milhão (TPM) foram estimados para to- dos os transcritos usando Salmon e a expressão dentro de cada tipo de câncer foi comparada com a expressão em 811 amostras de tecido saudável (controles correspondentes de tecido saudável para todos os tipos de câncer, quando disponíveis, de TCGA e, separadamente, de GTEx (The Genotype-Tissue Expression Consortium, 2015, Science, 348: 648-60). Os transcritos foram considerados expressos especifi- camente em câncer se detectados em mais de 1 TPM em qualquer amostra e como específicos de câncer se os seguintes critérios fos- sem cumpridos: i, expressos em ≥6 das 24 amostras de cada tipo de câncer; ii, expressos a <10 TPM em ≥90% de todas as amostras de tecido saudável; iii, expressos no tipo de câncer de interesse ≥3 × a expressão mediana em qualquer tipo de tecido de controle; e iv, ex- pressos no tipo de câncer de interesse ≥3 × o percentil 90 do respecti- vo tecido saudável, quando disponível. Além desses limites de expres- são, a seleção de transcritos foi baseada na inspeção manual, exclu- indo contigs potencialmente mal montados ou transcritos com elemen- tos LTR em suas regiões 3 ‘não traduzidas (UTRs). Quando a direção da transcrição não pôde ser inequivocamente atribuída, os transcritos correspondentes a ambas as fitas foram considerados.

[00353] A lista de transcritos específicos de câncer foi, então, cru- zada com a lista de transcritos contendo elementos LTR completos ou parciais para produzir uma lista de 5.923 transcritos que cumpriram os dois critérios (chamados de CLTs para Transcritos T que abrangem elementos LTR específicos de Câncer).

[00354] Para identificar CLTs com potencial de codificação de pro- teína, foi executado um algoritmo de predição de ORF, com base no comprimento e adequação das pontuações de dicódons (hexâmero). Um HMM foi treinado em hexâmeros derivados de sequências En- sembl CDS e ORFs ≥300 nucleotídeos foram desenvolvidos, em que sua pontuação de hexâmero senso excedeu a pontuação antissenso. Este filtro identificou 885 CLTs que codificam potencialmente uma pro- teína de pelo menos 99 aminoácidos de comprimento.

[00355] Para identificar sequências de proteínas exclusivas poten-

cialmente codificadas por CLTs, as sequências traduzidas do maior ORF de CLTs selecionados foram consultadas contra aquelas traduzi- das de todos os ORFs ≥210 nucleotídeos de toda a montagem do transcrito usando tblastn (BLAST + v2.3.0) sem soft-maskin. Apenas CLTs sem resultados ou com resultados com um valor E> 10-5 foram retidos.

[00356] Para garantir ainda mais a especificidade dos antígenos específicos de câncer codificados por CLTs, foi examinado sua poten- cial reatividade cruzada com outras proteínas que podem ser expres- sas em tecido saudável. Para este fim, ORFs traduzidos com <85% de identidade de sequência de aminoácidos (ao longo de todo o compri- mento da proteína) com qualquer outra proteína prevista foram retidos. Para as proteínas codificadas por CLT que mostram> 85% de identi- dade de sequência com uma ou mais proteínas previstas, foi interro- gado o padrão de expressão dos transcritos que codificam as proteí- nas similares. Quando esses transcritos adicionais também foram ex- pressos de maneira específica de câncer (com base nos critérios lista- dos acima), o respectivo CLT foi retido na lista de candidatos selecio- nados. Quando os transcritos adicionais também foram expressos em tecido saudável, o respectivo CLT foi descartado. A combinação des- ses critérios de seleção rendeu uma lista final de 139 CLTs com po- tencial para codificar proteínas com sequência de aminoácidos sufici- entemente exclusiva.

[00357] Desses 139 CLTs, 14 eram específicos para melanoma cu- tâneo (ou seja, foram encontrados para serem regulados crescente- mente em amostras de melanoma cutâneo no TGCA de acordo com a metodologia acima) e 7 eram específicos para melanoma cutâneo e melanoma uveal (ou seja, foram encontrados para serem regulado de- crescentemente especificamente em amostras de melanoma cutâneo e melanoma uveal em TGCA de acordo com a metodologia acima).

Quatro desses CLTs específicos para melanoma cutâneo são identifi- cados no presente documento como tendo a SEQ ID NO. 34, 37, 38 e

39. Quatro desses CLTs específicos para melanoma cutâneo e mela- noma uveal são identificados no presente documento como tendo a SEQ ID NOs. 33, 35, 36 e 40. EXEMPLO 2 - ANÁLISE IMUNOPEPTIDÔMICA

[00358] A análise imunopeptidômica é uma tecnologia poderosa que permite a detecção direta de peptídeos específicos associados a moléculas HLA em células ou tecidos. A técnica consiste na purifica- ção por afinidade de moléculas HLA de amostras biológicas e, então, eluição de peptídeos ligados das moléculas HLA e avaliação dos pep- tídeos por espectrometria de massa de cromatografia líquida de de- sempenho nano-ultra (nUPLC-MS2) (Freudenmann et al., 2018, Immu- nology 154 (3): 331-345). Os espectros de espectrometria de massa (MS) produzidos por este método podem ser usados para identificar precisamente os peptídeos curtos que estão ligados às moléculas HLA Classe I e HLA Classe II. O software usado para interpretação espec- tral e identificação de sequência depende da disponibilidade de uma lista predefinida de sequências de proteínas para correspondência es- pectral. Embora seja possível pesquisar dados de MS usando listas predefinidas correspondentes a todos os quadros de leitura aberta (ORFs) derivados do transcriptoma conhecido ou mesmo de todo o genoma (Nesvizhskii et al., 2014, Nat. Methods 11: 1.114-1.125), inter- rogar esses bancos de dados de sequência muito grandes leva a taxas de constatação falsa muito altas que limitam a identificação dos peptí- deos apresentados. Outras questões técnicas (por exemplo, massa de leucina = massa de isoleucina) e questões teóricas (por exemplo, spli- cing de peptídeo (Liepe, et al., 2016, Science 354(6310): 354-358)) aumentam as limitações associadas ao uso de bancos de dados muito grandes, como aqueles produzidos a partir do transcriptoma conhecido ou do genoma inteiro. Assim, na prática, é excepcionalmente difícil realizar análises de imunopeptidômicos para identificar antígenos ino- vadores sem referência a um conjunto bem definido de sequências polipeptídicas potenciais.

[00359] Bassani-Sternberg et al. (Bassani-Sternberg et al., 2016, Nature Commun., 7: 13404) interrogou dados de MS coletados de amostras de peptídeos ligados a HLA derivadas de 25 pacientes com melanoma cutâneo contra os polipeptídeos relatados para todo o pro- teoma humano. Essas análises revelaram centenas de milhares de peptídeos correspondentes a proteínas humanas conhecidas. Como esperado, esses peptídeos incluíram peptídeos encontrados em vários antígenos associados a tumores (TAA), incluindo PRAME, MAGEA3 e TRPM1 (melastatina). Além disso, os dados de MS de 5 desses paci- entes foram interrogados com uma lista de polipeptídeos criada a partir de sequências de proteínas mutadas específicas do paciente detecta- das por análises genômicas desses 5 pacientes, revelando neoantíge- nos específicos do paciente apresentados nas moléculas HLA Classe I e HLA Classe II desses pacientes.

[00360] Muitas das sequências polipeptídicas previstas (ORFs) de- rivadas dos 139 CLTs referidos no Exemplo 1 não estão contidas no proteoma humano. Com a aplicação do conhecimento detalhado da avaliação imunopeptidômica, os inventores interrogaram os arquivos de dados RAW de Bassani-Sternberg et al. (link do banco de dados: https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD004894) com este conjunto de potenciais sequências de antígeno de CLT inovadoras.

[00361] Para realizar esta análise, as sequências de peptídeos de todos os ORFs possíveis codificados por cada CLT foram concatena- das em um único arquivo de peptídeo para cada CLT, ou não, e esses arquivos concatenados (análise A) ou arquivos de peptídeo único (análise B) foram usados para interrogar os espectros brutos no con-

junto de dados PXD004894, junto com todos os polipeptídeos encon- trados no proteoma humano (UniProt (análise A) ou UniProt e masDB (análise B)), usando o software PeaksTM (análise A) ou o software Mascot (análise B).

[00362] Na análise A, os resultados desses estudos identificaram 14 peptídeos que estavam associados às moléculas HLA de Classe I imunoprecipitadas de amostras de tumor de 25 pacientes examinados por Bassani-Sternberg et al., O que pode ser atribuído a 8 ORFs que não foram encontrados no proteoma relatado (consultar Tabela 1). Na análise B, os resultados desses estudos identificaram 14 peptídeos que estavam associados às moléculas HLA Classe I ou moléculas HLA Classe II imunoprecipitadas de amostras de tumor de 25 pacien- tes examinados por Bassani-Sternberg et al., que podem ser atribuí- dos a 7 ORFs que não foram encontrados no proteoma relatado (con- sultar Tabela 2). A detecção desses peptídeos associados às molécu- las HLA Classe I e HLA Classe II dos pacientes citados confirma que os 10 ORFs dos quais os mesmos foram derivados (Tabelas 1 e 2, SEQ ID NOs. 1 a 10) foram traduzidos em tecido de melanoma e apresentado ao sistema imunológico complexado com moléculas HLA Classe I ou HLA Classe II. Com base nisso, os polipeptídeos codifica- dos por esses ORFs foram definidos como antígenos CLT. As tabelas 1 e 2 mostram as propriedades dos peptídeos encontrados nos antí- genos CLT que não estavam no banco de dados UniProt. As Figuras 1 a 32 mostram espectros de espectrometria de massa representativos de cada um dos peptídeos mostrados na Tabela 1 e Tabela 2. As figu- ras mostram espectros de fragmentos para sequências de peptídeos indicadas conforme detectado em tumores SKCM de pacientes indivi- duais por nUPLC-MS2 (de Bassani-Sternberg et al .; imagem extraída do conjunto de dados PRIDE pelo software PEAKS). Todos os frag- mentos que foram detectados são indicados na sequência de peptídeo acima do espectro e os íons de fragmento mais abundantes são atribu- ídos em cada espectro. Nas Figuras 1 a 15, 29 a 32 (análise A), o pai- nel inferior das figuras ilustra a anotação de sequência para um espec- tro previsto, enquanto dados similares são mostrados na forma tabular no lado direito das Figuras 16 a 28 (análise B) . Os íons de fragmento são anotados da seguinte forma: b: íon de fragmento N-terminal; y: íon fragmento C-terminal; -H2O: perda de água; -NH3: perda de amônia; [2+]: íon peptídico duplamente carregado; pré: íon peptídico precursor não fragmentado.

[00363] Uma série de peptídeos detectados em associação com HLA Classe I das Tabelas 1 e 2 foram avaliados para determinar a for- ça prevista de ligação a supertipos de HLA Classe I. Especificamente, todos os peptídeos associados a HLA Classe I mencionados na Tabe- la 3 que tinham 9 aminoácidos ou mais de comprimento foram interro- gados usando o software de previsão NetMHC 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) para prever sua ligação a supertipos de HLA Classe I tipo A e B. Os resultados desses estudos de previsão mostraram que todos os 11 peptídeos (ou 9-mers deriva- dos dos mesmos) foram previstos para se ligar a pelo menos um dos supertipos testados (consultar Tabela 3). Entre esses, muitas das se- quências foram previstas para se ligar com alta confiança (escores de classificação de % baixa) a tipos específicos dentro dos supertipos de HLA Classe I examinados.

[00364] Tomados em conjunto, os dados mostrados nas Tabelas 1 a 3 e Figuras 1 a 32 fornecem um suporte excepcionalmente forte para a apresentação dos antígenos CLT correspondentes em pacientes com melanoma.

[00365] Em suma: a identificação de peptídeos imunopeptidômicos derivados das ORFs previstas, demonstra que esses CLTs são tradu- zidos em polipeptídeos (SEQ ID NOs. 1 a 10; chamados de antígenos

CLT) no tecido tumoral.

Esses são, então, processados pelo aparelho de vigilância imunológica das células e carregados em moléculas de HLA Classe I ou HLA Classe II, permitindo que a célula seja alvejada para citólise por células T que reconhecem os complexos de peptí- deo/HLA Classe I ou peptídeo/HLA Classe II resultantes.

Assim, espe- ra-se que esses antígenos CLT e fragmentos dos mesmos sejam úteis em uma variedade de modalidades terapêuticas para o tratamento de melanoma em pacientes cujos tumores expressam esses antígenos.

TABELA 1: LISTA DE PEPTÍDEOS IDENTIFICADOS POR ANÁLISES IMUNOPEPTIDÔMICAS (ANÁLISE A) DE AMOSTRAS DE TUMOR SKCM, JUNTAMENTE COM O NOME DO ANTÍGENO DE CLT E REFERÊNCIA CRUZA- DA PARA SEQ ID NOS.

Sequências de Peptídeo SEQ ID Nº do an- Antígeno de CLT Pacien- Massa de Compri- Área4 # de Ppm6 Peptídeos1 No. tígeno de SEQ ID NO. te #2 peptídeo3 mento de espec- CLT peptídeo tros5 VQQGWFFPR SEQ ID NO. 11 1 SEQ ID NO. 1 Mel-3 1163,59 9 350.000 1 9,4 VVRGGAGFAAR SEQ ID NO. 12 1 SEQ ID NO. 1 Mel-3 1059,59 11 3.970.000 8 5,1 HLADRKLSL SEQ ID NO. 13 1 SEQ ID NO. 1 Mel-5 1051,61 9 125.000.000 2 -1,1 HLADRKLSL SEQ ID NO. 13 1 SEQ ID NO. 1 Mel-16 1051,61 9 3.290.000 30 5,1 ADSLILDF SEQ ID NO. 15 2 SEQ ID NO. 2 Mel-26 892,45 8 83.300 1 0,9 SSFSTLASLDK SEQ ID NO:16 2 SEQ ID NO. 2 Mel-20 1154,58 11 860.000 2 -6,7

97/146 NTPNIVSLR SEQ ID NO. 17 3 SEQ ID NO. 3 Mel-35 1012,57 9 4.690.000 2 3,8 KTKGSLSVFR SEQ ID NO. 19 4 SEQ ID NO: 4 Mel-3 1121,66 10 1.200.000 3 4,8 AAFDRAVHF SEQ ID NO:51 4 SEQ ID NO. 4 Mel-40 1032,51 9 227.000 1 0,3 AAFDRAVHF SEQ ID NO:51 4 SEQ ID NO: 4 Mel-41 1032,514 9 8.700.000 3 7,8 AFDRAVHF SEQ ID NO: 52 4 SEQ ID NO: 4 Mel-27 961,4769 8 1.240.000 3 7,9 AFDRAVHF SEQ ID NO: 52 4 SEQ ID NO. 4 Mel-39 961,47 8 1.940.000 3 2,6 DIPIKPW SEQ ID NO. 21 5 SEQ ID NO: 5 Mel-5 867,49 7 1.280.000 5 5,3 DIPIKPW SEQ ID NO. 21 5 SEQ ID NO. 5 Mel-27 867,49 7 1.790.000 6 9,1 RVADIPIKPW SEQ ID NO. 20 5 SEQ ID NO. 5 Mel-5 1193,69 10 8.710.000 4 4,7 RVADIPIKPW SEQ ID NO. 20 5 SEQ ID NO. 5 Mel-27 1193,69 10 82.000.000 6 9,8 RVADIPIKP SEQ ID NO:22 5 SEQ ID NO. 5 Mel-27 1007,61 9 30.300.000 6 8 RSRDNFAVW SEQ ID NO. 23 6 SEQ ID NO. 6 Mel-21 1149,57 9 21.900.000 4 8,5 RSRDNFAVW SEQ ID NO. 23 6 SEQ ID NO. 6 Mel-27 1149,57 9 19.800.000 6 7,8 RSRDNFA SEQ ID NO. 24 6 SEQ ID NO. 6 Mel-21 864,42 7 41.000.000 3 8,8 RSRDNFA SEQ ID NO. 24 6 SEQ ID NO. 6 Mel-27 864,42 7 2.550.000 3 7,9

Sequências de Peptídeo SEQ ID Nº do an- Antígeno de CLT Pacien- Massa de Compri- Área4 # de Ppm6 Peptídeos1 No. tígeno de SEQ ID NO. te #2 peptídeo3 mento de espec- CLT peptídeo tros5 SPGISLVF SEQ ID NO. 25 7 SEQ ID NO. 7 Mel-16 818,45 8 546.000 1 8,3 SSDSTILVL SEQ ID NO. 26 8 SEQ ID NO. 8 Mel-41 933,50 9 63.600 1 13,1 1 Peptídeo identificado por espectrometria de massa. Todos os peptídeos são peptídeos de HLA Classe I. 2 Bassani-Sternberg et al, 2016, Nature Comm., 7: 13404 3 Massa calculada do peptídeo. 4 Área do programa PeaksTM do espectro de massa; os valores de área selecionados são mostrados para os peptídeos para os quais mais de um espectro foi obtido. 5 Número de espectros nos quais o peptídeo foi detectado. 6 Desvio entre a massa observada e a massa calculada; os valores de ppm selecionados são mostrados para os pep- tídeos para os quais mais de um espectro foi obtido.

