KR101150663B1 - 인간 백혈구 항원 (ｈｌａ) ⅰ형 또는 ⅱ형 분자에 결합하는 종양 관련 펩티드 및 이와 관련된 항암 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역요법과 면역요법에 있어 사용되는 분자와 세포에 대한 것이다. 특히 본 발명은 암에 대한 면역요법에 관한 것이다. 더욱이 본 발명은 단독으로 사용되거나 또는 기타 종양 관련 펩티드와 병용된 종양 관련 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자에 대한 것이며, 항 종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 활성 제제로 작용한다. 특히 본 발명은 항 종양 면역 반응을 유발하는 백신 조성물에 사용될 수 있는 인간 종양세포주의 HLA II형 분자에서 유도된 두 가지 새로운 펩티드 서열에 대한 것이다.

Description

인간 백혈구 항원 (ＨＬＡ) Ⅰ형 또는 Ⅱ형 분자에 결합하는 종양 관련 펩티드 및 이와 관련된 항암 백신{TUMOR-ASSOCIATED PEPTIDES BINDING TO HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN (HLA) CLASS I OR II MOLECULES AND RELATED ANTI-CANCER VACCINE}

본 발명은 면역요법 및 면역요법에 사용되는 분자와 세포에 대한 것이다. 특히, 본 발명은 암(특히 신장암)에 대한 면역요법에 관한 것이다. 더욱이 본 발명은 단독 또는 기타 종양 관련 펩티드와 병용된 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자에 대한 것이며, 이러한 기타 종양 관련 펩티드는 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 활성 제제로 작용한다. 특히 본 발명은 항종양 면역 반응을 유발하는 백신 조성물에 사용될 수 있는 인간 종양 세포주의 HLA I형 및 II형 분자에서 유도된 두 가지 새로운 펩티드 서열에 대한 것이다.

본원에 인용된 모든 문헌은 내용 전체가 본 발명을 위해 참고로 혼입된다.

면역 반응의 자극은 숙주의 면역계가 외부 물질로 인식하는 항원의 존재 여부에 달려있다. 종양 관련 항원의 존재에 대한 발견은 숙주의 면역계를 사용하여 종양 성장에 개입할 수 있다는 가능성을 증대시켰다. 면역계의 체액 및 세포 부문(arms) 둘 모두를 이용하는 여러 기전은 현재 암 면역요법으로 탐구되고 있다.

세포 면역 반응의 특정 요소는 종양 세포를 특이적으로 인식하여 파괴할 수 있다. 종양침윤 세포 집단이나 말초 혈액에서 나온 세포독성 T세포(CTL)를 분리하면 이런 세포가 암에 대항하는 자연 면역 방어에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다(Cheever 외., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112). 특히, 세포질에 위치한 단백질에서 유도된 대개 8 내지 10개의 잔기인 펩티드를 갖는 주요 조직 적합 복합체(MHC) I형 분자를 인식하는 CD8 양성 T 세포(TCD8 양성)가 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC 분자는 또한 인간 백혈구 항원(HLA)이라 불린다.

MHC 분자에는 두 가지 형태가 있는데, MHC I형 분자는 내인성 단백질의 단백질 분해로 발생한 펩티드 및 더 큰 펩티드를 제시하며, 핵을 보유한 대부분의 세포에서 발견된다. MHC II형 분자는 전문 항원 제시 세포(APC) 상에서만 발견되며, 세포내 이입 과정 중 APC가 취한 외인단백질의 펩티드를 제시하고, 후속적으로 처리한다. 펩티드와 MHC I의 복합체는 CD8 양성 세포독성 T 림프구에 의해 인식되고, 펩티드와 MHC II의 복합체는 CD4 양성 보조 T 세포에 의해 인식된다.

CD4 양성 보조 T 세포는 항종양 T 세포 반응의 효과기 기능을 조정하는데 중요한 역할을 하므로, 이런 이유로 종양 관련 항원(TAA)에서 유도된 CD4 양성 T 세포 항원결정인자를 확인하는 것은 항종양 면역 반응을 유발하는 의약품 개발에 있어 상당히 중요할 수 있다(Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras Cuesta, 그 리고 E. Celis. 2002. 암종배아 항원에서 보조 T 림프구의 항원결정인자 확인. Clin. Cancer Res . 8:3219 3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jㅴger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, 그리고 L.J. Old. 2003. 암환자의 NY ESO 1에 대한 CD4+ T세포 반응의 자연 발생에 대한 조사: 항체 반응과의 상관관계. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 100(15):8862-7).

마우스 등의 포유동물 모델은, CD4 양성 T 세포가 세포독성 T 림프구(CTL) 효과기 세포(즉, CD8 양성 T 림프구)의 부재 하에서도 인터페론 감마(IFNγ)의 분비로 인한 혈관형성 억제를 통해 종양 발현을 억제하기에 충분하다는 것을 나타내었다(Qin, Z. 그리고 T. Blankenstein. 2000. CD4+ T 세포 매개 종양 거부는 비조혈세포에 의한 IFN 감마 수용체 발현에 의존하는 혈관생성의 억제와 관련. Immunity. 12:677-686). 더욱이 HLA II형 분자에 의해 제시되는 종양 관련 항원으로부터 나온 펩티드를 인식하는 CD4 양성 T 세포는 항체(Ab) 반응 유도를 통해 종양 진행을 방해할 수 있다(Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, 그리고 R.K. Bright. 2003. CD4 양성 T 림프구는 원숭이 바이러스의 40개 대형 종양 항원에 대해 항체 생산과 종양 면역에서 중요한 역할을 한다. Cancer Res. 63:1040-1045). HLA I형 분자에 결합하는 종양 관련 펩티드와는 대조적으로, 지금까지 소수의 TAA II형 리간드만이 기술되어 왔다(www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). HLA II형 분자의 구성적 발현이 대개 면역계의 세포로 제한되어 있으므로(Mach, B., V. Steimle, E. Martinez Soria, 그리고 W. Reith. 1996. MHC II형 유전자 규정: 질병에서 얻는 교훈. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331), II형 펩티드를 원발 종양(Primary Tumour)에서 직접 분리하는 것은 불가능하다고 간주되었다. 따라서 항원이 항원 제시 세포의 II형 처리 경로로 향하게 하는 여러 가지 전략이 기술되었으며, 그러한 예로 관심 있는 항원과 함께 APC를 배양하여 이것이 취해지고 처리되고 제시될 수 있게 한 것이나(Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, 그리고 B.P. van der Bruggen. 1999. CD4(+) T 림프구에 HLA-DR 분자에 의해 제시되는 MAGE 3 항원결정인자 확인. J. Exp. Med. 189:767-778), 혹은 관심 있는 항원을 인코딩하고, 항원을 리소솜 MHC II형 처리 및 집합 구역(MIIC)으로 이동시키는 것을 매개하는 불변 사슬에 융합시킨 유전자 또는 미니유전자로 세포를 형질감염시키는 것을 들 수 있다.

펩티드가 분자 면역 반응을 유발(도출)하기 위해서는 MHC 분자에 결합해야 한다. 이 과정은 MHC 분자의 대립유전자와 펩티드의 아미노산 서열의 특정 다형태에 의존한다. MHC I형 결합 펩티드는 대개 잔기가 8 내지 10개 길이이고 대응하는 MHC 분자의 상응하는 결합 그루브와 상호작용하는 1차 핵산 서열에서 두 가지 보존 잔기("고정기(anchor)")를 함유하고 있다.

염증이 없는 경우, MHC II형 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히 단핵구와 단핵구-유래 세포, 포식세포, 수지상세포 등의 전문 항원 제시 세포로 제한된다.

종양 특이적 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 이들의 항원결정인자는 효소 및 수용체, 전사 인자(transcription) 등과 같은 모든 단백질 부류에서 유도된 분자들일 수 있다. 더욱이 종양 관련 항원은 예를 들면 돌연변이된 유전자의 생성물로써 종양세포에만 존재할 수 있다. 종양 관련 항원의 또 다른 중요한 부류는 고환의 건강한 조직 및 여러 다른 종양에서 발현되는 CT("고환암") 항원과 같은 조직 특이적 구조를 갖는다.

여러 가지 종양 관련 항원이 확인되어 왔으며, 또한 추가적인 종양 관련 항원을 발견하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 일부 종양 관련 항원 집단은 당 분야에서 종양 특이적 항원이라고도 불리며, 조직 특이적이다. 그 예로는 흑색종(melanoma)에 대한 티로시나제(tyrosinase)와 전립선암에 대한 PSA와 PSMA, 림프종의 bcr/abl과 같은 염색체 교차(전위)가 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 그러나 확인된 많은 종양 관련 항원들은 여러 종양 형태에서 발현하고, 일부, 예를 들면 실제 형질전환 사례를 유발하는 발암성 단백질 및 종양 억제 유전자(한 예로 종양 억제 유전자는 Linehan WM, Walther MM, Zbar B에서 신장암에 대해 검토되었다. 신장암의 유전 기본. J Urol. 2003 Dec;170(6 Pt 1):2163-72)는 거의 모든 종양 형태에서 발생한다. 예를 들어, 세포 성장과 분화를 조절하는 정상 세포 단백질, 예를 들면 p53(종양 억제 유전자의 예), ras, c-met, myc, pRB, VHL 및 HER 2/neu는 돌연변이를 축적하여 이런 유전자 생성물의 발현을 상향 조절(upregulation)하여 이들이 발암원이 되도록 할 수 있다 (McCartey 외. Cancer Research 1998 15:58 2601 5; Disis 외. Ciba Found. Symp. 1994 187:198-211).

Mucin 1 (MUC1)은 유방암과 난소암과 같은 많은 인간의 선암 세포 표면에서 매우 과잉 발현되는 고도로 글라이코실화된 I형 막 당단백질이다. 악성종양 내의 이상 탈글라이코실화(deglycosylation)는 일반적이며, 정상세포에서는 제시될 수 없는 종양세포의 항원결정인자의 정체를 드러낸다. 더욱이 다발 골수종과 일부 B 세포 비호지킨 림프종(B cell Non Hodgkin lymphomas)에서 MUC1의 발현이 증명되어 왔다(Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, Duhig T, Rothbard J, 그리고 Burchell J. 암종에 발현된 인체의 다형태 상피 점액의 높은 면역원성 지역은 일렬 반복으로 구성. J. Biol. Chem. 263:12820-12823 (1988); Siddiqui 1988; Girling A, Bartkova J, Burchell J, Gendler S, Gillett C, 그리고 Taylor Papadimitriou J. 단일클론 항체인 SM 3에 의해 감지된 다형태 상피 점액의 코어 단백질 항원결정인자는 원발 암종의 범위에 선택적으로 노출됨. Int. J. Cancer 43:1072-1076 (1989); Brossart 1999; Duperray 1989; Mark 1989; Delsol 1988; Apostolopoulos V 그리고 McKenzie IF. 세포 점액: 면역요법 표적. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian Blander J, and Barratt Boyes SM. MUC 1 상피 종양 점액 기반 면역 및 암 백신. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995)). 최근의 여러 보고서(Apostolopoulos V 그리고 McKenzie IF. Cellular mucins: 면역 요법 표적. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian Blander J, and Barratt Boyes SM. MUC 1 상피 종양 점액 기반 면역 및 암 백신. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995); Barnd 1989; Takahashi 1994; Noto 1997)에 따르면 난소 및 유방, 췌장, 다발골수증 종양에서 나온 세포독성 MHC 비제한 T 세포가 탠덤(tandem) 반복에 국한된 MUC1 단백질 코어의 항원결정인자를 인지할 수 있음이 증명되었다. MUC1 단백질에서 유도된 두 가지 HLA-A2-제한 T 세포 항원결정인자(HLA-A2-restricted T cell epitopes)가 확인되었다(Brossart 1999, EP 1484397). 한 펩티드는 MUC1 단백질의 탠덤 반복 지역에서 유도되며, 두 번째 펩티드는 MUC1의 신호 서열 내에 국한되어 있다. 진행성 유방암 또는 난소암 환자들을 대상으로 펩티드 펄스처리된(peptide-pulsed) 수지상 세포를 접종한 후 실시한 생체 내 세포독성 T 림프구 반응 유도는 성공적이었다(Brossart 2000) (Wierecky 2005). 신장세포암종의 경우, 기존 종양에서 MUC1 발현이 일반적이고 종양 등급 및 단계와 관련이 있는 것으로 보고 되었다(Fujita 1999; Kraus 2002; Leroy 2002; Bamias 2003; Cao 2000). MUC1의 경우, 단백질의 과다 발현은 mRNA 과다발현과 상관관계가 없다.

아디포필린(adipophilin)은 지질 소적을 함유한 특수 분화 세포의 지표이자 지방 축적 세포와 관련 있는 질병의 지표이다(Heid 1998). 아디포필린은 섬유모세포(fibroblasts)와 내피세포, 상피세포를 포함하는 광범위한 범위의 배양 세포주에서 발생한다. 그러나 조직에서 아디포필린의 발현은 특정 세포 형태에만 제한되어 있는데, 수유 중인 유방 상피세포, 부신피질 세포, 남성 생식기계의 세르톨리 라이디히 세포(Sertoli and Leydig cells), 알코올 간경화의 지방증 또는 지방변성 간세포 등이 그러한 예이다(Heid 1998). 보고에 따르면 아디포필린은 결장직장암(Saha 2001)과 간세포암종(Kurokawa 2004), 신장세포암종(Young 2001)에서 과다 발현한다.

c-Met는 베타 아단위(β-subunit)에 이황화물 연결된 알파 사슬(α-chain)로 구성된 티로신 키나제(tyrosine kinase) 활성을 갖는 이형이량체의 막투과성 수용체를 인코딩한다(Bottaro 1991; Rubin 1993). 두 가지 아단위 모두 표면에 발현되고, 무거운 베타 아단위(β-subunit)는 리간드인 간세포 성장 인자(HGF)로의 결합을 담당하며, 알파 아단위(α-subunit)는 여러 다른 신호 전달 경로의 활성화를 매개하는 세포내 영역을 포함한다. c-Met 신호 전달은 기관 재생에 관여하는데 이는 간, 신장, 배아형성, 조혈, 근육 발달, 그리고 정상적으로 활성화된 B형 세포 및 단핵세포의 이동과 고정 조정에 대해 입증되었다(Zarnegar 1995; Naldini 1991; Montesano 1998; Schmidt 1995; Uehara 1995; Bladt 1995; Takayama 1996; Mizuno 1993; van, V 1997; Beilmann 2000). 더욱이 수많은 연구를 통해 악성 형질전환 및 악성세포의 침습에 있어 c-Met의 과다 발현이 관련 있는 것으로 나타났다.

c-Met는 세포 성장의 촉진, 이동동, 생존, 세포 외 기질 용해 및 혈관형성을 포함하는, HGF/산란 인자의 다기능성이고 잠재적인 발암 활성을 매개한다(Bottaro 1991; Rubin 1993; Zarnegar 1995). HGF가 수용체에 결합하게 되면 c-Met의 자가인산화를 유도하고, Ras, 포스파티딜이노시톨 3-키나제(phosphatidylinositol 3'-kinase), 포스포리파제Cγ(phospholipase Cγ), 미토젠 활성 단백 키나제 관련 경로를 비롯한 하류 신호 전달 사건들을 활성화한다(Naldini 1991; Montesano 1998; Furge 2000; Ponzetto 1993; Dong 2001; Furge 2001). c-Met 유전자는 상피세포에서 주로 발현되고, 여러 악성 조직과 세포주에서 과다 발현된다(Di Renzo 1995; Ferracini 1995; Tuck 1996; Koochekpour 1997; Li 2001; Fischer 1998; Maulik 2002; Qian 2002; Ramirez 2000). 조혈(haematopoietic) 세포와 신경세포, 골격세포 같은 비상피성 세포들은 HGF에 반응하고, 다발성 골수종, 호지킨병, 백혈병, 림프종과 같은 혈액암에서 c-Met 단백질이 발현된다는 사실이 더 많은 보고서를 통해 나타났다(Gherardi 1991; Teofili 2001; Borset 1999; Jucker 1994; Pons 1998). c-Met 활성화 돌연변이에 의해 자극 받아 발암성으로 활성화된 c-Met에 의한 침습적 성장 표현형의 조절 해지 및 c-Met 증폭/과다 발현, HGF/c-Met 자가분비 루프는 암세포에 침습적, 전이 특성을 부여한다. 특히 HGF 과다 발현의 유전자 삽입 마우스에서 c-Met의 구성적 활성화는 광범위한 종양생성(tumourigenesis)을 촉진한다(Wang 2001; Takayama 1997).

G 단백질 신호 전달 5의 조절자(RGS5)는, 비록 생체 내에서의 그 기능을 알 수는 없지만, 이형삼량체 G 단백질 신호 전달 경로의 음성 조절자이다. RGS 단백질은 통합된 촉매 기능을 갖지만, 조직 분포에 따라 다른 분자 패밀리를 포함한다. 이들은 활성화된 Gα 아단위의 내인성 구아노신 트리포스파테이스(GTPase) 활동을 자극하여 결국 G 단백질 불활성화를 가속화시킨다. 따라서 RGS 분자는 G 단백질-커플링된 수용체의 하류 신호 전달을 억제한다(De 2000). 최근에 밝혀진 바에 따르면 종양 신생혈관이 증식하는 동안 혈관주위 세포(pericytes) 내에서의 G 단백질 신호 전달-5 조절자의 유도가 활발한 활관 재형성과 일치하는 것으로 나타났다. 고도로 혈관을 형성하는 성상세포종 뿐 아니라 췌장 세포 발암 마우스 모델에서, 활발한 혈관 재형성을 동반한 혈관형성 전환동안 혈관주위 세포(pericytes)에서 RGS5의 과다 발현이 나타났다. 과다발현은 정상 랑게르한섬(islet of Langerhans)과 비교시 종양 혈관계로 제한되었으나, RGS5는 또한 상처 치유와 배란주기 동안에도 상향조절(upregulated)된다(Berger 2005).

RGS5 발현은 RCC에서 증가한다(Rae 2000). 또 다른 연구에서는 RT PCR 결과가 검사된 모든 RCC에서 RGS5가 강하게 발현된 것으로 드러났으며, 정상 신장에서는 발현이 매우 약하거나 확인이 어려웠다(6.6:1, 실시간 PCR). RCC에서 RGS5의 주 위치는 종양 내피세포였다(Furuya 2004). 또한, RGS5는 간세포 암종의 굴모양 내피세포 지표인 것으로 보고되었다(Chen 2004).

아포지단백질 L1(APOL1)은 분비된 고밀도 지단백질으로 아포지단백질 A-1에 결합한다. 아포지단백질 A-1은 비교적 풍부한 혈장 단백질이며 HDL의 주 아포단백질이다. 이는 혈장 내 대부분의 콜레스테롤에스테르(cholesteryl esters)의 형성에 연관된 것은 물론, 콜레스테롤의 세포로부터의 유출을 증진시킨다. 아포지단백질 L1(APOL1)은 지질 교환 역할을 할 수 있으며 신체 전체로 콜레스테롤을 전달할 뿐 아니라 역으로 말초 세포에서 간까지 콜레스테롤을 전달한다. 혈장 단백질은 약 40 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 단일 사슬 폴리펩티드(polypeptide)이다(Duchateau 1997; Duchateau 2001). APOL1 cDNA는 활성화된 내피세포 cDNA 라이브러리에서 분리되어 있고, 강력한 친염증성 시토킨(cytokine)인 TNF-α에 의해 상향조절되는 것으로 나타났다(Monajemi 2002).

KIAA0367은 추정 단백질을 인코딩하는, 미지의 긴 인간 전사물 확인을 목표로 한 Kazusa cDNA 프로젝트를 통해 확인되었다(Ohara 1997). KIAA0367의 잠정 820개 아미노산의 긴 단백질 생성물의 기능은 확인되지 않았으나, 여러 뉴클리오티드 교환 인자와 BCL2/아데노바이러스(adenovirus) E1B 19-kDa 단백질-상호작용 단백질 2(BNIP 2)에 존재하고, 카르복실기(C-말단)에 작은 소수성 분자와 결합하는 CRAL-TRIP 지질 결합 도메인 프로파일을 포함한다. BNIP 2는 세포 형태학, 이동성, 세포내이입, 세포 주기 진행을 포함한 다양한 세포 기능 조절에 관여한다(Zhou 2005). KIAA0367은 염색체 영역 9q21에 위치한다. 이 영역은 많은 종양에서 동종접합 결손의 일반적인 표적(Gursky 2001; Weber 2001) 혹은 이형접합성 소실(LOH)로 기술된다(Louhelainen 2000; Tripathi 2003).

알파와 베타 아단위(1개 헴 그룹)로 구성된 이형이량체 단백질인 구아닐레이트 사이클레이스(sGC)는 GTP를 이차 전령 cGMP로 전환하는 촉매 작용을 하며, 산화질소와 니트로바소딜레이터(nitrovasodilator) 약물의 주 수용체 기능을 한다(Zabel 1998). GUCYa3와 b3는 인간 신경아교종에서 과다 발현된다. 안티센스(antisense) GUCY1A3나 GUCY1B3의 형질감염은 누드 마우스(nude mice)의 혈관신생과 종양 성장을 감소시켰으며, 이는 VEFG가 cGMP로 유발된다는 사실에 기인한 것일 수 있다(Saino 2004). GUCY1A3는 마우스 유방 종양 세포주의 종양 세포 이동을 촉진한다(Jadeski 2003).

사이클린 D1은 매우 보존적인 사이클린(cyclins) 패밀리, 더 구체적으로는 사이클린(cyclins) D 아과에 속한다(Xiong 1991; Lew 1991). 사이클린(cyclins)은 CDKs(cyclin-dependent kinases)의 조절자 기능을 한다. 다른 사이클린들(cyclins)은 각 유사분열 사건의 시간적 협조에 기여하는 독특한 발현 및 분해 패턴을 보인다(Deshpande 2005). 사이클린(Cyclin) D1은 CDK4나 CDK6와 복합체를 구성하고 CDK4나 CDK6의 조절 아단위로 작용하는데 이러한 활동은 세포 주기 G1/S 이행에 필요한 것이다. CCND1은 CDK4 및 CDK6와 함께, 복합체에 기질 특이성을 부여하는 세린(serine)/티로닌(threonine) 키나제 완전효소 복합체를 형성한다(Bates 1994). 이 단백질은 종양 억제 단백질 Rb(Loden 2002)와 상호작용하는 것으로 나타났으며, 이 유전자의 발현은 Rb에 의해 양성으로 조절된다(Halaban 1999). 세포 주기 진행을 변경시키는 이 유전자의 돌연변이와 증폭, 과다 발현은 다양한 종양에서 자주 관찰되며, 종양발생에 기여할 수 있다(Hedberg 1999; Vasef 1999; Troussard 2000).

기질 메탈로프로테이네스(MMP) 패밀리의 단백질은 배아 생성, 생식, 조직 재형성과 같은 정상적 생리 과정뿐 아니라 관절염 및 전이와 같은 질병 과정에서 세포 외 기질 분해에 관여되어 있다(Mott 2004). 기질 메탈로프로테이네스 7(MMP7)은 세포 외 단백분해효소(proteinase)에 의해 분열되면 활성화되는 29.6 kDa의 비활성 프로단백질로 분비된다. 활성 효소는 19.1 kDa의 분자량을 갖고, 아단위 당 2개의 아연 이온(zinc ion)과 2개의 칼슘 이온을 결합하고 있다(Miyazaki 1990; Browner 1995). MMP7은 젤라틴과 섬유결합소(fibronectin), 카세인(casein)을 분해(Miyazaki 1990; Quantin 1989)시키며, 보존된 C-말단(C-terminal) 단백질 도메인이 없다는 점에서 대부분의 MMP 패밀리 구성원과는 다르다(Gaire 1994). MMP7은 자주 악성 조직에 과다발현(Lin 2004; Bramhall 1997; Denys 2004)되며, 생체 내 종양세포 침습을 촉진한다고 제안된다(Wang 2005).

본 단백질은 다양한 형태의 암에서 종양 특이적 면역 반응의 표적이 될 수 있다.

