KR20080052647A - 사람 백혈구 항원 (ｈｌａ) ⅰ형 또는 ⅱ형 분자 결합 종양관련 펩티드 및 관련 항암 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역요법과 면역요법에 있어 사용되는 분자와 세포에 대한 것이다. 특히 본 발명은 암에 대한 면역요법이다. 더욱이 본 발명은 종양 관련 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자 단독 또는 기타 종양 관련 펩티드와의 병용에 대한 것이며, 항 종양 면역 반응을 자극하는 백신 구성의 활성 제제로 작용한다. 특히 본 발명은 항 종양 면역 반응 유발하는 백신 구성에 사용될 수 있는 사람 종양세포주의 HLA II형 분자에서 유도된 두 가지 새로운 펩티드 서열에 대한 것이다.

Description

사람 백혈구 항원 (ＨＬＡ) Ⅰ형 또는 Ⅱ형 분자 결합 종양 관련 펩티드 및 관련 항암 백신{TUMOR-ASSOCIATED PEPTIDES BINDING TO HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN (HLA) CLASS I OR II MOLECULES AND RELATED ANTI-CANCER VACCINE}

본 발명은 면역요법 및 면역요법에 사용되는 분자와 세포에 대한 것이다. 특히, 본 발명은 암(특히 신장암)에 대한 면역요법이다. 더욱이 본 발명은 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자 단독 또는 기타 종양 관련 펩티드와의 병용에 대한 것이며, 이러한 기타 종양 관련 펩티드는 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 구성의 활성 제제로 작용한다. 특히 본 발명은 항종양 면역 반응을 유발하는 백신 구성에 사용될 수 있는 사람 종양 세포주의 HLA I형 및 II형 분자에서 유도된 두 가지 새로운 펩티드 서열에 대한 것이다.

본원에 인용된 모든 문헌은 내용 전체가 본 발명을 위해 참고로 혼입된다.

면역 반응의 자극은 숙주의 면역체계가 외부 물질로 인식하는 항원의 존재 여부에 달려있다. 항원 관련 종양의 존재 여부에 대한 발견은 숙주의 면역 체계를 사용하여 종양 성장에 개입할 수 있다는 가능성을 증대시켰다. 면역 체계의 체액 및 세포 아암 (arms) 모두를 이용하는 여러 기전은 현재 암 면역요법으로 탐구되고 있다.

세포 면역 반응의 특정 요소에는 특히 종양 세포를 인식하여 파괴할 수 있는 것이 있다. 종양침윤 세포 집단이나 말초 혈액으로부터 세포독성 T세포(CTL)를 분리하여 세포가 암에 대항하는 자연 면역 방어에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다(Cheever 외., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112). 특히, CD8 양성 T 세포(TCD8 양성)는 세포질에 위치한 단백질에서 유도된 대개 8 내지 10개의 잔기인 펩티드를 지탱하는 주조직 적합성 복합체(MHC) I형 분자를 인식하는데, 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 사람의 MHC 분자도 사람 백혈구 항원(HLA)이다.

MHC 분자에는 두 가지 형태가 있는데, MHC I형 분자는 내인성 단백질과 커다란 펩티드의 단백질 분해로 발생한 본 펩티드를 나타내는 핵을 보유한 대부분의 세포에서 볼 수 있다. MHC II형 분자는 전문 항원 제시 세포(APC)에서만 발견되며, 세포내 이입 과정 중 APC에서 취한 외인단백질의 펩티드를 제시하여 처리된다. 펩티드와 MHC I의 복합체는 CD8 양성 세포독성 T 림프구에 의해 인식되고, 펩티드와 MHC II의 복합체는 CD4 양성 보조 T 세포에 의해 인식된다.

CD4 양성 보조 T 세포는 항종양 T 세포 반응의 효과기 기능을 조정하는데 중요한 역할을 하므로, 이런 이유로 종양 관련 항원(TAA)에서 유도된 CD4 양성 T 세포 항원결정인자를 확인하는 것은 항종양 면역 반응을 유발하는 의약품 개발에 있어 상당히 중요할 수 있다(Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras Cuesta, 그 리고 E. Celis. 2002. 암종배아 항원에서 보조 T 림프구의 항원결정인자 확인. Clin. Cancer Res . 8:3219 3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jㅴger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, 그리고 L.J. Old. 2003. 암환자의 NY ESO 1에 대한 CD4+ T세포 반응의 자연 발생에 대한 조사: 항체 반응과의 상관관계. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 100(15):8862-7).

마우스 등의 포유동물 모델을 통해, CD4 양성 T 세포는 세포독성 T 림프구(CTL) 효과기 세포(즉, CD8 양성 T 림프구)의 부재 하에서도 인터페론 감마(IFNγ)의 분비로 인한 혈관형성 억제를 통해 종양 발현을 억제하기에 충분하다는 것이 나타났다(Qin, Z. 그리고 T. Blankenstein. 2000. CD4+ T 세포 매개 종양 거부는 비조혈세포에 의한 IFN 감마 수용체 발현에 의존하는 혈관생성의 억제와 관련. Immunity. 12:677-686). 더욱이 HLA II형 분자에 의해 제시되는 종양 관련 항원에서 펩티드를 인식하는 CD4 양성 T 세포는 항체(Ab) 반응 유도를 통해 종양 진행에 반대작용을 할 수 있다(Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, 그리고 R.K. Bright. 2003. CD4 양성 T 림프구는 원숭이 바이러스의 40개 대형 종양 항원에 대해 항체 생산과 종양 면역에서 중요한 역할을 한다. Cancer Res. 63:1040-1045). HLA I형 분자에 결합하는 종양 관련 펩티드와는 대조적으로 지금까지 소수의 TAA II형 리간드만이 기술되어 왔다(www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). HLA II형 분자의 기본구성 발현이 대개 면역 체계의 세포에 제한되어 있으므로(Mach, B., V. Steimle, E. Martinez Soria, 그리고 W. Reith. 1996. MHC II형 유전자 규 정: 질병에서 얻는 교훈. Annu . Rev . Immunol . 14:301-331), II형 펩티드를 원발 종양(Primary Tumour)에서 직접 분리하는 것은 불가능하다고 간주되었다. 따라서 항원을 항원 제시 세포의 II형 처리 경로로 유인하는 것을 목적으로 하는 여러 가지 전략이 기술되었으며, 그러한 예로 관심 있는 항원과 함께 APC를 배양하여 이를 취하여 처리하고 전달될 수 있게 한 것이나(Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, 그리고 B.P. van der Bruggen. 1999. CD4(+) T 림프구에 HLA-DR 분자에 의해 전달되는 MAGE 3 항원결정인자 확인. J. Exp . Med . 189:767-778), 혹은 리소솜 MHC II형 처리 및 집합 구역(MIIC)에 항원 전위를 매개하는 불변사슬에 용해된 유전자 또는 관심 있는 항원을 인코딩하는 미니유전자와의 세포 이입을 들 수 있다.

펩티드가 분자 면역 반응을 유발(도출)하기 위해서는 MHC 분자에 결합해야 한다. 이 프로세스는 MHC 분자의 대립유전자와 펩티드의 아미노산 서열의 특정 다형태에 의존한다. MHC I형 결합 펩티드는 대개 잔기가 8 내지 10이고 대응하는 MHC 분자의 결합 그루브와 상호작용하는 1차 핵산 서열에서 두 가지 보존 잔기 "고정(anchor)"을 담고 있다.

염증이 없는 경우, MHC II형 분자의 발현은 주로 면역 체계의 세포, 특히 단핵구와 단핵구 유도 세포, 포식세포, 수지상세포 등의 전문 항원 제시 세포로 제한된다.

종양 특정 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 이들의 항원결정인자는 효소 및 수용체, 전사 인자(transcription) 등과 같은 모든 단백질 등급에서 유도된 분 자들일 수 있다. 예를 들어, 더욱이 종양 관련 항원은 돌연변이 유전자 제품으로써 종양세포에만 존재할 수 있다. 종양 관련 항원의 또 다른 중요한 부류는 여러 다른 종양과 고환의 건강한 조직에 발현되는 CT("고환암") 항원과 같은 조직 특성의 구조를 가졌다는 것이다.

여러 가지 종양 관련 항원이 확인되어 왔으며, 게다가 추가적인 종양 관련 항원을 발견하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 일부 종양 관련 항원 집단은 기술적으로는 종양 특이적 항원이라고도 불리며 조직 특이적이다. 그 예로는 멜라닌종(melanoma)에 대한 티로시나제(tyrosinase)와 전립선암에 대한 PSA와 PSMA, 림프종의 bcr/abl과 같은 염색체 교차(전위)가 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 그러나 확인된 많은 종양 관련 항원들은 여러 종양 형태와 실제 변환 사례를 유발하는 발암성 단백질 및 종양 억제 유전자(한 예로 종양 억제 유전자는 Linehan WM, Walther MM, Zbar B에서 신장암에 대해 검토되었다. 신장암의 유전 기본. J Urol. 2003 Dec;170(6 Pt 1):2163-72) 등 거의 모든 종양 형태에서 발생한다. 예를 들어, 세포 성장과 분화를 조절하는 정상 세포 단백질은 p53(종양 억제 유전자의 예), 마우스, c-met, myc, pRB, VHL 및 HER 2/neu와 같이 돌연변이를 촉진하여 이런 유전자 제품의 발현을 상향 조절(upregulation)하여 결국 발암성이 되도록 할 수 있다 (McCartey 외. Cancer Research 1998 15:58 2601 5; Disis 외. Ciba Found. Symp. 1994 187:198-211).

Mucin 1 (MUC1)은 유방암과 난소암과 같은 많은 사람 샘암종의 세포 표면에 매우 과잉 발현하는 고도로 당화된 타입 I형 막 당단백질이다. 악성종양 내 이상 비당화(deglycosylation)는 일반적이며 정상세포에서 볼 수 없는 종양세포의 항원결정인자를 밝혀낸다. 더욱이 다발 골수종과 일부 B 세포 비호지킨 림프종(B cell Non Hodgkin lymphomas)에서 MUC1의 발현이 증명되어 왔다(Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, Duhig T, Rothbard J, 그리고 Burchell J. 암종에 발현된 인체의 다형태 상피 점액의 높은 면역원성 지역은 일렬 반복으로 구성. J. Biol. Chem. 263:12820-12823 (1988); Siddiqui 1988; Girling A, Bartkova J, Burchell J, Gendler S, Gillett C, 그리고 Taylor Papadimitriou J. 단일클론 항체인 SM 3에 의해 감지된 다형태 상피 점액의 핵심 단백질 항원결정인자는 원발 암종의 범위에 선택적으로 노출됨. Int. J. Cancer 43:1072-1076 (1989); Brossart 1999; Duperray 1989; Mark 1989; Delsol 1988; Apostolopoulos V 그리고 McKenzie IF. 세포 점액: 면역요법 표적. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian Blander J, and Barratt Boyes SM. MUC 1 상피 종양 점액 기반 면역 및 암 백신. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995)). 여러 최근 보고서(Apostolopoulos V 그리고 McKenzie IF. Cellular mucins: 면역 요법 표적. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian Blander J, and Barratt Boyes SM. MUC 1 상피 종양 점액 기반 면역 및 암 백신. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995); Barnd 1989; Takahashi 1994; Noto 1997)에 따르면 난소 및 유방, 췌장, 다발골수증 종양의 세포독성 MHC 비제한 T 세포가 일렬 반복에 국한된 MUC1 단백질 핵심의 항원결정인자를 인지할 수 있음이 증명되었다. MUC1 단백질에 서 유도된 두 가지 HLA-A2-제한 T 세포 항원결정인자(HLA-A2-restricted T cell epitopes)가 확인되었다(Brossart 1999, EP 1484397). 한 펩티드는 MUC1 단백질의 일렬 반복 지역에서 유도되며, 두 번째 펩티드는 MUC1의 단일 서열 내에 국한되어 있다. 유방 또는 난소 진행암이 있는 환자들을 대상으로 펩티드 펄스(peptide-pulsed) 수지상세포로 접종한 후 실시한 생체 내 세포독성 T 림프구 반응 유도는 성공적이었다(Brossart 2000) (Wierecky 2005). 콩팥세포암종은 기존 종양에서 MUC1 발현이 일반적이고, 종양 등급 및 단계와 관련이 있는 것으로 보고 되었다(Fujita 1999; Kraus 2002; Leroy 2002; Bamias 2003; Cao 2000). MUC1의 경우, 단백질의 과다 발현은 mRNA 과다발현과 상관관계가 없다.

아디포필린(adipophilin)은 지질 비말을 함유한 특수 분화 세포의 지표이자 지방 축적 세포와 관련 있는 질병의 지표이다(Heid 1998). 아디포필린은 섬유모세포(fibroblasts)와 내피세포, 상피세포를 포함하여 배양 세포주의 광범위한 범위에 걸쳐 발생한다. 그러나 조직에서 아디포필린의 발현은 특정 세포 형태에만 제한되어 있는데, 수유 유방 상피세포, 부신피질 세포, 남성 생기계의 세르톨리 라이디히 세포(Sertoli and Leydig cells), 알코올 간경화의 지방증 또는 지방변성 간세포 등이 그러한 예이다(Heid 1998). 보고에 따르면 아디포필린은 결장직장암(Saha 2001)과 간세포암종(Kurokawa 2004), 콩팥세포암종(Young 2001)에서 과다 발현한다.

c-Met는 베타 아단위(β-subunit)에 연결된 이황화물인 알파 사슬(α-chain)로 구성된 티로신 키나제(tyrosine kinase) 활동으로 이형 경막양수(heterodimeric transmembranous) 수용체를 인코딩한다(Bottaro 1991; Rubin 1993). 두 가지 아단위 모두 표면에 발현되고, 베타 아단위(β-subunit)는 리간드인 간세포 성장 인자(HGF) 결합을 담당하며, 알파 아단위(α-subunit)는 여러 다른 신호 전달 경로의 활성을 매개하는 세포내 영역을 포함한다. c-Met 신호전달은 기관 재생에 관여하는데 이는 간, 신장, 배아형성, 조혈, 근개발, 그리고 정상적으로 활동하는 B형 세포 및 단핵세포의 이동과 고정 조정에 대해 나타난 바와 같다(Zarnegar 1995; Naldini 1991; Montesano 1998; Schmidt 1995; Uehara 1995; Bladt 1995; Takayama 1996; Mizuno 1993; van, V 1997; Beilmann 2000). 더욱이 수많은 연구를 통해 악성으로의 전환 및 악성세포의 침습에 있어 c-Met의 과다 발현이 관련 있는 것으로 나타났다.

c-Met는 세포 성장 증지, 운동, 생존, 세포 외 기질 용해 및 혈관형성을 포함하여 다기능의 HGF/산란 계수의 발암성 활동 잠재성을 매개한다(Bottaro 1991; Rubin 1993; Zarnegar 1995). HGF가 수용체에 결합하게 되면 c-Met의 자가인산화를 유도하고, Ras, 포스파티딜노시톨 3-키나제(phosphatidylinositol 3'-kinase), 포스포리파제Cγ(phospholipase Cγ), 미토젠 활성 단백 키나제 관련 경로를 포함하여 하류 신호전달 사례를 활성화한다(Naldini 1991; Montesano 1998; Furge 2000; Ponzetto 1993; Dong 2001; Furge 2001). c-Met 유전자는 상피세포에 주로 발현되고, 여러 악성 조직과 세포주에 과다 발현된다(Di Renzo 1995; Ferracini 1995; Tuck 1996; Koochekpour 1997; Li 2001; Fischer 1998; Maulik 2002; Qian 2002; Ramirez 2000). 조혈악(haematopoietic) 세포와 신경세포, 골격세포 같은 비상피성 세포들은 HGF에 반응하고, 다골수종과 같은 혈액암, 호지킨병, 백혈병, 림프종은 c-Met 단백질을 발현한다는 사실이 더 많은 보고서를 통해 나타났다(Gherardi 1991; Teofili 2001; Borset 1999; Jucker 1994; Pons 1998). c-Met 활성 변이에 의해 자극 받아 발암성으로 활성화된 c-Met에 의한 침습적 성장 표현형의 조절 해지 및 c-Met 증폭/과다 발현, HGF/c-Met 자가분비 고리 획득은 암세포에 침습적, 전이 특성을 부여한다. 특히 HGF 과다 발현의 유전자 삽입 마우스에서 기본구성 활성화는 광범위한 종양생성(tumourigenesis)을 촉진한다(Wang 2001; Takayama 1997).

G 단백질 신호전달 5(RGS5) 조절기는 세포 내(heterotrimeric) G 단백질 신호전달 경로의 역조절기이나 생체 내 그 기능을 알 수는 없다. RGS 단백질은 촉매 기능을 통합하나 조직 분포에 변화를 가하는 분자과를 포함한다. 이들은 활성화된 Gα 아단위의 내인 구아노신 트리포스파테이스(GTPase) 활동을 자극하여 결국 G 단백질 불활성을 가속화한다. 따라서 RGS 분자는 G 단백질 연결 수용체의 하류 신호전달을 억제한다(De 2000). 최근에 밝혀진 바에 따르면 종양 신생혈관이 증식하는 동안 혈관주위 세포(pericytes) 내 G 단백질 신호전달의 조절기가 활성관 재형성에 부합하는 것으로 나타났다. 이자섬 세포 발암이 있는 마우스 모델뿐 아니라 고도의 혈관형성 성상세포종에서, 활성관 재형성을 동반한 혈관형성 전환동안 혈관주위 세포(pericytes)에서 RGS5의 과다 발현이 나타났다. 과다발현은 정상 랑게르한섬(islet of Langerhans)과 비교해서 종양 혈관계에 제한되었으나 RGS5는 상처 치유와 배란주기 동안에도 역시 상향조절(upregulated)된다(Berger 2005).

RGS5 발현은 RCC에서 증가한다(Rae 2000). 또 다른 연구에서는 RT PCR이 검사한 모든 RCC에서 RGS5가 강력하게 발현된 것으로 나타났으며, 정상 신장에서는 발현이 매우 약하거나 확인이 어려웠다(6.6:1 by real-time PCR). 종양 내피세포는 RCC에서 RGS5의 주 위치였다(Furuya 2004). 게다가 RGS5는 간세포 암종의 굴모양 내피세포 지표인 것으로 보고되었다(Chen 2004).

아포지방단백 L1(APOL1)은 분비된 고밀도 지질단백으로 아포지방단백 A-1에 결합한다. 아포지방단백 A-1은 비교적 혈장 단백질이 풍부하며 HDL의 주 아포단백질이다. 이는 혈장 내 대부분의 콜레스테롤에스테르(cholesteryl esters)의 형성에 연관된 것은 물론, 세포에서 콜레스테롤의 유출을 증진시킨다. 아포지방단백 L1(APOL1)은 지질 교환 역할을 할 수 있으며 신체 전체에 전달될뿐 아니라 역으로 말초세포에서 간까지 콜레스테롤을 전달한다. 혈장 단백질은 약 40 kDa의 명백한 분자량을 갖는 단일 사슬 폴리펩티드(polypeptide)이다(Duchateau 1997; Duchateau 2001). APOL1 cDNA는 활성화된 내피세포 cDNA 라이브러리에서 분리되어 있으며, 감염 유발 가능성이 있는 시토킨(cytokine)인 TNF-α에 의해 상향조절되는 것으로 나타났다(Monajemi 2002).

KIAA0367은 잠정 진단을 위해 인코딩하는 알려지지 않은, 사람의 지속 전사물 확인을 목표로 한 Kazusa cDNA 프로젝트를 통해 확인되었다(Ohara 1997). KIAA0367의 잠정 820 아미노산 지속 단백질 제품의 기능은 확인되지 않았으나, 소형 소수 분자를 결합하고 여러 뉴클리오티드 교환 인자와 BCL2/아데노바이러스(adenovirus) E1B 19-kDa 단백질 상호작용 단백질 2(BNIP 2)에 있는 카르복실 기(C-말단)에서 영역 계수를 결합하는 CRAL-TRIP 지질이 여기에 포함된다. BNIP 2는 세포 분자학과 이주, 세포내이입, 세포 주기 진행을 포함하여 각양각색의 세포 기능 조절에 관여한다(Zhou 2005). KIAA0367은 염색체 영역 9q21에 위치한다. 이 영역은 많은 종양에서 동종접합 결손의 일반적인 표적(Gursky 2001; Weber 2001) 혹은 이형접합성 소실(LOH)로 기술된다(Louhelainen 2000; Tripathi 2003).

알파와 베타 아단위(1 헴 그룹)를 포함하는 이형 단백질인 구아닐산사이클레이스(sGC)는 GTP를 이차 전령 cGMP로 전환하는 촉매 역할을 하며, 산화질소와 nitrovasodilator 약물의 주 수용체 기능을 한다(Zabel 1998). GUCYa3와 b3는 사람 신경아교종에 과다 발현된다. 안티센스(antisense) GUCY1A3나 GUCY1B3의 핵산전달감염은 실험용 마우스(nude mice)의 혈관분포와 종양 성장을 감소시켰으며, 이는 VEFG가 cGMP로 유발된다는 사실에 기인한 것일 수 있다(Saino 2004). GUCY1A3는 마우스 유방 종양 세포주의 종양 세포 이주를 촉진한다(Jadeski 2003).

D1 주기는 매우 보전적인 사이클린(cyclins)족, 더 구체적으로는 사이클린(cyclins) D 아과에 속한다(Xiong 1991; Lew 1991). 사이클린(cyclins)은 CDKs(cyclin-dependent kinases)의 조절기 기능을 한다. 다른 사이클린들(cyclins)은 각 유사분열 사례의 일시적 협조에 기여하는 명백한 발현과 분해 패턴을 보인다(Deshpande 2005). 사이클린(Cyclin) D1은 CDK4나 CDK6와 복합체를 구성하고 CDK4나 CDK6의 조절 아단위로 작용하는데 이러한 활동은 세포 주기 G1/S 이행에 필요한 것이다. CCND1은 CDK4 및 CDK6와 함께, 복합체에 기질 특이도를 부여하는 세린(serine)/티로닌(threonine) 키나제 완전효소 복합체를 형성한다(Bates 1994). 단백질은 종양 억제 단백질 Rb(Loden 2002)와 상호작용하는 것으로 나타났으며, 이 유전자의 발현은 Rb에 의해 양성으로 조절된다(Halaban 1999). 세포 주기 진행을 변경시키는 본 유전자의 변이와 증폭, 과다 발현은 다양한 종양에서 자주 관찰되며, 종양발생에 기여할 수 있다(Hedberg 1999; Vasef 1999; Troussard 2000).

기질 금속단백분해효소(MMP)의 단백질족은 배아 개발과 재생산, 조직 재형성과 같은 정상적 생리 과정뿐 아니라 관절염 및 전이와 같은 질병 과정에서 세포 외 복합체 분해에 관여되어 있다(Mott 2004). 기질 금속단백분해효소 7(MMP7)은 세포 외 단백분해효소(proteinase)에 의한 분열 시에 활성화되는 29.6 kDa의 비활성 프로단백질로 분비된다. 활성 효소는 19.1 kDa의 분자 무게로 아단위 당 두 가지 아연 이온(zinc ion)과 두 가지 칼슘 이온을 결합한다(Miyazaki 1990; Browner 1995). MMP7은 젤라틴과 섬유결합소(fibronectin), 카세인(casein)을 저하(Miyazaki 1990; Quantin 1989)시키며, 보존 C-말단(C-terminal) 단백질 도메인이 부족하다는 점에서 대부분의 MMP족 구성원과는 다르다(Gaire 1994). MMP7은 자주 악성 조직에 과다발현(Lin 2004; Bramhall 1997; Denys 2004)되며, 생체 내 종양세포 침습을 촉진한다고 나타난다(Wang 2005).

본 단백질은 다양한 형태의 암에서 종양 특정 면역 반응의 표적이 될 수 있다.

B형 간염 바이러스 핵심 항원 펩티드 HBV 001은 사람 종양 관련 항원 내부에서 유도되지 않으나, B형 간염 바이러스 핵심 항원에서 유도된다. 첫째, TUMAP에서 유도된 T 세포 반응의 크기를 정량 비교할 수 있게 하여, 항종양 반응을 유발하기 위한 용량에 대한 중요한 결론을 내릴 수 있게 한다. 둘째, 환자를 대상으로 하여 T 세포 반응이 있을 시 중요한 양성 조절로써 기능한다. 그리고 셋째, 환자의 면역적격 상태에 대해 결론을 내릴 수도 있게 한다.

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전세계 3억5천만 명 가량 영향을 미치는 간 질환 중에서도 선두 원인에 해당한다(Rehermann 2005). 수평적, 수직적 전달의 편이성과 간경화와 간세포암종에 이를 수 있는 만성 질병의 잠재성 때문에 HBV는 전세계 많은 국가의 공중 보건 시스템에 중대한 영향을 준다. HBV 유전체(Previsani 2002)는 부분적으로 이중 가닥의 고리형 DNA로 구성되어 있다. HBV 바이러스 입자에서, 지질이 담긴 외피와 표면 단백질족 HBs(막 단백질로도 불림)에 둘러쌓여 있는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 형성하기 위해 핵심 단백질 HBc와 다른 단백질과 함께 포장된다. HBc 및 HBs와 연관된 항원 결정기는 각각 HBcAg와 HBsAg로 언급된다. 이 항원들은 혈청학과 관련이 있다. 예를 들어, 사람 혈액에서 발견되고 임상적으로 가장 유용한 HBV 감염 진단용 항원 항체 시스템 중에서 항원 반응. 이전의 HBc는 HBV 감염 기록없이도 모든 개인의 새로운 외부 항원을 대표하게 된다. 면역 펩티드는 본 항원으로 잘 알려져 있기 때문에(Bertoletti 1993; Livingston 1997), HBcAg의 하나의 10 핵산 펩티드는 IMA 내에서 양성 조절 항원으로 선정되었다. 따라서 HBc 펩티드 특정 CTLs 유도는 환자 면역 적합과 성공적 접종의 지표로써 사용될 것이다.

암 환자 대상의 면역요법은 특히 면역체계의 활성 세포, 특히종양 세포에 대항하나 건강한 세포에는 대항하지 않는 세포독성 T 세포(CTL, "세포 킬러"로도 알 려져 있고, CD8 양성 T 세포로도 알려짐)에 맞추고 있다. 종양세포는 종양 관련 단백질 발현으로 인한 건강한 세포와는 다르다. 세포 표면의 HLA 분자는 외부에 분자 함량을 전달하여 세포독성 T 세포가 건강한 세포와 종양 세포를 식별할 수 있도록 한다(Rammensee 1993). 종양 세포에 있는 펩티드는 신체의 건강한 세포에 훨씬 낮은 범위까지 또는 그렇지 않은 범위까지, 종양 관련 펩티드(TUMAPs)라고 불린다.

종양 관련 펩티드를 사용하는 첫번째 임상 시험은 부운(Boon)과 그 동료들에 의해흑색종 위주로 1990년대 중반에 시작되었다. 최상의 임상시험 중에서 임상 반응은 10%에서 30%였다. 펩티드 기반의 백신 단일요법을 이용한 임상시험 어디서도 심각한 부작용이나 심각한 자가면역은 보고되지 않았다. 흑색종 관련 펩티드로 치료했던 일부 환자들에 대해 백반증의 경미한 형태가 보고되었다.