98/146

TABELA 2: LISTA DE PEPTÍDEOS IDENTIFICADOS POR ANÁLISES IMUNOPEPTIDÔMICAS (ANÁLISE B) DE AMOSTRAS DE TUMOR SKCM, JUNTAMENTE COM O NOME DO ANTÍGENO DE CLT E REFERÊNCIA CRUZA- DA PARA SEQ ID NOS.

Sequências de Peptídeo SEQ Nº do antíge- Antígeno de CLT Pacien- Massa de Comprimento # de es- Massa Del- Peptídeos1 ID No. no de CLT SEQ ID NO. te #2 peptídeo3 de peptídeo pectros4 ta5 HLADRKLSL SEQ ID NO. 13 1 SEQ ID NO. 1 Mel-16 1051,61 9 3 0,01015 VVRGGAGFAAR SEQ ID NO. 12 1 SEQ ID NO. 1 Mel-3 1059,59 11 1 0,001564 ARLQGSVTL SEQ ID NO:14 1 SEQ ID NO. 1 Mel-5 985,56 9 1 0,007816 SSFSTLASLDK SEQ ID NO. 16 2 SEQ ID NO. 2 Mel-20 1154,58 11 2 0,004607 QPEVGIIPSVLLMRP* SEQ ID NO. 18 3 SEQ ID NO. 3 Mel-18 1743,90 15 1 -0,052238 KTKGSLSVFR SEQ ID NO. 19 4 SEQ ID NO. 4 Mel-3 1121,66 10 2 0,005258 RVADIPIKPW SEQ ID NO 20 5 SEQ ID NO 5 Mel-4 1193,69 10 1 0,009444

99/146 RVADIPIKPW SEQ ID NO 20 5 SEQ ID NO 5 Mel-5 1193,69 10 1 0,00549 DIPIKPW SEQ ID NO 21 5 SEQ ID NO 5 Mel-4 867,49 7 1 0,008214 AGRMSKSLVIK SEQ ID NO 27 9 SEQ ID NO 9 Mel-15 1188,70 11 3 -0,000087 PQSAGRM SEQ ID NO 28 9 SEQ ID NO 9 Mel-6 745,35 7 1 0,007525 AGSQSSSFTRGHTG SEQ ID NO 29 9 SEQ ID NO 9 Mel-10 1875,83 18 1 0,04998 ETPQ* RSNLSIFL SEQ ID NO 30 10 SEQ ID NO 10 Mel-4 990,55 8 2 -0,005184 FSLCLFTL SEQ ID NO 31 10 SEQ ID NO 10 Mel-18 942,49 8 1 -0,000214 FSLCLFTL SEQ ID NO 31 10 SEQ ID NO 10 Mel-15 942,49 8 13 -0,0026 SRRVFSRFSYMTFYS SEQ ID NO 32 10 SEQ ID NO 10 Mel-7 3370,48 24 1 0,006099 FRSYIKVFV* 1 Peptídeo identificado por espectrometria de massa.

Todos os peptídeos são peptídeos de HLA Classe I, a menos que indicado com um * (quais são HLA Classe II) 2 Bassani-Sternberg et al, 2016, Nature Comm., 7: 13404 3 Massa de peptídeo calculada.

Número de espectros nos quais o peptídeo foi detectado. 5 Diferença entre a massa observada e a massa calculada; os valores de Delta de massa selecionados são mostrados para peptídeos para os quais mais de um espectro foi obtido. * indica um peptídeo de HLA Classe II

TABELA 3: LIGAÇÃO PREVISTA DE NETMHC 4.0 DE PEPTÍDEOS IDENTIFICADOS POR ESPECTROMETRIA DE MASSA (COMPRIMENTO > 9 RESÍDUOS) PARA 12 ALELOS DE SUPERTIPO DE HLA CLASSE I (HLA-A0101, HLA-A0201, HLA-A0301, HLA-A2402, HLA-A2601, HLA-B0702, HLA-B0801, HLA-B1501, HLA-B2705, HLA-B3901, HLA-B4001, HLA-B5801), JUNTAMENTE COM O NOME DE ANTÍGENO DE CLT E REFERÊNCIA CRUZADA A SEQ ID NOS.

Previsto para ligar Sequências de Pep- Número de ale- Número de ale- Peptídeo SEQ Nº de An- Paciente #4 12 supertipos tídeos los com uma los com uma ID NO tígeno de

100/146 humanos de HLA pontuação de pontuação de CLT 1 Classe IA e B classificação de classificação de <5,1%2 <2,1%3 SIM VQQGWFFPR 2/12 1/12 SEQ ID NO. 11 1 Mel-3 SIM VVRGGFAGFAAR 3/12 0 SEQ ID NO. 12 1 Mel-3 SIM HLADRKLSL 6/12 3/12 SEQ ID NO. 13 1 Mel-5/Mel-16 SIM ARLQGSVTL 7/12 3/12 SEQ ID NO. 14 1 Mel-5 SIM SSFSTLASLDK 7/12 3/12 SEQ ID NO. 16 2 Mel-20 SIM NTPNIVSLR 1/12 1/12 SEQ ID NO. 17 3 Mel-35 SIM KTKGSLSVFR 4/12 2/12 SEQ ID NO. 19 4 Mel-3 SIM AAFDRAVHF 12/12 6/12 SEQ ID NO:51 4 Mel-40/Mel-41 SIM RVADIPIKPW 1/12 1/12 SEQ ID NO:20 5 Mel-4/Mel- 5/Mel-27

Previsto para ligar Sequências de Pep- Número de ale- Número de ale- Peptídeo SEQ Nº de An- Paciente #4 12 supertipos tídeos los com uma los com uma ID NO tígeno de humanos de HLA pontuação de pontuação de CLT 1 Classe IA e B classificação de classificação de <5,1%2 <2,1%3 SIM RVADIPIKP 0/12 0/12 SEQ ID NO. 22 5 Mel-27 SIM RSRDNFAVW 3/12 1/12 SEQ ID NO 23 6 Mel-21/Mel-27 SIM SSDSTILVL 2/12 1/12 SEQ ID NO. 26 8 Mel-41 SIM AGRMSKSLVIK 4/12 4/12 SEQ ID NO:27 9 Mel-15 1 Ligação prevista a supertipos de HLA Classe I interrogados em qualquer pontuação de Classificação. 2 Fração de supertipos de HLA Classe I que foram previstos para ligação a uma pontuação de classificação de <5,1%

101/146 (ligação fraca). 3 Fração de supertipos de HLA Classe I que foram previstos para ligação a uma pontuação de classificação de <2,1% (ligação mais forte). 4 Bassani-Sternberg et al, 2016, Nature Comm., 7: 13404

EXEMPLO 2.1 – ANÁLISE IMUNOPEPTIDÔMICA ADICIONAL

[00366] Além das análises descritas no Exemplo 2, os inventores também identificaram peptídeos derivados dos ORFs previstos por meio de novos estudos imunopeptidômicos. Esse trabalho adicional, descrito abaixo, demonstra ainda que esses CLTs são traduzidos em polipeptídeos do Antígeno de CLT em tecido tumoral.

[00367] Os inventores obtiveram tecido tumoral congelado de 10 pacientes diagnosticados com melanoma. Amostras entre 0,05 a 1 g foram homogeneizadas, o lisado foi centrifugado em alta velocidade e o lisado limpo foi misturado com microesferas de proteína A (ProA) ligadas covalentemente a um anticorpo monoclonal anti-HLA humano classe I (W6/32).A mistura foi incubada de um dia para o outro a 4 °C para melhorar a ligação da molécula de HLA Classe I ao anticorpo (Ternette et al., 2018 Proteomics 18, 1700465). Os peptídeos ligados ao HLA Classe I foram eluídos do anticorpo usando ácido acético a 10% e os peptídeos foram então separados de outros componentes de massa molecular elevada usando cromatografia em coluna de fase reversa (Ternette et al., 2018). Os peptídeos purificados e eluídos fo- ram submetidos a nUPLC-MS, e peptídeos específicos de razão carga para massa definida (m/z) foram selecionados dentro do espectrôme- tro de massa, isolados, fragmentados e submetidos a MS/MS para re- velar a m/z dos fragmentos de íons resultantes (Ternette et al., 2018), produzindo um conjunto de dados de MS/MS correspondente ao imu- nopeptidoma para cada uma dessas amostras de tumor.

[00368] Com a aplicação do conhecimento detalhado da avaliação imunopeptidômica, os inventores interrogaram os espectros do conjun- to de dados de HLA-Classe I para os 10 tumores de melanoma prepa- rados pelos inventores com os antígenos CLT nº 1, 2, 3 e 4 (Tabela 4; SEQ ID NOs. 1 a 4), que foram pesquisados (para cada CLT) em con- junto com todas as sequências polipeptídicas encontradas no prote-

oma humano (UniProt) usando o software PEAKSTM (v8.5 e vX, Bioin- formatics Solutions Inc). Uma vez que a maioria dos peptídeos ligados a HLA de Classe I encontrados em células são derivados de proteínas expressas constitutivamente, a interrogação simultânea desses ban- cos de dados com o proteoma UniProt ajuda a garantir que as atribui- ções das presentes sequências de ORF de CLT aos espectros MS/MS estejam corretas.

[00369] Os resultados desses estudos identificaram 8 peptídeos individuais (Tabela 4; SEQ ID NOs. 1 a 4) que foram associados às moléculas HLA de Classe I imunoprecipitadas de amostras de tumor das 10 amostras de pacientes de melanoma adquiridas pelos invento- res. Esses peptídeos correspondiam à sequência de aminoácidos dos ORFs derivadas de CLT e não correspondiam às sequências polipep- tídicas presentes no proteoma humano conhecido (UniProt). 2 de 8 peptídeos identificados a partir de antígenos de CLT SEQ ID NOs. 1 a 4 (Tabela 4) no conjunto de dados dos inventores, são além dos 10 peptídeos individuais (dos mesmos antígenos de CLT SEQ ID NOs. 1 a 4 descritos no Exemplo 2 e Tabelas 1 e 2) que foram associados às moléculas de HLA Classe I imunoprecipitadas de amostras de tumor de pacientes examinados por Bassani-Sternberg et al.

[00370] A detecção desses peptídeos associados às moléculas de HLA Classe I confirma que os 4 ORFs dos quais derivaram foram pri- meiro traduzidos em tecidos de melanoma, processados através da via HLA Classe I e finalmente apresentados ao sistema imunológico em um complexo com moléculas de HLA Classe I. A Tabela 4 mostra as propriedades dos peptídeos encontradas nos antígenos de CLT. As Figuras 33 a 42 mostram espectros de MS/MS representativos de ca- da um dos peptídeos mostrados na Tabela 4. O painel superior de ca- da uma dessas figuras mostra o perfil do fragmento de peptídeo MS/MS, com anotações de MS/MS padrão (b: íon de fragmento N-

terminal; y: íon de fragmento C-terminal; -H2O: perda de água; -NH3: perda de amônia; [2+]: íon de peptídeo duplamente carregado; pré: íon de peptídeo precursor não fragmentado; an-n: íon de fragmento inter- no) mostrado acima dos picos de íon de fragmento mais abundantes, em uma imagem extraída do conjunto de dados dos inventores pelo software PEAKS. O painel inferior de cada Figura mostra uma repre- sentação do espectro indicando as posições das sequências de peptí- deos lineares que foram mapeadas para os íons do fragmento. Com- patível com as altas pontuações de -10lgP atribuídas aos peptídeos na Tabela 4, esses espectros contêm vários fragmentos que correspon- dem precisamente às sequências dos peptídeos (SEQ ID NOs. 12, 13, 16, 17, 19, 51, 53 e 54) encontradas nessas análises.

[00371] Todos os peptídeos detectados em associação a HLA Classe I da Tabela 4 que tinham pelo menos 9AA de comprimento fo- ram avaliados para determinar sua força de ligação prevista aos super- tipos de HLA Classe I tipo A e B usando o software de previsão NetMHCpan 4,0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/) . Os resultados desses estudos de previsão mostraram que todos os peptí- deos (ou 9-mers contidos em cada sequência completa) foram previs- tos para se ligar a pelo menos um dos supertipos testados (consultar Tabela 5). Entre esses, muitas das sequências foram previstas para se ligar com alta confiança (pontuações de classificação de % baixa) a tipos específicos dentro dos supertipos de HLA Classe I examinados. O fato de que se esperava que todos os peptídeos detectados se li- gassem aos tipos de HLA que deveriam estar na população de pacien- tes é compatível com sua detecção. Além disso, cada peptídeo encon- trado em uma amostra de tumor do conjunto de dados dos inventores foi previsto pelo NetMHCpan 4.0 para se ligar a um dos tipos de HLA que foi detectado na amostra do paciente.

[00372] Para fornecer mais certeza da atribuição de espectros de

MS derivados de tecido tumoral às sequências de peptídeos encontra- das no Exemplo 2.1, os peptídeos com essas sequências encontradas foram sintetizados e submetidos a nUPLC-MS2 usando as mesmas condições aplicadas às amostras de tumor nos dados dos inventores. A comparação dos espectros para os peptídeos selecionados é mos- trada nas Figuras 43 a 50. Em cada figura, o espectro superior corres- ponde a uma amostra de tumor (de entre o banco de dados de tecido tumoral do inventor - Figuras 33 a 42) e o espectro inferior correspon- de ao peptídeo produzido sinteticamente da mesma sequência. Os va- lores de m/z selecionados de fragmentos de íons detectados são mos- trados acima/abaixo de cada pico de fragmento nesses espectros de MS/MS. Estas figuras revelam um alinhamento preciso de fragmentos (pequenas diferenças nos valores m/z determinados experimentalmen- te entre íons de fragmentos derivados de tumor e peptídeo sintético estando bem dentro das tolerâncias m/z de <0,05 Daltons), confirman- do a veracidade da atribuição de cada um dos espectros derivados de tecido tumoral aos peptídeos codificados por CLT.

[00373] Tomados em conjunto, os dados do peptídeo mostrados na Tabela 4, Figuras 33 a 42 e Figuras 43 a 50 fornecem suporte excep- cionalmente forte para a tradução, processamento e apresentação dos antígenos de CLT correspondentes em pacientes com melanoma.

[00374] Para confirmar adicionalmente a especificidade do câncer desses CLTs, os inventores processaram 37 amostras de tecido nor- mal (10 de pele normal, 9 de pulmão normal e 18 de tecido de mama normal) e prepararam para análise imunopeptidômica. Os inventores interrogaram os espectros do conjunto de dados de HLA-Classe I des- sas amostras de tecido normal, procurando todas as sequências de peptídeos possíveis derivadas das sequências polipeptídicas dos antí- genos de CLT nº 1, 2, 3 e 4. Nenhum peptídeo derivado dos antígenos de CLT nº 1, 2, 3 e 4 foi detectado no conjunto de amostras de tecido normal (Tabela 6), fornecendo confirmação adicional de que os CLTs têm expressão específica para câncer.

[00375] Em suma: essa identificação adicional de peptídeos imuno- peptidômicos derivados dos ORFs previstos, demonstra, ainda, que esses CLTs são traduzidos em polipeptídeos (SEQ ID NOs. 1 a 4; chamados de antígenos de CLT) no tecido tumoral. Assim, espera-se que esses antígenos CLT e fragmentos dos mesmos sejam úteis em uma variedade de modalidades terapêuticas para o tratamento de me- lanoma em pacientes cujos tumores expressam esses antígenos.

TABELA 4: LISTA DE PEPTÍDEOS IDENTIFICADOS POR ANÁLISES IMUNOPEPTIDÔMICAS ADICIONAIS DE AMOSTRAS DE TUMOR DE MELANOMA, JUNTAMENTE COM O NOME DO ANTÍGENO DE CLT E REFERÊNCIA CRUZADA A SEQ ID NOS.

Sequências de Peptídeo SEQ ID Nº de Ant. de CLT Paciente Massa de Comprimen- Área4 # de Ppm6 peptídeos1 NO.