B형 간염 바이러스의 코어 항원 펩티드 HBV-001은 내인성 인간 종양 관련 항원에서 유래되지 않고, B형 간염 바이러스 코어 항원에서 유래된다. 먼저, 이는 TUMAP에서 유래된 T 세포 반응의 크기를 정량 비교할 수 있게 하여, 항종양 반응을 유발하는 능력에 대한 중요한 결론을 내릴 수 있게 한다. 둘째, 이는 환자에서 임의의 T 세포 반응이 없는 경우 중요한 양성 대조군으로서 작용한다. 그리고 셋째, 환자의 면역 적합성 상태에 대해 결론을 내릴 수도 있게 한다.

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전세계의 약 3억5천만 명에 영향을 미치며, 간 질환 중에서도 선두 원인에 해당한다(Rehermann 2005). 수평적, 수직적 전달이 용이하고 간경화와 간세포암종을 야기할 수 있는 만성 질병에 대한 잠재성 때문에 HBV는 전세계의 많은 국가의 공중 보건 시스템에 중대한 영향을 미친다. HBV 게놈(Previsani 2002)은 부분적으로 이중 가닥의 고리형 DNA로 구성되어 있다. HBV 바이러스 비리온에서, 이는 코어 단백질 HBc 및 다른 단백질과 함께 포장되어 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 형성하고, 이는 지질을 함유하는 외피와 표면 단백질족 HBs(막 단백질로도 불림)에 둘러싸인다. HBc 및 HBs와 연관된 항원 결정기는 각각 HBcAg와 HBsAg로 언급된다. 이 항원들은 혈청학과 관련이 있다. 즉, 인간 혈액에서 발견되는 항원 반응이고, HBV 감염 진단을 위한 임상적으로 가장 유용한 항원 항체 시스템이다. 이전에 HBV 감염 기록이 없는 모든 개인에게 HBc는 새로운 외부 항원을 제시하게 된다. 이 항원에 대한 면역 펩티드가 잘 알려져 있기 때문에(Bertoletti 1993; Livingston 1997), HBcAg에서 나온 하나의 10개 아미노산 펩티드가 IMA 내에서 양성 대조군 항원으로 선정되었다. 따라서 HBc 펩티드 특이적 CTLs 유도는 환자의 면역 적합성과 성공적 접종의 지표로써 사용될 것이다.

암 환자에서의 면역요법은 특히 면역계의 세포, 특히 종양 세포에 대항하나 건강한 세포에는 대항하지 않는 세포독성 T 세포(CTL, "킬러 세포"로도 알려져 있고, CD8 양성 T 세포로도 알려짐)의 활성화를 목표로 한다. 종양세포는 종양 관련 단백질 발현으로 인해 건강한 세포와 구별된다. 세포 표면의 HLA 분자는 외부에 세포 내용물을 제시하여 세포독성 T 세포가 건강한 세포와 종양 세포를 식별할 수 있도록 한다(Rammensee 1993). 이는 세포 내에서 모든 단백질을 짧은 펩티드로 분해하고, 이것이 나중에 HLA 분자에 부착되어 세포 표면에 제시됨으로써 실현된다. 종양 세포에서는 제시되지만, 신체의 건강한 세포에서는 제시되지 않거나 훨씬 낮은 범위까지 제시되는 펩티드가 종양 관련 펩티드(TUMAPs)로 불린다.

종양 관련 펩티드를 사용하는 첫번째 임상 시험은 부운(Boon)과 그 동료들에 의해 흑색종 위주로 1990년대 중반에 시작되었다. 최상의 임상시험 중에서 임상 반응은 10% 내지 30%였다. 펩티드 기반의 백신 단일요법을 이용한 임상시험 어디서도 심각한 부작용이나 심각한 자가면역은 보고되지 않았다. 흑색종 관련 펩티드로 치료했던 일부 환자들에 대해 경미한 형태의 백반증이 보고되었다.

그러나 대개 한종류의 CTL만 주입하는 것은 모든 종양 세포를 제거하는데 충분하지 않다. 종양들은 매우 변이성이 있어서 CTL의 인식을 회피하기 위해 그들의 단백질 패턴을 바꿔 CTL 공격에 신속하게 반응할 수 있다. 종양 회피 기전을 맞공격하기 위해 다양한 특이적 펩티드가 접종에 사용된다. 이런 방식으로 광범위한 동시 공격이 동시에 여러 CTL 클론에 의해 종양에 대항하는 공격이 이루어질 수 있다. 이는 종양이 면역 반응을 회피할 가능성을 감소시킬 수 있다. 이 가설은 최근 흑색종 말기 단계 환자들을 치료하는 임상 연구에서 확인되었다. 소수의 예외가 있었지만, 최소 3가지 분명한 T 세포 반응을 보였던 환자들은 긍정적인 임상 반응 또는 안정 병변을 보였고(Banchereau 2001), 생존율도 상승하였으나(personal communication with J. Banchereau과의 개인적 연락에 따르면), 반면 3가지 이하의 T 세포 반응을 가진 환자들은 대부분 병변이 진전되는 것으로 진단받았다.

현재까지 II형이나 I형 처리 경로로 항원을 향하게 하는 것을 목표로 하는 수많은 전략들이 소개되었다. 항원 제시 세포(APC)를 관심 있는 항원과 배양하여 이들이 함께 취해지고, 처리되도록 하는 것이 가능하다(Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778. Dengjel J, Schoor O, Fischer R, Reich M, Kraus M, Muller M, Kreymborg K, Altenberend F, Brandenburg J, Kalbacher H, Brock R, Driessen C, Rammensee HG, Stevanovic S. 자가포식현상(autophagy)이 세포내 원천 단백질로부터 펩티드의 MHC II형 제시를 촉진함. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 May 31;102(22):7922-7). 다른 전략들은 리포솜 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 사용한다. APC에서 발현된 이런 융합 단백질은 항원이 II형 처리 구획을 향하게 한다(Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell Biol. 131, 351 369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430).

단백질이 세포독성 T 림프구에 의해 종양 특이적 항원으로써 인식되고 치료법에 사용되기 위해서는 특정한 필요요건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포에 의해 발현되고, 정상적인 건강한 조직에서는 발현되지 않거나 소량으로 발현되어야 한다. 각 항원이 한 종류의 종양에서만 제시될 뿐 아니라 높은 농도(예: 세포 당 복사수)로 제시되는 것이 더욱 바람직하다. 종양 관련 항원에서 유래된 이러한 펩티드("면역학적 펩티드")가 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응을 야기해야만 하므로 항원의 아미노산 서열 내에 항원결정인자가 필수적으로 존재해야 한다.

환자들의 약 30% 가량은 전이 병변이 있으며, 환자의 25%는 국소적으로 진행된 종양을 가지고 있다. 외과적 절제를 받는 개인의 40%에서는 결국 전이가 나타날 것이다. 전이 병변이 있는 개인들 중에서 약 75% 정도는 폐로 전이되고, 36%는 림프절 및 연조직 병발, 20%는 골 병발, 18%는 간 병발을 보인다. 5년 생존율은 롭손(Robson) 단계 등급에 따라 달라진다. 모두 합쳐 RCC는 환자의 80% 가량에서 여전히 치명적이다(Senn HJ, Drings P, Glaus A, Jungi WF, Pralle HB, Sauer R, 그리고 Schlag PM. Checkliste Onkologie, 5th edition. Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York (2001), Vokes EE, 그리고 Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)).

TNM에 따라 실시되고 있는 신장 세포 암종의 분류는(Guinan P. 신장 세포 암종의 TNM 단계. '신장 세포 암종의 진단과 예후: 1997 워크샵'에 소개되었음, Rochester, Minnesota, March21 22, Communication of the UICC-Union Internationale Contre le Cancer, 그리고 AJCC American Joint Committee on Cancer, ASC American Society Cancer (1997) 발표, Communication of the UICC) 하기 표 A 및 B를 참조하기 바란다.

*미국 비뇨기 질병 재단(American Foundation for Urologic Disease)

RCC의 표준 치료로는 (모든 단계에 대한) 근본적인 신장절제술이 있다. 방사선 요법은 암 확산을 줄이는데 사용될 수 있으나, 신장 세포 암종은 방사선에 주로 내성을 보인다. 호르몬 요법은 일부 경우(10% 이하)에서 종양 성장을 줄일 수 있다. 현재까지 화학요법은 본 질환에서 어떤 유의미한 활성도 보이지 않았다. 빈블라스틴(vinblastine)과 5-FU (5-플루오로우라실), 플록스우리단(floxuridane) (FUDR)이 가장 많이 연구되는 화학요법제이지만 5-FU와 이의 대사산물인 FUDR만이 10-12%의 활성 비율을 입증하였다(Vokes EE, 그리고 Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)). 겜시타빈(Gemcitabine)과 5 FU의 조합은 17%의 반응 비율을 나타내었다.

알파 인터페론(IFNα)이나 인터루킨-2(IL-2)와 같은 면역 치료는, 진행된 RCC 치료를 위해 미국과 유럽의 허가 기관에 의해 최근 몇 년간 평가되었다. 높은 용량의 IL-2 치료는 현재까지 미 식품의약국(FDA)에서 유일하게 허가받은 면역 요법이다. IFNα 단일요법은 초기에는 25-30%의 반응 비율을 갖는 것으로 보고되었으나, 여러 추가 시험 결과 단지 약 10%의 참 반응 비율을 갖는 것으로 나타났다(Vokes EE, 그리고 Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)). IL-2는 약 5%의 환자가 항구적 완전 완화를 가 달성하여 IFNα와 유사한 총 반응 비율을 나타내는 것으로 보인다(Rosenberg 1987). 진행된 RCC가 있는 6,000명 이상의 환자들을 대상으로 한 최근 메타분석에 따르면, 평균적으로 시토킨 요법(예: IFN-alpha, 고용량 IL-2 일시 주사 또는 IL-2 흡입)을 이용하는 경우 단지 12.9%의 임상 반응율에 도달할 수 있는 것으로 나타났다. 동일한 분석에 따르면 위약 검사에서는 4.3%의 반응이, 비면역요법 대조군 부문(arms)에서는 2.5%의 반응을 보였다(Cochrane Database Syst Rev. 2000;(3):CD001425. 진행된 신장 세포 암에 대한 면역요법. Coppin C, Porzsolt F, Awa A, Kumpf J, Coldman A, Wilt T).

여러 종양에서 새로운 요법들이 임상적 효능을 보이고 최근 몇 년간 승인을 받았음에도 불구하고, 신장 세포 암종에 대한 생존율은 지난 10년 내 크게 변하지 않았다. 현재 가능한 전신 치료 옵션인 화학요법뿐 아니라 면역 치료는 비교적 낮은 효능 결과를 보였고 더 중요한 것은 유의한 신체 독성으로 인해 제한된다는 것이다. 결과적으로 신장 세포 암종에서 새로운 치료 옵션에 대한 잠재적인 의료적 필요성이 존재하게 되는 것이다.

보조 T 세포는 항종양 면역에서 CTL의 효과기 기능을 조율하는 데에 중요한 역할을 한다. TH1형의 보조 T 세포 반응을 유발하는 보조 T 세포 항원결정인자는 CD8 양성 킬러 T 세포의 효과기 기능을 돕는데, 여기에는 종양 관련 펩티드/MHC 복합체들을 세포 표면에 나타내는 종양 세포에 대항하는 세포독성 기능이 포함된다. 이런 식으로 종양 관련 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자는 단독으로 또는 다른 종양 관련 펩티드와 병행하여, 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 활성 제약 성분으로 제공될 수 있다.

따라서 종양 백신 개발에 있어 주요 목적은, CD8 양성 T 세포나 CD4 양성 T 세포, 특히 T_H1형 CD4 양성 T 세포에 의해 인식되는, 새로운 종양 관련 항원과 거기서 유래된 면역 보조 T 항원결정인자를 파악하고 특징을 부여하는 것이다. 따라서 본 발명의 목적은 주요 조직 적합 복합체(MHC) I형 (HLA I형) 또는 II형 (HLA II형)의 분자에 결합하는 능력을 가진 펩티드를 위한 새로운 아미노산 서열을 제공하는 것이다. 더 나아가 본 발명은 언급한 새로운 펩티드를 기반으로 하여 적어도 일부에서 효력있는 항암 백신을 제공하는 것 역시 목표로 한다.

본 발명에 따르면, 첫번째 목적은 첨부된 서열 리스트의 서열번호 1이나 서열번호 2 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 서열을 포함하는 펩티드군에서 선정된 종양 관련 펩티드를 제공함으로써 해결되는데, 여기에서 하나의 펩티드는 인간 주요 조직 적합 복합체(MHC) II형 (HLA II형)의 분자에 결합하는 능력이 있고 다른 하나는 인간 주요 조직 적합 복합체(MHC) I형 (HLA I형)의 분자에 결합하는 능력이 있고, 단 여기서의 펩티드는 완전한 인간 종양 관련 폴리펩티드가 아니어야 한다.
본 발명에서 발명자들은 포유동물의 종양, 바람직하게는 인간 종양, 그리고 가능하다면 신장 세포 암종에서 직접 나온 HLA I형 또는 II형 분자에 결합하는 펩티드를 분리 및 특징지울 수 있음을 증명하고 있다.

본 발명은 종양생성과 관련있는 항원에서 유래되며, 인간 백혈구, 특히 림프구, T 림프구, 특히 CD4 양성 T 림프구, 특히 T_H1 면역 반응을 중개하는 CD4 양성 T 림프구의 면역 반응을 유발하기 위해 HLA II형 분자에 충분히 결합하는 능력을 가진 펩티드를 제공한다.

또한 본 발명은 종양생성과 관련있는 항원에서 발생하며, 인간 백혈구, 특히 림프구, 특히 T 림프구, 특히 CD8 양성 세포독성 T 림프구의 면역 반응 유발을 위해 HLA I형 분자에 충분히 결합하는 능력을 가진 펩티드를 제공한다.

펩티드는 종양 관련 항원, 특히 단백질 분해와 혈관 생성, 세포 성장, 세포 주기 조절, 세포 분열, 전사 조절, 번역 조절, 조직 침범 등의 기능을 하는 종양 관련 항원에서 발생하고, 예를 들면 특히 메탈로프로테이네스 7(MMP7; 서열번호 1)와 아포지단백 L1(APOL1; 서열번호 4)에서 얻은 종양 관련 펩티드를 포함한다.

본 발명에서 발명자들은 HLA II형 분자, 특히 인간 유전자의 HLA-DR 좌에 의해 유전자적으로 인코딩된 HLA II형의 대립형질에 무차별적으로 충분히 결합하는 종양 관련 펩티드가 인간 CD4 양성 T 세포에 의해 매개된 면역 반응을 유발할 수 있다는 결정적인 사례를 제공하고 있다. CD4 양성 T 세포는 인간 말초혈액으로부터 분리되었으며, 이는 상기 펩티드가 종양 세포 펩티돔의 선택된 펩티드에 대한 인간 면역계의 T 세포 반응을 유발하기에 적합하다는 것을 증명한다. 하단에 MMP7(서열번호 1)에서 얻은 펩티드의 예와 같이, 무차별적으로 HLA-DR 결합되는 종양 관련 펩티드는 CD4 양성 T 세포에 의해 인식되는 것으로 나타났다.

유사하게도 HLA I형 분자에 충분히 결합되는 종양 관련 펩티드는 인간 CD8 양성 세포독성 T 림프구에 의해 매개된 면역 반응을 유발할 수 있는 것으로 나타났으며, 상기 펩티드는 또한 종양 세포 펩티돔의 선택된 펩티드에 대항하는 인간 면역계의 반응을 유발하기에 적합함을 증명한다.

펩티드는 화학적으로 합성되고 약학 제제의 활성 성분으로써 사용될 수 있으므로 본 발명에서 제공된 펩티드는 면역요법, 특히 암 면역요법에 사용될 수 있다.

펩티드 기반의 면역요법 개발을 위해 TAA에서 HLA I형 또는 II형을 확인하기 위해 발명가들은 고형 종양, 특히 신장 세포 암종(RCC)에서 직접 펩티드 분리를 시도하였다(하기 실시예 참조).

이러한 개념의 기술적 증거를 입증하기 위해 RCC에 초점을 맞춘 이유는 다음과 같다. 전세계 약 15만 명이 해마다 신규 진단을 받고 있는 RCC는 매년 약 78,000건의 높은 사망률을 보인다(Pavlovich, C.P. 그리고 L.S. Schmidt. 2004. 신장 세포 암종의 유전적 원인 규명. Nat. Rev. Cancer 4:381-393). 전이가 진단되면 1년 생존율은 약 60%로 하락하고(Jemal, A., R.C. Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E.J. Feuer, 그리고 M.J. Thun. 2004. Cancer statistics, 2004. CA Cancer J. Clin. 54:8-29), 이는 이 적응증에서의 만족되지 않은 높은 의학적 필요성을 명확하게 나타낸다. RCC는 종양 반응 및 종양 침윤성 CTL의 존재에 의해 암시되는 바와 같이(Finke, J.H., P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R.R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes, 그리고 R. Bukowski. 1990. 인간 신장 세포 암종 내 CD4+ 및 CD8+ 종양 침윤 림프구의 세포 용해 활동의 특징. Cancer Res. 50:2363-2370) 면역원성 종양으로 여겨지므로(Oliver RTD, Mehta A, Barnett MJ. 전이된 신장 세포 암종이 있는 환자들을 대상으로 한 감시 및 진행 시 치료하는 환자들의 반응을 평가하는 제 2상. Mol Biother. 1988;1:14 20. Gleave M, Elhilali M, Frodet Y, 외. 전이 신장 세포 암종에 대한 감마인터페론 1b(Interferon gamma 1b)와 위약 비교. N Engl J Med. 1998;338:1265), 펩티드 기반의 항암 백신 개발을 위한 임상 시험이 착수되었다(Wierecky J, Mueller M, Brossart P. MUC 1을 표적으로 하는 수지상세포 기반 암 면역요법. Cancer Immunol Immunother. 2005 Apr 28). 그러나 종양 관련 항원에서 나온 보조 T 세포 항원결정인자가 없기 때문에 분자적으로 규명된 백신은 대개 I형 리간드만으로써 기능하는 펩티드를 포함한다.

본 발명의 두번째 목적은 약학 제제를 제공함으로써 해결되는 것으로, 암 세포, 특히 고형 종양 세포에 대해 효과적인 백신 형태이며, 본 발명에 따른 펩티드의 효과적인 용량을 포함하거나 그러한 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 또한, 백신은 보다 효과적이기 위해 펩티드 및 부형제를 추가로 함유할 수 있으며, 이는 하단에 자세히 설명된다.

펩티드 또는 펩티드를 인코딩하는 핵산도 종양 또는 암 백신의 구성 요소가 된다. 이것은 환자에게 직접 투여되거나, 영향받은 장기 혹은 전신으로, 또는 환자나 인간 세포주에서 유래된 세포(이는 후속적으로 환자에게 투여된다)에 생체 외 적용되거나, 또는 환자에서 유래된 면역 세포(이는 나중에 환자에게 재투여된다)에서 나온 소집단을 선택하기 위해 생체 외 사용될 수 있다.

본 발명의 첫번째 양태에서 펩티드는 서열번호 1 (SQDDIKGIQKLYGKRS) 또는 서열번호 2 (VMAGDIYSV) 또는 그 변이에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 단 이 펩티드는 이 아미노산 서열이 유래된 완전한 인간 폴리펩티드(즉: 유전자좌 링크 ID에 열거된 대로 전체 길이 서열 중 하나)가 아니어야 한다 (수납 번호, 하기 표 1 참조).

하기에 설명된 대로, 본 발명의 기초를 형성하는 펩티드는 모두 MHC I형 또는 II형 부하 세포(RCC)에 의해 제시되는 것으로 확인되었다. 따라서 이들 특정 펩티드 뿐 아니라 서열을 함유한 기타 펩티드(예: 유래된 펩티드)는, 유발될 이런 반응 정도가 개별 펩티드마다 다양할 수는 있지만, 모두 특이적 T 세포 반응을 유발한다. 예를 들면, 언급된 펩티드의 돌연변이(하단 참조)로 인해 차이점이 발생할 수 있다. 당해 분야의 전문가는, 특히 본문의 실시예 및 관련 참고 문헌에 따라 각각의 펩티드에 의해 유발되는 반응 정도를 측정하는데 적용될 수 있는 방법을 잘 인지하고 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 펩티드는 본질적으로 서열번호 1이나 서열번호 2 또는 그 변이에 따른 아미노산 서열로 구성되어 있다.

"본질적으로 구성"되어 있다는 것은 본 발명에 따른 펩티드가 서열번호 1이나 서열번호 11 또는 그 변이에 따른 서열 외에도, 결합 모티프를 포함하는 펩티드의 핵심 서열과 면역 보조 T 항원결정인자로 작용하는 펩티드의 일부를 형성하는데 반드시 필요하지는 않는 아미노산의 N 또는 C 말단에 위치한 신장부를 추가로 함유함을 의미한다.

그럼에도 불구하고 이런 신장부는 본 발명에 따른 펩티드를 세포에 유효하게 도입하기 위해서 중요할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 펩티드는 NCBI, GenBank Accession number X00497에서 유래된 HLA-DR 항원-유래된 불변사슬의 80개 N 말단 아미노산(p33, 하단 "Ii")을 포함한다(Strubin, M., Mach, B. 그리고 Long, E.O. HLA-DR 관련 불변사슬에 대한 mRNA 완전 서열은 비정상적 막 극성 EMBO J와 폴리펩티드를 드러냄. 3 (4), 869-872 (1984)).

예를 들어, 상기 아미노산 서열의 "변이"란, 주어진 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 실질적으로 동일한 방법으로 펩티드가 HLA 분자에 결합할 수 있도록 하나 또는 두 가지 아미노산 잔기의 측쇄가 교체(예를 들어, 자연적으로 발생하는 다른 아미노산 잔기의 측쇄 또는 일부 다른 측쇄로 교체함으로써)됨을 의미한다. 예를 들어, HLA II형 분자의 경우에는 HLA-DRB1, 또는 I형 분자의 경우에는 HLA A2와 같은 적합한 MHC 분자와 상호작용하고 결합하는 능력을 (개선하지는 않더라도) 적어도 유지할 수 있도록 펩티드가 개질될 수 있으며, 본 발명의 다른 양태에서 규정된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있는 활성화된 CTL을 생성하는 능력 또는 CD8 양성 T 세포를 돕거나 시토킨을 분비하여 표적 세포를 직접 공격하도록 도움을 줄 수 있는 보조 T 세포를 자극하는 능력을 (개선하지는 않더라도) 적어도 유지할 수 있도록 펩티드가 개질될 수 있다. 하기 설명한 바와 같은 데이터베이스에서 얻을 수 있는 바와 같이, HLA-DR 결합 펩티드의 특정 위치는 일반적으로 HLA 결합 그루브의 결합 모티프에 핵심 서열이 부합하도록 하는 고정(anchor) 잔기이다. 이 잔기 및 HLA-DR 결합과 관련된 다른 잔기를 변화시키면 CTL 인식을 변경시키지 않고서 결합을 증진할 수 있다.

T 세포 수용체와 상호작용하는데 필수적이지 않은 아미노산 잔기는 다른 아미노산으로 교체되어 개질될 수 있는데, 이 아미노산의 편입은 결과적으로 T 세포 반응성에 영향을 주지 않으며 관련 MHC와의 결합을 제거하지 않는다. 따라서 주어진 프로비소(proviso)와는 별개로, 본 발명의 펩티드는 주어진 아미노산 서열 또는 이의 일부나 변이를 포함하는 임의의 펩티드(올리고펩티드(oligopeptide)나 폴리펩티드(polypeptide)를 포함한다)일 수 있다.

