PT1922334E - Peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas de classe i ou ii do antigénio leucocitário humano (hla) e correspondente vacina anti-cancerígena - Google Patents

Description

-1- "Peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas de classe I ou II do antigénio leucocitário humano (HLA) e correspondente vacina anti-cancerígena" A presente invenção refere-se a métodos imunoterápicos e a moléculas e células para utilização em métodos imunoterápicos. Em particular, a presente invenção se refere especificamente à imunoterapia do cancro, em especial do cancro renal. A presente invenção refere-se ainda a epitopos peptidicos de célula T auxiliar associados a tumores, isoladamente ou combinados com outros peptideos associados a tumores, que sirvam de ingredientes farmacêuticos activos em composições de vacinas estimuladoras das respostas imunes antitumorais. Em particular, a presente invenção refere-se a novas sequências peptídicas derivadas de moléculas HLA classe II de linhagens de células tumorais humanas utilizáveis em composições de vacinas, para provocar respostas imunes antitumorais .

Antecedentes da invenção A estimulação da resposta imune depende da presença de antigénios que sejam reconhecidos como estranhos pelo sistema imune do hospedeiro. A descoberta da existência de antigénios associados a tumores abriu a possibilidade de utilizar o sistema imune do hospedeiro para intervir no crescimento do tumor. Vários mecanismos de aproveitamento das armas humorais e celulares do sistema imunológico estão sendo explorados na actualidade na imunoterapia do cancro.

Alguns elementos específicos da resposta imune celular são capazes de reconhecer e destruir células tumorais. 0 isolamento de células T citotóxicas (CTL) a partir de populações celulares que se infiltram no tumor ou a partir do sangue periférico sugere que essas células desempenham um papel importante nas defesas imunes naturais contra o cancro -2- (Cheever et al., Annals NY Acad Sei 1993 690:101-112). As células T CD8+ (TCD8+) em particular, que reconhecem as moléculas de classe I dos peptideos do Complexo Principal de histocompatibilidade (MHC), formados normalmente por 8 a 10 resíduos derivados de proteínas localizadas no citosol, desempenham um papel importante nessa resposta. As moléculas MHC dos humanos também são chamadas de antigénios leucocitários humanos (HLA). Há duas classes de moléculas MHC: moléculas MHC-I, que podem ser encontradas na maioria das células nucleadas que apresentem peptideos resultantes de clivagem proteolítica de proteínas endógenas e peptideos maiores e moléculas MHC-II que podem ser encontradas somente em células profissionais apresentadoras de antigénios (APC) e apresentam proteínas exógenas que são absorvidas pelas APCs durante a endocitose e depois são processadas. Os complexos de peptideos e MHC-I são reconhecidos por linfócitos τ citotóxicos CD8+, enquanto que os complexos de peptideos e MHC-II são reconhecidos por células auxiliares T CD4+.

As células T auxiliares CD4+ desempenham um papel importante em administrar as funções efectoras de respostas de células T antitumorais e por isso a identificação de epítopos de célula T CD4+ derivadas de antigénios associados a tumores (TAA) pode ser de grande importância para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos para provocar respostas imunes antitumorais (Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, e E. Celis. 2002. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin. Câncer Res. 8:3219-3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jâger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, e L.J. Old. 2003. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in câncer -3- patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 100(15):8862-7).

Foi demonstrado em modelos com mamíferos, p.ex. ratinhos, que mesmo na ausência de células efectoras de linfócito T citotóxico (ou seja, linfócitos T CD8+), as células T CD4+ são suficientes para inibir a manifestação de tumores através da inibição da angiogénese pela secreção de gama-interferon (IFNy) (Qin, Z. e T. Blankenstein. 2000. CD4+ T-cell-mediated tumour rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 12:677-686). Além disso, foi demonstrado que as células T CD4+ que reconhecem peptídeos de antigénios associados a tumores apresentados por moléculas HLA classe II podem impedir o avanço de tumores pela indução de resposta dos anticorpos (Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, e R.K. Bright. 2003. Os linfócitos T CD4+ desempenham um papel vital na produção de anticorpos e na imunidade tumoral contra o antigénio tumoral grande do vírus 40 dos símios. Câncer Res. 63:1040-1045). Ao contrário dos peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas HLA classe I, somente um pequeno número de ligantes classe II de TAA foram descritos até agora (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Considerando que a expressão constitutiva das moléculas HLA classe II normalmente se limita a células do sistema imunológico (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, e W. Reith. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331), não se considerava possível isolar peptídeos classe II directamente a partir de tumores primários. Por isso, descreveram-se várias estratégias para atingir antigénios na via de processamento classe II de células apresentadoras de antigénios (APCs), como por exemplo a incubação de APCs com o antigénio de interesse para permitir que seja absorvido, processado e apresentado (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, -4- A.M. Eggermont, Τ. Βοοη, e Β.Ρ. van der Bruggen. 1999. Identification of MAGE-3 epitopes presented by hla-dr molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767-778), ou a transfecção de células com genes ou minigenes codificadores do antigénio de interesse e associado com a cadeia invariável que intermédia a translocação de antigénios para o compartimento lisossómico MHC classe II de processamento e montagem (MIIC).

Para que um peptideo dispare (provoque) uma resposta imunológica celular, é preciso que ele se ligue a uma molécula MHC. Esse processo depende dos alelos da molécula MHC e dos polimorfismos específicos da sequência de aminoácidos do peptideo. Os peptídeos que se ligam às MHCs classe I normalmente têm comprimento de 8-10 resíduos e contêm dois resíduos conservados ("âncoras") em sua sequência primária de aminoácidos que interagem com a correspondente fenda de ligação da molécula MHC.

Na ausência de inflamação, a expressão de moléculas MHC classe II se restringe principalmente a células do sistema imunológico, em especial às células profissionais apresentadoras de antigénios (APC), como p.ex., os monócitos, células derivadas de monócitos, macrófagos, células dendríticas.

Os antigénios que são reconhecidos pelos linfócitos T específicos do tumor, ou seja, os seus epítopos, podem ser moléculas derivadas de todas as classes de proteínas, tais como enzimas, receptores, factores de transcrição, etc. Além disso, os antigénios associados a tumores também podem estar presentes apenas em células tumorais, por exemplo, sob a forma de produtos de genes mutados. Outra importante classe de antigénios associados a tumores são estruturas teciduais específicas como, por exemplo, antigénios de cancro testicular que são expressos em diferentes tipos de tumores e em tecido testicular sadio. -5-

Foram identificados diversos antigénios associados a tumores. Além disso, tem-se dispendido grande esforço em pesquisas para identificar outros antigénios associados a tumores. Alguns grupos de antigénios associados a tumores, também chamados no estado da técnica de antigénios específicos de tumores, são específicos de tecidos. Os exemplos incluem mas não se restringem à tirosinase no melanoma, PSA e PSMA no cancro da próstata e a translocações cromossómicas, como por exemplo bcr/abl no linfoma. No entanto, vários antigénios associados a tumores que foram identificados ocorrem em diversos tipos de tumores e alguns deles, tais como as proteínas oncogénicas e/ou os genes supressores de tumor (uma análise dos genes supressores de tumores para o cancro renal, por exemplo, foi feita em Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of câncer of the kidney. J Urol. 2003 Dec;170(6 Pt 1):2163-72), que são os verdadeiros causadores do evento de transformação, ocorrem em quase todos os tipos de tumores. Por exemplo, as proteínas celulares normais que controlam o crescimento e a diferenciação das células, tais como a p53 (exemplo de gene supressor de tumores), ras, c-met, myc, pRB, VHL, e HER-2/neu, podem acumular mutações que resultam na regulação da expressão desses produtos genéticos, tornando-os oncogénicos (McCartey et al. Câncer Research 1998 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994 187:198-211). A mucina-1 (MUCl) é uma glicoproteína transmembrana tipo 1 altamente glicosilada, abundantemente superexpressa na superfície celular de vários adenocarcinomas humanos, tais como os cancros de mama e de ovário. A deglicosilação anormal em tumores malignos é comum e desmascara epítopos em células tumorais que podem não estar presentes em células normais.Além disso, foi demonstrada a expressão de MUCl em mieloma múltiplo e alguns linfomas não-Hodgkin de células B (Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, Duhig T, Rothbard J, and Burchell J. A highly immunogenic region of a human polymorphic epithelial mucin expressed by carcinomas is made up of tandem repeats. J. Biol. -6-

Chem. 263:12820-12823 (1988); Siddiqui 1988; Girling A, Bartkova J, Burchell J, Gendler s, Gillett C, and Taylor-Papadimitriou J. A core protein epitope of the polymorphic epithelial mucin detected by the monoclonal antibody SM-3 is selectively exposed in a range of primary carcinomas. Int. J. Câncer 43:1072-1076 (1989); Brossart 1999; Duperray 1989; Mark 1989; Delsol 1988; Apostolopoulos V and McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander j, and Barratt-Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and câncer vaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995)). Diversos relatórios recentes (Apostolopoulos V and McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, and Barratt-Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and câncer vaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995); Barnd 1989; Takahashi 1994; Noto 1997) demonstraram que células T citotóxicas MHC não restritas de tumores de ovário, mama, pâncreas e mieloma múltiplo podem reconhecer epitopos do cerne de proteina MUCl localizado na repetição em tandem. Foram identificados dois epitopos de célula T restrita a HLA-A2 derivados da proteina MUCl (Brossart 1999, EP 1484397) . Um peptideo é derivado da região de repetição em tandem da proteina MUCl. O segundo peptideo localiza-se dentro da sequência de sinais de MUCl. Tem-se obtido êxito na indução de respostas in vivo de linfócitos T citotóxicos após a vacinação com células dendriticas pulsadas com peptideos em cancro avançado de mama ou de ovário usando esses peptideos (Brossart 2000) (Wierecky 2005) . Com relação ao carcinoma de células renais, a expressão de MUCl é usual em tumores convencionais e foi relatado que ela está associada ao grau e ao estágio do tumor (Fujita 1999; Kraus 2002; Leroy 2002; Bamias 2003; Cao 2000) . No caso da MUCl, a sobreexpressão de proteina não está correlacionada à sobreexpressão do mRNA. -Ι Α adipofilina é um marcador de células diferenciadas especializadas contendo goticulas lipidicas e de doenças associadas a células acumuladoras de gordura (Heid 1998) . A adipofilina ocorre numa grande variedade de linhagens de células cultivadas, incluindo os fibroblastos, bem como em células endoteliais e epiteliais. No entanto, nos tecidos, a expressão da adipofilina restringe-se a certos tipos de células, tais como as células epiteliais mamárias lactantes, células do córtex adrenal, células de Sertoli e Leydig do sistema reprodutor masculino e na esteatose ou hepatócitos de degeneração gordurosa na cirrose hepática alcoólica (Heid 1998). Há relatos de adipofilina superexpressa em cancro colorretal (Saha 2001), carcinoma hepatocelular (Kurokawa 2004) e em carcinoma de células renais (Young 2001). O c-Met codifica um receptor transmembrana heterodimérico com actividade de tirocina quinase composta de uma cadeia α ligada por dissulfito a uma subunidade β (Bottaro 1991; Rubin 1993) . Ambas subunidades são expressas na superfície, sendo a subunidade β pesada responsável por ligar o ligante, o factor de crescimento dos hepatócitos (HGF), enquanto que a subunidade α contém um domínio intracelular que media a activação de diferentes vias de transdução de sinais. A sinalização de c-Met está implicada na regeneração de órgãos, como foi constatado no fígado e rim, na embriogénese, hematopoiese, desenvolvimento muscular e na regulação da migração e adesão de células B normalmente activadas e monócitos (Zarnegar 1995; Naldini 1991; Montesano 1998; Schmidt 1995; Uehara 1995; Bladt 1995; Takayama 1996; Mizuno 1993; van, V 1997; Beilmann 2000). Além disso, diversos estudos apontaram para o envolvimento da superexpressão de c-Met na transformação maligna e na invasividade de células malignas. O c-Met media as actividades multifuncionais e de potencial oncogénico do factor HGF/SF incluindo a promoção do crescimento, motilidade e sobrevivência das células, na -8- dissolução da matriz extracelular e na angiogénese (Bottaro 1991; Rubin 1993; Zarnegar 1995) . A ligação do HGF ao receptor induz a autofosforilação de c-Met e activa eventos de sinalização a jusante, incluindo ras, fosfatidilinositol 3'-quinase, fosfolipase Cy e vias relacionadas com proteína quinase activadas por mitógeno (Naldini 1991; Montesano 1998; Furge 2000; Ponzetto 1993; Dong 2001; Furge 2001). O gene c-Met é expresso predominantemente em células epiteliais e é superexpresso em diversos tecidos e linhagens de células malignos (Di Renzo 1995; Ferracini 1995; Tuck 1996; Koochekpour 1997; Li 2001; Fischer 1998; Maulik 2002; Qian 2002; Ramirez 2000) .

Um crescente número de relatórios mostrou que células não epiteliais, tais como células hematopoiéticas, neurais e do esqueleto respondem ao HGF e que malignidades hematológicas tais como o mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, leucemia e linfoma expressam a proteína c-Met (Gherardi 1991; Teofili 2001; Borset 1999; Jucker 1994; Pons 1998) . O controlo desregulado do fenótipo de crescimento invasivo por c-Met activado oncogenicamente provocado por mutações activadoras de c-Met, amplificação ou superexpressão de c-Met e aquisição de loops autócrinos de HGF/c-Met confere propriedades metastáticas e invasivas às células malignas. Notadamente, a activação constitutiva de c-Met em ratinhos transgénicos que superexpressam o HGF promove ampla génese tumoral (Wang 2001; Takayama 1997). O regulador de sinalização 5 da proteína G (RGS5) é um regulador negativo de vias sinalizadoras da proteína G heterotrimérica, embora sua função in vivo ainda seja desconhecida. As proteínas RGS compreendem uma família de moléculas com função catalítica unificadora, mas de distribuição tecidual variada. Elas estimulam a actividade intrínseca da guanosina trifosfatase (GTPase) de subunidades Ga activadas e desse modo aceleram a inactivação da proteína G. Assim, as moléculas RGS inibem a sinalização a jusante dos -9- receptores acoplados à proteína G (De 2000) . Recentemente, demonstrou-se que a indução do regulador de sinalização 5 da proteína G em pericitos coincide com a remodelagem vascular activa durante a neovascularização tumoral. Em um modelo de carcinogénese das ilhotas pancreáticas em ratinhos, bem como em astrocitomas altamente angiogénicos, demonstrou-se a superexpressão de RGS5 em pericitos no retorno angiogénico („angiogenic switch") que acompanha a remodelagem vascular activa. A superexpressão restringiu-se aos vasos tumorais quando comparada a uma ilhota de Langerhans normal. No entanto, a RGS5 também é regulada na cicatrização de feridas e na ovulação (Berger 2005). A expressão da RGS5 é aumentada no CCR (Rae 2000) . Em outro estudo, a RT-PCR mostrou forte expressão de RGS5 em todos CCRs examinados, e a expressão foi muito fraca ou não detectável em rins normais (6.6:1 em PCR em tempo real). No CCR, o RGS5 foi encontrado principalmente nas células endoteliais dos tumores (Furuya 2004). Além disso, foi relatado que a RGS5 é um marcador de células endoteliais dos sinusoides em carcinoma hepatocelular (Chen 2004). A apolipoproteína Ll (APOLl) é uma lipoproteína secretada, de alta densidade, que se liga à apolipoproteína A-I. A apolipoproteína A-I é uma proteína plasmática relativamente abundante e é a principal apoproteína do HDL. Ela se envolve na formação da maioria dos ésteres de colesterol no plasma e também promove a saída do colesterol das células. A apolipoproteína Ll pode ter função na troca e transporte lipídicos no corpo, bem como no transporte reverso de colesterol das células periféricas para o fígado. A proteína plasmática é um polipeptídeo de cadeia simples com massa molecular aparente de cerca de 40 kDa (Duchateau 1997; Duchateau 2001). O cDNA da APOLl foi isolado a partir de uma banco de cDNA de células endoteliais activadas e foi constatado ser regulado pela TNF-α, uma potente citocina pró-inflamatória. (Monajemi 2002). -10- 0 ΚΙΑΑ0367 foi identificado no Projecto cDNA Kazusa que busca identificar longos transcritos humanos desconhecidos que codificam supostas proteínas (Ohara 1997). Embora a função da suposta sequência peptídica de 820 aminoácidos correspondente ao produto do gene KIAA0367 seja desconhecida, ela contém um domínio de ligação a lipídios do tipo CRAL-TRIO próximo à região c-terminal que se liga a pequenas moléculas hidrofóbicas e que está presente em vários factores de troca de nucleotídeos e na proteína 2 de interacção com proteína (BNIP-2) presente em BCL2/adenovírus ElB 19 KDa. Ο BNIP-2 está envolvido no controlo de diversas funções celulares incluindo a morfologia, migração, endocitose celular e progressão do ciclo celular (Zhou 2005) . Ο KIAA0367 está situado na região cromossómica 9q21. Essa região é descrita como alvo comum de delecção homozigótica em diversos tumores (Gursky 2001; Weber 2001) ou perda de heterozigosidade (Louhelainen 2000; Tripathi 2003) . A guanilato ciclase solúvel (GCs) é uma proteína heterodimérica que consiste em uma subunidade alfa e uma subunidade beta (1 grupo heme) e cataliza a conversão da GTP para o segundo cGMP mensageiro, funcionando como o principal receptor de óxido nítrico e nitrovasodilatadores (Zabel 1998) . GUCYa3 e b3 estão superexpressos em gliomas humanos. A transfecção de GUCY1A3 ou GUCY1B3 antisenso reduziu a vascularização e o crescimento de tumores em ratinhos glabros. Isso pode se dever ao fato de que VEGF é induzido por cGMP (Saino 2004) . GUCY1A3 promove a migração das células tumorais numa linhagem de células de tumor de mama em ratinhos (Jadeski 2003) . A ciclina Dl pertence à família altamente conservada de ciclinas, mas especificamente à subfamília de ciclina D (Xiong 1991; Lew 1991). As ciclinas funcionam como reguladores de CDKs (quinases ciclina-dependentes). As diferentes ciclinas apresentam diferentes padrões de expressão e degradação que contribuem para a coordenação temporal de cada evento mitótico - 11 - (Deshpande 2005). A ciclina Dl forma um complexo com, e age como, uma subunidade reguladora de CDK4 ou CDK6 cuja actividade é necessária para a transição Gl/S de ciclo celular. CCNDl forma com CDK4 e CDK6 um complexo de holoenzimas serina/treonina quinase conferindo especificidade de substrato ao complexo (Bates 1994) . Foi demonstrado que a proteína interage com a proteína Rb supressora de tumor (Loden 2002) e a expressão desse gene é regulada de forma positiva pela Rb (Halaban 1999). Frequentemente são observadas mutações, amplificação e superexpressão desse gene, que altera o avanço do ciclo celular, numa série de diferentes tumores, podendo contribuir para a génese tumoral (Hedberg 1999; Vasef 1999; Troussard 2000) .