Ant. de SEQ ID NO: #2 peptídeo3 to de peptí- espec- CLT deo tros5 HLADRKLSL SEQ ID NO. 13 1 SEQ ID NO. 1 2MT3 1051,61 9 154.000 2 -1,4 HLADRKLSL SEQ ID NO. 13 1 SEQ ID NO. 1 2MT10 1051,61 9 ND 1 3,4 VVRGGAGFAAR SEQ ID NO. 12 1 SEQ ID NO. 1 2MT3 1059,594 11 985.000 6 -0,9 SSFSTLASLDK SEQ ID NO. 16 2 SEQ ID NO. 2 2MT4 1154,582 11 559.000 1 0,9 NTPNIVSLR SEQ ID NO. 17 3 SEQ ID NO. 3 2MT3 1012,567 9 884.000 1 -2,8

107/146 RPLRIKGVF SEQ ID NO:53 3 SEQ ID NO. 3 1MT1 1084,6869 9 19.400.000 7 0 AAFDRAVHF SEQ ID NO:51 4 SEQ ID NO. 4 2MT3 1032,514 9 ND 1 -1,3 KTKGSLSVFR SEQ ID NO. 19 4 SEQ ID NO. 4 2MT3 1121,6556 10 10.100.000 6 -0,7 KTKGSLSVFR SEQ ID NO. 19 4 SEQ ID NO. 4 2MT1 1121,6556 10 10.100.000 2 -0,7 KTKGSLSVF SEQ ID NO: 54 4 SEQ ID NO. 4 2MT12 965,555 9 4.830.000 1 1,2 ND – Não determinado 1 Peptídeos de HLA Classe I identificados por espectrometria de massa. 2 Conjunto de dados dos inventores (1MT1, 1MT2, 1MT3, 2MT1, 2MT2, 2MT3, 2MT4, 2MT9, 2MT10, 2MT12). 3 Massa de peptídeo calculada. 4 Área de programa PeaksTM de espectro de massa; valores de Área selecionada são mostrados para peptídeos para os quais mais de um espectro foi obtido. 5 Número de espectros nos quais o peptídeo foi detectado. 6 Desvio entre massa observada e massa calculada; valores ppm selecionados são mostrados para peptídeos para os quais mais de um espectro foi obtido.

TABELA 5:LIGAÇÃOPREVISTA DE NETMHC 4.0 DE PEPTÍDEOS IDENTIFICADOS POR ESPECTROMETRIA DE MASSA (COMPRIMENTO>9 RESÍDUOS) A 12 ALELOS DE SUPERTIPO DE HLA CLASSE I (HLA-A0101, HLA- A0201, HLA-A0301, HLA-A2402, HLA-A2601, HLA-B0702 , HLA-B0801, HLA-B1501, HLA-B2705, HLA-B3901, HLA-B4001, HLA-B5801), JUNTAMENTE COM O NOME DO ANTÍGENO DE CLT E REFERÊNCIA CRUZADA A SEQ IDNOS.

Previsto para ligar Sequências de Número de alelos Número de alelos Peptídeo SEQ Nº de Paciente 12 supertipos Peptídeos com uma pontua- com uma pontua- ID NO Antíge- #4 humanos de HLA ção de classifica- ção de classifica- no de 1 2 3 Classe IA e B ção de <5,1% ção de <2,1% CLT SIM HLADRKLSL 6/12 3/12 SEQ ID NO. 13 1 2MT3 2MT10 SIM VVRGGFAGFAAR 3/12 0 SEQ ID NO. 12 1 2MT3

108/146 SIM SSFSTLASLDK 7/12 3/12 SEQ ID NO. 16 2 2MT4 SIM NTPNIVSLR 1/12 1/12 SEQ ID NO. 17 3 2MT3 SIM RPLRIKGVF 2/12 2/12 SEQ ID NO. 53 3 2MT1 SIM AAFDRAVHF 12/12 6/12 SEQ ID NO. 51 4 2MT3 SIM KTKGSLSVFR 4/12 2/12 SEQ ID NO. 19 4 2MT1 2MT3 SIM KTKGSLSVF 7/12 4/12 SEQ ID NO. 54 4 2MT12 1 Ligação prevista a supertipos de HLA Classe I interrogados em qualquer pontuação de Classificação. 2 Fração de supertipos de HLA Classe I que foram previstos para ligação a uma pontuação de classificação de <5,1% (ligação fraca). 3 Fração de supertipos de HLA Classe I que foram previstos para ligação a uma pontuação de classificação de <2,1% (ligação mais forte). 4 Banco de dados do inventor (1MT1, 1MT2, 1MT3, 2MT1, 2MT2, 2MT3, 2MT4, 2MT9, 2MT10, 2MT12).

TABELA 6 NÚMERO DE PEPTÍDEOS DERIVADOS DE ANTÍGENOS DE CLT 1 A 4 EM UM CONJUNTO DE AMOSTRAS DE TECIDO NORMAL.

Antígeno Pele Pulmão Mama Antígeno 1 de CLT 0/10 0/9 0/18 Antígeno 2 de CLT 0/10 0/9 0/18 Antígeno 3 de CLT 0/10 0/9 0/18 Antígeno de CLT 4 0/10 0/9 0/18

109/146

[00376] Os resultados apresentados aqui nos Exemplos 1, 2 e 2.1 são no total ou em parte baseados em dados gerados pela Cancer Genome Atlas (TCGA) Research Network (http://cancergenome.nih.gov/); e o Projeto Genotype-Tissue Expressi- on (GTEx) (apoiado pelo Common Fund of the Office of the Director of the National Institutes of Health, e por NCI, NHGRI, NHLBI, NIDA, NIMH e NINDS). EXEMPLO 3 - HERVFEST

[00377] A expansão funcional da tecnologia de células T específi- cas (FEST) foi usada para identificar epítopos derivados de tumores terapeuticamente relevantes presentes norepertório de "mutação- as- sociado ne oantígeno" (MANA) encontrado em células tumorais de pa- cientes com câncer com base na detecção de células T de pacientes que reagem a epítopos MANA (Anagnostou et al., Cancer Discovery 2017; Le et al., Science 2017; Forde et al., NEJM 2018; Danilova et al., Cancer Immunol. Res. 2018). A aplicação da tecnologia FEST a antí- genos de CLT encontrados com o uso dos métodos elucidados nos Exemplos 1, 2 & 2,1 (Tabelas 1 a 6, Figuras 1 a 50) pode ser usada para identificar respostas terapeuticamente relevantes de células T a antígenos de CLT em pacientes com câncer.

[00378] Como outros ensaios (por exemplo, ELISPOT) para identifi- car células T específicas do epítopo em um indivíduo que foi submeti- do à exposição imunológica, as tecnologias "FEST" derivam sua espe- cificidade ativando/expandindo as células T cognatas em culturas ex vivo que incluem células apresentadoras de antígeno e peptídeos anti- gênicos adequados. A técnica difere de outros ensaios imunológicos por utilizar sequenciamento de próxima geração do receptor de células T (TCR) sequências de DNA presentes nessas culturas amplificadas (especificamente: TCRseq direcionado à região TCR-Vβ CDR3) para detectar os TCRs específicos que são expandidos nas células cultiva-

das com peptídeos individuais de um painel de peptídeos alvo deriva- dos de um antígeno (ou antígenos). A aplicação de TCRseq a tecidos tumorais no mesmo paciente também pode ser usada para demonstrar se TCRs / células T detectadas no ex vivo, culturas estimuladas por peptídeos também estão presentes nos linfócitos infiltrantes de tumor encontrados em tecidos cancerígenos in situ. Assim, MANAFEST pro- vou ser uma tecnologia poderosa para identificar epítopos MANA que são reconhecidos por células T de pacientes, permitindo a identifica- ção de peptídeos MANA funcionalmente relevantes entre a multidão de peptídeos mutantes encontrados por sequenciamento de exoma total de tecidos normais e tumorais de pacientes com câncer (Le et al., Science 2017; Forde et al., NEJM 2018; Danilova et al., Cancer Immu- nol. Res. 2018; Smith et al., J Immunother Cancer 2019).

[00379] A aplicação da metodologia MANAFEST (Danilova et al., Cancer Immunol. Res. 2018) aos antígenos CLT foi realizada da se- guinte forma. O método, ao qual será feita referência como HER- VFEST, consiste nas seguintes etapas: Etapa 1: Os peptídeos previs- tos por conterem epítopos que se ligam de forma eficiente aos alelos de HLA Classe I selecionados foram identificados em Antígenos de CLT. Etapa 2: As CMSPs de pacientes com melanoma adequados fo- ram combinadas pelo tipo de HLA Classe I com a biblioteca de peptí- deos selecionada na etapa 1. Etapa 3: As CMSPs desses pacientes foram separadas em células T e frações de células não T. As células não T foram adicionadas de volta às células T do paciente e, então, divididas em 20 a 50 poços (contendo 250.000 células T por cultura) e propagadas com vários fatores de crescimento de células T e peptí- deos sintéticos derivados do Antígeno de CLT individuais (seleciona- dos na etapa 1/2) por 10 dias. Etapa 4: TCRseq (sequenciamento das sequências de CDR3 de TCR-Vβ) foi realizado em todos os poços, e as sequências de CDR3 de TCR-Vβ que foram amplificadas na pre-

sença de peptídeos derivados de Antígeno de CLT individuais (mas não amplificados na presença de peptídeos de controle ou na ausên- cia de estimulação de peptídeo) foram identificadas. A presença de sequências de CDR3 de TCR-Vβ amplificadas em poços individuais do ensaio identifica assim os peptídeos derivados do Antígeno de CLT que provocaram uma resposta imunológica no paciente com melano- ma. Etapa 5: TCRseq também pode ser realizado em amostras de tu- mor para determinar se as células T portadoras dos TCRs amplifica- dos por antígeno de CLT se alojaram em tumores do paciente, forne- cendo evidências adicionais de que as células T portadoras desses TCRs reconhecem os peptídeos derivados de Antígeno de CLT dentro do tumor de um paciente .

[00380] Os ensaios de HERVFEST foram realizados com peptídeos derivados dos antígenos 1 a 4 de CLT (SEQ ID NOs 1 a 4). O painel de peptídeos (consultar a etapa 1 acima) usado para esses estudos foi baseado nas previsões do NetMHC de peptídeos derivados de Antíge- no de CLT que foram previstos para se ligarem fortemente aos 8 tipos de HLA Classe I comumente encontrados em amostras de tumor de pacientes disponíveis para as presentes análises. Os peptídeos deri- vados de antígeno de CLT que amplificaram um ou mais TCRs nesses ensaios HERVFEST são fornecidos na Tabela 7. A Tabela 7 também indica o tipo (ou tipos) de HLA Classe I de peptídeos de antígeno de CLT que foram testados com as culturas derivadas de cada paciente de CMSP. O tipo de HLA Classe I dos pacientes cujas CMSPs foram testadas nesses estudos e amplificaram um ou mais TCRs nos ensai- os é mostrado na Tabela 8.

[00381] A Figura 51, painel A, mostra dados publicados que de- monstram a amplificação de TCR com peptídeos MANA específicos do paciente com NSCLC (Forde et al., NEJM 2018). O eixo vertical mostra a prevalência de cada sequência indicada de CDR3 de TCR-Vβ para poços de células cultivadas na presença de MANA ou peptídeos con- trole listados no eixo geométrico horizontal. A amplificação no poço contendo MANA7 indica que o repertório de células T do paciente in- clui células T que são reativas a esse peptídeo. Os painéis B e C da Figura 51 mostram dados de amplificação de TCR representativos de CMSPs de 2 pacientes com melanoma que foram incubados na pre- sença dos peptídeos do Antígeno de CLT indicados e peptídeos con- trole. Conforme com o Painel A, as amplificações específicas observa- das nos Painéis B e C demonstram que o repertório de células T des- ses pacientes com melanoma inclui células T que são reativas com peptídeos derivados do Antígeno de CLT específicos. O Painel B mos- tra a frequência de TCRs detectados no poço estimulado por LMSS- FSTLASL de CMSPs do paciente com melanoma 222B em todos os poços estimulados com o painel 15 de peptídeos de HLA Classe I A*02 dos antígenos 1, 2 e 4 de CLT. Três sequências de TCR foram amplificadas. LMSSFSTLASL (SEQ ID NO. 61) é um peptídeo de liga- ção a A*02 derivado do antígeno 2 de CLT. O painel C mostra a fre- quência de TCRs detectados no poço estimulado por MVACRIKTFR de CMSPs do paciente com melanoma 224B em todos os poços esti- mulados com o painel de 15 Peptídeos de HLA classe I A*02 dos antí- genos 1, 2 e 4 de CLT e 24 Peptídeos de HLA classe I A*03 dos antí- genos 1, 2, 3 e 4 de CLT. Uma sequência de TCR foi amplificada. MVACRIKTFR (SEQ ID NO. 64) é um peptídeo de ligação a A*03 deri- vado do Antígeno 2 de CLT.

[00382] Os peptídeos/condições de controle usados nesses expe- rimentos foram os seguintes: CEF = mistura de peptídeos de CMV, EBV e de influenza; SL9, TV9 e QK1 = peptídeos controle de HIV-1; sem peptídeo = cultivo na ausência de peptídeo; Linha de base = célu- las T antes da cultura.

[00383] A Figura 52 mostra um sumário de todos os peptídeos do

Antígeno de CLT para os Antígenos 1 a 4 de CLT que amplificaram um ou mais TCRs em estudos concluídos com esses pacientes. Cada pai- nel exibe as sequências de aminoácidos de Antígenos 1 a 4 de CLT sobrepostas aos peptídeos detectados por análises imunopeptidômi- cas (denotadas por texto sublinhado tracejado ou em negrito ; con- sultar Exemplos 2 e 2.1). Abaixo dessas sequências, os peptídeos de- tectados por HERVFEST (consultar Figura 51) são exibidos com o número do paciente com melanoma em que foram detectados (Tabela 8) e o tipo de HLA Classe I alvejado.

[00384] As propriedades de cada detecção HERVFEST são defini- das da seguinte forma: • Texto simples: Amplificação significativa de um único TCR • Texto em negrito: Amplificação significativa de vários TCRs • Texto sublinhado em itálico: Amplificação significativa de um único TCR que foi detectado em outros poços • Texto sublinhado em negrito: Amplificação significativa de vários TCRs, pelo menos um dos quais foi detectado em outros po- ços

[00385] Estes resultados fornecem fortes evidências de que os an- tígenos 1 a 4 de CLT estão presentes em pacientes com melanoma e que os peptídeos derivados desses antígenos de CLT provocaram respostas de células T específicas nesses pacientes com melanoma, confirmando o valor desses antígenos de CLT como alvos para inter- venções terapêuticas para tratar melanoma.

TABELA 7: PEPTÍDEOS DERIVADOS DO ANTÍGENO DE CLT QUE

AMPLIFICARAM UM OU MAIS TCRS EM ENSAIOS HERVFEST Antígeno SEQ ID NO Sequências de Tipo de HLA Referência de CLT Peptídeos Classe I para pep- do painel de Refe- tídeo (previsto por HERVFEST rência NetMHC) 1 SEQ ID NO.55 VPANTYNALK HLA-A*03:01 37 1 SEQ ID NO.56 RLGGCQAWWR HLA-A*03:01 41 1 SEQ ID NO.57 ANTYNALKSR HLA-A*11:01 60 1 SEQ ID NO.13 HLADRKLSL HLA-B*07:02 109 2 SEQ ID NO:58 LVTDMVACRI HLA-A*01:01 8 2 SEQ ID NO.59 LILDFQPLQL HLA-A*01:01 13 2 SEQ ID NO.60 MSSFSTLASL HLA-A*01:01 15 2 SEQ ID NO.59 LILDFQPLQL HLA-A*02:01 25 2 SEQ ID NO.61 LMSSFSTLASL HLA-A*02:01 27 2 SEQ ID NO.62 LMSSFSTLA HLA-A*02:01 23 2 SEQ ID NO.63 QLMSSFSTLA HLA-A*02:01 26 2 SEQ ID NO.64 MVACRIKTFR HLA-A*03:01 46 2 SEQ ID NO.16 SSFSTLASLDK HLA-A*03:01 45 2 SEQ ID NO.64 MVACRIKTFR HLA-A*11:01 67 2 SEQ ID NO.65 VTDMVACRIK HLA-A*11:01 69 2 SEQ ID NO.66 SPADSLIL HLA-B*07:02 119 2 SEQ ID NO.78 SLILDFQPL HLA-A*02:01 20 3 SEQ ID NO.67 NTPNIVSLRA HLA-A*01:01 18 3 SEQ ID NO.68 VLLMRPLRIK HLA-A*11:01 78 3 SEQ ID NO.69 MRPLRIKGVF HLA-B*07:02 124 4 SEQ ID NO.70 FLFLELWL HLA-A*02:01 30 4 SEQ ID NO.71 SVFRELHPA HLA-A*02:01 29 4 SEQ ID NO.72 SPPSSTAPL HLA-B*07:02 132

TABELA 8: CARACTERÍSTICAS DAS CMSPs DE PACIENTES COM

MELANOMA USADAS EM ENSAIOS HERVFEST Paciente Alelo A1 Alelo A2 Alelo B1 Alelo de Alelo C1 Alelo C2 HLA (ou de HLA de HLA de HLA HLA B2 de HLA de HLA HLAs) alve- jado em es- tudos HER-

VFEST 204B A*01:01 A*25:01 B*03:01 B*16:01 C*07:01 C*12:03 A*01 222B A*02:01 A*30:02 B*44:02 Não co- C*05:01 B*18:01 A*02 nhecido 224B A*02:01 A*03:01 B*35:01 B*40:02 C*04:01 C*02:02 A*02, A*03 293B A*02:01 A*30:01 B*13:02 B*44:02 C*06:02 C*05:01 A*02 254C A*11:01 A*32:01 B*15:01 B*56:01/ C*01:02 C*03:03 A*11 56:55 188B A*02:01 A*11:01 B8*7:02 B*14:02 C*07:02 C*08:02 A*11, B*07 271B A*01:01 A*01:01 B*08:01 B*08:01 C*07:01 C*07:01 A*01 225B A*02:01 A*03:01 B*07:02 B*51:01 C*07:02 C*14:02 A*03, B*07 EXEMPLO 4 - ENSAIOS PARA DEMONSTRAR CÉLULAS T DE AL- TA AFINIDADE ESPECÍFICAS PARA ANTÍGENOS CLT NÃO FO- RAM DELETADOS DO REPERTÓRIO DE CÉLULAS T DE INDIVÍ-

DUOS NORMAIS

[00386] Um ensaio ELISPOT pode ser usado para mostrar que as células T CD8 específicas do antígeno de CLT estão presentes no re- pertório de células T normais de indivíduos saudáveis e, portanto, não foram deletadas pela tolerância central devido à expressão de antíge- nos de CLT específicos do câncer em tecidos virgens e tímicos nesses pacientes. Esse tipo de ensaio ELISPOT compreende várias etapas. Etapa 1: células T CD8 e monócitos CD14 podem ser isolados do san- gue periférico de doadores de sangue normais, essas células são do tipo HLA para corresponder aos antígenos CLT específicos que estão sendo testados. As células T CD8 podem ser adicionalmente subdivi- didas em subtipos virgens e de memória usando anticorpos marcados magneticamente para o marcador de memória CD45RO. Etapa 2: Mo- nócitos CD14 são pulsados com peptídeos de antígeno de CLT indivi-

duais ou agrupados por três horas antes de serem co-cultivados com células T CD8 por 14 dias.