특정 HLA 특이적 아미노산 모티프를 갖는 "핵심 서열", 및 선택적으로는 핵심 서열의 기능을 방해하지 않는(즉, 펩티드와 T 세포의 상호작용과 무관한 것으로 간주) N-말단 연장부 또는 C-말단 연장부로 구성된 펩티드가 또한 MHC II형 제시 펩티드로 알려져 있다. N-말단 연장부 또는 C-말단 연장부는 각각 1 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있다. 그러므로 본 발명의 바람직한 펩티드 길이는 전반적으로 9 내지 100개이며 가급적 9 내지 30개이고, 9 내지 16개 아미노산이 가장 선호된다. 이들 펩티드는 MHC II형 분자를 로딩하기 위해 직접 사용하거나, 하단의 설명에 따라 서열이 벡터로 클로닝될 수 있다. 이들 펩티드들이 세포 내부에서 더 큰 펩티드 처리의 최종 산물을 형성하므로, 보다 긴 펩티드도 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 어느 크기라도 가능하지만, 바람직하게는 50,000 Da 이하, 보다 바람직하게는 10,000 Da 이하, 일반적으로 5,000 Da 정도인 100,000 Da 이하의 분자량일 수 있다. 아미노산 잔기의 수의 경우, 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 500개 미만의 잔기, 보다 바람직하게는, 100개 미만의 잔기와 같은 1,000개 이하의 잔기를 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, MHC II형 분자에 대해 상기 설명한 상황과 유사하게, 본 발명의 펩티드는 HLA I형 분자의 핵심 또는 부분 서열을 동시에 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 펩티드는 MHC I형의 특이적 반응을 유발하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 MHC I형 특이적 펩티드는 9 내지 16개, 바람직하게는 9 내지 12개의 아미노산 전체 길이를 나타낸다. MHC II형 펩티드와 유사하게, 이런 펩티드들이 (예를 들면 백신에서) 더 긴 펩티드로써 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. HLA I형 분자를 위한 특정 HLA 특이적 아미노산 모티프를 갖는 MHC I형 특이적 "핵심 서열"을 확인하는 방법은 전문가들에게 알려져 있으며, 예를 들면 컴퓨터 프로그램 PAProC (http://www.uni tuebingen.de/uni/kxi/) 및 SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de)으로 예측이 가능하다(하단 참조).

본 발명의 펩티드는 T 세포가 본 발명의 펩티드의 기초를 형성하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 인식할 수 있도록 하는 면역요법 방식에서 특히 유용하다. 주어진 아미노산 서열로 구성되는 이런 특이적 펩티드가 HLA I형이나 HLA II형 분자에 결합하므로, 본 발명의 펩티드는 HLA I형이나 HLA II형 분자에 결합하며, 이렇게 결합하였을 때 HLA 펩티드 복합체가 적절한 항원 제시 세포의 표면에 제시되어, 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 인식하는 T 세포의 자극을 유발할 수 있는 것이 바람직하다.

약 12개 아미노산 잔기 보다 더 큰 펩티드가 MHC 분자에 직접 결합하는데 사용된다면, 핵심 HLA 결합 영역의 측면에 있는 잔기는 특히 MHC 분자의 결합 그루브에 특이적으로 결합하거나 T 세포에 펩티드를 제시하는 펩티드의 능력에 결과적으로 영향을 주지 않는 것이 선호된다. 그러나 상기에 이미 설명한 바와 같이, 이런 더 큰 펩티드가 적절한 항원 제시 세포에 의해 분해될 수 있으므로, 더 큰 펩티드가, 특히 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 때, 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

MHC 리간드의 펩티드, 모티프, 변이의 예뿐만 아니라 N 말단 연장부 및 C-말단 연장부의 특정 예는 http://syfpeithi.bmi heidelberg.com/의 데이터베이스 SYFPEITHI(Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: MHC 리간드와 펩티드 모티프 데이터베이스. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3 4):213 9. Review.)와 본문에 인용된 참고 문헌에서 얻을 수 있다.

비제한(non-limiting) 예로써, 데이터베이스 내의 HLA-DR에 대한 특정 펩티드로는 Ig kappa 사슬 188-203에서 얻어진 K H K V Y A C E V T H Q G L S S(Kovats 외. Eur J Immunol. 1997 Apr;27(4):1014-21); Ig kappa 사슬 145-159에서 얻은 K V Q W K V D N A L Q S G N S (Kovats 외. Eur J Immunol. 1997 Apr;27(4):1014-21), GAD65 270-283에서 얻은 L P R L I A F T S E H S H F(Endl 외. J Clin Invest. 1997 May 15;99(10):2405-15) 또는 GAD65 556-575에서 얻은 F F R M V I S N P A A T H Q D I D F L I(Endl 외. J Clin Invest. 1997 May 15;99(10):2405-15)이 있다. 그 외에 펩티드는 bcr-abl 210 kD 융합 단백질에서 얻은 A T G F K Q S S K A L Q R P V A S의 경우나(ten Bosch 외. Blood. 1996 Nov 1;88(9):3522-7), HCV-1 NS3 28-41에서 얻은 G Y K V L V L N P S V A A T(Diepolder 외. J Virol. 1997 Aug;71(8):6011-9), 또는 HIV-1 (HXB2) RT 326-345에서 얻은 F R K Q N P D I V I Q Y M D D L Y V G(van der Burg 외. J Immunol. 1999 Jan 1;162(1):152-60)과 같은 항원의 돌연변이된 서열에서도 얻을 수 있다. 모든 "고정" 아미노산(Friede 외 참조, Biochim Biophys Acta. 1996 Jun 7;1316(2):85-101; Sette 외. J Immunol. 1993 Sep 15;151(6):3163-70.; Hammer 외. Cell. 1993 Jul 16;74(1):197-203., 그리고 Hammer 외. J Exp Med. 1995 May 1;181(5):1847-55. As examples for HLA-DR4)은 볼드체로 표시되고, 잠정적 핵심 서열에는 밑줄이 그어져 있다.

상기에 설명된 모든 펩티드는 주어진 아미노산 서열의 "변이"라는 용어에 포함된다.

"펩티드"에는 펩티드(-CO-NH-) 결합에 의해 연결되는 아미노산 잔기 분자뿐만 아니라, 펩티드 결합이 역전된 분자까지도 포함된다. 이러한 리트로-인버소-펩티도미메틱(retro-inverso-peptidomimetics)은, 본문에 인용된 참고문헌으로 Meziere 외 학자들이 1997년에 J. Immunol. 159,3230-3237에 밝힌 것과 같은 기술적인 방법으로 만들어진 것이다. 이 접근법은 주쇄는 변화되지만 측쇄의 배향은 변화되지 않는 가성펩티드(pseudopeptide) 제작을 포함한다. Meziere 외(1997)는 최소한 MHC II형과 보조 T 세포 반응에 대해서, 이러한 가성펩티드가 효과적이라고 보았다. 리트로 인버소 펩티드는 CO-NH 펩티드 결합이 아닌 NH-CO 결합을 포함하며, 단백질 가수분해에 비교적 저항력이 세다.

본 발명의 펩티드는, 만약 항원제시세포에서 발현될 경우, 가공되어 그 조각이 적절한 MHC 분자에 결합하고 적절한 세포에 의해 제시된 후 최종적으로 바람직한 T 세포 반응을 꾀하게 되는 것이다. 본 펩티드로부터 만들어진 조각이 또한 본 발명의 펩티드가 되는 것으로 인식될 것이다. 본 발명의 펩티드는 이미 주어진 아미노산 서열 혹은 그 일부나 그 변이를 포함하는 부위를 갖고 있고 이외에 일부 바람직한 성질을 부여하는 추가 부위를 함유한다. 예를 들어, 추가 부위는 T 세포 항원결정인자(제 1 T세포 항원결정인자-함유 부위와 동일한 폴리펩티드에서 유래되었거나 유래되지 않았던지 간에)를 추가적으로 가질 수도 있고 또한 운반 단백질 혹은 펩티드를 포함할 수도 있다. 따라서, 한 양태에서 본 발명의 펩티드는 절단된 인간 단백질이거나 또는 단백질 절편과 다른 폴리펩티드 부분의 융합 단백질이고, 단, 인간 부분이 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열을 포함해야 한다.

특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 펩티드는 본 발명의 아미노산 서열, 및 비정상적으로 종양 관련 항원(TAA)을 발현하는 특정한 종양에 대해 T 세포 반응 생성을 촉진할 수 있는 하나 이상의 추가 T 세포 항원결정인자 부위를 포함한다. 따라서, 본 발명의 펩티드를 백신으로도 사용될 수 있는 소위 "실에 꿴 염주알(beads on a string)" 폴리펩티드라 부른다. 이러한 펩티드는 화학적 링커에 의해 분리될 수 있는데 이러한 화학적 링커는 아미노산(예: G stretches)을 포함할 수도 있으나, 추가적 혹은 대용으로 화학적 링커 기(즉 특정한 간격을 제공하는 것을 제외하고는 기능을 보유하지 않음)를 포함할 수 있다.

앞서 언급한 "비정상적으로 발현되는"이란 단어는 1) 유전자가 종양에서는 발현하나 종양이 유래한 조직에서는 발현되지 않는 경우 혹은 2) 정상적인 발현 수준과 비교해서 폴리펩티드가 과발현되는 경우에 사용되는 말이다. "과발현"이라는 단어는 폴리펩티드가 정상 조직보다 최소한 1.2배 수준으로 많이 존재할 때 (보다 적절하게는 2배 혹은 5배나 10배 수준으로 더 많이 존재할 때) 쓰인다.

펩티드(적어도 아미노산 잔기 사이에 펩티드 연결을 포함하는 펩티드)는 본 참고문헌에 있는 Lu 외 (1981) J. Org. Chem. 46,3433-3436에 의해 밝혀진 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-폴리아미드 방식으로 합성될 수 있다. 일시적인 N-아미노기 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(fluorenylmethyloxycarbonyl) (Fmoc)기에 의해 이루어진다. 이러한 염기에 매우 취약한 보호기의 반복적인 분할이 N, N-디메틸포름아미드 중의 20 % 피페리딘을 사용하여 달성된다. 측쇄 작용기는 이의 부틸 에테르(세린, 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카르보닐 유도체(리신 및 히스티딘의 경우), 트리틸 유도체(시스테인의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐 유도체(아르기닌의 경우)로 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단 잔기인 경우, 측쇄 아미노 작용기를 보호하기 위해 4,4'-디메톡시벤즈히드릴 기가 이용된다. 고체상 지지체는 3가지 모노머인 디메틸아크릴아미드(백본-모노머), 비스아크릴로일에틸렌 디아민(교차 연결) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르(작용화제)로 구성된 폴리디메틸-아크릴아미드 폴리머에 근거한다. 사용된 펩티드-대-수지의 분할가능한 연결 성분은 산에 취약한 4-히드로메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 이미 형성된 대칭적 무수물 유도체로써 첨가되며, 아스파라긴 및 글루타민은 예외적으로 역 N,N-디시클로헥실-카르보디이미드/1히드록시벤조트리아졸 매개의 커플링 절차를 이용하여 첨가된다. 모든 커플링 및 탈보호 반응은 닌히드린, 트리니트로벤젠 설폰산 또는 이소틴 검사 절차를 사용하여 모니터링 된다. 합성 완료시, 50% 소거제 혼합물을 포함한 95% 트리플루오로아세트산으로 처리하여 측쇄 보호기를 제거하면서 동시에 수지 지지체로부터 펩티드를 분할한다. 일반적으로 사용되는 소거제는 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물이며, 합성되는 펩티드의 구성 아미노산에 따라 정확한 선택이 결정된다.

진공상태에서 증발시켜 트리플루오로아세트산이 제거되는데, 후속적으로 디에틸에테르로 저작하여 조질 펩티드를 제공한다. 존재하는 임의의 소거제는 단순한 추출에 의해 제거되고, 이는 수성 상의 동결건조시 소거제가 없는 조질 펩티드를 제공한다. 펩티드 합성에 쓰이는 용액들은 보통 Calbiochem Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK에서 구입 가능하다.

정제과정은 크기배제 크로마토 그래피(SEC), 이온교환 크로마토그래피(IEC), 그리고 역상 고성능액체 크로마토그래피(HPLC)나 혹은 이의 조합에 의해 수행될 수 있다.

펩티드 분석은 MALDI, ESI-Q TOF 질량분광분석법은 물론, 박막 크로마토그래피(TLC), 역상 고성능액체 크로마토그래피(HPLC), 산 가수분해 후 아미노산 분석, 고속원자충돌법(FAB), 질량분광분석법을 통해 이루어진다.

본 발명의 추가 양태는 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 핵산(예: 폴리뉴클레오티드)을 추가적으로 제공한다. 본 발명에 따른 핵산은 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA나 이들의 재조합산물인데, 이들은, 펩티드를 코딩하는 한, 인트론 부위를 가질 수도 갖지 않을 수도 있다. 물론, 천연 펩티드 결합으로 결합된 (천연) 아미노산 잔기를 포함하는 것만이 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 본 발명의 추가 양태는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터이다.

상보적 점착성 말단을 통해 폴리뉴클레오티드, 특히 DNA를 벡터에 연결하기 위해 다양한 방법들이 사용되었다. 예를 들어, 상보적 동종 중합체 트랙을 벡터 DNA로 삽입될 DNA 분획에 첨가시킬 수 있다. 그런 다음, 상보적인 동종 중합체 꼬리 사이의 수소 결합에 의해 연결시켜 재조합 DNA 물질을 만들 수 있다.

하나 이상의 제한 부위를 함유하는 합성링커는 DNA 절편을 벡터에 연결시키는 다른 방안을 제공한다. 앞서 서술한 대로 엔도뉴클레이스 제한효소분해(endonuclease restriction digestion)로 생성된 DNA 절편을 박테리오파지 T4 DNA 중합효소나 대장균 DNA 중합효소 I (3'-5'-핵산말단분해활성 기능으로 3'-단사슬 말단을 제거하는 효소)로 처리한 후, 이들의 중합 활성을 이용하여 들어간 3'-말단을 채운다.

따라서, 이들 활성의 조합은 블런트 말단 DNA 절편을 생성할 수 있다. 그 뒤 이 절편을 박테리오파지 T4 DNA 연결효소 같은 블런트 말단 DNA 분자의 연결을 촉진할 수 있는 효소의 존재 하에서, 링커 분자와 항온처리한다. 따라서, 이 반응의 산물은 말단에서 중합링커서열을 갖는 DNA 절편이다. 그런 다음, 이런 DNA 절편들을 적절한 제한효소로 자른 후, 발현 벡터에 연결시킨다.

다양한 제한효소 부위를 포함하는 합성 링커는 International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA에서 구입했다.

본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 개질시키는 바람직한 방법으로는 (Saiki 외 1988, Science 239,487-491) 중합효소연쇄반응(PCR)이 있다. 이 방법은 예를 들면 적합한 제한효소 부위에서 유전자조작함으로써 DNA를 적절한 벡터에 유입하는데 이용될 수 있거나, 또는 이를 당 분야에 공지된 다른 유용한 방식으로 DNA를 개질시키는데 이용할 수 있다. 이 방법에서 효소를 통해 증폭된 DNA는 증폭된 DNA에 혼입되는 두 개의 특정한 프라이머 옆에 위치하게 된다. 상기 특정한 프라이머는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 발현 벡터로 클로닝되는데 이용될 수 있는 제한효소 인식부위를 포함할 수 있다.

그런 다음, DNA (혹은 레트로바이러스 벡터인 경우에는 RNA)를 적당한 숙주에서 발현시켜 본 발명의 화합물을 포함하는 폴리펩티드를 생성한다. 따라서, 본 발명의 화합물을 구성하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA는 공지된 기법에 따라 사용되고 본원에 함유된 개시내용에 따라 적절히 개질되어 발현 벡터를 구성하고, 이는 다시 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및 생성을 위한 적절한 숙주 세포로 형질전환된다. 그러한 기술은 다음의 미국 특허에 개시되어 있다. 4,440,859 Rutter 외 1984년 4월 3일 발행, 4,530,901 Weissman 1985년 7월 23일 발행, 4,582,800 Crowl 1986년 4월 15일 발행, 4,677,063 Mark 외 1987년 6월 30일 발행, 4,678,751 Goeddel 1987년 7월 7일 발행, 4,704,362 Itakura 외 1987년 11월 3일발행, 4,710,463 Murray 1987년 12월 1일 발행, 4,757,006 Toole, Jr. 외 1988년 7월 12일 발행, 4,766,075 Goeddel 외 1988년 8월 23일 발행, 4,810,648 Stalker 1989년 3월 7일 발행된 문헌들 모두 여기에 참고문헌으로 이용되었다.

본 발명의 화합물을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA (혹은 레트로바이러스 벡터인 경우에는 RNA)는 적절한 숙주에 도입하기 위해 다양한 DNA 서열에 결합될 수 있다. 이 동반 DNA는 1) 숙주 특성과 2) 숙주에 DNA를 도입하는 방식, 그리고 3) 에피솜 유지나 상호작용이 필요한지 여부에 따라 달라진다.

일반적으로, DNA는 발현을 위한 적절한 배향 및 정확한 리딩 프레임으로 플라스미드와 같은 발현 벡터들에 삽입된다. 필요한 경우, DNA는 원하는 숙주에 의해 인식되는 알맞은 전사 및 번역 제어 조절 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있으나, 그와 같은 조절은 발현 벡터에서 일반적으로 가능하다. 그런 다음, 벡터를 표준 기술을 통해 숙주에 도입한다. 일반적으로 모든 숙주들이 벡터에 의해 형질전환이 되는 것은 아니므로, 먼저 형질전환될 숙주세포를 선택하는 일이 필수적이다. 한가지 선택 기법은 항생제 내성과 같은 형질전환된 세포에 선택가능한 특성을 코딩하는 임의의 필요한 조절 요소와 함께 DNA 서열을 발현 벡터로 도입하는 것을 포함한다.

대안적으로, 이러한 선별특성을 갖는 유전자가 바람직한 숙주 세포를 동시 형질전환시키는데 이용되는 다른 벡터 상에 있을 수 있다.

본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주세포들은 본원에 개시된 내용을 고려하여 당 분야에 공지된 적절한 조건 하에서 폴리펩티드(이는 나중에 회수될 수 있다)의 발현을 허용하도록 충분한 시간동안 배양된다.

박테리아(예: E. coli, Bacillus subtilis), 효모(예: Saccharomyces cerevisiae), 곰팡이(예: Aspergillus), 식물세포, 동물세포와 곤충 세포 등의 여러 가지 발현 체계가 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 이러한 발현 체계는 RCC 또는 아웰스 세포(Awells cells)일 수 있다.

프로모터란 RNA 중합효소와 결합하여 전사가 일어나는 것을 허용하는 DNA 서열로 구성된 발현 조절 요소이다. 전형적으로 예시적인 박테리아 숙주와 상용성인 프로모터 서열이 본 발명의 DNA 절편의 삽입을 위한 제한 부위를 갖는 플라즈미드 벡터상에 제공된다. 전형적인 원핵생물성 벡터 플라즈미드는 pUC18, pUC19, pBR322 와 pBR329Biorad Laboratories, (Richmond, CA, USA)에서 구입가능하며, pTrc99A 와 pKK223-3는 Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.에서 구입할 수 있다.

전형적인 포유동물 세포 벡터 플라즈미드는 pSVL로 Pharmacia, Piscataway, NJ, USA에서 구입이 가능하다. 이러한 벡터는 클론 유전자의 발현을 유도하기 위해 SV40 레이트(late) 프로모터를 사용하고, 가장 높은 발현 수준은 COS-1 세포와 같은 T 항원 생산 세포에서 발견된다. 유도성 포유류 발현 벡터의 또 다른 예로는 pMSG가 있으며 이는 또한 Pharmacia에서 구할 수 있다. 이 벡터는 클론 유전자의 발현을 위해 생쥐의 유선 종양 바이러스의 긴 말단 반복부의 글루코코르티코이드 유도 프로모터를 사용한다. 유용한 효모 플라즈미드 벡터로는 pRS403-406과 pRS413-416이 있으며 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA에서 구입 가능하다. 플라즈미드 pRS403와 pRS404, pRS405, pRS406는 효모통합 플라스미드(Yips)로 효모선별마커인 HIS3, TRP1, LEU2, URA3가 혼입되어 있다. 플라즈미드 pRS413 416는 효모 동원체 플라스미드(Ycps)이다. 그 밖에 다양한 숙주 세포와 함께 사용하기 위한 다른 벡터와 발현 체계도 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터 구성체로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 숙주세포는 진핵세포 혹은 원핵세포중 어느 하나일 수 있다. 박테리아 세포가 특정한 환경에서 바람직한 원핵 숙주 세포일 수 있고, 전형적으로는 E.coli DH5 균주와 같은 E Coli 균주는 Bethesda Research Laboratories Inc, Bethesda, MD, USA에서 구입이 가능하며, RR1는 American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, USA(No ATCC 31343)에서 구입이 가능하다. 선호되는 원핵성 숙주세포는 효모, 동물, 포유동물 세포를 포함하는데, 특히 생쥐, 쥐, 원숭이나 인간의 섬유아세포와 신장 세포계 같은 척추동물 세포가 더 좋다. 효모 숙주세포에는 YPH499, YPH500와 YPH501 등이 있는데 이들은 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA에서 구입 가능하다. 바람직한 포유동물 숙주세포로는 ATCC에서 CRL 61로 이용가능한 중국햄스터난소(CHO) 세포, ATCC에서 CRL 1658로 구입가능한 NIH 스위스 생쥐 배아세포 NIH/3T, ATCC에서 CRL 1650으로 구입가능한 원숭이의 신장에서 유래한 COS 1 세포 및 인간배아신장세포인 293 세포가 포함된다. 바람직한 곤충세포로는 발현벡터로 도입될 수 있는 바큘로바이러스 Sf9 세포가 있다.

본 발명의 DNA 구축물을 이용하여 적절한 숙주세포를 형질전환시키는 방법은 전형적으로 벡터의 유형에 따른 잘 공지된 방법을 이용하여 달성된다. 진핵성 숙주세포 형질전환의 경우, Cohen 외 (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,2110 와 Sambrook 외 (1989) 분자 클로닝, 실험실 설명서, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY를 참고할 수 있다. 효모세포의 형질전환은 Sherman 외 (1986) 효모 유전학 방법, 실험실 설명서, Cold Spring Harbor, NY에 설명되어 있으며, 벡스 방법 (1978) Nature 275,104-109 또한 유용하다. 척추동물 세포의 경우에는 인산칼슘과 DEAE 덱스트란 또는 리포솜 제형을 이용한 도입(transfection) 방법이 효과적인데 이들은 Stratagene Cloning Systems이나 Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA에서 구입 가능하다. 전기천공법(Electroporation)도 효모세포, 박테리아 세포, 곤충 세포 및 척추동물의 도입(transfection)이나 변환(transformation) 시 효과적인 방법으로 사용된다.

성공적으로 형질전환된 세포, 즉, 본 발명의 DNA 구축물을 함유하는 세포는 이미 알려진 기술로 충분히 식별할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발현 구성물의 도입으로 인해 생성된 세포는 폴리펩티드를 생산할 수 있도록 배양될 수 있다. 이 세포를 수확하여 용해시키고, 세포의 DNA 함량을 Southern (1975) J. Mol. Biol. 98,503나 Berent 외 (1985) Biotech. 3,208 등의 방법으로 조사할 수 있다. 또한, 상층액 중의 단백질을 하기 방식을 참고하여 항체로 검출할 수 있다.

재조합 DNA의 존재를 직접적으로 조사하는 것 이외에도, 재조합 DNA가 단백질 발현을 지시하도록 할 수 있는 경우, 면역방법을 통해 형질전환 결과를 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 발현벡터로 성공적으로 형질전환된 세포는 적절한 항원성을 갖는 단백질을 생산한다. 형질전환된 것으로 의심되는 세포 표본을 수확하여 적합한 항체를 이용하여 단백질에 대해 분석한다. 그러므로, 본 발명은 (형질전환된 숙주 세포들뿐만 아니라) 또한 이러한 영양 배지 중의 이러한 세포의 배양액, 특히 단일클론성(동질한 클론) 배양액 또는 단일클론성 배양액에서 유래한 배양을 고려해야 한다.