그러나 대개 CTL 한 종류만 주입하는 것은 모든 종양 세포를 제거하는데 충분하지 않다. 종양들은 매우 변이성이 있어서 CTL의 인식을 회피하기 위해 그들의 단백질 패턴을 바꿔 CTL 공격에 신속하게 반응할 수 있다. 종양 회피 기전을 맞공격하기 위해 다양한 특정 펩티드가 접종에 사용된다. 이런 방식으로 광범위한 동시 공격이 여러 CTL 클론에 의해 종양에 대항해 동시에 공격이 이루어질 수 있다. 이는 종양 가능성을 낮추어 면역 반응을 회피할 수 있다. 본 가설은 최근 흑색종 후기 단계 환자들을 치료하는 임상 연구에서 확인 되었다. 소수의 예외가 있었지만, 최소 3가지 분명한 T 세포 반응을 보였던 환자들은 긍정적인 임상 반응 또는 안정 병변을 보였고(Banchereau 2001), 생존율도 상승하였으나(personal communication with J. Banchereau과의 개인적 연락에 따르면), 반면 대다수의 3가지 이하의 T 세 포 반응을 가진 환자들은 병변이 진전되는 것으로 진단받았다.

현재까지 II형이나 I형 진행 경로로 항원을 유인하는 것을 목표로 하는 수많은 전략들이 소개되었다. 항원 제시 세포를 관심 있는 항원과 함께 취하여 처리키 위해 이를 배양하는 것은 가능하다(Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778. Dengjel J, Schoor O, Fischer R, Reich M, Kraus M, Muller M, Kreymborg K, Altenberend F, Brandenburg J, Kalbacher H, Brock R, Driessen C, Rammensee HG, Stevanovic S. 자가포식현상(autophagy)이 세포내 원천 단백질로부터 펩티드의 MHC II형 전달을 촉진함. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 May 31;102(22):7922-7). 기타 전략들은 리포솜 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 사용한다. 그런 융합 단백질은 APC에 발현되어, 항원을 II형 처리 구획으로 돌린다(Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell Biol. 131, 351 369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430).

종양 특이 항원으로써 단백질이 세포독성 T 림프구에 의해 인식되고 치료법에 사용되기 위해서는 특정한 필요요건이 수행되어야 한다. 주로 항원은 정상적인 건강한 조직이 아닌 종양 세포에 의해 발현되거나 소량으로 발현되어야 한다. 더욱이 각 항원은 한 종류의 종양에 제시될 뿐 아니라 높은 농도(예: 세포 당 숫자 복사)에서 제시되는 것이 바람직하다. 종양 관련 항원에서 유도된 이러한 펩티드("면 역학적 펩티드")가 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응으로 이어져야 하므로 항원의 아미노산 서열 내에 항원결정인자가 필수적으로 존재해야 한다.

환자들의 약 30% 가량은 전이 병변이 있으며, 환자의 25%는 국소적으로 진행된 종양을 가지고 있다. 외과적 절제를 받는 개인의 40%는 결국 전이가 나타날 것이다. 전이 병변이 있는 개인들 중에서 약 75% 정도는 폐로 전이되고, 36%는 림프절 및 연조직 병발, 20%는 골 병발, 18%는 간 병발을 보인다. 5년 생존율은 롭손(Robson) 단계 등급에 따라 달라진다. 모두 합쳐 RCC는 환자의 80% 가량에게 여전히 치명적이다(Senn HJ, Drings P, Glaus A, Jungi WF, Pralle HB, Sauer R, 그리고 Schlag PM. Checkliste Onkologie, 5th edition. Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York (2001), Vokes EE, 그리고 Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)).

TNM에 따라 실시되고 있는 신장 세포 암종의 분류는(Guinan P. 신장 세포 암종의 TNM 단계. '신장 세포 암종의 진단과 예후: 1997 워크샵'에 소개되었음, Rochester, Minnesota, March21 22, Communication of the UICC-Union Internationale Contre le Cancer, 그리고 AJCC American Joint Committee on Cancer, ASC American Society Cancer (1997) 발표, Communication of the UICC) 하기 표 A 및 B를 참조하기 바란다.

*미국 비뇨기 질병 재단(American Foundation for Urologic Disease)

RCC의 기본 치료로는 (모든 단계에 대한) 근치 신장절제술이 있다. 방사선 요법은 암 확산을 줄이는데 사용될 수 있으나, 신장 세포 암종은 방사선에 주로 내성을 보인다. 호르몬 요법은 일부 경우(10% 이하)에서 종양 성장을 줄일 수 있다. 현재까지 화학요법은 본 질환에서 어떤 유의미한 활동도 보이지 않았다. 빈블라스틴(vinblastine)과 5-FU (5-플루오로우라실), 플록스우리단(floxuridane) (FUDR)은 가장 많이 연구되는 화학요법이지만 5-FU와 그 신진대사물인 FUDR만이 10-12%의 활동률을 보였다(Vokes EE, 그리고 Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)). Gemcitabine과 5 FU의 조합은 17% 반응률을 보였다.

알파 인터페론(IFNα)이나 인터루킨-2(IL-2)와 같은 면역 치료는, 진행된 RCC 치료에 대한 미국과 유럽의 허가 기관에 의해 최근 몇 년간 평가되었다. 높은 용량의 IL-2 치료는 현재까지 미 식품의약국(FDA)에서 융리하게 허가받은 면역 요법이다. IFNα 단일요법은 초기에는 25-30% 반응률을 가진 것으로 보고되었으나, 추가 시험을 통해 약 10%만이 참반응률을 보이는 것으로 나타났다(Vokes EE, 그리고 Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)). IL-2는 항구적 완전 완화가 된 환자들 중 약 5%의 IFNα와 비교하여 유사한 총 반응율을 가진 것으로 보인다(Rosenberg 1987). 진행된 RCC가 있는 6,000명 이상의 환자들을 대상으로 한 최근 메타분석에 따르면, 평균적으로 12.9%의 임상 반응율만이 시토킨 요법(예: IFN-alpha, 고용량 IL-2 일시 주사 또는 IL-2 흡입)에 도달할 수 있는 것으로 나타났다. 동일한 분석에 따르면 위약 검사에서는 4.3%의 반응이, 비면역요법 조절 아암(arms)에서는 2.5%의 반응을 보였다(Cochrane Database Syst Rev. 2000;(3):CD001425. 진행된 신장 세포 암에 대한 면역요법. Coppin C, Porzsolt F, Awa A, Kumpf J, Coldman A, Wilt T).

여러 종양에서 새로운 요법들이 임상적 효능을 보이고 최근 몇 년간 승인을 받았음에도 불구하고, 신장 세포 암종에 대한 생존율은 지난 10년 내 크게 변하지 않았다. 현재 가능한 전신 치료 옵션인 화학요법뿐 아니라 면역 치료는 비교적 낮은 효능 결과를 보였고 더 중요한 것은 유의한 체독성으로 제한된다는 것이다. 결과적으로 신장 세포 암종에서 새로운 치료 옵션에 대한 잠재적인 의료적 필요성이 존재하게 되는 것이다.

보조 T 세포는 항종양 면역에서 CTL의 효과기 기능을 조율하는 데에 중요한 역할을 한다. TH1형의 보조 T 세포 반응을 유발하는 보조 T 세포 항원결정인자는 CD8 양성 킬러 T 세포의 효과기 기능을 돕는데, 여기에는 종양 관련 펩티드 혹은 이러한 펩티드 세포 표면의 MHC 복합체를 표시하는 종양 세포에 대해 대항하는 세포독성 기능이 포함된다. 이런 식으로 종양 관련 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자는 단독 또는 다른 종양 관련 펩티드와 병행하여, 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 구성의 활성 제약 성분으로 제공될 수 있다.

따라서 종양 백신 개발에 있어 주요 목적은 새로운 종양 관련 항원과 거기서 유도된 면역 보조 T 항원결정인자를 파악하고 특징을 부여하는 것이며, 이 새로운 종양은 특정 T_H1형 CD4 양성 T 세포 내의 CD8 양성 T 세포나 CD4 양성 T 세포에 의해 인식된다. 따라서 본 발명의 목적은 주조직적합 복합체(MHC) I형 (HLA I형) 또는 II형 (HLA II형)의 분자에 결합하는 능력을 가진 펩티드를 위한 새로운 아미노산 서열을 제공하는 것이다. 더 나아가 본 발명은 언급한 새로운 펩티드를 기반으로 하여 적어도 일부에서 효력있는 항암 백신을 제공하는 것 역시 목표로 한다.

본 발명에 따르면, 첫번째 목적은 첨부된 서열 리스트의 서열번호 1이나 서열번호 2 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 서열을 포함하는 펩티드군에서 선정된 종양 관련 펩티드를 제공함으로써 해결되는데, 여기에서 하나의 펩티드는 사람 주조직적합 복합체(MHC) II형 (HLA II형)의 분자에 결합하는 능력이 있고 다른 하나는 사람 주조직적합 복합체(MHC) I형 (HLA I형)의 분자에 결합하는 능력이 있다. 단 여기서의 펩티드는 완전한 사람 종양 관련 폴리펩티드가 아니여야 한다. 본 발명에서 발명자들은 포유동물의 종양, 바람직하게는 사람 종양, 그리고 가능하다면 신장 세포 암종에서 직접 HLA I형 또는 II형 분자에 결합하는 펩티드를 분리 및 특징지울 수 있음을 증명하고 있다.

본 발명은 종양생성과 관련있는 항원에서 유도된 펩티드를 제공하며, 사람 백혈구, 특히 림프구, T 림프구, 특히 CD4 양성 T 림프구, 특히 T_H1 면역 반응을 중개하는 CD4 양성 T 림프구의 면역 반응을 유발하기 위해 HLA II형 분자에 충분히 결합하는 능력을 가진 펩티드를 제공한다.

또한 본 발명은 종양생성과 관련있는 항원에서 발생한 펩티드를 제공하며, 사람 백혈구, 특히 림프구, 특히 T 림프구, 특히 CD8 양성 세포독성 T 림프구의 면역 반응 유발을 위해 HLA I형 분자에 충분히 결합하는 능력을 가진 펩티드를 제공한다.

펩티드는 종양 관련 항원, 특히 단백질 분해와 혈관 생성, 세포 성장, 세포 주기 조절, 세포 분열, 전사 조절, 전위 조절, 특히 금속단백분해효소 7(MMP7; 서열번호 1)와 아포지단백 L1(APOL1; 서열번호 4)에서 얻은 종양 관련 펩티드를 포함한 조직 침범 등의 기능을 하는 종양 관련 항원에서 발생한다.

본 발명에서 발명자들은 HLA II형 분자, 특히 사람 유전자의 HLA-DR 좌에 의해 유전자적으로 인코딩된 HLA II형의 대립형질에 불규칙적으로 충분히 결합하는 종양 관련 펩티드가 사람 CD4 양성 T 세포에 의해 매개된 면역 반응을 유발할 수 있다는 결정적인 사례를 제공하고 있다. CD4 양성 T 세포는 사람 말초혈액으로부터 분리되었으며, 이는 상기한 펩티드가 종양 세포 펩티돔의 선택된 펩티드에 대한 사람 면역체계의 T 세포 반응을 유발하기에 적합하다는 것을 증명한다. 하단에 MMP7(서열번호 1)에서 얻은 펩티드의 예와 같이, 불규칙하게 HLA-DR 결합되는 종양 관련 펩티드는 CD4 양성 T 세포에 의해 인식되는 것으로 나타났다.

유사하게도 HLA I형 분자에 충분히 결합되는 종양 관련 펩티드는 사람 CD8 양성 세포독성 T 림프구에 의해 매개된 면역 반응을 유발할 수 있는 것으로 나타났으며, 상기한 펩티드는 또한 종양 세포 펩티돔의 선택된 펩티드에 대항하는 사람 면역체계의 반응을 유발하기에 적합함을 증명한다.

펩티드는 화학적으로 합성되고 제제용 활성 제약 요소로써 사용될 수 있으므로 본 발명에서 제공된 펩티드는 면역요법, 특히 암 면역요법에 사용될 수 있다.

펩티드 기반의 면역요법 개발을 위한 TAA에서 HLA I형 또는 II형을 확인하기 위해 발명가들은 고형 종양, 특히 신장 세포 암종(RCC)에서 직접 펩티드 분리를 시도하였다(하단의 예제 참조).

이러한 개념의 기술적 증거를 나타내기 위해 RCC에 초점을 맞춘 이유는 다음과 같다. 전세계 약 15만 명이 해마다 신규 진단을 받고 있는 RCC는 매년 약 78,000건의 사망률을 보인다(Pavlovich, C.P. 그리고 L.S. Schmidt. 2004. 신장 세포 암종의 유전적 원인 규명. Nat. Rev. Cancer 4:381-393). 전이가 진단되면 1년 생존율은 약 60%로 하락하고(Jemal, A., R.C. Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E.J. Feuer, 그리고 M.J. Thun. 2004. Cancer statistics, 2004. CA Cancer J. Clin. 54:8-29). 이는 의료적 치료가 이루어지기 힘들다는 것을 암시한다. RCC는 종양 반응 및 종양 침윤성 CTL의 존재에 의해 암시되는 바와 같이(Finke, J.H., P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R.R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes, 그리고 R. Bukowski. 1990. 사람 신장 세포 암종 내 CD4+ 및 CD8+ 종양 침윤 림프구의 세포 용해 활동의 특징. Cancer Res. 50:2363-2370) 면역원성 종양으로 여겨지므로(Oliver RTD, Mehta A, Barnett MJ. 전이된 신장 세포 암종이 있는 환자들을 대상으로 한 감시 및 진행 시 치료하는 환자들의 반응을 평가하는 제 2상. Mol Biother. 1988;1:14 20. Gleave M, Elhilali M, Frodet Y, 외. 전이 신장 세포 암종에 대한 감마인터페론 1b(Interferon gamma 1b)와 위약 비교. N Engl J Med. 1998;338:1265), 펩티드 기반의 항암 백신 개발을 위한 임상 시험이 착수되었다(Wierecky J, Mueller M, Brossart P. MUC 1을 표적으로 하는 수지상세포 기반 암 면역요법. Cancer Immunol Immunother. 2005 Apr 28). 그러나 종양 관련 항원의 보조 T 세포 항원결정인자가 부족함에 따라 분자적으로 규명된 백신은 대개 I형 리간드만으로써 기능하는 펩티드를 포함한다.

본 발명의 두번째 목적은 약제 제조 방법을 제공하는 것으로, 암 세포, 특히 고형 종양 세포에 대해 효과적인 백신 형태이며 본 발명에 따른 펩티드의 효과적인 용량을 포함하거나 그러한 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 게다가 백신은 보다 효과적이기 위해 펩티드 및 부형제를 추가로 함유할 수 있으며, 이는 하단에 자세히 설명된다.

펩티드나 핵산을 인코딩하는 펩티드도 종양 또는 암 백신의 구성 요소가 된다. 이것은 환자에게 직접 투여되거나, 영향받은 장기 혹은 전신으로, 또는 환자나 사람 세포주에서 유도된 세포(결과적으로 환자에게 투여되는 세포)에 생체 밖 적용되거나, 또는 환자에서 유도된 면역 세포로부터 소인구집단을 선택하기 위해 체외 사용된 후 환자에 재투여될 수 있다.

본 발명의 첫번째 측면에서 펩티드는 서열번호 1 (SQDDIKGIQKLYGKRS) 또는 서열번호 2 (VMAGDIYSV) 또는 그 변이에 따른 핵산 서열을 포함한다. 단 이 펩티드는 핵산 서열이 유도된 완전한 사람 폴리펩티드가 아니어야 한다(예: 유전자자리 링크 ID에 열거된 대로 전체 길이 서열 중 하나) (영구 숫자, 하단에 첨부한 표 1 참조).

하단에 설명된 대로, 본 발명의 기초를 형성하는 펩티드는 MHC I형 또는 II형 부하 세포(RCC)에 의해 소개된 대로 모두 확인되었다. 따라서 이들 특정 펩티드 뿐 아니라 서열을 함유한 기타 펩티드(예: 유도된 펩티드)는 유발될 이런 반응의 범위가 개별 펩티드에서부터 펩티드까지 다양할 수 있을지라도, 모두 특정 T 세포 반응을 유발한다. 예를 들면, 언급된 펩티드의 돌연변이(하단 참조)로 인해 차이점이 발생할 수 있다. 본 기술에 대한 전문가는, 특히 본문의 예제 및 관련 참고 문헌에 따라 각각의 펩티드에 의해 유발되는 반응의 범위를 결정하기 위해 적용될 수 있는 방법을 잘 인지하고 있다.

가급적 본 발명에 따른 펩티드는 본질적으로 서열번호 1이나 서열번호 2 또는 그 변이에 따른 핵산 서열로 구성되어 있다.

"본질적으로 구성"되어 있다는 것은 본 발명에 따른 펩티드는 서열번호 1이나 서열번호 11 또는 그 변이에 따른 서열 외에도 추가로 결합 동기를 구성하는 펩티드의 핵심 서열과 면역 보조 T 항원결정인자로 작용하는 펩티드의 일부를 필수적으로 형성하지 않는 핵산의 N 또는 C 영구 위치한 신장의 함유를 의미한다.

그럼에도 불구하고 이런 신장은 본 발명에 따른 펩티드를 세포에 유효하게 도입하기 위해서 중요할 수 있다. 본 발명 구현 시, 본 발명의 펩티드는 NCBI, GenBank Accession number X00497에서 유도된 불변사슬과 관련된 HLA-DR의 80 N 말단 핵산(p33, 하단 "Ii")으로 구성된다(Strubin, M., Mach, B. 그리고 Long, E.O. HLA-DR 관련 불변사슬에 대한 mRNA 완전 서열은 비정상적 막 극성 EMBO J와 폴리펩티드를 드러냄. 3 (4), 869-872 (1984)).

예를 들어, 상기한 핵산 서열의 "변이"란 하나 또는 두 가지 핵산 잔기의 곁사슬이 교체되어(예를 들어, 자연적으로 발생하는 다른 핵산 잔기 또는 일부 다른 곁사슬의 곁사슬로 교체함으로써), 상기한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 동일한 방법으로 펩티드가 HLA 분자에 실질적으로 결합할 수 있다는 의미이다. 예를 들어, HLA II형 분자의 경우에는 HLA-DRB1, 또는 I형 분자의 경우에는 HLA A2와 같은 적합한 MHC 분자와 상호작용하고 결합하는 능력을 (개선하지는 않더라도) 적어도 유지할 수 있도록 펩티드가 수정될 수 있으며, 본 발명의 다른 측면에서 규명된 대로 아미노 핵산을 함유하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있는 활성화된 CTL을 생성하는 능력 또는 CD8 양성 T 세포를 돕거나 시토킨을 분비하여 표적 세포를 직접 공격하도록 도움을 줄 수 있는 보조 T 세포를 자극하는 능력을 (개선하지는 않더라도) 적어도 유지할 수 있도록 펩티드가 수정될 수 있다. 하단에 설명한 바와 같이 데이터베이스에서 얻을 수 있는 것은 펩티드를 결합하는 HLA-DR의 특정 포지션은 일반적으로 HLA 결합 그루브의 결합 모티프에 핵심 서열 부착을 형성하는 고정 잔기이다. HLA-DR을 결합하는데 관계한 이 잔기와 다른 잔기의 변화는 CTL 인식을 변경하지 않고 결합을 증진할 수도 있다.

T 세포 수용체와 상호작용하는데 필수적이지 않은 아미노산 잔기는 다른 아미노산으로 교체되어 수정될 수 있는데, 이 아미노산의 편입은 결과적으로 T 세포 반응성에 영향을 주지 않으며 관련 MHC와의 결합을 제거하지 않는다. 따라서 주어진 프로비소(proviso)에서 분리되어 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열이나 상기한 아미노산 서열의 일부나 변이를 포함하는 어느 펩티드(올리고펩티드(oligopeptide)나 폴리펩티드(polypeptide)를 포함하는 용어에 의해)라도 가능하다.

더욱이 MHC II형 표시 펩티드로 알려진 이들 펩티드들은 특정 HLA 특이적 아미노산 모티프가 있는 "핵심 서열"로 구성되어 있으며 선택적으로는 핵심 서열의 기능(예: 펩티드와 T 세포의 상호작용과 관계없는 것으로 간주)을 방해하지 않는 N-말단 확대 또는 C-말단 확대로 구성되어 있다. N-말단 확대 또는 C-말단 확대는 각각 아미노산 길이 1 10 사이에 있을 수 있다. 그러므로 본 발명의 바람직한 펩티드 길이는 전반적으로 9에서 100개까지이며 가급적 9에서 30개 사이와, 9에서 16개 아미노산 사이가 가장 선호된다. 이들 펩티드는 MHC II형 분자가 서열에 직접 로딩되기 위해 사용되거나, 하단의 설명에 따라 서열이 벡터로 복제될 수 있다. 이들 펩티드들이 세포 내 대형 펩티드 처리의 최종 산물을 형성하므로, 보다 긴 펩티드도 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 어느 크기라도 가능하나, 가급적 50,000 Da 이하와 더 가급적으로는 10,000 Da 이하, 일반적으로 5,000 Da 정도로 100,000 Da 이하의 분자 무게일 수 있다. 아미노산 잔기의 수의 경우, 본 발명의 펩티드는 가급적 500보다 적은 잔기와 더 가급적으로는 100보다 적은 잔기로 1,000 이하의 잔기를 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서 MHC II형 분자에 대해 상기한 상황과 유사하게, 펩티드는 HLA I형 분자의 핵심 또는 부분 서열을 동시에 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 펩티드는 MHC I형의 특정 반응을 유발하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 MHC I형 특이적 펩티드는 전체 길이 9와 16개 사이에, 가급적 9와 12개 사이의 아미노산을 나타낸다. 그런 펩티드들은 MHC II형 펩티드와 유사한 더 긴 펩티드로써 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다(예: 백신). HLA I형 분자에 대해 특정 HLA 특이적 아미노산 모티프를 갖는 MHC I형 특이적 "핵심 서열"을 확인하는 방법은 전문가들에게 알려져 있으며, 컴퓨터 프로그램 PAProC (http://www.uni tuebingen.de/uni/kxi/) 및 SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de)로도 예측이 가능하다(하단 참조).

본 발명의 펩티드는 T 세포가 본 발명의 펩티드의 기초를 형성하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 인식할 수 있도록 면역요법 방식에서 특히 유용하다. 주어진 아미노산 서열을 포함하는 이런 특이적 펩티드가 HLA I형이나 HLA II형 분자에 결합하므로, 본 발명의 펩티드는 HLA I형이나 HLA II형 분자를 결합하며 따라서 HLA 펩티드 복합체가 적절한 항원 전달 세포의 표면에 있을 때에는 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 인식하는 T 세포의 자극을 유발할 수 있는 것이 선호된다.

핵산 잔기가 약 12 보다 더 큰 펩티드가 MHC 분자에 직접 결합하여 사용된다면, 핵심 HLA 결합 영역을 측면 공격하는 잔기는 특히 MHC 분자의 결합 그루브에 결합하거나 T 세포에 펩티드를 전달하는 펩티드의 능력에 결과적으로 영향을 주지 않는 것이 선호된다. 그러나 이미 상기하였듯이, 이런 대형 펩티드가 적절한 항원 전달 세포에 의해 분열될 수 있으므로, 대형 펩티드는 특히 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 때 사용될 수 있을 것이다.

MHC 리간드와 모티프, 변이의 펩티드의 예뿐만 아니라 N 말단 확대 및 C-말단 확대의 특정 예제로는 http://syfpeithi.bmi heidelberg.com/의 데이터베이스 SYFPEITHI(Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: MHC 리간드와 펩티드 모티프 데이터베이스. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3 4):213 9. Review.)와 본문에 인용된 참고 문헌에서 얻을 수 있다.

비제한(non-limiting) 예제로써, 데이터베이스 내 HLA-DR에 대한 특정 펩티드로는 Ig kappa 사슬 188-203에서 얻어진 K H K V Y A C E V T H Q G L S S(Kovats 외. Eur J Immunol. 1997 Apr;27(4):1014-21); Ig kappa 사슬 145 159에서 얻은 K V Q W K V D N A L Q S G N S (Kovats 외. Eur J Immunol. 1997 Apr;27(4):1014-21), GAD65 270 283에서 얻은 L P R L I A F T S E H S H F(Endl 외. J Clin Invest. 1997 May 15;99(10):2405-15) 또는 GAD65 556-575에서 얻은 F F R M V I S N P A A T H Q D I D F L I(Endl 외. J Clin Invest. 1997 May 15;99(10):2405-15)이 있다. 그 외에 펩티드는 bcr abl 210 kD 융합 단백질에서 얻은 A T G F K Q S S K A L Q R P V A S의 경우나(ten Bosch 외. Blood. 1996 Nov 1;88(9):3522-7), HCV 1 NS3 28-41에서 얻은 G Y K V L V L N P S V A A(Diepolder 외. J Virol. 1997 Aug;71(8):6011-9), 또는 HIV 1 (HXB2) RT 326-345에서 얻은 F R K Q N P D I V I Q Y M D D L Y V G(van der Burg 외. J Immunol. 1999 Jan 1;162(1):152-60)과 같은 항원의 돌연변이된 서열에서도 얻을 수 있다. 모든 "고정" 아미노산(Friede 외 참조, Biochim Biophys Acta. 1996 Jun 7;1316(2):85-101; Sette 외. J Immunol. 1993 Sep 15;151(6):3163-70.; Hammer 외. Cell. 1993 Jul 16;74(1):197-203., 그리고 Hammer 외. J Exp Med. 1995 May 1;181(5):1847-55. As examples for HLA-DR4)은 뚜렷한 잠정적 핵심 서열이 강조되어 나타났다.

상기에 설명된 모든 펩티드는 주어진 아미노산 서열의 "변이"라는 용어에 모두 포함된다.

"펩티드"에는 펩티드(-CO-NH-) 결합에 의해 묶이지는 아미노산 잔기 분자뿐만 아니라, 펩티드 결합에 반하는 분자까지도 포함된다. 이러한 리트로-인버소-펩티도미네틱(retro-inverso-peptidomimetics)은, 본문에 인용된 참고문헌으로 Meziere 외 학자들이 1997년에 J. Immunol. 159,3230-3237에 밝힌 것과 같은 기술적인 방법으로 만들어진 것이다. 이 접근법은 가성펩티드(pseudopeptide) 제작을 포함하는 것인데, 이 펩티드는 곁사슬의 골결은 포함하나 그의 방향은 포함하지 않는 변화를 갖는다. Meziere 외(1997)는 MHC II형과 보조 T 세포 반응에 대해서, 이러한 가성펩티드가 효과적이라고 보았다. 리트로 인버소 펩티드는 CO NH 펩티드 결합이 아닌 NH-CO 결합을 포함하며, 단백질 가수분해에 비교적 저항력이 세다.

본 발명의 펩티드는, 만약 항원제시세포에서 발현될 경우, 가공되어 그 조각이 적절한 MHC 분자에 결합하고 적절한 세포에 의해 제시된 후 최종적으로 바람직한 T 세포 반응을 꾀하게 된다. 본 펩티드로부터 만들어진 조각이 이 발명의 펩티드가 된다. 본 발명의 펩티드는 이미 주어진 아미노산 서열 혹은 그 일부나 그 변이를 포함하는 부위를 가지고 있고 이외의 추가 부위는 다른 특성을 가지고 있다. 예를 들어, 추가 부위에는 T 세포 항원결정인자를 추가적으로 가질 수도 있고 (첫 T세포 항원결정인자 포함부위와 같은 폴리펩티드에서 유도되었거나 그렇지 않아도) 또한 운반 단백질 혹은 펩티드를 포함할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 1) 우리 단백질의 일부분 혹은 2) 단백질 조각들의 융합 단백질이며 또한 우리의 단백질 부위가 하나 이상의 독창적인 아미노산 서열을 가진다면 3) 새로운 폴리펩티드 부위일 수 도 있다.