Etapa 3: Células T CD8 expandidas são isoladas dessas culturas e reestimuladas de um dia para o outro com monócitos frescos pulsados com peptídeos.

Esses peptídeos podem incluir; peptídeos individuais do antígeno de CLT, peptídeos controle irrelevantes ou peptídeos conhecidos por provocarem uma resposta robusta a antígenos infecciosos (por exemplo, CMV, EBV, Flu, HCV) ou próprios (por exemplo, Mart-1). A reestimulação é realizada em pla- cas revestidas com anticorpo anti-interferon gama (IFNγ O anticor- po captura qualquer IFNγ secretado pelas células T estimuladas por peptídeo.

Após a ativação de um dia para o outro, as células são lava- das da placa e IFNγ capturado na placa é detectado com anticorpos anti-IFNγ e corantes colorimétricos padrão adicionais.

Quando as célu- las produtoras de IFNγ estavam originalmente na placa, pontos escu- ros são deixados para trás.

Os dados derivados de tais ensaios inclu- em contagem de pontos, tamanho médio do ponto e intensidade média do ponto.

Estas são medidas de frequência de células T produtoras de IFNγ e quantidade de IFNγ por célula.

Além disso, uma medida da magnitude da resposta ao antígeno de CLT pode ser derivada do índi- ce de estimulação (SI), que é a resposta específica, medida em conta- gem de pontos ou tamanho de ponto médio, dividido pela resposta de fundo aos monócitos sem peptídeo específico.

Uma métrica de força de estimulação é derivada multiplicando-se o índice de estimulação para o número de pontos pelo índice de estimulação para a intensida- de de pontos.

Desta forma, as comparações das respostas a antíge- nos de CLT e antígenos controle podem ser usadas para demonstrar que os indivíduos virgens contêm um repertório robusto de células T reativas a antígeno de CLT, que pode ser expandido através de vaci- nação com formulações imunogênicas à base de antígeno de CLT.

A Tabela 9 fornece uma lista de peptídeos derivados do antígeno de CLT que induziram respostas significativas de células T CD8 de dadores de sangue normais compatíveis com HLA. Os resultados são mostrados nas Figuras 53 a 56. Barras horizontais representam a média dos da- dos. A significância estatística foi medida com o teste Anova unidireci- onal de Kruskall Wallis com correção para medições repetidas com correção de Dunns. A Figura 53 mostra respostas significativas de cé- lulas T CD8 de um doador de sangue normal a peptídeos restritos a HLA-A*0201 de Antígeno 1 de CLT (CLT001 na figura). O exemplo mostrado na Figura 54 demonstra respostas de CD8 de um doador normal a um peptídeo derivado do Antígeno 2 de CLT (CLT002 na fi- gura) também restrito por HLA-A*0201. A Figura 55 mostra respostas significativas de células T CD8 de um doador de sangue normal a um peptídeo restrito a HLA-A*0201 de Antígeno 4 de CLT (CLT004 na Fi- gura). A Figura 56 mostra uma falta de resposta a peptídeos restritos a HLA-B * 0702 de Antígenos 1 e 4 de CLT (CLT001 e CLT004 na figu- ra) em células T CD8 positivas para CD45RO de memória (painéis A e C). Em contrapartida, as células T CD8 virgens negativas para CD45RO do mesmo doador respondem significativamente a peptídeos de tanto de CLT001 como de CLT004 (Figura 56, painéis B e D). TABELA 9: PEPTÍDEOS DERIVADOS DE ANTÍGENO DE CLT QUE INDUZIRAM RESPOSTAS SIGNIFICATIVAS DE CÉLULAS T CD8

DE DOADORES DE SANGUE NORMAIS CORRESPONDENTES A

HLA Antígeno de SEQ ID NO: Sequências de Tipo HLA para CLT de Re- Peptídeos peptídeo (previsto ferência por NetMHC) 1 SEQ ID. NO. 73 RLQGSVTLV HLA-A*02:01 1 SEQ ID. NO. 74 VPANTYNAL HLA-B*07:02 2 SEQ ID. NO. 75 QLMSSFSTL HLA-A*02:01 4 SEQ ID. NO. 76 FLELWLPEPML HLA-A*02:01 4 SEQ ID. NO. 77 APLLGSEPL HLA-B*07:02

EXEMPLO 5 - COLORAÇÃO DE CÉLULAS T REATIVAS COM PEN-

TÂMEROS DE PEPTÍDEO DO ANTÍGENO DE CLT

[00387] A presença e a atividade de células T CD8 circulantes es- pecíficas para antígenos de CLT em doadores saudáveis e pacientes com melanoma podem ser medidas usando HLA Classe I/peptídeo- pentâmero ("pentâmero") e/ou ensaios de extermínio in vitro. Dessa forma, a aplicação dessas metodologias a antígenos de CLT encon- trados com o uso dos métodos elucidados nos Exemplos 1, 2 e 2.1 (Tabelas 1 a 6, Figuras 1 a 50) pode ser usada para demonstrar a existência de respostas de células T terapeuticamente relevantes a antígenos de CLT em pacientes com câncer.

[00388] Para esses estudos, as células T CD8 isoladas de doador saudável ou sangue do paciente são expandidas usando vários méto- dos de cultivo, por exemplo, microesferas microscópicas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28 mais Interleucina-2. As células expandidas podem, então, ser coradas para reatividade a antígeno de CLT especí- fico de seus receptores de células T usando pentâmeros de peptídeo de CLT, que consistem em pentâmeros de moléculas de HLA Classe I ligadas ao peptídeo do antígeno de CLT relevante na ranhura de liga- ção ao peptídeo da molécula de HLA. A ligação é medida por detecção com ficoeritrina ou fragmentos de anticorpos conjugados à aloficocia- nina específicos para o domínio de multimerização em espiral da es- trutura do pentâmero. Além da coloração de pentâmero, outros marca- dores de superfície podem ser interrogados, como o marcador de me- mória CD45RO e o marcador de liberação lisossômico CD107a. A as- sociação da positividade do pentâmero a marcadores de superfície específicos pode ser usada para inferir tanto o número como o estado (memória versus virgem/tronco) das populações de células T reativas ao pentâmero

[00389] As células coradas com pentâmero podem também ser classificadas e purificadas usando um classificador de células ativadas por fluorescência (FACS). As células classificadas podem, então, ser testadas quanto à sua capacidade de exterminar células-alvo em en- saios de extermínio in vitro.

Esses ensaios compreendem uma popula- ção de células T CD8 e uma população de células alvo marcada com fluorescência.

Nesse caso, a população CD8 é específica para o antí- geno de CLT ou células T CD8 classificadas por pentâmero e específi- cas para um antígeno controle positivo conhecido por induzir uma res- posta de extermínio forte, como Mart-1. As células alvo para esses es- tudos podem incluir células T2 pulsadas com peptídeo que expressam HLA-A*02, células C1R pulsadas com peptídeo transfectadas com HLA-A*02,03 ou B*07 ou linhagens de células de melanoma anterior- mente mostradas para expressar os CLTs/antígenos de CLT ou célu- las tumorais do paciente.

Os peptídeos usados para pulsar as células T2 ou C1R incluem peptídeos do antígeno de CLT ou peptídeos de controle positivo.

As células alvo podem ser marcadas fluorescente- mente com éster de succinimidil carboxifluoresceína (CFSE, um coran- te de proliferação celular) e a morte é indicada pela absorção de 7AAD.

Desse modo, à medida que as células-alvo são exterminadas, por apoptose mediada por células T CD8, as mesmas ganham fluores- cência vermelha e se tornam duplamente positivas para verme- lho/verde.

Assim, a aplicação de tais ensaios de extermínio a células T CD8 específicas do antígeno de CLT classificadas por pentâmero po- de ser usada para enumerar a atividade citotóxica de células T especí- ficas do antígeno de CLT em culturas ex vivo de pacientes com mela- noma ou células T de doadores saudáveis.

A Figura 57 mostra a colo- ração com pentâmero de HLA de células T CD8 de doadores saudá- veis com peptídeos derivados dos Antígenos 1, 2 e 4 de CLT (CLT001, CLT002 e CLT004 na figura). A Figura 58 mostra células classificadas por pentâmero CLT004 expandido exterminando células alvo C1R-B7 pulsadas com CLT004. O extermínio significativo de células C1R-B7 pulsadas com peptídeo é aparente em razões de células efetoras para alvo de 3:1 e 1:1. EXEMPLO 6 - ESTUDOS DE IMUNOGENICIDADE EM CAMUN-

DONGOS

[00390] Para demonstrar a imunogenicidade dos antígenos de CLT, os camundongos podem ser inoculados com vetores de adenovírus com defeito de replicação que expressam um ou mais antígenos de CLT, e as células T obtidas desses camundongos podem ser testadas quanto à presença de células T específicas de antígeno de CLT usan- do ensaios ELISPOT com IFNγ (Mennuni et al., Int.J.Cancer, 2005). Brevemente, os camundongos são inoculados com adenovírus recom- binantes que expressam antígeno de CLT e, em um ponto de tempo adequado, os mesmos são sacrificados humanamente e as prepara- ções de células do baço são carregadas em poços de uma placa de múltiplos poços derivatizada com anticorpos monoclonais para IFNγmurino, na presença (ou ausência) de peptídeos sobrepostos cor- respondentes ao antígeno de CLT. Após um tempo adequado, o IFNγ imobilizado é corado com um anticorpo monoclonal diferente, permi- tindo a numeração das células/pontos que são, então, comparadas com o total de células carregadas no poço para render uma leitura quantitativa de células T reativas a antígeno de CLT. EXEMPLO 7 - ENSAIOS PARA VALIDAR A EXPRESSÃO DE CLT

EM CÉLULAS DE MELANOMA A) VALIDAÇÃO DE qRT-PCR DE EXPRESSÃO DE CLT EM LINHA-

GENS DE CÉLULAS DE MELANOMA

[00391] A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) é uma técnica amplamente distribuída para determinar a quantidade de um transcrito específico presente no RNA extraído de uma determinada amostra biológica. Sequências de iniciadores de ácido nucleico específicas são projetadas contra o transcrito de inte- resse, e a região entre os iniciadores é subequentemente amplificada através de uma série de reações de termocicladores e fluorescente- mente quantificada através do uso de corantes intercalantes (SYBR Green). Os pares de iniciadores foram projetados contra os CLTs e testados contra o RNA extraído de linhagens celulares de melanoma. As linhagens celulares sem melanoma foram utilizadas como controles negativos. Especificamente, as linhagens celulares de melanoma CO- LO 829 (referência ATCC CRL-1974), MeWo (referência ATCC HTB- 65), SH-4 (referência ATCC CRL-7724) e linhagens celulares de con- trole HepG2 (carcinoma hepatocelular, referência ATCC HB-8065), Jurkat (leucemia de células T, referência ATCC TIB152) e MCF7 (ade- nocarcinoma, referência ATCC HTB-22) foram expandidas in vitro e o RNA foi extraído de 1x106 células congeladas imediatamente e trans- crito reversamente em cDNA. A análise de qRT-PCR COM detecção de SYBR Green seguindo técnicas padrão foi realizada com iniciado- res projetados contra duas regiões de cada CLT e genes de referên- cia. A quantificação relativa (RQ) foi calculada como: RQ = 2 [Ct (REFERÊNCIA) -Ct (ALVO)].

[00392] Os resultados desses experimentos são apresentados na figura 59. O painel A mostra os resultados de um ensaio de qRT-PCR com dois conjuntos de iniciadores (1+2 e 3+4) que alvejam regiões di- ferentes do CLT que codifica Antígeno 1 de CLT (SEQ ID 33) em RNA extraído de três linhagens celulares de melanoma e quatro linhagens celulares sem melanoma. O painel B mostra os resultados de um en- saio de qRT-PCR com dois conjuntos de iniciadores (5+6 e 7+8) que alvejam regiões diferentes do CLT que codifica Antígeno 2 de CLT (SEQ ID 34) em RNA extraído de três linhagens celulares de melano- ma e quatro linhagens celulares sem melanoma. O painel C mostra os resultados de um ensaio de qRT-PCR com dois conjuntos de iniciado-

res (9+10 E 11+12) qu alvejam regiões diferentes do CLT que codifica Antígenos 3/4 de CLT (SEQ ID 35) em RNA extraído de três linhagens celulares de melanoma e quatro linhagens celulares sem melanoma. Esses resultados confirmaram a expressão específica de CLTs em RNA extraído de linhagens celulares de melanoma, em comparação com células sem melanoma. Os CLTs foram detectados em cada uma das linhagens celulares de melanoma testadas. B) VALIDAÇÃO RNAScope DA EXPRESSÃO DE CLT EM CÉLULAS

DE MELANOMA IN SITU

[00393] Os métodos de hibridização in situ (ISH) de análise da ex- pressão do transcrito permitem que a presença e os níveis de expres- são de um determinado transcrito sejam visualizados dentro do con- texto histopatológico de um espécime. Os ensaios ISH de RNA tradici- onais envolvem o reconhecimento de moléculas de RNA nativas in situ com sondas oligonucleotídicas específicas para um trecho curto da sequência de RNA desejada, que são visualizadas através de um sinal produzido por uma combinação de reações colorimétricas ou basea- das em anticorpos ou enzimas. RNAScope é uma técnica baseada em hibridização in situ desenvolvida recentemente com química de sonda mais avançada, garantindo a especificidade do sinal produzido e per- mitindo a visualização sensível de uma única molécula de transcritos alvo (Wang et al 2012 J Mol Diagn. 14 (1): 22-29 ) A coloração positiva para uma molécula de transcrito aparece como um pequeno ponto vermelho em uma determinada célula, com vários pontos indicativos de vários transcritos presentes.