본 발명의 일부 숙주세포(예를 들어 박테리아, 효모 및 곤충 세포)들은 본 발명의 펩티드의 제조에 유용한 것으로 인식될 것이다. 그러나, 다른 숙주 세포들은 다른 특정 치료방법에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 수지상세포 같은 항원제시세포는 적절한 MHC 분자로 부하될 수 있도록 본 발명의 펩티드를 발현하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

바람직한 숙주 세포는 재조합 RCC 또는 아웰스(Awells) 세포이다. 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 표준 방법에 따라 숙주 세포 또는 이의 배양 배지로부터 펩티드를 분리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 종양 관련 펩티드를 생산하는 방법이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태는 구강, 직장, 비강 또는 설하 섭취, 정맥내(i.v.) 주입, 피하(s.c.) 주입, 경피(i.d.) 주입, 복강내(i.p.) 주입, 근육내(i.m.) 주입 등의 주입을 위한 펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 바람직한 펩티드 주입법으로는 s.c., i.d., i.p., i.m.과 i.v 이 있으며, DNA 주입시는 i.d., i.m., s.c., i.p.와 i.v 주입법이 선호된다. 이 때 하기 개시된 바와 같이 펩티드나 DNA를 1내지 500 mg의 양으로 주입한다.

또한 본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 종양 관련 펩티드 및 본 발명에 따른 핵산, 혹은 본 발명에 따른 발현벡터의 의약에서의 용도에 관한 것이다.

또 다른 양태에서 본 발명의 목적은, 본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 하나 이상의 종양 관련 펩티드, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 발현 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물에 의해 해결된다. 이 조성물은 피하나 피부 내, 복막 내, 정맥 내, 근육 내 또는 구강 주입과 같은 비경구 투여에 사용된다. 이를 위해, 펩티드는 약학적으로 수용가능한, 가급적이면 수용 담체에 용해되거나 현탁화된다. 또한, 상기 조성물은, 완충액, 결합제, 블라스팅제, 희석제, 향미제, 윤활제 등의 부형제를 함유할 수 있다. 펩티드는 시토킨 과 같은 면역 자극 물질과 함께 투여될 수 있다. 이런 조성물에 이용될 수 있는 부형제의 확장된 리스트는 예를 들어, A. Kibbe의 제약 부형제 안내서, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press에서 확인할 수 있다. 조성물은 선종 또는 암종 질병의 예방, 예방적 및/또는 치료적 처치에 사용될 수 있다.

서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함하는 본 발명의 하나 이상의 핵산, 본 발명에 따른 핵산, 또는 본 발명에 따른 발현 벡터를 함유하는 약학 제제를 각각의 펩티드 또는 항원과 관련된 선암 또는 암종 질병으로 고통받는 환자에게 투여한다. 이에 의해, T 세포 매개 면역 반응이 유발될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 서열번호 3 내지 서열번호 10 중 어느 하나에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 추가의 종양 관련 펩티드, 개별적인 핵산 또는 개별적인 발현 벡터를 추가로 포함한다.

일반적으로, 본 발명에 따른 약학 조성물에 존재하는 펩티드는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2를 포함하는 본 발명의 펩티드에 대해 상기 개시된 바와 동일한 성질을 갖는다. 따라서 이들은 9 내지 100개, 바람직하게는 9 내지 30개, 가장 바람직하게는 9 내지 16개의 전체 길이를 가질 수 있다. 더욱이 서열번호 1 내지 서열번호 11 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 펩티드는 비펩티드(non-peptide) 결합을 포함할 수 있다. 게다가 각각의 핵산은 9 내지 100개, 바람직하게는 9 내지 30개, 가장 바람직하게는 9 내지 16개의 아미노산을 인코딩할 수 있다.

서열번호 1 및/또는 서열번호 2 및 서열번호 3 내지 서열번호 11에 따른 아미노산으로 구성된 (특히 종양 관련)펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 약학 조성물이 바람직하다.

조성물에 존재하는 본 발명에 따른 발현벡터(들) 또는 본 발명에 따른 핵산(들)의 양 혹은 펩티드(들)(특히 종양 관련)의 양이 조직, 암 또는 환자 특이적인 본 발명에 따른 약학 조성물이 바람직하다.

펩티드는 태깅(tagged)되거나 융합 단백질일 수 있으며 하이브리드 분자일 수 있다.

펩티드는 실질적으로 순수하거나, 혹은 면역촉진 보조액과 조합되거나 혹은 면역촉진 시토카인과 조합되어 사용될 수도 있고, 리포솜 같은 적절한 전달 시스템로도 주입 가능하다. 보조액으로는 사포닌에서 유래된 아퀼라 QS21 스티뮬론(Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), 미코박테리아성 추출물, 합성 박테리아 세포벽 유사물질, 리비스 데톡스(Ribi's Detox)와 같은 물질이 있다. 또 다른 사포닌 유래 보조액인 퀼(Quil) A도 쓸 수 있다(Superfos, Denmark). 프룬드(Freund's) 같은 다른 보조액도 매우 효과적이다. 특히 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 만난에 컨쥬게이트된 펩티드도 보조액과 함께 주입 시 효과적이라고 알려져 있다(WO 95/18145과 Longenecker 외 (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291 참조). 보조액은 항원에 대한 면역 반응을 강화하는 물질(MedlinePlus^TM Medical Dictionary, NIH)로 규정되므로, 톨(toll) 류 수용체 작용제(TLR 작용제), 바람직하게는 TLR-3, -7, -8, -9, 바람직하게는 TLR-9와 작용적으로 상호작용하는 물질, 예를 들면, 프로타민 안정화 RNA, CpG 올리고뉴클레오타이드, CpR 올리고뉴클레오타이드, 세균성 DNA, 이미다조퀴놀린 등을 포함하나 이에 국한되지 않는, 이 성능을 갖는 다른 물질들이 사용될 수도 있다.

면역 반응을 강화하는데 적합한 것으로 당 분야에 알려진 기타 물질은, 유도성 니트릭 옥사이드 합성효소(nitric oxide synthase) (iNOS)와 아르기닌분해효소(ARG1), 인돌아민 디옥시게네이즈(indoleamine-2,3-dioxygenase) (IDO), 혈관 내피 성장 인자 수용체 1(VEGFR 1), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 사이클로옥시게네이즈 2(cyclooxygenase 2) (COX-2), TGF 베타 수용체 I(TGF beta-RI)의 억제제를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 이러한 억제제5는 상기 분자나 소분자에 대한 단일클론 항체일 수 있다. 상기 언급된 인자에 대해 억제 기능을 갖고, 따라서 면역 반응 개선 효과를 갖는 것으로 당 분야에서 알려진 소분자와 단일클론 항체들로는 1-MT, NCX-4016, 로페코십(rofecoxib), 셀레브렉스(celebrex), BEC, ABH, nor-NOHA, SB-505124, SD-208, LY580276, AMD3100, 액시티닙(axitinib), 베바시주맵(bevacizumab), JSI-124, CPA-7, XL-999, ZD2171, 파조파닙(pazopanib), CP-547632, 및 VEGF Trap 등이 있다.

또한 조절 T 세포(CD 4+, CD25+, FoxP3+)의 수를 감소시키는 물질이 보조액으로 적합하다. 여기에는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide) (Cytoxan), ONTAK (denileukin diftitox), 수니티닙(Sunitinib), 항-CTLA-4 (MDX-010, CP-675206), 항-CD25, 항-CCL22, 및 항-GITR이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.

또 다른 바람직한 양태에서, 백신은 핵산 백신이다. 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 백신과 같은 핵산 백신의 접종은 T 세포 반응을 이끌어내는 것으로 알려져 있다. 이것은 환자에게 직접 투여되거나, 영향받은 장기 혹은 전신으로, 또는 환자나 인간 세포주에서 유도된 세포(이는 후속적으로 환자에게 투여되거나, 또는 환자로부터 유래된 면역 세포로부터의 소집단을 선택하기 위해 생체 외 이용된다)에 생체 외 적용된다. 핵산이 생체 외에서 세포로 투여되는 경우, 인터루킨-2(interleukin-2)나 GM-CSF같은 면역 자극 시토킨을 동시 발현하도록 형질감염된 세포가 유용할 수 있다. 핵산 백신은 BCG나 백반 같은 보조액과 함께 투여될 수 있다. 그러나 보조액 없이 핵산 백신을 투여하는 것이 선호된다.

폴리뉴클리오티드는 실질적으로 순수하거나, 혹은 적절한 벡터 또는 전달 시스템에 함유될 수 있다. 적절한 벡터 및 전달 시스템은 바이러스, 예를 들면, 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아(vaccinia) 바이러스, 리트로바이러스(retrovirus), 포진(herpes) 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 또는 하나 이상의 바이러스 요소를 함유하는 하이브리드에 근거한 시스템을 포함한다. 비바이러스(non-viral) 전달 시스템에는 DNA 전달 기술에서 잘 알려진 바와 같은 양이온(cationic) 지질과 양이온 중합체가 포함된다. "유전자 총(gene-gun)"과 같은 물리적 전달도 이용될 수 있다. 펩티드나 핵산에 의해 인코딩된 펩티드는 예를 들면 CD4 양성 T 세포를 자극하는 파상풍톡소이드에서 얻은 항원결정인자를 갖는 융합 단백질일 수 있다.

환자에 투여된 모든 핵산은 멸균성이며 발열원(pyrogen)이 없다. 네이키드 DNA는 근육내 또는 피부 내 또는 피하로 제공될 수 있으며, 펩티드는 근육내, 피부 내 또는 피하로 제공될 수 있다.

편리하게도, 핵산 백신은 알맞은 핵산 전달 수단을 포함할 수 있다. 핵산, 가급적이면 DNA는 네이키드 상태(즉, 실제로 투여되는 다른 구성요소 없이)이거나 리포솜(liposome) 중에서 전달되거나, 바이러스 벡터 전달 시스템의 일부로써 전달될 수 있다.

핵산 섭취 및 수지상세포 같은 전문 항원 제시 세포에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 발현은 면역 반응의 프라이밍 기전일 수 있다;그러나, 수지상세포는 조직 에서 형질감염된 세포로부터 발현된 펩티드를 포착할 수 있으므로, 이들은 형질감염되지 않을 수 있으나 여전히 중요하다("교차 자극(cross priming)", 예: Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Mesothelin 특이적 CD8(+) T 세포 반응에서 접종받은 췌장암 환자의 항원 제시 세포에 의한 생체 내 교차 자극 증거 제공. J Exp Med. 2004 Aug 2;200(3):297-306).

펩티드 백신이 바람직하게는 피하(s.c.) 또는 근육내(i.d.)로 투여되는 반면, DNA 백신과 같은 핵산 백신은 근육에 투여하는 것이 선호된다. 백신을 피부에 주입하는 것도 선호된다. 핵산 백신은 보조액 없이 투여될 수 있다. 핵산 백신은 BCG나 백반(alum)과 같은 보조액과 함께 투여될 수도 있다. 다른 적합한 보조액으로는 사포닌에서 유래된 아퀼라 QS21스티뮬론 (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), 미코박테리아성 추출물, 합성 세균 세포벽 유사물질, 및 라비스 데톡스 같은 물질이 있다. 또 다른 사포닌 유래 보조액인 퀼 A도 쓸 수 있다(Superfos, Denmark). 핵산 백신이 보조액없이 투여되면 바람직하다. 프룬드와 같은 기타 보조액도 매우 효과적이다. 특히 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 컨쥬게이트된 펩티드를 보조액과 함께 이용하는 것이 유용할 수 있다.

암의 폴리뉴클리오티드 매개된 면역화 요법은 [Conry 외 (1996) Seminars in Oncology 23,135-147, Condon 외 (1996) Nature Medicine 2,1122-1127, Gong 외 (1997) Nature Medicine 3,558-561, Zhai 외 (1996) J. Immunol. 156,700-710, Graham 외 (1996) Int J. Cancer 65,664-670, 그리고 Burchell 외 (1996) pp 309-313 In: 유방암, 생물학과 치료에서의 진행, Calvo 외 (eds), John Libbey Eurotext]에 설명되어 있으며, 이는 모두 본문에 참고 문헌으로 인용되었다.

주사 부위에 의해, 표적 벡터 및 전달 시스템을 이용하거나, 또는 환자로부터 이런 세포 모집단을 선택적으로 선택하고 펩티드 또는 핵산을 생체 외 투여함으로써 항원 제시 세포와 같은 특정한 세포 모집단에 백신을 향하게 하는 것 또한 유용할 수 있다(예: 수지상세포는 [Zhou 외 (1995) Blood 86,3295-3301; Roth 외 (1996) Scand. J. Immunology 43,646-651]에서 설명된 대로 분리될 수 있다). 예를 들어, 표적 벡터는 적합한 위치에서 항원 발현을 지시하는 조직- 또는 종양-특이적 프로모터를 포함할 수 있다.

추가의 양태에서 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 상기 펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 피하, 피부 내, 근육 내 또는 경구 투여와 같은 비경구 투여에 이용된다. 이를 위해, 펩티드는 제약적으로 허용가능한, 가급적이면 수용성 담체에 용해되거나 현탁화된다. 또한, 조성물은 완충액, 결합제, 블라스팅제, 희석제, 향미제, 윤활제 등의 부형제를 함유할 수 있다. 펩티드는 시토킨 등의 면역 자극 물질과 함께 투여될 수 있다. 이런 조성물에 사용될 수 있는 부형제의 광범위한 목록은 예를 들어, [A. Kibbe의 제약 부형제 안내서, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press]에서 확인할 수 있다. 조성물은 샘종 질환이나 암종 질환의 예방, 예방법 및/또는 치료법에 사용될 수 있다.

서열번호 1 및/또는 서열번호 2를 포함하는 하나 이상의 본 발명의 펩티드를 포함하는 약학 제제를 개별적인 펩티드나 항원과 관련된 샘종 또는 암종 질환으로 고생하는 환자에게 투여한다. 이로써, CTL-특이적 면역반응이 일어나게 된다.

본 발명의 다른 양태에서는, 직접적인 조합물로서 또는 동일한 치료 처방 내에서 본 발명에 따른 둘 혹은 그 이상의 펩티드들의 혼합물을 백신으로 사용할 수 있다. 또한, MHC I형 또는 II형 특이적 펩티드 같은 다른 펩티드와의 조합물을 이용할 수 있다. 당 분야의 숙련자들은 예를 들면 시험관 내에서의 T-세포의 생성, 이들의 효율 및 전반적인 제시, 특정 펩티드에 대한 특정 T세포의 증식, 친화성 및 팽창, 및 T-세포의 작용성을 시험함으로써, 예를 들면 IFN-γ 생산(하기 실시예 참조)을 분석함으로써 바람직한 면역원성 펩티드의 조합을 선택할 수 있을 것이다. 보통, 그 뒤에 가장 효율이 좋은 펩티드를 상기 개시된 바와 같은 목적을 위한 백신으로 혼합하여 사용한다.

적절한 백신은 바람직하게는 1 내지 20개 펩티드, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 다른 펩티드, 보다 더 바람직하게는 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 다른 펩티드 및 가장 바람직하게는 11개의 다른 펩티드를 함유할 것이다. 암 백신에 사용되는 펩티드 길이는 임의의 적합한 것일 수 있다. 특히, 9-mer, 7-mer, 8-mer, 10-mer, 11-mer 펩티드나 12-mer가 좋다. 더 긴 펩티드 또한 적합할 수 있고, 첨부한 표 1에서 서술한 바와 같은 9-mer 또는 10-mer 펩티드가 MHC I형 펩티드에 바람직하다.

펩티드는 종양 또는 암 백신을 구성한다. 이는 영향을 받은 장기 혹은 전신으로 환자에게 직접 투여되거나, 또는, 후속적으로 환자에게 투여되거나, 환자에게 유래된 면역세포에서 나온 소집단을 선택하도록 생체외에서 사용된 후 환자에게 다시 투여될 환자에서 나온 세포 또는 인간 세포주로 생체 외 적용된다. 펩티드는 키홀 림펏 헤모시아닌(KHL) 또는 만난(mannan)같은 적절한 담체에 컨쥬게이트될 수 있다 (WO 95/18145와 Longenecker 외 (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291 참조). 펩티드 백신은 보조액 없이 투여될 수 있다. 펩티드 백신은 또한 BCG나 백반(alum)같은 보조액과 함께 투여될 수 있다. 보조액으로는 사포닌에서 유래된 아퀼라 QS21 스티뮬론(Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), 미코박테리아성 추출물, 합성 박테리아 세포벽 유사물질, 리비즈 데톡스(Ribi's Detox)와 같은 물질이 있다. 또 다른 사포닌 유래 보조액인 퀼 A도 쓸 수 있다(Superfos, Denmark). 프룬드(Freund's) 같은 다른 보조액도 매우 효과적이다. 특히 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 컨쥬게이트된 펩티드를 보조액과 함께 주입 시 효과적이라고 알려져 있다. 상기 언급된 것과 같은 기타 보조액이 사용될 수 있다. 펩티드는 태깅되거나 융합 단백질일 수 있으며 하이브리드 항체 분자일 수 있다. 본 발명에서 제공된 서열의 펩티드는 CD8⁺ CTL을 자극할 것으로 기대된다. 그러나 자극은 CD4⁺ T 세포의 도움이 있을 때 보다 효율적이다. 따라서 하이브리드 분자의 융합 파트너나 구역은 CD4⁺ T 세포를 자극하는 항원결정인자를 적절히 제공한다. CD4⁺ 자극 항원결정인자는 본 기술에서 잘 알려져 있고, 파상풍톡소이드에서 확인되는 것들을 포함한다.

본 발명에 따른 펩티드 백신의 특히 바람직한 양태에서, 상기 백신은 신장 세포 암종 치료를 위한 다수 펩티드 종양 백신이다. 바람직하게는, 상기 백신은 원발성 신장암 세포에 위치하고 확인된 서열번호 1 내지 10에 따른 종양 관련 펩티드 세트를 포함한다. 이 세트는 HLA I형 및 II형 펩티드를 포함한다. 펩티드 세트는 또한 피부 내 투여 효율성을 검사하기 위해 면역 지표로 제공되는 양성 대조군 펩티드로서 사용되는 HBV 핵심 항원과 같은 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 한 특정한 양태에서 백신은 각 펩티드가 약 1500 μg 내지 약 75 μg, 바람직하게는 약 1000 μg 내지 약 750 μg, 보다 바람직하게는 약 500 μg 내지 약 600 μg, 가장 바람직하게는 약 578 μg인 11개의 개별 펩티드(서열번호 1-11)를 포함하고, 이들 모두 HPLC와 이온 교환 크로마토그래피로 정제될 수 있으며, 회색 빛이 도는 흰색 파우더로 보인다. 동결건조물(lyophilisate)을 가급적 탄산수소나트륨(sodium hydrogen carbonate)에 용해시키고, 실내 온도에서 재구성한 후 30분 이내에 피부 내 주입용으로 사용한다. 본 발명에서 바람직한 펩티드의 양은 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.1 내지 1 mg, 가장 바람직하게는 500 μl 당 약 300 μg 내지 800 μg의 용액으로 다양하다. 여기에서 "대략" 이라는 용어는 따로 명시하지 않는 한, 주어진 값의 +/- 10%를 의미한다. 당 업자는 각 환자의 면역 상태 및 특정 암 유형에 있는 TUMAP의 양 등 여러 요인에 기초하여 사용되는 실제 펩티드 양을 조정할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 동결건조물 대신 다른 적절한 형태(무균액 등)로 제공될 수 있다.

본 발명에서 제공된 펩티드의 서열은 CD8 양성 T 세포(CTL)을 자극할 것으로 기대된다. 그러나 자극은 CD4 양성 T 세포에 의해 제공된 도움의 존재 하에서 보다 효율적이다. 따라서 하이브리드 분자의 융합 파트너나 구역은 CD4 양성 T 세포를 자극하는 항원결정인자를 적당히 제공한다. CD4 양성 자극 항원결정인자는 본 기술에서 잘 알려져 있고, 파상풍톡소이드 또는 본 발명에서 제공된 MMP7의 펩티드에서 확인된 것들이 포함된다.

마지막으로, 본 발명에 따른 백신은 치료받을 환자들이 고통받고 있는 특정 암 종류뿐 아니라, 질환의 상태와 이전의 치료 요법, 환자의 면역 상태는 물론 환자의 HLA 일배체형(HLA-haplotype)에 의존될 수 있다. 더욱이 본 발명에 따른 백신은 특정 환자의 개인적 필요에 따라 개별적 구성요소를 함유할 수 있다. 그 예로, 상기 특정 환자에서 관련된 종양 관련 항원의 발현에 따른 각기 다른 펩티드의 양이 다른 것과, 개인적 알레르기나 기타 치료로 인한 부작용, 그리고 치료 방식의 초진에 이은 두번째 치료시의 조정이 다르다는 것을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 표적 세포가 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자를 대상으로 표적 세포를 사멸시키는 약물 제조에 있어, 본 발명에 따른 펩티드나 폴리뉴클리오티드, 이러한 펩티드를 인코딩하는 발현 벡터의 용도에 관한 것이다. 항암 백신인 약학 조성물로서의 용도가 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태는 면역 반응, 특히 세포 면역 반응, 특히 세포가 표면에서 인간의 I형 또는 II형의 MHC 분자를 발현하고 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타내는 고형 종양 세포에 대한 T 세포 매개 면역 반응을 유발하기 위한 약물 제조에서, 본 발명에 따른 펩티드 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클리오티드 혹은 발현 벡터의 용도를 제공한다.

고형 종양의 종양 세포가 (동일 조직의 건강한 세포와는 대조적으로) 세포 표면에 인간의 HLA II형 분자를 발현한다는 사실은 매우 흥미롭다. 이러한 사실은 Brasanac 외 (Brasanac D, Markovic Lipkovski J, Hadzi Djokic J, Muller GA, Muller CA. 신장세포암종에서 HLA II형 항원 및 종양 침윤성 단핵세포의 면역조직화학분석: 임상 및 조직병리 정보와의 관련성. Neoplasma. 1999;46(3):173-8.)의 문헌에서만 유일하게 발견되었다. 여기에서는 37개의 신장세포 암종(25가지 투명세포 종류, 10가지 과립성, 2가지 혐색소성)이 HLA II형 항원 분석용 HLA-DR, -DP와 -DQ에 대한 단일클론성 항체 (MoAb) 및 종양 침윤성 단핵세포(TIM) 분석용 항-CD14, -CD3, -CD4 및 -CD8 MoAb를 적용한 간접적 면역과산화효소법으로 연구되었다. 양성 세포의 수를 반정량적으로 추정하였고, 면역조직화학 조사 결과는 RCC에 대한 임상적인 특징(환자 나이, 성별, 종양 크기, TNM 단계) 및 조직학적인 특징(세포는 세포학, 조직학, 수준)과 연결되었다. 모든 RCC는 HLA-DR, 92% -DQ와 73% -DP 항원을 발현하였지만(발현수준 DR>-DQ>-DP), 분석된 임의의 조직학적 혹은 임상적인 변수와의 통계적으로 중요한 상관성은 확립될 수 없었다. 단핵세포가 T 림프구보다 많고 CD4+가 CD8+ T 세포보다 더 많은 반면, T 림프구를 갖는 종양이 가장 많고, 대략 동일한 수의 CD4+와 CD8+ T세포가 가장 큰 평균 직경을 가졌다. 종양 세포에 의한 T 림프구의 부적절한 활성화가(항원 제시의 능력에도 불구하고), 보다 공격적인 종양 특성을 나타내는 변수와 RCC 상의 비정상적인 HLA II형 항원 발현의 상관성의 원인일 수 있다.

본 발명의 추가의 양태는 서열번호 1 내지 10중 임의의 것에서 주어진 아미노산 서열을 포함하며 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포가 있는 환자들의 표적 세포를 사멸시키는 약물 제조에 있어, 본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드를 인코딩하는 발현 벡터나 폴리뉴클리오티드의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 양태는 생체내 또는 체외에서 활성화된 T 림프구를 생산하는 방법을 제공하고, 이에 의해 첫번째 방법은, 항원 특이 방식으로, 언급된 T 세포를 활성화하기에 충분한 시간동안 적합한 항원 제시 세포 표면에서 발현된 항원 부하된 인간 I형 또는 II형 MHC 분자와 T 세포를 생체내에서 접촉하는 것을 의미하고, 여기에서 항원은 본 발명에 따른 펩티드이다. 두번째 방법은, 보다 선호되는 것으로, Water 등(Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. 최첨단: 조정된 MHC/항 CD28 코팅 미세구에서 확장된 인간 CD8 T 세포의 미리 결정된 총결합력. J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8)에서 기술되어 있다.