특히 바람직한 본 발명의 펩티드는, 비정상적으로 종양 관련 항원(TAA)을 발현 하는 특정한 종양에 대해 T세포 반응을 촉진할 수 있는 추가 T 세포 항원결정인자 부위 안에서, 최소한 한 개 이상의 T세포 항원결정인자를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 이 펩티드를 백신으로도 쓸 수 있는 "실에 꿴 염주알(beads on a string)" 폴리펩티드라 부른다. 이러한 펩티드는 화학적 링커에 의해 분리될 수 있는데 이러한 화학 링커는 아미노산(예: G stretches)을 포함할 수도 있으나, 추가적 혹은 대용으로 화학적 링커군을 포함할 수 있다(예: 특정 간격 제공을 제외하여 기능 보유하지 않음).

앞서 언급한 "비정상적으로 발현되는"이란 단어는 1) 유전자가 종양에서는 발현하나 종양에서 유래한 조직에서는 발현되지 않는 경우 혹은 2) 정상적인 발현 수준과 비교해서 폴리펩티드가 과발현되는 경우에 사용되는 말이다. "과발현"이라는 단어는 정상 조직보다 최소한 1.2배 수준으로 발현이 많을 때 (보다 적절하게는 2배 혹은 5배나 10배 수준 더 발현량이 많을 때) 쓰인다.

펩티드(적어도 아미노산 잔기 사이에 펩티드 연결을 포함하는 펩티드)는 본 참고문헌에 있는 Lu 외 (1981) J. Org. Chem. 46,3433-3436에 의해 밝혀진 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-아민복합체 모드에 의해 합성될 수 있다. 일시적인 N-아미노기 보호는 9-플루오르에닐메틸옥시카보닐(fluorenylmethyloxycarbonyl) (Fmoc)기에 의해 이루어진다. N, N-디메틸포름아미드의 20 % 피페리딘을 사용하여 획득한, 이러한 염기에 매우 취약한 보호기의 반복적인 분할이 나타난다. 곁사슬의 기능성은 그것의 부틸 에테르(세린 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르(글루타민산 및 아스파르트산의 경우), 부티록시카르보닐 유도체(리신 및 히스티딘의 경우), 트리틸 유도체(시스테인의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐 유도체(아르기닌의 경우)로 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴은 C-말단 잔기가 있는 곳에, 곁사슬 아미노 기능성의 보호를 위해 4,4'-디메톡시벤지드릴 기로 만들어진다. 고체상 지지는 3가지 모노머인 디메틸아크릴아미드(백본-모노머), 비사크릴로일에틸렌 디아민(교차 연결) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르(기능성 성분)로 구성된 폴리디메틸 아크릴아미드 폴리머에 근거한다. 사용된 펩티드-to-레신의 분할가능한 연결 성분은 산에 취약한 4-히드로메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 이미 형성된 대칭적 무수물 유도체로써 첨가되며, 아스파라긴 및 글루타민은 예외적으로 역 N,N-디시클로헥실-카르보디이미드/1히드록시벤조트리아졸 매개의 결합 절차를 이용하여 첨가된다. 모든 결합 및 탈보호 반응은 닌히드린, 트리니트로벤젠 설폰산 또는 이소틴 검사 절차를 사용하여 모니터링 된다. 합성 완료시, 50% 혼합 청소제를 포함한 95% 트리플루오로아세트산으로 처치하여 곁사슬 보호기를 동시에 제거하고 레신 지지로부터 펩티드를 분할한다. 일반적으로 사용되는 청소제는 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물이며, 합성되는 펩티드 구성 아미노산에 따라 사용이 결정된다.

진공상태에서 트리플루오로아세트산은 제거되는데, 이때 천연그대로의 펩티드를 생산하기 위해 디에틸에테르로 분쇄된다. 모든 청소제 들은 (청소제 없는 천연상태의 펩티드를 생산하게 하는) 액상의 동결건조 같은 단순한 추출 절차에 의해 제거된다. 펩티드 합성에 쓰이는 용액들은 보통 Calbiochem Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK에서 구입 가능하다.

정제과정은 크기배제 크로마토 그래피(SEC), 이온교환 크로마토그래피(IEC), 소수성 작용 크로마토그래피, 그리고 아세토니트릴/물 경사 분리를 이용하는 역상 고성능액체 크로마토그래피(HPLC)나 혹은 이것들의 결합에 영향을 받을 수 있다.

펩티드 분석은 MALDI, ESI-Q TOF 질량분광분석법은 물론, 얇은 막 크로마토그래피(TLC), 역상 고성능액체 크로마토그래피(HPLC), 산 가수분해 후 아미노산 분석, 고속원자충돌법(FAB), 질량분광분석법을 통해 이루어진다.

본 발명은 펩티드를 인코딩하는 핵산(예: 폴리뉴클레오티드)을 추가적으로 산출할 수도 있다. 본 발명에 따른 핵산은 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA나 이들의 재조합산물인데, 이들은 인트론 부위를 가질 수도 그렇지 않을 수도 있다. 물론, 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있는 펩티드 결합을 자연적으로 유도하여 결합한 (자연 산출적인) 아미노산 잔기를 포함하는 것은 펩티드 밖에 없다. 본 발명의 추가적인 측면은 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터이다.

폴리뉴클레오티드들은 연결하기 위해 다양한 방법들이 사용되었다. DNA의 예를 들면, 상보점착말단을 통한 벡터가 있다. 예를 들어, 상보동질중합체관은 DNA 부위에 추가되어 벡터 DNA에 삽입될 수 있다. 이 벡터와 DNA 부위들은 그 뒤 상보동질중합체꼬리 사이를 수소결합으로 묶어 재조합 DNA 물질을 만들 수 있다.

하나 이상의 제한 부위를 포함하는 합성링커는 DNA 절편을 벡터에 붙이는 대처방안을 제공한다. 앞서 서술한 대로 제한효소분해(endonuclease restriction digestion)로 생성된 DNA 절편은 박테리오파지 T4 DNA 중합효소나 대장균 DNA 중합효소 I (3'-5'-핵산말단분해활성 기능으로 3'-단사슬 말단을 제거하는 효소)로 처리된 후, 중합 기능을 가지는 함요 3'-말단으로 채워지게 된다.

따라서, 이들 기능의 조합으로 블런트 말단 DNA 절편을 생성할 수 있다. 그 뒤 이 절편은 박테리오파지 T4 DNA 연결효소 같은 블런트 말단 DNA 분자의 연결을 촉진할 수 있는 효소의 존재 하에서, 링커 분자와 배양시킨다. 따라서, 이 반응의 산물은 각 말단의 중합링커서열을 전하는 DNA 절편이다. 이런 DNA 절편들은 그 뒤 적절한 제한효소로 잘린 뒤, 발현 벡터에 연결시킨다.

다양한 제한효소 부위를 포함하는 합성링커는 International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA에서 구입했다.

본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 개조하는 바람직한 방법으로는 Saiki 외 (1988, Science 239,487-491) 중합효소연쇄반응(PCR)이 있다. 이 방법은 DNA를 적절한 벡터에 유입하는데 아주 좋은 방법의 예로는 적절한 제한 효소 부위에서 조작하는 것이 있으며, 최신에 쓰이는 다른 효율적인 방식으로 DNA를 개조하여 사용할 수도 있다. 이 방법에서 효소를 통해 증폭된 DNA는 증폭된 DNA에 섞이는 두 개의 특정한 프라이머 옆에 위치하게 된다. 여기에서 말하는 특정한 프라이머는 제한효소 인식부위를 포함하고 있어서 벡터로 복제하기 위해 쓰일 수 있다.

그러면 DNA (혹은 레트로바이러스 벡터인 경우에는 RNA)는 적당한 숙주에서 발현하게 되어 본 발명의 화합물을 포함하는 폴리펩티드를 만들게 된다. 따라서, 이 화합물을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA는, 여기에 가르치는 관점에서 적절히 수정하고 이미 알려진 기술로 다룰 수 있으며, 발현 벡터를 제작하여 폴리펩티드 발현과 생산을 위해 적절한 숙주의 형질전환을 유도한다. 그러한 기술에는 다음의 미국 특허를 포함한다. 4,440,859 Rutter 외 1984년 4월 3일 발행, 4,530,901 Weissman 1985년 7월 23일 발행, 4,582,800 Crowl 1986년 4월 15일 발행, 4,677,063 Mark 외 1987년 6월 30일 발행, 4,678,751 Goeddel 1987년 7월 7일 발행, 4,704,362 Itakura 외 1987년 11월 3일발행, 4,710,463 Murray 1987년 12월 1일 발행, 4,757,006 Toole, Jr. 외 1988년 7월 12일 발행, 4,766,075 Goeddel 외 1988년 8월 23일 발행, 4,810,648 Stalker 1989년 3월 7일 발행된 문헌들 모두 여기에 참고문헌으로 이용되었다.

본 발명의 화합물을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA (혹은 레트로바이러스 벡터인 경우에는 RNA)는 적절한 숙주에 도입하기 위해 다양한 DNA 서열에 결합될 수 있다. 이 동반DNA는 1) 숙주 특성과 2) 숙주에게 DNA를 도입하는 방식, 그리고 3) 에피솜 유지나 상호작용이 필요한지 여부에 따라 달라진다.

일반적으로, DNA는 적절한 위치와 정확한 해독 틀에서 플라즈미드 같은 발현 벡터들에 삽입되어 발현된다. 필요한 경우, DNA는 원했던 숙주에 의해 인식되는 알맞은 전사 및 번역 제어조절 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있으나, 그와 같은 조절은 발현 벡터에서 일반적으로 가능하다. 벡터는 표준 기술을 통해 숙주에게 도입된다. 일반적으로 모든 숙주들이 벡터에 의해 형질전환이 되는 것은 아니므로, 먼저 형질전환 숙주세포를 선택하는 일이 필수적이다. 한가지 선택 기술로는 필요한 조절 요소와 함께 DNA 서열을 발현 벡터에 삽입하는 것이 있으며, 이러한 DNA 서열은 항생제 내성과 같이 형질전환된 세포의 선택 가능한 특성을 코드화한 것이다.

대안적으로, 이러한 선별특성을 갖는 유전자는 또하나의 벡터가 될 수 있어서 숙주세포의 형질전환에 동시에 적용 가능하다.

본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주세포들은 후 적당한 조건과 충분한 시간동안 세포배양되며 폴리펩티드 발현을 위해 여기에서 밝혀지니 학설을 고려하여 숙련된 최신 기술 하에서 다뤄지게 된다.

박테리아(예: E. coli, Bacillus subtilis), 효모(예: Saccharomyces cerevisiae), 곰팡이(예: Aspergillus), 식물세포, 동물세포와 곤충 세포 등의 여러 가지 발현 체계가 잘 알려져 있다. 이러한 발현 체계는 RCC 나 아웰스 세포(Awells cells)가 선호된다.

프로모터란 RNA 중합효소와 발현하여 전사과정을 일으키는 DNA 서열로 구성된 발현 조절 부위이다. 박테리아 숙주와 경쟁적인 프로모터 서열은 본 발명의 DNA 일부 도입에 있어 제한 부위를 가지는 플라즈미드 벡터상에 존재한다. 전형적인 원핵생물성 벡터 플라즈미드는 pUC18, pUC19, pBR322 와 pBR329Biorad Laboratories, (Richmond, CA, USA)에서 구입가능하며, pTrc99A 와 pKK223-3는 Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.에서 구입할 수 있다.

보통의 포유동물 세포 벡터 플라즈미드는 pSVL로 Pharmacia, Piscataway, NJ, USA에서 구입이 가능하다. 이러한 벡터는 클론 유전자의 발현을 유도하기 위해 COS-1 세포와 같은 T 항원 생산 세포에서 고발현되는 SV40 래이트 프로모터를 사용한다. 유발성 포유류 발현 벡터의 또 다른 예로는 pMSG가 있으며 이는 또한 Pharmacia에서 구할 수 있다. 이 벡터는 클론 유전자의 발현을 위해 생쥐의 유선종양 바이러스 긴말단반복의 글루코코르티코이드 유도 프로모터를 사용한다. 유용한 효모 플라즈미드 벡터로는 pRS403-406과 pRS413-416이 있으며 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA에서 구입 가능하다. 플라즈미드 pRS403와 pRS404, pRS405, pRS406는 효모통합 플라스미드(Yips)로 효모선별마커인 HIS3, TRP1, LEU2, URA3를 이용한다. 플라즈미드 pRS413 416는 효모 동원체 플라스미드(Ycps)이다. 그 밖에 다른 벡터와 발현 체계도 다양한 숙주 세포 사용으로 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드 벡터와 함께 형질전환된 숙주세포와 연관성이 깊다. 숙주세포는 진핵성 혹은 원핵성 모두 될 수 있다. 박테리아 세포로는 특정한 환경에서 진핵 세포가 더 좋고 E.coli DH5 균주와 같은 E Coli 균주는 Bethesda Research Laboratories Inc, Bethesda, MD, USA에서 구입이 가능하며, RR1는 American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, USA(No ATCC 31343)에서 구입이 가능하다. 선호되는 원핵성 숙주세포는 효모, 동물, 포유동물 세포를 포함하는데, 특히 생쥐, 쥐, 원숭이나 사람의 섬유아세포와 신장 세포계 같은 척추동물 세포가 더 좋다. 효모 숙주세포에는 YPH499, YPH500와 YPH501 등이 있는데 이들은 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA에서 구입 가능하다. 우선순위 포유동물 숙주세포로는 중국햄스터난소(CHO) 세포가 있으며 ATCC에서 CRL 1658로 구입이 가능하다. NIH 스위스 생쥐 배아세포 NIH/3T3는 ATCC에서 CRL 1658로 구입이 가능하며, 원숭이의 신장에서 유도한 COS 1 세포는 ATCC에서 사람배아신장세로인 CRL1650과 293 세포로 구입 가능하다. 바람직한 곤충세포로는 발현벡터로 도입될 수 있는 바큘로바이러스 Sf9 세포가 있다.

본 발명에서 DNA를 적절한 숙주세포에 도입하여 형질전환 시키는 방법은 일반적으로 벡터의 유형에 따라 달라지는 방식을 따랐다. 진핵성 숙주세포 형질전환의 경우에서는 Cohen 외 (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,2110 와 Sambrook 외 (1989) 분자 클로닝, 실험실 설명서, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY를 참고할 수 있다. 효모세포의 형질전환은 Sherman 외 (1986) 효모 유전학 방법, 실험실 설명서, Cold Spring Harbor, NY에 설명되어 있으며, 벡스 방법 (1978) Nature 275,104-109 또한 유용하다. 척추동물 세포의 경우에는 인산칼슘과 DEAE 덱스트란 또는 리포솜 제형을 이용한 도입(transfection) 방법이 효과적인데 이들은 Stratagene Cloning Systems이나 Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA에서 구입 가능하다. 전기천공법(Electroporation)도 효모세포, 박테리아 세포, 곤충 세포 및 척추동물의 도입(transfection)이나 변환(transformation) 시 효과적인 방법으로 사용된다.

성공적으로 형질전환된 세포, 즉, 본 발명의 DNA 구성을 함유하는 세포는 이미 알려진 기술로 충분히 식별할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발현 구성 도입으로 인해 발생한 세포는 폴리펩티드를 생산할 수 있도록 배양될 수 있다. 이 세포들을 모아 특정 용액으로 분해한 후 세포의 DNA 함량을 Southern (1975) J. Mol. Biol. 98,503나 Berent 외 (1985) Biotech. 3,208 등의 방법으로 조사할 수 있다. 또한, 상층액 속에 있는 단백질은 하기한 방식을 참고하여 항체로 검출할 수 있다.

재조합 DNA를 직접적으로 조사하는 것 이외에도, 재조합 DNA가 직접적으로 단백질 발현을 유도할 수 있을 때에는 면역방법을 통해 형질전환 결과를 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 발현벡터로 성공적으로 형질전환된 세포는 적절한 항원성을 가지는 단백질을 생산한다. 의심되는 형질전환된 세포 표본을 모아서 항체로 반응을 살펴본다. 그러므로, (형질전환된 숙주 세포들뿐만 아니라) 본 발명은 또한 이러한 세포 배양, 특히 단일클론성(동질한 클론) 배양이나 단일클론성 배양에서 유래한 배양에 있어 적당한 영양 상태를 유지를 고려해야 한다.

본 발명에서 어떤 숙주세포(예를 들어 박테리아, 효모 및 곤충 세포)들은 펩티드 준비과정 상 유용할 수 있다. 그러나, 다른 숙주 세포들은 다른 특정 치료방법으로 유용할 수 있다. 예를 들어, 수지상세포 같은 항원제시세포는 적절한 MHC 분자로 로딩 될 수 있는 펩티드를 발현하는 데 매우 효과적이다.

바람직한 숙주 세포는 재조합 RCC나 아웰스 세포이다. 본 발명에 따른 종양 관련 펩티드를 생산하는 방법과, 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 방법, 표준 방법에 따른 숙주 세포나 그 배양 배지에서 펩티드를 분리하는 것이 선호된다.

본 발명의 또 다른 측면으로는 구강, 직장, 코나 혀 섭취 정맥 주입, 피하 주입, 피부 내 주입, 복부 내 주입, 근육 내 주입 등의 주입법으로 인한 펩티드 생산방법을 제공한다는 것이 있다. 보다 선호하는 펩티드 주입법으로는 s.c., i.d., i.p., i.m.과 i.v 이 있으며, DNA 주입시는 i.d., i.m., s.c., i.p.와 i.v 주입법이 선호된다. 이 때 하단에 제시한 것과 동일하게 펩티드나 DNA를 1내지 500 mg 양으로 주입한다.

또한 본 발명은, 본 발명에 따른 종양 관련 펩티드 및 본 발명에 따른 핵산, 혹은 본 발명에 따른 발현벡터와도 관련성이 있다.

또 다른 측면에서 본 발명의 목적은, 1) 본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2나, 2)본 발명의 핵산이나 3) 본 발명의 발현 벡터 그리고 4) 제약적으로 수용가능한 전달체에 따라 적어도 하나의 종양 관련 펩티드를 함유하는 약학 조성물로 성취된다. 이 구성은 피하나 피부 내, 복막 내, 정맥 내, 근육 내 또는 구강 주입과 같은 비경구적 주입에 사용된다. 여기서 펩티드는 제약적으로 수용가능한, 가급적이면 수용 전달체에 용해되거나 현탁화된다. 게다가 그 구성은 버퍼, 결합제, 울림제, 희석제, 향미, 윤활제 등의 부형제를 함유할 수 있다. 펩티드는 시토킨 등의 구성에도 사용될 수 있다. 그런 구성에 사용될 수 있는 부형제의 확장된 리스트는 예를 들어, A. Kibbe의 제약 부형제 안내서, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press에서 확인할 수 있다. 구성은 예방, 예방법, 또는 샘종 질환이나 암성 질환 치료법에 사용될 수 있다.

1) 서열번호 1나 서열번호 2, 2) 본 발명에 따른 핵산, 3) 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 본 발명의 펩티드 중 적어도 하나를 함유하는 제제를 각각 펩티드나 항원과 관련있는 샘종 또는 암종 질환으로 고통받는 환자에게 투여한다. 이로써 T 세포 매개 면역 반응이 유발될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 가급적 서열번호 3에서 서열번호 10 중 하나, 각 핵산이나 각 발현 벡터 중 어느 하나에 따른 서열을 포함하며 하나 이상의 추가적 종양 관련 펩티드를 포함한다.

일반적으로 본 발명에 따른 약학 조성물의 펩티드는 서열번호 1나 서열번호 2를 포함하며 본 발명의 펩티드에 대해 상기와 동일한 성질을 갖는다. 따라서 전체길이는 9에서 100개 사이, 가급적이면 9에서 30개 사이, 가장 선호되는 9에서 16개 사이가 될 수 있다. 더욱이 서열번호 1에서 서열번호 11 중 어느 하나에 따라 하나 이상의 펩티드는 비펩티드(non-peptide) 결합이 포함될 수 있다. 게다가 각각의 핵산은 9와 100개 사이, 가급적 9와 30개 사이, 가장 선호되는 9와 16개 사이의 아미노산에 대해 인코딩할 수 있다.

서열번호 1 및 서열번호 2 및 서열번호 3에서 서열번호 11까지에 따른 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함(특히 종양 관련에서)하는 본 발명에 따른 약학 조성물이 바람직하다.

본 발명에 따른 약학 조성물이 선호되며, 상기한 구성 내의 1) 본 발명에 따른 발현벡터(들)나 2) 본 발명에 따른 핵산(들)의 양 혹은 펩티드(들)(특히 종양 관련)의 양은 조직, 암 또는 환자 특이적이다.

펩티드는 표지되거나 융합 단백질일 수 있으며 하이브리드 항체 분자일 수 있다.

펩티드는 순수한 것이거나 혹은 면역촉진 보조액이거나 혹은 면역촉진 시토카인과 결합시킬 수도 있고, 리포솜 같은 적절한 운반체계로도 주입 가능하다.보조액으로는 사포닌과 미코박테리아성 추출물, 합성 박테리아 세포벽 유사물질에서 유래된 아퀼라 QS21 스티뮬론(Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), Ribi's Detox같은 물질이 있다. 또 다른 사포닌 유래 보조액인 Quil A도 쓸 수 있다(Superfos, Denmark). Freund's 같은 다른 보조액도 매우 효과적이다. 특히 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 유착한 펩티드도 보조액과 함께 주입 시 효과적이라고 알려져 있다(WO 95/18145과 Longenecker 외 (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291 참조). 보조액은 항원에 면역 반응을 강화하는 물질 (MedlinePlus^TM Medical Dictionary, NIH) 로 규정되므로 동일한 기능의 기타 물질들이 사용될 수도 있다. TLR-3, -7, -8, -9, 바람직하게는 TLR-9(프로타민 안정화 RNA, CpG 올리고핵산염, CpR 올리고핵산염, 세균성 DNA, imidazoquinolines 등)는 부자연스럽게 상호작용하는 물질인 톨(toll) 같은 수용체 작용제(TLR 작용제)를 포함하나 이에 국한되지 않는다.

면역 반응을 강화하는데 알맞은 기술로 알려진 기타 물질에는, 유발 가능한 니트릭 옥사이드 합성효소(nitric oxide synthase) (iNOS)와 아르기닌분해효소(ARG1), 인돌아민 디옥시게네이즈(indoleamine-2,3-dioxygenase) (IDO), 혈관 내피 성장 인자 수용체 1(VEGFR 1), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 사이클로옥시게네이즈 2(cyclooxygenase 2) (COX-2), TGF 베타 수용체 I(TGF beta-RI)의 억제제를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 이러한 억제제는 상기한 분자나 소분자에 대항하는 단일클론 항체일 수 있다. 요인들에 대해 억제 기능을 갖는 본 기술에서 알려진 소분자와 단일클론 항체들은 상기에 언급되었으며, 따라서 효과를 강화하는 면역 반응으로는 1-MT, NCX-4016, 로페코십(rofecoxib), 셀레브렉스(celebrex), BEC, ABH, nor-NOHA, SB-505124, SD-208, LY580276, AMD3100, 액시티닙(axitinib), 베바시주맵(bevacizumab), JSI-124, CPA-7, XL-999, ZD2171, 파조파닙(pazopanib), CP-547632, 및 VEGF Trap 등이 있다.

또한 수많은 조절 T 세포를 감소시키는 물질들(CD 4+, CD25+, FoxP3+)은 보조액으로 적합하다. 여기에는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide) (Cytoxan), ONTAK (denileukin diftitox), 수니티닙(Sunitinib), 항-CTLA-4 (MDX-010, CP-675206), 항-CD25, 항-CCL22, 및 항-GITR이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.

또 다른 선호되는 구현의 백신은 핵산 백신이다. 이 백신은 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 백신처럼 핵산 백신으로 접종하여 T 세포 반응을 이끌어내는 것으로 알려져 있다. 이것은 환자에게 직접 투여되거나, 영향받은 장기 혹은 전신으로, 또는 환자나 사람 세포주에서 유도된 세포(결과적으로 환자에게 투여되는 세포)에 생체 밖 적용되거나, 또는 환자에서 유도된 면역 세포로부터 소인구집단을 선택하기 위해 체외 사용된 후 환자에 재투여될 수 있다. 핵산이 체외 세포에 투여되는 경우, 인터루킨-2(interleukin-2)나 GM-CSF같은 면역 자극 시토킨을 동시 발현하기 위한 세포의 핵산 감염에 유용할 수 있다. 핵산 백신은 BCG나 백반 같은 보조액으로 투여될 수 있다. 그러나 보조액 없이 핵산 백신을 투여하는 것이 선호된다.

폴리뉴클리오티드는 실제 순수하거나, 혹은 적절한 벡터에 포함되거나 적절한 전달 방식에 포함될 수 있다. 적절한 벡터와 운반체계는 하나 이상의 바이러스 요소를 함유하며 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아(vaccinia) 바이러스, 리트로바이러스(retrovirus), 포진(herpes) 바이러스, 아데노 관련 바이러스나 하이브리드 등의 바이러스가 포함된다. 비바이러스(non-viral) 운반체계에는 DNA 전달 기술에서 잘 알려진 바와 같이 양이온(cationic) 지질과 양이온 중합체가 포함된다. "유전자 총(gene-gun)"과 같은 물리적 전달도 이용될 수 있다. 펩티드나 핵산에 의해 인코딩된 펩티드는 CD4 양성 T 세포를 자극하는 파상풍톡소이드에서 얻은 항원결정인자 등과 함께 융합 단백질이 될 수 있다.

환자에 투여된 모든 핵산은 멸균되며 발열원(pyrogen)이 없다. 네이키드 DNA는 근육내 또는 피부 내 또는 피하로 제공될 수 있으며, 펩티드는 근육내, 피부 내 또는 피하로 제공될 수 있다.

편리하게도, 핵산 백신은 알맞은 핵산 전달 수단을 포함할 수 있다. 핵산, 가급적이면 DNA는 네이키드 상태(즉, 실제로 투여되는 다른 구성요소 없이)이거나 리포솜(liposome)으로 전달되거나 바이러스 벡터 운반체계의 일부로써 전달될 수 있다.

핵산 섭취와 수지상세포 같은 전문 항원 전달 세포에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 발현은 면역 반응 자극의 기전일 수 있다. 그러나 조직 내 핵산감염된 세포에서 발현된 펩티드를 포착할 수 있으므로, 수지상세포는 핵산감염되지 않을 수 있으나 여전히 중요하다("교차 자극(cross priming)", 예: Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Mesothelin 특이적 CD8(+) T 세포 반응에서 접종받은 췌장암 환자의 항원 전달 세포에 의한 생체 내 교차 자극 증거 제공. J Exp Med. 2004 Aug 2;200(3):297-306).

피하(s.c.) 또는 근육내(i.d.)로 투여되는 동안 DNA 백신과 같은 핵산 백신을 근육에 투여하는 것이 선호된다. 백신을 피부에 주입하는 것도 선호된다. 핵산 백신은 보조액 없이 투여될 수 있다. 핵산 백신은 BCG나 백반(alum)과 같은 보조액과 투여될 수도 있다. 보조액으로는 사포닌과 미코박테리아성 추출물, 합성 세균 세포벽 유사물질에서 유래된 아퀼라 QS21스티뮬론 (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), Ribi's Detox같은 물질이 있다. 또 다른 사포닌 유래 보조액인 Quil A도 쓸 수 있다(Superfos, Denmark). 핵산 백신이 보조액없이 투여될 수 있다면 선호된다. Freund와 같은 기타 보조액도 매우 효과적이다. 특히 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 유착한 펩티드도 보조액과 함께 주입 시 효과적이라고 알려져 있다.