[00394] As sondas RNAScope foram projetadas contra os CLTs e testadas em seções de 12 núcleos de tumor de melanoma cutâneo fixados em formalina e embebidos em parafina. A pontuação do sinal de expressão foi realizada em imagens representativas de cada núcleo da seguinte forma:

• % estimada de células com coloração positiva para a son- da CLT, arredondada para as 10 mais próximas • Nível estimado de expressão por célula na seção forneci- da como: • 0 = sem coloração • 1 = 1 a 2 pontos por célula • 2 = 2 a 6 pontos por célula • 3 = 6 a 10 pontos por célula • 4 => 10 pontos por célula

[00395] A expressão de cada um de cada CLT foi detectada em uma série de diferentes núcleos de tumor de pacientes, validando de forma independente a descoberta de CLTs de dados de RNAseq deri- vados de tumor e confirmando a homogeneidade de expressão dentro do tecido tumoral em certas amostras e também destacando a presen- ça de pelo menos um CLT em cada núcleo de paciente analisado. TABELA 10 - PONTUAÇÃO DO RNAScope EM NÚCLEOS DE TE-

CIDO DE PACIENTES COM MELANOMA Antígeno de CLT Antígeno de CLT Antígeno de CLT 1 (SEQ ID 33) 2 (SEQ ID 34) 3/4 (SEQ ID 35) Tecido Nú- % de Pontua- % de Pontu- % de Pontua- cleo células ção células ação células ção positivas positivas positivas Melanoma 61 10 1 80 4 10 1 Melanoma 62 80 2 80 2 100 4 Melanoma 63 100 4 0 0 100 4 Melanoma 64 0 0 0 0 100 3 Melanoma 65 70 3 0 0 80 4 Melanoma 66 100 3 50 2 90 3 Melanoma 67 100 3 100 4 50 2 Melanoma 68 0 0 0 0 100 3 Melanoma 69 90 3 100 4 100 4 Melanoma 70 0 0 0 0 70 3

Antígeno de CLT Antígeno de CLT Antígeno de CLT 1 (SEQ ID 33) 2 (SEQ ID 34) 3/4 (SEQ ID 35) Tecido Nú- % de Pontua- % de Pontu- % de Pontua- cleo células ção células ação células ção positivas positivas positivas Melanoma 71 0 0 0 0 80 4 Melanoma 72 100 3 100 4 60 2

[00396] Ao longo do relatório descritivo e das reivindicações que seguem, a menos que o contexto exija em contrário, a palavra "com- preende" e variações como "compreender" e "compreendendo", serão entendidas para implicar a inclusão de um número inteiro, etapa, grupo de números inteiros ou grupo de etapas especificados, porém sem ex- cluir qualquer outro número inteiro, etapa, grupo de números inteiros ou grupo de etapas.

[00397] Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e ou- tras referências mencionadas ao longo do relatório descritivo da pre- sente invenção estão incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00398] A invenção abrange todas as combinações de grupos pre- feridos e mais preferidos e grupos adequados e mais adequados e modalidades de grupos citados acima.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO. 1 (Sequência polipeptídica de antígeno 1 de CLT)

MWNFFRRELTSNGFPENFSLDVPANTYNALKSRLCDPNADHTSCPS PCSLHAAGALPGTGRQRWRVELAHLADRKLSLRDVSRLRQGGERR SGIAVKVVRGGAGFAARLQGSVTLVQQGWFFPRLGGCQAWWRMG

AVVWCGELLTCTS SEQ ID NO. 2 (Sequência polipeptídica de antígeno de CLT 2)

MTGVLIRRGDLVTDMVACRIKTFRGHTEKAAICKTRKESSAETSPADS

LILDFQPLQLMSSFSTLASLDK SEQ ID NO. 3 (sequência polipeptídica do antígeno 3 de CLT)

MNTPNIVSLRAHQPEVGIIPSVLLMRPLRIKGVFHHIHSPLHGENQGFT

LCLQGAPPSSSV SEQ ID NO. 4 (sequência polipeptídica do antígeno 4 de CLT)

MAKTKGSLSVFRELHPAAAFDRAVHFLFLELWLPEPMLSSSPPSSTA

PLLGSEPLRHWEASLSR SEQ ID NO. 5 (Sequência polipeptídica de antígeno 5 de CLT)

MKRKANRWRLSLRNGLLPSTPRATQQIPMEFLNSRVADIPIKPW SEQ ID NO. 6 (Sequência polipeptídica de antígeno 6 de CLT)

MRGFLWRVETRGVEGSMRGPQKVLGNRLPGAGRNARSRDNFAVW SEQ ID NO. 7 (Sequência polipeptídica de antígeno 7 de CLT)

MVYYGNPESSPGISLVFGLLRLDRMQPGFSVSQEGDPVGITDHLGC SEQ ID NO. 8 (Sequência polipeptídica de antígeno 8 de CLT)

MPAQLKFTLQVNPATKMRVTLLSQPMETYEGDVLGVQTPYSSDSTIL

VL SEQ ID NO. 9 (Sequência polipeptídica de antígeno 9 de CLT)

MGSSRVGERMMEEESRTGQKVNPGNTGKLFVGVGISRIAKVKYGEC GQGFSDKSDVITHQRTHTGGKPYVCRECGRALAGSQTSSVTRGHTQ GRSLMSAESVSGALAGSQSSSFTRGHTGETPQSAGRMSKSLVIKPY

LNSHKKTNVITTHLHTPALRWLQRKSANPLHSPRV SEQ ID NO. 10 (Sequência polipeptídica de antígeno 10 de CLT)

MHSLQIFSLCLFTLLIVSFIVQKPFNLIRSNLSIFLLVEIAFEDLVMNYLP KLTSRRVFSRFSYMTFYSFRSYIKVFVSSQIDFFSLVKGRGPVQAHFS

MWFCYSG SEQ ID NO. 11 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 1 de CLT)

VQQGWFFPR SEQ ID NO. 12 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 1 de CLT)

VVRGGAGFAAR SEQ ID NO. 13 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 1 de

CLT)

HLADRKLSL SEQ ID NO 14 (sequência de peptídeo derivada do antígeno 1 de CLT)

ARLQGSVTL SEQ ID NO. 15 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

ADSLILDF SEQ ID NO. 16 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

SSFSTLASLDK SEQ ID NO. 17 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 3 de CLT)

NTPNIVSLR SEQ ID NO. 18 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 3 de CLT)

QPEVGIIPSVLLMRP SEQ ID NO. 19 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 4 de CLT)

KTKGSLSVFR SEQ ID NO. 20 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 5 de CLT)

RVADIPIKPW SEQ ID NO. 21 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 5 de CLT)

DIPIKPW SEQ ID NO. 22 (sequência de peptídeo derivada do antígeno 5 de CLT)

RVADIPIKP SEQ ID NO. 23 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 6 de

CLT)

RSRDNFAVW SEQ ID NO. 24 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 6 de CLT)

RSRDNFA SEQ ID NO. 25 (sequência de peptídeo derivada do antígeno 7 de CLT)

SPGISLVF SEQ ID NO. 26 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 8 de CLT)

SSDSTILVL SEQ ID NO. 27 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 9 de CLT)

AGRMSKSLVIK SEQ ID NO. 28 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 9 de CLT)

PQSAGRM SEQ ID NO. 29 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 9 de CLT)

AGSQSSSFTRGHTGETPQ SEQ ID NO. 30 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 10 de CLT)

RSNLSIFL SEQ ID NO. 31 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 10 de CLT)

FSLCLFTL SEQ ID NO. 32 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 10 de CLT)

SRRVFSRFSYMTFYSFRSYIKVFV SEQ ID NO. 33 (sequência de cDNA de CLT que codifica o Antígeno 1 de CLT)

CGGGGCCAGTCTTTCCCGTGCTATTCTCGTGATAGTGAATAAGTC TCACAAGATCTGATGGGTTTATCAGGGGTTTTCATTTTGCTTCTTC CTCATTTTCTTTTGCTGCTGTAATGTAAGAAACGCCTTTTGCCTCC TGCCATAATTCTGAGGCCTCACAGCCATGTGGAACTTCTTCAGGA GAGAATTAACATCCAATGGATTCCCAGAAAACTTTTCCCTCGATGT ACCAGCAAACACCTACAATGCCCTGAAAAGCCGCCTCTGCGACCC CAATGCAGATCACACGTCCTGTCCCAGCCCCTGCAGCCTCCACG CGGCGGGTGCACTGCCAGGCACGGGAAGGCAGCGCTGGCGAGT AGAACTGGCCCATCTCGCAGATAGGAAGCTGAGCCTCAGGGACG TTTCACGCCTTCGTCAAGGTGGTGAGAGGAGGAGCGGGATTGCC GTGAAGGTGGTGAGAGGAGGAGCGGGGTTTGCTGCCCGACTTCA GGGATCTGTCACCCTCGTCCAGCAGGGTTGGTTCTTCCCGAGGC TGGGAGGATGCCAAGCCTGGTGGAGGATGGGGGCGGTGGTGTG GTGTGGGGAGCTTCTGACTTGCACATCCTGAGGGAACCTTCTGCA GCTGATGTGTGAACTGGACCCCAGGCCGTGCCTCCGAGGAATCC CCAAGGCTATGGCCCCTCAGGTCCTGCTGGGGTGTTGGCCCCCA CCTCTGCCTCAGAATGCAGGGGTTCTGCAGGGAAGCCGCAGACC AGCCTGCTGCCTTGGGCCCTAGGGACACTGCAGCCCCAGAAAGT ACTGTGGGGGACAAAAGAGTTGTTTCTCGGGGGAGAAAACACCT GTGAGGAAATGCAGGTGCCACAGAGGGAAATCCTCCTGGGGAGG AGGGTACCTGTTCCATCCTCGGCCGACACGGGACTGCCTGGTGC CTGGTACCCACAGCCGCTACCTGCCGCACGCATCTCTCCATGGTT TGCTAATTACTTCCATTAGTTTTAAACAAACTTGACAAGAGACAGA

AGGGTCCAGAGAGAAATTAAATCTAACTGTTTAAACATGT SEQ ID NO. 34 (sequência de cDNA de CLT que codifica o Antígeno 2 de CLT)

CACCTCCATCACTGCGAATTATAATTCGACATGAGATTTGGGAGAT GACACAAAACCAAACCATATCAGTCTTTAAAGAGTTAAGTTAAAAT AAGCTCTTTAAAGTGGGCCCTAATCCAGTATGACTGGTGTTCTTAT AAGAAGAGGAGATTTGGTCACAGACATGGTTGCATGCAGAATAAA GACTTTTCGAGGACACACTGAGAAGGCAGCCATCTGCAAAACAAG GAAAGAGTCCTCAGCAGAAACCAGTCCTGCAGACTCCTTGATCTT GGACTTCCAGCCACTGCAATTGATGTCAAGCTTCAGCACCCTTGC ATCTCTGGATAAATGAAATGTCACCCCAGCTGCCGTCCTTGTTCA GATCTGTGCAATAAAGAGCAAAGCATAAAACCAAGTCAAGGCTTT GAGGGAGTGACCTACAAAATGCATAATGTGAAACAATGCAAAAGC GAAAGGTGCAAAATCCCCATCAAAGAGCTGGAGGCTGACAGATG CGCCAGTGATAATTCCCATCTTCCAACACAGGAGCACAGCTTCCA TTTTCCATAACAGAACAACAGCCAGAGCAGCTGGAAGGCAGGGC CGCATCCCAGACTTCCACCAACAATGGGATGAGACTTGACATCTG GAATCACAACCACAACAGACCTGAGAGACCCACCAGCTTGATGAC AAGCTTCTTCTTTCAAAGAAAGGTATCAGTCTGGGGGACCTAGTG CTGCAAACCATGACAAATTAAGTGTGGCATCCCTCACTTGCATAAT GGAACTCAGTGATATTTTTTAATTAACAAGAGTTATTTTTATGTAAG CTTCTCTCATTCCTCCACTGTGCGTGCTCGGGGGCTGGTGGTGAG GAAAAAGAAAACAGCTGTGCGGGAAGCATCAAGAAAAGGCAAGTC ATGAAGTCTTAGAGATCAGTGACATGTAAGAAAAAGAGTGAGGAG AAAAATATTCCTACTAAAGTTTTCCATTTGTTTACCTTCCTTGTCAC ATAGACTTCCAAGAGTTAGAAGTCTAGGATTTGATCTCCAAATCTT CCTGGCAGATTACTCATCTTCATTTCATTCATATAGTCCAGGGGTT TGTACAAAGGAAGATGCCAGTTCTTCCCCAATCATAACTAAGATAT CAAGAGATATTCTTTTGAAATGTAACAAAGGAGATCTGAAGTTCAT CTGAAAAAAATAAATGGTTTTAGGCGGTCATGACCATGGGATGCT GGACCAGGATGGTAAGCTTCAGGAAACAGAATCTGGAGAATGCC CAGCTGCTCCCACAGGAAGCATCAGGGAAGAAGAAGAAGAGGTG TGAAGTCTGCCTTCTGCTCTGCTGGGATCCCTTTCACATCTCCTTT GCCTCCAGGCAGTTTTGGTTCCTGGCCATTTCCAGGTGTGACTCA CTCAGGATGGTAAGCATCTTCTCTCCTACCCAGAGTAGAGGATGA AGACCTCATCTCAGAGGTTGAAGGGAGCTCCAGAGAGAGGTCTC AAACTTCCAGCATTAACTGCTAAAGAAGCTTCATGAGCTGCTGGA GAACCTGGGAAATGACCAATTATAGGGACAGAGCTCAAATACTCT GGGACACTCTAGTAGCTGAGAAAGTTCCAACTCCAGGGTGATAGA GGACTGCCTGGCAAACCATCATCAAAGCAGAAGACCTGATACTAA CATCACAGGCTATGGTTTATTACTGAAGATCAGTGCTTACACCCTG CCAGAGGTTCAGAAGCAAACTTATCATTGTTCTCCCTGGAGATGTT GGCCCACATTCTGAAAAGTGTGGTCAGTAGTAGCAACAGAAAGCA ATTGTGCTTGCCAAGCACAATGTCACTGTCCCCAGCCCTTCCCCC AACACAACCCAGTAGGTGCTTCCTGGCTGCAAACTTGGGAAAGTC ACTTGACCTGTCTGAGGTTCCACTTCCTAATCTGGCCTGGCGAAG ATAAGAAAAACAGTTTATTTAAAGTGTCTAGCAAAGTGCTTGGACC AAAATAGGACCTCTGAAATGGTTATGGTAGTGCTGTTAAGGTGAT GTTTTAAGTGCTGATGAGCACAAAGATGGGTAAGATATTCCTTCTG TTAAAATCTACAGTCTAATGAGAGAGAACAAGATGAATGCACAATA ACTGTCATTCAGAACAGGATTATGAGAAGGTGTGAATTTCTGTGAA AAATCAGAACAGGGAGTAATATGATCCCAGGTGATTGGCAGGGG GTGGGGGTCTGGATTCAACTGGAGAGGGAGCTGGCAGGGAAGG CTTCCTGGAGGATGAGAGTTCAACAAGGGGCAGGTGTAGGATGT GGGTGGCCAAGTGACTGGGCAGAAGGAGCTGCAGAAGTAAGACC CCAAATCAGGAAGACAAGGGCCTGCTGAGAAACACGAGCTACAAA GTGCAAGTGCAGGAAGAGTTGGGATGAGATTAGAAGGGGGTCTG GGGCCAGACTGTGGAAGGCCCAAATGCCGGGCTAAGGAGTTTGT ACTTAATTCAGTGGTCAACGGGGAGTCATTGGAGGCTGTTGAGCA GGAGAGTTGCTTTCTTTACAGCTGTGCCAGACTAAATTAAACCTAA ACAGTACTTTATAGCTGGAAAGGGAAGGCCCAGGAATAGCTCTTG ACTCAGAAACAGGCATTGGGGAAGGTAATGAGAAACAGCCGTGA CTGATCAAAGCAGAGAGGTTAATTAAATTTGTAATTATTGTGAAAG GCCATTAAAAACCCTAGTTCACTAGAGATAACTGCTCTAGTGGGG CTTCAAAGACAAACGCTTCTTTTAACCTTGAATAGGGGGATGTTTG CTTCTCTGTGGAGGAGATATGATTAAGATACTTAATAAATGGTAGA

TAAACA SEQ ID NO. 35 (sequência de cDNA de CLT que codifica os Antígenos 3 e 4 de CLT)