MHC II형 분자는 임의의 적절한 세포 표면에서 발현될 수 있는데, 세포가 자연적으로 MHC II형 분자를 발현하지 않거나(여기서, 세포가 이 분자를 발현하도록 형질전환된 경우), 또는 발현한다면, 항원 가공 혹은 항원제시 경로가 불완전한 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, MHC II형 분자를 발현하는 세포는 CTL 활성 전에 이미 선택한 펩티드 항원으로 완전히 프라이밍될 수 있다.

항원-제시 세포(혹은 자극 세포)는 통상적으로 표면에 MHC I형이나 II 분자를 갖고 있으며, MHC I형이나 II 분자를 선택한 항원으로 스스로 로딩할 수는 없다. 밑에 자세히 언급하겠지만, MHC I형이나 II 분자는 시험관 내에서는 선택된 항원으로 쉽게 로딩된다.

바람직하게는 포유동물 세포에는 TAP 펩티드 운반체 기능이 없거나, 낮은 수준으로 갖고 있다. TAP 펩티드 운반체가 결핍된 적합한 세포로는 T2, RMA-S와 초파리 세포가 있다. TAP는 항원처리와 관련된 운반체(Transporter Associated with antigen Processing)의 약어이다.

인간 펩티드를 로딩하는 불완전 세포주 T2는 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA under Catalogue No CRL 1992에서 구입 가능하다: 초파리 세포주 슈나이더 주 2는 ATCC under Catalogue No CRL 19863 에서 구입 가능하며, 생쥐의 RMA-S 세포주는 Karre and Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162,1745에 개시되어 있다.

편리하게도, 상기 숙주 세포들은 형질전환 전에는 어떠한 MHC I형 분자도 발현하지 않는다. 만약 자극 세포가 B7.1, B7.2, ICAM-1 혹은 LFA 3 같은 T 세포 공자극에 중요한 분자를 발현한다면 이 또한 선호된다.

추가의 양태에서는, HLA 분자의 조합물 또한 사용될 수 있다.

재조합 다항원결정인자 백신을 다양한 CD8+ CTL 항원결정인자 운반에 사용하는 방법은 (여기에서 참고문헌으로 이용된) Thomson 외 (1996) J. Immunol. 157, 822-826와 WO 96/03144에 언급되어 있다. 본 발명과 관련하여, (본 발명의 아미노산 서열과 다른 CD4 양성 T 세포 자극 항원결정인자(MMP-7에서 나온 것과 같은)를 임의의 순서로 포함하는) 펩티드(혹은 펩티드를 코딩하는 핵산)가 단독 백신에 포함되는 것이 바람직하며 유리하다. 이러한 백신은 암치료에 특히 효과적일 것이다.

시험관내에서 CTL를 생성하는데 이용되는 방법은 많이 알려져 있다. 예를 들어, [Peoples 외 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,432-436와 Kawakami 외 (1992) J. Immunol. 148,638-643]에서는 CTL 생성에 자가 종양 침윤성 림프구를 사용했다. [Plebanski 외 (1995) Eur. J. Immunol. 25,1783-1787]에서는 CTL의 준비를 위해 자가 말초혈액 림프구(PLBs)를 이용했다. 또한 [Jochmus 외 (1997) J. Gen. Virol. 78,1689-1695]에서는 수지상세포에 펩티드 혹은 폴리펩티드를 펄스적용하거나, 또는 재조합 바이러스를 이용한 감염에 의한 자가 CTL의 생산을 개시하고 있다. [Hill 외 (1995) J. Exp. Med. 181,2221 2228와 Jerome 외 (1993) J. Immunol. 151,1654-1662]에서는 자가 CTL을 생성하기 위해 B 세포를 이용했다. 게다가, 펩티드나 폴리펩티드로 펄스처리되었거나 혹은 재조합 바이러스로 감염된 대식세포를 자가 CTL 준비를 위해 이용할 수도 있다.

CTL 준비 시 동종이형세포를 사용할 수 있는데 이는 (여기에 참고문헌으로 이용된) WO 97/26328 에 상세히 기재돼있다. 예를 들어, 초파리 세포와 T2 세포뿐만 아니라, CHO 세포, 바큘로바이러스 감염 곤충 세포, 박테리아, 이스트, 백시니아 감염 표적 세포 등의 기타 세포도 항원제시에 이용될 수 있다. 또한 식물 바이러스도 쓸 수 있다(참조 Porta 외 (1994) Virology 202, 449-955에는 외부 펩티드 발현에 대한 고수익 시스템으로써의 카우피 모자이크바이러스의 개발에 대해 설명되어 있다).

가급적, 본 발명에 따른 방법에서 항원 제시 세포는 상기와 같은 발현 벡터를 포함한다.

본 발명의 펩티드에 대해 활성화된 T 세포는 치료 방법에서 매우 효과적이다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태는 전술된 본 발명의 방법에 의해 수득된 활성화된 T 세포를 제공한다.

본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는 활성화된 T 세포를 제공한다. 바람직하게는, T 세포는 HLA/펩티드 복합체와 상호작용(예를 들어 결합)하여 상기 세포를 인식한다. 효과적인 수의 활성화된 T-세포가 투여된 환자에서 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포를 죽이는 방법에서 T-세포가 유용하다. 환자에게 투여된 T 세포는 환자자신에서 유래된 것이고, 상기 언급한 대로 활성화된(즉 자가 T 세포) 것일 수도 있다. 대안적으로, T 세포를 환자 자신이 아닌 타인으로부터 얻은 것을 쓸 수도 있다. 물론, 타인이 건강한 인간이면 더 좋을 것이다. 여기서 말하는 "건강한 인간"이란 일반적으로 우수한 건강 상태이고, 바람직하게는 완전한 면역계를 갖고 있고, 보다 바람직하게는 쉽게 검사 및 감지될 수 있는 질환이 없는 인간을 말한다.

활성화된 T 세포는 T세포 수용체(T-cell receptor: TCR)를 발현하고, 이 수용체는 비정상적인 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대한 인식과정에 관여한다. TCR을 인코딩하는 cDNA를 활성화된 T 세포로부터 클로닝하고 발현을 위해 다른 T 세포로 형질이입시킨다면 유용하다.

생체내에서, 본 발명의 한 양태에 따른 CD4 양성 T 세포에 대한 표적 세포는 (때때로 MHC II형을 발현하는) 종양 세포일 수도 있고, (때때로 MHC II형을 발현하는) 종양 (종양 세포)을 둘러싸는 기질 세포일 수도 있다.

본 발명의 펩티드에 특이적인 T 세포 클론의 TCR은 클로닝된다. T 세포 클론에 사용되는 TCR은 1) TCR 변이부에 특이적인 단일클론성 항체 (TCR variable region specific monoclonal antibodies)와 2) Va와 Vp 유전자과에 특이적인 프라이머를 이용한 RT PCR을 사용하여 결정된다. cDNA 라이브러리는 T 세포 클론에서 추출한 poly-A mRNA 로부터 만들어지게 된다. 이때 TCR a 와 P 사슬의 C 말단부위와 Va 및 P 분절의 N말단 부위에 특이적인 프라이머를 사용한다. TCR a와 P 사슬에 대한 완전 cDNA는 고정확도 DNA 중합효소로 증폭되고 증폭 산물은 적절한 복제 벡터로 클론된다. 복제된 a와 P 사슬 유전자는 [Chung 외 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658]에 기재된 방식대로 단사슬 TCR로 모아질 수 있다. 이 단사슬 구축물에서 VaJ 분절 다음에 V DJ 분절이 오고, 그 다음에 Cp 분절이 있고, CD3 사슬의 세포막 및 세포질 부위가 그 뒤를 잇는다. 이 단사슬 TCR은 그 뒤 레트로바이러스 발현 벡터에 삽입된다(벡터의 패널은 성숙한 인간의 CD8 양성 T 림프구를 감염시키고 유전자 발현을 매개하는 능력에 따라 사용될 수 있다). 레트로바이러스 벡터 시스템 Kat이 그러한 바람직한 예이다(참조 Finer 외 (1994) Blood 83,43). 고역가 양친화성 레트로바이러스는 종양 환자의 말초 혈액에서 분리한 CD8 양성이나 CD4 양성 T 림프구를 감염시키는 데 사용된다(Roberts 외 (1994) Blood 84,2878-2889 문헌의 프로토콜 참조). CD3 항체는 순수한 CD8 양성 T 세포의 증폭 과정을 유발하는데 사용되며, 이는 단사슬 TCRs의 안정적인 발현양상과 레트로바이러스 통합을 촉진한다. 레트로바이러스 형질도입의 효율성은 단사슬 TCR에 특이적인 항체로 감염된 CD8 양성 T 세포를 염색함으로써 측정된다. 형질도입된 CD8 양성 T 세포를 시험관 내 분석하였더니, TCR 사슬이 원래 클로닝된 알로-제한된 T-세포 클론을 이용한 것과 동일한 종양-특이적 사멸을 나타내는 것을 확인하였다. 예상되는 특이성을 갖는 형질도입된 CD8 양성 T 세포의 개체군을 이용하여 종양 환자에게 면역요법을 시행할 수 있다. 환자들은 10⁸ 내지 10¹¹ 개의 자가 T 세포 및 형질도입된 T 세포로 치료받는다. CD8 양성 세포와 유사하게, 관련된 구축물을 갖는 형질도입된 CD4 양성 T 조세포도 생성될 수 있다.

유전자를 T 세포에 도입하는 다른 적절한 방법은 여기에 참고문헌으로 이용된 [Moritz 외 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4318-4322]에 잘 나와있다. [Eshhar 외 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720-724 와 Hwu 외 (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 논문]도 T 세포 형질감염(transfection)을 개시하고 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상정으로 발현하는 세포를 인식하는 TCR (활성화된 T 세포에서 얻을 수 있는 TCR)을 제공한다.

TCR뿐만 아니라, TCR과 기능적으로 동일한 분자들도 본 발명에 포함된다. TCR과 같은 기능을 수행할 수 있는 분자면 어떤 것이든지 상관없다. 특히, (여기에 참고문헌으로 이용된 Chung 외 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658 에 나타난 방식에 의해 만들어진) 유전자 조작된 3개 도메인을 갖는 단사슬 TCR이 여기에 속한다. 본 발명은 또한 TCR 또는 기능적으로 유사한 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 TCR 또는 기능적으로 유사한 분자를 인코딩하는 발현벡터를 제공한다. 본 발명의 TCR을 발현하는 데 적합한 발현 벡터는 본 발명의 펩티드 발현에 대해 앞서 언급했던 것들을 포함한다.

그러나, 형질감염(transfection) 후에 T 세포에서 TCR을 발현할 수 있는 발현 벡터가 더 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태는 효과적인 용량의 펩티드, 또는 효과적인 양의 폴리뉴클리오티드나 언급한 펩티드를 인코딩하는 발현 벡터, 또는 효과적인 수의 상기 정의된 바와 같은 T 림프구를 환자에게 투여함을 포함하되, 여기서, 상기 펩티드의 양, 상기 폴리뉴클리오티드나 발현 벡터의 양, 또는 T 세포의 수가 상기 환자에서 항 표적 세포 면역 반응을 불러 일으키는데 효과적인, 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포가 비정상적으로 발현하는 환자에서 표적 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 표적 세포는 일반적으로 종양이나 암 세포이며, 특히 표면 상에 인간 MHC I형 또는 II형 분자를 발현하고 상기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 고형 종양의 특정 세포이다.

또한 본 발명의 또다른 양태는, 1) 환자로부터 T 세포를 얻는 단계; 2) TCR, 또는 상기 정의된 바와 같은 기능적으로 유사한 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 세포에 도입하는 단계: 3) 단계(2)에서 생성된 세포를 환자에게 도입하는 단계를 포함하는, 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포가 비정상적으로 발현하는 환자에서 표적 세포만을 죽이는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태는 1) 수지상세포 같은 항원제시세포를 환자에게서 수득하는 단계; 2) 본 발명의 제 1, 제 2 또는 제 3 양태에서 정의된 바와 같은 펩티드 또는 이런 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 항원 제시 세포와 생체 외에서 접촉시키는 단계; 및 3) 이렇게 처리된 항원 제시 세포를 환자에게 재 주입하는 단계를 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포가 비정상적으로 발현하는 환자에서 표적 세포를 죽이는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 적합하게는, 수지상 세포는 항원성 펩티드로 펄스처리된 자가조직의 수지상 세포이다. 적절한 T세포 반응을 꾀하는 것이라면 항원성 펩티드는 어떤 것이든 상관없다. 종양 관련 항원에서 유래한 펩티드로 펄스처리된 자가 조직의 수지상세포를 이용한 T세포 치료는 [Murphy 외 (1996) The Prostate 29,371-380 와 Tjua 외 (1997) The Prostate 32, 272-278]에 개시되어 있다.

추가의 양태에서, 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포를 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시킨다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 수지상 세포를 형질도입하여 펩티드를 제시하고 면역성을 유도할 수 있는 것이 바람직하다.

편리하게도, 폴리뉴클레오티드는 바이러스성 폴리뉴클레오티드나 바이러스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 형질도입된 수지상 세포는 MUC1과 관련한 항원-특이적 항종양 면역성을 유발한다고 알려져 왔다 (Gong 외 (1997) Gene Ther. 4,1023-1028). 이와 유사하게 아데노바이러스에 의거한 시스템이 사용될 수 있으며 (Wan 외 (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363), 레트로바이러스 시스템도 사용될 수 있고 (Specht 외 (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221), 수지상 세포로의 혈액 입자-매개 전달도 이용될 수 있고 (Szabolcs 외 (1997)), RNA도 사용될 수 있다 (Ashley 외 (1997) J. Exp. Med. 186, 1177-1182).

환자의 표적세포를 죽이는 방식에 대해서, 표적 세포가 암세포, 특히 신장암 또는 결장 암 세포인 경우가 특히 더 효과적이다.

바람직한 양태에서, 환자의 HLA 하플로타입은 치료 전에 결정된다. HLA 하플로타이핑은 임의의 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있고, 이런 방법은 당 분야에 잘 공지되어 있다.

본 발명은 특히, 생체 내에서 백신요법의 활성화를 위해; 시험관내에서 자가조직 수지상세포의 조작 및 이후의 이렇게 조작된 수지상 세포를 생체 내로 도입하여 T-세포 반응을 활성화시키기 위해; 시험관 내에서 자가 T 세포를 활성화시킨 후 (즉, 이렇게 조작된 T 세포를 환자에게 주입하는) 채택적 치료를 위해; 생체 외에서 건강한 기증자(MHC 일치 또는 불일치)에서 얻은 T-세포를 활성화시킨 후 채택적 치료를 위한, 본 발명의 펩티드 (혹은 이러한 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 용도를 포함한다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 백신은 종양의 형성을 억제하거나 혹은 억압하기 위해 단독으로 혹은 다른 암치료법과 조합되어 숙주에 투여된다.

펩티드 백신은 보조액 없이 투여될 수 있다. 또한 BCG나 명반 같은 보조액과 함께 투여될 수 있다. 다른 적합한 보조액은 상기에 언급되었다.

본 발명의 펩티드는 또한 진단 시약으로 쓰일 수도 있다. 펩티드를 사용함으로써, 펩티드에 특이적이거나 치료에 유도된 T-세포가 T-세포 모집단에 존재하는지 여부를 분석할 수 있다. 더욱이, 한정된 펩티드에 대한 반응성을 나타내는 전구체 T-세포의 증가를 이들 펩티드를 이용하여 시험할 수 있다. 또한, 상기 펩티드는 펩티드가 유래된 상기 항원을 발현하는 질병의 진행을 모니터링하기 위한 마커로서 사용될 수 있다.

첨부된 표 1에는 확인된 펩티드가 나열되어 있다. 또한 각 펩티드의 유래 단백질뿐만 아니라, 각각의 단백질에서 각각의 펩티드 위치를 기재했다. 더욱이 각각의 열람번호는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 "생명공학 정보 국립센터(National Centre for Biotechnology Information)" 유전자은행(Genebank)를 참조한 것이다(참고 http: www.ncbi.nlm.nih.gov).

다른 바람직한 양태에서, 펩티드는 백혈구, 특히 T 림프구 염색에 사용된다. 펩티드에 대한 특정한 CTL이 CTL-모집단에 존재하는지가 입증되어야할 경우 이의 이용이 특히 유리하다. 또한, 펩티드를 선종 및 암종 질환에서 치료의 진행을 평가하는데 마커로도 쓰일 수 있다.

다른 바람직한 양태에서, 펩티드는 항체 생산에도 이용될 수 있다. 다클론 항체는 펩티드의 주사를 통해 동물을 면역화시키고, 후속적으로 면역 글로불린을 정제하는 표준화된 방식으로 얻을 수 있다. 단일클론성 항체도 예를 들면 [Enzymol. (1986), 121, 하이브리도마 기술 및 단일클론성 항체]에 개시된 표준 프로토콜에 따라 만들어질 수 있다.

TAA의 T 보조 세포 항원 결정 인자의 확인은 항종양 면역치료에서 여전히 중요한 과제로 남아있다. 현재까지, TAA로부터 I형 또는 II형 펩티드를 식별하는 몇몇 전략이 밝혀졌는데, 이는 APC를 섭취되고 가공되도록 관심 항원과 함께 항온처리하는 것(Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, and B.P. van der Bruggen. 1999. CD4(+) T 림프구에 대한 HLA-DR 분자에 의해 발현된 MAGE-3 항원결정인자 확인. J. Exp. Med. 189:767-778)부터, 융합 단백질을 이용한 다양한 형질감염 전략(Dengjel,J., P.Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. HLA II형 표적 및 감별 질량 분광측정법의 진성조합에 의해 자연적으로 처리된 시클린 D1 보조 T 항원결정인자의 확인. Eur.J.Immunol. 34:3644-3651)까지 다양하다. 모든 이러한 방법들은 시간 소비적이고, 종종, 확인된 HLA 리간드가 실제로 인간의 조직에 의해 생체 내에서 제시되는지도 불분명하다.

본 발명의 발명자들은 MMP7로부터 하나의 중심 서열을 담당하는 하나의 리간드를 규명했다. 본 발명자들은 신장세포 암종에서 이 단백질이 과발현됨을 발견했고, 또한 종양에 관련된 것으로 개시되었다(Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. 인슐린 유사 성장인자 결합단백질 3에 대한 기질 메탈로프로테이네스-7의 단백분해활성을 통해 기질 메탈로프로테이네스-7은 인슐린 유사 성장인자 생체이용률을 촉진한다. Cancer Res. 64:665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. 인간신장세포암종에서의 기질 메탈로프로테이네스-7 및 2의 발현. Oncol. Rep. 10:567-570). 상기 펩티드는 HLA II형 분자에 무차별적으로 결합하며 다른 건강한 공여자에서 나온 CD4 양성 T 세포를 활성시켰다. 따라서, 이러한 접근법은 임상 백신 프로토콜에 이용하기 위해 TAA로부터 새로운 II형 펩티드의 후보 규명과정에 도움이 될 것이다.

본 발명에서 밝혀지고 기재된 특성들은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고서 개시된 바와 같은 개별적인 조합에서뿐만 아니라 단일 형태로서 사용될 수 있다.

본 발명을 다음의 표, 서열 목록 및 실시예를 참고하여 보다 상세히 기재했다. 하기 실시예는 단지 예시 목적일 뿐 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니다.

서열번호 1 내지 서열번호 2는 본 발명에 따른 MHC I형이나 II형에 의해 제시되는 펩티드를 함유하는 T 세포 항원 결정 인자의 펩티드 서열이다.

서열번호 3 내지 서열번호 11은 본 발명의 백신에 사용된 펩티드의 펩티드 서열을 나타내며, 이후에 "IMA"로 언급된다.

도 1은 원발성 종양 시료인 RCC013 상에서 c-Met 원종양유전자 유래된 펩티드인 IMA-MET-001의 제시를 보여준다. 나노모세관의 고성능 액체 크로마토그래피 ESI MS를 RCC013으로부터 용출된 펩티드에 수행하였다. 1006.54±0.5 Da에 대한 질량 크로마토그램은 정체 시간 47.8분에서 최고조를 보인다. 주어진 정체 시간에서 제 2 LC-MS 수행으로 기록되고 삽입화에 도시된 m/z 1006.54에서 충돌로 유도된 붕괴 질량 스펙트럼은 IMA-MET-001의 발현을 확인하였다(Weinschenk 2002).

도 2는 c-Met 원종양유전자(MET)의 조직 발현을 보여 준다. 발현은 올리고뉴클리오티드 마이크로어레이로 분석되었다. 복사 번호는 1.0으로 설정에 신장에 대한 상대적인 값이다. 통계학적 절대 콜 알고리즘에 따라 "P"는 유전자가 발현했음을, "A"는 없음을, "M"은 경계적임을 의미한다. "I"는 유전자 발현이 신장에 비해 유의하게 상승함을 의미하고, "D"는 발현이 감소됨을 의미하며, "NC"는 발현에 아무 변화가 없음을 의미한다. 신장에 상대적인 발현값은 신호 로그 비율에서 산출되어 바의 상단에 표시된다. 수평의 파선은 정상 세포(이 경우, 폐)에서 가장 높은 발현을 보인다.

도 3은 IMA-MET-001로 프라이밍된 CTL에 의한 펩티드-로딩된 표적 세포의 사멸을 보여준다.

도 4는 IMA-MET-001로 프라이밍된 CTL에 의한 악성 세포의 사멸을 보여준다.

도 5는 콜드(cold) 표적 억제 측정법을 보여준다.

도 6은 미세구 구동된 확장의 사량체 분석을 보여준다.

도 7은 IMA-MMP-001의 시험관 내 면역원성을 보여준다 대표적 세포내 IFN 감마 대 4명의 건강한 기증자의 CD4 염색. 기증자 1, 2, 3은 세번째와 네번째 자극이 있은 후 IMA-MMP-001에 대한 CD4 양성 T 세포 반응을 보였다. 기증자 4는 항상 음성이었다.

도 8은 종양과 건강한 조직 내의 차별화된 펩티드 발현을 보여준다. (A) 두 펩티드 종인 m/z 739.96 및 741.95의 질량 스펙트럼은 환자 RCC100의 각각 정상 신장과 신장 세포 암종 조직에서 유래되었다. 질량 스펙트럼은 상응하는 자가 정상 조직(B)과 비교하여 신장 세포 암종 조직 내 아디포필린(Adipophilin) 펩티드가 약 4배 과다발현함을 나타낸다. m/z 741.95(종양)의 충돌 유발된 붕괴 질량 분광 계측법은 아디포필린에서 유래된 펩티드 서열인 펩티드 서열 IMA-ADF-003을 나타냈다.

도 9는 MUC에서 유래된 두 개의 TUMAPs으로 펄스처리된 자가 수지상세포로 접종된 환자에서 여러 비접종된 펩티드에 대한 2명의 RCC 환자에서 IMA-ADF-001-T 세포 면역에 대한 생체내 면역을 보여준다. IMA-ADF-001 ("아디포필린")에 특이적인 T 세포는 접종 전에는 발현하지 않았으며, 환자 #8(하위 패널)에서는 8번의 접종 후에, 환자 #3(상위 패널)에서는 6번의 접종 후에 검출되었다.

도 10은 동일 환자와 항원에 대해 증폭된 ELISPOT 분석에서 확인된 IMA 유도 T 세포 반응의 대표적 예를 보여준다. 위쪽과 아래쪽 컬럼은 각각 판독을 위해 사용된 음성 대조군 항원 HIV-001과 단일 TUMAP IMA-CCN-001을 나타낸다. 왼쪽 컬럼은 제2 선별일(S2)에 접종을 하기 전과 제 1 주입(VI) 바로 직전에 채취한 모아진 시료의 ELISPOT을 보여준다. 오른쪽 컬럼은 22일(V6)과 36일(V7)에 접종 임상시험 계획 동안에 채취한 모아진 시료의 ELISPOT을 보여준다. 일정 수의 양성 세포가 각 실험을 위해 주어진다.