As proteínas da família da metaloproteinase matricial (MMP) estão envolvidas na quebra da matriz extracelular em processos fisiológicos normais, tais como desenvolvimento embrionário, reprodução e remodelagem tecidual, bem como em processos mórbidos, como artrite e metástase (Mott 2004) . A matriz metaloproteinase 7 (MMP7) é secretada como pró-proteína inactiva com 29.6 kDa, que é activada quando clivada por proteinases extracelulares. A enzima activa tem peso molecular 19.1 kDa e se liga a dois iões zinco e dois iões cálcio por subunidade (Miyazaki 1990; Browner 1995). A MMP7 decompõe gelatinas, fibronectinas e caseína (Miyazaki 1990; Quantin 1989) e difere da maioria dos membros da família de mmp por nao ter um domínio de proteína conservado de terminal C (Gaire 1994) . A MMP7 Frequentemente está superexpressa em tecido maligno (Lin 2004; Bramhall 1997; Denys 2004) e supõe-se que ela facilite a invasão de células tumorais in vivo (Wang 2005) .

Essas proteínas podem ser alvo de uma resposta imune específica do tumor em diversos tipos de cancro. O peptídeo VHB-001 do antigénio do cerne do vírus da hepatite B não deriva de um antigénio endógeno humano associado a tumor, mas do antigénio do cerne do vírus da -12- hepatite B. Em primeiro lugar, ele permite comparar qualitativamente a extensão das respostas das células τ induzidas por peptideos associados a tumor e portanto permite tirar importantes conclusões sobre a capacidade de provocar respostas anti-tumor. Segundo, ela age como um importante controlo positivo no caso de ausência de respostas das células T no paciente. Terceiro, ela também permite tirar conclusões sobre a situação de imunocompetência do paciente. A infecção com o virus da hepatite B (VHB) é uma das principais causas das doenças hepáticas, atingindo cerca de 350 milhões de pessoas ao redor do mundo (Rehermann 2005). Devido à facilidade da transmissão horizontal e vertical e o potencial de a doença se tornar crónica, levando à cirrose hepática e ao carcinoma hepatocelular, o VHB representa um grande impacto no sistema público de saúde de inúmeros paises. O genoma do VHB (Previsani 2002) é formado de DNA circular parcialmente de fita dupla. Nos vírions de VHB, ele é conjugado com a proteina do capsídeo HBc e outras proteínas para formar o nucleocapsídeo que é cercado por um envelope externo contendo lipídios e a família HBs de proteínas de superfície (também chamada de proteína do envelope). A notação dos determinantes antigénicos associados a HBc e HBs é HBcAg e HBsAg, respectivamente. Esses antigénios são associados a respostas sorológicas, ou seja, de anticorpos encontrados no sangue do paciente e estão entre os sistemas antigénio-anticorpo mais úteis para o diagnóstico de infecção com VHB. O HBc irá representar um novo antigénio estranho para todos aqueles que não tenham um histórico de infecção com VHB. Como os peptideos imunogénicos para esse antigénio são bem conhecidos (Bertoletti 1993; Livingston 1997), seleccionou-se um peptídeo de 10 aminoácidos do HBcAg como antigénio de controlo positivo dentro do IMA. A indução de Células T citotóxicas específicos do peptídeo HBc será então utilizada como marcador da imunocompetência e vacinação bem sucedida. -13- A imunoterapia em pacientes de cancro visa activar especificamente células do sistema imunológico, em especial as chamadas células T citotóxicas, ou ainda chamadas de "células killer" ou células T CD8+), contra células tumorais, mas não contra tecido sadio. As células malignas diferem das células sadias pela expressão das proteínas associadas a tumores. As moléculas HLA na superfície da célula apresentam o conteúdo celular para o exterior, assim permitindo que a célula T citotóxica possa diferenciar entre a célula sadia e a célula maligna. Isso é feito quebrando-se todas as proteínas dentro da célula em peptídeos de cadeia curta os quais são anexados a moléculas HLA e apresentados na superfície celular (Rammensee 1993). Os peptídeos que são apresentados nas células tumorais e não - ou em menor grau - em células sadias do corpo, são chamados de peptídeos associados a tumores (TUMAPs).

Os primeiros ensaios clínicos usando peptídeos associados a tumores iniciaram em meados da década de 1990 por Boon et al., principalmente como indicação para o melanoma. As melhores respostas clínicas variaram entre 10% e 30%. Não foram relatados efeitos colaterais graves ou autoimunidade severa em nenhum ensaio clínico que usou monoterapia com vacina baseada em peptídeos. Foram relatadas formas suaves de vitiligo em alguns pacientes tratados com peptídeos associados a melanoma.

No entanto, o condicionamento de um tipo de linfócito T citotóxico normalmente não é suficiente para eliminar todas as células tumorais. Os tumores são extremamente mutagénicos e por isso são capazes de reagir rapidamente a ataques de linfócitos T citotóxicos mudando seu padrão proteico para evitar serem reconhecidos por eles. Para contra-atacar os mecanismos evasivos dos tumores, utilizam-se diversos peptídeos específicos na vacinação. Dessa forma, pode-se preparar um grande ataque simultâneo contra o tumor, utilizando diversos clones de linfócito T citotóxico ao mesmo tempo. Isso pode diminuir a possibilidade do tumor fintar a -14- resposta imune. Esta hipótese foi confirmada recentemente em um estudo clinico para tratar pacientes com melanoma em estágio avançado. Excepto alguns poucos casos, os pacientes que mostraram no minimo 3 respostas distintas das células T apresentaram respostas clinicas objetivas ou estabilização da doença (Banchereau 2001) bem como um aumento de sobrevida (comunicação pessoal com J. Banchereau), enquanto que a grande maioria dos pacientes com menos de 3 respostas das células T tiveram diagnóstico de avanço da doença.

Até hoje foram descritas numerosas estratégias para introduzir antigénios nas vias de processamento classe II e I. É possivel incubar células apresentadoras de antigénios (APCs) com o antigénio em questão para que seja assumido e processado (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. Μ., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778. Dengjel J, Schoor O, Fischer R, Reich M, Kraus M, Muller M, Kreymborg K, Altenberend F, Brandenburg J, Kalbacher H, Brock R, Driessen C, Rammensee HG, Stevanovic S. Autophagy promotes MHC class II presentation of peptides from intracellular source proteins. Proc Natl Acad Sei USA. 2005 May 31;102(22):7922-7.) . Outras estratégias utilizam proteínas de fusão contendo sequências alvo lisossómicas. Quando expressas em células APCs, essas proteínas de fusão direccionam os antigénios para o compartimento de processamento classe li (Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. &

Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell Biol. 131, 351-369,

Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430).

Para que as proteínas sejam reconhecidas pelos linfócitos T citotóxicos como antigénios específicos do tumor, e para que sejam usadas num tratamento, precisam atender a certos pré-requisitos. O antigénio deve ser expresso principalmente por células tumorais e não por tecidos saudáveis normais ou preferivelmente em quantidades pequenas. -15-

Além disso, é desejável que o respectivo antigénio esteja presente não só num tipo especifico de tumor, mas também que esteja presente em altas concentrações (por ex., número de cópias por célula). É essencial a presença de epitopos na sequência de aminoácidos do antigénio, uma vez que esse peptideo ("peptídeo imunogénico"), derivado de um antigénio associado a tumor, deve induzir uma resposta da célula T in vitro ou in vivo.

Cerca de 30% dos pacientes sofrem de doença metastásica na apresentação e outros 25% dos pacientes apresentam tumor em estágio avançado localmente. Quarenta por cento dos indivíduos que se submetem a ressecção cirúrgica irão desenvolver metástase. Entre os indivíduos com doença metastática, cerca de 75% apresentam metástase pulmonar, 36% comprometimento de linfonodos e/ou partes moles, 20% comprometimento ósseo e 18% comprometimento hepático. A taxa de 5 anos de sobrevida varia de acordo com o sistema de estágios de Robson. De modo geral, o CCR ainda é fatal em cerca de 80% dos pacientes (Senn HJ, Drings P, Glaus A, Jungi WF, Pralle HB, Sauer R, and Schlag PM. Checkliste Onkologie, 5th edition. Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York (2001), Vokes EE, and Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)).

O carcinoma de células renais segue a classificação TNM (Guinan P. tnm Staging of Renal Cell carcinoma. Presented at 'Diagnosis and prognosis of Renal Cell Carcinoma: 1997 Workshop', Rochester, Minnesota, March 21-22, Communication of the UICC - Union Internationale Contre le Câncer, and AJCC -American Joint Committee on Câncer, published by ASC

American Society Câncer (1997), Communication of the UICC); vide as tabelas A e B a seguir. -16-

Tabela A: Classificação TNM de Carcinoma de Células Renais T1 <=7.0 cm, restrito ao rim T2 >7.0 cm, restrito ao rim NI um único linfonodo regional N2 mais de um linfonodo regional T3 avanço para grandes veias, invasão MO sem metástase à distância adrenal ou perirrenal.

Ml metástase à distância T4 ultrapassa a fáscia de Gerota

Sistema de Classificação TNM estágios ; AJCC Estágio I TI NO MO Estágio II T2 NO MO Estágio III TI NI MO T2 NI MO T3 NO, NI MO Estágio IV T4 NO, NI MO Qq T N2 MO Qq T Qq N Ml

Tabela B: Sistema de estágios de Robson para o Carcinoma de Células Renais e sobrevida de 5 anos

Classe do Taxa de sistema de sobrevida estágios de anos* Robson Estágios I / II 75% - 86% Estágio III 41% - 64% Estágio IV (T4) 15% - 18% Estágio IV (Ml) 0% - 3% * American Foundation for Urologic Disease O tratamento padrão para o CCR é a nefrectomia radical (em todos os estágios). A radioterapia pode ser usada para diminuir o avanço do cancro, mas os carcinomas de células renais em geral são resistentes à radiação. A terapia hormonal pode reduzir o crescimento do tumor em alguns casos (menos de -17- 10%) . Até o momento, a quimioterapia não mostrou actividade importante nessa doença. As drogas vimblastina, 5-fu (5-fluorouracil) e floxuridina (FUDR) são as drogas quimioterápicas mais estudadas, mas somente a 5-FU e seu metabólito FUDR mostraram uma taxa de actividade de 10-12% (Vokes EE, and Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)). A combinação de gencitabina e 5-FU resultou em resposta de 17%.

Os tratamentos imunológicos para CCR em estágio avançado como, por exemplo, o alfa-interferon (iFNa) ou interleucina-2 (IL-2), foram avaliados nos últimos anos pelas autoridades reguladoras nos EUA e na Europa. Até o presente momento, o tratamento com alta dosagem de IL-2 ainda é o único regime imunológico aprovado pelo FDA. Inicialmente, relatou-se que a monoterapia com IFNa apresentava um índice de resposta de 25-30%, porém estudos adicionais sugeriram que o índice real de resposta seria de apenas uns 10% (Vokes EE, and Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)). A IL-2 parece ter um índice global de resposta similar ao INFa, com aproximadamente 5% dos pacientes obtendo remissão completa permanente (Rosenberg 1987). Uma recente meta-análise com mais de 6.000 pacientes com CCR em estágio avançado concluiu que, em média, é possível obter um índice de resposta clínica de somente 12,9% com a terapia com citoquinas, como p.ex. o iFN-α, injecções de bolo de IL-2 de alta dosagem ou inalação de IL-2. A mesma análise obteve uma resposta de 4,3% para o placebo e 2,5% para os braços de controlo de não-imunoterapia (Cochrane Database Syst Rev. 2000; (3):CD001425. Immunotherapy for advanced renal cell câncer. Coppin C, Porzsolt F, Awa A, Kumpf J, Coldman A, Wilt T) .

Embora as novas terapias tenham mostrado uma eficácia clínica em diversas entidades tumorais e tenham sido aprovadas nos últimos anos, as taxas de sobrevida para o carcinoma de células renais não se alterou significativamente na última -18- década. As opções actuais de tratamento sistémico disponíveis, ou seja a quimioterapia e os tratamentos imunológicos, mostraram relativamente poucos resultados eficazes e o que é mais importante, eles são limitados por uma toxicidade sistémica importante. Consequentemente, existe considerável demanda médica - que não está sendo atendida - por novas opções de tratamento do carcinoma de células renais.

As células T auxiliares desempenham um importante papel na coordenação da função efectora das células T citotóxicas na imunidade antitumoral. Os epítopos das células T auxiliares que provocam uma resposta das células T auxiliares do tipo THl apoiam as funções efectoras das células T assassinas CD8+, que incluem funções citotóxicas dirigidas contra as células tumorais que apresentam complexos peptídeo/MHC associados ao tumor nas superfícies celulares. Desta forma, os epítopos peptídicos de célula T auxiliar associados a tumores, isoladamente ou em combinação com outros peptídeos associados a tumores, podem servir como ingredientes farmacêuticos activos em composições de vacinas estimuladoras das respostas imunes antitumorais. 0 principal objectivo no desenvolvimento de uma vacina antitumoral é, portanto, identificar e caracterizar novos antigénios associados a tumores e epítopos T auxiliares imunogénicos derivados desses novos antigénios, que possam ser reconhecidos por células T citotóxicas CD8+, ou células T CD4 + , em especial células T CD4+do tipo THi. Portanto, objecto da presente invenção é apresentar novas sequências de aminoácidos para esses peptídeos que tem a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I (HLA classe I) . Fora isso, também é um objecto da invenção presente, fornecer uma vacina eficaz de anti-cancro que é - pelo menos em parte -baseada nos novos peptídeos mencionado. -19-

De acordo com a presente invenção, atinge-se o primeiro objectivo ao se produzir peptideo associado a tumor escolhido do grupo de peptideos de acordo com a SEQ ID N° 2 da listagem de sequências anexa, ou um peptideo de acordo com a SEQ ID No. 2, onde a cadeia lateral citada de um ou dois residuos de aminoácidos são alterados, onde o peptideo citado tem a capacidade de se ligar a uma molécula do principal complexo de histocompatibilidade (MHC) humano classe I (HLA classe I)HLA-A*02.

Na presente invenção, os inventores demonstram que é possível isolar e caracterizar peptideos que se ligam a moléculas HLA classe I ou II directamente de tumores de mamíferos, preferencialmente tumores humanos, preferencialmente carcinomas de células renais. A presente invenção descreve peptideos que se originam de antigénios associados com a génese de tumores e que têm a capacidade de se ligar de tal modo a moléculas HLA classe II para desencadear uma resposta imune de leucócitos humanos, especialmente em linfócitos, em linfócitos T, em linfócitos T CD4+, em linfócitos T CD4+ que intermediam respostas imunes do tipo THi. A presente invenção proporciona peptideos que se originam de antigénios HLA-A*02 associados com a génese de tumores e que têm a capacidade de se ligar de tal modo a moléculas HLA classe I HLA-A*02 de forma a provocar uma resposta imune de leucócitos humanos, especialmente em linfócitos, especialmente linfócitos T, especialmente linfócitos T citotóxicos CD8+.

Os peptideos se originam de antigénios associados a tumores, especialmente de antigénios associados a tumores com função por exemplo na proteólise, angiogénese, crescimento celular, regulação do ciclo celular, divisão celular, regulação da transcrição, regulação da translação, invasão tecidual, incluindo, por exemplo, peptideos associados a tumor -20- da metaloproteinase matricial 7 (MMP 7; SEQ ID N° 1) e da apolipoproteina Ll (APOLl; SEQ ID N° 4).

Na presente invenção, os inventores dão provas conclusivas de que os peptideos associados a tumores que se ligam de forma promíscua a moléculas HLA classe II, especialmente aqueles alelos de HLA classe li geneticamente codificados por loci HLA DR do genoma humano, são capazes de provocar respostas imunes mediadas por células humanas T CD4+. As células T CD4+ foram isoladas a partir de sangue periférico, mostrando que os peptideos objecto das reivindicações são capazes de provocar respostas de células T do sistema imunológico humano contra peptideos seleccionados do peptidoma das células tumorosas. Como mostrado mais adiante com um peptídeo do MMP7 (SEQ ID N° 1), esse peptídeo associado a tumor que se liga promiscuamente a HLA DR foi reconhecido pelas células T CD4+.

Da forma semelhante, descobriu-se que os peptideos associados a tumor suficientemente ligados a moléculas HLA classe I podem provocar respostas imunes mediadas por linfócitos T citotóxicos CD8+, igualmente demonstrando que os peptideos reivindicados são capazes de provocar respostas do sistema imunológico humano contra peptideos seleccionados do peptidoma das células do tumor.

Como os peptideos podem ser sintetizados quimicamente e ser usados como ingredientes farmacológicos activos de preparações farmacêuticas, os peptideos proporcionados pela presente invenção podem ser usados em imunoterapia, preferencialmente em imunoterapia oncológica.

Com o intuito de identificar ligantes HLA classe I ou II do antigénio associado a tumor para o desenvolvimento de imunoterapia baseada em peptideos, os inventores procuraram isolar peptideos directamente de tumores sólidos, em especial do carcinoma de células renais (CCR) (vide exemplos abaixo).

Os motivos para focar no CCR para apresentar provas técnicas do conceito foram os seguintes: cerca de 150.000 -21 - novas pessoas no mundo por ano recebem diagnóstico de CCR; a doença está associada a um elevado indice de mortalidade que resulta em cerca de 78.000 óbitos por ano. (Pavlovich, C.P. and L.S. Schmidt. 2004. Searching for the hereditary causes of renal-cell carcinoma. Nat. Rev. Câncer 4:381-393). Quando são diagnosticadas metástases, o indice de sobrevida de um ano cai para cerca de 60% (Jemal, A., R.C. Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A. Samuéis, E. Ward, E.J. Feuer, and M.J. Thun. 2004. Câncer statistics, 2004. CA Câncer J. Clin. 54:8-29), enfatizando a grande demanda médica não atendida nessa indicação. Pelo fato de o CCR aparentemente ser um tumor imunogénico (Oliver RTD, Mehta A, Barnett MJ. A phase 2 study of surveillance in patients with metastatic renal cell carcinoma and assessment of response of such patients to therapy on progression. Mol Biother. 1988;1:14-20. Gleave M, Elhilali M, Frodet Y, et al. Interferon gamma-lb compared with placebo in metastatic renal cell carcinoma. N Engl j Med. 1998;338:1265), como indicado pela existência de linfócito T citotóxico que reage e se infiltra no tumor (Finke, J.H., P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R.R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes, and R. Bukowski. 1990. Characterization of the cytolytic activity of CD4+ and CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes in human renal cell carcinoma. Câncer Res. 50:2363-2370), foram iniciados ensaios clínicos para desenvolver vacinas antitumor baseadas em peptídeos (wierecky J, Mueller M, Brossart P. Dendritic cell-based câncer immunotherapy targeting MUC-1. Câncer Immunol Immunother. 2005 Apr 28). No entanto, devido à ausência de epitopos de célula T auxiliar de antigénio associado a tumor, as vacinas definidas molecularmente em geral englobam peptideos que funcionam somente como ligantes classe I. O segundo objecto da presente invenção é resolvido através de uma preparação farmacêutica, de preferência sob a forma de uma vacina que seja eficaz contra as células cancerosas, em especial células de tumores sólidos, -22- compreendendo uma quantidade eficaz de um peptideo de acordo com a invenção, ou compreendendo um ácido nucleico que codifica tal um peptideo.