폴리뉴클리오티드 매개된 암의 면역화 요법은 Conry 외 (1996) Seminars in Oncology 23,135-147, Condon 외 (1996) Nature Medicine 2,1122-1127, Gong 외 (1997) Nature Medicine 3,558-561, Zhai 외 (1996) J. Immunol. 156,700-710, Graham 외 (1996) Int J. Cancer 65,664-670, 그리고 Burchell 외 (1996) pp 309-313 In: 유방암, 생물학과 치료에서의 진행, Calvo 외 (eds), John Libbey Eurotext에 설명되어 있으며, 이는 모두 본문에 참고 문헌으로 인용되었다.

주사 부위에 벡터와 운반체계의 표적 사용, 또는 핵산이나 펩티드의 생체 외 투여나 환자로부터 얻은 세포 인구의 선택적 정제 중 하나로 항원 전달 세포와 같은 특정 세포 인구에 백신을 표적으로 하는데에도 유용할 수 있다(예: 수지상세포는 Zhou 외 (1995) Blood 86,3295-3301; Roth 외 (1996) Scand. J. Immunology 43,646-651에서 설명된 대로 분리될 수 있다). 예를 들어, 벡터를 표적하는 것은 적합한 곳에서 항원 발현을 지시하는 조직이나 종양 특이적 촉진물을 포함할 수 있다.

더 나아간 측면에서 본 발명은 약학 조성물과 관련있으며, 본 발명에 따른 하나 이상의 상기한 펩티드를 포함한다. 이 조성물은 피하, 피부 내, 근육 내 또는 경구 투여와 같은 비경구 투여에 이용된다. 여기서 펩티드는 제약적으로 수용가능한, 가급적이면 수용 전달체에 용해되거나 현탁화된다. 게다가 그 조성물은 버퍼, 결합제, 울림제, 희석제, 향미, 윤활제 등의 부형제를 함유할 수 있다. 펩티드는 시토킨 등의 조성물에 사용될 수도 있다. 그런 조성물에 사용될 수 있는 부형제의 확장된 리스트는 예를 들어, A. Kibbe의 제약 부형제 안내서, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press에서 확인할 수 있다. 조성물은 예방, 예방법 또는 샘종 질환이나 암종 질환 치료법에 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드(서열번호 1에서 서열번호 2)를 최소한 하나 포함하는 약리학적 조제약을 개개의 펩티드나 항원과 연관된 샘종 또는 암종 질환으로 고생하는 환자에게 주입한다. 이로써, CTL에 특이적인 면역반응이 일어나게 된다.

또한 둘 혹은 그 이상의 펩티드들의 혼합물도 백신으로 사용될 수 있는데, 같은 처방 방법으로 줄 수도 혹은 직접 혼합하여 줄 수도 있다. 게다가, MHC I형이나 II 특이적 펩티드 같은 다른 펩티드와 혼합하여 줄 수도 있다. 이에 연구원은 실험을 통해 어떤 펩티드를 혼합하였을 때 그 면역성이 좋은지 실험해 봐야 한다. 예를 들어, 1) 특정한 펩티드에 대한 특정 T 세포의 증가, 친화, 증폭, 전반적인 관여, 효율성뿐만 아니라 시험관내에서 T 세포의 발생, 그리고 2) T세포의 기능 (예를 들어 IFNα (아래 예시 참조)) 등을 검사한다. 보통, 그 뒤에 가장 효율이 좋은 펩티드를 위의 목적으로써 백신으로 혼합하여 사용한다.

적절한 백신은 가급적 1과 20 펩티드 사이에서, 보다 선호되는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 다른 펩티드, 그 보다 더 선호되는 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 다른 펩티드 및 가장 선호되는 11의 다른 펩티드 사이에서 포함될 것이다. 암 백신에 사용되는 펩티드 길이는 어떤 것이든지 적용이 높은 편이다. 특히, 9-mer, 7-mer, 8-mer, 10-mer, 11-mer 펩티드나 12-mer가 좋다. 펩티드는 길수록 좋은데, 첨부한 표 1에서 서술한 바와 같이 9에서 10-mer 펩티드가 선호된다.

펩티드나 핵산을 인코딩하는 펩티드도 종양 또는 암 백신의 구성 요소가 된다. 이것은 환자에게 직접 투여되거나, 영향받은 장기 혹은 전신으로, 또는 환자나 사람 세포주에서 유도된 세포(결과적으로 환자에게 투여되는 세포)에 생체 밖 적용되거나, 또는 환자에서 유도된 면역 세포로부터 소인구집단을 선택하기 위해 체외 사용된 후 환자에 재투여될 수 있다. 펩티드는 키홀림펏헤모시아닌(KHL)이나 만난(mannan)같은 적절한 전달체에도 결합될 수 있다 (WO 95/18145와 Longenecker 외 (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291 참조). 펩티드 백신은 보조액 없이 투여될 수 있다. 펩티드 백신은 또한 BCG나 백반(alum)같은 보조액과 함께 투여될 수 있다. 보조액으로는 사포닌과 미코박테리아성 추출물, 합성 박테리아 세포벽 유사물질에서 유래된 아퀼라 QS21 스티뮬론(Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), 리비즈 데톡스(Ribi's Detox)같은 물질이 있다. 또 다른 사포닌 유래 보조액인 Quil A도 쓸 수 있다(Superfos, Denmark). 프레운즈(Freund's) 같은 다른 보조액도 매우 효과적이다. 특히 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 유착한 펩티드도 보조액과 함께 주입 시 효과적이라고 알려져 있다. 상기 언급된 것처럼 기타 보조액이 사용될 수 있다. 펩티드는 표지되거나 융합 단백질일 수 있으며 하이브리드 항체 분자일 수 있다. 본 발명에서 제공된 펩티드의 서열은 CD8⁺ CTL을 자극할 것으로 기대된다. 그러나 자극은 CD4⁺ T 세포의 도움이 있을 때 보다 효율적이다. 따라서 하이브리드 분자의 융합 파트너나 구역은 CD4⁺ T 세포를 자극하는 항원결정인자를 적절히 제공한다. CD4⁺ 자극 항원결정인자는 본 기술에서 잘 알려져 있고, 파상풍톡소이드에서 확인되는 것들을 포함한다.

본 발명에 따라 특히 선호되는 펩티드 백신 구현에서, 상기한 백신은 신장 세포 암종 치료에 대한 다수 펩티드 종양 백신이다. 가급적이면 상기한 백신은 원발성 신장암 세포에 위치하고 확인된 서열번호 1에서 10에 따라 종양 관련 펩티드 세트를 포함한다. 이 세트는 HLA I형 과 II형 펩티드가 포함된다. 펩티드 세트는 또한 HBV 핵심 항원과 같이 피부 내 주입의 효율성을 검사하기 위해 면역 지표로 제공되는 양성 조절 펩티드 등는 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 한 특정 구현에서 백신은 각 펩티드의 약 1500 μg에서 약 75 μg 사이, 가급적 약 1000 μg에서 약 750 μg 사이, 보다 선호되는 약 500 μg에서 약 600 μg 사이, 가장 선호되는 약 578 μg의 11개의 개별 펩티드(서열번호 1-11)를 포함하고, 이들 모두 HPLC와 이온 교환 크로마토그래피로 정제될 수 있으며, 회색 빛이 도는 흰색 파우더로 보인다. 라이오필리세이트(lyophilisate)는 가급적 탄산수소나트륨(sodium hydrogen carbonate)에서 용해되고, 실내 온도에서 재구성된 후 30분 이내에 피부 내 주입용으로 사용된다. 본 발명에 따라 선호되는 펩티드의 양은 0.1에서 100 mg 사이, 가급적 0.1에서 1 mg사이, 가장 선호되는 500 μl 당 약 300 μg에서 800 μg 사이의 용액으로 다양하다. 여기에서 "대략" 이라는 용어는 따로 명시하지 않는 한, 주어진 값의 +/- 10%를 의미한다. 전문가는 각 환자의 면역 상태 및 특정 암 유형에 있는 TUMAP의 양 등 여러 요인에 기초하여 사용되는 실제 펩티드 양을 조정할 수있다. 본 발명의 펩티드는 라이오필리세이트 대신 다른 적절한 형태(무균액 등)로 제공될 수 있다.

본 발명에서 제공된 펩티드의 서열은 CD8 양성 T 세포(CTL)을 자극할 것으로 기대된다. 그러나 자극은 CD4 양성 T 세포에 의해 제공된 도움이 있는 데서 보다 효율적이다. 따라서 하이브리드 분자의 융합 파트너나 구역은 CD4 양성 T 세포를 자극하는 항원결정인자를 적당히 제공한다. CD4 양성 자극 항원결정인자는 본 기술에서 잘 알려져 있고, 파상풍톡소이드 또는 본 발명에서 제공된 MMP7의 펩티드에서 확인되는 것들이 포함된다.

마지막으로, 본 발명에 따른 백신은 치료받을 환자들이 고통받고 있는 특정 암 종류뿐 아니라, 질환의 상태와 조기 치료 요법, 환자의 면역 상태는 물론 환자의 HLA 일배체형(HLA-haplotype)에 의존될 수 있다. 더욱이 본 발명에 따른 백신은 특정 환자의 개인적 필요에 따라 개별적 구성요소를 함유할 수 있다. 그 예로, 상기한 특정 환자에서 관련된 종양 관련 항원의 발현에 따른 각기 다른 펩티드의 양이 다른 것과, 개인적 알레르기나 기타 치료로 인한 부작용, 그리고 치료 방식의 초진에 이은 두번째 치료시의 조정이 다르다는 것을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 표적 세포가 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자를 대상으로 표적 세포를 사멸시키는 약물 제조에 있어, 본 발명에 따른 펩티드나 폴리뉴클리오티드, 이러한 펩티드를 인코딩하는 발현 벡터의 사용과 관련되어 있다. 항암 백신인 약제 조제로 사용되는 것이 선호된다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 펩티드의 사용이나 이러한 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클리오티드 혹은 발현 벡터의 사용을 제공하며, 이는 면역 반응을 유발하기 위한 약물 제조, 특히 세포 면역 반응, 특히 세포가 표면에서 사람의 I형 또는 II형의 MHC 분자를 발현하고 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타내는 고형 종양 세포에 대한 T 세포 매개 면역 반응을 위해 제공된다.

고형 종양의 종양 세포는 (동일 조직의 건강한 세포와는 대조적으로) 세포 표면에 사람의 HLA II형 분자를 발현한다는 사실은 매우 흥미롭다. 이러한 사실은 Brasanac 외 (Brasanac D, Markovic Lipkovski J, Hadzi Djokic J, Muller GA, Muller CA. 신장세포암종에서 HLA II형 항원 및 종양 침윤성 단핵세포의 면역조직화학분석: 임상 및 조직병리 정보와의 관련성. Neoplasma. 1999;46(3):173-8.)의 문헌에서만 유일하게 발견되었다. 여기에서는 37개의 신장세포 암종(25가지 투명세포 종류, 10가지 과립성, 2가지 혐색소성)이 1) HLA II형 항원과 2) 종양 침윤성 단핵세포(TIM) 분석하기 위한 항-CD14, -CD3, -CD4 및 -CD8 MoAb를 분석하기 위해서 단일클론성 항체 (MoAb)를 HLA-DR, -DP와 -DQ에 적용하는 면역과산화효소법으로 연구되었다. 염색 양성은 준정량적으로 세었고, 실험 결과는 RCC에 대한 1) 임상적인 (환자 나이, 성별, 종양 크기, TNM 단계), 2) 조직학적인 (세포는 세포학, 조직학, 수준) 특성과 연결시켰다. HLA-DR, 92% -DQ와 73% -DP 항원을 발현하는(발현수준 DR>-DQ>-DP) 모든 RCC는 조직학적 혹은 임상적인 모수와는 통계적으로 유의미한 결과가 나오지는 않았다. 단핵세포가 T 림프구보다 많고 CD4+가 CD8+ T 세포보다 더 많은 반면, T 클론이 많고 CD4+와 CD8+ T세포의 수가 대략 같은 종양의 평균 직경이 가장 컸다. 종양 세포에 의한 불충분한 T 클론 활성은 모수 상관성에 영향을 미치는데, 이는 RCC의 비정상적인 HLA II형 항원 발현을 보이는, 보다 공격적인 종양 특성을 나타내는 것이다.

더 나아간 본 발명의 측면은 서열번호 1에서 No. 10 중 주어진 대로 아미노산 서열을 포함하며 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포가 있는 환자들의 표적 세포를 사멸시키는 약물 제조에 있어, 본 발명에 따른 펩티드 사용 또는 펩티드를 인코딩하는 발현 벡터나 폴리뉴클리오티드 사용을 제공한다.

따라서 더 나아간 본 발명의 측면은 생체내 또는 체외에서 활성화된 T 림프구를 생산하는 방법을 제공하고, 이에 의해 첫번째 방법은, 항원 특이 방식으로, 언급된 T 세포를 활성화하기에 충분한 시간동안 적합한 항원 전달 세포 표면에서 발현된 항원 부하된 사람 I형 또는 II형 MHC 분자와 T 세포를 생체내에서 접촉하는 것을 의미하고, 여기에서 항원은 본 발명에 따른 펩티드이다. 두번째 방법은, 보다 선호되는 것으로, Water 등(Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. 최첨단: 조정된 MHC/항 CD28 코팅 미세구에서 확장된 사람 CD8 T 세포의 미리 결정된 총결합력. J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8)에서 기술되어 있다.

MHC II형 분자는 적절한 세포 표면에 발현하게 될 수 있는데, 1) 만약 어떤 세포가 자연적으로 MHC II형 분자를 발현하지 않거나 (이 경우 세포가 이 분자를 발현하도록 형질전환된 경우) 2) 이 분자를 발현할 경우, 항원 가공 혹은 항원제시 경로에서는 불완전하다. 이러한 방식으로, MHC II형 분자 발현 하는 세포는 CTL 활성 전에 이미 선택한 펩티드 항원으로 완전히 자극될 수 있다.

항원제시세포(혹은자극 세포)는 통상적으로 표면에 MHC I형이나 II 분자를 가지고 있으며 이미 선택한 항원으로 스스로 로딩할 수는 없다. 밑에 자세히 언급하겠지만, MHC I형이나 II 분자는 시험관내에서 선택된 항원으로 쉽게 로딩된다.

포유동물 세포는 TAP 펩티드 운반체 기능을 낮은 수준으로 갖고 있거나 혹은 부족하게 가지고 있다. TAP 펩티드 운반체가 결핍된 세포로는 T2, RMA-S와 초파리 세포가 있다. TAP는 항원처리와 관련된 운반체(Transporter Associated with antigen Processing)의 약어이다.

불완전한 세포계 T2를 로딩하는 사람 펩티드는 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA under Catalogue No CRL 1992에서 구입 가능하다: 초파리 세포주 슈나이더 주 2는 ATCC under Catalogue No CRL 19863 에서 구입 가능하며, 생쥐의 RMA-S 세포주는 Karre and Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162,1745를 참고했다.

편리하게도, 상기한 숙주 세포들은 형질전환 전에 어떠한 MHC I형 분자도 발현하지 않는다. 만약 자극 세포가 B7.1, B7.2, ICAM-1 혹은 LFA 3 같은 T 세포 공자극에 중요한 인자를 발현한다면 이 또한 선호된다.

구체적으로, HLA 분자 결합 방식도 사용될 수 있다.

재조합성 다항원결정인자 백신을 다양한 CD8+ CTL 항원결정인자 운반에 사용하는 방법은 (여기에서 참고문헌으로 이용된) Thomson 외 (1996) J. Immunol. 157, 822-826와 WO 96/03144에 언급되어 있다. 본 발명과 관련하여, (어느 순서라도 펩티드가 본 발명의 아미노산 서열과 다른 CD4 양성 T 세포 자극 항원결정인자(MMP-7에서와 같이)를 포함하는 점에서) 펩티드(혹은 펩티드를 코딩하는 핵산)가 단독 백신에 포함되는 것이 바람직하며 이익이 된다. 이러한 백신은 암치료에 특히 효과적일 것이다.

시험관내에서 CTL 유도에 효과적인 방법은 많이 알려져 있다. 예를 들어, Peoples 외 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,432-436와 Kawakami 외 (1992) J. Immunol. 148,638-643는 CTL 생성에 자가 종양 침윤성 림프구를 사용했다. Plebanski 외 (1995) Eur. J. Immunol. 25,1783-1787는 CTL의 준비를 위해 자가 말초혈액 림프구(PLBs)를 이용했다. 또한 Jochmus 외 (1997) J. Gen. Virol. 78,1689-1695는 재조합 바이러스를 이용한 감염이나 펩티드 혹은 폴리펩티드로 수지상세포를 적용하여 자가 CTL을 초래했다. Hill 외 (1995) J. Exp. Med. 181,2221 2228와 Jerome 외 (1993) J. Immunol. 151,1654-1662는 자가 CTL을 생성하기 위해 B 세포를 이용했다. 게다가, 펩티드나 폴리펩티드로 펄스되었거나 혹은 재조합 바이러스로 감염된 대식세포를 자가 CTL 준비를 위해 쓸 수도 있다.

CTL 준비 시 동종이형세포를 사용할 수 있는데 이는 (여기에 참고문헌으로 이용된) WO 97/26328 에 상세히 기재돼있다. 예를 들어, 초파리 세포와 T2 세포뿐만 아니라, CHO 세포, 바큘로바이러스 감염 곤충 세포, 박테리아, 이스트, 백시니아 감염 표적 세포 등의 기타 세포도 항원제시에 이용될 수 있다. 또한 식물 바이러스도 쓸 수 있다(참조 Porta 외 (1994) Virology 202, 449-955에는 외부 펩티드 발현에 대한 고수익 시스템으로써의 카우피 모자이크바이러스의 개발에 대해 설명되어 있다).

가급적, 본 발명에 따른 방법에서 항원 전달 세포는 상기에서와 같이 발현 벡터를 포함한다.

본 발명의 펩티드에 반하여 지시된 활성상태 T 세포는 치료 방법으로 매우 효과적이다. 따라서, 본 발명에서도 앞서말한 방법에 의해 획득가능한 활성상태의 T 세포를 제공한다.

아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는 활성 상태의 T 세포는 이미 언급했듯이 본 발명의 또 다른 중요 과제이다. 더욱이, T 세포는 HLA/펩티드 복합체(예를 들어 결합)로 상호작용하여 상기한 세포를 인식한다. 활성 상태의 T 세포를 효과적인 정도 내에서 환자에게 주입하는 상황에서 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적세포를 가진 환자에서 표적세포만 선택적으로 죽이는 데 T 세포가 유용하다. 환자에게 주는 T 세포는 환자자신에서 유래된 것이어도 되고, 또한 위에 언급한 대로 활성상태(즉 자가 T 세포)일 수도 있다. 대안적으로, T 세포를 환자 자신이 아닌 타인으로부터 얻은 것을 쓸 수도 있다. 물론, 타인이 건강하면 더 좋을 것이다. 여기서 말하는 "건강한 사람"이란 면역체계 경쟁력을 갖춘 면역 체계가 있고, 검사 및 감지를 쉽게 할 수 있는 질환이 없는 사람을 말한다.

활성 상태의 T 세포는 T세포 수용체(T-cell receptor: TCR)를 발현하는 데 이 수용체는 비정상적인 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대한 인식과정에 관여한다. TCR을 인코딩한 cDNA가 활성상태의 T 세포로부터 복제되고 TCR 발현을 위해 다른 T 세포로 형질이입이 된다면 더 유용하다.

생체내에서, 본 발명의 구현에 따른 CD4 양성 T 세포에 대한 표적 세포는 (때때로 MHC II형을 발현하는) 종양 세포일 수도 있고, (때때로 MHC II형을 발현하는) 종양 (종양 세포)를 둘러싸는 기질 세포일 수도 있다.

본 발명의 펩티드에 특이적인 T 세포 클론의 TCR은 복제된다. T 세포 클론에 사용되는 TCR은 1) TCR 변이부에 특이적인 단일클론성 항체 (TCR variable region specific monoclonal antibodies)와 2) Va와 Vp 유전자과에 특이적인 프라이머를 이용한 RT PCR 사용에 따라 결정된다. cDNA 라이브러리는 T 세포 클론에서 추출한 poly-A mRNA 로부터 만들어지게 된다. 이때 TCR a 와 P 사슬의 C 말단부위와 Va 및 P 분절의 N말단 부위에 특이적인 프라이머를 사용한다. TCR a와 P 사슬에 대한 완전 cDNA는 고정확도 DNA 중합효소로 증폭되고 증폭 산물은 적절한 복제 벡터로 클론된다. 복제된 a와 P 사슬 유전자는 Chung 외 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658에 기재된 방식대로 단사슬 TCR로 모을 수 있다. 단사슬에서 VaJ 분절은 V DJ 분절 뒤에 오고, 이는 CD3 사슬의 세포막 및 세포질 부위 뒤에 오는 Cp 분절이 그 뒤를 잇는다. 이 단사슬 TCR은 그 뒤 레트로바이러스 발현 벡터에 삽입된다(벡터의 패널은 성숙한 사람의 CD8 양성 T 림프구를 감염시키고 유전자 발현을 매개하는 능력에 따라 달리 사용된다. 레트로바이러스 벡터 시스템 Kat이 그러한 바람직한 예이다(참조 Finer 외 (1994) Blood 83,43). 고역가 양생 레트로바이러스는 종양 환자의 말초 혈액에서 분리한 CD8 양성이나 CD4 양성 T 림프구를 감염시키는 데 사용된다(Roberts 외 (1994) Blood 84,2878-2889 문헌의 프로토콜 참조). CD3 항체는 CD8 양성 T 세포 의 증폭 과정을 유발하는데 사용되며, 이는 단사슬 TCRs의 안정적인 발현양상과 레트로바이러스 통합을 촉진한다. 레트로바이러스 형질도입의 효과는 단사슬 TCR에 특이적인 항체로 염색한 감염된 CD8 양성 T 세포에 따라 달라진다. 시험관내에서 형질도입된 CD8 양성 T 세포 분석은 이들이 보이는 동일한 종양에 대한 특이적 사멸효과로 결정되는데, 이는 TCR 사슬이 복제된 자가제한 T 세포 클론으로 관찰된 바와 같다. 형질도입된 CD8 양성 T 세포로 종양 환자에게 면역요법을 시행할 수 있다. 환자들은 10⁸ 에서 10¹¹ 개의 자가 T 세포 및 형질도입된 T 세포로 치료받는다. CD8 양성 세포와 유사하게, 관련 물질을 운반하는 형질도입된 CD4 양성 T 조세포도 발생할 수 있다.

유전자를 T 세포에 도입하는 적절한 방법은 여기에 참고문헌으로 이용된 Moritz 외 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4318-4322에 잘 나와있다. Eshhar 외 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720-724 와 Hwu 외 (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 논문도 T 세포 도입(transfection)을 기재했다. 따라서, 본 발명은 이미 알고 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상정으로 발현하는 세포를 인식하는 TCR (활성 상태의 T 세포에서 얻을 수 있는 TCR) 에도 그 초점을 두고 있다.

TCR뿐만 아니라, TCR에 기능적으로 동일한 분자들도 본 발명에 포함되어 있다. TCR과 같은 기능을 수행할 수 있는 분자면 어떤 것이든지 상관없다. 특히, (여기에 참고문헌으로 이용된 Chung 외 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658 에 나타난 방식에 의해 만들어진) 유전적으로 설계된 세 부위의 단사슬 T세포수용체가 여기에 속한다. 또한 본 발명의 과제에는 TCR이나 기능적으로 유사한 물질을 인코딩하는 1) 폴리뉴클레오티드 와 2) 발현벡터도 존재한다. 본 발명에서 TCR을 발현하는 데 적합한 발현 벡터는 본 발명의 펩티드 발현에 대해 앞서 언급했던 것들을 동일하게 포함한다.

그러나, 도입(transfection) 후에 T 세포에 TCR을 발현할 수 있는 발현 벡터가 더 바람직하다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포를 사멸하는 방법과 본 발명에 따라 환자에 투여하는 펩티드의 효과적인 용량을 포함하는 방법, 또는 폴리뉴클리오티드나 언급한 펩티드를 인코딩하는 발현 벡터의 효과적인 양, 또는 상기에 정의된대로 T 림프구의 효과적인 수를 제공하는 것이며, 여기서 상기한 펩티드의 양이나 상기한 폴리뉴클리오티드나 발현 벡터의 양, 혹은 T 세포는 상기한 환자에서 항 표적 세포 면역 반응을 불러 일으키는데 효과가 있다. 표적 세포는 일반적으로 종양이나 암 세포이며, 특히 표면에 있는 사람 MHC I형 또는 II형 분자를 발현하고 상기한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 있는 고형 종양의 특정 세포이다.

또한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포만을 죽이는 방법을 본 발명에서 제공하는데, 이러한 방법은 다음과 같은 3단계로 이루어진다. 1) 환자로부터 T 세포를 얻는 일; 2) TCR이나 기능적으로 유사한 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 앞서 언급한 세포에 도입하는 일: 3) 앞의 세포를 환자에게 주입하는 일.

본 발명의 첫째, 둘째, 셋째 측면으로 이미 나열한 것처럼, 앞서 언급한 표적세포를 죽이는 또 다른 방법은 다음의 3단계로 이루어진다. 1) 수지상세포 같은 항원제시세포를 환자에게서 얻는 일; 2) 상기에 언급한 바처럼 펩티드와 항원제시세포를 접촉시키거나 혹은 이러한 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 항원제시세포를 생체 외(ex vivo)로 접촉시키는 일 3) 그리고 이 항원제시세포를 환자에게 재 주입하는 일이 그 3단계이다.

보통 이러한 항원제시세포로는 수지상세포가 적격이다. 이때 항원성 펩티드와 펄스될 수 있는 자가조직의 수지상세포가 더욱더 좋다. 적절한 T세포 반응을 꾀하는 것이라면 항원성 펩티드는 어떤 것이든 상관없다. 종양 관련 항원에서 유래한 펩티드로 펄스한 자가조직의 수지상세포를 이용한 T세포 치료는 Murphy 외 (1996) The Prostate 29,371-380 와 Tjua 외 (1997) The Prostate 32, 272-278 문헌에 발표되었다.

수지상세포 같은 항원제시세포는 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 접하고 잇다. 폴리뉴클레오티드는 어떤 것이든지 상관없고 수지상세포를 형질도입할 수 있을 만한 것이면 더 좋은데, 이는 펩티드를 제시하고 면역성을 유도하기 때문이다.

편리하게도, 폴리뉴클레오티드는 바이러스성 폴리뉴클레오티드나 바이러스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 형질이입된 수지상세포는 MUC1과 관련한 항원에 특이적인 항종양 면역성을 유발한다고 알려져 왔다 (Gong 외 (1997) Gene Ther. 4,1023-1028). 이와 유사하게 아데노바이러스에 의거한 시스템이 사용될 수 있으며 (Wan 외 (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363), 레트로바이러스 시스템도 사용될 수 있고 (Specht 외 (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221), 수지상세포에 혈액입자를 매개한 방식도 이용될 수 있고 (Szabolcs 외 (1997)), RNA도 사용될 수 있다 (Ashley 외 (1997) J. Exp. Med. 186, 1177-1182).

환자의 표적세포를 죽이는 방식에 대해서, 표적 세포가 암세포, 특히 신장이나 결장 암 세포인 경우가 특히 더 효과적이다.

환자의 HLA 하플로타입은 치료 전에 결정되는 것이 선호된다. HLA 하플로타이핑은 최근에 밝혀진 방법으로 충분히 시행 가능하다.