도 11: 증폭된 사량체 염색 분석법으로 확인된 IMA 유도된 T 세포 반응의 대표적 예를 나타낸다. 위쪽 및 중간 중간 패널은 CD3+ 림프구 상에서 게이팅된(gated) 2차원 도트 플롯을 나타내고, 아래쪽 패널은 CD3+ CD8+ 림프구 상에 게이팅된다. 각 칼럼에 대해 지시된 환자, 시점, 염색. S1+V1(접종 전 채취한 시료), V4+V5(접종 후 22일과 36일에 채취한 시료) V8+FU(64일(마지막 접종)에 채취하고 85 내지 92일(시험 완료) 후에 채취한 시료)

A: 도 10에서와 같이 IMA-CCN-001에 면역 반응을 보이는 환자 03-004의 자료. CD3+와 IMA-CCN-001 사량체에 대해 양성인 세포 모집단은 림프구(V6+V7: 하위 패널)의 0.78%를 차지하는 IMA(V6+7; 중간 패널)의 네 번째와 다섯 번째 주입 후에 확인 가능하다. K67-001 사량체(하부 패널)에 대해서는 어떠한 양성 모집단도 발견되지 않았다.

B: 림프구(하위 패널; 3 종향)의 0.8%까지 차지하는 접종 임상시험 계획 기간(중간 패널, 종행 3과 4)동안 IMA-RGS-001 펩티드에 대해 면역 반응을 보이지 않으나 IMA-CCN-001 사량체 양성 반응이 발전되는 환자 03-003의 자료.

도 12: 단일 시점 증폭된 사량체 분석법에서 관찰된 T 세포 크기 운동학. 모아진 시료를 이용한 기본 증폭된 사량체 분석법에 의해 백신 유도된 T 세포 반응이 검출된 환자 05-001에 대한 단일 시점 판독에 대한 결과를 보여준다. IMA(TUMAP 풀)에 존재하는 모든 종양 관련된 항원, 및 특히 IMA-CCN-001 펩티드에 대한 결과가 주어진다. 추가로 동일한 단일 시점 분석법 내의 HIV-001 및 IMA-HBV-001 대조군이 도시된다.

용어

I. 본 발명의 펩티드의 특성

IMA 펩티드가 유래된 유전자 생성물의 발현에 대한 자료

주로 유전자 발현 분석, 문헌, 펩티드가 유래된 것으로 확인된 항원의 공지된 성질에 대한 데이터베이스 검색에 근거한 내부 순위 시스템에 따라, 원발성 RCC로부터 확인된 펩티드가 백신 IMA(하단 참조)에 포함되기 위해 선택되었다. 모든 자연적으로 제시된 펩티드는 정상 신장 조직뿐 아니라 광범위한 기타 생명 유지 기관과 조직에 비해 신장 세포 암종 조직에서 과다 발현된다. 이러한 선택은 (1) IMA의 접종으로 유도된 자가면역 가능성을 최소화하기 위해, 종양은 인식하지만 다른 조직은 인식하지 않는 높은 특이성을 갖는 T 세포를 유도할 수 있는 펩티드를 선택하고, (2) 환자 모집단의 대부분의 종양이 유도된 T 세포에 의해 인식되는 것을 보증할 것을 필요로 한다.

IMA에 함유된 펩티드가 유래된 항원의 평균 유발률은 68%이며, 단일 항원에 대해 54% 내지 96%에 이른다(RCC에서의 과다 발현 대 n=24 RCC 시료 내 생명유지 기관 및 조직). 이는 Her-2/neu (유발률: 25 내지 30%)과 같은 표준 종양 항원보다 상당히 높다.

상업적으로 판매되는 고밀도 마이크로어레이 시스템(Affymetrix)을 사용하여 완전 유전자 발현 프로파일링(profiling)을 실행하였다. RNA는 조직에서 분리되어, 가공되고, 고밀도 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이(microarray)로 혼성화되었다. 염색과 세척 후, 어레이를 스캔하여 어레이 상의 각 점의 형광 강도는 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열과 일치하는 유전자의 발현 수준에 따라 분류되어 나타났다. 어레이 상의 여러 올리고뉴클레오티드는 각 유전자 서열을 커버한다. 통계학적 소프트웨어 분석 후 두 시료간의 쌍(pair wise) 상대적 발현값을 각 유전자에 대해 수득할 수 있다. 기저치로써 하나의 일정한 시료를 사용하여 다른 시료들에서 나온 모든 자료를 규격화하여 모든 시료간의 발현 수준의 상대적 정량을 가능하게 한다.

RNA 소스: 상업적으로 수득된 인간 조직의 총 RNA(Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Germany; Stratagene, Amsterdam, The Netherlands, BioChain, Heidelberg, Germany). 여러 개인의 총 RNA는 각 개인의 RNA가 동등한 무게가 되는 방식으로 혼합되었다. 품질과 수량은 RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent)를 사용하여 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent, Waldbronn, Germany)에서 확인되었다.

고밀도 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 분석법: 아피메트릭스(Affymetrix) 지침에 따라 두 가닥 DNA는 SuperScript RTII (Life Technologies, Inc., Karlsruhe, Germany)와 프라이머(Eurogentec, Seraing, Belgium)를 사용하여 5-8 μg의 총 RNA로부터 합성되었다. BioArray™ High Yield™ RNA 전사 라벨링 키트(ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY)를 사용한 생체외 전사, 분절, Affymetrix U133A 또는 U133 Plus 2.0 GeneChips 상의 혼성화(Affymetrix, Santa Clara, CA) 및 스트렙타비딘 피코에리쓰린(streptavidin phycoerythrin) 및 비오틴(biotin)이 부착된 항-스트렙타비딘 항체(Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)를 이용한 염색은 제조사의 프로토콜(Affymetrix)을 따랐다. Affymetrix GeneArray 스캐너가 사용되었고 Microarray Analysis Suite 5.0 소프트웨어나 GeneChip^TM Operating Software (GCOS)로 분석되었다. 규격화를 위해 어피메트릭스(Affymetrix)에서 제공한 100개의 관리 유전자가 사용되었다. 쌍(pairwise) 비교는 기저값으로써 신장에서의 발현 값을 사용하여 계산되었다. 따라서 신호 로그비(signal log ratio)에서 산출된 모든 표현값은 1로 설정된 신장에 대한 상대값이다. 차별 발현의 유의성은 소프트웨어의 통계학적 알고리즘으로 주어진 "변경" 값으로 판단되었다. 발현의 절대적 검출을 위해, 통계학적 알고리즘을 사용하여 데이터를 분석하였다. 유전자 발현의 유무는 절대 콜 알고리즘에 의해 결정되었다.

c-Met 원종양유전자(MET)의 유전자 발현에 대한 예시적인 발현 패널이 도 2에 도시되어 있다. MET는 분석된 신장 세포 암종의 96%에서 과다 발현되었으나(n=24, 오른쪽), 선별된 여러 생체 건강 조직과 기관뿐 아니라 면역학적으로 중요한 조직과 세포에서는 발현되지 않거나 훨씬 낮은 정도로 발현되었다(도 2의 왼쪽).

표 1은 본 발명에 따른 펩티드를 또한 포함하는 본 발명의 IMA 백신에 함유된 펩티드에 대해 요약하고 있다.

표 2는 본 발명의 IMA 백신에 함유된 펩티드를 코딩하는 모든 항원에 대한 발현 결과와 본 발명에 따른 펩티드에 대한 발현 결과를 요약하고 있다.

1 소프트웨어의 통계학적 알고리즘에서 제공된 "변경" 값에 따름("I"의 수)

2 모든 정상 조직 중에서 가장 높은 발현을 보이는 정상 조직과 비교하여 더 높은 발현을 보이는 RCC의 수

3 뇌는 면역-특권을 갖고 있으며, 이러한 이유로 고려되지 않았다.

모든 정상 조직에 대한 RCC에서의 최소 과다 발현은 54%이고 최대는 96%이다. 이는 Her-2/neu (유병률: 25-30%)와 같은 표준 종양 항원에 비해 상당히 높다.

MUC mRNA에 대한 과다 발현이 감지 되지 않는 MUC는 예외이다. 그러나 하단에 발표된 보고서들이 참작되었다.

1. 악성 종양에서 비정상적인 탈글리코실화(deglycosylation)는 일반적이며, 종양 세포에서는 항원 결정 인자를 드러내고, 이는 정상 세포 상에서는 제시되지 않을 수 있다. 이런 기전이 RCC에서도 일어날 가능성이 높다. 이것이 MUC를 발현하는 종양 세포주의 특이적 사멸을 설명할 것이다(Brossart 1999). MUC의 속성에 대해서는 4.1.5장을 참조하기 바란다.

2. Tubingen 대학에서 진행된 조사자 착수 시험에서 IMA-MUC-001은 자가 수지상 세포와 함께 투여되었다. ASCO 2003 (Mueller 2003)에서 최근 소개된 이 시험과 ASCO 2005 (Wierecky 2005) 미팅에서 소개된 추적조사 자료에서는 어떤 자가면역 효과도 보고되지 않았다.

3. 임상 연구에서 나온 다른 보고들은 IMA-MUC-001에 대해 특이성을 보이는 세포독성 T 세포가 유방암종(Rentzsch 2003)과 직장결장암종 환자(Dittmann 2004)에서 자연적으로(면역 없이) 발생함을 증명하고 있다. 이 환자들에게서 자가면역 효과는 보고되지 않았다. 이는 IMA-MUC-001 특이적 T 세포의 자연적 역할을 강조한다.

이 지지적인 자료에 근거하여, 비록 mRNA 수준 단독에서는 MUG 항체에 대한 과다 발현이 검출될 수 없지만, IMA-MUC-001의 투여가 안전한 것으로 고려될 수 있다.

여러 HLA-DR 대립유전자에 대한 IMA-MMP-001의 무차별적인 결합

IMA-MMP-001은 HLA II형 분자인 HLA-DR에 결합되는 펩티드이다. II형 TUMAPs는 II형 TUMAPs에 의해 활성화되는 세포독성 T 세포의 기능을 지원하는 중대한 역할을 하는 보조 T 세포를 활성화한다. HLA-DR 펩티드의 무차별적인 결합은 IMA로 치료받은 HLA-A^*02 양성 환자들의 대다수(>50%)가 또한 IMA-MMP-001에 대한 T 세포 반응을 유발할 수 있음을 보증하는 데 중요하다. IMA-MMP-001의 결합에 대한 인실리코(In silico) 분석은 IMA-MMP-001가 HLA-A2 양성 백인 환자군의 적어도 69.6%를 커버하는 여러 HLA-DR 대립유전자((DRB1^*0101, ^*0301, ^*0401, ^*1101 그리고 ^*1501)에 무차별적으로 결합함을 보여준다. IMA-MMP-001의 무차별적인 결합은 생체 외 면역원성 자료로 실험상 확인된다.

검사 원리

Tubingen 대학에서 개발된 SYFPEITHI 알고리즘 Tubingen (Rammensee 1997; Rammensee 1999)을 사용하여, IMA-MMP-001의 여러 일반 HLA-DR 대립유전자 결합(아래 표 참조)이 순위 지어졌다. 광범위한 항원, 예를 들어 인간 종양 관련 항원 TRP2(I형) (Sun 2000)와 SSX2(II형) (Neumann 2004)로부터 I형과 II 항원결정인자를 확인하는 데 알고리즘이 성공적으로 사용되었다. 분석된 HLA-DR 대립유전자는 HLA-A2 양성 백인 환자군의 적어도 69.6%를 커버한다(Mori 1997). 결합의 역치는 발표된 무차별적인 HLA-DR 리간드의 결합 점수 분석을 바탕으로 한 18 점으로 정의되었다. 무차별적인 결합은 백인 환자군의 적어도 50%에서 발현된 여러 HLA-DR 대립유전자에 대한 HLA-DR 펩티드의 결합으로 정의된다.

HLA-A와 HLA-DR의 유전자 좌는 다른 것에 비해 우호적인 특정한 HLA-DR과 HLA-A2의 결합을 야기하는 결합불균형에 속해 있다(표 3).

n.a.는 할당되지 않음(not assigned)을 의미한다 (Mori 1997).

특정 MHC 분자의 리간드는 모든 MHC 대립유전자를 위한 펩티드 모티프를 정의하는 것을 가능케하는 일차 서열의 특정 위치에서 화학적으로 관련된 아미노산을 갖고 있다(Falk 1991). SYFPEITHI는 에드만(Edman) 퇴행과 탠덤 질량 분광법에 의한 자연적 리간드 분석에만 근거하여 한정된 모티프로부터 추론되는 모티프 매트릭스를 사용한다(Schirle 2001). 이들 매트릭스는 MHC I형 또는 II형 분자 상에 제시된 주어진 단백질 서열로부터 펩티드를 정확하게 예측하는 것을 가능하게 한다(Rotzschke 1991).

백인 환자군에서 가장 흔한 HLA-DRB1 대립유전자에 대한 IMA-MMP-001 SYFPEITHI 결합 점수를 보여준다. HLA-A2 양성 백인의 상응하는 혈청학적 하플로타입의 빈도는 각 괄호에 나와 있다. 점수가 18과 동일하거나 더 높은 경우, 펩티드가 HLA 분자에 결합되는 것으로 간주되었다.

SYFPEITHI 알고리즘에 의한 예견에 기초하여, IMA-MMP-001은 HLA-A2 양성 백인 환자군의 적어도 69.6%를 커버하는 여러 HLA-DR 대립유전자(DRB1^*0101, ^*0301, ^*0401, ^*1101 그리고 ^*1501)에 결합할 가능성이 높다. HLA-DR15에 대한 빈도 자료가 없기 때문에 이 대립유전자는 계산시 생략되었다. 따라서 환자군의 적용범위는 심지어 69.9% 보다 높을 수 있다. IMA-MMP-001의 무차별적 결합에 대한 실험적 확인은 생체 외 면역원성 자료에서 확보된다(하단 참조).

항원 발현과 종양 및 자가 정상 조직 상의 유래된 펩티드 제시 비교.

과다 발현된 항원은 세포 표면 상의 HLA 분자 상에 과다 제시될 것으로 추정된다. 대표적으로, 아디포필린에서 유도된 HLA-A^*03 펩티드, 이로부터 과다 발현된 항원인 둘 다 IMA 함유된 HLA-A*02 펩티드 IMA-ADF-001과 IMA-ADF-002는, QUALITEA 전략을 사용하여 비교하였을 때 환자 RCC100의 자가 정상 조직에 비해 신장 세포 암종에 과다 제시되는 것으로 나타났다. 이는 이 예시적인 사례에서 항원의 과다 발현(이 경우 아디포필린)이 동일한 항원의 유래된 펩티드의 과다 발현과 상관 관계가 있음을 증명한다.

본 방법은 (Lemmel 2004)에 상세히 기술되어 있다. QUALITEA는 종양과 정상 조직으로부터 HLA 용출된 펩티드의 차별화된 정량에 대한 방법을 나타낸다. 두 개의 다른 소스에서 유도된 HLA 리간드는 ¹H_x- 또는 ²D_x-시약 중 하나에 의해 N-말단 유도체화되고 조합된다. 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 펩티드 복합도 감소에 이어, 펩티드는 최고 피크 면적에 따른 ESI-MS 분석으로 그 양이 평가된다. 유도체 화된 한 쌍의 펩티드(¹H_x-derivatisation와 ²D_x-derivatisation)는 물리화학적으로 동일하고 크로마토그래프 시스템에서 본질적으로 공동 용출되기 때문에 쉽게 검출될 수 있다. 더욱이, 질량 분광 스캔으로 측정하였을 때 일정한 질량 차이가 있다. 이 차이는 유도체 중의 안정한 동위원소(isotopes)의 수에 따라 달라진다. 리간드의 서열 식별은 ESI-MSMS 분석과 기록된 스펙트럼의 컴퓨터 이용 데이터베이스 탐색으로 드러난다. 따라서, 이 분석은 종양과 정상 조직 내 펩티드 존재의 정성 및 질량 측면에 대한 정보를 제공한다.

과다 발현된 항원의 종양과 정상 조직 내 차별된 HLA 펩티드 제시에 대한 예는 도 8에 나와 있다. 환자 RCC100에서 나온 건강한 신장 조직에 비해 종양 조직에 4배 더 과다 제시된 펩티드 IMA-ADF-003은 동등하게 제시된 많은 펩티드 중에서 충돌 유도된 붕괴 질량 분광 분석법으로 식별되었다. 종양 조직에 과다 제시되는 이 펩티드는 아디포필린으로부터 유래되었다. 동일한 환자 RCC100의 유전자 발현 분석도 건강한 신장과 비교하여 이 종양 조직에서 아디포필린이 2.64배 과다 발현됨을 나타내었다(자료 없음). 이 자료는 본 특정 사례에서 유전자 수준에서 종양 조직 에서의 과다 발현이 종양 세포 표면에서 펩티드 과다 제시를 야기함을 확인해 주고 있다.

IMA-ADF-001에 대한 생체 내 면역원성
RCC 환자로부터 생성된 자가 수지상 세포(DCs)는 이들 IMA-ADF-001 중에서 MUC로부터 유래된 두 개의 TUMAP로 펄스처리되었다. IMA-ADF-001는 접종되지 않았다. 접종은 매 2주 마다 4차례 피하 투여(s.c.) 하였고, 종양 진전될 때까지 매월 반복하였다. 5번째 수지상 세포(DC) 투여 후에 환자들은 저용량 IL-2 (1Mio IE/m2) sc로 주당 3차례 투여 받았다. IFN-감마 ELISPOT을 이용하여 T 세포 전구물질 활성화가 모니터링되었다. 두 개의 접종된 펩티드에 대한 T 세포 유도 외에도, IMA-ADF-001 중에서 TUMAPs로 알려진 여러 다른 것에 대한 T 세포 활동도 검사되었다.

결과는 최근 미국 임상 종양협회 연례 회의(ASCO) 2005에서 Peter Brossart(Tubingen 대학) 의사의 발표에서 보여 주었고, 전체 발표 자료는 ASCO 홈페이지에서 나와 있다. 자가 수지상 세포(DCs)에서 펄스된 두 개의 MUC 펩티드로 접종한 두 명의 환자(pt #8과 pt #13)에서 접종된 펩티드가 아닌 다른 펩티드에 대한 T 세포 면역이 접종 후 감지되었다(도 9). 접종 전에 면역이 존재하지 않았기 때문에, 그런 T 세포는 항원 결정 인자 확산으로 유발된 것이 거의 확실하다. 항원결정인자 확산은 종양 세포가 붕괴(예: 괴사, 백신 유발 T 세포 등에 의한 용해로)되고, 항원 제시 세포(APCs, 예: DCs)에 의해 섭취된 항원을 방출될 때 생길 수 있다. 이 APCs는 그 후 세포 내에서 항원을 처리하고 T 세포 항원결정인자(즉, TUMAP)를 제시하여 T 세포 반응을 프라이밍한다. 이 자료는 천연 T 세포 항원으로서의 IMA-ADF-001의 강력한 잠재 역할을 강조한다.

II. 본 발명에 따른 "IMA" 백신의 생산 및 사용

IMA는 원발성 신장 암 세포에 위치하고 확인된 종양 관련 펩티드 세트를 함유한 백신이다. 이 세트에는 HLA I형과 II 펩티드가 포함된다. 펩티드 세트는 또한 피부 내 투여 효과를 검사하기 위한 면역 마커로서 작용하는 양성 대조군 펩티드로써 사용되는 HBV 핵심 항원에서 나온 하나의 펩티드를 포함한다. 일반적으로 펩티드 백신은 보조액이 혼입될 필요가 있고, 따라서, 이런 GM CSF가 본 접종 일정에서 보조액으로써 활용될 것이다(인간 GM CSF는 Sargramostim, Leukine^TM, Berlex에서 상업적으로 판매한다).

IMA에 함유된 10개의 종양 관련 펩티드 중 8개는 하단에 설명된 XPRESIDENT 기술로 식별되었다. 따라서, 이들 펩티드들의 경우, 종양에 의해 발현된 HLA 분자의 측면에서 자연적인 제시가 직접적인 증거에 의해 입증된다. 펩티드 IMA-MUC-001과 IMA-CCN-001은 다른 기술을 사용하여 식별되었다. 후자의 펩티드 둘 모두의 경우, 종양 세포주에 의한 이들 펩티드의 자연적 제시는 생체 외 면역원성 측정에서의 간접적 증거에 기초하여 증명된다(하단 참조).

검사 원리

쇼크-냉동(Shock-frozen) 처리된 원발성 신장 세포 암종 조직에서 나온 HLA 분자를 정제하고 HLA 관련 펩티드를 분리한다. 이들 펩티드중 하나는 HPLC에서 오프라인으로 분리되고, 분획은 분석되거나 또는 질량 분광법에 의한 서열 분석이 온라인 HPLC-MSMS 실험으로 실행된다. 결과로 생긴 서열은 식별된 펩티드의 합성과 식별되고, 합성된 펩티드의 분할 스펙트럼 비교에 의해 증명된다. 식별된 펩티드는 원발성 종양의 HLA 분자에서 직접 유래되기 때문에, 이런 결과들은 원발성 신장 세포 암종 조직에서 식별된 펩티드의 자연적 처리와 제시에서 직접적 증거를 나타낸다.

방법

본 방법은 (Weinschenk 2002)에 의해 상세히 기술되어 있다. 간단히 말해, Tubingen 대학의 비뇨기과에서 입수된 쇼크-냉동된 환자 시료(현지 윤리 위원회에서 승인)들은 용균되고, HLA 분자는 HLA I형 특이적 항체 W6/32나 HLA-A^*02 특이적 항체 BB7.2나 (IMA-MMP-001의 경우) HLA-DR 특이적 항체 L243을 사용한 친화성 크로마토그래피(chromatography)에 의해 정제되었다. HLA 관련 펩티드는 산 처리로 용출되고, 초여과에 의해 MHC 알파 사슬 단백질로부터 분리되었다. 분리된 펩티드는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(chromatography)에 의해 오프라인 분리되고, 분획은 하이브리드 사중 직각 가속 유체 속도 강조(TOF) 일렬 질량 분광계(Q-TOF I 또는 Q-TOF Ultima, Waters)에서 nano-ESI MS에 의해 분석되거나, 또는 온라인 LC-MSMS 분석을 동일한 장비를 사용하여 실시하였다. 시스템에 펩티드가 없도록 하기 위해 항상 공회전이 포함되었다. 교정은 적어도 1일 1회 실시되었고, 표준 화합물 분석은 시스템의 적정 성능을 보장하기 위해 적절한 간격을 두고 실시되었다. 분할 스펙트럼 해석은 수동으로 실시되었다. 분석 증명은 데이터베이스 검색, 잠정적 펩티드 서열의 고상 합성, 및 식별되어 합성된 펩티드의 분할 스펙트럼의 비교에 의해 수득되었다. IMA-MUC-001을 제외한 IMA(자료 없음)에 함유된 모든 펩티드와 IMA-MUC-001은 원발성 신장 세포 암종 조직에서 이들 펩티드의 자연적 제시를 확인하며 동일한 방식으로 식별되었다.

IMA의 성분

본 임상 개발용 펩티드는 표준 및 확립된 Fmoc 화학에 의해 합성된다. HLPC와 이온 교환을 이용하여 정제를 실시한다. 중요한 것은, 펩티드의 정체와 순도를 질량 분광법과 HPLC를 사용하여 쉽고 높은 정확도로 결정할 수 있다는 것이다. IMA 제제는 하단에 상세히 기술된 11개의 개별 약물 제제로 구성된다.

모든 펩티드는 Fmoc 고상 화학에 의해 합성되고, 이온 교환 크로마토그래피(chromatography)와 HPLC에 의해 순도 > 95%로 정제된다. 정확한 구조는 아미노산 분석과 질량 분광법에 의해 결정된다.

약제인 IMA는 염(아세테이트)의 형태로 (578 μg의 각각의 펩티드를 포함) 11개 펩티드를 함유한 피부 내 적용을 위한 동결 건조물로 나타난다. 환자에 대한임상 시험 처방 적용에 대해 578 μg의 각 펩티드를 포함하는 투여용 파우더는 700 μl의 탄산수소나트륨(4.2%)에서 용해될 것이다. 500μl의 용액(투여 당 413 μg의 각 펩티드의 단일 용량 및 투여 당 4.5 mg IMA의 전체 단일 용량과 동일)을 재구성한 후 피부 내로 투여될 것이다.