Além disso, a vacina pode conter peptideos adicionais e/ou excipientes para ser mais eficiente, como será melhor explicado mais adiante. 0 peptideo ou o ácido nucleico que codifica o peptideo também podem constituir uma vacina contra tumor ou cancro. Ele pode ser aplicado directamente no paciente, no órgão afectado ou de forma sistémica, ou aplicado ex vivo a células oriundas do paciente ou a uma linhagem de células humanas que são posteriormente aplicadas ao paciente, ou usado in vitro para seleccionar uma subpopulação das células imunes do paciente as quais são então novamente aplicadas a ele.

Num primeiro aspecto da invenção, é proporcionado um peptideo contendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID N° 2 (VMAGDIYSV).

Como descrito mais adiante, os peptideos que formam a base da presente invenção foram identificados como sendo apresentados por células portadoras de MHC classe I (CCR). Assim, estes peptideos em particular, bem como outros peptideos contendo a sequência (isto é, peptideos derivados), todos eles provocam uma resposta especifica de célula T, embora o grau de indução da resposta possa variar de peptideo para peptideo. As diferenças, por exemplo, poderiam ser causadas por mutações nos referidos peptideos (vide abaixo) . 0 técnico neste assunto conhece bem os métodos passíveis de serem aplicados para determinar o grau de indução de uma resposta pelo peptideo individual, em particular com referência aos exemplos aqui contidos e à respectiva literatura.

Preferivelmente um peptideo de acordo com a presente invenção consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No 2. -23- "Consiste essencialmente de" significa que um peptideo, além da sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID No. la SEQ ID No. 11 ou uma variante das mesmas, contém trechos adicionais localizados em terminal N e/ou C de aminoácidos que não fazem, necessariamente, parte do peptideo que funciona como sequência núcleo do peptideo compreendendo o motivo da ligação e como um epitopo de célula T auxiliar imunogénico.

No entanto, esses trechos podem ser importantes na finalidade de proporcionar uma introdução eficaz do peptideo para as células de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade da presente invenção, o peptideo da presente invenção compreende o terminal N de 80 aminoácidos da cadeia invariante HLA-DR associada a antigénio (p33, no seguinte "li") como derivado do NCBI, GenBank Número acessão X00497 (Strubin, M., Mach, B. e Long, E.O. A sequência completa do mRNA para cadeia invariante associada a HLA-DR revela um polipeptideo com uma polaridade transmembrana incomum EMBO J. 3 (4), 869 — 872 (1984)) .

Com o termo "variante" da sequência de aminoácidos em questão, queremos dizer que as cadeias laterais de, por exemplo, um ou dois dos resíduos de aminoácidos estão alteradas (por exemplo, ao substitui-las pela cadeia lateral de outro resíduo de aminoácido ocorrendo naturalmente ou por outra cadeia lateral) de tal forma que o peptideo ainda seja capaz de se ligar a uma molécula HLA de modo substancialmente igual ao peptideo formado pela sequência de aminoácidos em questão. Por exemplo, um peptideo pode ser modificado de modo a pelo menos manter, se não melhorar, sua capacidade de interagir com e de ligar-se a uma molécula MHC apropriada, como a HLA-DRBl no caso das moléculas HLA classe II, ou HLA-A2 no caso de moléculas de classe I, e de tal modo que pelo menos

mantenha, ou melhore, a capacidade de gerar linfócitos T citotóxicos activados que possam reconhecer e eliminar as -24- células que expressem de maneira anormal um polipeptídeo que contenha uma sequência de aminoácidos como a definida nos aspectos da invenção, ou a capacidade de estimular as células T auxiliares que podem ajudar as células T CD8+ ou atacar directamente células alvo ao secretarem citoquinas. Como é possível deduzir da base de dados descrita a sequir, certas posições de peptídeos que se ligam a HLA-DR são tipicamente resíduos âncora que formam uma sequência cerne que se encaixa no motivo de ligação do sulco de ligação do HLA. Modificações destes ou de outros resíduos envolvidos na ligação de HLA-DR podem melhorar a ligação sem alterar o reconhecimento de linfócitos T citotóxicos.

Os resíduos de aminoácidos que não são essenciais para a interacção com o receptor de células T podem ser modificados mediante substituição por outro aminoácido cuja incorporação não gere substancial reactividade da célula T e não elimine a ligação ao MHC relevante. Assim, independentemente da ressalva acima, o peptídeo da invenção pode ser qualquer peptídeo (termo esse em que incluímos os oligopeptídeos ou polipeptídeos) que inclua as sequências de aminoácidos, uma parte ou uma variante delas, conforme indicado. É sabido que os peptídeos apresentados por MHC classe II são compostos por uma "sequência cerne" que tem um determinado motivo aminoácido específico para o hla e, opcionalmente, extensões de terminal N e/ou C que não interferem na função da sequência cerne (isto é, que sejam considerados irrelevantes para a interacção do peptídeo e da célula T) . As extensões de terminal N e/ou C podem ter um comprimento de 1 a 10 aminoácidos, respectivamente. Assim, um peptídeo preferencial da presente invenção exibe um comprimento total entre 9 e 100 aminoácidos, preferivelmente entre 9 e 30 aminoácidos e mais preferencialmente entre 9 e 16 aminoácidos. Estes peptídeos podem ser usados directamente para carregar moléculas MHC de classe II ou a sequência pode -25- ser clonada em vectores de acordo com a descrição abaixo. Como estes peptideos formam o produto final do processamento de peptideos maiores dentro da célula, peptideos mais longos também podem ser usados. Os peptideos podem ser de qualquer tamanho, mas normalmente eles podem ser inferiores a 100.000 Da em peso molecular, de preferência menos de 50.000 Da, mais preferivelmente menos de 10.000 Da e tipicamente cerca de 5.000 Da. Em termos do número de resíduos de aminoácidos, os peptideos podem ter menos de 1.000 resíduos, de preferência menos de 500 resíduos, mais preferivelmente menos de 100 residuos.

No principal aspecto da presente invenção, semelhante à situação explicada acima a respeito das moléculas MHC classe II, os peptideos da invenção podem ser utilizados para provocar uma resposta especifica de MHC classe I, Um peptídeo preferencial especifico de MHC classe I exibe um comprimento total entre 9 e 16 aminoácidos, e de preferência entre 9 e 12 aminoácidos. Entende-se que os peptideos podem ser usados (por exemplo, em uma vacina) como peptideos mais longos, semelhante a peptideos MHC da classe II. Os métodos para identificar "sequências cernes" especificas de MHC classe I contendo um determinado motivo aminoacidico especifico para moléculas HLA classe I são de conhecimento do profissional habilitado nessa arte e podem ser previstos, por exemplo, pelos softwares PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) e SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de) (vide abaixo).

Os peptideos da invenção são particularmente úteis em métodos imunoterápicos para permitir que células T reconheçam células que expressem de maneira anormal polipeptideos que formam a base dos peptideos. Uma vez que esses peptideos específicos que consistem de determinadas sequências de aminoácidos se ligam a moléculas HLA classe I HLA-A*02, prefere-se que os peptideos da invenção sejam peptideos que se liguem a moléculas HLA classe I HLA-A*02 e quando assim ligados o complexo de peptideos HLA esteja presente na -26- superfície de célula apropriada apresentando antigénio, seja capaz de provocar a estimulação de células T que reconhecem células que expressam de maneira anormal um polipeptideo formado pela sequência dada de aminoácidos.

Se for utilizado directamente um peptideo maior do que aproximadamente 12 residuos de aminoácidos para se ligar a uma molécula MHC, é preferível que os residuos que flanqueiam a região de ligação do HLA cerne sejam do tipo que não afectem substancialmente a capacidade do peptideo de se ligar especificamente ao sulco de ligação da molécula MHC ou de apresentar o peptideo para as células T. Contudo, como já indicado acima, perceber-se-á que é possível utilizar peptídeos maiores, especialmente quando codificados por um polinucleotídeo, já que estes peptídeos maiores podem ser fragmentados por células apresentadoras de antigénios apropriadas.

Exemplos de peptídeos de ligantes de MHC, motivos, variantes, bem como certos exemplos de extensões de terminais N e/ou C podem ser, por exemplo, derivados do banco de dados SYFPEITHI (Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3-4):213-9. Review.) em http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/ e as referências ali citadas.

Como exemplos não limitantes, certos tipos de peptídeos para HLA-DR no banco de dados são K Η K V Y A C E V T H Q G L S S derivados da cadeia kappa de Ig 188-203 (Kovats et al. Eur J Immunol. 1997 Apr;27(4) :1014-21) ; K V Q W K V D N A L Q S G N S derivados da cadeia kappa de Ig 145-159 (Kovats et al. Eur J Immunol. 1997 Apr;27(4):1014-21), L P R L I A F T S E H S H F derivados de GAD65 270-283 (Endl et al. J Clin Invest. 1997 May 15 ; 99 (10):2405-15) ou F FRMVISNPA A T HQDIDFLI derivados de GAD65 556-575 (Endl et al. J Clin Invest. 1997 May 15; 99(10):2405-15) . Além disso, os peptídeos podem também derivar-se de sequências mutadas de antigénios, -27-

como no caso de ATGFKQSSKA L Q R P V A S derivada da proteína de fusão bcr-abl 210 kD (ten Bosch et al. Blood. 1996 Nov 1;88 (9) :3522-7), G YKVLVLNPS V A A T derivada de HCV-1 NS3 28-41 (Diepolder et al. J Virol. 1997 Aug;71 (8) :6011-9) , ou FRKQNPDIV IQYMDDLYVG derivada de HIV-1 (HXB2) RT 326-345 (van der Burg et al. J Immunol. 1999 Jan 1,-162(1) : 152 O kD 1 Todos aminoácidos "âncora" (vide Friede et al., Biochim Biophys Acta. 1996 Jun 7;1316(2) :85-101,- Sette et al. J Immunol. 1993 Sep 15,-151(6) :3163-70.; Hammer et al. Cell. 1993 Jul 16;74 (1) :197-203., and Hammer et al. J Exp Med. 1995 May 1;181 (5):1847-55). Como os exemplos de HLA-DR4 foram indicados em negrito, as supostas sequências cerne foram sublinhadas. O termo "variantes" da sequência de aminoácidos dada engloba todos os peptídeos descritos acima.

No termo "peptídeo" os inventores incluem não só moléculas nas quais os resíduos de aminoácidos são unidos por ligações peptídicas (-CO-NH-), mas também moléculas onde a ligação peptídica está invertida. É possível produzir esta peptidomimética retroinversa utilizando métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, os métodos descritos em Meziere et al (1997) J. Immunol. 159,3230-3237. Esta abordagem implica fazer pseudopeptídeos contendo alterações relacionadas com o esqueleto e não com a orientação das cadeias laterais. Meziere et al (1997) mostram que, pelo menos no que se refere às respostas de célula T auxiliar e MHC classe II, esses pseudopeptídeos são úteis. Os peptídeos retroinversos contendo ligações NH-CO ao invés de ligações peptídicas CO-NH são muito mais resistente à proteólise.

Tipicamente, o peptídeo da invenção é do tipo que, se expresso numa célula apresentadora de antigénio, pode ser processado de modo a produzir um fragmento capaz de ligar-se a uma molécula MHC apropriada e pode ser apresentado por uma célula adequada e provocar uma resposta da célula T apropriada. Como poderá ser observado, um fragmento produzido -28- a partir do peptídeo também pode ser um peptídeo da invenção. Convenientemente, o peptídeo da invenção contém uma fracção que inclui a sequência de aminoácidos dada e uma porção adicional que confere propriedades desejáveis. Por exemplo, a porção adicional pode incluir outro epitopo de célula T (quer seja derivado ou não do mesmo polipeptídeo da primeira porção contendo o epitopo de célula T) ou uma proteína portadora ou peptídeo. Assim, em uma outra modalidade, o peptídeo da invenção é uma proteína de fusão de um fragmento de proteína e um ou mais sequências de aminoácidos inventivas. Numa variante particularmente preferida, os peptídeos da invenção incluem as sequências de aminoácidos da invenção e pelo menos mais um epitopo de célula T, sendo esse epitopo adicional de célula T capaz de facilitar a produção de uma resposta da célula T dirigida ao tipo de tumor que expresse de maneira anormal um antigénio associado ao tumor. Assim, os peptídeos da invenção incluem polipeptídeos do tipo "colar de contas", que também podem ser usados como vacina. Esses peptídeos podem ser espaçados por ligandos químicos que podem conter aminoácidos (como por exemplo alongamentos G), mas que podem compreender -adicionalmente ou alternativamente - grupos de ligação química (ou seja, sem função, excepto a de proporcionar um espaçamento em particular).

Com o termo "expresso de maneira anormal" os inventores incluem o sentido de que o polipeptídeo está superexpresso em comparação com os níveis normais de expressão ou de que o gene está silencioso no tecido do qual se deriva o tumor, mas que está expresso no tumor. Por "superexpresso" os inventores entendem que o polipeptídeo está presente em nível pelo menos 1.2 x a mais que o nível apresentado pelo tecido normal; de preferência, pelo menos 2 x a mais e, com maior preferência, pelo menos 5 x ou 10 x a mais que o nível presente no tecido normal.

Os peptídeos (ao menos aqueles que contém ligações peptídicas entre resíduos de aminoácidos) podem ser -29- sintetizados pelo método Fmoc-poliamida de síntese peptídica em fase sólida descrito por Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433-3436, e referências ali contidas. A protecção temporária do grupo N-amino é viabilizada pelo grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). A clivagem repetitiva desse grupo protector altamente instável em meio básico é alcançada utilizando-se piperidina a 20% em N, N-dimetilformamida. As funcionalidades da cadeia lateral podem ser protegidas como os seus éteres butílicos (no caso de serina treonina e tirocina), ésteres butílicos (no caso de ácido glutâmico e ácido aspártico), derivado de butiloxicarbonilo (no caso de lisina e histidina), derivado de tritilo (no caso de cisteína) e derivado de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenosulfonilo (no caso de arginina). Onde a glutamina ou a asparagina forem resíduos de terminal C, utiliza-se o grupo 4,4'-dimetoxibenzidrilo para proteger as funcionalidades do amido da cadeia lateral. O suporte de fase sólida se baseia num polímero polidimetil-acrilamida formado pelos três monómeros dimetilacrilamida (monómero da cadeia principal), bisacriloiletileno diamina (agente reticulante) e acriloilsarcosina metil éster (agente funcionalizante). O agente reticulante clivável, peptídeo-resina utilizado é o derivado de ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético, instável em meio ácido. Todos os derivados de aminoácido são adicionados na forma dos seus derivados anidridos simétricos pré-formados, excepto a asparagina e a glutamina, que são adicionadas utilizando um procedimento de acoplamento reverso mediado por N, N-diciclohexil-cabodiimido/lhidroxibenzotriazola. Todas as reacções de acoplamento e desprotecção são monitorizadas utilizando os procedimentos de teste ninidrina, ácido trinitrobenzeno sulfónico ou isotina. Ao concluir a síntese, os peptídeos são clivados do suporte de resina com remoção concomitante dos grupos protectores da cadeia lateral mediante tratamento com ácido trifluoracético a 95% contendo uma mistura de agente depurador a 50 %. Os depuradores comummente usados são -30- etanoditiol, fenol, anisol e água, sendo que a escolha exacta depende dos aminoácidos que constituem o peptídeo que está sendo sintetizado. O ácido trifluoracético é removido por evaporação em vácuo, com subsequente trituração com éter dietilico, produzindo o peptideo bruto. Todos os agentes depuradores presentes são removidos através de um simples procedimento de extracção que, na liofilização da fase aquosa, produz o peptideo bruto livre de depuradores. Os reagentes para a síntese peptídica são fornecidos, geralmente, pela empresa Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Reino Unido. A purificação pode ser feita por qualquer técnica ou combinação de técnicas, tais como cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de troca de iões e, normalmente, cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa. A análise dos peptídeos pode ser feita utilizando-se cromatografia de camada fina, cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, análise de aminoácido posterior a hidrólise ácida, espectrometria de massa por bombardeio de átomos rápidos (BAR), bem como por espectrometria de massa MALDI e ESI-Q-TOF.

Um outro aspecto da invenção fornece um ácido nucleico (p. ex., um polinucleotídeo) que codifica o peptídeo da invenção. O ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA ou combinações destes, podendo conter ou não íntrons, contanto que codifique o peptídeo. Naturalmente, apenas os peptídeos contendo resíduos de aminoácidos de ocorrência natural, unidos pelas ligações peptídicas também de ocorrência natural, podem ser codificados por um polinucleotídeo. Ainda um outro aspecto da invenção fornece um vector de expressão capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com a invenção.

Foi desenvolvida uma série de métodos para ligar funcionalmente os polinucleotídeos, especialmente o DNA, aos -31- vectores, por exemplo via terminais coesivos complementares. Por exemplo, é possível juntar trechos homopoliméricos ao segmento do DNA a ser inserido no DNA do vector. Posteriormente, o vector e o segmento de DNA são unidos por ligações de hidrogénio entre as caudas homopoliméricas para formar moléculas de DNA recombinante.

Os ligandos sintéticos que contêm um ou mais sítios de restrição oferecem um método alternativo para unir o segmento de DNA aos vectores. 0 segmento de DNA gerado por digestão de endonuclease de restrição, conforme descrito anteriormente, é tratado com DNA polimerase do bacteriófago T4 ou DNA polimerase I da E. coli, enzimas que removem os terminais proeminentes de cadeias simples de 3' com as suas actividades exonucleolíticas de 3'-5' e preenchem extremidades de 3' com as suas actividades polimerizadoras.