본 발명은 1) 생체내에서 백신요법의 활성화를 위해 2) 시험관내에서 자가조직 수지상세포의 조작과 잇따른 (생체내에서 T 세포 반응을 활성화시키는) 조작된 수지상세포를 주입하기 위해 3) 시험관내에서 자가조직의 T 세포를 활성화시키고 (즉, 이른바 조작 T 세포를 환자에게 주입하는) 잇따른 채택적 치료를 위해 4) 그리고 (MHC 일치 여부에 관계 없이) 건강한 공여자의 T 세포를 활성화시키고 잇따를 채택적 치료를 위해, 특히 본 발명의 펩티드 (혹은 이러한 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 사용을 포함한다.

구체적으로, 본 발명의 백신은 종양의 형성을 억제하거나 혹은 억제하기 위해 숙주에게 단독으로 혹은 다른 암치료와 덧붙여 치료에 이용한다.

펩티드 백신은 보통 보조액 없이 주입할 수 있다. 또한 BCG나 명반 같은 보조액으로 투여할 수 있다. 다른 알맞은 보조액은 상기에 언급되었다.

본 발명의 펩티드는 진단 제재로 또한 쓰일 수도 있다. 펩티드를 사용함으로써, 치료에 의해 유도되거나 혹은 펩티드에 대항하여 특이적으로 반응하는 T 세포를 분석할 수도 있다. 더욱이, T 세포 전구체의 증가 여부는 본 펩티드에 대한 반응을 보이는 펩티드들로 살펴볼 수 있다. 게다가, 펩티드를 얻은 항원을 발현하는 종양의 진전을 관찰하기 위해, 펩티드 자체를 하나의 마커로 사용할 수도 있다.

첨부된 표 1에는 펩티드가 나열되어 있다. 또한 각 펩티드의 유래 단백질뿐만 아니라, 각각의 단백질에서 각각의 펩티드 위치를 기재했다. 더욱이 각각의 열람번호는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 "생명공학 정보 국립센터(National Centre for Biotechnology Information)" 유전자은행(Genebank)를 참조한 것이다(참고 http: www.ncbi.nlm.nih.gov).

펩티드는 백혈구, 특히 T 림프구 염색 시에 사용된다. 펩티드에 대하여 반응하는 특정한 CTL이 존재하여 이것을 증명하고자 할 때 특히 유용하다. 또한, 펩티드를 샘종 및 암종 질환 치료 시의 진행성을 평가하는데 마커로도 쓰일 수 있다.

또한, 펩티드는 항체 생산에도 이용될 수 있다. 다클론 항체는 펩티드를 특정동물에게 주입후 발생하는 면역화에 의해 표준화된 방식으로 얻을 수 있다. 단일클론성 항체도 이미 표준화된 프로토콜에 의해 만들어진다(예를 들어, Enzymol. (1986), 121, 하이브리도마 기술 및 단일클론성 항체).

TAA의 T 세포 항원결정인자를 구별하는 일은 종양에 대한 면역치료에서 여전히 중요한 과제로 남아있다. 현재까지, TAA의 II형 펩티드를 식별하는 몇몇 전략이 밝혀졌는데, 그 범위는 관심있는 항원과 항원제시세포를 배양하는 것부터 (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, and B.P. van der Bruggen. 1999. CD4(+) T 림프구에 대한 HLA-DR 분자에 의해 발현된 MAGE-3 항원결정인자 확인. J. Exp. Med. 189:767-778), 융합단백질로 다양하게 도입(transfection)을 하는 것까지(Dengjel,J., P.Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. HLA II형 표적 및 감별 질량 분광측정법의 진성조합에 의해 자연적으로 처리된 시클린 D1 보조 T 항원결정인자의 확인. Eur.J.Immunol. 34:3644-3651) 이른다. 모든 이러한 방법들은 시간 낭비도 많을뿐더러 또한 HLA 리간드가 실제로 사람의 조직 생체내에서 제시되는지도 불분명한 상태이다.

본 발명의 발명가들은 MMP7에서 하나의 중심 서열을 담당하는 하나의 리간드를 규명했다. 이들은 신장세포 암종에서 이 단백질이 과발현됨을 발견했고, 더욱이 이 단백질이 종양에 관련성있다고 보았다(Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. 인슐린 유사 성장인자 결합단백질 3에 대한 기질 금속단백분해효소-7의 단백분해활성을 통해 기질 금속단백분해효소-7은 인슐린 유사 성장인자 생체이용률을 촉진한다. Cancer Res. 64:665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. 사람신장세포암종에서의 기질 금속단백분해효소-7 및 2의 발현. Oncol. Rep. 10:567-570). 이 펩티드는 HLA II형 분자에 불규칙적으로 결합하며 다른 건강한 공여자의 CD4 양성 T 세포를 활성시켰다. 따라서, 이러한 접근법은 TAA의 새로운 II형 펩티드의 후보 규명과정에 매우 도움을 주어 이는 실제 임상에서 백신 프로토콜에 꽤 효율적인 연구가 될 것이다.

본 발명에서 밝혀지고 기재된 특성들은 각각을 적절하게 결합하여 사용할 수도 있고, 본 발명의 의도에서 벗어나지 않은 한도 내에서 단적으로 사용할 수도 있다.

본 발명을 다음의 표, 서열표, 예시를 통해 보다 상세히 기재했다. 예시는 오로지 서술적인 목적으로만 기재한 것이지 본 발명의 제한을 두는 의도는 전혀 아니다.

서열번호 1 에서 서열번호 2는 MHC I형이나 II에 의해 제시되는 펩티드를 함유하는 T 세포 항원결정인자의 펩티드 서열이다.

서열번호 3에서 서열번호 11은 본 발명의 백신에 사용된 펩티드의 펩티드 서열을 나타내며, 이후에 "IMA"로 언급된다.

도 1은 원발성 종양 시료인 RCC013에서 펩티드 IMA-MET-001을 유도한 c-Met 원종양유전자의 발현을 보여준다. 나노모세혈관의 고성능 액체 크로마토그래피 ESI MS는 RCC013에서 용출된 펩티드에 실시되었다. 1006.54±0.5 Da에 대한 질량 크로마토그램은 정체 시간 47.8분에서 최고조를 보인다. m/z 1006.54에서 충돌로 유도된 붕괴 질량 스펙트럼은 주어진 정체 시간에서 두번째 LC-MS 실행으로 기록되어 있고 삽입화에 나타나며, IMA-MET-001의 발현이 확인되었다(Weinschenk 2002).

도 2는 c-Met 원종양유전자(MET)의 조직 발현을 보여 준다. 발현은 올리고뉴클리오티드 최소배열로 분석되었다. 복사 번호는 신장과 상대적이고, 이는 1.0으로 설정된다. 통계학적 절대 콜 알고리즘에 따라 "P"는 유전자가 발현했음을, "A"는 없음을, "M"은 최저를 의미한다. "I"는 유전자 발현이 신장에 유의하게 상대적으로 상승함을 의미하고, "D"는 발현이 감소됨을 의미하며, "NC"는 발현에 아무 변화가 없음을 의미한다. 신장에 상대적인 발현값은 신호 로그 비율에서 산출되어 바의 상단에 표시된다. 수평의 파선은 정상 세포에서 가장 높은 발현을 보인다(이 경우, 폐).

도 3은 IMA-MET-001로 감작된 CTL로 펩티드를 로딩한 표적 세포를 사멸하는 것을 보여준다.

도 4는 IMA-MET-001로 감작된 CTL로 악성 세포를 사멸하는 것을 보여준다.

도 5는 저온 표적 억제 측정법을 보여준다.

도 6은 확정으로 유도된 사합체 분석을 보여준다.

도 7은 체외 IMA-MMP-001의 면역원성을 보여준다 대표적 세포내 IFN 감마 대 4명의 건강한 기증자의 CD4 염색. 기증자 1, 2, 3은 세번째와 네번째 자극이 있은 후 IMA-MMP-001에 대한 CD4 양성 T 세포 반응을 보였다. 기증자 4는 항상 음성이었다.

도 8은 종양과 건강한 조직 내의 차별화된 펩티드 발현을 보여준다. (A) 두 펩티드 종인m/z 739.96 그리고 741.95의 질량 스펙트럼은 환자 RCC100의 각각 정상 신장과 신장 세포 암종 조직에서 유도되었다. 질량 스펙트럼은 동종 자가 정상 조직과 비교하여 신장 세포 암종 조직 내 아디포필린(Adipophilin) 펩티드의 약 4 주름의 과다발현을 보인다. (B) m/z 741.95(종양)의 충돌하여 유발된 붕괴 질량 분광 계측법은 아디포필린에서 유도된 펩티드 서열인 펩티드 서열 IMA-ADF-003을 나타냈다.

도 9는 IMA-ADF-001-MUC에서 유도된 두 개의 TUMAPs으로 펄스된 자가 수지상세포로 접종된 환자들을 대상으로 여러 비접종된 펩티드에 대한 2명의 RCC 환자에서 T 세포 면역에 대한 생체내 면역을 보여준다. IMA-ADF-001 ("아디포필린")에 특이적인 T 세포는 접종에 앞서 발현하지 않았으며, 환자 #8(하위 패널)에서는 8번의 접종 후에, 환자 #3(상위 패널)에서는 6번의 접종 후에 감지되었다.

도 10은 동일 환자와 항원에 대한 증폭 ELISPOT 분석에서 확인된 IMA 유도 T 세포 반응의 대표적 예제를 보여준다. 상위와 하위 종행은 각각 음성 조절 항원 HIV-001과 단일 판독에 사용되는 TUMAP IMA-CCN-001을 대표한다. 왼쪽 종행은 선별일 2일(S2)에 접종을 하기 전과 첫 주입(VI) 바로 직전에 채취한 혼주 시료의 ELISPOTs을 보여준다. 오른쪽 종행은 22일(V6)과 36일(V7)에 접종 임상시험 계획 동안에 채취한 혼주 시료의 ELISPOTs을 보여준다. 각 실험을 위해 양성 세포 수가 부여된다.

도 11: 증폭 사합체 염색 측정법으로 확인된 IMA 유도 T 세포 반응의 대표적 예제. 상위와 중간 패널은 CD3 림프구의 2차원 도트 플롯을 나타내고, 하위 패널은 CD3+ CD8+ 림프구의 관문을 나타낸다. 각 칼럼에 대해 지시된 환자, 시점, 염색. S1+V1(접종 전 채취한 시료), V4+V5(22일과 36일에 채취한 시료) V8+FU(64일(마지막 접종)에 채취하고 85에서 92일(시험 완료) 후에 채취한 시료)

A: 도 10에서와 같이 IMA-CCN-001에 면역 반응을 보이는 환자 03-004의 자료. CD3+와 IMA-CCN-001 사합체에 대한 세포군은 림프구(V6+V7: 하위 패널)의 0.78%를 차지하는 IMA(V6+7; 중간 패널)의 네 번째와 다섯 번째 주입 후에 확인 가능하다.

B: 림프구(하위 패널; 3 종향)의 0.8%까지 차지하는 접종 임상시험 계획 기간(중간 패널, 종행 3과 4)동안 IMA-RGS-001 펩티드에 대해 면역 반응을 보이지 않으나 IMA-CCN-001 사합체 양성 반응이 진전되는 환자 03-003의 자료.

도 12: 단일 시점 증폭 사합체 분석법에서 관찰된 T 세포 크기 운동. 혼주 시료를 가지고 기본 증폭 사합체 측정법에 의해 감지된 백신 유발 T 세포 반응의 환자 05-001에 대한 단일 시점 판독에 대한 결과를 보여준다. IMA(TUMAP 혼주)에서 발현하고 IMA-CCN-001 펩티드에 대해 특수한 모든 종양 관련 항원에 대한 결과를 보여준다. 추가로 동일한 단일 시점 측정법 내에 HIV-001과 IMA-HBV-001이 보인다.

용어

I. 본 발명의 펩티드의 특성

유도된 IMA 펩티드의 유전자 제품의 발현에 관련한 자료

주로 유전자 발현 분석 및 문헌, 유도된 펩티드로부터 알려진 항원 특성에 대한 데이터베이스 검색에 근거한 내부 순위 시스템에 따라, 백신 IMA(하단 참조)으로 봉입을 위해 선택된 원발성 RCC로부터 확인된 펩티드가 확인되었다. 자연적으로 발현한 모든 펩티드는 정상 신장 조직뿐 아니라 기타 생명 유지 기관과 조직 범위와 비교하여 신장 세포 암종 조직에서 과다 발현된다. 이러한 선택은 (1) 종양 인식에 높은 특이도를 가진 T 세포를 유도할 수 있는 펩티드이지만 IMA의 접종으로 유도된 자가면역 가능성을 최소화하기 위한 기타 조직를 대상으로 해야 하고, (2) 유도된 T 세포에 의해 인식된 환자군의 종양 다수를 확인해야 할 필요성이 있다.

IMA에 포함된 유도 펩티드로부터 평균 항원 유발률은 68%이며, 단일 항원에 대해 54%에서 96%에 이른다(RCC에서 과다 발현 대 n=24 RCC 시료 내 생명유지 기관 및 조직). 이는 Her-2/neu (유발률: 25 30%)과 같은 표준 종양 항원보다 상당히 높다.

완전 유전자 발현 프로파일링(profiling)은 상업적으로 판매되는 높은 밀도의 microarray 시스템(Affymetrix)을 사용하여 실행되었다. RNA는 조직에서 분리되어 올리고핵산염 마이크로어레이(microarray)의 높은 밀도로 처리 및 교배되었다. 염색과 세척 후, 배열이 스캔되어 배열의 각 점의 형광 강도는 올리고핵산염의 DNA 서열과 일치하는 유전자의 발현 정도를 나타내었다. 배열 내 여러 올리고핵산염은 각 유전자 서열을 포함한다. 통계학적 소프트웨어 분석 후 두 시료간의 쌍(pair wise) 상대 발현 가치가 각 유전자를 위해 확보될 수 있다. 기저치로써 하나의 상존 시료를 사용하여 다른 시료의 모든 자료를 규격화하여 모든 시료간의 발현 정도의 상관 정량을 가능하게 한다.

RNA 소스 상업적으로 확보된 사람 조직의 총 RNA(Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Germany; Stratagene, Amsterdam, The Netherlands, BioChain, Heidelberg, Germany). 여러 개인의 총 RNA는 각 개인의 RNA가 동등한 무게였던 방식대로 혼합되었다. 품질과 수량은 RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent)를 사용하여 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent, Waldbronn, Germany)에서 확인되었다.

고밀도 올리고핵산염 마이크로어레이 분석법 연구계획서(Affymetrix) 지침에 따라 두 가닥 DNA는 SuperScript RTII (Life Technologies, Inc., Karlsruhe, Germany)와 시동체(Eurogentec, Seraing, Belgium)를 사용하여 총 RNA의 5-8 μg로부터 합성되었다. BioArray™ High Yield™ RNA 전사 라벨링 키트(ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY) 를 사용한 체외 전사, 분절, Affymetrix U133A 또는 U133 Plus 2.0 GeneChips의 부합화(Affymetrix, Santa Clara, CA) 및 스트렙타비딘 피코에리쓰린(streptavidin phycoerythrin) 염색 및 비오틴(biotin)이 부착된 항-스트렙타비딘 항체(Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)는 제조사의 연구계획서(Affymetrix)를 따랐다. Affymetrix GeneArray 스캐너가 사용되었고 Microarray Analysis Suite 5.0 소프트웨어나 GeneChip^TM Operating Software (GCOS)로 분석되었다. 규격화를 위해 연구계획서(Affymetrix)에서 제공된 100개의 관리 유전자가 사용되었다. 쌍(pairwise) 비교는 기저로써 신장에서의 표현값을 사용하여 산출되었다. 따라서 신호 로그비(signal log ratio)에서 산출된 모든 표현값은 신장과 관계가 있고, 이는 1로 설정되었다. 차별 발현의 유의성은 소프트웨어의 통계학적 알고리즘으로 주어진 "변경" 값으로 판단되었다. 발현을 완전 감지하기 위해, 통계학적 알고리즘을 사용하여 데이터가 분석되었다. 유전자 표현의 유무는 완전 콜 알고리즘에 의해 결정되었다.

c-Met 원종양유전자(MET)의 유전자 발현에 대한 전형적인 조직 표현 판은 도 2에 나와있다. MET는 분석된 신장 세포 암종의 96%에서 과다 발현되었으나(n=24, 오른쪽), 선별된 여러 생체 건강 조직과 기관뿐 아니라 면역학적으로 중요한 조직과 세포에서 훨씬 낮게 확장되거나 그렇지 않았다(도 2의 왼쪽).

표 1은 본 발명에 따른 펩티드 또한 구성하는 발명 IMA 백신에 함유된 펩티드에 대해 요약하고 있다.

표 2는 발명 IMA 백신에 함유된 펩티드의 모든 항원 코딩에 대한 발현 결과와 본 발명에 따른 펩티드에 대한 발현 결과를 요약하고 있다.

1 소프트웨어의 통계학적 알고리즘에서 제공된 "변경" 값에 따름("I"의 수)

2 모든 정상 조직 중에서도 가장 높은 발현을 보이는 정상 조직과 비교하여 더 높은 발현을 보이는 RCC의 수

3 뇌는 면역이 면제되었으며 본 이유에 대해 고려되지 않았다.

RCC에서의 최소 과다 발현 vs 모든 정상 조직은 54%이고 최대는 96%이다. 이는 Her-2/neu (유병률: 25-30%)처럼 표준 종양 항원에서 보다 상당히 높다.

MUC mRNA에 대한 과다 발현이 감지 되지 않는 MUC는 예외이다. 그러나 하단에 발표된 보고서들이 참작되었다.

1. 악성에서 비정상적인 비당화(deglycosylation)는 일반적이며, 정상 세포에서 발현되지 않는 종양 세포 내 항원결정인자를 드러낸다. 이런 기전은 RCC에서도 일어날 가능성이 높다. 이는 MUC를 발현하는 종양 세포주의 특정 사멸을 설명한다(Brossart 1999). MUC의 속성에 대해서는 4.1.5장을 참조하기 바란다.

2. IMA-MUC-001은 Tㆌbingen 대학에서 진행된 조사자 착수 시험에서 자가 수지상세포에 관련하여 투여되었다. ASCO 2003 (Mueller 2003)에서 최근 소개된 이 시험과 ASCO 2005 (Wierecky 2005) 미팅에서 소개된 추적조사 자료에서는 어떤 자가면역 효과도 보고되지 않았다.

3. 임상 연구에서 나온 다른 보고들은 IMA-MUC-001에 대해 특이성을 보이는 세포독성 T 세포가 유방암종(Rentzsch 2003)과 직장결장암종 환자(Dittmann 2004)에서 자연적으로(면역 없이) 발생함을 증명하고 있다. 이 환자들에게서 자가면역 효과는 보고되지 않았다. 이는 IMA-MUC-001 특이적 T 세포의 자연적 역할을 강조한다.

과다 발현이 mRNA 수준에서만 MUC 항원에 대해 감지될 수 없더라도, 이 보완 자료를 기초로 하여 IMA-MUC-001의 투여가 안전한 것으로 고려될 수 있다.

여러 HLA-DR 대립유전자로 IMA-MMP-001의 불규칙 결합

IMA-MMP-001은 HLA II형 분자인 HLA-DR에 결합되는 펩티드이다. II형 TUMAPs는 II형 TUMAPs에 의해 활성화되는 세포독성 T 세포의 기능을 지원하는 중대한 역할을 하는 보조 T 세포를 활성화한다. HLA-DR 펩티드의 불규칙 결합은 IMA로 치료받은 HLA-A^*02 양성 환자들의 대다수(>50%)도 IMA-MMP-001에 T 세포 반응을 유발할 수 있음을 보증하는 데 중요하다. IMA-MMP-001의 결합에 대한 인실리코(In silico) 분석은 IMA-MMP-001가 HLA-A2 양성 백인 환자군의 적어도 69.6%를 포함하며, 여러 HLA-DR 대립유전자((DRB1^*0101, ^*0301, ^*0401, ^*1101 그리고 ^*1501)에 불규칙하게 결합됨을 보여준다. IMA-MMP-001의 불규칙 결합은 체외 면역원성 자료로 실험상 확인된다.

검사 원리

Tubingen 대학에서 개발된 SYFPEITHI 알고리즘 Tubingen (Rammensee 1997; Rammensee 1999)을 사용하여, IMA-MMP-001의 여러 일반 HLA-DR 대립유전자 결합(아래 표 참조)이 순위 지어졌다. 광범위한 항원, 예를 들어 사람 종양 관련 항원 TRP2(I형) (Sun 2000)와 SSX2(II형) (Neumann 2004)로부터 I형과 II 항원결정인자를 확인하는 데 알고리즘이 성공적으로 사용되었다. 분석된 HLA-DR 대립유전자는 HLA-A2 양성 백인 환자군의 적어도 69.6%를 포함한다(Mori 1997). 결합의 역치는 발표된 불규칙한 HLA-DR 리간드의 결합 점수 분석을 바탕으로 한 18 점으로 정의되었다. 불규칙한 결합은 백인 환자군의 적어도 50%에서 발현된 여러 HLA-DR 대립유전자의 HLA-DR 펩티드 결합으로 정의된다.

HLA-A와 HLA-DR의 좌는 다른 것에 비해 선행하는 특정한 HLA-DR과 HLA-A2의 결합을 야기하는 결합불균형에 속해 있다(표 3).

n.a.는 할당되지 않음(not assigned)을 의미한다 (Mori 1997).

특정 MHC 분자의 리간드는 모든 MHC 대립유전자에 대한 펩티드 모티프의 정의를 가능케하는 일차 서열의 특정 위치에서 화학적으로 관련된 아미노산을 운반한다(Falk 1991). SYFPEITHI는 에드만(Edman) 퇴행과 일렬 질량 분광법에 의한 자연적 리간드 분석에 기초하여 독점적으로 정제 모티프로부터 추론되는 모티프 기질을 사용한다(Schirle 2001). 이 기질들은 MHC I형 또는 II형 분자에 나타난 상기한 단백질 서열로부터 펩티드의 정확한 예측이 가능하게 한다(Rotzschke 1991).

백인 환자군에서 가장 흔한 HLA-DRB1 대립유전자에 대한 IMA-MMP-001 SYFPEITHI 결합 점수를 보여준다. HLA-A2 양성 백인의 대응되는 혈청학적 하플로타입의 빈도는 각 괄호에 나와 있다. 펩티드는 점수가 18과 동일하거나 더 높은 경우 HLA 분자에 결합되는 것으로 간주되었다.

SYFPEITHI 알고리즘에 의한 예견에 기초하여, IMA-MMP-001은 HLA-A2 양성 백인 환자군의 적어도 69.6%를 포함하며 여러 HLA-DR 대립유전자(DRB1^*0101, ^*0301, ^*0401, ^*1101 그리고 ^*1501)에 결합될 가능성이 높다. HLA-DR15에 대한 빈도 자료가 없기 때문에 이 대립유전자는 산출 시 삭제되었다. 따라서 환자군의 적용범위는 심지어 69.9% 보다 높을 수 있다. IMA-MMP-001의 불규칙 결합에 대한 실험적 확인은 체외 면역원성 자료에서 확보된다(하단 참조).

항원 발현과 종양 및 자가 정상 조직에 유도된 펩티드 존재 비교.

과다 발현된 항원은 세포 표면에 HLA 분자에 과다 존재되는 것으로 추정된다. 대표적으로, 아디포필린에서 유도된 HLA-A^*03 펩티드는 둘 다 IMA 함유된 HLA-A*02 펩티드 IMA-ADF-001과 IMA-ADF-002로부터 과다 존재하는 항원으로써, QUALITEA 전략을 사용하며 환자 RCC100의 자가 정상 조직과 비교하여 신장 세포 암종에 과다 존재하는 것으로 보였다. 이는 이 대표적 사례에서 항원의 과다 발현(이 경우 아디포필린)이 동일한 항원의 유도된 펩티드의 과다 발현과 상관 관계가 있음을 증명한다.

본 방법은 (Lemmel 2004)에 상세히 기술되어 있다. QUALITEA는 종양과 정상 조직으로부터 HLA 용출된 펩티드의 차별화된 정량에 대한 방법을 나타낸다. 두 개의 다른 소스에서 유도된 HLA 리간드는 ¹H_x- 또는 ²D_x-시약 중 하나와 병용되어 N 말단으로 유도체 합성된다. 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 펩티드 복합도 감소에 이어, 펩티드는 최고 구역에 따른 ESI-MS 분석으로 그 양이 평가된다. 유도체 합성된 한 쌍의 펩티드(¹H_x-derivatisation와 ²D_x-derivatisation)는 물리화학적으로 동일하고 크로마토그래프 시스템에서 본질적으로 공동 희석되기 때문에 쉽게 감지 가능하다. 더욱이, 질량 분광 스캔에서 지속적으로 질량 차이가 측정된다. 이 차이는 유도체에서 동위원소(isotopes)의 수에 따라 달라진다. 리간드의 서열 식별은 ESI-MSMS 분석과 기록된 스펙트럼의 컴퓨터 이용 데이터베이스 탐색으로 드러난다. 따라서, 이 분석은 종양과 정상 조직 내 펩티드 존재의 정성 및 질량 측면에 대한 정보를 제공한다.

과다 발현된 항원의 종양과 정상 조직 내 차별된 HLA 펩티드 존재에 대한 예제는 도 8에 나와 있다. 종양 조직에 4 주름으로 과다 존재한 펩티드 IMA-ADF-003 대 환자 RCC100의 건강한 신장 조직은 동등하게 존재하는 많은 펩티드 중에서 충돌적으로 유도된 붕괴 질량 분광 분석법으로 식별되었다. 종양 조직에 과다 존재하는 이 펩티드는 아디포필린으로부터 유도되었다. 동일한 환자 RCC100의 유전자 발현 분석도 건강한 신장과 비교하여 이 종양 조직에서 아디포필린의 2.64 주름 과다 발현을 보였다(자료 없음). 이 자료는 본 특정 사례에서 유전자 수준에서 종양 조직 내 과다 발현이 종양 세포 표면에서 펩티드 과다 존재로 인도함을 확인해 주고 있다.

IMA-ADF-001에 반하는 생체 내 면역원성 RCC 환자로부터 생성된 자가 수지상세포(DCs)는 이들 IMA-ADF-001 중에서 MUC에서 유도된 두 개의 TUMAPs으로 전해졌다. IMA-ADF-001는 접종 되지 않았다. 접종은 매 2주 마다 4차례 피하 투여(s.c.) 하였고, 종양 진전이 있는 동안 매월 반복하였다. 5번째 수지상세포(DC) 투여 후에 환자들은 저용량 IL-2 (1Mio IE/m2) sc로 주당 3차례 투여 받았다. IFN-감마 ELISPOT을 이용하여 T 세포 전구물질 활성화가 모니터링되었다. 두 개의 접종된 펩티드에 대항해 T 세포 유도 외에도 IMA-ADF-001 중에서 TUMAPs로 알려진 여러 다른 것에 대항한 T 세포 활동도 검사되었다.

결과는 최근 미국 임상 종양협회 연례 회의(ASCO) 2005에서 Peter Brossart(Tubingen 대학) 의사의 발표에서 보여 주었고, 전체 발표 자료는 ASCO 홈페이지에서 나와 있다. 자가 수지상세포(DCs)에서 펄스된 두 개의 MUC 펩티드로 접종한 두 명의 환자(pt #8과 pt #13)에서 접종된 펩티드 보다 다른 펩티드에 T 세포 면역은 접종 후 감지되었다(도 9). 접종 전에 면역이 존재하지 않았기 때문에, 그런 T 세포는 항원결정인자(epitope) 확산으로 유발된 것이 거의 확실하다. 항원결정인자 확산은 종양 세포가 붕괴(예: 괴사, 백신 유발 T 세포 등에 의한 용해로)될 때 생길 수 있고, 항원 전달 세포(APCs, 예: DCs)에 의해 빼앗긴 항원을 방출한다. 이 APCs는 그 후 세포 내에서 항원을 처리하고 T 세포 반응을 감작하기 위해 T 세포 항원결정인자(즉, TUMAP)를 나타낸다. 이 자료는 자연적으로 T 세포 항원을 생기게 함으로써 IMA-ADF-001의 강력한 잠재 역할을 강조한다.