AAACACACTAAGGGCTTTGTTATGGACTGAAATGTGTCCTCTCCCC AGAGTCACAGGATTATGAAGCCATAATCCTCAATGTGACTATATTT GGAGCAGGGGCCTTTACAGACATAATTAAATTAAATGAGGTCATAA GAGTGGGGCCCTAGTCTGATAGGACTGGTGTCCTTACAAGAAGA GGGAGAGTCCTCAGAGAGTCCTCTCTCTCGGCATGGACACAAAA GAAAAGCCATGTGAGGACACAGAGAGAAGGTGGCTGTCTACGAG CTAGGAAGAAAGGCCTCACCGGAAACCAACCCTCACAGCAGCTC CATCTTGGACTTCCAGCCTCCGGAACTGTGAGAAAATAAATGTTTG CAATTCAGGTCGGTTGTATTTTGTGAAGGCCATCCTAGCAAATGAA TACTCCTAACATTGTCTCTTTAAGAGCTCACCAGCCTGAGGTAGGA ATCATTCCATCTGTGTTACTAATGAGACCGCTGAGGATCAAAGGG GTTTTCCACCACATCCACTCACCTCTACATGGCGAAAACCAAGGG TTCACTCTCTGTCTTCAGGGAGCTCCACCCAGCAGCAGCGTTTGA CAGAGCTGTTCACTTCCTCTTCCTGGAGCTGTGGCTTCCAGAGCC CATGCTCAGCAGTTCCCCTCCTTCTTCGACTGCTCCTCTCTTAGG CTCAGAGCCACTCAGACATTGGGAAGCAAGTTTGTCAAGATGACA GAGAACCGAGGTAATGGATTCGAGTGATGAAACAGGAAGTTCATT CATGAGTTTTTGGCCACACCTCCAAAGTGACGACTTAGCCAGAAA TGGGATAACTGGGTTTCCCTACTTCTCTTTTATCATCCTCAATGAG AGTGACCAAATATTAGAGCTAGATGGAACCTTAGTGAAAATCTGG CTACTCGTCCCGTCCCACCAGCCTGCCACCCATTTCAAGTTTGAA GAGACAAAGACACATGGACCTTATGTAATTACTGGGGATTACCCC AGGAGTCTGTGGCAAAAGTCAGCTTCTTCCCTCCCTGCTTCCCCG CCCTGTCTCTGGTACTTTCTACCAACACTGGGCTGTTTCTGTGATC ACACTTAAGCGTACCTAACCTGCGAATGCTGTATAGAAGGTGCTA ATGAACATGATTTAGCTTTAACACTCAGTTTTCTAAAGGGACACGT GGGGGCAGCAAATGTTTAGGCAAAAACAATTCCAGTTCTAGCCTC TACTGTCTACATATGTGTATACATTTGGGAAACGTTTGGGAAAGGG ATATTTGAGAGCTTCTTTTTCTTTTTTGTGGTTTAGTTATTTGATGAT ATTGAGATTGTTTCTGAGCCATGTGCTTCAACATCGGATTGGGGAT TTCAGAAAAAGTTTTAGTCACTGTGATTCCATTTAGCTTCCAAATGT GTCTCTGCTAAGAGACTTAAAAGCACTCATAAATAGCACGTGTGTC TTCTTTGCAGTGTTTGCTAATTTTGAGTCACATCTTTTTAGAAAATC ATGAGATTTGGTGTCACAGAGACTGGAATAAATATAGTCAAACTTA TTGGTGAAGATTTCCTTTAGCTGTTTTCATAATCCATTTCCATTGTT ATGATTATTGATGAATAAAACATTTTCTTTAGGTAGATACTTCTTTTT TCCCCCCACCTTGATTTAATGTTTCCACTCTTATTGTCAAGTTTCTT ATTACTCCCTAATAACTCTCAATAAAATAATGATTCCTGGGAGATTA TTCCTGCTTTCCTACTATCACCTGTTGATTTGAAAAGACAGAACAA TACCGTAGAAGCTTCACTAATACATTGAAAGATAAAATGATAATAC TAAATACTAAAATATGAAAAGTGATACTAAAAGTGGAGTCCTGGCA CTAGTATTTTTTTTTTTGAGTCTTTAAATTTTATTTATTTATTTTTGAA TTTTTTAAAATTATATGTTATGTTCTGGGATACATGTGCAGAACGTG CAGGTTTGTTACATAGGTATACAGGTCTGGCACTAGTATTTTGTTG CCACAAAATATCAAGCATGTATCCAAACTGCTCAAGACACATTAAA GACACAGGTAATCTGTAGGCATATTCAGGCTTGTAGTTTGCATTTT TTGGTTTTCTTGTGGCTTTCAGTGCAAGTTGAGGTAATTCATGGGA AACAGTCACCAAAGAAGTGCCAGTATTAGAAATCCAAGAGCCATTT CTCTAGCTTCTTCCAGAATCAAGACTTTAGAGGTAATTTCTATCAA CACTGGACATTTCCTGTCTGCAATTAACAATGAACACATAGCATTA TGTTTAATTGCAACCTGTTTAAAGCAGATTGGATGCTAAGGTTTAA GAACACTCTTCAGTCAAAAAGGTCTTTTAATCAGGTTTTTAATCTTG AGCACAATCTAGGACACAGCATCATAGACTAACTCATTCGAGAATA GGTGTTGTCATCTAATCCTAACCACCCCCACCACCAACAAGCTGA ATAGCTCTGGGCTCAGTATATACATTTGTACTGGGCTCAGTACACA CACCTAAGCTGGGTTCAGTATATGCCACTTTATAGTGAGAGGCATT TTGTAATGAGAGCTCTGGGTTCACTATATACATTTGTACTGGGCTC

A SEQ ID NO 36 (sequência de cDNA de CLT que codifica o Antígeno 5 de CLT)

GGGAGGGGGCCATGGCGGGGCCACTTCAAAGGAAAAGCTCTAGC TCCCCTACCTCTCTCACATCCTAAGGCTGCCTTTGTGGGATTCCA CACAGAACAGCCTGGAAGCTTGGGGCCCTGGCTTCCTTTTCTGGC CTGGGAGTCAGGTCATGGGGCCATCGCTTCACAGCAATCATGAG GGCCCAGGCCCAAGTGCTCACATGCTCCTCATGGGGACTGCTCC TCTTAAAGGGTGGGCCCTCCTCACCCAGCTCCCTGCCCTGGCCA AGGAGGAGGCTGAAAGAGCCTGAGCTGTGCCCTCTCCATTCCAC TGCTGTGGCAGGGTCAGAAATCTTGGATAGAGAAAACCTTTTGCA AACGGGAATGTATCTTTGTAATTCCTAGCATGAAAGACTCTAACAG GTGTTGCTGTGGCCAGTTCACCAACCAGCATATCCCCCCTCTGCC AAGTGCAACACCCAGCAAAAATGAAGAGGAAAGCAAACAGGTGGA GACTCAGCCTGAGAAATGGTCTGTTGCCAAGCACACCCAGAGCTA CCCAACAGATTCCTATGGAGTTCTTGAATTCCAGGGTGGCGGATA TTCCAATAAAGCCATGGTGAGAAAGGCATTCAGACATGGTGCCAC TAGGATCACAGCTTTCATTGGCGGCCAGTCTCCCAGCCCCAAACT GCAGATACCTGGTCTTCTTCATGGCTGTGGCTCAATCTTCCTAGAT ATTTCATTGAAAAACCAAGAGATATATCTGTGCACATGGCTTTTAG CCATGAGGCTTGGAAACTGGACACCACTGTAAAGAACATCTAGTG TCCCGTAAATCCATACCAAAGCTCTGAATCCACAAACCAGGCTCT GGCCCAACCCTGCAAACACACTCCATTGCTCCATCTTCAGTAAAG GAAGACAAATTCATTTTTCTAATAACTGTGGACCTGCAGCCCCCTT AGATGTGTTGAGAGTCTTTGGAAATATTTTCCTCTGAGGTCTGTCC ACAGCTTCCCTGGGCCTGCGCTCAGCTGGCCCGAGAAGGACCAA GGTCCCTCACATTTGCATGTAAACAGGGAGTGCCCTCTGCCCTTC CAGTGAGCCCTGCCAGCGTGGGGGAGGCTTCAGCTCTGTGATCC GTTCCAGCTCACTCTGAATTACACTCCTACATGCCCAGTCACAGA CTTTTTGCAATTTCATTTTATTTCACTGGCCCAACATCATTGTTAAA ATAAAATTTAGCTGTGTTCCAAATGCTGCAATATACAGTCTTCTGA AATGGCACCCTACATATTAGCCCAGACACAAAGAAGCAGTTTATA GGAGACAAGGCATCTGAGCATTATTAGCCTCCTCCTCACTTTGAA GAGGTCAAGTTCATGGGTGGGCCCATGATCGCCTGACCCATTTAC TCAACAACATCCTCATCCAACTTCTTGGGCCACTGTTCTAGCTAAG CCAGCTTTGGAACCTATTCCTCCAACATTAGGATTGCCAGATAAAA TACAGGACACCCAGTTATATTTGAACTTCAGACATACATTGGATAA ATTTTCAGTACAAGTATGTCCCAAATATTGCATGATTTATTGCATTT AATAAAAATGTTGTACTGAAACATTTTTCATTGTTCCTCTAAAATTC AAATTTAACTGGGTGTCTTGGTCTGTTTGGCTGCTATAACAAATTG CCTTAGGCTGGGGAATTTATAAACAACAGAAATTTATTGCTCACAT TTCTAGAGTCTGGGAGGCCCAAGATCAAGGTGCCAGCAGATTTGG TGCCTGGCGAGGGCCCATCCTCTGCTTCATAGATAGCACCTTCTT GCTGTGTCCTCACATGGCAGAAGCAGAGAACAAGCTCTCTGAGTC

CTC SEQ ID NO 37 (sequência de cDNA de CLT que codifica o Antígeno 6 de CLT)

CTTGGACTTCCCAGCCTCCAGAACTGTGAGAAATAAATTTTTGTTG TTTAATCCATCCAGTCTGTGATATTTTGTTATGGCAGCTGAAGCAG TCAGGAAAGGATCCTCCCCATCTCTGCAGAAGCCTGACCATCCCC CTAGAGGGCCTGGGAGGAAGTGGGTTTTGCATACAGTCCCTGTT GACTCTAGTGCCCCCTGCTGGCCCCAGACGCGAGTTCCGGCGAG GCTTCAGGGTACAGCTCCCCCGCAGCCAGAAGCCGGGCCTGCAG CGCCTCAGCACCGCTCCGGGACACCCCACCCGCTTCCCAGGCGT GACCTGTCAACAGGTCTGTATTGGCGACAAAAGGAGCAGCCCTGA ATGTAGGGAAAGCAGGGCGGAGTCCTCTGCAGGCTCGGGGGAG GGGAGGGGCGTGAATGCGTGGATTTCTGTGGAGAGTGGAAACAC GGGGAGTCGAGGGGAGCATGCGCGGGCCTCAGAAAGTTCTGGG AAACCGACTCCCGGGAGCAGGGAGGAACGCGCGCTCCAGAGAC AACTTCGCGGTGTGGTGAACTCTCTGAGGAAAAACACGTGCGTGG CAACAAGTGACTGAGACCTAGAAATCCAAGCGTTGGAGGTCCTGA GGCCAGCCTAAGTCGCTTCAAAATGGAACGAAGGCGTTTGTGGG GTTCCATTCAGAGCCGATACATCAGCATGAGTGTGTGGACAAGCC CACGGAGACTTGTGGAGCTGGCAGGGCAGAGCCTGCTGAAGGAT GAGGCCCTGGCCATTGCCGCCCTGGAGTTGCTGCCCAGGGAGCT CTTCCCGCCACTCTTCATGGCAGCCTTTGACGGGAGACACAGCCA GACCCTGAAGGCAATGGTGCAGGCCTGGCCCTTCACCTGCCTCC CTCTGGGAGTGCTGATGAAGGGACAACATCTTCACCTGGAGACCT TCAAAGCTGTGCTTGATGGACTTGATGTGCTCCTTGCCCAGGAGG TTCGCCCCAGGAGGTGGAAACTTCAAGTGCTGGATTTACGGAAGA ACTCTCATCAGGACTTCTGGACTGTATGGTCTGGAAACAGGGCCA GTCTGTACTCATTTCCAGAGCCAGAAGCAGCTCAGCCCATGACAA AGAAGCGAAAAGTAGATGGTTTGAGCACAGAGGCAGAGCAGCCC TTCATTCCAGTAGAGGTGCTCGTAGACCTGTTCCTCAAGGAAGGT GCCTGTGATGAATTGTTCTCCTACCTCATTGAGAAAGTGAAGCGA AAGAAAAATGTACTACGCCTGTGCTGTAAGAAGCTGAAGATTTTTG CAATGCCCATGCAGGATATCAAGATGATCCTGAAAATGGTGCAGC TGGACTCTATTGAAGATTTGGAAGTGACTTGTACCTGGAAGCTAC CCACCTTGGCGAAATTTTCTCCTTACCTGGGCCAGATGATTAATCT GCGTAGACTCCTCCTCTCCCACATCCATGCATCTTCCTACATTTCC CCGGAGAAGGAAGAGCAGTATATCGCCCAGTTCACCTCTCAGTTC CTCAGTCTGCAGTGCCTGCAGGCTCTCTATGTGGACTCTTTATTTT TCCTTAGAGGCCGCCTGGATCAGTTGCTCAGGCACGTGATGAACC CCTTGGAAACCCTCTCAATAACTAACTGCCGGCTTTCGGAAGGGG ATGTGATGCATCTGTCCCAGAGTCCCAGCGTCAGTCAGCTAAGTG TCCTGAGTCTAAGTGGGGTCATGCTGACCGATGTAAGTCCCGAGC CCCTCCAAGCTCTGCTGGAGAGAGCCTCTGCCACCCTCCAGGAC CTGGTCTTTGATGAGTGTGGGATCACGGATGATCAGCTCCTTGCC CTCCTGCCTTCCCTGAGCCACTGCTCCCAGCTTACGACCTTAAGC TTCTACGGGAATTCCATCTCCATATCTGCCCTGCAGAGTCTCCTG CAGCACCTCATCGGGCTGAGCAATCTGACCCACGTGCTGTATCCT GTCCCCCTGGAGAGTTATGAGGACATCCATGGTACCCTCCACCTG GAGAGGCTTGCCTATCTGCATGCCAGGCTCAGGGAGTTGCTGTG TGAGTTGGGGCGGCCCAGCATGGTCTGGCTTAGTGCCAACCCCT GTCCTCACTGTGGGGACAGAACCTTCTATGACCCGGAGCCCATCC TGTGCCCCTGTTTCATGCCTAATTAGCTGGGTGCACATATCAAATG CTTCATTCTGCATACTTGGACACTAAAGCCAGGATGTGCATGCATC TTGAAGCAACAAAGCAGCCACAGTTTCAGACAAATGTTCAGTGTG AGTGAGGAAAACATGTTCAGTGAGGAAAAAACATTCAGACAAATG TTCAGTGAGGAAAAAAAGGGGAAGTTGGGGGTAGGCAGATGTTG ACTTGAGGAGTTAATGTGATCTTTGGGGAGATACATCTTATAGAGT TAGAAATAGAATCTGAATTTCTAAAGGGAGATTCTGGCTTGGGAAG TACATGTAGGAGTTAATCCCTGTGTAGACTGTTGTAAAGAAACTGT

TGAAAATAAAGAGAAGCAATGTGAAGC SEQ ID NO 38 (sequência de cDNA de CLT que codifica os Antígenos CLT 7 e 8)

GAGACAGGTCTCACTCTGTTGCCCGGTCAGGAAAGTGGCACAATC ACAGCTCACTGCAGTCTCAGTCTCCCAGGCTCAAGATGGATACAT TTAAGGTATGGTGATCCGGTCCACCGTGTGGTTAGGATTCCCAAA TTTTGTTGACAGCGTCTCGGATATGAACCACACGGAAATTTGGCC TGCTGCTTTCTGCGTGGGGAGTGCGATGTGGATCCAGCTGTTGTA CAGTGCCTGCTTCTGGTGGCTGTTTTGCTATGCAGTGGATGCTTA TCTGGTGATCCGGAGATCGGCAGGACTGAGCACCATCCTGCTGT ATCACATCATGGCGTGGGGCCTGGCCACCCTGCTCTGTGTGGAG GGAGCCGCCATGCTCTACTACCCTTCCGTGTCCAGGTGTGAGCG GGGCCTGGACCACGCCATCCCCCACTATGTCACCATGTACCTGC CCCTGCTGCTGGTTCTCGTGGCGAACCCCATCCTGTTCCAAAAGA CAGTGACTGCAGTGGCCTCTTTACTTAAAGGAAGACAAGGCATTT ACACGGAGAACGAGAGGAGGATGGGAGCCGTGATCAAGATCCGA TTTTTCAAAATCATGCTGGTTTTAATTATTTGTTGGTTGTCGAATAT CATCAATGAAAGCCTTTTATTCTATCTTGAGATGCAAACAGATATC AATGGAGGTTCTTTGAAACCTGTCAGAACTGCAGCCAAGACCACA TGGTTTATTATGGGAATCCTGAATCCAGCCCAGGGATTTCTCTTGT CTTTGGCCTTCTACGGCTGGACAGGATGCAGCCTGGGTTTTCAGT CTCCCAGGAAGGAGATCCAGTGGGAATCACTGACCACCTCGGCT GCTGAGGGGGCTCACCCATCCCCACTGATGCCCCATGAAAACCC TGCTTCCGGGAAGGTGTCTCAAGTGGGTGGGCAGACTTCTGACG AAGCCCTGAGCATGCTGTCTGAAGGTTCTGATGCCAGCACAATTG AAATTCACACTGCAAGTGAATCCTGCAACAAAAATGAGGGTGACC CTGCTCTCCCAACCCATGGAGACCTATGAAGGGGATGTGCTGGG GGTCCAGACCCCATATTCCTCAGACTCAACAATTCTTGTTCTTTAG AACTGTGTTCTCACCTTCCCAACACTGCACTGCCGAAGTGTAGCG GCCCCCAAACCTTGCTCTCATCACCAGCTAGAGCTTCTTCCCGAA GGGCCTTTAGGATAGGAGAAAGGGTTCATGCACACACGTGTGAG