Portanto, a combinação dessas actividades gera segmentos de DNA de extremidades truncadas. Os segmentos de extremidades truncadas são então incubados com um grande excedente molar de moléculas de ligação na presença de enzima capaz de catalizar a ligação de moléculas de DNA de extremidades truncadas, tais como DNA ligase de bacteriófago T4. Assim, os produtos da reacção são segmentos de DNA com sequências de ligandos poliméricos em suas extremidades. Esses segmentos de DNA são então clivados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vector de expressão que tenha sido clivado com uma enzima produtora de terminais compatíveis com aqueles do segmento de DNA.

Os ligandos sintéticos contendo uma série de sítios de endonuclease de restrição podem ser adquiridos de diversos fornecedores, inclusive da International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, EUA.

Uma forma desejável de modificar o DNA que codifica o polipeptídeo da invenção é usar a reacção em cadeia da polimerase, como proposto por Saiki et al (1988) Science 239,487-491. Esse método pode ser usado para introduzir o DNA -32- em um vector apropriado, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética em sitios de restrição apropriados, ou para modificar o DNA de outras formas proveitosas conhecidas no estado da técnica. Nesse método, o DNA, para ser amplificado enzimaticamente, é flanqueado por dois primers específicos que são incorporados ao DNA amplificado. Os referidos primers específicos podem conter sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição utilizáveis para clonagem de vectores de expressão por meio de métodos conhecidos no estado da técnica. 0 DNA (ou, no caso dos vectores rectrovirais, o RNA) é então expresso em um hospedeiro adequado para produzir um polipeptídeo que englobe o composto da invenção. Assim, o DNA que codifica o polipeptídeo constitutivo do composto da invenção pode ser usado de acordo com as técnicas conhecidas e modificado de maneira apropriada à luz dos ensinamentos contidos na presente descrição para formar um vector de expressão que posteriormente será utilizado para transformar uma célula hospedeira apropriada para a expressão e produção do polipeptídeo da invenção. Essas técnicas incluem as descritas nas patentes dos Estados Unidos de números 4,440,859 concedida em 3 de Abril de 1984 a Rutter et al, 4,530,901 concedida em 23 de Julho de 1985 a Weissman, 4,582,800 concedida em 15 de Abril de 1986 a Crowl, 4,677,063 concedida em 30 de Junho de 1987 a Mark et al, 4,678,751 concedida em 7 de Julho de 1987 a Goeddel, 4, 704,362 concedida em 3 de Novembro de 1987 a Itakura et al, 4, 710, 463 concedida em 1 de Dezembro de 1987 a Murray, 4, 757, 006 concedida em 12 de Julho de 1988 a Toole, Jr. et al, 4, 766,075 concedida em 23 de

Agosto de 1988 a Goeddel et al, e 4, 810, 648 concedida em 7 de Março de 1989 a Stalker. O DNA (ou, no caso dos vectores rectrovirais, o RNA) que codifica o polipeptídeo constitutivo do composto da invenção pode ser associado a uma grande variedade de outras sequências de DNA para a introdução em um hospedeiro -33- apropriado. 0 DNA associado dependerá da natureza do hospedeiro, da maneira como o DNA é introduzido no hospedeiro e de se o objectivo em vista é a permanência ou a integração epissomal.

Em geral, o DNA é inserido num vector de expressão, como por exemplo um plasmidio, na orientação correcta e dentro da estrutura certa para a expressão. Se necessário, o DNA pode ser ligado às sequências nucleotidicas de controlo regulatório transcricional e translacional apropriadas, reconhecidas pelo hospedeiro desejado, embora esses controlos estejam geralmente disponíveis no vector de expressão. Depois, o vector é introduzido no hospedeiro por meio de técnicas padrão. Em geral, nem todos os hospedeiros serão transformados pelo vector. Portanto, será necessário seleccionar células hospedeiras transformadas. Uma técnica de selecção consiste em incorporar uma sequência de DNA no vector de expressão, com todos os elementos de controlo necessários, sequência esta que codifique uma caracteristica seleccionável na célula transformada, como por exemplo a resistência a antibióticos.

Alternativamente, o gene para esta caracteristica seleccionável pode estar em outro vector, usado para conjuntamente transformar a célula hospedeira desejada.

Depois, as células hospedeiras transformadas pelo DNA recombinante da invenção são cultivadas por tempo suficiente sob condições apropriadas conhecidas dos especialistas, à luz dos ensinamentos aqui descritos, para permitir a expressão do polipeptideo, que poderá, então, ser recuperado. São conhecidos muitos sistemas de expressão, inclusive bactérias (por exemplo E. colí e Bacillus subtilis), leveduras (por exemplo Saccharomyces cerevisiae), fungos filamentosos (por exemplo, Aspergillus), células de plantas, de animais e de insectos. De preferência, o sistema pode ser de células de CCR ou Awells.

Um promotor é um elemento de controlo de expressão formado por uma sequência de DNA que permite haver a ligação -34- do RNA polimerase e a transcrição. As sequências promotoras compatíveis com hospedeiros bacterianos exemplares são apresentadas normalmente nos vectores plasmídicos que contenham sítios convenientes de restrição para a inserção de um segmento de DNA da presente invenção. Os vectores plasmídicos procarióticos característicos são pUC18, pUC19, pBR322 e pBR329, comercializados por Biorad Laboratories (Richmond, CA, EUA), bem como pTrc99A e pKK223-3, comercializados por Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA.

Um plasmídio vector de célula de mamífero é o pSVL, comercializado por Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA. Esse vector usa o promotor tardio SV40 para dirigir a expressão de genes clonados, sendo o nível máximo de expressão encontrado em células produtoras de antigénio T, como por exemplo as células COS-1. Um exemplo de vector de expressão induzível de mamífero é o pMSG, também fornecido por Pharmacia. Esse vector utiliza o promotor induzível por glicocorticóide da repetição de terminal longo do vírus do tumor mamário de ratinhos para dirigir a expressão do gene clonado. Os plasmídios vectores de levedura úteis são pRS403-406 e pRS413-416, que podem ser obtidos da Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. OS plasmídios pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmídios integradores de leveduras (YIps) e incorporam os marcadores seleccionáveis de levedura HIS3, TRPl, LEU2 e URA3. Os plasmídios pRS413-416 são plasmídios centrómeros de levedura (Ycps). Outros vectores e sistemas de expressão são conhecidos no estado da técnica para uso com série de células hospedeiras. A presente invenção também se refere a uma célula hospedeira transformada com uma variante de polinucleotídeo vector de acordo com a presente invenção. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica. As células bacterianas podem ser células hospedeiras procarióticas preferidas em algumas circunstâncias e, normalmente, são uma cepa de E. coli, tais como, por exemplo, a cepa DH5 de E. coli, que pode -35- ser obtida dos Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA, e RRl, da American Type Culture Collection (ATCC) e Rockville, MD, EUA (No ATCC 31343) . Entre as células hospedeiras eucarióticas preferidas estão as células de levedura, de insectos e de mamíferos, de preferência células de vertebrados, como ratinhos, ratos, macacos, ou linhagens de células renais e fibroblásticas humanas. Entre as células hospedeiras de levedura estão YPH499, YPH500 e YPH501, que podem ser obtidas da Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA YPH501, EUA. Entre as células hospedeiras preferidas de mamíferos estão células de ovário de hamster chinês (CHO), obteníveis da colecção ATCC sob referência CCL61, células de embrião de ratinho suíço NIH/3T3, obteníveis da ATCC sob referência CRL 1658, células COS-1 derivadas de rins de macaco, obteníveis da ATCC sob referência CRL 1650, e células 293, que são células renais embrionárias de humanos. As células de insectos preferidas são as células Sf9, que podem ser transfectadas com vectores de expressão de baculovírus. A transformação de células hospedeiras apropriadas com uma construção de DNA da presente invenção é obtida por métodos bem conhecidos que normalmente dependem do tipo de vector utilizado. Com relação à transformação das células hospedeiras procarióticas, vide, por exemplo, Cohen et al (1972) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 69,2110 e Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. A transformação de células de levedura é descrita em Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. O método de Beggs (1978) Nature 275,104-109 também é útil. Com relação às células de vertebrados, reagentes úteis para a transfecção dessas células, por exemplo, fosfato de cálcio e DEAE-dextrana ou formulações lipossomais, podem ser obtidas da Stratagene Cloning Systems ou da Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA. A electroporação também é útil para transformar e/ou transfectar células e é bem conhecida no -36- estado da técnica para transformar células de levedura, de bactérias, de insectos e de vertebrados.

As células transformadas com sucesso, isto é, células que contêm uma construção de DNA da presente invenção, podem ser identificadas utilizando técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as células resultantes da introdução de uma construção de expressão da presente invenção podem ser cultivadas para produzir o polipeptideo da invenção. As células podem ser colhidas e lisadas e o seu conteúdo de DNA pode ser examinado quanto à presença do DNA utilizando um método como o descrito por Southern (1075) J.Mol. Biol. 98,503 ou Berent et al (1985) Biotech. 3,208. Alternativamente, é possível detectar a presença da proteína no sobrenadante utilizando anticorpos, conforme descrito abaixo.

Além do exame directo para detectar a presença do DNA recombinante, é possível confirmar a transformação bem succedida por meio de métodos imunológicos conhecidos, nos casos em que o DNA recombinante é capaz de dirigir a expressão da proteína. Por exemplo, as células transformadas com sucesso com um vector de expressão produzem proteínas que apresentam antigenicidade adequada. As amostras de células tidas como provavelmente transformadas são colhidas e examinadas quanto à presença da proteína utilizando anticorpos apropriados. Assim, além das próprias células hospedeiras transformadas, a presente invenção também contempla a cultura dessas células, de preferência uma cultura monoclonal (com homogeneidade clonal), uma cultura derivada de uma cultura monoclonal, em meio nutriente.

Observar-se-á que certas células hospedeiras da invenção são úteis na preparação dos peptídeos da invenção, por exemplo, as células de bactérias, leveduras ou s insectos. No entanto, outras células hospedeiras podem ser úteis em certos métodos terapêuticos. Por exemplo, as células apresentadoras de antigénios, tais como as células dendríticas, podem ser usadas com proveito para expressar os -37- peptídeos da invenção de modo a poderem ser carregados em moléculas MHC apropriadas.

As células hospedeiras preferenciais são as células de CCR ou as células Awells. Dá-se preferência a um método de produzir um peptídeo associado a tumor de acordo com a presente invenção, compreendendo esse método a cultura da célula hospedeira de acordo com a presente invenção, e isolando o peptideo da célula hospedeira ou de seu meio de cultivo, de acordo com os métodos padrão.

Outro aspecto da invenção proporciona um método de produção de peptídeo para uso oral, rectal, nasal ou lingual, injecção intravenosa (i.v.), subcutânea (s.c.), intradérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) e intramuscular (i.m.). As vias preferidas para a injecção do peptídeo são as injecções s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. As vias preferidas para a injecção do DNA são as injecções i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Podem-se administrar doses entre 1 e 500 mg do peptídeo ou do dna, conforme descrito mais adiante.

Um outro aspecto da invenção refere-se a utilização de um peptídeo associado a tumor de acordo com a invenção, um ácido nucleico de acordo com a invenção ou um vector de expressão de acordo com a invenção na medicina. O objecto da presente invenção, em um outro aspecto da mesma, é resolvido através de uma composição farmacêutica que contém pelo menos peptídeo associado a tumor de acordo com SEQ ID No. 2 e de acordo com a invenção, um ácido nucleico de acordo com a invenção ou um vector de expressão acordo com a invenção, bem como um veículo farmaceuticamente aceitável. O composto é usado para administração parenteral, como por exemplo por via subcutânea, intradérmica, intravenosa ou intramuscular, ou administração oral. Para isso, os peptídeos são dissolvidos ou suspensos num veículo farmaceuticamente aceitável, de preferência um veículo aquoso. Além disso, o composto pode conter excipientes como tampões, ligantes, -38- agentes desintegrantes, diluentes, flavorizantes, lubrificantes, etc. Os peptideos podem também ser administrados juntamente com substâncias imunoestimulantes como, por exemplo, as citoquinas. Uma relação completa de excipientes utilizáveis nessa composição pode ser consultada, por exemplo, em A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. A composição pode ser usada para a prevenção, profilaxia e/ou terapia de doenças adenomatosas ou cancerígenas. A preparação farmacêutica, contendo pelo menos um dos peptideos da presente invenção de acordo com SEQ ID No. 2, um ácido nucleico de acordo com a invenção - ou um vector de expressão de acordo com a invenção - é administrado a um paciente que sofre de uma doença adenomatosa ou cancerígena que está associada com o respectivo peptídeo ou antígeno. Dessa forma, é possível provocar uma resposta imune mediada por célula T. O composto farmacêutico de acordo com a presente invenção preferencialmente engloba ainda ao menos mais um peptídeo associado a tumor englobando uma das sequências entre SEQ ID N° 3a SEQ ID N° 10, um ácido nucleico respectivo ou um vector de expressão respectivo.

Em geral, os peptideos que estão presentes na composição farmacêutica de acordo com a invenção têm as mesmas propriedades como descrito acima para os peptideos da presente invenção de acordo com a SEQ ID No. 2. Eles podem ter um comprimento total de entre 9 e 100, de preferência, entre 9 e 30, e mais preferivelmente entre 9 e 16 aminoácidos. Além disso, pelo menos um peptídeo de acordo com qualquer uma das SEQ ID No. la SEQ ID No. 11 pode incluir ligações não peptídicas. Além disso, os respectivos ácidos nucleico podem codificar entre 9 e 100, de preferência, entre 9 e 30, e mais preferivelmente entre 9 e 16 aminoácidos. -39- Dá-se preferência a uma composição farmacêutica de acordo com a invenção que englobe peptídeos (em especial, associados a tumores), consistindo em sequências de aminoácidos de acordo com a SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2 assim como as sequências SEQ ID N° 3 a SEQ ID N° 11. Dá-se preferência a uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, onde a quantidade de peptídeo(s) (em particular, associado[s] a tumor) de ácido nucleico(s) de acordo com a invenção ou vector(es) de expressão de acordo com a invenção, conforme presente em dita composição que seja(m) especifico (s) ao tecido, cancro e/ou paciente.

Os peptideos também podem ser etiquetados, ou uma proteína de fusão, ou mesmo uma molécula híbrida. 0 peptídeo pode ser substancialmente puro, ou combinado com um adjuvante imunoestimulante, ou usado em combinação com as citoquinas imunoestimulantes, ou ser administrado com um sistema de administração adequado, por exemplo lipossomas. Outros adjuvantes adequados são QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), derivada da saponina, extractos micobacterianos e imitadores sintéticos da parede celular bacteriana, e adjuvantes de marca como por exemplo Ribi's Detox. Também se pode utilizar o Quil A, outro adjuvante derivado da saponina (Superfos, Dinamarca). Outros adjuvantes, como por exemplo o da Freund, também podem ser úteis. 0 peptídeo também pode ser conjugado a um veículo adequado, tal como a hemocianina do molusco Megathura crenulata ou manana (vide WO 95/18145 e Longenecker e at (1993) Ann. NY Acad. Sei. 690,276-291). Já que um dos adjuvantes é definido como uma substância reforçando a resposta imunológica a um antígeno (MedlinePlus® Dicionário Médico, NIH) outras substâncias com

esta função podem ser usadas, incluindo agonistas de receptores do tipo "toll" mas não apenas estes (TLR agonistas), de preferência substâncias que interagem com de modo agonista com TLR 3, 7, 8 e 9, mais preferivelmente TLR 9, -40- como RNA de estabilização de protamina, CpG-oligonucleotídeos, CPR-oligonucleotídeos de dna bacteriano, imidazoquinolinos etc.

Outras substâncias conhecidas na arte por serem adequadas para melhorar a resposta imune incluem, inibidores de sintase induzida de óxido nítrico (iNOS), arginase (ARGl), indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), factor de crescimento endotelial vascular receptor 1 (VEGFR-1), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), ciclooxigenase-2 (COX-2), TGF-beta do receptor I (TGF-beta RI), entre outras. Esses inibidores podem ser, por exemplo, anticorpos monoclonais contra as referidas moléculas ou pequenas moléculas. Pequenas moléculas e anticorpos monoclonais conhecidos na arte por terem uma função inibitória perante os factores acima mencionados e, portanto, um efeito de melhoria da resposta imune são, por exemplo, 1-MT, NCX-4016, rofecoxib, Celebrex, BEC, ABH, nor- -NOHA, SB- -505124, SD-208, LY580276, AMD 3100, bevacizumab axitinibe, JSI-124, CPA-7, XL-999, ZD2171, pazopanib, CP-547632, e VEGF Trap.

Além disso, substâncias reduzindo o número de células T reguladoras (CD 4+, CD25+, FoxP3+) são adequadas como adjuvantes. Estas incluem, por exemplo, a ciclofosfamida (Cytoxan), ONTAK (denileukina diftitox), Sunitinib, anti-CTLA-4 (MDX-010, CP-675206), anti-CD25, anti-CCL22 e anti-GITR entre outras.

Em uma modalidade preferida, a vacina é uma vacina de ácido nucleico. Sabe-se que a inoculação com uma vacina de ácido nucleico, como uma vacina de DNA, codificando um polipeptídeo leva a uma resposta de células T. Ela pode ser aplicada directamente no paciente, no órgão afectado ou de forma sistémica, ou aplicada ex vivo em células derivadas do paciente ou linhagem de células humanas que são posteriormente administradas ao paciente, ou pode ainda ser usada in vitro para seleccionar uma subpopulação a partir de células imunes -41 - derivadas do paciente as quais são então novamente administradas ao paciente. Se o ácido nucleico for administrado a células in vitro, pode ser conveniente transfectar as células de forma que co-expressem as citoquinas imunoestimulantes, tais como a interleucina-2 ou GM-CSF. A vacina de ácido nucleico pode também ser administrada com um adjuvante, tal como a BCG ou alum . No entanto, é preferível que a vacina de ácido nucleico seja administrada sem adjuvante. O polinucleotideo pode ser substancialmente puro ou ser combinado com vector ou sistema de administração apropriados. Entre os vectores e sistemas de administração apropriados estão os de tipo virai, baseados no adenovirus, virus da vacina, rectrovirus, virus de herpes, vírus adeno-associado ou híbrido contendo elementos de mais de um vírus. Os sistemas de administração não virais incluem lipídios catiónicos e polímeros catiónicos e são bem conhecidos no estado da técnica da administração de DNA. Também é possível recorrer à administração física, por exemplo, via "canhão de genes". 0 peptídeo ou o peptídeo codificado pelo ácido nucleico pode ser uma proteína de fusão, por exemplo, com um epitopo de toxóide de tétano que estimule as células τ CD4+.

Assim, convenientemente, todo ácido nucleico administrado ao paciente é estéril e livre de pirogénios. 0 DNA nu pode ser administrado por via intramuscular, intradérmica ou subcutânea. Os peptídeos podem ser administrados por via intramuscular, intradérmica ou subcutânea.