II. 본 발명에 따른 "IMA" 백신 생산 및 사용

IMA는 원발성 신장 암 세포에 위치하고 확인된 종양 관련 펩티드 세트를 함유한 백신이다. 이 세트에는 HLA I형과 II 펩티드가 포함된다. 펩티드 세트도 피부 내 투여 효과를 검사하기 위한 면역 지표로 역할하는 양성 조절 펩티드로써 사용되는 HBV 핵심 항원에서 하나의 펩티드를 포함한다. 일반적 필요면에서 보조가 될 펩티드 접종과 그런 GM CSF는 본 접종 일정에서 보조로써 활용될 것이다(사람 GM CSF는 Sargramostim, Leukine^TM, Berlex에서 상업적으로 판매한다).

IMA에 함유된 10개의 종양 관련 펩티드 중 8개는 하단에 설명된 XPRESIDENT 기술로 식별되었다. 이들 펩티들은, 종양으로 발현된 HLA 분자의 상황에서 자연적 존재는 직접적 증거로 증명된다. 펩티드 IMA-MUC-001과 IMA-CCN-001은 다른 기술을 사용하여 식별되었다. 후자의 펩티드 모두에 대해, 종양 세포주에 의한 이들 펩티드의 자연적 존재는 체외 면역원성 측정에서 간접 증거에 기초하여 증명된다(하단 참조).

검사 원리

쇼크-냉동(Shock-frozen) 처리된 원발성 신장 세포 암종 조직에서 HLA 분자는 정제되고 HLA 관련 펩티드는 분리된다. 이들 펩티드 중 하나는 HPLC에서 오프라인으로 분리되고, 분할은 분석되거나 질량 분광법에 의한 서열 분석은 온라인으로 HPLC-MSMS 실험으로 실행된다. 결과로 생긴 서열은 식별된 펩티드의 합성과 식별되고 합성된 펩티드의 분할 스펙트럼 구성에 의해 증명된다. 식별된 펩티드는 원발성 종양의 HLA 분자에서 직접 유도되기 때문에 이런 결과들은 원발성 신장 세포 암종 조직에서 식별된 펩티드의 자연적 처리와 존재에서 직접적 증거를 나타낸다.

방법

본 방법은 (Weinschenk 2002)에 의해 상세히 기술되어 있다. 간단히 말해, Tubingen 대학의 비뇨기과에서 입수된 쇼크-냉동된 환자 시료(현지 윤리 위원회에서 승인)들은 분리되고, HLA 분자는 HLA I형 특이 항체 W6/32나 HLA-A^*02 특이 항체 BB7.2나 (IMA-MMP-001의 경우) HLA-DR 특이 항체 L243을 사용하여 친화 크로마토그래피(chromatography)에 의해 정제되었다. HLA 관련 펩티드는 산 처리로 용출되어 초여과에 의한 MHC 알파 사슬 단백질에서 분리되었다. 분리된 펩티드는 역 단계의 높은 활동도의 액체 크로마토그래피(chromatography)에 의해 오프라인에서 분리되고, 분할은 하이브리드 사중 직각 가속 유체 속도 강조(TOF) 일렬 질량 분광계(Q-TOF I 또는 Q-TOF Ultima, Waters)에서 nano-ESI MS에 의해 분석되거나 온란 LC-MSMS 분석은 동일한 장비를 사용하여 실시되었다. 시스템에 펩티드가 없도록 하기 위해 항상 공회전이 포함되었다. 교정은 적어도 1일 1회 실시되었고, 표준 화합물에서 분석은 시스템의 적정 성능을 보장하기 위해 적절한 간격을 두고 실시되었다. 분할 스펙트럼 해석은 수동으로 실시되었다. 분석 증명은 데이터베이스 검색과 식별되어 합성된 펩티드의 분할 스펙트럼의 잠정적 펩티드 서열과 비교의 고형 단계 합성으로 확보되었다. IMA-MUC-001을 제외한 IMA(자료 없음)에 함유된 모든 펩티드와 IMA-MUC-001은 원발성 신장 세포 암종 조직에서 이들 펩티드의 자연적 존재를 확인하며 동일한 방식으로 식별되었다.

IMA 성분

본 임상 개발용 펩티드는 표준 및 확립된 Fmoc 화학에 의해 합성된다. 제조 HLPC와 이온 교환으로 정제가 실시된다. 중요한 것은, 펩티드의 주체성과 순도는 쉽고 질량 분광법과 HPLC를 사용하여 높은 정확도로 결정될 수 있다. IMA 제제는 하단에 상세히 기술된 11개의 개별 약물 제제로 구성된다.

모든 펩티드는 Fmoc 고형 단계 화학으로 합성되고, 순도 > 95%로 이온 교환 크로마토그래피(chromatography)와 HPLC에 의해 정제된다. 교정된 구조는 아미노산 분석과 질량 분광법에 의해 결정된다.

약제인 IMA는 염(아세테이트산)의 형태로 (각 펩티드의 578 μg를 포함하는) 11개 펩티드를 함유한 피부 내 적용에 대한 동결 건조로 나타난다. 환자들의 임상 시험 처방 적용에 대해 각 펩티드의 578 μg을 포함하는 투여용 파우더는 700 μl의 탄산수소나트륨(4.2%)에서 용해될 것이다. 용액(투여 당 각 펩티드의 413 μg의 단일 용량 및 투여 당 4.5 mg IMA의 전체 단일 용량과 동일)의 재구성 후에 500 μl이 피부 내로 투여될 것이다.

*제조 공정 중 제거됨

IMA의 품질은 활성 제제 사용과 Ph. Eur 요건에 부합하는 부형제 모두에 의해 보증된다.

IMA에 함유된 펩티드의 체외 면역원성

IMA는 9개의 HLA I형 종양 관련 펩티드와 1개의 HLA II형 종양 관련 펩티드, 1개의 HLA I형 바이러스 조절 펩티드를 포함한다. 체외 면역원성은 IMA 에 함유된 막대한 대다수의 펩티드에 대해 증명될 수 있다.

체외 면역원성은 주로 두 가지 T 세포 측정법 크롬 방출 측정에서 표적 세포에 대한 세포독성 사멸 및/또는 HLA 사합체에 의한 T 세포 B. 감지-을 사용하여 IMA에 함유된 10개 중 8개의 HLA I형 서열에 대해 증명되었다. 이 측정법들은 HLA-A*02 양성 기증자의 혈액 내 특정 전구물질의 존재뿐 아니라 표적 세포를 사멸시키는 특정 T 세포 능력에 대한 증거를 증명한다. 후자의 사례에서와 같이 내생적으로 항원을 발현하는 여러 종양 세포주가 인식된다. 이는 종양 세포에서 사용되는 펩티드의 자연적 존재에 대해 추가적(간접적) 적용을 부여하고, 이런 펩티드를 사용하여 생성된 세포독성 T 세포가 종양 세포 인식에 대해 큰 항원항체 결합력을 갖는 다는 것을 보여 준다. 체외 면역원성은 흐름 세포측정(cytometry)에서 염색되는 세포내 시토킨을 사용하여 IMA에 함유된 HLA II형 펩티드 IMA-MMP-001에 대해 증명되었다(하단 참조).

살해 측정법: 크롬 방출 측정법에 의해 측정된 표적의 세포독성 사멸을 하는 시토킨 방출, ELISA로 측정된 T 세포에 의한 시토킨 방출을 하는 시토킨 염색, 피부 내 흐름 세포측정(flow cytometry)로 측정된 T 세포에 의한 시토킨 합성을 하는 사합체 감지, HLA 사합체에 의한 펩티드 특이성 T 세포 감지.

IMA에 함유된 HLA I형 펩티드의 체외 면역원성

IMA는 10개의 HLA I형 결합 펩티드를 함유한다. 이들의 체외 면역항원에 대한 펩티드를 검사하기 위해 CD8 양성 세포독성 T 세포는 IMA 함유된 단일 펩티드를 사용하여 건강한 기증자로부터 얻은 자가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 생성되었고, 이들 세포독성 T 세포 활동은 크롬 방출 측정법과 흐름 세포측정(flow cytometry)에서 HLA 사합체로 T 세포를 감지하여 검사되었다. 상기 표 8에 요약되어 있는 기타 펩티드에 대한 자료인 두 방법 모두에 대해 하나의 대표적인 펩티드에 대해 상세 자료를 보여 준다.

첫번째 단계에서 세포독성 T 세포는 검사될 특정 펩티드로 건강한 HLA-A*02 양성 기증자에게서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 반복적인 자극에 의해 체외에서 생성(시동)된다. 시동은 기증자의 혈액 단핵구에서 생성된 자가 수지상세포 또는 HLA 사합체가 실린 구슬을 사용하여 실시될 수 있다.

A. 표적의 세포독성 사멸: 두번째 단계에서 그렇게 시동된 세포독성 T 세포(CTLs)의 세포독성은 방사성 크롬으로 표적 세포를 라벨링하고 생성된 CTLs로 표적 세포를 배양함으로써 검사된다. 상청으로 배출된 방사성 크롬 양은 사멸된 표적 세포의 비율과 직접적으로 상관이 있을 수 있다.

B. HLA 사합체로 T 세포 감지: 두번째 단계에서 주어진 펩티드에 대한 특이성으로 시동된 CTLs은 HLA 사합체를 사용하여 감지된다. 사합체는 서로에게 연결된 4개의 펩티드 장착 HLA-A*02 분자로 구성된다. 이들 구성은 사합체에서 HLA 펩티드 복합체를 인식하는 인지체 T 세포 수용체의 특정 라벨링과 흐름 세포측정(flow cytometry)에서 분석에 따른(FACS) 플루오로크롬(fluorochrome)으로 사합체 라벨링을 가능하게 한다.

수지상세포로 세포독성 T 세포 시동.

CTL 유도에 대해 5x10⁵ DC는 2시간 동안 합성 펩티드 IMA-MET-001의 50 ㎍/ml로 펄스되고, 세척되어, RP10 배지에서 2.5x10⁶ 자가 PBMNC로 배양되었다. 7일간의 배양 후에 자가 펩티드 펄스된 PBMNC로 세포가 재자극되었고, 1 ng/ml의 사람 재조합 IL-2(R&D 시스템)은 1, 3, 5일에 추가되었다. 유도된 CTL의 세포독성 활동은 표준 ⁵¹Cr-방출 측정법에서 마지막 재자극 후에 5일에 분석되었다(Brossart 1999). (하단 참조)

사합체(tetramer) 장착 구슬로 세포독성 T 세포의 체외 시동.

약간의 수정 또는 이전에 (Walter 2003) 적용 시 체외 시동이 실시되었다. 간단히 말해, 비오틴이 부착된 재조합 HLA-A*0201 분자는 막 영역을 부족하게 하고 무거운 사슬의 카르복시(carboxy) 끝머리에서 Biotin이 부착되어지며, 이전에 기술된 대로 생산되었다 (Altman 1996). 정제된 공동 자극 마우스 IgG2a 항 사람 CD28 Ab 9.3 (Jung 1987)은 제조사가 권장하는 조건 하에서 설포-하이드록시숙신이미도비오틴(Sulfo-hydroxysuccinimidobiotin)을 사용하여 화학적으로 비오틴이 부착되었다(Perbio Science, Bonn, Germany). 사용된 미세구는 약 0.06 μg의 비오틴 FITC/mg 미세구의 결합 용량으로 폴리스티렌(polystyrene) 입자로 코팅된 5.60 μm 지름의 스트렙타비딘이었다(Bangs Laboratories, Fishers, Illinois/USA). 미세구 취급에 있어, 멸균된 PBS/BSA/EDTA 버퍼가 사용되었다. 비오틴이 부착된 분자에 연결하기 위해 미세구는 비오틴이 부착된 MHC 및/또는 다양한 농도에서의 항체를 함유하는 버퍼에서 2 × 10⁶ 입자/ml에서 세척되어 재현탁되었다. 결합은 흔들리는 동안 30분간 실내 온도에서 허용되었다. 코팅된 구슬은 3번 세척되었고, 상기 버퍼에서 재현탁되어, 사용 전 4 ℃에서 4주까지 보관되었다.

PBMCs는 표준 차이 분리 배양을 사용하여 새로운 연막으로부터 분리되었다(Linaris, Wertheim Bettingen, Germany 또는 PAA Laboratories, Linz, Austria). 지시된 대로, 손대지 않은 CD8 T 세포는 80% 이상의 CD8 양성 TCR 양성 세포의 순도의결과를 낳는 제조사의 조건에 따라 CD8 T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 음성 고갈에 의해 자기적으로 강화되었다. 1.5 ml T 세포 배양에서 샘마다 5 × 10⁶ 대응체 세포 플러스 1 x 10⁶ APCs 또는 미세구로 24개 수조 판에서 체외 자극이 착수되었다. 제시되어 있지 않은 경우, 5 ng/ml의 사람 IL-12 p70 (R&D)는 APCs나 미세구에 추가되었다. 37 ℃에서 3-4일간 공동 배양된 후 새로운배양과 20 U/ml의 사람 IL-2 (R&D)가 추가되어 3-4일 동안 37 ℃에서 세포가 추가 배양되었다. 이 자극 주기는 두번 반복되었다.

CTL에 의한 크롬 방출 측정법을 사용한 표적 세포 사멸.

표준 ⁵¹Cr 방출 측정법은 기술한 대로 실시되었다(Brossart 2001). 표적 세포는 37℃에서 1시간 동안 RP10에서 펄스되고, ⁵¹Cr-소듐 크로메이트(sodium chromate)로 라벨링되었다. 10⁴ 세포는 둥근 바닥의 96개의 수조 판의 우물로 전이되었다. CTL의 다양한 수는 200 ㎕의 최종 양을 부여하기 위해 추가되고 37℃에서 4시간 동안 배양되었다. 측정 완료 시, 상층액(50 ㎕/수조)이 채취되어 베타 판 계수기에서 계산된다. 용해에 대한 %는 100 x(실험 방출 자발적 방출 / 최대 방출 자가 방출)로 산출되었다. 자발적 및 최대 방출은 배양 또는 2% 트리톤(Triton) X 100 각각의 존재 여부로 결정되었다. 종양 세포 용해의 항원 특이도는 더 나아가 20:1 비율(억제제: 표적 비율)로 종양 세포의 용해를 차단하기 위해 펄스된 라벨링 처리되지 않은 T2 세포 용량을 분석하여 저온 표적 억제 측정법으로 결정되었다.

HLA 사합체(tetramer)로 독성세포 T 세포 감지.

약간의 수정 또는 이전에 (Walter 2003) 적용 시 사합체 염색이 실시되었다. 간단히 말해, 비오틴이 부착된 재조합 HLA-A*0201 분자는 막 영역을 부족하게 하고 무거운 사슬의 카르복시(carboxy) 끝머리에서 biotin이 부착되어지며, 이전에 기술된 대로 생산되었다 (Altman 1996). 형광 사합체는 4:1 몰(molar) 비율로 스트렙타비딘 PE 또는 스트렙타비딘 APC (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)로 비오틴이 부착된 HLA-A*0201를 공동 배양함으로써 생성되었다. 사합체 분석의 경우, 10 mg/ml의 아지드화 나트륨(sodium azid) (Merck, Darmstadt, Germany)을 함유하는 PBS/BSA/EDTA로 세척되고, Abs CD4-FITC 및 CD8-PerCP 복제 SK1 (둘 모두 Becton Dickinson)을 함유하며 동일한 버퍼에서 20분 동안 4 ℃에서 염색되었다. 미세구 자극 실험 후에 100 μg/ml의 라벨링 처리되지 않은 스트렙타비딘(Sigma)이 포함되었다. 세포는 2 %의 가열-불활성화된 FCS (PAN Biotech, Aidenbach, Germany), 2 mM 소듐-EDTA 및 10 mg/ml 아지드화 나트륨(sodium azid), PBS/FCS/EDTA/아지드이나 50% FCS가 포함된 데서 30분간 4 ℃에서 염색된 사합체를 함유하며 PBS에서 세척되었다. 사합체 시약은 항상 5 μg/ml의 MHC 농도에서 사용되었다. 염색된 세포는 PBS/FCS/EDTA/아지드에서 광범위하게 세척되었고 1 % 포름알데하이드(formaldehyde) (Merck)로 고정되었다. 세포는 4색의 FACSCalibur (Becton Dickinson)에서 분석되었다. A 방법뿐 아니라 B 방법에 대한 IMA-MET-001에 대해서 대표적으로 상세히 결과가 나타났다. 기타 HLA I형 펩티드에 대한 결과는 표 8에 요약되어 있다.

A. 표적에 대한 세포독성 사멸

그 결과는 (Schag 2004)에 의해 발표되었다. 관련 정보는 하단에 요약되어 있다.

첫 단계에서, 유도된 CTL의 세포독성은 표적으로써 T2 세포를 장착한 펩티드와 자가 DC를 사용하여 표준 ⁵¹Cr-방출 측정법에서 분석되었다. 도 3에서와 같이, 주 2회 재자극이 있은 후에 확보된 CTL 라인(line)은 항원 특이 사멸을 증명하였다. T 세포는 세포독성 활동의 특이성을 확인하며 생존 단백질에서 유도된 불규칙적 HLA-A2 결합 펩티드 또는 HIV-1 역 전사효소로 펄스된 표적 세포를 용해하지 않은 반면, T2 세포나 인제체 펩티드로 코팅된 DC만을 인식하였다.

두번째 단계에서, 내부적으로 c-Met 단백질을 발현하는 체외로 유도된 CTL의 능력은 표준 ⁵¹Cr-방출 측정법에서 표적으로써 c-Met를 발현하는 HLA-A*02 양성 세포주 HCT 116 (결장암), A498, MZ 1257 (신장 세포 암종, RCC), MCF-7 (유방암), Mel 1479 (악성 흑색종) 그리고 U266 (다발 골수종)을 사용하여 분석되었다. EBV 변환된 B 세포주 크로프트(Croft)(HLA-2+/c-Met-)와 난소암 세포주 SK-OV-3 (HLA-A3+/c-Met+)는 CTL의 특이성과 HLA-제한을 결정하기 위해 포함되었다. 도 4에서 증명되었듯이, CTL에 특이한 c-Met은 HLA-A2와 c-Met 모두를 발현하며 악성 세포를 효과적으로 용해할 수 있었다. 종양 세포 내 HLA-A2 분자와 관련있는 c-Met 펩티드의 존재가 표적 세포의 효과적 용해에 필요하고 CTL의 항원 특이성과 MHC 제한을 확인함을 증명하며, 난소암 세포 SK-OV3 또는 크로프트 세포에 대한 인식은 없었다. 체외에서 유도된 T 세포는 세포독성 활동이 NK 세포로 매개되지 않았음을 보이며, K 562를 인식하지 않았다.

더 나아가 체외로 유도된 CTL 주에 대한 항원 특이성과 MHC 제한을 증명하기 위해서, 저온 표적 억제 측정법을 실시하였다. 표적 세포(U 266 및 A 498) 용해는 저온 표적 억제 측정법에서 차단될 수 있었다. 불규칙적 펩티드로 펄스된 T2 세포가 아무 효과를 보이지 않은 반면, 인지체 펩티드로 펄스된 저온 (⁵¹Cr로 라벨링 처리되지 않은) T2 세포를 추가하여 종양 세포 용해를 감소시켰다(도 5).

B. HLA 사합체(tetramer)로 T 세포 감지

A*02+ 의 건강한 기증자의 강화된 CD8 T 세포는 10 nM CD28 Ab에 더불어 불규칙한 A*02 복합체(왼쪽 패널)의 10nM 또는 지시된 항원(중간 및 오른쪽 패널)로 재주름된 A*02 중 하나가 있을 경우, 코팅된 구슬로 3차례 자극되었다. 지시된 항원은 CMV pp65로부터의 펩티드 NLVPMVATV(Wills 1996), 멜란(Melan)-A/MART-1 (Kawakami 1994)로부터 수정된 펩티드 및 펩티드 IMA-MET-001였다. 모든 T 세포주는 CD8-PerCP Ab와 인지 사합체-PE(도 6; 왼쪽 및 중간 패널), 불규칙한 A*02/ILKEPVHGV 사합체-APC(오른쪽 패널)로 염색된 표면이었다. CD8 양성 림프구 중 사합체+(tetramer+) 세포 비율은 각 도에 지시되어 있다.

IMA 함유된 HLA II형 펩티드 IMA-MMP-001의 체외 면역원성

IMA는 MMP 7으로부터 나온 하나의 HLA II형 펩티드인 IMA-MMP-001를 함유한다. 체외 면역원성과 불규칙 결합 특성과 관련하여 펩티드를 검사하기 위해, CD4 양성 T 세포는 IMA-MMP-001 펩티드와 흐름 세포측정(flow cytometry)에서 세포 내 시토킨 염색으로 검사된 이들 보조 T 세포의 활동을 이용하여, 다른 HLA 유전자형으로 건강한 기증자에서 자가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 생성되었다.

첫째, CD4 양성 T 세포는 IL-12 가 있을 시 검사될 특정 펩티드로 건강한 기증자에게서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 반복적인 자극에 의해 체외에서 생성(시동)되었다. 시동은 기증자의 혈액 단핵구에서 생성된 자가 수지상세포를 사용하여 실시되었다. 두번째 단계에서, 주어진 펩티드에 대해 특이한 시동된 CD4 양성 T 세포 활동은 형광으로 라벨링된 항체를 사용하여 세포 내 IFNγ 염색에 의해 IFNγ 생산을 측정하여 검사되었다. 흐름 세포측정(FACS)에 의해 분석이 실시되었다.

수지상 세포(DCs) 생성

사람 DCs는 건강한 기증자에게서 새로 채취한 혈액의 PBMCs에서 준비되었다. PBMCs는 Ficoll 밀도차(림프구 분리 배지, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria)를 사용하여 분리되었다. 확보된 세포는 세척되어, 50 U/ml 페니실린과 50 μg/ml 스트렙토마이신 및 2mM L 글루타민(BioWhittaker, Verviers, Belgium)으로 보조된 생체 밖 15 배양에서 재현탁되었고, 7 × 10⁶ 세포/ml의 밀도로 평판 배양되었다. 37℃에서 2 시간 후, 유착 단핵구는 100 ng/ml GM-CSF 및 40 ng/ml IL-4 (AL-ImmunoTools, Friesoythe, Germany)으로 생체 밖 배지에서 6일간 배양되었다. 7일 째에 DCs는 3일 동안 10 ng/ml TNF-α (R&D Systems, Wiesbaden, Germany)와 20 μg/ml poly(IC) (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany)로 활성화되었다. DCs의 분화 상태는 현저하게 CD14 , CD40 양성, CD80 양성, CD83 양성, CD86 양성 및 HLA-DR+(자료 없음)인 성숙 DC인 흐름 세포측정(flow cytometry)로 검사되었다.

CD4 양성 T 세포 특이적 항원 생성

CD4 양성 T 세포를 생성하기 위해 PBMCs는 2 × 10⁵ 자가 DCs로 10⁶ 자극되었다. 시동 후 6-8일마다 냉동보존된 자가 PBMCs로 재자극이 실시되었다. 자극을 위해서는 37℃에서 90 시간 동안 5 μg/ml 펩티드로 펄스되어 방사선 조사되었다(60 Gy; Gammacell 1000 Elite, Nordion International Inc, Ontario, Canada). 세포는 T 세포 배지로 96개의 수조 판(기증자와 펩티드 당 7개 수조)에서 다음과 같이 배양되었다:

HEPES와 L-글루타민(Gibco, Paisley, UK)을 함유하는 RPMI 1640은 10 ng/ml IL 12 (Promocell, Heidelberg, Germany)가 있는 가운데 10% 열 활성 사람 혈청(PAA, Colbe, Germany) 및 50 U/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신, 20 μg/ml 젠타마이신(gentamycin) (BioWhittaker)로 보충되었다. 3-4일 동안 37℃에서 공동 배양한 후, 80 U/ml IL-2 (Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA)와 5 ng/ml IL-7 (Promocell)로 새 배지가 추가되었다. 세포 내 IFNγ 염색으로 세번째와 네번째 자극 후에 분석이 실시되었다.

세포 내 IFNγ 염색

냉동 보존되었던 PBMCs는 해동되어, 생체 밖 15 배지에서 2회 세척하고, T 세포 배지 내 10⁷ cells/ml에서 재현탁 처리한 후, 불특정 IFNγ 생산을 감소시키기 위해 하룻밤 배양되었다(Provenzano 2002). 다음 날, PBMCs는 2 시간 동안 5 μg/ml 펩티드로 펄스되고, 생체 밖 15 배지로 3회 세척한 후 6시간 동안 1:1 비율로 효과기 세포로 배양되었다. 최종 4시간 동안의 배양을 위해 Golgi-Stop (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)이 추가 되었다. Cytofix/Cytoperm Plus kit (Becton Dickinson)와 CD4-FITC-(Immunotools), IFNγ-PE- 및 CD8-PerCP 복제 SK1 항체(Becton Dickinson)를 사용하여 세포를 분석하였다. 염색 후에 3색 FACSCalibur (Becton Dickinson)에서 세포가 분석되었다.

CD4 양성 T 세포에 특이성을 갖는 항원을 생성하고 불규칙한 결합에서 펩티드를 검사하기 위해서, 펩티드 펄스된 자가 DCs를 사용하여 각기 다른 HLA-DR 대립유전자로 4명의 건강한 기증자의 PBMCs를 자극하였다. CD4 양성 T 세포 IFNγ 생산에 특이성을 갖는 항원 생성을 위한 판독 시스템은 흐름 세포측정(flow cytometry)로 측정되었다. T 세포는 특정 T 세포 소집단에서 IFNγ 생산 세포의 비율을 판단하기 위해 세포 내 IFNγ 염색에 CD4-FITC와 CD8-PerCP 염색을 추가하여 세번째와 네번째 자극 후에 분석되었다. 모든 실험에서, 불규칙적 펩티드가 있을 때와 펩티드가 없을 때의 자극은 음성 조절로 실시되었다. IFNγ 반응은 IFNγ 생산 CD4 양성 T 세포 감지가 음성 조절과 비교하여 2 주름 이상 더 높았다면, 양성인 것으로 간주되었다(Horton 2004). 4명 중 3명의 기증자에서 관심 펩티드에 특히 반응하는 CD4 양성 T 세포를 생성할 수 있었다(도 7). 세번째나 네번째 자극 후 언제도 기증자 4에게서 T 세포 반응은 관찰될 수 없었다. 기증자 1과 2 각각에서 IMA-MMP-001 에 대해 특이성을 갖는 IFNγ 생산 CD4 양성 T 세포의 가장 높은 빈도가 보였다.

따라서 IMA-MMP-001는 각기 다른 HLA 대립유전자를 운반하는 4명의 건강한 기증자 중 3명에서 CD4 양성 T 세포 반응을 유발할 수 있는 불규칙한 결합체이다. 결합 예언과 획득한 결과에 따라, 펩티드는 HLA-DRB1*0101, HLA-DRB1*0401/*0408 및 HLA-DRB1*1101에 의해 나타나는 것이 거의 확실하다. 모든 네 개의 대립유전자는 위치 86에서 글리세린(Glycine) 잔기와 β 사슬의 위치 57에서 아스파르트산 잔기를 갖는다(자료 없음). 따라서 결합 포켓 P1과 P4에 대한 결합 특성을 공유하는 매우 유사한 결합 동기를 갖는다(Rammensee 1997; Hammer 1993; Marshall 1994). 기증자 4는 매우 다른 결합 동기를 가진 HLA-DRB1*0318 및 DRB1*1401 대립유전자를 운반한다. 이는 상기 언급된 펩티드를 사용하여 이 기증자에서 세포로 T 세포 반응을 유발할 수 없는 이유를 설명한다.