*제조 공정 중 제거됨

IMA의 품질은 Ph. Eur 요건에 부합하는 활성 물질 및 부형제의 사용에 의해 보증된다.

IMA에 함유된 펩티드의 생체 외 면역원성

IMA는 9개의 HLA I형 종양 관련 펩티드와 1개의 HLA II형 종양 관련 펩티드, 1개의 HLA I형 바이러스 대조군 펩티드를 포함한다. 생체 외 면역원성은 IMA에 함유된 막대한 대다수의 펩티드에 대해 증명될 수 있다.

생체 외 면역원성은 주로 두 가지 T 세포 분석법(A. 크롬 방출 분석에 의한 표적 세포의 세포독성 사멸; 및/또는 B. HLA 사량체에 의한 T 세포 검출)을 사용하여 IMA에 함유된 10개 중 8개의 HLA I형 서열에 대해 증명되었다. 이 분석법들은 HLA-A*02 양성 기증자의 혈액 내 특정 전구물질의 존재뿐 아니라 표적 세포를 사멸시키는 특정 T 세포 능력에 대한 증거를 증명한다. 후자의 사례에서와 같이 내생적으로 항원을 발현하는 여러 종양 세포주가 인식된다. 이는 종양 세포 상에 사용된 펩티드의 자연적 제시에 대한 추가의(간접적) 표시를 제공하고, 이런 펩티드를 사용하여 생성된 세포독성 T 세포가 종양 세포 인식에 대해 큰 항원항체 결합력을 갖는다는 것을 보여 준다. 생체 외 면역원성은 흐름 세포측정(cytometry)에서 세포내 시토킨 염색을 사용하여 IMA에 함유된 HLA II형 펩티드 IMA-MMP-001에 대해 증명되었다(하단 참조).

살해(killer) 분석법: 크롬 방출 분석법에 의해 측정된 표적의 세포독성 사멸; 시토킨 방출: ELISA로 측정된 T 세포에 의한 시토킨 방출; 시토킨 염색: 피부 내 흐름 세포측정(flow cytometry)로 측정된 T 세포에 의한 시토킨의 합성; 사량체 검출: HLA 사량체에 의한 펩티드 특이성 T 세포 검출.

IMA에 함유된 HLA I형 펩티드의 생체 외 면역원성

IMA는 10개의 HLA I형 결합 펩티드를 함유한다. 이들의 생체 외 면역원성에 대해 펩티드를 검사하기 위해, IMA에 함유된 단일 펩티드를 사용하여 건강한 기증자로부터 얻은 자가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 CD8 양성 세포독성 T 세포를 생성하였고, 이들 세포독성 T 세포의 활성을 크롬 방출 분석법 및 흐름 세포측정(flow cytometry)에서 HLA 사량체를 이용한 T 세포 검출을 이용하여 시험하였다. 두가지 방법 모두에 대한 한가지 예시적인 펩티드(IMA-MET-001)의 상세한 자료가 도시되어 있고, 다른 펩티드에 대한 자료는 상기 표 8에 요약되어 있다.

첫번째 단계에서, 건강한 HLA-A*02 양성 기증자에게서 나온 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 검사될 특정 펩티드로 반복 자극함으로써, 세포독성 T 세포가 생체 외에서 생성(프라이밍)된다. 프라이밍은 기증자의 혈액 단핵구에서 생성된 자가 수지상세포를 이용하거나, 또는 HLA 사량체가 부하된 구슬을 사용하여 실시될 수 있다.

A. 표적의 세포독성 사멸: 두번째 단계에서, 이렇게 프라이밍된 세포독성 T 세포(CTLs)의 세포독성은 방사성 크롬으로 표적 세포를 라벨링하고 생성된 CTL과 함께 표적 세포를 배양함으로써 검사된다. 상청액으로 방출된 방사성 크롬의 양은 사멸된 표적 세포의 비율과 직접적으로 상관이 있을 수 있다.

B. HLA 사량체를 이용한 T 세포 검출: 다르게는, 두번째 단계에서 주어진 펩티드에 특이성을 갖는 프라이밍된 CTLs을 HLA 사량체를 사용하여 검출한다. 사량체는 서로 커플링된 4개의 펩티드-부하된 HLA-A*02 분자로 구성된다. 이들 구성은 사량체에서 HLA 펩티드 복합체를 인식하는 동족(cognate) T 세포 수용체의 특이적 라벨링과 흐름 세포측정(flow cytometry)에서 분석에 따른(FACS) 플루오로크롬(fluorochrome)을 이용한 사량체 라벨링을 가능하게 한다.

수지상세포를 이용한 세포독성 T 세포의 프라이밍.

CTL 유도를 위해, 5x10⁵개의 DC를 2시간 동안 50 ㎍/ml의 합성 펩티드 IMA-MET-001로 펄스처리하고, 세척하고, RP10 배지 중의 2.5x10⁶개의 자가 PBMNC와 함께 배양하였다. 7일간의 배양 후에, 자가 펩티드 펄스된 PBMNC로 세포를 재자극하였고, 1 ng/ml의 인간 재조합 IL-2(R&D 시스템)을 1, 3, 5일에 추가하였다. 유도된 CTL의 세포독성 활동을 표준 ⁵¹Cr-방출 분석법에서 마지막으로 재자극한 지 5일 후에 분석하였다(Brossart 1999). (하단 참조)

사량체(tetramer)-부하된 구슬을 이용한 세포독성 T 세포의 생체 외 프라이밍.

이전에 개시된 바와 같이(Walter 2003) 또는 사소하게 개질하여 생체 외 프라이밍을 실시하였다. 간단히 말해, 막투과 도메인이 없고 무거운 사슬의 카복실 말단에서 비오티닐화된 비오틴이 부착된 재조합 HLA-A*0201 분자를 이전에 기술된 대로 생산하였다 (Altman 1996). 정제된 공동 자극 마우스 IgG2a 항 인간 CD28 Ab 9.3 (Jung 1987)에 제조사가 권장하는 조건 하에서 설포-하이드록시숙신이미도비오틴(Sulfo-hydroxysuccinimidobiotin)을 사용하여 화학적으로 비오틴을 부착하였다(Perbio Science, Bonn, Germany). 사용된 미세구는 약 0.06 μg의 비오틴 FITC/mg 미세구의 결합 용량을 갖는, 스트렙타비딘 코팅된 5.60 μm 지름의 폴리스티렌(polystyrene) 입자이었다(Bangs Laboratories, Fishers, Illinois/USA). 미세구 취급에 있어, 멸균된 PBS/BSA/EDTA 완충액이 사용되었다. 비오틴이 부착된 분자에 커플링시키기 위해서 미세구를 비오틴이 부착된 MHC 및/또는 다양한 농도의 항체를 함유하는 완충액에서 2 × 10⁶ 입자/ml로 세척하고 재현탁하였다. 결합은 흔들리는 동안 30분간 실내 온도에서 허용되었다. 코팅된 구슬을 3회 세척하였고, 상기 완충액에서 재현탁하여, 사용 전에 4 ℃에서 4주까지 보관하였다.

PBMCs는 표준 구배 분리 배양을 사용하여 새로운 연막으로부터 분리되었다(Linaris, Wertheim Bettingen, Germany 또는 PAA Laboratories, Linz, Austria). 지시된 대로, 손대지 않은 CD8 T 세포는 제조사의 조건에 따라 CD8 T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 음성 고갈에 의해 자기적으로 강화되고, 이로 인해 80% 이상의 CD8 양성 TCR 양성 세포의 순도가 생성되었다. 1.5 ml의 T 세포 배지 중에 웰 당 5 × 10⁶ 개의 대응 세포 + 1 x 10⁶ 개의 APCs 또는 미세구를 갖는 24웰 플레이트에서 생체 외 자극이 개시되었다. 달리 언급되어 있지 않은 경우, 5 ng/ml의 인간 IL-12 p70(R&D)을 APCs나 미세구에 추가하였다. 37 ℃에서 3-4일간 공동 배양한 후 새로운 배지 및 20 U/ml의 인간 IL-2 (R&D)를 첨가하고, 세포를 3-4일 동안 37 ℃에서 추가 배양하였다. 이 자극 주기는 두번 반복되었다.

크롬 방출 분석법을 사용한 CTL에 의한 표적 세포 사멸.

표준 ⁵¹Cr 방출 분석법은 기술한 대로 실시되었다(Brossart 2001). 표적 세포를 50㎕/ml 펩티드로 2시간동안 펄스처리하였고, 37℃에서 1시간 동안 RP10 중의 ⁵¹Cr-소듐 크로메이트(sodium chromate)로 라벨링하였다. 10⁴ 개의 세포를 둥근 바닥의 96웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 다양한 수의 CTL를 200 ㎕의 최종 부피가 되도록 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 측정 완료 시, 상층액(50 ㎕/웰)을 수확하고, 베타 판 계수기에서 계수하였다. 특이적 용균%는 100 x(실험 방출 - 자발적 방출 / 최대 방출 - 자가 방출)로 산출되었다. 자발적 및 최대 방출은 각각 배양액 또는 2% 트리톤(Triton) X 100중 하나의 존재 하에서 측정되었다. 20:1 비율(억제제: 표적 비율)에서 펄스처리된 라벨링되지 않은 T2 세포가 종양 세포의 용해를 차단하는 능력을 분석함으로써 종양 세포 용해의 항원 특이성이 콜드 표적 억제 분석에서 추가로 측정되었다.

HLA 사량체(tetramer)를 이용한 독성세포 T 세포 검출.

이전에 개시된 (Walter 2003) 바와 같거나 약간 개질하여 사량체 염색을 실시하였다. 간단히 말해, 막투과 도메인이 없고 무거운 사슬의 카복시 말단에서 비오틴이 부착된 재조합 HLA-A*0201 분자는 이전에 기술된 대로 생산되었다 (Altman 1996). 형광 사량체는 비오틴이 부착된 HLA-A*0201를 4:1 몰(molar) 비율로 스트렙타비딘 PE 또는 스트렙타비딘 APC(Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)와 공동 배양함으로써 생성되었다. 사량체 분석의 경우, 세포를 10 mg/ml의 아지드화 나트륨(sodium azid) (Merck, Darmstadt, Germany)을 함유하는 PBS/BSA/EDTA로 세척하고, Abs CD4-FITC 및 CD8-PerCP 클론 SK1 (둘 모두 Becton Dickinson)을 함유하는 동일한 완충액에서 20분 동안 4 ℃에서 염색하였다. 미세구 자극 실험 후에 100 μg/ml의 라벨링되지 않은 스트렙타비딘(Sigma)을 포함시켰다. 세포를 2 %의 열-불활성화된 FCS (PAN Biotech, Aidenbach, Germany), 2 mM 소듐-EDTA 및 10 mg/ml 아지드화 나트륨(sodium azid)를 함유하는 PBS 중에서 세척하고, PBS/FCS/EDTA/아지드 또는 50% FCS가 포함된 완충액에서 30분간 4 ℃에서 염색하였다. 사량체 시약은 항상 5 μg/ml의 MHC 농도에서 사용되었다. 염색된 세포를 PBS/FCS/EDTA/아지드에서 광범위하게 세척하였고 1% 포름알데하이드(formaldehyde) (Merck)로 고정시켰다. 세포를 4색의 FACSCalibur (Becton Dickinson)로 분석하였다. IMA-MET-001의 경우 A 방법뿐 아니라 B 방법에 대해 예시적으로 상세히 결과를 도시하였다. 다른 HLA I형 펩티드에 대한 결과는 표 8에 요약되어 있다.

A. 표적의 세포독성 사멸

그 결과는 (Schag 2004)에 의해 발표되었다. 관련 정보는 하기에 요약되어 있다.

제 1 단계에서, 유도된 CTL의 세포독성은 표적으로써 자가 DC 및 펩티드 부하된 T2 세포를 이용한 표준 ⁵¹Cr-방출 분석법으로 분석되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 주 2회 재자극이 있은 후에 수득된 CTL 라인(line)은 항원 특이적 사멸을 증명하였다. T 세포는 T2 세포 또는 코그네이트 펩티드로 코팅된 DC만을 인식하였으며, HIV-a 역 전사효소 또는 서비빈 단백질에서 유래된 무관한 HLA-A2 결합 펩티드로 펄스처리된 표적 세표는 용균시키지 않아서 세포독성 활성의 특이성을 확인시켰다.

두번째 단계에서, 내인적으로 c-Met 단백질을 발현하는 종양 세포를 용균시키는 생체 외 유도된 CTL의 능력은 표준 ⁵¹Cr-방출 분석법에서 표적으로써 c-Met를 발현하는 HLA-A*02 양성 세포주 HCT 116 (결장암), A498, MZ 1257 (신장 세포 암종, RCC), MCF-7 (유방암), Mel 1479 (악성 흑색종) 그리고 U266 (다발 골수종)을 사용하여 분석되었다. CTL의 특이성과 HLA-제한을 측정하기 위해, EBV 형질전환된 B 세포주 크로프트(Croft)(HLA-2+/c-Met-)와 난소암 세포주 SK-OV-3 (HLA-A3+/c-Met+)를 포함시켰다. 도 4에서 증명되었듯이, c-Met 특이적 CTL은 HLA-A2와 c-Met 모두를 발현하는 악성 세포를 효과적으로 용균시킬 수 있었다. 난소암 세포 SK-OV3 또는 크로프트 세포를 인식하지 않았고, 이는 종양 세포 상의 HLA-A2 분자의 측면에서 c-Met 펩티드의 제시가 표적 세포의 효과적 용균에 필요함을 증명하고 CTL의 항원 특이성과 MHC 제한을 확인한다. 생체 외 유도된 T 세포는 K 562를 인식하지 않고, 이는 세포독성 활동이 NK 세포로 매개되지 않음을 나타낸다.

생체 외 유도된 CTL 주의 항원 특이성과 MHC 제한을 추가로 증명하기 위해서, 콜드 표적 억제 분석법을 실시하였다. 표적 세포(U 266 및 A 498)의 용균은 저온 표적 억제 분석법에서 차단될 수 있었다. 동족 펩티드로 펄스처리된 콜드(⁵¹Cr로 라벨링 처리되지 않은) T2 세포를 첨가하면 종양 세포의 용균이 감소되는 반면, 무관한 펩티드로 펄스처리된 T2 세포는 효과를 나타내지 않았다(도 5).

B. HLA 사량체(tetramer)를 이용한 T 세포 검출

A*02+ 의 건강한 기증자의 강화된 CD8 T 세포를 10 nM CD28 Ab + 10nM의 무관한 A*02 복합체(왼쪽 패널) 또는 지시된 항원(중간 및 오른쪽 패널)로 재절첩된 A*02 중 하나의 존재하에서 코팅된 구슬로 3차례 자극하였다. 지시된 항원은 CMV pp65에서 나온 펩티드 NLVPMVATV(Wills 1996), 멜란(Melan)-A/MART-1 (Kawakami 1994)에서 나온 개질된 펩티드 및 펩티드 IMA-MET-001였다. 모든 T 세포주는 CD8-PerCP Ab, 동족 사량체-PE(도 6; 왼쪽 및 중간 패널), 무관한 A*02/ILKEPVHGV 사량체-APC(오른쪽 패널)로 표면 염색되었다. CD8 양성 림프구 중 사량체+(tetramer+) 세포 비율은 각각의 도면에 지시되어 있다.

IMA에 함유된 HLA II형 펩티드 IMA-MMP-001의 생체 외 면역원성

IMA는 MMP 7으로부터 나온 하나의 HLA II형 펩티드인 IMA-MMP-001를 함유한다. 펩티드의 생체 외 면역원성과 무차별적 결합 특성을 검사하기 위해, IMA-MMP-001 펩티드를 이용하여 서로 다른 HLA 유전자형을 갖는 건강한 기증자에서 나온 자가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 CD4 양성 T 세포를 생성하고, 이들 보조 T-세포의 활성을 흐름 세포측정(flow cytometry)에서 세포내 시토킨 염색을 이용하여 시험하였다.

먼저, CD4 양성 T 세포는, IL-12의 존재하에서 시험될 특정한 펩티드로 건강한 기증자에서 나온 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 반복적으로 자극함으로써 생체 외 생성(프라이밍)되었다. 프라이밍은 기증자의 혈액 단핵구에서 생성된 자가 수지상세포를 사용하여 실시되었다. 두번째 단계에서, 주어진 펩티드에 대해 특이적인 프라이밍된 CD4 양성 T 세포 활성은 형광으로 라벨링된 항체를 사용한 세포 내 IFNγ 염색에 의해 IFNγ 생산을 측정함으로써 검사되었다. 흐름 세포측정(FACS)에 의해 분석이 실시되었다.

수지상 세포(DCs)의 생성

인간 DCs는 건강한 기증자에게서 새로 채취한 혈액의 PBMCs에서 준비되었다. PBMCs는 Ficoll 밀도 구배(림프구 분리 배지, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria)를 사용하여 분리되었다. 수득된 세포를 세척하고, 50 U/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신 및 2mM L 글루타민(BioWhittaker, Verviers, Belgium)으로 보충된 엑스-비보(X-Vivo) 15 배양액에서 재현탁하고, 7 × 10⁶ 세포/ml의 밀도로 평판 배양하였다. 37℃에서 2 시간 후, 유착 단핵구를 100 ng/ml GM-CSF 및 40 ng/ml IL-4 (AL-ImmunoTools, Friesoythe, Germany)를 갖는 엑스-비보 배지에서 6일간 배양하였다. 7일 째에 DCs를 3일 동안 10 ng/ml TNF-α (R&D Systems, Wiesbaden, Germany) 및 20 μg/ml poly(IC) (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany)로 활성화시켰다. DCs의 분화 상태는 흐름 세포측정(flow cytometry)로 검사되었고, 성숙한 DC는 주로 CD14-, CD40-양성, CD80-양성, CD83-양성, CD86-양성 및 HLA-DR+(자료 없음)이다.

항체 특이적 CD4 양성 T 세포의 생성

CD4 양성 T 세포를 생성하기 위해, 10⁶ 개의 PBMCs를 2 × 10⁵개의 자가 DCs로 자극하였다. 프라이밍 후, 6 내지 8일마다 냉동보존된 자가 PBMCs로 재자극이 실시되었다. 자극을 위해서는 37℃에서 90초 동안 5 μg/ml 펩티드로 세포를 펄스처리하고, 방사선 조사하였다(60 Gy; Gammacell 1000 Elite, Nordion International Inc, Ontario, Canada). T 세포를 10 ng/ml의 IL 12 (Promocell, Heidelberg, Germany)의 존재하에서, 10% 열-불활성화된 인간 혈청(PAA, Colbe, Germany), 50 U/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신 및 20 μg/ml 젠타마이신(gentamycin) (BioWhittaker)로 보충된, HEPES와 L-글루타민(Gibco, Paisley, UK)을 함유하는 RPMI 1640인 T-세포 배지를 이용하여 96웰 플레이트(기증자당 펩티드당 7개 웰)에서 세포를 배양하였다. 3 내지 4일 동안 37℃에서 공동 배양한 후, 80 U/ml IL-2 (Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA) 및 5 ng/ml IL-7 (Promocell)가 있는 새 배지를 추가하였다. 세번째와 네번째 자극 후에 세포 내 IFNγ 염색에 의해 분석을 실시하였다.

삭제

세포 내 IFNγ 염색

냉동 보존되었던 PBMCs를 해동하고, 엑스-비보 15 배지로 2회 세척하고, T 세포 배지 내에서 10⁷ cells/ml로 재현탁 처리한 후, 비특이적 IFNγ 생산을 감소시키기 위해 하룻밤 배양하였다(Provenzano 2002). 다음 날, PBMCs를 2 시간 동안 5 μg/ml의 펩티드로 펄스처리하고, 엑스-비보 15 배지로 3회 세척한 후 6시간 동안 1:1 비율의 효과기 세포와 함께 배양하였다. 최종 4시간 동안의 배양을 위해 Golgi-Stop (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)을 첨가하였다. Cytofix/Cytoperm Plus kit (Becton Dickinson)와 CD4-FITC-(Immunotools), IFNγ-PE- 및 CD8-PerCP 복제 SK1 항체(Becton Dickinson)를 사용하여 세포를 분석하였다. 염색 후에 3색 FACSCalibur (Becton Dickinson)에서 세포를 분석하였다.

항체-특이적 CD4 양성 T 세포를 생성하고, 무차별적 결합에 대해 펩티드를 시험하기 위해서, 각기 다른 HLA-DR 대립유전자를 갖는 4명의 건강한 기증자의 PBMCs를 펩티드 펄스처리된 자가 DCs를 사용하여 자극하였다. 항원-특이적 CD4 양성 T 세포 IFNγ 생산을 위한 판독 시스템은 흐름 세포측정(flow cytometry)로 측정되었다. 특이적 T 세포 모집단 중의 IFNγ 생산 세포의 비율을 판단하기 위해, 세포 내 IFNγ 염색 + CD4-FITC와 CD8-PerCP 염색에 의해 세번째와 네번째 자극 후에 T 세포를 분석하였다. 모든 실험에서, 무관한 펩티드를 이용한 자극 및 펩티드가 없는 자극이 음성 대조군으로서 수행되었다. IFNγ 생산 CD4 양성 T 세포의 검출이 음성 대조군에 비해 2배 이상 더 높다면, IFNγ 반응은 양성인 것으로 간주되었다(Horton 2004). 4명 중 3명의 기증자에서, 관심 펩티드에 특이적으로 반응하는 CD4 양성 T 세포를 생성할 수 있었다(도 7). 기증자 4에게서는 세번째 자극 및 네번째 자극 후 T 세포 반응을 관찰할 수 없었다. 기증자 1과 2 각각에서 IMA-MMP-001 특이적인 IFNγ 생산 CD4 양성 T 세포의 빈도가 가장 높았다.

따라서 IMA-MMP-001는 각기 다른 HLA 대립유전자를 갖는 건강한 기증자 4명중 3명에서 CD4 양성 T 세포 반응을 이끌어낼 수 있는 무차별적인 결합체이다. 결합 예측과 수득된 결과에 따라, 펩티드가 HLA-DRB1*0101, HLA-DRB1*0401/*0408 및 HLA-DRB1*1101에 의해 제시될 가능성이 높다. 네 개의 모든 대립유전자는 위치 86에서 글리세린(Glycine) 잔기를 갖고, β 사슬의 위치 57에서 아스파르트산 잔기를 갖는다(자료 없음). 따라서 결합 포켓 P1과 P4에 대한 결합 특성을 공유하는 매우 유사한 결합 모티프를 갖는다(Rammensee 1997; Hammer 1993; Marshall 1994). 기증자 4는 매우 다른 결합 모티프를 갖는 HLA-DRB1*0318 및 DRB1*1401 대립유전자를 갖는다. 이는 상기 언급된 펩티드를 사용하여 이 기증자에서 나온 세포에서 T 세포 반응을 유발할 수 없는 이유를 설명한다.

인간에서의 효과

1996년 이래에 본원에 개시된 것들과 길이 및 아미노산 분포가 유사한 짧은 펩티드를 수천명의 다양한 1 내지 3상의 임상 시험 환자에게 면역화시켰다. 이들 연구중 어떤 것도 심각한 부작용 사례를 보고하지 않았다. 또한, IMA에 함유된 펩티드 IMA-MUC-001는 독일 Tubingen 대학에서 조사자가 착수한 시험에서 자가 세포에 부하되는 접종에 이미 사용되어 왔고 내성이 매우 강했다(Wierecky 2005).
서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10을 갖는 펩티드를 30명의 환자에서 시험하였고, 이중 26명이 10주 간에 걸친 전체 접종 코스를 완료하였다. 높은 환자 비율인 74%가 백신에 포함된 펩티드 서열에 대해 특이적인 면역 반응을 보였다. 이 작은 I상 코호트에서 MHC I형(대립유전자 HLA-A*02)에 결합하는 9개의 펩티드(서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9)중 8개의 생체내 생물학적 기능은 하기 기술된 대로 실시된, 증폭된 ELISPOT 및 사량체(tetramer) 염색 측정 결과에 따라 이미 확인될 수 있었다. 다른 판독이 요구되는 서열번호 1 (IMA-MMP-001)을 갖는 펩티드는 환자 혈액에서 나온 PBMC의 제한된 이용가능성으로 인해 시험될 수 없었다.