Assim, convenientemente, a vacina de ácido nucleico pode englobar qualquer meio apropriado de administração de ácido nucleico. 0 ácido nucleico, de preferência DNA, pode estar nu, isto é, praticamente sem qualquer outro componente a ser administrado) ou pode ser administrado num lipossoma ou como parte integrante de um sistema de administração de vectores virais. -42-

Acredita-se que a absorção do ácido nucleico e a expressão do polipeptídeo codificado pelas células dendríticas podem ser o mecanismo de condicionamento da resposta imune; no entanto, as células dendriticas podem não estar transfectadas, mas permanecem importantes, porque podem captar o peptideo expressado das células transfectadas no tecido. ("cross-priming", e.g., Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Mesothelin-specific CD8(+) T-cell responses provide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic câncer patients. J Exp Med. 2004 Aug 2,-200(3) :297-306) . É preferível que a vacina de ácido nucleico, como, por exemplo, a vacina de DNA, seja administrada no músculo, enquanto que as vacinas peptídicas são aplicadas preferencialmente na forma subcutânea ou intradérmica. Também é preferido que a vacina seja administrada na pele. A vacina de ácido nucleico pode ser administrada sem adjuvante. A vacina de ácido nucleico pode também ser administrada com um adjuvante, como por exemplo BCG ou alume. Outros adjuvantes adequados são o QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), derivado da saponina, extractos micobacterianos e imitadores sintéticos da parede celular bacteriana, e adjuvantes de marca como por exemplo o Detox de Ribi. Também se pode utilizar o Quil A, outro adjuvante derivado da saponina (Superfos, Denmark). De preferência, a vacina de ácido nucleico é administrada sem adjuvante. Outros adjuvantes, como por exemplo o da Freund, também podem ser úteis. Também pode ser conveniente administrar o peptideo conjugado com hemocianina do molusco Megathura crenulata, de preferência também com um adjuvante. A imunoterapia do cancro mediada por polinucleotídeo é descrita em Conry et al (1996) Seminars in Oncology 23,135-147; Condon et al (1996) Nature Medicine 2,1122-1127; Gong et al (1997) Nature Medicine 3,558-561; Zhai et al (1996) J. -43-

Immunol. 156,700-710; Graham et al (1996) Int J. Câncer 65,664-670; and Burchell et al (1996) pp 309-313 In: Breast Câncer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al (eds), John Libbey Eurotext.

Também pode ser útil concentrar a vacina para populações celulares especificas, por exemplo, células apresentadoras de antigénios, quer seja pelo sitio da injecção, pela utilização de vectores e sistemas de administração concentradores, quer seja pela purificação selectiva de tal população de células do paciente e administração ex vivo do peptideo ou do ácido nucleico (por exemplo, células dendriticas podem ser seleccionadas, conforme a descrição apresentada em Zhou et al (1995) Blood 86,3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43,646-651). Por exemplo, os vectores concentradores podem compreender um promotor especifico do tecido ou do tumor que oriente a expressão do antigénio num local apropriado.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica, que contém um ou mais dos referidos peptideos conforme a invenção. A composição é usada para administração parenteral, como por exemplo por via subcutânea, intradérmica ou intramuscular ou para administração oral. Para isso, os peptideos são dissolvidos ou suspensos em veiculo de forma farmacêutica aceitável, de preferência em forma aquosa. Além disso, o composto pode conter excipientes como tampões, ligantes, agentes desintegrantes, diluentes, flavorizantes, lubrificantes, etc. Os peptideos também podem ser administrados juntamente com substâncias imunoestimulantes tais como as citoquinas. Uma relação completa de excipientes utilizáveis nessa composição pode ser obtida, por exemplo, de A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed., 2000, da American Pharmaceutical Association e da imprensa farmacêutica. A composição pode ser usada para a prevenção, profilaxia e/ou terapia de doenças adenomatosas ou cancerígenas. -44- A preparação farmacêutica contendo pelo menos um dos peptídeos de acordo com a SEQ id No 2 é administrada a um paciente de doença adenomatosa ou cancerígena associada ao respectivo peptideo ou antigénio. Desta forma é possível provocar uma resposta imune especifica ao linfócito T citotóxico.

Em outro aspecto da presente invenção, é possivel utilizar uma combinação de dois ou mais peptideos de acordo com a presente invenção sob forma de vacina, tanto em combinação directa como dentro do mesmo regime de tratamento. Além disso, é possivel utilizar combinações com outros peptideos, por exemplo, peptideos específicos de MHC classe I ou II. O profissional habilitado saberá seleccionar as combinações preferenciais de peptídeos imunogénicos ao testar, por exemplo, a geração de células T in vitro, bem como sua eficiência e presença total, a proliferação, afinidade e expansão de certas células T para certos peptídeos, e a funcionalidade das células T, p. ex. ao analisar a produção de IFN-γ (vide também exemplos mais adiante). Normalmente, os peptideos mais eficientes são então combinados sob forma de vacina para os fins acima descritos.

Uma vacina apropriada conterá preferencialmente entre 1 a 20 peptídeos, com maior preferência 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 peptídeos diferentes, com mais preferência ainda 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 peptídeos diferentes, e com maior preferência ainda 11 peptídeos diferentes. O comprimento do peptideo para uso em vacina anti-cancerígena pode ser qualquer peptideo apropriado. Em particular, pode ser um peptideo adequado de nove unidades monoméricas ou um peptideo adequado de 7, 8, 10, 11 ou 12 unidades monoméricas compatíveis. Peptídeos mais longos também podem ser apropriados, mas dá-se preferência aos peptídeos de 9 ou 10 monómeros, conforme descrito na Tabela 1 anexa, para peptídeos MHC classe I. 0(s) peptideo(s) constitui(em) uma vacina anti-tumor ou anti-cancerígena. Pode ser aplicada directamente no -45- paciente, no órgão afectado ou de forma sistémica, ou aplicada ex vivo em células derivadas do paciente ou linhagem de células humanas que são posteriormente administradas ao paciente, ou pode ainda ser usada in vitro para seleccionar uma subpopulação a partir de células imunes derivadas do paciente as quais são então novamente administradas ao paciente. 0 peptídeo também pode ser conjugado a um veiculo adequado, tal como a hemocianina KLH (do molusco Megathura crenulata) ou manana (vide WO 95/18145 e Longenecker e at (1993) Ann. NY Acad. Sei. 690,276-291). A vacina de peptídeo pode ser administrada sem adjuvante. A vacina de peptídeo também pode ser administrada com adjuvante, como por exemplo BCG ou alume. Outros adjuvantes adequados são o QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), derivado da saponina, extractos micobacterianos e imitadores sintéticos da parede celular bacteriana, e adjuvantes de marca como por exemplo o Detox de Ribi. Também se pode utilizar o Quil A, outro adjuvante derivado da saponina (Superfos, Denmark). Outros adjuvantes, como por exemplo o da Freund, também podem ser úteis. Também pode ser conveniente administrar o peptídeo conjugado com hemocianina do molusco keyhole limpet (Megathura crenulata), de preferência também com um adjuvante; outros adjuvantes, tais como os mencionados acima, podem ser utilizados. O peptídeo pode também ser marcado, ser uma proteína de fusão ou uma molécula híbrida. Espera-se que os peptídeos cujas sequências são dadas na presente invenção estimulem os linfócitos T citotóxicos CD8+. No entanto, a estimulação é mais eficiente quando houver ajuda de células T CD4+. Assim, o parceiro de fusão ou as secções de uma molécula híbrida apropriada produzem epitopos que estimulam as células T CD4+. Os epitopos que estimulam as CD4+ são bem conhecidos no estado da técnica, e incluem aqueles identificados no toxóide tetânico.

Numa variante particularmente preferencial da vacina peptídica de acordo com a invenção, ela é uma vacina -46- antitumoral multipeptídica para o tratamento de carcinoma de células renais. Preferencialmente, a referida vacina compreende um conjunto de peptideos associados a tumor de acordo com as SEQ ID N° 1 a 10, localizadas e identificadas em células primárias de cancro renal. Esse conjunto inclui peptideos HLA classe I e classe II. O conjunto de peptideos também pode conter ao menos um peptideo, como por exemplo do antigénio do cerne do VHB, usado como peptideo de controlo positivo e actuando como marcador imunológico para testar a eficiência da administração intradérmica. Em uma variante em particular, a vacina consiste em 11 peptideos individuais (de acordo com as SEQ ID N° 1 a 11) com cerca de 1500 pg a 600 pg, de preferência entre aprox. 1000 pg a aprox. 750 pg, com mais preferência ainda entre aprox. 500 pg a aprox. 600 pg, e com preferência máxima com cerca de 578 pg de cada peptideo, todos eles purificados por HPLC e cromatografia de troca de iões e tem aparência de cor entre branco e esbranquiçado. O produto liofilizado é dissolvido preferencialmente em carbonato ácido de sódio e é usado em injecção intradérmica dentro de 30 min. após reconstituição em temperatura ambiente. De acordo com a presente invenção, as quantidades preferenciais de peptideos podem variar entre aprox. 0,1 e 100 mg, de preferência entre aprox. 0,1 e 1 mg, e com maior preferência ainda entre aprox. 300 pg e 800 pg por 500 pl de solução. No presente documento, o termo "aproximadamente" significa + /- 10 por cento do referido valor, excepto onde mencionado de forma diferente. O profissional habilitado saberá ajustar a quantidade efectiva de peptideo a ser usada com base em diversos factores, tais como por exemplo a situação imunológica do paciente individual e/ou a quantidade de TUMAP presente em um tipo de cancro em particular. Os peptideos da presente invenção podem ser fornecidos em outras formas apropriadas (soluções estéreis, etc.) ao invés de liofilizado.

Espera-se que os peptideos cujas sequências são dadas na presente invenção estimulem as células T CD8+. No entanto, -47- a estimulação é mais eficiente quando houver ajuda de células T CD4+. Assim, o parceiro de fusão ou as secções de uma molécula hibrida apropriada produzem epitopos que estimulam as células T CD4+. Os epitopos que estimulam as CD4+ são bem conhecidos no estado da técnica e incluem aqueles identificados no toxóide tetânico ou peptídeo de MMP7 fornecido pela presente invenção.

Por fim, a vacina de acordo com esta invenção pode ser dependente do tipo especifico de cancro de que o paciente a ser tratado está acometido, bem como do estado da doença, dos regimes de tratamento anteriores, do estado imune do paciente e, naturalmente, do haplótipo HLA do paciente. Além disso, a vacina de acordo com a invenção pode conter componentes individualizados, segundo necessidade pessoais do paciente em particular. Exemplo disso, são as diferentes quantidades de peptideos de acordo com a expressão de TAAs relacionados naquele paciente em particular, efeitos colaterais indesejados devido a alergias pessoais ou outros tratamentos, e ajustes para tratamentos secundários após uma primeira rodada ou esquema de tratamento.

Ainda outro aspecto desta invenção se refere ao uso de um peptídeo de acordo com a invenção, ou de um polinucleotídeo ou vectores de expressão codificando tal peptídeo na produção de um medicamento para eliminar células alvo no paciente, células alvo essas que expressem de forma anormal um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido da invenção. Preferido é o uso como uma composição farmacêutica que seja uma vacina anti-cancro.

Um outro aspecto da presente invenção fornece o uso de um peptídeo de acordo com a invenção, ou de um polinucleotídeo ou vectores de expressão codificando um peptídeo, para a fabricação de um medicamento para induzir uma resposta imune, mais particularmente uma resposta imune mediada por células T contra as células de tumores sólidos, -48- cujas células expressam uma molécula humana de MHC da classe I em sua superfície e apresentam um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos da invenção.

Foi surpreendente descobrir no escopo da presente invenção que as células tumorais de tumores sólidos, ao contrário das células sadias do mesmo tecido, expressam uma molécula HLA classe II humana em sua superfície. Isso foi descrito somente uma vez em Brasanac et al. (Brasanac D, Markovic-Lipkovski J, Hadzi-Djokic J, Muller GA, Muller CA. Immunohistochemical analysis of HLA class II antigens and tumor infiltrating mononuclear cells in renal cell carcinoma: correlation with clinicai and histopathological data.

Neoplasma. 1999;46(3):173-8.), onde as secções criostáticas de 37 carcinomas de células renais (CCR) - sendo 25 do tipo células claras, 10 de células granulosas e 2 de células cromófobas - foram estudadas pelo método de imunoperoxidase indirecta aplicando anticorpos monoclonais a antigénios hala-DR, -DP e DQ para análise de antigénios HLA classe II e anticorpos monoclonais anti-CDl4, -CD3, -CD4 e -CD8 para células mononucleares infiltrantes. O número de células positivas foi estimado de forma semiquantitativa e os resultados da investigação imunohistológica foram correlacionados com características clinicas (idade e sexo do paciente, tamanho do tumor e estágio TNM) e histopatológicos (citologia, histologia, grau) do CCR. Todos os CCRs expressaram antigénios de HLA-DR, 92% antigénios HLA-DQ e 73% antigénios -LA-DP, com nivel de expressão em hierarquia -DR>-DQ>-DP, mas não possível determinar nenhuma correlação de importância estatística com nenhum dos parâmetros histopatológicos ou clínicos analisados. Os monócitos foram mais abundantes do que os linfócitos T e as células T CD4+ foram mais abundantes que as CD8+, enquanto que os tumores com predominância de linfócitos T e aproximadamente a mesma quantidade de células T CD4+ e CD8+ apresentaram o maior diâmetro médio. Uma activação inadequada de linfócitos T pelas -49- células tumorais (apesar da capacidade de apresentação de antigénios) poderia ser o motivo da associação de parâmetros que indicam um comportamento tumoral mais agressivo com expressão anormal de antigénio HLA classe II sobre o CCR.

Um outro aspecto da presente invenção fornece o uso de um peptideo de acordo com a invenção, ou de um polinucleotideo ou de vectores de expressão codificando tal peptideo, na fabricação de um medicamento para matar células-alvo em um paciente cujo células-alvo expressam um polipeptideo composto por uma sequência de aminoácidos, tal como consta na SEQ ID No. 2.

Um outro aspecto da invenção proporciona métodos para produzir linfócitos T activados in vivo ou in vitro, sendo que um método inicial compreende o contacto in vitro de células T com moléculas MHC humanas classe I carregadas com antigénios e expressas na superfície de uma célula apresentadora de antigénio adequada durante tempo suficiente para activar, de maneira especifica para o antigénio, a referida célula T, sendo o antigénio um peptideo de acordo com a invenção. Dá-se maior preferência a um segundo método, descrito por Walter et al. (Walter S, Herrgen L, Schoor 0, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T-cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8) .

As moléculas MHC classe II podem estar expressas na superfície de qualquer célula apropriada e é preferível que a célula seja uma que não expresse naturalmente moléculas MHC classe II (caso esse em que a célula é transfectada para expressar essa molécula) ou, se o for, que seja defeituosa nas vias de processamento ou de apresentação dos antigénios. Dessa forma, é possível que a célula que expressa a molécula MHC classe II seja condicionado praticamente por completo com um antigénio peptídico antes de activar o linfócito T citotóxico. -50- A célula apresentadora do antigénio (ou a célula estimuladora) em geral tem uma molécula mhc classe I ou li em sua superfície e, de preferência, é praticamente incapaz de carregar por si só a referida molécula MHC classe I ou II com o antigénio seleccionado. Como descrito mais pormenorizadamente abaixo, a molécula MHC classe I ou li pode facilmente ser carregada com o antigénio seleccionado in vitro.

De preferência, a célula de mamífero não possui ou somente apresenta um nível reduzido ou função reduzida do transportador peptídico TAP. Entre as células apropriadas que não têm o transportador peptídico TAP estão T2, RMA-S e células de drosofila. O TAP é o Transportador Associado ao Processamento do antigénio. O peptídeo humano que carrega a linha de células defeituosa T2 pode ser obtido da American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA, sob o número de catálogo CRL 1992; a linhagem Schneider 2 de células de drosofila pode ser obtida da ATCC sob o número de catálogo CRL 19863; a linhagem de células RMA-S de ratinhos é descrita em Karre e Ljunggren (1985) J. Exp. Méd. 162,1745.

Convenientemente, a referida célula hospedeira não expressa, antes da transfecção, praticamente nenhuma molécula MHC classe I. Também é preferível que a célula estimuladora expresse uma molécula importante para a co-estimulação da célula T, como por exemplo qualquer uma dentre B7.1, B7.2, ICAM-1 e LFA 3.

Em outra variante, é possível usar combinações de moléculas HLA. O uso de vacinas à base de poliepítopos recombinantes para a administração de múltiplos epítopos de linfócito T citotóxico CD8+ é descrito em Thomson et al (1996) J. Immunol. 157, 822-826 e WO 96/03144. Em relação à presente invenção, pode ser desejável incluir numa única vacina, um peptídeo (ou um ácido nucleico codificador de peptídeo), onde o peptídeo -51 - inclui, em qualquer ordem, uma sequência de aminoácidos conforme a presente invenção e um epitopo estimulador de célula T CD4-positiva (como por exemplo de MMP-7). Uma vacina assim seria particularmente útil para o tratamento de cancro.

Inúmeros outros métodos podem ser utilizados para gerar linfócito T citotóxico in vitro. Por exemplo, os métodos descritos em Peoples et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92,432-436 and Kawakami et al (1992) J. Immunol. 148, 638643 usa linfócitos autólogos que infiltram tumores para gerar linfócito T citotóxico. Plebanski et al (1995) Eur. j. Immunol. 25, 1783-1787 usa linfócitos autólogos do sangue periférico (PLBs) na preparação de linfócito T citotóxico.

Jochmus et al (1997) j. Gen. Virol. 78,1689-1695 descreve a produção de linfócito T citotóxico autólogo usando células dendriticas pulsantes com peptideo ou polipeptideo ou via infecção com vírus recombinante. Hill et al (1995) J. Exp. Med. 181, 2221-2228 e Jerome et al (1993) J. Immunol. 151,1654-1662 utilizam células B na produção de linfócito T citotóxico autólogo. Além disso, é possível utilizar macrófagos pulsados com peptideo, ou polipeptideo ou infectadas com vírus recombinante, na preparação de linfócito T citotóxico autólogo. Células alogénicas também podem ser usadas no preparo de linfócito T citotóxico, e esse método é descrito detalhadamente em wo 97/26328. Por exemplo, além das células de drosofila e células T2, outras células podem ser usadas para apresentar antigénios, como por exemplo as células CHO, células de insectos infectadas com baculovírus, células alvo infectadas com vacínia, bactérias e leveduras. Além disso, podem-se utilizar vírus de plantas (vide por exemplo Porta et al (1994) Virology 202, 449-955, que descreve o desenvolvimento do vírus do mosaico do feijão Vigna unguiculata fcowpea; caupi) como um sistema de grande rendimento para a apresentação de peptídeos estranhos. -52-

De preferência, no método conforme a presente invenção, a célula apresentadora de antigénio compreende um vector de expressão conforme mencionado acima.