A SEQ ID NO 39 (sequência de cDNA de CLT que codifica o Antígeno 9 de CLT)

CCTGTAGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTT GAATCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGGGGAGATTGTGCCACT GCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGGGAGACTCCATATCAAAAAGA AAAAAAAATCTCTAGAGTTTGGAAACATTTACCAACCAAACCACTG ATTTCTCATCACCTCTTAGTCAAACCTCCTTGGATGGCCTTCAGAG GAGAACAGAGTAAACACCAGAAGAACTCAGGAGGAAGGAGACTG AAGGAAAGATGTATAGCCTGCGAGAAAGAAAGGGTCATGCATACA AAGAGATCAGCGAGCCACAGGATGATGACTACCTCTATTGTGAGA TGTGTCAGAACTTCTTCATTGACAGCTGTGCTGCTCATGGGCCCC CTACATTTGTAAAGGACAGTGCAGTGGACAAGGGGCATCCCAACC GTTCAGCCCTCAGTCTGCCCCCGGGGCTGAGAATTGGGCCATCA GGCATCCCTCAGGCTGGGCTTGGAGTATGGAACGAGGCATCTGA TCTGCCACTGGGTCTGCACTTTGGCCCCTATGAGGGCCGAATTAC AGAAGACGAAGAGGCAGCCAACAGTGGATATTCCTGGCTAATCAC CAAGGGGAGAAACTGCTATGAGTATGTGGATGGAAAAGATAAATC CTCGGCCAACTGGATGAGAACCAAAGCCAGAGATCCATCCATGTC CCTCATGCTGTCTGGCCTTTTCAAGTCAAAAATTTCTCAGTCAACA TGTGGAACGCAATCACTCCTCTCAGAACTTCCCAGGACCATCTGC AAGAAAACTTCTCCAACCAGAGAATCCCTGCCCAGGGGATCAGAA TCAGGAGCGGCAATATTCTGATCCACGCTGCTGTAATGACAAAAC CAAAGGTCAAGAGATCAAAGAAAGGTCCAAACTCTTGAATAAAAG GACATGGCAGAGGGAGATTTCAAGGGCCTTTTCTAGCCCACCCAA AGGACAAATGGGGAGCTCTAGAGTGGGAGAAAGAATGATGGAAG AAGAGTCCAGAACAGGCCAGAAAGTGAATCCAGGGAACACAGGC AAATTATTTGTGGGGGTAGGAATCTCAAGAATTGCGAAAGTCAAAT ATGGAGAGTGTGGGCAAGGTTTCAGTGATAAGTCAGATGTTATTA CACACCAAAGGACACACACAGGGGGGAAGCCCTACGTCTGCAGA GAGTGTGGGAGGGCTTTAGCCGGAAGTCAGACCTCCTCAGTCAC CAGAGGACACACACAGGGGAGAAGCCTTATGTCTGCAGAGAGTG TGAGCGGGGCTTTAGCCGGAAGTCAGTCCTCCTCATTCACCAGAG GACACACAGGGGAGACGCCCCAGTCTGCAGGAAGGATGAGTAAG TCATTAGTAATAAAACCTTATCTCAATAGCCACAAGAAGACAAACG TGATCACCACACACTTGCACACCCCAGCTCTGAGGTGGCTTCAGC GAAAGTCTGCTAACCCCTTACATTCCCCGAGAGTGTAAAGAGATC GGAAATAACTAATTAAACAAATCCGCCACTTTCATGACTAGAGTTG AGGAAGAACAGGGGATAGTTCTGTAAGTGTTCGGGGGACGTCAA CATGTGTGGTTGTTTCCCGCACTGATCCCCTCCATTTTTTGTGTTT TGCCTCCTGTTCTAATTAATTTTGTCTCCATACATATCTGAACCCCA AGTGTGTACCTCATTCTTCCCTTATCACTGAAGGAAGGAAGAGTC CAGAAGGGCCACAGAGAACTCAAACGTTCAGTTCAAGTCTCCACA GGAATTCAACCCCAGAAAGACATAAACTTGGAGTCCATCTGGTTTA ATTATTGGAGAATCGATTCCCAAGTCCAGGAAGAGAAATGTAGGG TTTTACAGAGTCGCAGCAGGAAAGAGAGCTCCCTGGTCTCCTGGG AAGTGTGACCTCTTCTAATGGACCCCTCTCCTCTGCTGCCATACTC CCCCTTGGCTCCCCCTGTCTCCTCTCCTGATTTCCTCCAATCTCTG TAGCCCCAGAAGTGAACGCCAGACAGGAACACGCATGTGTGTATA TATGTGTTCACGTGTGCTATGTGTGTTAAGCCTGCATGCATGGGT GTGGGGGTATGTGCCCTCTGTGTACGTATCTGTGTGAGTGTGGG GGTTTCAAGGGTGTATTAGGAATAACGCTCAAAATCCTAAGGAAAT TGAATACTCTGAGAGAAGAGAGACAGACCCTCTCATACTGTTTTAT ATTGTTTTATACTCAGAAAAGGAAAAAGAAGCAAAACTAAAGGCAG GTAGCCTGGCGCCTAGGAACCAGACCTGAAACCAAGGAACCAGA CCCGAAACCAGGCCTGGGCCGGCCTGACCTAAGCCTGGTAGTTA AAATTCGACCCCTGACCTAGCAACTGATGTTATCTATAGATTATAG AAAGACATTGTGAAACTTCCCGGTCTGTTCTGTTCCACTCTGACCA TCGGTGCATGCAGCCCCTGTCACCTACCCCCTGCTTGCTCAATCG ATCACGACCCTCTCACGTGGACCCCCTTAGAGTTGTGAGCCCTTA AAAGGGACAGGAATTGCTCACTCGGGGAGCTCGGCTCTTGAGAC

AGCAGTCTTGCTGATGCTCCTGGCCGAATAAACCGCTTCCTTCTTT SEQ ID NO 40 (sequência de cDNA de CLT que codifica o Antígeno 10 de CLT)

CCCACCTACTGATTTACCAACTCTTTTTCATTTCAACTTTTATTTTA GGTCCAGAGGGTACATGTGTGAGTTTGTTGCATGAGTATATTGTG TGACACTCATGTATGGGGTACAAATAATCCCAACACCAATGTAGA GAACACAATATCCAATAGGCAGTTCTTCAGGCCCTTTCTCCATCCT GCCCTCCCCCACATGGTAGATCCCAGTGTCTATTGTGCCCATCTT TATGTCCATGCATAACCAATGTTTAGTTCCCACTTATAAGTGAGAG CATGCAGTATTGGGCTTTCTGTGCCCACATTAATTCACTTAAGATA ATGGTCTCCAGCTGGATCCATATTGATGCAAAGTACATAATTTCTT TCATTTTATGGCTGCATAGTATTCCATGTTATGTTTGTACCACATTT TCTTTATCCAGTCCATAGCTGATGGACATCTACATTGATTCCATGT CCTCATTAATGTGAATAGTGTTTTGATGAACATATGAATGTATGTGT CTTTTTGGTAGAATAATTTATTTTCCTTTGGATATAAAGCCAGTAAT GGAATTGCTGGGTCGAATCGTCGTTCTTTTGTAAGTTCTTTGAGAT ATCTCCAAGTTTCGTTCCACAGGCACTGAAATAGTTTACATTCCCA CCAATAATGAACACGCATTCCCTTTTCTCCACAACCCTGTCAACAT CTGTTATTTTTTTACTTTTTAATAGTAGCCATTCTGACTGGTGTGTG ATGGTACTTCATTATGGCTTTCATTCGCATTTCTTTCCTGACTTGTG ATTTTGAGTAGTTTTTCATATGTTTGTTGGCGACATGTATGTCTTCT GAGAAGAGCCTGTTCATGTTTTTTGCCCACTTCTTAACAGGGCTGT TCATCTTTTGCTTGTTGATTTGTTCAAGTTTCTTAGAGATAGTGGAT ATTAGATCTCTGTTGGATGCATAGTTTGCAAATATTTTCTCTCTGTC TGTTTACCCTGTTGATAGTTTCTTTTATTGTGCAGAAACCCTTTAAT TTAATCAGGTCCAACTTATCCATTTTTCTTTTGGTTGAAATTGCTTT TGAGGACTTAGTTATGAATTATTTGCCAAAGCTGACGTCAAGAAGG GTATTCTCTAGGTTTTCTTATATGACATTTTATAGTTTTAGGTCTTAT ATTAAAGTCTTTGTTTCATCTCAAATTGACTTTTTTTCTCTGGTAAA AGGTAGGGGTCCAGTTCAAGCTCATTTTTCCATGTGGTTTTGTTAC AGTGGGTAGCTGCAGACATGAGCTGGGCAGGAGAGGCCTCTTCC

TAACAGGAATGTCAGGTGACCA SEQ ID NO. 41 (sequência de cDNA que codifica o Antígeno 1 de CLT)

ATGTGGAACTTCTTCAGGAGAGAATTAACATCCAATGGATTCCCAG AAAACTTTTCCCTCGATGTACCAGCAAACACCTACAATGCCCTGAA AAGCCGCCTCTGCGACCCCAATGCAGATCACACGTCCTGTCCCA GCCCCTGCAGCCTCCACGCGGCGGGTGCACTGCCAGGCACGGG AAGGCAGCGCTGGCGAGTAGAACTGGCCCATCTCGCAGATAGGA AGCTGAGCCTCAGGGACGTTTCACGCCTTCGTCAAGGTGGTGAG AGGAGGAGCGGGATTGCCGTGAAGGTGGTGAGAGGAGGAGCGG GGTTTGCTGCCCGACTTCAGGGATCTGTCACCCTCGTCCAGCAG GGTTGGTTCTTCCCGAGGCTGGGAGGATGCCAAGCCTGGTGGAG GATGGGGGCGGTGGTGTGGTGTGGGGAGCTTCTGACTTGCACAT CC

SEQ ID NO. 42 (sequência de cDNA que codifica o Antígeno 2 de CLT)

ATGACTGGTGTTCTTATAAGAAGAGGAGATTTGGTCACAGACATG GTTGCATGCAGAATAAAGACTTTTCGAGGACACACTGAGAAGGCA GCCATCTGCAAAACAAGGAAAGAGTCCTCAGCAGAAACCAGTCCT GCAGACTCCTTGATCTTGGACTTCCAGCCACTGCAATTGATGTCA

AGCTTCAGCACCCTTGCATCTCTGGATAAA SEQ ID NO. 43 (sequência de cDNA que codifica o Antígeno 3 de CLT)

ATGAATACTCCTAACATTGTCTCTTTAAGAGCTCACCAGCCTGAGG TAGGAATCATTCCATCTGTGTTACTAATGAGACCGCTGAGGATCAA AGGGGTTTTCCACCACATCCACTCACCTCTACATGGCGAAAACCA AGGGTTCACTCTCTGTCTTCAGGGAGCTCCACCCAGCAGCAGCGT

T SEQ ID NO. 44 (sequência de cDNA que codifica o Antígeno 4 de CLT)

ATGGCGAAAACCAAGGGTTCACTCTCTGTCTTCAGGGAGCTCCAC CCAGCAGCAGCGTTTGACAGAGCTGTTCACTTCCTCTTCCTGGAG CTGTGGCTTCCAGAGCCCATGCTCAGCAGTTCCCCTCCTTCTTCG ACTGCTCCTCTCTTAGGCTCAGAGCCACTCAGACATTGGGAAGCA

AGTTTGTCAAGA SEQ ID NO. 45 (sequência de cDNA que codifica o Antígeno 5 de CLT)

ATGAAGAGGAAAGCAAACAGGTGGAGACTCAGCCTGAGAAATGG TCTGTTGCCAAGCACACCCAGAGCTACCCAACAGATTCCTATGGA

GTTCTTGAATTCCAGGGTGGCGGATATTCCAATAAAGCCATGG SEQ ID NO 46 (sequência de cDNA que codifica o Antígeno 6 de CLT)

ATGCGTGGATTTCTGTGGAGAGTGGAAACACGGGGAGTCGAGGG GAGCATGCGCGGGCCTCAGAAAGTTCTGGGAAACCGACTCCCGG GAGCAGGGAGGAACGCGCGCTCCAGAGACAACTTCGCGGTGTG

G SEQ ID NO 47 (sequência de cDNA que codifica o Antígeno 7 de CLT)

ATGGTTTATTATGGGAATCCTGAATCCAGCCCAGGGATTTCTCTTG TCTTTGGCCTTCTACGGCTGGACAGGATGCAGCCTGGGTTTTCAG TCTCCCAGGAAGGAGATCCAGTGGGAATCACTGACCACCTCGGC

TGC SEQ ID NO 48 (sequência de cDNA que codifica o Antígeno 8 de CLT)

ATGCCAGCACAATTGAAATTCACACTGCAAGTGAATCCTGCAACAA AAATGAGGGTGACCCTGCTCTCCCAACCCATGGAGACCTATGAAG GGGATGTGCTGGGGGTCCAGACCCCATATTCCTCAGACTCAACAA

TTCTTGTTCTT SEQ ID NO 49 (sequência de cDNA que codifica o Antígeno 9 de CLT)

ATGGGGAGCTCTAGAGTGGGAGAAAGAATGATGGAAGAAGAGTC CAGAACAGGCCAGAAAGTGAATCCAGGGAACACAGGCAAATTATT TGTGGGGGTAGGAATCTCAAGAATTGCGAAAGTCAAATATGGAGA GTGTGGGCAAGGTTTCAGTGATAAGTCAGATGTTATTACACACCA AAGGACACACACAGGGGGGAAGCCCTACGTCTGCAGAGAGTGTG GGAGGGCTTTAGCCGGAAGTCAGACCTCCTCAGTCACCAGAGGA CACACACAGGGGAGAAGCCTTATGTCTGCAGAGAGTGTGAGCGG GGCTTTAGCCGGAAGTCAGTCCTCCTCATTCACCAGAGGACACAC AGGGGAGACGCCCCAGTCTGCAGGAAGGATGAGTAAGTCATTAG TAATAAAACCTTATCTCAATAGCCACAAGAAGACAAACGTGATCAC CACACACTTGCACACCCCAGCTCTGAGGTGGCTTCAGCGAAAGTC

TGCTAACCCCTTACATTCCCCGAGAGTG SEQ ID NO 50 (sequência de cDNA que codifica o Antígeno 10 de CLT)

ATGCATAGTTTGCAAATATTTTCTCTCTGTCTGTTTACCCTGTTGAT AGTTTCTTTTATTGTGCAGAAACCCTTTAATTTAATCAGGTCCAACT TATCCATTTTTCTTTTGGTTGAAATTGCTTTTGAGGACTTAGTTATG AATTATTTGCCAAAGCTGACGTCAAGAAGGGTATTCTCTAGGTTTT CTTATATGACATTTTATAGTTTTAGGTCTTATATTAAAGTCTTTGTTT CATCTCAAATTGACTTTTTTTCTCTGGTAAAAGGTAGGGGTCCAGT

TCAAGCTCATTTTTCCATGTGGTTTTGTTACAGTGGG SEQ ID NO. 51 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 4 de CLT)

AAFDRAVHF SEQ ID NO. 52 (sequência de peptídeo derivada do antígeno 4 de CLT)

AFDRAVHF SEQ ID NO. 53 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 3 de CLT)

RPLRIKGVF SEQ ID NO. 54 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 4 de CLT)

KTKGSLSVF SEQ ID NO.55 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 1 de CLT)

VPANTYNALK SEQ ID NO.56 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 1 de CLT)

RLGGCQAWWR SEQ ID NO.57 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 1 de CLT)

ANTYNALKSR SEQ ID NO.58 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

LVTDMVACRI SEQ ID NO.59 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

LILDFQPLQL

SEQ ID NO.60 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

MSSFSTLASL SEQ ID NO.61 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

LMSSFSTLASL SEQ ID NO.62 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

LMSSFSTLA SEQ ID NO.63 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

QLMSSFSTLA SEQ ID NO.64 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

MVACRIKTFR SEQ ID NO.65 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

VTDMVACRIK SEQ ID NO.66 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

SPADSLIL SEQ ID NO.67 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 3 de CLT)

NTPNIVSLRA SEQ ID NO.68 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 3 de CLT)

VLLMRPLRIK SEQ ID NO.69 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 3 de CLT)

MRPLRIKGVF

SEQ ID NO.70 (sequência de peptídeo derivada do antígeno 4 de CLT)

FLFLELWL SEQ ID NO.71 (sequência de peptídeo derivada do antígeno 4 de CLT)

SVFRELHPA SEQ ID NO.72 (sequência de peptídeo derivada do antígeno 4 de CLT)

SPPSSTAPL SEQ ID NO.73 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 1 de CLT)

RLQGSVTLV SEQ ID NO.74 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 1 de CLT)

VPANTYNAL SEQ ID NO.75 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

QLMSSFSTL SEQ ID NO.76 (sequência de peptídeo derivada do antígeno 4 de CLT)

FLELWLPEPML SEQ ID NO.77 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 4 de CLT)

APLLGSEPL SEQ ID NO. 78 (sequência de peptídeo derivada do Antígeno 2 de CLT)

SLILDFQPL

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 1; e (b) uma variante imunogênica da sequência de (a) que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1; e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a) que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1.

2. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que compreende ou consiste na sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs. 1, 11 a 14, 55 a 57 e 73 a 74.

3. Polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo isolado, como definido na reivindicação 1 ou 2, fundido com um segundo ou outro polipeptídeo selecionado de (i) um ou mais outros polipeptídeos selecionados de (x) polipeptídeos que têm as sequências das SEQ ID NOs: 2 a 10 e variantes imunogênicas dos polipeptídeos de (x) que são pelo menos 80% idênticas aos mes- mos e fragmentos imunogênicos dos polipeptídeos de (x) que compre- endem pelo menos 9 aminoácidos contíguos da sequência do dito po- lipeptídeo e (y) polipeptídeos que têm as sequências das SEQ ID NOs: 15 a 32, 51 a 54, 58 a 72 e 75 a 78 (ii) outros polipeptídeos que são antígenos associados a melanoma (iii) sequências polipeptídicas que têm capacidade para intensificar uma resposta imunológica (ou seja, sequências imunoestimulantes) e (iv) sequências polipeptídicas, por exemplo, compreendendo epítopos auxiliares CD4 universais, que têm capacidade para fornecer CD4+ forte para ajudar a aumentar as res- postas das células T CD8+ a epítopos de antígeno.

4. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo de fusão, como definido na reivindicação 3.

5. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico isolado que codifica o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 4.

6. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 4, ou o vetor, como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é um DNA.

7. Ácido nucleico ou vetor, como definido na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende uma sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs. 33 e 41.

8. Ácido nucleico ou vetor, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é otimizado por có- dons para expressão em uma célula hospedeira humana.

9. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 4, ou o vetor, como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é um RNA.

10. Ácido nucleico ou vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 4, 5, 6, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é uma sequência de ácido nucleico artificial.

11. Vetor, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 5 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende DNA que codifica elementos reguladores adequados para permitir a transcrição de uma molécula de RNA traducionalmente ativa em uma célula hos- pedeira humana.

12. Vetor, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 5 a 11, caracterizado pelo fato de que é um vetor viral.

13. Vetor, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é um vetor adenoviral, um vírus adeno-associado (AAV), alfavírus, vírus do herpes, vírus de arena, vírus do sarampo, poxvírus, paramixovírus, lentivírus e vetor de rabdovírus.

14. Composição farmacêutica imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo, um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo, polipeptídeo de fusão, ácido nucleico ou vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, jun- tamente com um carreador farmaceuticamente aceitável.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, carac- terizada pelo fato de que compreende um ou mais imunoestimulantes.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, carac- terizada pelo fato de que os imunoestimulantes são selecionados de sais de alumínio, saponinas, oligonucleotídeos imunoestimuladores, emulsões de óleo em água, aminoalquil glicosaminida 4-fosfatos, lipo- polissacarídeos e derivados dos mesmos e outros ligantes de TLR4, ligantes de TLR7, ligantes de TLR8, ligantes de TLR9, IL-12 e interfe- rons.

17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que é uma composição estéril adequada para administração parenteral.

18. Polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipep- tídeo, polipeptídeo de fusão, ácido nucleico, vetor ou composição, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracteriza- do pelo fato de que serve para uso em medicina.

19. Método para aumentar uma resposta imunológica em um ser humano, caracterizado pelo fato de que compreende a admi- nistração ao dito ser humano do polipeptídeo, ácido nucleico que codi- fica o dito polipeptídeo, vetor ou composição, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 17.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteri- zado pelo fato de que a resposta imunológica é aumentada contra um tumor canceroso que expressa uma sequência selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos

80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1.

21. Polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipep- tídeo, polipeptídeo de fusão, ácido nucleico, vetor ou composição, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracteriza- do pelo fato de que serve para uso no aumento de uma resposta imu- nológica em um ser humano.

22. Polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipep- tídeo, polipeptídeo de fusão, ácido nucleico, vetor ou composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a res- posta imunológica é aumentada contra um tumor cancerígeno que ex- pressa uma sequência correspondente selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1.

23. Método de tratamento de um paciente humano que so- fre de câncer, em que as células do câncer expressam uma sequência selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmen- to imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 ami- noácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, ou para prevenir que um ser humano sofra de câncer cujo câncer expressaria uma sequência sele- cionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 amino- ácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao dito ser humano, de um polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo, polipeptídeo de fusão,

ácido nucleico, vetor ou composição correspondente, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

24. Polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipep- tídeo, polipeptídeo de fusão, ácido nucleico, vetor ou composição, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracteriza- do pelo fato de que serve para uso no tratamento ou prevenção de câncer em um ser humano, em que as células do câncer expressam uma sequência correspondente selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idênti- ca à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO:

1.

25. Polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipep- tídeo, polipeptídeo de fusão, ácido nucleico, vetor ou composição, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracteriza- do pelo fato de que serve para uso na estimulação ex vivo e/ou ampli- ficação de células T derivadas de um ser humano que sofre de câncer, para reintrodução subsequente das ditas células T estimuladas e/ou amplificadas no dito ser humano para o tratamento do dito câncer no dito ser humano.

26. Método de tratamento de câncer em um ser humano, caracterizado pelo fato de que as células do câncer expressam uma sequência selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, que compreende coletar do dito ser humano uma população de leucócitos que compre- ende pelo menos células T opcionalmente com células apresentadoras de antígeno, estimular e/ou amplificar as ditas células T na presença de um polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo,

polipeptídeo de fusão, ácido nucleico, vetor ou composição correspon- dente, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, e reintroduzir alguns ou todos os ditos glóbulos brancos pelo menos es- timulados e/ou amplificados por células T no ser humano.

27. Método ou polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo, polipeptídeo de fusão, ácido nucleico, vetor ou com- posição para uso, como definido em qualquer uma das reivindicações 20 e 22 a 26, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo.

28. Processo de preparação de uma população de células T que é citotóxica para células cancerosas que expressam uma se- quência selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1 e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo me- nos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, caracterizado pelo fato de que compreende (a) obter células T opcionalmente com células apresentadoras de antígeno de um paciente com câncer e (b) estimu- lar e amplificar a população de células T ex vivo com um polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo, polipeptídeo de fusão, ácido nucleico, vetor ou composição correspondente, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

29. População de células T, caracterizada pelo fato de que é obtida por um processo que compreende (a) obter células T opcio- nalmente com células apresentadoras de antígeno de um paciente com câncer e (b) estimular e amplificar a população de células T ex vivo com um polipeptídeo que tem a sequência da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1.

30. Célula T que foi estimulada com um polipeptídeo, ca- racterizada pelo fato de que tem a sequência da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo me- nos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1.

31. Célula apresentadora de antígeno, caracterizada pelo fato de que é modificada por carregamento ex vivo com o polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo, polipeptídeo de fusão, ácido nucleico, vetor ou composição, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou geneticamente modificada para expres- sar o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

32. Célula apresentadora de antígeno, de acordo com a rei- vindicação 31, caracterizada pelo fato de que é uma célula dendrítica.

33. Exossoma carregado com um polipeptídeo, caracteri- zado pelo fato de que é preparado a partir de células carregadas com um polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo, poli- peptídeo de fusão, ácido nucleico, vetor ou composição, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou geneticamente modifi- cado para expressar o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

34. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a população de células T, a célula T, a célula apre- sentadora de antígeno ou exossoma, como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 33, juntamente com um carreador farmaceuti- camente aceitável.

35. População de células T, célula T, célula apresentadora de antígeno ou exossoma, como definido em qualquer uma das reivin- dicações 29 a 33, caracterizado pelo fato de que serve para uso em medicina.

36. Método de tratamento de um ser humano que sofre de câncer, caracterizado pelo fato de que as células do câncer expres- sam uma sequência selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imu-

nogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreen- de pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, ou para prevenir que um ser humano sofra de câncer, em que as células do câncer expressariam uma sequência selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, que compreende a administração ao dito ser humano da popu- lação de células T, célula T, célula apresentadora de antígeno, exos- soma ou composição, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 29 a 34.

37. População de células T, célula T, célula apresentadora de antígeno, exossoma ou composição, como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 34, caracterizada pelo fato de que serve para uso no tratamento ou prevenção de câncer em um ser humano, em que as células do câncer expressam uma sequência correspon- dente selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo me- nos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1.

38. Processo, método ou população de células T, célula T, célula apresentadora de antígeno, exossoma ou composição para uso, como definido em qualquer uma das reivindicações 28, 36 e 37, carac- terizado pelo fato de que o câncer é melanoma, por exemplo, mela- noma cutâneo.

39. Polipeptídeo de ligação a antígeno isolado, caracteri- zado pelo fato de que é imunoespecífico para um polipeptídeo que tem a sequência da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1.

40. Polipeptídeo de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo mo- noclonal ou um fragmento do mesmo.

41. Polipeptídeo de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que é acoplado a uma porção química citotóxica.

42. Polipeptídeo de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que serve para uso em medicina.

43. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações de 39 a 41, juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável.

44. Método de tratamento de um ser humano que sofre de câncer, caracterizado pelo fato de que as células do câncer expres- sam uma sequência selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imu- nogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreen- de pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, ou para prevenir que um ser humano sofra de câncer, em que as células do câncer expressariam uma sequência selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, que compreende a administração ao dito ser humano do poli- peptídeo de ligação ao antígeno ou composição, como definido em qualquer uma das reivindicações 39 a 41 e 43.

45. Polipeptídeo de ligação a antígeno ou composição, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 39 a 41 e 43, para uso no tratamento ou prevenção de câncer em um ser humano, carac- terizado pelo fato de que as células do câncer expressam uma se- quência correspondente selecionada das SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compre- ende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1.

46. Método, polipeptídeo de ligação ao antígeno ou compo- sição, como definido na reivindicação 44 ou 45, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma, por exemplo, melanoma cutâneo.

47. Polipeptídeo de ligação a antígeno isolado, caracteri- zado pelo fato de que é imunoespecífico para um polipeptídeo ligado a HLA que é ou faz parte do polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

48. Polipeptídeo de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que é um receptor de cé- lulas T ou um fragmento do mesmo.

49. Polipeptídeo de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 47 ou 48, caracterizado pelo fato de que tem capacida- de de ligação a células citotóxicas ou outros componentes imunes em um indivíduo.

50. Célula citotóxica, caracterizada pelo fato de que foi ge- neticamente modificada para expressar o polipeptídeo de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 47 a 49, em sua superfície.

51. Célula citotóxica, de acordo com a reivindicação 50, ca- racterizada pelo fato de que é uma célula T.

52. Célula citotóxica, de acordo com a reivindicação 50 ou 51, caracterizada pelo fato de que serve para uso em medicina.

53. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a célula, como definida na reivindicação 50 ou 51.

54. Método de tratamento de um paciente humano que so- fre de câncer em que as células do câncer expressam uma sequência selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmen- to imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 ami- noácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, ou para prevenir que um ser humano sofra de câncer cujo câncer expressaria uma sequência sele- cionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 amino- ácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao dito ser humano de uma célula, como definida na reivindicação 50 ou 51.

55. Célula citotóxica, de acordo com a reivindicação 50 ou 51, para uso no tratamento ou prevenção de câncer em um ser huma- no, caracterizada pelo fato de que as células do câncer expressam uma sequência correspondente selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idênti- ca à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO:

1.

56. Método para diagnosticar um ser humano que sofre de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: determinar se as células do dito câncer expressam uma se- quência de polipeptídeos selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compre- ende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, ou um ácido nucleico que codifica a dita sequência polipeptídica selecionada das sequências das SEQ ID NOs: 33 e 41, e diagnosticar o dito ser humano como sofrendo de câncer se o dito polipeptídeo ou ácido nu- cleico correspondente for superexpresso nas ditas células cancerosas.

57. Método para diagnosticar que um ser humano sofre de câncer, que é melanoma cutâneo ou melanoma uveal, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: determinar se as células do dito câncer expressam uma sequência polipeptídica selecionada da SEQ ID NO. 1, uma variante imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1; ou um ácido nucleico que codifica a dita sequência polipeptídica, e diagnosticar o dito ser humano como sofrendo de cân- cer que é melanoma cutâneo ou melanoma uveal se o dito polipeptí- deo ou ácido nucleico correspondente for superexpresso nas ditas cé- lulas cancerosas.

58. Método de tratamento de um ser humano que sofre de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) determinar se as células do dito câncer expressam uma sequência de polipeptídeos selecionada da SEQ ID NO. 1, uma varian- te imunogênica da SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1, e um fragmento imunogênico da SEQ ID NO: 1 que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, ou um ácido nucleico que codifica a dita sequência polipeptídica (por exemplo, selecionada das sequências das SEQ ID NOs. 33 e 41); e se (b) administrar ao dito ser humano um polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo, polipeptídeo de fusão, ácido nucleico, vetor, composição, população de células T, célula T, célula apresentadora de antígeno, exossoma, polipeptídeo de ligação ao an- tígeno ou célula citotóxica correspondente, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, 29 a 34, 39 a 41, 43, 49, 50 e 52.

59. Uso de um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 1; ou (b) uma variante imunogênica das sequências de (a) que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1; e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a) que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1; isolado do tumor de um ser humano que sofre de câncer, ou uso de um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo selecio- nado das sequências da SEQ ID NO: 33 e 41, como um biomarcador para a determinação para verificar se o dito ser humano seria adequa- do para o tratamento por uma vacina compreendendo um polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo, proteína de fusão, áci- do nucleico, vetor, composição, população de células T, célula T, célu- la de apresentação de antígeno, exossoma, polipeptídeo de ligação ao antígeno ou célula citotóxica correspondente, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 17, 29 a 34, 39 a 41, 43, 50, 51 e 53.

60. Método ou uso, de acordo com a reivindicação 58 ou 59, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma, por exem- plo, melanoma cutâneo.

61. Método ou polipeptídeo, ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor ou composi- ção para uso, como definido em qualquer uma das reivindicações 20 e 22 a 26, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma uveal.

62. Método, de acordo com a reivindicação 44, ou um poli- peptídeo de ligação ao antígeno ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma uveal.

63. Processo, método ou população de células T, célula T, célula apresentadora de antígeno, exossoma ou composição para uso, como definido em qualquer uma das reivindicações 28, 36 e 37, carac-

terizado pelo fato de que o câncer é melanoma uveal.

64. Método ou uso, como definido em qualquer uma das reivindicações 58 ou 59, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma uveal.

65. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende: (x) um polipeptídeo que compreende uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 1; e (b) uma variante imunogênica da sequência de (a) que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1; e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a) que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1, e (y) uma ou mais (por exemplo, uma, duas ou três) sequên- cias selecionadas das sequências das SEQ ID NOs. 2, 3 e 4; ou, em relação a cada uma das ditas sequências das SEQ ID NOs. 2, 3 e 4, uma variante da dita sequência que é pelo menos 80% idêntica à dita sequência ou um fragmento imunogênico que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da dita sequência.

66. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 1; e (b) uma variante imunogênica da sequência de (a) que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1; e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a) que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1; e (ii) uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 2; e (b) uma variante imunogênica da sequência de (a) que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 2; e

(c) um fragmento imunogênico da sequência de (a) que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 2; e (iii) uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 3; e (b) uma variante imunogênica da sequência de (a) que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 3; e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a) que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 3; e (iv) uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 4; e (b) uma variante imunogênica da sequência de (a) que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 4; e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a) que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 4.

67. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que compreende as sequências das SEQ ID NOs. 1, 2, 3 e 4.

68. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 1; e (b) uma variante imunogênica da sequência de (a) que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1; e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a) que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1; e (ii) uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 2; e (b) uma variante imunogênica da sequência de (a) que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 2; e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a) que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 2; e (iii) uma sequência selecionada de: (a) a sequência da SEQ ID NO. 4; e (b) uma variante imunogênica da sequência de (a) que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 4; e (c) um fragmento imunogênico da sequência de (a) que compreende pelo menos 9 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 4.

69. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que compreende as sequências das SEQ ID NOs. 1, 2 e 4.

70. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 65 a 69.

71. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 70, ca- racterizado pelo fato de que é um DNA.

72. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 71.

73. Vetor, como definido na reivindicação 71, caracteriza- do pelo fato de que compreende DNA que codifica elementos regula- dores adequados para permitir a transcrição de uma molécula de RNA traducionalmente ativa em uma célula hospedeira humana.

74. Vetor, de acordo com a reivindicação 72 ou 73, carac- terizado pelo fato de que é um vetor viral.