특이적 면역 매개변수(면역 관찰)

현재까지 면역 관찰은 다양한 치료적 접종 연구에서 수천명의 환자들을 대상으로 한 흔한 진료였다(Romero 2004). 기능적 및 특이적 분석법을 비롯한 많은 상이한 면역 관찰 방법이 현재까지 보고되었다. 치료적 백신 IMA의 면역 성분은 생체 내 특정 T 림프구를 유발하는 것으로 추정되는 HLA 결합 펩티드이다. 이러한 활성화는 이들의 증식 및 효과기 기능의 획득을 야기할 것이고, 여기에는 항원 접촉 시 시토킨 분비 능력이 포함된다.

T 세포 활성화에 대한 대용 마커로써, 혈액에서 단핵 세포를 분비하는 특이적 시토킨의 빈도를 ELISPOT 분석법을 사용하여 검사할 수 있다. 이런 분석법이 이 목적에 특히 적절한데, 이들이 단일 세포에 근거하고, 혈액 시료 중의 시코틴 분비 항원 특이적 T 림프구의 진정한 빈도와 직접적으로 관련되어 있을 것으로 예상되는 매개변수(즉, 단핵 세포들 중에서 점 형성 세포의 수)를 생성하기 때문이다. 따라서, 분석이 또한 비교적 많은 수의 시료 및 펩티드를 병렬로 처리하는 것을 가능하게 하므로, 이들은 이제까지 많은 수의 임상 연구에서 면역 관찰에 대해 이미 광범위하게 사용되었다(Schmittel 2000).

면역 반응

면역 활성/효과는 T 세포 반응 분석으로 설명될 수 있다. 각기 다른 적응증에 대한 면역 반응에 대해 각기 다른 임상 연구로부터 나온 경험과 결과를 문헌에서 찾을 수 있다. 100%까지의 T 세포 반응이 난소암과 유방암이 있는 환자를 대상으로 한 [Disis 외., 1999]에 기술되어 있다. Her2/neu 항원에 GM-CSF를 더하여 진행한 3-부문(arm) 연구에서 환자들(n = 64)의 84%에서의 항원결정인자 확산이 난소암과 유방암, 소세포 폐암 환자들을 대상으로 한 [2002년 Disis 외.]에 보고되었다. 기타 저자들은 흑색종 환자에서 33% 내지 83%의 T 세포 반응에 대한 결과를 발표하였다(Keilholz/Schadendorf, 2003; Slingluff 외., 2004). [2003년 Gaudernack/Gjertsen 보고서]는 본 연구에 사용된 항원에 특이적인 여러 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포 클론의 면역 반응에 관해 보고하고 있다.

또한 결과들은 [Wierecky 외., ASCO 2005]에 의해 발표되었다: 자가 성숙 단핵구 유래된 수지상 세포(DC)를 MUC1 펩티드에서 추론된 두 개의 HLA-A2 결합 펩티드로 펄스처리하였다. CD4 양성 T 세포를 모집하고 활성화시키기 위해서, DC를 PAN-DR 결합 펩티드 PADRE와 함께 추가 배양하였다. 2주마다 네번 피하주사(s.c.)로 접종이 실시되었고, 이 치료 접근에서 종양이 진전될 때까지 매월 반복되었다. 5번째 DC 투여 후에 환자들은 추가로 저용량 IL-2(1 Mio IE/m2)를 주당 3번 투여 받았다. IFN-γ ELISPOT과 ⁵¹Cr-방출 분석법을 사용하여 T 세포 전구물질 강화에 대해 모니터링하였다. 더욱이 백신 관련 항원결정인자(epitope)를 이용한 공격에 대한 반응으로 시토킨을 생산하는 PBMC의 능력은 실시간 정량 PCR로 검사되었다.

[Wierecky 외.]의 이 연구에서, 생체 내 MUC1 펩티드 특이적 T 세포 반응은 OR이 있는 모든 환자들의 PBMC에서 검출되었다. 이들 생체 내 유도된 T 세포들은 생체 내 재자극 후 동족 펩티드로 펄스처리된 표적 세포 또는 HLA 제한된 방식으로 항원에서 MUC1을 구성적으로 발현하는 매칭된 동종이계 종양 세포를 인식할 수 있었다. 치료에 반응하는 환자에서, 아디포필린, 텔로머라제 또는 OFA와 같은 백신화에 이용되지 않은 항원에 대한 T 세포 반응이 검출될 수 있었고, 이는 항원 결정 인자 확산(spreading)이 발생할 수 있음을 나타낸다. PADRE 펩티드에 대한 증식 반응은 16명 중 11명의 환자들에서 검출될 수 있었고, 일부 환자의 경우 두번째 예방접중 후 이미 검출될 수 있었다. 결론: 접종된 환자에서의 항원결정인자(epitope) 확산에 대한 분석은 임상 반응과 면역 반응을 연관시키는 유용한 매개변수일 수 있다.

생체 내 면역 반응

임상 시험 제제

IMA 임상 시험 제제는 다음과 같이 구성된다:

- 3ml 바이알 내의 11개 펩티드를 포함하고 있는 동결건조물(Lyophilisate)

- 희석제(탄산수소나트륨 4.2%)

IMA의 투여 형태

3 ml 유리병 바이알 내의 주사용 분말. 포장 정보: 박스 당 4개 바이알 포장. 희석제는 700 μl 탄산수소나트륨으로 구성되고 250 ml 병으로 포장된다. 1개 바이알의 IMA는 700 μl의 4.2% 탄산수소 나트륨(희석제)를 첨가함으로써 재구성된다. IMA를 용해시키기 위해 바이알과 희석제를 3분간 세게 흔든 후 1분간 초음프로 처리한다. 그 후에 1분간 다시 바이알을 흔든다. 재구성한 지 30분 이내에 500 μl의 이 용액을 투여한다.

이 연구에서 진행된 신장 암종이 있는 환자들은 10주간에 걸쳐 8번의 접종을 받았다. 모두 24명의 HLA-A*02 양성 HLA 타입 환자들이 등록하였다. 1, 2, 3, 8, 15, 22, 36, 64일 째에 피부 내 접종(GM-CSF + IMA)을 하였다. 본 시험 기간 동안 각기 다른 시점에서 혈액 시료를 채취하고, 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs) 내에 함유된 T 세포를 밀도차 원심분리에 의해 헤파린 혈액으로부터 분리시키고, 혈구계를 사용하여 계산하고, 분석될 때까지 냉동 온도에서 보관되도록 보존하였다. 그런 다음, 2가지의 서로 다른 일반 ELISPO 분석법과 한가지 일반 사량체(tetramer) 분석법이 본 출원인에 의해 실시되었다.

증폭된 ELISPOT 분석법

"생체 외 ELISPOT" 분석에서 세포를 각기 다른 시점에서 융해시키고, 살아있는 세포 수를 계산하고, 3개의 중복 웰에서 시료들을 다른 펩티드 또는 대조군과 함께 하루동안 배양하였다. 생체 외 ELISPOT 분석법은 하단의 다른 분석법에 비해 훨씬 신속한 방식으로 정량 자료를 전달한다. 또한, 이는 IMA에 함유된 하나의 HLA II형 펩티드(IMA-MMP-001)의 측정을 가능하게 하는 유일한 분석법이다. 그러나 이 분석법은 매우 제한된 민감성을 갖고 있어서, 바이러스에 대한 기억(회상) 면역 반응에 비해 매우 강한 T-세포 반응의 경우에만 양성 자료가 예상되었다.
"증폭된 ELISPOT" 분석법에서는, 세포들을 각기 다른 시점에서 모으고, 계수하고, 특정 세포가 분할할 수 있도록 약 2주동안 항원으로 미리 자극하였다. 그런 다음, 세포를 배양물로부터 수확하고, 다시 계산한 후, 항원으로 하루 동안 재자극하였을 때의 IFN-γ 점 생산에 대해 상기와 같이 측정힌다. 이런 조건 하에서 활성화된 세포들은 효소 연결 샌드위치 항체 방법으로 감지되는 IFN-γ를 분비한다. 점들은 색상 형성 반응에 의해 시각화되고 높은 해상도의 자동 디지털 카메라(여기서는 "ELISPOT 리더")로 계산된다. 시료 중의 활성화된 항원 특이적 T 림프구의 진짜 빈도와 연관된 점의 수는 ELISPOT 리더에서 획득한 이미지로부터 소프트웨어 알고리즘에 의해 결정된다. 이 분석법은 다양한 제 3자의 임상 시험에서 접종된 종양 항원에 대한 T 세포 반응을 검출하는데 주로 사용되었다. T 세포의 "생체 외 프라이밍"에 기인한 위양성(false-positive) 자료의 가능성은 이 분석법에서 다양한 대조군을 이용함으로써 배제된다. 하단의 사량체(tetramer) 분석법에 비해, 이 분석법은 추가의 기능 정보, 즉 IFN-γ 시토킨 방출을 제공한다.

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증폭된 ELISPOT 분석법은 본 연구에서 28명의 환자에 대해 수행되었고, 모든 항원은 각기 다른 시점에서 접종 프로토콜 이전 또는 동안에 IMA에서 나타난다. 도 10은 동일한 환자와 항원에 대한 증폭된 ELISPOT 분석법으로 확인된 IMA 유도된 T 세포 반응의 대표적 예를 보여준다. 상부 컬럼과 하부 컬럼은 각각 음성 대조군 항원인 HIV-001과 판독에 사용되는 단일 TUMAP IMA-CCN-001을 나타낸다. 양성 세포 의 수는 각 실험에 대해 주어진다. 오른 쪽 컬럼이 접종 프로토콜 동안 채취된 모아진 시료의 ELISPOTs를 나타내는 반면, 왼쪽 열은 접종 전에 채취된 모아진 시료의 ELISPOTs을 보여준다. 대조군 항원의 경우 면역 반응 유도 후에 점의 수를 증가시키지 않은 반면, IMA 투여는 IMA-CCN-001에 대한 반점 수를 증폭시켰다. 양성인 수, 즉 IFN-γ 분비 세포의 수는 접종 전에는 27 내지 34개였으나 네번째와 다섯번째 투여 후 100 내지 141개로 증가하였다. IMA로 치료함으로써 이 환자에서 IMA-CCN-001 항원 특이적인 활성화된 T 림프구 빈도를 증가시키는 결과를 가져왔다.

증폭 사량체(tetramer) 분석법

"증폭된 사량체" 분석법에서는, 각기 다른 시점에서 세포들을 해동시키고, 계산하고, 항원-특이적 T-세포가 분할되도록 대략 2주동안 항원으로 사전 자극시킨다. 그 후 세포를 배양액으로부터 수확하고, 재계산한 후, PE- 및 APC-플루오로크롬(fluorochrome) 라벨링된 MHC 다량체 + 항체로 염색하여 CD8+ T 세포(염색 및 시점 당 하나의 수조)를 한정한다. MHC 다량체는 다량체화되고, 형광 염료에 컨쥬게이트된 재조합 펩티드 MHC 복합체이다. 본원에서는 단순히 사량체로서 언급되는 당 분야에서 처음 도입된 것(Altmann 1996)과 완전히 등가인 사량체 HLA-A*0201 다량체만을 사용하였다. 염색되고 고정된 시료들을 당 분야에서 잘 공지된 표준 절차를 사용하여 흐름 세포측정(flow cytometer)으로 분석하였고, 각 시료에 대해 단일 세포에 기초한 데이터세트를 생성하였다. 이 "증폭된 사량체(Tetramer)" 분석법은 매우 높은 민감성을 가졌으나 생체 외 분석법에 비해 낮은 정량성을 갖는다.

사량체(tetramer) 자료의 일차적 분석을 위해, 시료당 전체적으로 평가된 CD8+ T 세포의 수, 단일 사량체(tetramer) 양성 세포의 수, 및 이중 사량체(tetramer) 양성 세포의 수를 상업적 소프트웨어를 사용하여 세포측정(cytometry) 리스트 모드 파일로부터 전자적으로 계산하였다. CD8+ T 세포는 항체 형광에 근거하여 살아있는 림프구 상의 전방 및 측방 분산 통문(gating) 및 CD8+ CD3+ 사례 상의 보조 통문(subgating)에 의해 확인되었다. 림프구 통문과 CD3/CD8 통문에 대한 정의는 분석법 내의 한 환자의 모든 염색에 대해 동일하였다. 사량체(tetramer) 양성 모집단은 사분원 또는 통문을 갖는 이중 사량체 점 플록을 분석함으로써 CD8+ T 세포로부터 확인되었다. 사량체+(tetramer+) 세포에 대한 정의는 분석법에서 주어진 환자의 각각의 염색 조건에 대해 동일하였고, 인식가능한 세포 모집단에 근거한다. 증폭된 사량체(tetramer) 분석법은 연구에서 28명의 환자에 대해 수행되었으며, 모든 항원이 각기 다른 시점에서 접종 프로토콜 기간 전과 기간 동안 IMA에 제시된다.

도 11은 증폭된 사량체(tetramer) 염색 분석법으로 확인된 IMA 유도된 T 세포 반응의 대표적인 두 가지 예를 보여준다. 상부와 중간 패널은 CD3+ 림프구 상의 상에 게이트된 2차원 점 그림을 나타내며, 하위 패널은 CD3+ CD8+ 림프구 상에서 게이트된다. 환자들과 시점, 염색은 각 열에 대해 나타나 있다. 도 11A에서 ELISPOT 분석법(도 10)에서 이미 나왔던 환자 03-004의 IMA-CCN-001에 대한 면역 반응은 사량체(tetramer) 분석법에 의해 확인되었다. CD3+와 IMA-CCN-001 사량체(tetramer)에 양성인 세포 환자군은 네번째와 다섯번째 IMA(V6+V7; 중간 패널) 투여 후에 확인된 반면, K67-001 사량체(상위 패널)에 대한 양성 환자군은 발견되지 않았다. IMA-CCN-001 양성 세포는 접종 전에는 0.03%였으나 처음 세번의 투여 후 림프구의 0.78%(V6+V7; 하위 패널)로 상승하였다.

환자 03-003은 RGS-001 펩티드에 대해 면역 반응을 보이지 않았으나(도 11B: 상위 패널), 접종 프로토콜 기간 동안 IMA-CCN-001 사량체(tetramer) 양성 반응이 진행되었다(S1+V1: 접종 전에 채취한 시료; V4+V5: 8일째와 15일째 채취된 시료; V6+V7: 22일째와 36일째에 채취된 시료; V8+FU: 64일째(마지막 접종)와 85일 내지 92일째 후에 채취된 시료; 시험 종료). 중간 패널에서 3열과 4열은 CNN 001과 CD3+에 대해 양성을 나타내는 명백한 세포 환자군을 보여준다. 접종 기간 동안 이들 세포 양은 접종 전에는 0.02%였으나 처음 세번의 투여 후 0.8% 림프구(아래 패널; 3열)로 상승하였고, 64일째 후에 0.31%로 하락하였다(아래 패널; 4열; V8+FU).

선택된 환자들의 경우, 단일 시점에 대한 증폭된 사량체(tetramer) 분석법이 실시되었다. 즉, 혈액 시료를 모으지 않았고, T-세포 동력학의 보다 정확한 평가를 가능하게 하였으며, 이의 예가 도 12에 나타나 있다. 단일 시점 증폭된 사량체(tetramer) 분석법에서 관찰된 T 세포 크기 동력학은 환자 05-001에 대해 나타난다. IMA(TUMAP 풀)에 존재하는 종양 관련 항원은 22일, 36일, 64일(V6, V7, V8)에 가장 높았으나, IMA-CCN-001 펩티드에 대한 반응은 초기인 22일(V6)째에 정점에 이르렀다. HBV-001 양성 대조군은 15일(V5)째에 최고조에 도달한 보다 신속한 반응을 생성하였다.

IMA-CCN-001에 대해 매우 높은 반응성을 갖는 두 환자가 비 증폭 실험에서 증폭된 사량체(tetramer) 분석법의 결과를 확인하기 위해 선택되었다. 이들 생체 외 사량체(tetramer) 분석법은 2주 동안의 세포 배양없이 실시되었다.

결과들은 아래 표 9에 요약되어 있다. 백신 유도된 반응이 증폭 분석법에서 검출되었던 생체 외 사량체(tetramer) 및 환자/항원 매칭된 증폭된 사량체(tetramer) 분석법에서 얻은 모든 가치있는 결과들이 도시되어 있다. "생체 외" 방법의 경우, 전체 CD8+ T 세포 중 사량체+(Tetramer+)의 비율이 나타나 있다. "증폭, 일반" 평가 방법의 경우, CD8+ T 림프구의 소집단이 분석될 수 있고, 일반 자료의 2번째 재 평가가 총 CD8+ T 림프구에 근거한 계산을 이용하여 도시되어 있다("증폭, 정량"). 별개의 사량체+(tetramer+) 환자군이 생체 외 및 증폭된 사량체(tetramer) 분석법에서 나타나면, "증폭 인자"를 계산하였다.

결과들에서 증폭된 사량체(tetramer) 분석법을 이용하여 측정된 면역 반응이 2주간의 배양동안의 세포 팽창에 기인한 것이 아니라, 환자 혈액에 존재하는 이전의 "생체 외" 림프구에 근거한다는 것을 분명히 증명하고 있다.

*: 별개 사량체(tetramer)+ 환자군 검출됨

#: 별개의 분석법은 TUMAP Pool 반응이 전적으로 rCCN-001에 기인한 것일 수 있다는 명백한 근거를 나타내었다.

전반적인 환자 반응성

상기에 기술된 분석법으로 측정된 T 세포 반응은, 본 연구의 각기 다른 시점에서 28명의 환자에 대해 IMA에 함유된 모든 펩티드에 대해 평가되었다. 접종 시점 후에 채취한 혈액 시료 중에 하나가 사량체 양성 림프구를 함유하거나 펩티드 중 하나로 자극하였을 때 분비된 IFN-γ를 함유할 경우, 환자는 "반응", 다시 말해 백신 유도된 면역 반응을 보이는 것으로 기록되었다.

예상한 대로, 환자들은 IMA에 함유된 각기 다른 펩티드에 개별적으로 반응했다. 소수의 환자를 참작한다면, 대다수의 환자들(27명의 평가 가능한 환자들 중 23명)은 펩티드 중 적어도 하나에 대한 면역 반응이 생겼으므로 놀랍게도 좋은 반응을 얻었다. 27명의 평가 가능한 환자들 중 8명(30%)은 심지어 여러 TUMAPs에 대한 T 세포 반응을 보였다.

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Ref Type: Abstract

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SEQUENCE LISTING <110> Immatics biotechnologies GmbH <120> TUMOR-ASSOCIATED PEPTIDES BINDING TO HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN (HLA) CLASS I OR II MOLECULES AND RELATED ANTI-CANCER VACCINE <130> I30559PCT <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Met Ala Gly Asp Ile Tyr Ser Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Val Ala Ser Thr Ile Thr Gly Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Leu Ala Asp Gly Val Gln Lys Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Val Phe Ala Gly Val Val Gly Val 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Leu Phe Asp Gly Asp Pro His Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Ala Ala Leu Pro His Ser Cys Leu 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 11 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10

Claims (36)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 2 에 따른 하나 이상의 서열을 포함하는 펩티드 군에서 선택되는, 9개 내지 100개 아미노산의 전체 길이를 갖는 항종양 면역 반응을 촉진하는 펩티드.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 펩티드가 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 아미노산 서열로 구성되는 항종양 면역 반응을 촉진하는 펩티드.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 펩티드가 9 내지 30개 아미노산의 전체 길이를 갖는 항종양 면역 반응을 촉진하는 펩티드.
4. 제 1 항에 있어서,

   인간의 주요 조직 적합 복합체(major histocompatibility complex: MHC) I형 또는 II형의 분자에 결합하는 능력을 갖는 항종양 면역 반응을 촉진하는 펩티드.
5. 제 4 항에 있어서,

   인간의 주요 조직 적합 복합체(MHC) II형의 하나 이상의 추가 분자에 결합하는 능력을 갖는 항종양 면역 반응을 촉진하는 펩티드.
6. 제 1 항에 있어서,

   상기 펩티드가 비펩티드(non-peptide) 결합을 포함하는 항종양 면역 반응을 촉진하는 펩티드.
7. 제 1 항에 있어서,

   상기 펩티드가 HLA-DR 항원 관련 불변사슬(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 융합 단백질인 항종양 면역 반응을 촉진하는 펩티드.
8. 제 1 항에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산.
9. 제 8 항에 있어서,

   DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 그의 조합인 핵산.
10. 제 8 항의 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터.
11. 삭제
12. 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산, 또는 제 10 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
13. 제 12 항에 있어서,

    재조합 RCC 또는 아웰스(Awells) 세포인 숙주 세포.
14. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 펩티드, 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산, 또는 제 10 항의 발현 벡터, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 약학 조성물.
15. 제 14 항에 있어서,

    서열번호 3 내지 서열번호 11 중 어느 하나에 따른 서열을 포함하는 하나 이상의 추가 펩티드를 추가로 포함하는 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 약학 조성물.
16. 제 14 항에 있어서,

    9 내지 30개 아미노산의 전체 길이를 갖는 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 약학 조성물.
17. 제 14 항에 있어서,

    하나 이상의 펩티드가 비펩티드 결합을 포함하는 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 약학 조성물.
18. 제 14 항에 있어서,

    서열번호 1 및 서열번호 3 내지 서열번호 11, 서열번호 2 내지 서열번호 11, 또는 서열번호 1 내지 서열번호 11에 따른 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 약학 조성물.
19. 제 14 항에 있어서,

    치료 유효량의 항종양 면역 반응을 촉진하는 펩티드를 포함하는 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 약학 조성물.
20. 제 14 항에 있어서,

    하나 이상의 보조제(adjuvant)를 추가로 포함하는 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 약학 조성물.
21. 제 20 항에 있어서,

    보조제가 집락-자극 인자들의 군으로부터 선택되는 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 약학 조성물.
22. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 펩티드, 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산, 또는 제 10 항의 발현 벡터를 포함하는 항암 백신.
23. 제 12 항의 숙주 세포를 배양하고 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드를 분리하는 것을 포함하는, 항종양 면역 반응을 촉진하는 펩티드의 제조방법.
24. 삭제
25. 삭제
26. 세포 독성 T 림프구(CTL)를 항원 제시 세포의 표면 상에 발현된 항원-부하된 인간 I형 또는 II형 MHC 분자와, 상기 세포 독성 T 림프구가 항원 특이적 방식으로 활성화되기에 충분한 시간 동안 시험관 내 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 항원이 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 펩티드인, 활성화된 세포독성 T 림프구의 시험관 내 제조방법.
27. 제 26 항에 있어서,

    충분한 양의 항원을 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 알맞은 항원 제시 세포의 표면 상에 발현된 I형 또는 II형 MHC 분자에 로딩되는 제조방법.
28. 세포독성 T 림프구를 항원 제시 세포의 표면 상에 발현된 항원-부하된 인간 I형 또는 II형 MHC 분자와, 상기 세포 독성 T 림프구가 항원 특이적 방식으로 활성화되는 데에 충분한 시간 동안 시험관 내 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 항원이 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 펩티드이고 상기 항원 제시 세포가 제 10 항의 발현 벡터를 포함하는, 활성화된 세포독성 T 림프구의 시험관 내 제조방법.
29. 제 26 항의 제조방법에 의해 제조되는 활성화된 세포독성 T 림프구.
30. 제 29 항의 세포독성 T 림프구로부터 획득가능한 T 세포 수용체(TCR).
31. 제 30 항의 T 세포 수용체를 인코딩하는 핵산.
32. 제 30 항의 T 세포 수용체의 발현이 가능한 발현 벡터.
33. 제 29 항의 세포독성 T 림프구의 유효수를 포함하는, 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 약학 조성물.
34. 제 30 항의 T 세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 도입된 세포독성 T 림프구 를 포함하는, 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 약학 조성물.
35. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 펩티드, 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산, 제 10 항의 발현 벡터를 포함하는, 환자 내 암 세포를 사멸하기 위한 약학 조성물.
36. 제 35 항에 있어서,

    상기 암 세포가 신장 암 세포인 약학 조성물.

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