As células T activadas e dirigidas contra os peptideos da invenção são úteis em terapia. Assim, um outro aspecto da invenção fornece células T activadas obtidas pelos métodos anteriores da invenção.

Ainda outro aspecto da invenção fornece células T activadas que selectivamente reconhecem uma célula que aberrantemente expressa um polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácidos da invenção. De preferência, as células T reconhecem a referida célula, interagindo com o complexo HLA/peptideo (por exemplo, por ligação). As células T são úteis em um método de eliminação de células-alvo em um paciente, cujas células-alvo aberrantemente expressam um polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácidos da invenção, na qual ao paciente é administrado um número efectivo de células T activadas. As células T que são administradas ao paciente podem ser derivadas do paciente e activadas como descrito acima (ou seja, são células T autólogas). Alternativamente, as células T não são do paciente, mas são de outra pessoa. É claro que é preferível, que o indivíduo seja um indivíduo saudável. Por "indivíduo saudável", os inventores querem dizer que o indivíduo tem geralmente uma boa saúde, de preferência tem um sistema imune competente e, de preferência, não sofre de qualquer doença que possa ser facilmente testada e detectada.

As células T activadas expressam um receptor de células T (TCR), que está envolvido no reconhecimento de células que expressam o polipeptideo aberrante. Será muito útil se o cDNA codificando a TCR for clonado a partir das células T activadas e transferido para outras células T para a expressão. -53- in vivo, as células-alvo para as células T CD4 positivas, de acordo com uma modalidade da presente invenção, podem ser células do tumor (que às vezes expressam MHC da classe II) e/ou células estromais em torno do tumor (células tumorais) (que às vezes também expressam MHC da classe li).

As TCRs de clones de células T da invenção especificas para os peptideos da invenção são clonadas. 0 uso de TCR nos clones de células T é determinado empregando (i) TCR anticorpos monoclonais variáveis de receptor de célula T e específicos da região e (ii) RT PCR com primers específicos para as famílias de genes Va e Vp. Uma biblioteca de cDNA é preparada a partir de mRNA poli-A extraído dos clones de células T. São utilizados primers específicos para a porção do terminal C das cadeias TCR a e P e para a porção do terminal N dos segmentos Va e P identificados. 0 cDNA completo para a cadeia TCR a é amplificado com DNA polimerase de alta fidelidade e os produtos amplificados são clonados para um vector de clonagem apropriado. Os genes clonados de cadeia a e P podem ser montados para formar uma única cadeia TCR usando o método descrito por Chung et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91,12654-12658. Nesta construção de cadeia individual o segmento VaJ é seguido pelo segmento V DJ, seguido pelo segmento Cp seguido pela transmembrana e pelo segmento citoplásmico da cadeia CD3. Esta cadeia TCR simples é então inserida em um vector de expressão rectroviral (pode-se usar um grupo de vectores com base em sua capacidade de infectar linfócitos T CD8+ humanos maduros e de mediar a expressão de genes: o sistema Kat de vectores rectrovirais é uma das possibilidades preferenciais (vide Finer et al (1994) Blood 83, 43) . Rectrovírus anfotróficos de alto título são usados para infectar os linfócitos T CD8+ ou CD4+ purificados isolados a partir de sangue periférico de pacientes com tumores (de acordo um protocolo publicado por Roberts et al -54- (1994) Blood 84, 2878-2889) . Utilizam-se anticorpos Anti-CD3 para provocar a proliferação de células T CD8+ purificadas, o que facilita a integração rectroviral e a expressão estável de TCRs de cadeia simples. A eficiência da transdução rectroviral é determinada por tingimento das células T CD8+ infectadas com anticorpos específicos para o receptor de célula T de cadeia simples. A análise in vitro das células T CD8+ transduzidas mostra que elas apresentam o mesmo extermínio específico de tumores como o observado com o clone de célula T com restrição alogénica a partir do qual as cadeias TCR foram originalmente clonadas. Populações de células T CD8+ transduzidas com a especificidade esperada podem ser usadas para a imunoterapia adoptiva de pacientes com tumores. Os pacientes podem ser tratados com células T autólogas transduzidas entre 108 e 1011. De modo semelhante como no caso das células T auxiliares CD8+, pode-se gerar células T auxiliares CD4+ contendo construtos correspondentes.

Outros sistemas apropriados para introduzir genes em células T são descritos em Moritz et ai (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91, 4318-4322. Eshhar et ai (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90, 720-724 e Hwu et al (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 também descrevem a transfecção de células T. Assim a invenção descreve um TCR que reconhece uma célula que expressa de forma anormal um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos da invenção, TCR esse que é obtido a partir das células T activadas.

Adicionalmente ao TCR, moléculas funcionalmente equivalentes ao TCR são descritos na invenção. Entre elas se incluem todas moléculas que sejam funcionalmente equivalentes a um TCR e que possam exercer a mesma função de um TCR. Em particular, essas moléculas incluem TCRs de cadeia simples e três domínios desenvolvidos por meio de engenharia genética, tais como as obtidas pelo método descrito por Chung et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91, 12654-12658. A invenção também descreve um polinucleotídeo que codifica o TCR ou a -55- molécula funcionalmente equivalente e também um vector de expressão que codifica o TCR ou uma molécula funcionalmente equivalente do mesmo. Entre os vectores de expressão apropriados para expressar o TCR estão os descritos acima relativamente à expressão dos peptideos da invenção.

No entanto, os vectores preferenciais de expressão são os capazes de expressar o TCR em uma célula T após a transfecção.

Um outro aspecto da invenção descreve um método de matar células-alvo em um paciente, cujas as células-alvo aberrantemente expressam um polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácidos da invenção, o método compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um peptídeo de acordo com a invenção, ou uma quantidade efectiva de um polinucleotídeo ou uma vector de expressão codificando o dito peptídeo, ou um número significativo de linfócitos T como definido acima, no qual o montante do peptídeo referido ou montante do polinucleotídeo referido ou vector de expressão ou células T é eficaz para provocar uma resposta imune anti célula-alvo no referido paciente. A célula-alvo normalmente é uma célula de tumor ou cancro, em células específicas de tumores sólidos que expressam uma molécula humana MHC da classe I em sua superfície e apresentam um polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácidos como dado acima.

Um aspecto adicional da invenção descreve um método de eliminar células-alvo em um paciente, cujas células-alvo aberrantemente expressam um polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácidos da invenção, o método compreendendo as etapas de (1) obtendo células T do paciente; (2) introduzindo às ditas células um polinucleotídeo codificando um TCR, ou uma molécula funcionalmente equivalente, como definido acima; e (3) introduzindo as células produzidas na etapa (2) no paciente. -56-

Um outro aspecto adicional da invenção descreve um método de eliminar células-alvo em um paciente, cujas células-alvo aberrantemente expressam um polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácidos como descrito acima, o método compreendendo as etapas (1) obtendo células apresentando antígeno, tal como células dendríticas, provenientes do dito paciente; (2) contactando as referidas células apresentadoras de antigenios, com um peptideo definido no primeiro, segundo ou terceiro aspecto da invenção, ou com um polinucleotideo codificando um tal peptideo, ex vivo; e (3) reintroduzindo no paciente as células apresentadoras de antígeno e tratadas desta forma.

De preferência, as células apresentadoras de antigénios devem ser células dendríticas. De forma adequada, as células dendríticas são células dendríticas autólogas pulsadas com um peptideo antigénico. 0 peptideo antigénico pode ser qualquer peptideo antigénico apropriado que provoque uma resposta adequada das células T. A terapia com células T utilizando células dendríticas autólogas pulsadas com peptídeos provenientes de um antigénio associado a tumor é descrita em Murphy et al (1996) The Prostate 29 e Tjua et al (1997) The Prostate, 32, 272-278.

Em outra variante, as células apresentadoras de antigénios, como por exemplo as células dendríticas, são postas em contacto com um polinucleotideo que codifica um peptideo da invenção. 0 polinucleotideo pode ser qualquer polinucleotideo apropriado, sendo preferível um que seja capaz de transduzir a célula dendrítica, resultando assim em apresentação de um peptideo e indução de imunidade.

Convenientemente, o polinucleotideo pode estar contido num polinucleotideo virai ou vírus. Por exemplo, observou-se que as células dendríticas transduzidas pelo adenovírus induzem a imunidade antitumoral específica do antigénio em relação a MUC1 (vide Gong et al (1997) Gene Ther. 4,1023-1028). De modo semelhante, é possível utilizar sistemas -57- à base de adenovírus (vide por exemplo Wan et al (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); pode-se usar sistemas retrovirais (Specht et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 e Szabolcs et al (1997) . Também se pode usar transferência mediada por partícula de sangue para células dendríticas (Tuting et al (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707) ; e pode-se usar ainda RNA (Ashley et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1177 1182).

Observar-se-á, em relação aos métodos para eliminar células alvo de um paciente, que é particularmente preferível que as células alvo sejam células cancerígenas, mais preferivelmente ainda células cancerígenas renais ou de cólon.

Numa variante preferencial, o haplótipo HLA do paciente é determinado antes do tratamento. A haplotipagem HLA pode ser efectuada utilizando qualquer método apropriado; tais métodos são bem conhecidos no estado da técnica. A invenção inclui particularmente o uso dos peptídeos da invenção (ou dos polinucleotídeos que os codificam) para a vacinação activa in vivo; para a manipulação das células dendríticas autólogas in vitro seguida da introdução das células dendríticas assim manipuladas in vivo para activar as respostas das células T; para activar células T autólogas in vitro seguido de terapia adoptiva (isto é, as células T assim manipuladas são introduzidas no paciente); e para activar células T de doadores saudáveis (quer com MHC correspondentes ou não correspondentes) in vitro seguido de terapia adoptiva.

Numa variante preferencial, as vacinas da presente invenção são administradas a um hospedeiro quer individualmente ou em combinação com outra terapia contra o cancro, para inibir ou suprimir a formação de tumores. A vacina de peptídeo pode ser administrada sem adjuvante. A vacina de peptídeo também pode ser administrada com adjuvante, como por exemplo BCG ou alume. Outros adjuvantes apropriados são descritos acima.

Os peptídeos de acordo com a invenção também podem ser usados como reagentes de diagnóstico. Usando-se os -58- peptídeos, pôde ser analisado se há células T em uma população de células T que sejam especificamente dirigidas contra um peptideo ou sejam induzidas por uma terapia. Além disso, o aumento das células T precursoras pode ser testado com os peptideos que têm reactividade contra o peptideo definido. Além disso, o peptideo pode ser usado como indicador para monitorar a progressão da doença de um tumor que expressa o antigénio citado, do qual o peptideo foi derivado. A Tabela 1 anexa relaciona os peptideos conforme identificados. Além disso, a tabela informa as proteínas das quais se origina o peptideo, bem como a respectiva posição do peptideo dentro da proteína correspondente. Além disso, são informados os respectivos números Acc relacionados ao banco genético Genbank do "National Centre for Biotechnology Information" do National Institute of Health (vide http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Em outra variante preferencial, os peptideos são usados para tingir leucócitos, nomeadamente os linfócitos T. Esse uso é particularmente vantajoso quando se quer provar que numa população de Células T citotóxicas estão presentes Células T citotóxicas específicos dirigidos contra um peptideo. Além disso, o peptideo pode ser usado como marcador para determinar o avanço de uma terapia em doenças ou distúrbios adenomatosos ou cancerígenos.

Em outra variante preferencial da presente invenção, os peptideos são utilizados para a produção de anticorpo. É possível obter anticorpos policlonais de forma padrão pela imunização de animais via injecção do peptideo e posterior purificação da imunoglobulina. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos de acordo com protocolos padrão, como por exemplo em Methods Enzymol. (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies.

Identificar os epítopos de células T auxiliares de TAA continua sendo tarefa importante na imunoterapia antitumoral. Até o momento, foram utilizadas diversas -59- estratégias para identificar peptídeos classe I ou II de TAA, variando desde a incubação de APCs com o antigénio de interesse a fim de serem absorvidos e processados (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, e B.P. van der Bruggen. 1999. Identification of mage-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767-778), até diversas estratégias de transfecção com proteínas de fusão (Dengjel, J., P.Decker, 0. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, e S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin Dl T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651). Todos esses métodos demandam muito tempo e muitas vezes não fica claro se os ligantes HLA identificados são efectivamente apresentados in vivo em tecido humano.

Os inventores identificaram um ligante responsável por uma sequência cerne de MMP7. Os inventores descobriram que essa proteína está superexpressa em carcinomas de células renais, tendo sido ainda descrita como sendo associada a tumor (Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. Matrix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth factor bioavailability through its proteinase activity on insulin-like growth factor binding protein 3. Câncer Res. 64:665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcinoma. Oncol. Rep. 10:567-570). O peptídeo se ligou de forma promíscua a moléculas HLA classe II e foi capaz de activar células T CD$+ de diferentes doadores sadios. Assim, a abordagem dos inventores será útil na identificação de novos candidatos a peptídeos classe II de TAA para uso em protocolos clínicos de vacinação. -60- A invenção será agora descrita com mais detalhes, fazendo referências às figuras, à lista de sequências e aos exemplos. Os exemplos a seguir são dados exclusivamente para fins ilustrativos, sem intenção de limitar a invenção.

As SEQ ID No 1 e SEQ ID No 2 mostram sequências peptidicas de epítopos de célula T contendo peptídeos apresentados por MHC classe I ou II.

As SEQ ID N° 3 a 11 mostram sequências de peptideos usados na vacina da presente invenção, que é posteriormente referida como "IMA". A Figura 1 mostra a apresentação do peptideo IMA-MET-001, derivado de protooncogene c-Met, em amostra de tumor primário CCR013. Foi realizada HPLC ESI MS nanocapilar em peptideos eluídos de CCR013. O espectrómetro de massa para 1006.54 ±0.5 Da mostra um pico no tempo de retenção de 47,8 min. O espectro de decaimento de massa induzido por colisão de 1006,54, registrado em uma segunda operação/passagem LC-MS a um certo tempo de retenção e mostrado no quadro, confirmou a presença de IMA-MET-001 (Weinschenk 2002). A Figura 2 mostra a expressão tecidual do protooncogene c-Met (MET). A expressão foi analisada por microarranjos de oligonucleotideos. O número de cópias se refere ao rim, e foi ajustado em 1,0."P" significa que o gene está presente, "A" que ele está ausente e "M" que ele é marginal segundo os algoritmos estatísticos de call absoluto. "I" significa que a expressão do gene está significativamente aumentada em relação ao rim, "D" que a expressão está diminuída e "NC" que não há variação de expressão. O valor de expressão relativo ao rim é calculado a partir da razão logarítmica do sinal e mostrado acima das barras. A linha horizontal tracejada mostra a expressão máxima em tecidos normais (nesse caso, do pulmão). -61 - A Figura 3 mostra a eliminação de células alvo carregadas de peptídeos por Células τ citotóxicas condicionadas com IMA-MET-001. A Figura 4 mostra a eliminação de células malignas por Células T citotóxicas condicionadas com IMA-MET-001. A Figura 5 mostra o ensaio de inibição do alvo a frio. A Figura 6 mostra a análise tetramérica de expansões promovidas por microesferas. A Figura 7 mostra a imunogenicidade de IMA-MMP-001 -IFN gamma intracelular representativo versus colorações de CD4 de quatro doadores sadios. Os doadores 1, 2 e 3 apresentaram células T CD4+ reactivas contra IMA-MMP-001 após a terceira e quarta estimulações. 0 doador 4 sempre apresentou resultado negativo. A Figura 8 mostra a apresentação diferencial de peptídeos sobre tecido tumoral e sadio - (A) Espectro de massa de duas espécies de peptídeos m/z 739.96 e 741.95 derivados de rim normal e de tecido de carcinoma de células renais de paciente de CCR001. 0 espectro de massa demonstra uma superapresentação de aproximadamente 4 vezes o peptídeo adipofilina no tecido de carcinoma de células renais em comparação com o tecido normal autólogo correspondente (B) . A análise por espectrometria de massa de decaimento induzido por colisão de m/z 741.95 (tumor) revelou a sequência peptídica IMA-ADF-003, derivada da adipofilina. A Figura 9 mostra a imunidade in vivo contra IMA-ADF-001 - imunidade de célula T em 2 pacientes de CCR contra diversos peptídeos não vacinados em pacientes vacinados com células dendríticas autólogas pulsadas com dois TUMAPs oriundos de MUC. As células T específicas para IMA-ADF-001 ("adipofilina") não estavam presentes antes da vacinação e foram detectadas no paciente N° 3 (painel superior) após 6 vacinações e no paciente N° 8 (painel inferior) após 8 vacinações . -62- A Figura 10 mostra exemplos representativos de uma resposta de células T IMA induzida identificada pelo ensaio ELISPOT amplificado para o mesmo paciente e antigeno. A coluna superior e inferior representam antigenos de controlo negativo HIV-001 e TUMAP IMA-CCN-001 simples usados para leitura, respectivamente. A coluna esquerda mostra ELISPOTs de amostras colectivas, retiradas antes da vacinação sobre o rastreio do dia 2 (S2) e imediatamente antes da primeira injecção (Vl). A coluna da direita mostra ELISPOTs de amostras colectivas feitas durante o protocolo de vacinação no dia 22 (V6) e dia 36 (V7). O número de células positivas é dado para cada experimento.

Figura 11 Exemplos representativos de respostas de célula T induzida por IMA identificadas pelo ensaio ampliado de coloração tetrâmera. Painéis superiores e médios representam parcelas de ponto bidimensionais com delimitação de linfócitos CD3+, painéis inferiores são fechados em CD3+ CD8+ linfócitos. Pacientes, instantes e colorações conforme o indicado para cada coluna. Sl+Vl: Amostras colhidas antes da vacinação; V4+V5: amostras colhidas no dia 8 no dia 15; V6+V7: amostras colhidas no dia 22 e no dia 36; V8+FU: amostras colhidas no dia 64 (última vacinação) e após 85 a 92 dias (final do estudo) A: Dados para o paciente 03-004 confirmando a resposta imunológica ao IMA-CCN-001 mostrado na Figura 10. A população de células positivas para CD3+ e tetrâmero IMA-CCN-001 podem ser identificados após a quarta e quinta injecção de IMA (V6+V7; painel do meio), que representa 0,78% dos linfócitos (V6+V7; painel inferior). Nenhuma população positiva foi achada para o tetrâmero K67-001 (painel superior) . B: Dados para o paciente 03-003 não apresentando nenhuma resposta imunológica contra o peptideo IMA-RGS-001 -63- (painel superior), mas o desenvolvimento de resposta tetrâmero-positiva no IMA-CCN-001 decorrer do tempo do protocolo de vacinação (painel do meio, coluna 3 e 4) responsável por até 0,8% dos linfócitos (painel inferior; coluna 3) .