사람에서의 효과

길이에서 유사한 단기 펩티드와 본문에 설명된 펩티드에 아미노산 분포는 1996년 이후 다양한 1부터 3상에서 수천명의 환자들에게 면역되었다. 이 연구 중 어떤 것에도 심각한 사례는 보고되지 않았다. 추가적으로 IMA에 함유된 펩티드 IMA-MUC-001는 독일 Tubingen 대학에서 조사자가 착수한 시험에서 자가 세포에 장착되는 접종에 이미 사용되어 왔고 내성에 매우 강했다(Wierecky 2005). 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로 30명 중 10주 간에 걸친 전체 접종 코스를 완료한 환자들 중 26명을 대상으로 검사하였다. 높은 환자 비율인 74%가 백신을 포함한 펩티드 서열에 대해 특정 면역 반응을 보였다. 이 작은 I 단계 코호트에서 이미 MHC I형(대립유전자 HLA-A*02)에 결합하는 9개의 펩티드(서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9)의 생체내 생물학적 기능은 하단에 기술된 대로 실시된, 증폭된 ELISPOT 및 사합체(tetramer) 염색 측정 결과에 따라 확인할 수 있었다. 필요했을 각기 다른 판독에 대한 서열번호 1 (IMA-MMP-001)로 펩티드는 환자 혈액으로부터 PBMC의 제한된 가능성에 기인하여 시험할 수 없었다.

특정 면역 매개변수(면역 관찰)

현재까지 면역 관찰은 다양한 치료 접종 연구에서 수천명의 환자들을 대상으로 한 일반 진료였다(Romero 2004). 기능적 및 특정 측정법을 포함하여 여러 가지 기타 면역 관찰 방법이 현재까지 보고되었다. 치료 백신 IMA의 면역 요소는 생체 내 특정 T 림프구를 유발하는 HLA 결합 펩티드이다. 이 활성화는 항원 접촉 시 시토킨 분비 능력을 포함하는 효과기 기능의 증식과 획득으로 유도할 것이다.

T 세포 활성화에 대한 대용 지표로써, 혈액에서 단핵 세포를 분비하는 특정 시토킨의 빈도는 ELISPOT 측정법을 사용하여 검사될 수 있다. 이런 측정법은 단일 세포에 기초하고 혈액 시료에서 항원 특정 T 림프구를 분비하는 시토킨의 진짜 빈도와 상관 관계에 있는 매개변수(즉, 단핵 세포들 중에서 세포를 형성하는 반점의 수)의 결과를 낳는다. 이렇게 하여, 평행의 시료와 펩티드의 비교적 큰 숫자를 처리할 수 있으므로, 현재까지 많은 수의 임상 연구에서 면역 관찰에 대해 이미 광범위하게 사용되었다(Schmittel 2000).

면역 반응

면역 활동/효과는 T 세포 반응 분석으로 설명될 수 있다. 각기 다른 적응증에 대한 면역 반응에 대해 각기 다른 임상 연구로부터 나온 경험과 결과는 문헌에서 찾을 수 있다. 100%까지의 T 세포 반응은 난소암과 유방암이 있는 환자를 대상으로 한 Disis 외., 1999에 기술되어 있다. Her2/neu 항원에 GM-CSF를 더하여 진행한 3-아암(arm) 연구에서 환자들(n = 64)의 84%에서 확산되는 항원결정인자는 난소암과 유방암, 소세포 폐암이 있는 환자들을 대상으로 한 2002년 Disis 외.에 의해 보고되었다. 기타 저자들은 흑색종이 있는 환자들 중 33%에서 83%사이의 T 세포 반응에 대한 결과를 발표하였다(Keilholz/Schadendorf, 2003; Slingluff 외., 2004). 본 연구에 사용된 항원에 대해 특이성을 갖는 여러 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포 복제의 면역 반응에 관한 2003년 Gaudernack/Gjertsen 보고서.

또한 결과들은 Wierecky 외., ASCO 2005에 의해 발표되었다: 수지상세포(DC)를 유발한 자가 성숙 단핵구는 MUC1 펩티드에서 추론된 두 개의 HLA-A2 결합 펩티드로 펄스되었다. CD4 양성 T 세포 DC를 모집하고 활성화하기 위해서 PAN-DR 결합 펩티드 PADRE 로 이후 배양되었다. 매주 마다 네번 피하주사(s.c.)로 접종이 실시되었고, 이 치료 접근에서 종양 진전이 있을 때까지 매월 반복되었다. 5번째 DC 투여 후에 환자들은 저용량 IL-2(1 Mio IE/m2)를 주당 3번 투여 받았다. IFN-γ ELISPOT과 ⁵¹Cr-방출 측정법을 사용하여 T 세포 전구물질 강화가 관찰되었다. 더욱이 백신 관련 항원결정인자(epitope)로 유발에 반응하여 시토킨을 생산하기 위해 PBMC의 능력은 실시간 정량 PCR로 검사되었다.

Wierecky 외.에서 한 이 연구에서 생체 내 MUC1 펩티드 특정 T 세포 반응은 OR이 있는 모든 환자들의 PBMC에서 감지되었다. T 세포를 생체 내에서 유도한 이들은 생체 내 재자극 후 항원과 HLA 제한 방식으로 MUC1을 구성적으로 발현하며 인지체 펩티드나 짝지은 동종 종양 세포(A498)로 펄스된 표적 세포를 인식할 수 있었다. 치료에 반응하는 환자들에게서 아디포필린, 텔로머레이즈(telomerase) 또는 OFA와 같은 접종에 사용되지 않는 항원에 대한 T 세포 반응은 발생할 지 모르는 항원결정인자(epitope) 환산을 보이며 감지될 수 있었다. PADRE 펩티드에 대한 증식 반응은 두번째 예방접중 후 이미 일부 환자들, 16명 중 11명의 환자들에서 감지될 수 있었다. 결론: 접종된 환자들에게서 항원결정인자(epitope) 확산에 대한 분석은 임상 및 면역 반응과 상관관계가 있는 유용한 매개변수일 수 있었다.

생체 내 면역 반응

임상 시험 제제

IMA 임상 시험 제제는 다음과 같이 구성된다:

- 3ml 바이알의 11 펩티드를 포함한 라이오필리세이트(Lyophilisate)

- 희석재(탄산수소나트륨 4.2%)

IMA 투여량 형식

3 ml 유리병 바이알 내 투여용 파우더. 포장 정보: 박스 당 4개 바이알 포장. 희석제는 250 ml 병으로 포장된 700 μl 탄산수소나트륨으로 구성된다. IMA의 1 바이알은 4.2% 탄산수소 나트륨(희석제) 700 μl를 추가하여 재구성된다. IMA를 용해하기 위해 바이알과 희석제는 3분간 세게 흔든 후 1분간 초음프로 처리된다. 그 후에 1분간 다시 바이알을 흔든다. 이 용액 500 μl는 재구성 후 30분 내에 투여된다.

이 연구에서 진행 신장 암종이 있는 환자들은 10주간에 걸쳐 8번의 접종을 받았다. 모두 24명의 HLA-A*02 양성 HLA 타입 환자들이 등록하였다. 1, 2, 3, 8, 15, 22, 36, 64일 째에 피부 내 접종(GM-CSF + IMA)을 하였다. 본 시험 기간 동안 각기 다른 시점에서 채취된 혈액 시료와 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs) 내에 함유된 T 세포는 밀도차 원심분리에 의한 헤파린 혈액에서 분리되고, 혈구계를 사용하여 계산되어, 측정 전까지 냉동 온도에서 보관을 위해 보존되었다. 그 후 두 가지 다른 일반 ELISPO 측정법과 한가지 일반 사합체(tetramer) 측정법이 지원자에 의해 실시되었다.

증폭 ELISPOT 측정법

"생체 밖 ELISPOT" 측정에서 세포는 각기 다른 시점에서 융해되고, 살아있는 세포 수는 계산되고, 시료들은 다른 펩티드로 하루동안 배양되거나 세겹의 수조에서 조절되어 측정된다. 생체 밖 ELISPOT 측정법은 하단의 다른 측정법들과 비교하여 훨씬 신속한 방식으로 정량 자료를 전달한다. 추가적으로 이는 IMA 함유된 하나의 HLA II형 펩티드(IMA-MMP-001) 측정을 가능하게 하는 유일한 측정법이다. 그러나 이 측정법은 바이러스에 대한 기억(회상) 면역 반응과 비교 가능한 매우 강력한 T 세포 반응에서만 제한적 민감도와 양성 자료가 있을 것으로 예상되었다.

"증폭 ELISPOT" 측정에서 특정 세포가 분리될 수 있도록 각기 다른 시점에서 세포들은 울혈되고, 계산되어 대략 2주 동안 항원으로 사전 자극된다. 그 후 세포는 배지에서 채취되어 재계산된 후 항원으로 하루 동안 재자극 시 IFN-γ 반점 생산에 대해 상기와 같이 측정된다. 그런 조건 하에 활성화된 세포들은 효소 연결 샌드위치 항체 방법으로 감지되는 IFN-γ를 분비한다. 반점들은 색상 형성 반응으로 시각화되고 높은 해상의 자동 디지털 카메라(여기서는 "ELISPOT 리더")로 계산된다. 시료에서 활성 항원 특정 T 림프구의 진짜 빈도와 상관관계가 있는 반점의 수는 ELISPOT 리더에서 획득한 이미지로부터 소프트웨어 알고리즘에 의해 결정된다. 이 측정법은 다양한 제 3자의 임상 시험에서 접종된 종양 항원에 T 세포 반응을 감지하는데 주로 사용되었다. T 세포의 "생체 밖 시동"에 기인한 가양한 자료의 가능성은 이 측정에서 다양한 조절을 사용하여 제외된다. 하단의 사합체(tetramer) 측정법과 비교하여 이 측정법은 추가적으로 기능적 정보, 즉 IFN-γ 시토킨 방출을 제공한다.

증폭된 ELISPOT 측정법은 본 연구와 각기 다른 시점에서의 접종 프로토콜 기간 동안과 전의 IMA에 있는 모든 항원에서 28명의 환자들에 대해 실시되었다. 도 10은 동일한 환자와 항원에 대한 증폭된 ELISPOT 측정법으로 확인된 IMA 유발 T 세포 반응의 대표적 예를 보여준다. 상하 열은 판독에 사용되는 음성 조절 항원 HIV-001과 단일 TUMAP IMA-CCN-001 각각을 의미한다. 양성 세포 소는 각 실험에 대해 주어진다. 오른 쪽 열이 접종 프로토콜 동안 채취된 울혈 시료의 ELISPOTs를 보이는 반면, 왼쪽 열은 접종 전에 채취된 울혈 시료의 ELISPOTs을 보여준다. 조절 항원이 면역 반응 유도 후에 반점 수의 상승으로 이어지지 않은 반면, IMA 투여는 IMA-CCN-001에 대한 반점 수 증식으로 이어졌다. 양성 수, 즉 IFN-γ 분비 세포 수는 네번째와 다선번째 투여 후 100-141에 접종하기 전 27-34에서 상승하였다. IMA로 치료함으로써 이 환자의 IMA-CCN-001 항원에 대해 특이성을 갖는 활성 T 림프구 빈도를 상승시키는 결과를 가져왔다.

증폭 사합체(tetramer) 측정법

"증폭 ELISPOT" 측정에서 항원 특정 T 세포가 분리될 수 있도록 각기 다른 시점에서 세포들은 해동되고, 계산되어 대략 2주동안 항원으로 사전 자극된다. 그 후 세포는 배지에서 채취되어 재계산된 후 CD8+ T 세포(염색 및 시점 당 하나의 수조)를 규명하기 위해 MHC 다합체에 항체를 더하여 라벨링된 PE- 및 APC-플루오로크롬(fluorochrome)으로 염색된다. MHC 다합체는 형광 염색에 다성화되고 결합되는 재조합 펩티드 MHC 복합체이다. 여기에서 간단히 사합체(Tetramer)라고 불리는 영역(Altmann 1996)에 원래 소개된 것과 모두 동등한 사합체된 HLA-A*0201 다합체만이 사용되었다. 염색되어 고정된 시료들은 본 기술에서 잘 알려진 표준 절차를 사용하여 흐름 세포측정(flow cytometer)에서 분석되었고, 각 시료에 대해 데이터세트에 기반한 단일 세포의 결과를 가져왔다. 이 "증폭 사합체(Tetramer)" 측정법은 매우 높은 민감도를 가졌으나 생체 밖 측정법과 비교하여 낮은 정량을 보인다.

사합체(tetramer) 자료의 일차적 분석을 위해, 전체적으로 평가된 시료 당 CD8+ T 세포와 단일 사합체(tetramer) 양성 및 이중 사합체(tetramer) 양성 세포의 수는 상업적 소프트웨어를 사용하여 세포측정(cytometry) 리스트 모드 파일에서 전자적으로 계산되었다. CD8+ T 세포는 살아있는 림프구에서 앞과 옆의 산란 동기와 항체 형광을 기초로한 CD8+ CD3+ 사례에서 보조 동기(subgating)에 의해 확인되었다. 림프구 관문과 CD3/CD8 동기에 대한 정의는 측정법 내에서 한 환자의 모든 염색에 대해 동일하였다. 사합체(tetramer) 양성 환자군은 사분의 일로 이중 사합체 도트 도 분석 또는 관문에 의해 CD8+ T 세포에서 확인되었다. 사합체+(tetramer+) 세포에 대한 정의는 측정법에서 주어진 환자와 인식 가능한 세포 환자군에 기초하여 각 염색 조건에 대해 동일하였다. 증폭 사합체(tetramer) 측정법은 각기 다른 시점에서 접종 프로토콜 기간 동안과 전, IMA에 있는 모든 항원과 시험에서 28명의 환자들에게 실시되었다.

도 11은 증폭 사합체(tetramer) 염색 측정법으로 확인된 IMA 유도 T 세포 반응의 대표적인 두 가지 예를 보여준다. 상위와 중간의 패널은 CD3+ 림프구에서 동기된 2차원 도트 그림을 나타내며, 하위 패널은 CD3+ CD8+ 림프구에서 동기된다. 환자들과 시점, 염색은 지시된 대로 각 열에 대한 것이었다. 도 11에서 ELISPOT 측정(도 10)에서 이미 나왔던 환자 03-004에서 IMA-CCN-001에 대한 면역 반응은 사합체(tetramer) 측정으로 확인되었다. K67-001 사합체(상위 패널)에 대해 양성 환자군이 나타나지 않은 반면, CD3+와 IMA-CCN-001 사합체(tetramer)에 양성인 세포 환자군은 네번째와 다섯번째 IMA(V6+V7; 중간 패널) 투여 후에 확인되었다. IMA-CCN-001 양성 세포는 접종 전 0.03%에서 처음 세번의 투여 후 림프구의 0.78%(V6+V7; 하위 패널)로 상승하였다.

환자 03-003은 RGS-001 펩티드에 대해 면역 반응을 보이지 않았으나(도 11B: 상위 패널), 접종 프로토콜 기간 동안 IMA-CCN-001 사합체(tetramer) 양성 반응이 진행되었다(S1+V1: 접종 전에 채취한 시료; V4+V5: 8일째와 15일째 채취된 시료; V6+V7: 22일째와 36일째에 채취된 시료; V8+FU: 64일째(마지막 접종)와 85일에서 92일째 후에 채취된 시료; 시험 종료). 중간 패널에서 3열과 4열은 CNN 001과 CD3+에 대한 양성을 보이는 명백한 세포 환자군을 보인다. 접종 기간 동안 이들 세포 양은 접종 전 0.02%에서 처음 세번의 투여 후 0.8% 림프구(아래 패널; 3열)로 상승하였고, 64일째 후에 0.31%로 하락하였다(아래 패널; 4열; V8+FU).

선별된 환자들의 경우, 단일 시점에 대해 증폭 사합체(tetramer) 측정이 실시되었다. 즉, 도 2에서 묘사된 예제인 T 세포 동력학의 보다 정확한 평가를 가능하게 하며, 혈액 시료는 울혈되지 않았다. 단일 시점에 증폭된 사합체(tetramer) 측정법에서 관찰된 T 세포 크기 동력학은 환자 05-001에 대해 보여진다. IMA(TUMAP 울혈)에 있는 종양 관련 항원은 22일(V6)째에 이전에 정점이었던 IMA-CCN-001 펩티드에 반응하는 한편, 22, 36, 64(V6, V7, V8)에서 가장 높았다. HBV-001 양성 조절은 15일(V5)째에 최고조에 도달한 보다 신속한 반응의 결과를 가져왔다.

IMA-CCN-001에 매우 높게 반응하는 두 환자는 비 증폭 실험에서 증폭 사합체(tetramer)의 결과를 확인하기 위해 선택되었다. 이들 생체 밖 사합체(tetramer) 측정은 2주 동안 세포 배양없이 실시되었다.

결과들은 아래 표 9에 요약되어 있다. 백신 유도 반응이 증폭 측정에서 감지된 생체 밖 사합체(tetramer) 및 환자/항원 균형 증폭 사합체(tetramer) 측정에서 얻은 모든 가치있는 결과들이 나와 있다. "생체 밖" 방법의 경우, 전체 CD8+ T 세포 중 사합체+(Tetramer+)의 비율이 나타나 있다. "증폭, 일반" 평가 방법의 경우, CD8+ T 림프구의 소집단은 분석되고, 총 CD8+ T 림프구를 기초로한 산출과 함께 일반 자료의 두번째 재평가 나와 있다("증폭, 정량"). 분리된 사합체+(tetramer+) 환자군이 생체 밖과 증폭 사합체(tetramer) 측정에서 나타나면, "증폭 인자"를 산출하였다.

결과들에서 증폭 사합체(tetramer) 측정과 측정된 면역 반응은 2주간의 배양 기간동안 세포 확장에 기인하지는 않으나 이전에 환자 혈액에 있던 "생체 밖" 림프구에 기초한다는 것을 분명히 증명하고 있다.

*: 별개 사합체(tetramer)+ 환자군 감지됨

#: 별도 측정법은 TUMAP Pool 반응이 rCCN-001에 단독적으로 기여할 수 있다는 분명한 근거를 보였다.

전체 환자 반응

상기에 기술된 측정법으로 측정된 T 세포 반응은, 본 연구의 각기 다른 시점에서 28명의 환자의 IMA에 함유된 모든 펩티드에 대해 평가되었다. 접종 시점 후에 채취한 혈액 시료 중에 하나라도 사합체 양성 림프구나 펩티드 중 하나와 자극 시 분리된 IFN-를 포함할 경우, 환자는 "반응", 다시 말해 백신이 면역 반응을 유발한 것을 나타났다.

예상한 대로 환자들은 IMA에 함유된 각기 다른 펩티드에 개별적으로 반응했다. 소수의 환자를 참작한다면, 대다수의 환자들(27명의 평가 가능한 환자들 중 23명)은 펩티드 중 적어도 하나에 면역 반응이 생겼으므로 놀랍게도 좋은 반응을 얻었다. 27명의 평가 가능한 환자들 중 8명(30%)은 심지어 여러 TUMAPs에 대해 T 세포 반응을 보였다.

참고 문헌

Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, and Davis MM. Phenotypic analysis of antigen specific T lymphocytes. Science 274:94-96 (1996).

Apostolopoulos V and McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994).

Bamias A, Chorti M, Deliveliotis C, Trakas N, Skolarikos A, Protogerou B, Legaki S, Tsakalou G, Tamvakis N, and Dimopoulos MA. Prognostic significance of CA 125, CD44, and epithelial membrane antigen in renal cell carcinoma. Urology 62:368-373 (2003).

Barnd DL, Lan MS, Metzgar RS, and Finn OJ. Specific, Major Histocompatibility Complex Unrestricted Recognition of Tumor Associated Mucins by Human Cytotoxic T cells. PNAS 86:7159-7163 (1989).

Bates S, Bonetta L, MacAllan D, Parry D, Holder A, Dickson C, and Peters G. CDK6 (PLSTIRE) and CDK4 (PSK-J3) are a distinct subset of the cyclin-dependent kinases that associate with cyclin D1. Oncogene 9:71-79 (1994).

Beilmann M, Vande Woude GF, Dienes HP, and Schirmacher P. Hepatocyte growth factor stimulated invasiveness of monocytes. Blood 95:3964-3969 (2000).

Berger M, Bergers G, Arnold B, Hammerling GJ, and Ganss R. Regulator of G protein signaling 5 induction in pericytes coincides with active vessel remodeling during neovascularization. Blood 105:1094-1101 (2005).

Bertoletti A, Chisari FV, Penna A, Guilhot S, Galati L, Missale G, Fowler P, Schlicht HJ, Vitiello A, Chesnut RC, and . Definition of a minimal optimal cytotoxic T cell epitope within the hepatitis B virus nucleocapsid protein. J Virol. 67:2376-2380 (1993).

Bladt F, Riethmacher D, Isenmann S, Aguzzi A, and Birchmeier C. Essential role for the c-met receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud. Nature 376:768-771 (1995).

Borset M, Seidel C, Hjorth-Hansen H, Waage A, and Sundan A. The role of hepatocyte growth factor and its receptor c-Met in multiple myeloma and other blood malignancies. Leuk. Lymphoma 32:249-256 (1999).

Bottaro DP, Rubin JS, Faletto DL, Chan AM, Kmiecik TE, Vande Woude GF, and Aaronson SA. Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. Science 251:802-804 (1991).

Bramhall SR, Neoptolemos JP, Stamp GW, and Lemoine NR. Imbalance of expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of the matrix metalloproteinases (TIMPs) in human pancreatic carcinoma. J Pathol. 182:347-355 (1997).

Brossart P, Heinrich KS, Stuhler G, Behnke L, Reichardt VL, Stevanovic S, Muhm A, Rammensee HG, Kanz L, and Brugger W. Identification of HLA-A2 restricted T cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies. Blood 93:4309-4317 (1999).

Brossart P, Schneider A, Dill P, Schammann T, Grunebach F, Wirths S, Kanz L, Buhring HJ, and Brugger W. The epithelial tumor antigen MUC1 is expressed in hematological malignancies and is recognized by MUC1 specific cytotoxic T lymphocytes. Cancer Res. 61:6846-6850 (2001).

Brossart P, Wirths S, Stuhler G, Reichardt VL, Kanz L, and Brugger W. Induction of cytotoxic T lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells. Blood 96:3102-3108 (2000).

Browner MF, Smith WW, and Castelhano AL. Matrilysin-inhibitor complexes: common themes among metalloproteases. Biochemistry 34:6602-6610 (1995).

Cao Y, Karsten U, Zerban H, and Bannasch P. Expression of MUC1, Thomsen Friedenreich-related antigens, and cytokeratin 19 in human renal cell carcinomas and tubular clear cell lesions. Virchows Arch. 436:119-126 (2000).

Chen X, Higgins J, Cheung ST, Li R, Mason V, Montgomery K, Fan ST, van de RM, and So S. Novel endothelial cell markers in hepatocellular carcinoma. Mod. Pathol. 17:1198-1210 (2004).

De VL, Zheng B, Fischer T, Elenko E, and Farquhar MG. The regulator of G protein signaling family. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40:235-271 (2000).

Delsol G, Al ST, Gatter KC, Gerdes J, Schwarting R, Caveriviere P, Rigal Huguet F, Robert A, Stein H, and Mason DY. Coexpression of epithelial membrane antigen (EMA), Ki-1, and interleukin-2 receptor by anaplastic large cell lymphomas. Diagnostic value in so called malignant histiocytosis. Am. J. Pathol. 130:59-70 (1988).

Denys H, De Wever O, Nusgens B, Kong Y, Sciot R, Le AT, Van Dam K, Jadidizadeh A, Tejpar S, Mareel M, Alman B, and Cassiman JJ. Invasion and MMP expression profile in desmoid tumours. Br. J Cancer 90:1443 1449 (2004).

Deshpande A, Sicinski P, and Hinds PW. Cyclins and cdks in development and cancer: a perspective. Oncogene 24:2909-2915 (2005).

Di Renzo MF, Olivero M, Giacomini A, Porte H, Chastre E, Mirossay L, Nordlinger B, Bretti S, Bottardi S, Giordano S, and Overexpression and amplification of the met/HGF receptor gene during the progression of colorectal cancer. Clin. Cancer Res. 1:147-154 (1995).

Dittmann J, Keller Matschke K, Weinschenk T, Kratt T, Heck T, Becker HD, Stevanovic S, Rammensee HG, and Gouttefangeas C. CD8(+) T cell response against MUC1 derived peptides in gastrointestinal cancer survivors. Cancer Immunol Immunother. (2004).

Dong G, Chen Z, Li ZY, Yeh NT, Bancroft CC, and Van WC. Hepatocyte growth factor/scatter factor induced activation of MEK and PI3K signal pathways contributes to expression of proangiogenic cytokines interleukin-8 and vascular endothelial growth factor in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res. 61:5911-5918 (2001).

Duchateau PN, Pullinger CR, Cho MH, Eng C, and Kane JP. Apolipoprotein L gene family: tissue specific expression, splicing, promoter regions; discovery of a new gene. J. Lipid Res. 42:620-630 (2001).

Duchateau PN, Pullinger CR, Orellana RE, Kunitake ST, Naya Vigne J, O'Connor PM, Malloy MJ, and Kane JP. Apolipoprotein L, a new human high density lipoprotein apolipoprotein expressed by the pancreas. Identification, cloning, characterization, and plasma distribution of apolipoprotein L. J. Biol. Chem. 272:25576-25582 (1997).

Duperray C, Klein B, Durie BG, Zhang X, Jourdan M, Poncelet P, Favier F, Vincent C, Brochier J, Lenoir G, and . Phenotypic analysis of human myeloma cell lines. Blood 73:566-572 (1989).

Falk K, Rotzschke O, Stevanovic S, Jung G, and Rammensee HG. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self peptides eluted from MHC molecules. Nature 351:290-296 (1991).

Ferracini R, Di Renzo MF, Scotlandi K, Baldini N, Olivero M, Lollini P, Cremona O, Campanacci M, and Comoglio PM. The Met/HGF receptor is over expressed in human osteosarcomas and is activated by either a paracrine or an autocrine circuit. Oncogene 10:739-749 (1995).

Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, and Barratt Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995).

Fischer J, Palmedo G, von KR, Bugert P, Prayer Galetti T, Pagano F, and Kovacs G. Duplication and overexpression of the mutant allele of the MET proto-oncogene in multiple hereditary papillary renal cell tumours. Oncogene 17:733-739 (1998).

Fujita K, Denda K, Yamamoto M, Matsumoto T, Fujime M, and Irimura T. Expression of MUC1 mucins inversely correlated with post surgical survival of renal cell carcinoma patients. Br. J. Cancer 80:301-308 (1999).

Furge KA, Zhang YW, and Vande Woude GF. Met receptor tyrosine kinase: enhanced signaling through adapter proteins. Oncogene 19:5582-5589 (2000).

Furge KA, Kiewlich D, Le P, Vo MN, Faure M, Howlett AR, Lipson KE, Woude GFV, and Webb CP. Suppression of Ras-mediated tumorigenicity and metastasis through inhibition of the Met receptor tyrosine kinase. PNAS 98:10722-10727 (2001).