Figura 12 Cinética observada de magnitude das células T ensaios tetrâmero amplificados em único momento. Os resultados são mostrados para leituras de um único ponto de tempo para o paciente 05-001, para quem a resposta das células T induzida por vacina foi detectada pelo ensaio tetrâmero amplificado de rotina com amostras colectivas. Os resultados são apresentados para todos os antigenios associados a tumor presentes na IMA (grupo TUMAP) e, em particular, para o peptideo IMA-CCN-001. Além disso, são mostrados os controlos HIV-001 e IMA-HBV-001 dentro do ensaio condizido ao mesmo ponto de tempo único.

Exemplos

Glossário

Termo ou Descrição abreviatura

AE AJCC BfArM

CTL DC GM-CSF rhuGM-CSF

VHB HLA

Evento Adverso

American Joint Committee on Câncer Bundesinstitut fur Arzneimittel und Medizinprodukte (Agência Alemã de Controlo de Medicamentos e Produtos Medicinais) Células τ citotóxicas Células Dendríticas rhuGM-CSF (recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor) (factor recombinante humano estimulador das colónias de granulócitos e macrófagos) Vírus da Hepatite B Antigénio Leucocitário Humano -64-

Termo ou Descrição abreviatura

IARC IMP INF MAA MHC CCR SAE SmPC TUMAP

Agência Internacional de Pesquisa sobre o Cancro

Produto Medicinal Experimental Interferon

Pedido de Autorização para Comercialização Complexo Principal de Histocompatibilidade Carcinoma de Células Renais Sério Evento Adverso

Resumo das Caracteristicas do Produto Peptídeo Associado a Tumor I. Caracterização dos peptídeos

Dados referentes à expressão de produtos dos genes dos quais se derivam os peptídeos ima

Os peptídeos identificados a partir de tecido de CCR foram seleccionados por inclusão na vacina IMA (vide mais adiante) de acordo com um sistema interno de classificação baseado principalmente em análise de expressão de genes, na literatura e em pesquisa de bancos de dados por propriedades conhecidas de um antigénio a partir do qual foi identificado um peptídeo derivado. Todos os peptídeos apresentados naturalmente encontram-se bastante superexpressos no tecido do CCR em comparação ao tecido renal normal e uma série de outros tecidos e órgãos vitais. Essa selecção é essencial para (1) escolher peptídeos que sejam capazes de induzir as células T com alta especificidade para reconhecerem o tumor mas não o tecido, para minimizar a possibilidade de auto-imunidade induzida pela vacinação com IMA e (2) para assegurar que a maioria dos tumores numa população de pacientes seja reconhecida pela célula T induzida. A prevalência media de antigénios dos quais os peptídeos derivados estão contidos no IMA é de 68% (superexpressão no CCR vs. tecidos e órgãos vitais em n=24 -65- amostras de CCR) variando de 54% a 96% para os antigénios individuais, isso é bem mais do que em antigénios tumorais padrão, como por exemplo o Her-2/neu (prevalência de 25-30%). O estudo do perfil global da expressão génica foi realizado com um sistema de microarranjos de alta densidade que pode ser obtido comercialmente. O RNA foi isolado dos tecidos, processado e hibridizado para microarranjos de oligonucleotideos de alta densidade. Depois de corados e lavados, os arranjos foram submetidos a varredura (scanned) e a intensidade da fluorescência de cada ponto no arranjo representou o grau de expressão do gene que combina com a sequência de DNA do oligonucleotideo. Diversos oligonucleotideos dos arranjos cobrem a sequência de cada gene. Depois da análise com software estatístico, é possível obter para cada gene valores de expressão relativos aos pares entre duas amostras. A normalização de todos os dados de diferentes amostras usando uma amostra constante como base possibilita uma quantificação de níveis de expressão entre todas as amostras.

Fontes de RNA - O RNA total de tecidos humanos -foram obtidos comercialmente (Ambion, Huntingdon, RU; Clontech, Heidelberg, Alemanha; Stratagene, Amsterdam, Holanda, BioChain, Heidelberg, Alemanha). O RNA total de diversos indivíduos foi misturado de forma que o RNA de cada indivíduo tinha peso igual. A qualidade e a quantidade foram confirmadas no bioanalisador Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn, Alemanha) usando o kit RNA 6000 Nano LabChip da Agilent.

Análise de Microarranjo de Nucleotídeos de Alta Densidade - DNA de fita dupla foi sintetizado a partir de 5-8 pg de RNA total, usando SuperScript RTII (Life Technologies, Inc., Karlsruhe, Alemanha) e o primer (Eurogentec, Seraing, Bélgica) conforme informado no manual Affymetrix. A transcrição in vitro com o kit BioArray® High Yield® RNA Transcript Labelling (ENZO Diagnostics, Inc., de Farmingdale, NY, EUA), fragmentação, hibridização em Affymetrix U133A ou -66- U133 Plus 2,0 GeneChipes (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) e coloração com streptavidina-ficoeritrina e anticorpo anti-streptavidina biotinilada (Molecular Probes, Leiden, Holanda) foi realizada de acordo com os protocolos do fabricante (Affymetrix). Usou-se o Affymetrix GeneArray Scanner e os dados foram analizados com o software Microarray Analysis Suite 5.0 (ou GeneChip® Operating Software GCOS). Para a normalização, foram usados 100 genes de manutenção ("housekeeping" fornecidos pela Affymetrix). Comparações de pares foram calculadas usando-se os valores de expressão no rim como base. Portanto, todos os valores de expressão calculados a partir dos índices de log signal referem-se ao rim, ajustado para 1. A importância da expressão diferencial foi avaliada pelos valores de "mudança" dados pelos algoritmos estatisticos implementados no software. Para a detecção absoluta da expressão, os dados foram novamente analisados com algoritmos estatísticos. A presença ou ausência de expressão genética foi determinada por algoritmos de call absoluto.

Um exemplo de painel de expressão tecidual para a expressão do protooncogene c-Met (MET) é mostrado na Figura 2. O MET estava superexpresso em 96% dos carcinomas de células renais analisados (n=24, lado direito), mas não - ou em menor extensão - em diversos tecidos e órgãos vitais sadios seleccionamos, bem como em células e tecidos imunologicamente importantes (lado esquerdo na Figura 2). A Tabela 1 apresenta um resumo dos peptideos contidos na vacina IMA da invenção, compreendendo também os peptideos de acordo com a invenção. -67-

Tabela 1: Peptídeos contidos na vacina da invenção. SEQ ID Interna Antlgénlo Sequência SEQ ID N° IMA-MMP-0 01 Metaloproteinase matricial 7 SQDDIKGIQKLYGKRS 1 IMA-ADF-002 Adipofilina VMAGDIYSV 2 IMA-ADF-001 Adipofilina SVASTITGV 3 IMA-APO-OOl Apolipoproteina LI ALADGVQKV 4 IMA-CCN-001 Ciclina Dl LLGATCMFV 5 IMA-GUC-001 GUCY1A3 SVFAGWGV 6 IMA-K67-001 KIAA0367 ALFDGDPHL 7 IMA-MET-OOl Protooncogene c-Met YVDPVITSI 8 IMA-MUC-001 MUC1 STAPPVHNV 9 IMA-RGS-0 01 RGS-5 LAALPHSCL 10 IMA-HBV-0 01 VHB FLPSDFFPSV 11 A Tabela 2 apresenta um resumo dos resultados de expressão para todos os antigénios que codificam peptideos contidos na vacina IMA da invenção, assim como para os peptideos de acordo com a invenção.

Tabela 2: Frequências de superexpressão de antigénios no CCR (n=24) SEQ ID Interna Antigénio Superexpressão significativa CCR versus rim1 Superexpressão CCR versus todos tecidos normais2 IMA-ADF-001 & 002 Adipofilina 83% 75% IMA-APO-OOl Apolipoproteina LI 67% 58% IMA-CCN-001 Ciclina Dl 58% 63% IMA-GUC-001 GUCY1A3 88% 71% IMA-K67-001 KIAA0367 54% 54%3 IMA-MET-001 Protooncogene c-Met 96% 96% IMA-MUC-001 MUC1 Não há superexpressão no nível do mRNA Não há superexpressão no nível do mRNA IMA-RGS-001 RGS-5 96% 58% IMA-MMP-001 Metaloproteinase matricial 7 58% 67% 1 Dê acordo com os valores dê "mudança" dados pelos algoritmos estatísticos implementados nõ" software (número de "I"s) 2 Número de CCRs com mais expressão quando comparados com o tecido normal com a maior expressão entre os tecidos normais 3 0 cérebro é imuno-privilegiado e por esse motivo não levado em consideração A superexpressão mínima no CCR versus todos os tecidos normais é de 54% e a máxima é de 96%. Isso é bem mais do que em antigénios tumorais padrão, como por exemplo o Her-2/neu (prevalência de 25-30%). -68-

Excepção disso é o MUC, pois não foi detectada superexpressão para o MUC mRNA. No entanto, é preciso levar em conta os seguintes relatórios publicados: 1. A deglicosilação anormal em tumores malignos é comum e desmascara epitopos em células tumorais que podem não estar presentes em células normais. É muito provável que esse mecanismo também ocorre no CCR. Isso explicaria a eliminação especifica de linhagens de células tumorais que expressam MUC (Brossart 1999). Vide também o capitulo 4.1.5 sobre as propriedades do MUC. 2. 0 IMA-MUC-001 foi administrado junto com células dendriticas autólogas num teste iniciado por pesquisador na Universidade de Tubingen, na Alemanha. Nesse teste, recentemente apresentado na ASCO 2003 (Mueller 2003) e os dados de follow-up apresentados na reunião da ASCO 2005 (Wierecky 2005), não foram relatados efeitos auto-imunes. 3. Outros relatórios de estudos clínicos mostram que as células T citotóxicas específicas para IMA-MUC-001 ocorrem naturalmente (sem imunização) no carcinoma de mama (Rentzsch 2003) e pacientes de carcinoma colorretal (Dittmann 2004). Nesses pacientes, não foram relatados efeitos auto-imunes. Isso enfatiza o papel natural das células T específicas do IMA-MUC-001.

Com base nesses dados de apoio, a administração de IMA-MUC-001 pode ser considerada segura, embora não pode ser detectada superexpressão do antigénio MUC somente no nível do mRNA.

Ligação promíscua de IMA-MMP-001 a diversos alelos HLA-DR O IMA-MMP-001 é um peptídeo que se liga a HLA-DR, uma molécula HLA classe II. TUMAPs classe II activam células T auxiliares as quais desempenham um papel essencial em auxiliar a função das células T citotóxicas activadas pelas TUMAPs classe II. A ligação promíscua do peptídeo HLA-DR é importante para garantir que a maioria (> 50%) dos pacientes HLA-A*02-positivos tratados com IMA também possam provocar uma resposta -69- de célula T ao IMA-MMP-001. A análise in silico da ligação do IMA-MMP-001 indica que o IMA-MMP-001 se liga de forma promíscua a diversos alelos HLA-DR (DBR1*0101, *0301, *0401, *1101 e *1501) cobrindo um total de no mínimo 69,6% da população caucasiana positiva para HLA-A2. A ligação promíscua do IMA-MMP-001 é confirmada de forma experimental por dados de imunogenicidade in vitro.

Princípio de teste

Com o uso do algoritmo SYFPEITHI desenvolvido na Universidade de Tiibingen (Rammensee 1997; Rammensee 1999), classificou-se a ligação do IMA-MMP-001 a diversos alelos HAL-DR comuns (vide a tabela a seguir). O algoritmo foi usado com êxito para identificar epítopos classe I e II da ampla gama de antigénios, p.ex. dos TAA TRP2 (classe I) (Sun 2000) e SSX2 (classe II) (Neumann 2004) humanos.

Os alelos hla-dr analisados cobrem no mínimo 69,6% da população caucasiana HLA-A2 positiva (Mori 1997) . O limiar de ligação foi definido a escore de 18, com base na análise de escores de ligações de ligantes HLA-DR promíscuos conhecidos e publicados. Ligação promíscua é definido como uma ligação de peptídeo HLA-DR com diversos alelos HLA-DR expressos em pelo menos 50% da população caucasiana.

Os loci de HLA-A e HLA-DR estão em desequilíbrio de ligação, produzindo combinações de HLA-A2 e HLA-DRs específicas que são favorecidas em relação a outras (Tabela 3) .

Haplótipo Frequência HLA- HLA-A DR [%] 2 I 878 2 2 14.9 2 3 6.1 2 4 21.3 -70- 2 5 1.2 2 6 15.2 2 7 13.0 2 8 4.2 2 9 1.2 2 10 1.4 2 11 8.7 2 12 2.6 2 n. a. 1.4 Tabela 3: As frequências dos haplótipos em indivíduos caucasianos na América do Norte - São mostrados os haplótipos sorológicos, N. a. significa não atribuído (Mori 1997) .

Os ligantes de determinadas moléculas MHC contêm aminoácidos quimicamente relacionados em determinadas posições de sua sequência primária, o que permite definir o motivo de um peptideo para cada alelo MHC (Falk 1991). O SYFPEITHI usa matrizes de motivos deduzidos a partir de motivos refinados, baseados exclusivamente na análise de ligantes naturais via degradação de Erdman e espectrometria de massa em linha (Schirle 2001) . Essas matrizes permitem prever exactamente os peptideos de determinada sequência de proteínas apresentados em moléculas MHC classe I ou II (Rotzschke 1991).

Antigén io AlelO DRBl* 0101 (8.8% ) 0301 (6.1% ) 0401 (21.3 %) 0701 (13. 0%) 1101 (8.7% ) 1501 (n. a. %) IMA- MMP-001 35 18 20 14 26 20

Tabela 4: Escores de ligação de IMA-MMP-001 a alelos HLA-DR comuns. São mostrados os escores de ligação de IMA-MMP-001 SYFPEITHI para os alelos HLA-DRBl mais comuns na população caucasiana. As Frequências dos haplótipos sorológicos correspondentes de indivíduos caucasianos HLA-A2 positivos são -71 - dadas entre parênteses. Considerou-se que o peptídeo se ligava a uma molécula HLA quando o escore era igual ou maior que 18.

Com base na previsão via algoritmo SYFPEITHI, o IMA-MMP-001 provavelmente se ligará a diversos alelos HLA-DR (DRBl*0101, *0301, *0401, *1101 e *1501) cobrindo pelo menos 69,6% da população caucasiana positive para HLA-A2. Como não há dados disponíveis sobre a Frequência do HLA-DR15, esse alelo foi omitido do cálculo. Assim, é bem provável que a cobertura da população seja ainda maior do que 69,9%. A confirmação experimental da ligação promíscua do IMA-MMP-001 é obtida por dados de imunogenicidade in vitro (vide abaixo).

Comparação da expressão do antigénio e apresentação do peptídeo derivado em tumor e tecido normal autólogo.

Parte-se do princípio de que os antigénios superexpressos estejam superexpressos nas moléculas HLA na superfície da célula. Por exemplo, descobriu-se que o peptídeo HLA-A*03 derivado da adipofinlina, um antigénio superexpresso do qual se derivam os peptídeos IMA-ADF-001 e IMA-ADF-002 de HLA-A*02, ambos contidos em IMA, estava altamente superexpresso no tecido de CCR em comparação ao tecido normal autólogo do paciente RCC100 que utilizava a estratégia QUALITEA. Nesse exemplo, vê-se que a superexpressão de um antigénio (nesse caso a adipofilina) se correlaciona com a superapresentação de peptídeos derivados do mesmo antigénio. O método é detalhadamente descrito por (Lemmel 2004). QUALITEA é uma estratégia de quantificação diferencial de peptídeos eluídos de HLA a partir de tecido tumoral e tecido normal. Os ligantes HLA derivados das duas fontes diferentes são derivados no terminal N por um reagente ou 2DX e combinados. Após a redução da complexidade dos peptídeos por cromatografia líquida de alta performance, os peptídeos são quantizados por análise ESI-MS segundo suas áreas de pico. O par de peptídeos derivados (1Hx-derivatização e 2DX-derivatização) é idêntico em termos físico-químicos e pode ser -72- facilmente detectado, pois ele essencialmente co-elui em sistemas cromatográficos. Além disso, há uma diferença constante de massa medida nas varreduras de espectrometria de massa. Essa diferença depende do número de isótopos estáveis no derivativo. A identificação sequencial de um ligante é revelada pela análise ESI-MSMS e pesquisa do espectro gravado em bancos de dados e assistida por computador. Portanto, a análise fornece informações sobre os aspectos qualitativos e quantitativos da apresentação do peptídeo em tecido tumoral e tecido normal. A Figura 8 mostra um exemplo de apresentação diferencial de peptideo HLA em tecido tumoral e tecido normal de um antigénio superexpresso. 0 peptídeo IMA-ADF-003, que estava superexpresso quadruplamente no tecido tumoral em relação a tecido renal sadio do paciente RCC100, foi identificado por análise de espectrometria de decaimento de massa induzido por colisão entre os muitos peptídeos igualmente apresentados. Esse peptídeo superapresentado em tecido tumoral derivou da adipofilina. A análise de expressão de genes do mesmo paciente RCC100 revelou também uma superexpressão de 2,64 vezes de adipofilina nesse tecido tumoral em relação ao rim sadio (dados não exibidos) Esses dados confirmam nesse caso em particular que a superexpressão no tecido tumoral em nível de gene leva à superexpressão do peptídeo na superfície da célula tumoral.

Imunogenicidade in vivo contra o IMA-ADF-001 Células dendríticas autólogas (DCs) produzidas por pacientes de CCR foram pulsadas com dois TUMAPs derivados de MUC, entre esses o IMA-MUC-001. 0 IMA-ADF-001 não foi vacinado. As vacinações foram realizadas de forma subcutânea a cada duas semanas quatro vezes e repetidas mensalmente até a progressão do tumor. Após a quinta injecção com células dendríticas, os pacientes receberam adicionalmente 3 injecções/semana, aplicadas de forma subcutânea, de IL-2 de -73- baixa dosagem (lMi lE/m2). A activação do precursor de célula T foi monitorizada com ELISPOT IFN-gama. Além da indução de células T contra os dois peptideos vacinados, também foi testada a actividade das células T contra diversos outros TUMAPs conhecidos, entre eles o IMA-ADF-001.