Furuya M, Nishiyama M, Kimura S, Suyama T, Naya Y, Ito H, Nikaido T, and Ishikura H. Expression of regulator of G protein signalling protein 5 (RGS5) in the tumour vasculature of human renal cell carcinoma. J. Pathol. 203:551-558 (2004).

Gaire M, Magbanua Z, McDonnell S, McNeil L, Lovett DH, and Matrisian LM. Structure and expression of the human gene for the matrix metalloproteinase matrilysin. J Biol. Chem. 269:2032-2040 (1994).

Gendler S, Taylor Papadimitriou J, Duhig T, Rothbard J, and Burchell J. A highly immunogenic region of a human polymorphic epithelial mucin expressed by carcinomas is made up of tandem repeats. J. Biol. Chem. 263:12820-12823 (1988).

Gherardi E and Stoker M. Hepatocyte growth factor scatter factor: mitogen, motogen, and met. Cancer Cells 3:227-232 (1991).

Girling A, Bartkova J, Burchell J, Gendler S, Gillett C, and Taylor Papadimitriou J. A core protein epitope of the polymorphic epithelial mucin detected by the monoclonal antibody SM-3 is selectively exposed in a range of primary carcinomas. Int. J. Cancer 43:1072-1076 (1989).

Gursky S, Olopade OI, and Rowley JD. Identification of a 1.2 Kb cDNA fragment from a region on 9p21 commonly deleted in multiple tumor types. Cancer Genet. Cytogenet. 129:93-101 (2001).

Halaban R. Melanoma cell autonomous growth: the Rb/E2F pathway. Cancer Metastasis Rev. 18:333-343 (1999).

Hammer J, Valsasnini P, Tolba K, Bolin D, Higelin J, Takacs B, and Sinigaglia F. Promiscuous and allele-specific anchors in HLA-DR-binding peptides. Cell 74:197-203 (1993).

Hedberg Y, Davoodi E, Roos G, Ljungberg B, and Landberg G. Cyclin-D1 expression in human renal cell carcinoma. Int. J. Cancer 84:268-272 (1999).

Heid HW, Moll R, Schwetlick I, Rackwitz HR, and Keenan TW. Adipophilin is a specific marker of lipid accumulation in diverse cell types and diseases. Cell Tissue Res. 294:309-321 (1998).

Horton H, Russell N, Moore E, Frank I, Baydo R, Havenar Daughton C, Lee D, Deers M, Hudgens M, Weinhold K, and McElrath MJ. Correlation between interferon-gamma secretion and cytotoxicity, in virus specific memory T cells. J. Infect. Dis. 190:1692-1696 (2004).

Jadeski LC, Chakraborty C, and Lala PK. Nitric oxide mediated promotion of mammary tumour cell migration requires sequential activation of nitric oxide synthase, guanylate cyclase and mitogen-activated protein kinase. Int. J. Cancer 106:496-504 (2003).

Jager, E., Y. Nagata, S. Gnjatic, H. Wada, E. Stockert, J. Karbach, P. R. Dunbar, S. Y. Lee, A. Jungbluth, D. Jager, M. Arand, G. Ritter, V. Cerundolo, B. Dupont, Y. T. Chen, L. J. Old, and A. Knuth. Monitoring CD8 T cell responses to NY ESO-1: correlation of humoral and cellular immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97:4760 (2000).

Jucker M, Gunther A, Gradl G, Fonatsch C, Krueger G, Diehl V, and Tesch H. The Met/hepatocyte growth factor receptor (HGFR) gene is overexpressed in some cases of human leukemia and lymphoma. Leuk. Res. 18:7-16 (1994).

Jung G, Ledbetter JA, and Muller Eberhard HJ. Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 84:4611-4615 (1987).

Kawakami Y, Eliyahu S, Sakaguchi K, Robbins PF, Rivoltini L, Yannelli JR, Appella E, and Rosenberg SA. Identification of the immunodominant peptides of the MART 1 human melanoma antigen recognized by the majority of HLA-A2 restricted tumor infiltrating lymphocytes. J Exp. Med. 180:347-352 (1994).

Koochekpour S, Jeffers M, Rulong S, Taylor G, Klineberg E, Hudson EA, Resau JH, and Vande Woude GF. Met and hepatocyte growth factor/scatter factor expression in human gliomas. Cancer Res. 57:5391-5398 (1997).

Kraus S, Abel PD, Nachtmann C, Linsenmann HJ, Weidner W, Stamp GW, Chaudhary KS, Mitchell SE, Franke FE, and Lalani e. MUC1 mucin and trefoil factor 1 protein expression in renal cell carcinoma: correlation with prognosis. Hum. Pathol. 33:60-67 (2002).

Kurokawa Y, Matoba R, Nakamori S, Takemasa I, Nagano H, Dono K, Umeshita K, Sakon M, Monden M, and Kato K. PCR-array gene expression profiling of hepatocellular carcinoma. J. Exp. Clin. Cancer Res. 23:135-141 (2004).

Lemmel C, Weik S, Eberle U, Dengjel J, Kratt T, Becker HD, Rammensee HG, and Stevanovic S. Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stable isotope labeling. Nat. Biotechnol. 22:450-454 (2004).

Leroy X, Copin MC, Devisme L, Buisine MP, Aubert JP, Gosselin B, and Porchet N. Expression of human mucin genes in normal kidney and renal cell carcinoma. Histopathology 40:450-457 (2002).

Lew DJ, Dulic V, and Reed SI. Isolation of three novel human cyclins by rescue of G1 cyclin (Cln) function in yeast. Cell 66:1197-1206 (1991).

Li G, Schaider H, Satyamoorthy K, Hanakawa Y, Hashimoto K, and Herlyn M. Downregulation of E cadherin and Desmoglein 1 by autocrine hepatocyte growth factor during melanoma development. Oncogene 20:8125-8135 (2001).

Lin TS, Chiou SH, Wang LS, Huang HH, Chiang SF, Shih AY, Chen YL, Chen CY, Hsu CP, Hsu NY, Chou MC, Kuo SJ, and Chow KC. Expression spectra of matrix metalloproteinases in metastatic non small cell lung cancer. Oncol Rep. 12:717-723 (2004).

Livingston BD, Crimi C, Grey H, Ishioka G, Chisari FV, Fikes J, Grey H, Chesnut RW, and Sette A. The hepatitis B virus specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection. J Immunol. 159:1383-1392 (1997).

Loden M, Stighall M, Nielsen NH, Roos G, Emdin SO, Ostlund H, and Landberg G. The cyclin D1 high and cyclin E high subgroups of breast cancer: separate pathways in tumorogenesis based on pattern of genetic aberrations and inactivation of the pRb node. Oncogene 21:4680-4690 (2002).

Louhelainen J, Wijkstrom H, and Hemminki K. Initiation development modelling of allelic losses on chromosome 9 in multifocal bladder cancer. Eur. J. Cancer 36:1441-1451 (2000).

Mark AS and Mangkornkanok M. B cell lymphoma marking only with anti epithelial membrane antigen. Cancer 63:2152-2155 (1989).

Marshall KW, Liu AF, Canales J, Perahia B, Jorgensen B, Gantzos RD, Aguilar B, Devaux B, and Rothbard JB. Role of the polymorphic residues in HLA-DR molecules in allele-specific binding of peptide ligands. J. Immunol. 152:4946-4957 (1994).

Maulik G, Kijima T, Ma PC, Ghosh SK, Lin J, Shapiro GI, Schaefer E, Tibaldi E, Johnson BE, and Salgia R. Modulation of the c-Met/hepatocyte growth factor pathway in small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 8:620-627 (2002).

Miyazaki K, Hattori Y, Umenishi F, Yasumitsu H, and Umeda M. Purification and characterization of extracellular matrix degrading metalloproteinase, matrin (pump 1), secreted from human rectal carcinoma cell line. Cancer Res. 50:7758-7764 (1990).

Mizuno K, Higuchi O, Ihle JN, and Nakamura T. Hepatocyte growth factor stimulates growth of hematopoietic progenitor cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 194:178-186 (1993).

Monajemi H, Fontijn RD, Pannekoek H, and Horrevoets AJ. The apolipoprotein L gene cluster has emerged recently in evolution and is expressed in human vascular tissue. Genomics 79:539-546 (2002).

Montesano R, Soriano JV, Malinda KM, Ponce ML, Bafico A, Kleinman HK, Bottaro DP, and Aaronson SA. Differential effects of hepatocyte growth factor isoforms on epithelial and endothelial tubulogenesis. Cell Growth Differ. 9:355-365 (1998).

Mori M, Beatty PG, Graves M, Boucher KM, and Milford EL. HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation 64:1017-1027 (1997).

Mott JD and Werb Z. Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. Curr. Opin. Cell Biol. 16:558-564 (2004).

Mueller MRWJ, Brugger W, Gouttefangeas.C., Kanz L, and Brossart P. Vaccinations with peptide pulsed dendritic cells induces clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma. Proc Am Soc Clin Oncol 22, 168. 1-6-2003.

Ref Type: Abstract

Naldini L, Vigna E, Narsimhan RP, Gaudino G, Zarnegar R, Michalopoulos GK, and Comoglio PM. Hepatocyte growth factor (HGF) stimulates the tyrosine kinase activity of the receptor encoded by the proto oncogene c-MET. Oncogene 6:501-504 (1991).

Neumann F, Wagner C, Stevanovic S, Kubuschok B, Schormann C, Mischo A, Ertan K, Schmidt W, and Pfreundschuh M. Identification of an HLA-DR-restricted peptide epitope with a promiscuous binding pattern derived from the cancer testis antigen HOM-MEL-40/SSX2. Int. J. Cancer 112:661-668 (2004).

Noto H, Takahashi T, Makiguchi Y, Hayashi T, Hinoda Y, and Imai K. Cytotoxic T lymphocytes derived from bone marrow mononuclear cells of multiple myeloma patients recognize an underglycosylated form of MUC1 mucin. Int. Immunol. 9:791-798 (1997).

Ohara O, Nagase T, Ishikawa K, Nakajima D, Ohira M, Seki N, and Nomura N. Construction and characterization of human brain cDNA libraries suitable for analysis of cDNA clones encoding relatively large proteins. DNA Res. 4:53-59 (1997).

Pachter JS, de Vries HE, and Fabry Z. The blood brain barrier and its role in immune privilege in the central nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62:593-604 (2003).

Pass, H. A., S. L. Schwarz, J. R. Wunderlich, and S. A. Rosenberg. Immunization of patients with melanoma peptide vaccines: immunologic assessment using the ELISPOT assay. Cancer J. Sci. Am. 4:316 (1998).

Pons E, Uphoff CC, and Drexler HG. Expression of hepatocyte growth factor and its receptor c-met in human leukemia lymphoma cell lines. Leuk. Res. 22:797-804 (1998).

Ponzetto C, Bardelli A, Maina F, Longati P, Panayotou G, Dhand R, Waterfield MD, and Comoglio PM. A novel recognition motif for phosphatidylinositol 3-kinase binding mediates its association with the hepatocyte growth factor/scatter factor receptor. Mol. Cell Biol. 13:4600-4608 (1993).

Previsani N and Lavanchy D. Hepatitis B. World Health Organization Department of Communicable Diseases Surveillance and Response. 2002 WHO/CDS/CSR/LYO/2002. 2:Hepatitis B. (2002).

Qian CN, Guo X, Cao B, Kort EJ, Lee CC, Chen J, Wang LM, Mai WY, Min HQ, Hong MH, Vande Woude GF, Resau JH, and Teh BT. Met protein expression level correlates with survival in patients with late stage nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res. 62:589-596 (2002).

Quantin B, Murphy G, and Breathnach R. Pump 1 cDNA codes for a protein with characteristics similar to those of classical collagenase family members. Biochemistry 28:5327-5334 (1989).

Rae FK, Stephenson SA, Nicol DL, and Clements JA. Novel association of a diverse range of genes with renal cell carcinoma as identified by differential display. Int. J. Cancer 88:726-732 (2000).

Ramirez R, Hsu D, Patel A, Fenton C, Dinauer C, Tuttle RM, and Francis GL. Over expression of hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) and the HGF/SF receptor (cMET) are associated with a high risk of metastasis and recurrence for children and young adults with papillary thyroid carcinoma. Clin Endocrinol. (Oxf) 53:635-644 (2000).

Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, and Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50:213-219 (1999).

Rammensee,H.G., Bachmann,J., and Stevanovic,S. (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer Verlag, Heidelberg, Germany).

Rehermann B and Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection. Nat. Rev. Immunol. 5:215-229 (2005).

Rentzsch C, Kayser S, Stumm S, Watermann I, Walter S, Stevanovic S, Wallwiener D, and Guckel B. Evaluation of pre existent immunity in patients with primary breast cancer: molecular and cellular assays to quantify antigen specific T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells. Clin Cancer Res. 9:4376-4386 (2003).

Rotzschke O, Falk K, Stevanovic S, Jung G, Walden P, and Rammensee HG. Exact prediction of a natural T cell epitope. Eur. J. Immunol. 21:2891-2894 (1991).

Rubin JS, Bottaro DP, and Aaronson SA. Hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor, the c-met proto-oncogene product. Biochim. Biophys. Acta 1155:357-371 (1993).

Saha S, Bardelli A, Buckhaults P, Velculescu VE, Rago C, St CB, Romans KE, Choti MA, Lengauer C, Kinzler KW, and Vogelstein B. A phosphatase associated with metastasis of colorectal cancer. Science 294:1343-1346 (2001).

Saino M, Maruyama T, Sekiya T, Kayama T, and Murakami Y. Inhibition of angiogenesis in human glioma cell lines by antisense RNA from the soluble guanylate cyclase genes, GUCY1A3 and GUCY1B3. Oncol. Rep. 12:47-52 (2004).

Schag K, Schmidt SM, Muller MR, Weinschenk T, Appel S, Weck MM, Grunebach F, Stevanovic S, Rammensee HG, and Brossart P. Identification of C-met oncogene as a broadly expressed tumor associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Clin Cancer Res. 10:3658-3666 (2004).

Scheibenbogen, C., A. Schmittel, U. Keilholz, T. Allgauer, U. Hofmann, R. Max, E. Thiel, and D. Schadendorf.. Phase 2 trial of vaccination with tyrosinase peptides and granulocyte macrophage colony stimulating factor in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 23:275 (2000).

Schirle M, Weinschenk T, and Stevanovic S. Combining computer algorithms with experimental approaches permits the rapid and accurate identification of T cell epitopes from defined antigens. J. Immunol. Methods 257:1-16 (2001).

Schmidt C, Bladt F, Goedecke S, Brinkmann V, Zschiesche W, Sharpe M, Gherardi E, and Birchmeier C. Scatter factor/hepatocyte growth factor is essential for liver development. Nature 373:699-702 (1995).

Siddiqui J, Abe M, Hayes D, Shani E, Yunis E, and Kufe D. Isolation and Sequencing of a cDNA Coding for the Human DF3 Breast Carcinoma Associated Antigen. PNAS 85:2320-2323 (1988).

Slingluff, C. L., Jr., G. R. Petroni, G. V. Yamshchikov, D. L. Barnd, S. Eastham, H. Galavotti, J. W. Patterson, D. H. Deacon, S. Hibbitts, D. Teates, P. Y. Neese, W. W. Grosh, K. A. Chianese Bullock, E. M. Woodson, C. J. Wiernasz, P. Merrill, J. Gibson, M. Ross, and V. H. Engelhard. Clinical and immunologic results of a randomized phase II trial of vaccination using four melanoma peptides either administered in granulocyte macrophage colony stimulating factor in adjuvant or pulsed on dendritic cells. J. Clin. Oncol. 21:4016 (2003).

Sun Y, Song M, Stevanovic S, Jankowiak C, Paschen A, Rammensee HG, and Schadendorf D. Identification of a new HLA-A(*)0201 restricted T cell epitope from the tyrosinase-related protein 2 (TRP2) melanoma antigen. Int. J. Cancer 87:399-404 (2000).

Takahashi T, Makiguchi Y, Hinoda Y, Kakiuchi H, Nakagawa N, Imai K, and Yachi A. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153:2102-2109 (1994).

Takayama H, Larochelle WJ, Sharp R, Otsuka T, Kriebel P, Anver M, Aaronson SA, and Merlino G. Diverse tumorigenesis associated with aberrant development in mice overexpressing hepatocyte growth factor/scatter factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94:701-706 (1997).

Takayama H, LaRochelle WJ, Anver M, Bockman DE, and Merlino G. Scatter factor/hepatocyte growth factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development. PNAS 93:5866-5871 (1996).

Teofili L, Di Febo AL, Pierconti F, Maggiano N, Bendandi M, Rutella S, Cingolani A, Di RN, Musto P, Pileri S, Leone G, and Larocca LM. Expression of the c-met proto-oncogene and its ligand, hepatocyte growth factor, in Hodgkin disease. Blood 97:1063-1069 (2001).

Tripathi A, Dasgupta S, Roy A, Sengupta A, Roy B, Roychowdhury S, and Panda CK. Sequential deletions in both arms of chromosome 9 are associated with the development of head and neck squamous cell carcinoma in Indian patients. J. Exp. Clin. Cancer Res. 22:289-297 (2003).

Troussard X, vet Loiseau H, Macro M, Mellerin MP, Malet M, Roussel M, and Sola B. Cyclin D1 expression in patients with multiple myeloma. Hematol. J. 1:181-185 (2000).

Tuck AB, Park M, Sterns EE, Boag A, and Elliott BE. Coexpression of hepatocyte growth factor and receptor (Met) in human breast carcinoma. Am. J. Pathol. 148:225-232 (1996).

Uehara Y, Minowa O, Mori C, Shiota K, Kuno J, Noda T, and Kitamura N. Placental defect and embryonic lethality in mice lacking hepatocyte growth factor/scatter factor. Nature 373:702-705 (1995).

van d, V, Taher TE, Keehnen RM, Smit L, Groenink M, and Pals ST. Paracrine regulation of germinal center B-cell adhesion through the c-met hepatocyte growth factor/scatter factor pathway. J. Exp. Med. 185:2121-2131 (1997).

Vasef MA, Brynes RK, Sturm M, Bromley C, and Robinson RA. Expression of cyclin D1 in parathyroid carcinomas, adenomas, and hyperplasias: a paraffin immunohistochemical study. Mod. Pathol. 12:412-416 (1999).

Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, and Stevanovic S. Cutting Edge: Predetermined Avidity of Human CD8 T cells Expanded on Calibrated MHC/Anti CD28 Coated Microspheres. J Immunol 171:4974-4978 (2003).

Wang FQ, So J, Reierstad S, and Fishman DA. Matrilysin (MMP-7) promotes invasion of ovarian cancer cells by activation of progelatinase. Int. J Cancer 114:19-31 (2005).

Wang R, Ferrell LD, Faouzi S, Maher JJ, and Bishop JM. Activation of the Met receptor by cell attachment induces and sustains hepatocellular carcinomas in transgenic mice. J. Cell Biol. 153:1023-1034 (2001).

Weber RG, Rieger J, Naumann U, Lichter P, and Weller M. Chromosomal imbalances associated with response to chemotherapy and cytotoxic cytokines in human malignant glioma cell lines. Int. J. Cancer 91:213-218 (2001).

Weinschenk T, Gouttefangeas C, Schirle M, Obermayr F, Walter S, Schoor O, Kurek R, Loeser W, Bichler KH, Wernet D, Stevanovic S, and Rammensee HG. Integrated functional genomics approach for the design of patient individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-5827 (2002).

Wierecky J, Muller MR, Horger MS, Brugger W, Kanz L, and Brossart P. Induction of clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells. J Clin Oncol (Meeting Abstracts) 23:2507 (2005).

Wills MR, Carmichael AJ, Mynard K, Jin X, Weekes MP, Plachter B, and Sissons JG. The human cytotoxic T lymphocyte (CTL) response to cytomegalovirus is dominated by structural protein pp65: frequency, specificity, and T cell receptor usage of pp65 specific CTL. J Virol. 70:7569-7579 (1996).

Xiong Y, Connolly T, Futcher B, and Beach D. Human D type cyclin. Cell 65:691-699 (1991).

Yewdell JW, Reits E, and Neefjes J. Making sense of mass destruction: quantitating MHC I형 antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3:952-961 (2003).

Young AN, Amin MB, Moreno CS, Lim SD, Cohen C, Petros JA, Marshall FF, and Neish AS. Expression profiling of renal epithelial neoplasms: a method for tumor classification and discovery of diagnostic molecular markers. Am. J. Pathol. 158:1639-1651 (2001).

Zarnegar R and Michalopoulos GK. The many faces of hepatocyte growth factor: from hepatopoiesis to hematopoiesis. J. Cell Biol. 129:1177-1180 (1995).

Zhou YT, Guy GR, and Low BC. BNIP-2 induces cell elongation and membrane protrusions by interacting with Cdc42 via a unique Cdc42 binding motif within its BNIP-2 and Cdc42GAP homology domain. Exp. Cell Res. 303:263-274 (2005).

Romero P, Cerottini JC, Speiser DE. Monitoring tumor antigen specific T cell responses in cancer patients and phase I clinical trials of peptide based vaccination. Cancer Immunol Immunother. 2004 Mar;53(3):249-55.

Schmittel A, Keilholz U, Thiel E, Scheibenbogen C. Quantification of tumor specific T lymphocytes with the ELISPOT assay. J Immunother. 2000 May Jun;23(3):289-95.

Wierecky J, Mㆌller M, Horger M, Brugger W, Kanz L, Brossart P. Induction of clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells. Abstract No. 2507 presented at the Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology ASCO (2005).

SEQUENCE LISTING <110> Immatics biotechnologies GmbH <120> TUMOR-ASSOCIATED PEPTIDES BINDING TO HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN (HLA) CLASS I OR II MOLECULES AND RELATED ANTI-CANCER VACCINE <130> I30559PCT <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Met Ala Gly Asp Ile Tyr Ser Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Val Ala Ser Thr Ile Thr Gly Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Leu Ala Asp Gly Val Gln Lys Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Val Phe Ala Gly Val Val Gly Val 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Leu Phe Asp Gly Asp Pro His Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Ala Ala Leu Pro His Ser Cys Leu 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 11 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10

Claims (36)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 그 변이물에 따른, 하나 이상의 서열을 포함하는 펩티드 군에서 선택되되, 완전한 사람 종양 관련 폴리펩티드가 아닌 종양 관련 펩티드.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 펩티드가 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 그 변이물에 따른 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 종양 관련 펩티드.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 펩티드가 9에서 100개 아미노산, 바람직하게는 9 내지 30개 아미노산, 더욱 바람직하게는 9 내지 16개 아미노산의 전체 길이를 갖는 종양 관련 펩티드.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

   사람의 주요 조직적합 복합체(MHC) I형 또는 II형의 분자에 결합하는 종양 관련 펩티드.
5. 제 4 항에 있어서,

   사람의 주요 조직적합 복합체(MHC) II형의 하나 이상의 추가 분자에 결합하 는 종양 관련 펩티드.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 펩티드가 비펩티드(non-peptide) 결합을 포함하는 종양 관련 펩티드.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

   펩티드가 HLA-DR 항원 관련 불변사슬(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 융합 단백질인 종양 관련 펩티드.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산.
9. 제 8 항에 있어서,

   DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 그의 조합인 핵산.
10. 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터.
11. 의학에 사용되는, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 종양 관련 펩티드, 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산, 또는 제 10 항의 발현 벡터.
12. 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산, 또는 제 10 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
13. 제 12 항에 있어서,

    재조합 RCC 또는 아웰스(Awells) 세포인 숙주 세포.
14. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 종양 관련 펩티드, 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산, 또는 제 10 항의 발현 벡터, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
15. 제 14 항에 있어서,

    서열번호 3 내지 서열번호 11 중 어느 하나에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 추가 펩티드를 추가로 포함하는 약학 조성물.
16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,

    상기 펩티드가 9에서 100개 아미노산, 바람직하게는 9 내지 30개 아미노산, 더욱 바람직하게는 9 내지 16개 아미노산의 전체 길이를 갖는 약학 조성물.
17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,

    하나 이상의 펩티드가 비펩티드(non-peptide) 결합을 포함하는 약학 조성물.
18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,

    서열번호 1 및/또는 서열번호 2 및 서열번호 3 내지 서열번호 11에 따른 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 약학 조성물.
19. 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,

    조성물에 존재하는 종양 관련 펩티드의 양이 조직, 암 및/또는 환자 특이적인 약학 조성물.
20. 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,

    하나 이상의 적절한 보조액을 추가로 포함하는 약학 조성물.
21. 제 20 항에 있어서,

    보조액이 과립구 대식구 집락-자극인자(GM-CSF)와 같은 집락-자극 인자들의 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
22. 제 14 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 약학 조성물의 항암 백신으로서의 용도.
23. 제 12 항의 숙주 세포를 배양하고 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드를 분리하는 것을 포함하는, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 종양 관련 펩티드의 제조방법.
24. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 펩티드의 유효량, 또는 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산의 유효량, 또는 제 10 항의 발현 벡터의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 펩티드의 양 또는 상기 핵산의 양 또는 상기 발현 벡터의 양이 상기 환자에게 항 표적 세포 면역 반응을 유발하는데 효과적인, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포가 비정상적으로 발현하는 환자에서 표적 세포를 사멸하는 방법.
25. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포가 비정상적으로 발현하는 환자에서 표적 세포를 사멸하기 위한 약물의 제조에 사용되는, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 종양 관련 펩티드, 또는 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산, 또는 제 10 항의 발현 벡터의 용도.
26. 알맞은 항원 전달 세포의 표면 상에 발현된 사람 I형 또는 II형 MHC 분자에 로딩된 항원과 체외 세포독성 T 림프구(CTL)를, 체외 CTL을 항원 특이 방식으로 활성화하는 데에 충분한 시간 동안 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 항원이 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 펩티드인, 활성 세포독성 T 림프구(CTL)의 체외 제조방법.
27. 제 26 항에 있어서,

    충분한 양의 항원을 항원 전달 세포와 접촉시킴으로써 항원이 알맞은 항원 전달 세포의 표면 상에 발현된 I형 또는 II형 MHC 분자에 로딩되는 제조방법.
28. 제 27 항에 있어서,

    항원 전달 세포가 제 10 항의 발현 벡터를 포함하는 제조방법.
29. 제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조되고, 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는 활성 세포독성 T 림프구(CTL).
30. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 인식하고, 제 29 항의 세포독성 T 림프구(CTL)로부터 획득가능한 T 세포 수용체(TCR) 또는 TCR과 기능적으로 동등한 분자.
31. 제 30 항의 T 세포 수용체(TCR)를 인코딩하는 핵산.
32. 제 30 항의 T 세포 수용체(TCR)의 발현이 가능한 발현 벡터.
33. 제 29 항의 세포독성 T 림프구(CTL)의 유효수를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포가 비정상적으로 발현하는 환자에서 표적 세포를 사멸하는 방법.
34. (1) 환자로부터 세포독성 T 림프구(CTL)를 획득하는 단계;

    (2) 제 30 항의 T 세포 수용체(TCR) 또는 이와 기능적으로 동등한 분자를 인코딩하는 핵산을 표적 세포에 도입하는 단계; 및

    (3) 상기 환자에게 (2) 단계에서 생산된 세포를 도입하는 단계

    를 포함하는, 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포가 비정상적으로 발현하는 환자에서 표적 세포를 사멸하는 방법.
35. 환자 내 암 세포를 사멸하기 위한 약물의 제조에 사용되는, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 종양 관련 펩티드, 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산, 제 10 항의 발현 벡터, 또는 제 14 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 약학 조성물의 용도.
36. 제 35 항에 있어서,

    상기 암 세포가 신장 암 세포인 용도.

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