Os resultados foram mostrados recentemente numa apresentação do Dr. Peter Brossart (Universidade de Tubingen) na Reunião Anual da Sociedade Americana de Oncologia Clinica (ASCO) e 2005. A apresentação completa foi publicada na página da ASCO na Internet. Em dois pacientes (pac N° 8 e pac N° 13), vacinados com dois peptideos MUC pulsados em células dendriticas autólogas foi detectada após a vacinação imunidade das células T contra peptideos diferentes daqueles que foram injectados (Figura 9). Como não havia imunidade antes da vacinação, é muito provável que essas células T foram induzidas por espalhamento dos epitopos. Pode haver espalhamento dos epitopos quando as células tumorais são destruídas (p. ex. por necrose, lise por células T induzidas por vacina, etc.) liberando antigénios que são absorvidos por células apresentadoras de antigénios (APCs, p.ex. DCs). Essas células apresentadoras de antigénios (APCs) podem então processar o antigénio dentro da célula e apresentar um epitopo de célula T (p.ex. um TUMAP) para prime as respostas das células T. Esses dados enfatizam o grande papel reservado ao IMA-ADF-001 como antigénio de célula τ de ocorrência natural. II. Produção e uso da vacina "IMA" de acordo com a invenção A vacina IMA é uma vacina que contém um conjunto de peptideos associados a tumor, localizados e identificados em células de cancro renal primário. Esse conjunto inclui peptideos HLA classe I e classe II. O conjunto de peptideos também contém um peptídeo do antigénio do cerne do VHB, usado como peptídeo de controlo positivo e actuando como marcador imunológico para testar a eficiência da administração intradérmica. A vacinação com peptídeo em geral precisa de -74- adjuvante e, portanto, no presente esquema de vacinação será usado o GM-CSF como adjuvante (o GM-CSF humano é comercializado como Sargramostim, Leukine®, Berlex). 8 dos 10 peptideos associados a tumor contidos no IMA foram identificados com a tecnologia XPRESIDENT descrita mais adiante. Para esses peptideos, a apresentação natural no contexto das moléculas HLA expressas pelo tumor é portanto demonstrada por meio de prova directa. Os peptideos IMA-MUC-001 e IMA-CCN-001 foram identificados por meio de outras tecnologias. Para os dois últimos peptideos, a apresentação natural desses peptideos por linhagens de células tumorais é demonstrada com base em provas indirectas no ensaio de imunogenicidade in vitro (vide abaixo).

Princípio de teste

As moléculas HLA de tecido de carcinoma renal primário processado por ultracongelamento ("shock-freeze") são purificadas e os peptideos associados ao HLA são isolados. Esses peptideos são separados offline por HPLC e as fracções são analisadas ou é feita análise sequencial por espectrometria de massa por meio de experimentos online de HPLC-MSMS. As sequências resultantes são confirmadas por síntese dos peptideos identificados e comparação dos espectros dos fragmentos dos peptideos identificados e sintetizados. Como os peptideos identificados derivam directamente de moléculas HLA dos tumores primários, esses resultados apresentam provas directas do processamento e apresentação naturais dos peptideos identificados no tecido do CCR primário. Método O método é descrito detalhadamente por (Weinschenk 2002). Em resumo, as amostras tiradas dos pacientes e ultracongeladas ("shock-freezed"), obtidas do Departamento de Urologia da Universidade de Tubingen (com aprovação do comité -75- local de ética) foram lisadas, as moléculas HLA foram purificadas por cromatografia de afinidade usando o anticorpo W6/32 especifico para HLA classe I, ou o anticorpo BB7.2 especifico para HLA-A*02, ou (no caso do IMA-MMP-001) o anticorpo L243 especifico de HLA-DR. Os peptideos associados a HLA foram eluidos com tratamento com ácido e isolados da proteina MHC de cadeia alfa por ultrafiltração. Os peptideos isolados são separados offline por cromatografia liquida de alta performance de fase reversa e as fracções são analisadas por espectrometria de massa nano-ESl num espectrómetro de massa híbrido em tandem Q-TOF de aceleração ortogonal (Q-TOF I ou Q-TOF Ultima, Waters) ou foi feita análise cromatografia líquida MSMS on-line usando os mesmos instrumentos. Todas as vezes incluiu-se uma operação em vazio para ter-se certeza de que o sistema estava livre de peptideos. As calibrações foram feitas pelo menos uma vez por dia e análises com compostos padrão foram realizadas a intervalos apropriados para assegurar um desempenho perfeito dos sistemas. A interpretação dos espectros dos fragmentos foi feita manualmente. A confirmação da análise foi obtida por pesquisas em bancos de dados e pela síntese da fase sólida da suposta sequência de peptideos e comparação dos espectros dos fragmentos dos peptideos identificados e sintetizados. Todos peptideos contidos em IMA (dados não exibidos), excepto o IMA-MUC-001 e IMA-CCN-001 foram identificados de modo idêntico, confirmando a apresentação natural desses peptideos em tecido de carcinoma primário de células renais.

Ingredientes do IMA

Os peptideos deste desenvolvimento clinico são sintetizados por meio de química Fmoc padrão e tradicional. A purificação é feita com HPLC e troca de iões. 0 importante é que a identidade e a pureza dos peptideos pode ser determinada facilmente e com grande precisão usando espectrometria de -76- massa e HPLC. A formulação do IMA consiste em 11 substâncias individuais descritas mais detalhadamente a seguir.

Tabela 5: Antigénios no IMA ID do peptídeo Tipo Antigénio Siglas e sinónimos comuns 1 IMA-ADF- 001 TUMAP classe I Adipofilina Proteína relacionada com a diferenciação de adipócitos, ADRP 2 IMA-ADF- 002 TUMAP classe I Adipofilina vide acima 3 IMA-APO- 001 TUMAP classe I Apolipoproteina LI APOL1 4 IMA-CCN- 001 TUMAP classe I Ciclina Dl CCNDl, PRADl, adenomatose de paratireóide 1, BCL-1 5 IMA-GUC- 001 TUMAP classe I GUCY1A3 guanilato ciclase 1-solúvel-alfa 3 6 IMA-K67- 001 TUMAP classe I KIAA0367 7 IMA-MET- TUMAP Protooncogene c- MET, receptor de HGF 001 classe I Met (factor de crescimento de hepatócitos), HGFR 8 IMA-MUC- 001 TUMAP classe I MUC1 mucina, CD227, episialina, antigénio de membrana epitelial 9 IMA-RGS- 001 TUMAP classe I RGS-5 regulador de sinalização 5 de proteína G 10 IMA-MMP- TUMAP Metaloproteinase MMP7, matrilisina, 001 Classe II matricial 7 uterina 11 IMA-HBV- 001 Peptideo de controlo virai Antigénio cerne de VHB HBc, HBcAg, cAg -77-

Todos os peptídeos são sintetizados por quimica Fmoc de fase sólida e são purificados por hplc e cromatografia de troca de

determinada por análise de aminoácidos e espectrometria de massa.

Tabela 6: Caracteristicas fisico-quimicas dos peptideos no ima 0 fármaco é apresentado na forma liofilizada, para aplicação intradérmica, contendo 11 peptideos - 578 pg de cada peptideo - em forma de seus sais (acetatos). Para a aplicação da fórmula de teste clinico nos pacientes, o pó para injecção, contendo 578 pg de cada peptideo, é dissolvido em 700 pl de carbonato ácido de sódio (4,2%). Depois da reconstituição da -78- solução, são injectados via intradérmica 500 μΐ (equivalente a uma dose única de 413 pg de cada peptídeo por injecção e uma dose única total de 4,5 mg de IMA por injecção).

Tabela 7: Outros ingredientes no IMA Água para injecção* Solvente De acordo com Ph. Eur. Ácido acético* Solvente De acordo com Ph. Eur. Nitrogénio* Gás inerte De acordo com Ph. Eur. *retirado durante o processo de produção A qualidade do IMA é assegurada pelo uso de substâncias activas e excipientes que atendem as exigências da Ph. Eur.

Imunogenicidade in vitro dos peptídeos contidos no IMA O IMA contém 9 peptídeos associados a tumor HLA classe I, 1 peptídeo associado a tumor HLA classe II e 1 peptídeo virai de controlo HLA classe I. A imunogenicidade in vitro pôde ser demonstrada para a grande maioria dos peptídeos contidos no IMA. A imunogenicidade in vitro foi demonstrada para 8 das 10 sequências HLA classe I contidas no IMA, usando principalmente dois ensaios com células T: A. eliminação citotóxica de células alvo em ensaios de liberação de cromo e/ou B. por detecção de células T por tetrâmeros HLA. Esses ensaios apresentam provas da presença de células precursoras específicas no sangue de doadores HLA-A*02 positivos, bem como a capacidade dessas células T específicas de eliminar células alvo. Como no último caso, também são reconhecidas diversas linhagens de células tumorais que expressam o antigénio. Isso dá indicações adicionais (indirectas) da apresentação natural dos peptídeos usados em células tumorais e mostra que as células T citotóxicas produzidas com o uso desses peptídeos -79- têm grande avidez pelo reconhecimento de células tumorais. A imunogenicidade in vitro foi demonstrada para o peptídeo HLA classe II IMA-MMP-001 contido no IMA usando-se coloração da citoquina intracelular em citometria de fluxo (vide abaixo).

Tabela 8: Resumo dos dados de imunogenicidade in vitro para os peptideos contidos no IMA # ID do peptídeo Imunogenicidade in vitro Referências 1 IMA-ADF-001 Ensaio tipo "killer" Schmidt et al., 2004 2 IMA-ADF-002 Detecção de tetrâmeros não publicado 3 IMA-APO-001 n/a não publicado 4 IMA-CCN-001 Ensaio "killer" (células T alogénicas) Sadovnikova et al., 1998 5 IMA-GUC-001 n/a não publicado 6 IMA-K6 7-001 Detecção de tetrâmeros não publicado 7 IMA-MET-001 Ensaio "killer", coloração com citoquina, detecção de tetrâmeros Schag et al., 2004 8 IMA-MUC-001 Ensaio "killer", liberação de citoquina Brossart et al., 1999 9 IMA-RGS-001 Detecção de tetrâmeros não publicado 10 IMA-MMP-001 Coloração da citoquina não publicado 11 IMA-HBV-001 Ensaio "killer" Wentworth et al., 1995

Ensaio killer: eliminação citotóxica de alvo medido por ensaio de liberação de cromo; Liberação de citoquina: liberação de citoquinas por células T medido por teste ELISA; Coloração de citoquina: sintese de citoquinas por células T medida por citometria de fluxo intracelular; Detecção de tetrâmero: detecção de células T especificas de peptideos por tetrâmeros HLA. -80-

Imunogenicidade in vitro dos peptídeos HLA classe I contidos no IMA O IMA contém 10 peptídeos que se ligam a HLA classe 1. Para testar os peptídeos no que concerne sua imunogenicidade in vitro, foram geradas células T citotóxicas CD8+ a partir de células mononucleares autólogas de sangue periférico (PBMC) de doadores sadios usando peptídeos simples contidos no IMA e a actividade dessas células T citotóxicas foi testada com ensaios de liberação de cromo e detecção de células T com tetrâmeros HLA em citometria de fluxo. Os dados detalhados para ambos os métodos são mostrados para um peptídeo escolhido como exemplo (IMA-MET-001), e os dados para os outros peptídeos foram reunidos na Tabela 8 acima.

No primeiro passo, as células T citotóxicas foram condicionadas (priming) in vitro por estimulação repetida de células mononucleares de sangue periférico (H) de doadores sadios de hla-a*02 com o peptídeo específico a ser testado. O condicionamento pode ser feito com células dendríticas autólogas geradas a partir de monócitos sanguíneos do doador ou com esférulas carregadas de tetrâmero. A. Eliminação citotóxica do alvo: No segundo passo, a citoxicidade dessas células T citotóxicas condicionadas (primed) (células T citotóxicas) é testada marcando-se as células alvo com cromo radioactivo e incubando-se as células alvo com as Células T citotóxicas produzidas. A quantidade de cromo radioactivo liberado no sobrenadante pode ser directamente correlacionado com a proporção de células alvo eliminadas. B. Detecção de células T com tetrâmeros HLA: Alternativamente, os Células T citotóxicas condicionadas com especificidade para determinado peptídeo são detectados no segundo passo usando-se tetrâmeros HLA. Os tetrâmeros são moléculas HLA-A*02 carregadas com 4 peptídeos acoplados uns aos outros. Esses construtos permitem rotulagem específica do receptor cognato de célula T que reconhece o complexo de -81 - peptídeo HLA no tetrâmero e por marcação do tetrâmero com um fluorocromo seguido por análise em citometria de fluxo (FACS).

Condicionamento (priming) de células T citotóxicas com células dendríticas

Para a indução de CTL, 5x105 células dendríticas foram pulsadas com 50 pg/ml de peptídeo IMA-MET-001 sintético durante 2 horas, lavadas, e incubadas com PBMNC autólogo 2,5xl06 em meio RP10. Após 7 dias de cultivo, as células foram reestimuladas com PBMNC autólogo pulsado com peptídeo e 1 ng/ml de IL-2 recombinante humano (R&D Systems) foi acrescentado no primeiro, terceiro e quinto dia. A actividade citolítica do linfócito T citotóxico induzido foi analisada no quinto dia após a última reestimulação em ensaio padrão de liberação de 51Cr (Brossart 1999) (vide abaixo).

Condicionamento in vitro de células τ citotóxicas com esférulas carregadas com tetrâmero. O condicionamento in vitro foi feito como indicado anteriormente (Walter 2003) ou com pequenas modificações. Em resumo, foram produzidas moléculas HLA-A*0201 recombinantes biotiniladas sem o domínio transmembrana e biotiniladas no terminal carboxi da cadeia pesada como descrito anteriormente ((Altman 1996). O anticorpo 9.3 CD28 anti-humano purificado co-estimulatório de IgG2a de camundongo (Jung 1987) foi quimicamente biotinilado com sulfo-N-hidroxisuccinimida biotina sob condições conforme recomendado pelo fabricante (Perbio Science, Bonn, Alemanha). Foram usadas microesferas de streptavidina com 5,60 pg de diâmetro com revestimento de partículas de poliestireno com capacidade de ligação de aproximadamente 0,06 pg de microesferas de biotina-FICT/mg (Bangs laboratories, Fishers, Illinois, EUA). Para o manuseio das microesferas, usou-se um tampão estéril de PBS/BSA/EDTA. Para poderem se acoplar às moléculas biotiniladas, as microesferas foram lavadas e ressupendidas a 2 x 106 -82- partículas/ml em tampão contendo MHC e/ou anticorpos biotinilados em diversas concentrações. A ligação foi realizada em temperatura ambiente durante 30 minutos sob agitação. As esférulas revestidas foram lavadas 3 vezes, ressuspendidas no tampão acima mencionado e armazenadas por até 4 semanas a 4 °C antes de serem usadas.

Os PBMCs foram isolados dos revestimentos tamponados frescos com meio de separação gradiente padrão (Linaris, Wertheim-Bettingen, Alemanha ou PAA Laboratories, Linz, Áustria). Onde indicado, células T CD8 intocadas foram enriquecidas magneticamente por depleção negativa por meio do kit de isolamento de células T CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) de acordo com as condições do fabricante, que resultou numa pureza de mais de 80% das células TCR-positivas CD8+. As estimulações in vitro foram iniciadas em 24 placas de microtitulação com 5 x 106 células respondedoras mais 1 x 106 APCs ou microesferas por poço em 1,5 ml de meio de células T. Caso não afirmado em contrário, acrescentou-se 5 ng/ml de IL-12 p70 humano (R&D) com APCs ou microesferas. Depois de 3-4 dias de co-incubação a 37 C°, acrescentou-se meio fresco e 20 U/ml de IL-2 humano (R&D) e as células foram incubadas a 37 C° por mais 3-4 dias. Esse ciclo de estimulação foi repetido duas vezes.

Eliminação de células por Células τ citotóxicas usando ensaio de liberação de cromo O ensaio de liberação de 51Cr padrão foi realizado conforme descrito em (Brossart 2001). As células alvo foram pulsadas com 50 pg/ml de peptideo por 2 h e marcadas com cromato de sódio 51Cr em RP10 por 1 h a 37 °C. 104 células foram transferidas para um poço de uma placa de microtitulação de 96 poços com fundo em U. Foram acrescentados diferentes quantidades de linfócito T citotóxico para dar o volume final de 200 μΐ e a incubação ocorreu por 4 h a 37 °C. Ao final do ensaio, os sobrenadantes (50 μΐ/poço) foram colhidos e contados -83- em contador beta. 0 percentual de lise específico foi calculado como: 100 x (liberação experimental - liberação espontânea / liberação máxima-liberação espontânea). A liberação espontânea e a liberação máxima foram calculadas na presença de meio ou Triton X-100 a 2%, respectivamente. A especificidade de antigénio de lise de célula tumoral também foi determinada em ensaio inibitório de alvo a frio, analisando-se a capacidade do peptídeo pulsado com células T2 não marcadas de bloquear a lise de células tumorais na razão de 20:1 (razão inibidor: alvo).

Detecção de células T citotóxicas com tetrâmeros HLA. A coloração do tetrâmero foi feita como indicado anteriormente (Walter 2003) ou com pequenas modificações. Em resumo, foram produzidas moléculas HLA-A*0201 recombinantes biotiniladas sem o domínio transmembrana e biotiniladas no terminal carboxi da cadeia pesada como descrito anteriormente (Altman 1996). Os tetrâmeros fluorescentes foram obtidos pela co-incubação de HLA-A*0201 biotinilado com streptavidina-PE ou streptavidina-APC (Molecular Probes, Leiden Holanda) numa razão molar de 4:1. Para as análises dos tetrâmeros, as células foram lavadas em PBS/BSA/EDTA contendo 10 mg/ml de azida de sódio (Merck, Darmstadt, Alemanha) e coloridos a 4 °C por 20 minutos no mesmo tampão contendo os anticorpos CD4FITC e CD8-PerCP clone SKl/o clone SKl dos anticorpos CD4FITC e CD8-PerCP (ambos da Becton Dickinson). Após os experimentos de estimulação de microesferas, acrescentou-se 100 pg/ml de streptavidina não marcada (Sigma). As células foram lavadas em PBS contendo 2 % FCS a 2% inactivado por calor (PAN Biotech, Aidenbach, Alemanha), 2 mM de EDTA sódico e 10 mg/ml de azida de sódio e tetrâmero colorido a 4 °C por 30 minutos em PBS/FCS/EDTA/Azida mas incluindo FCS a 50%. Os reagentes de tetrâmero foram sempre usados em concentrações de MHC de 5 pg/ml. AS células coradas foram intensamente lavadas em PBS/FCS/EDTA/Azida e fixadas com formaldeído a 1% (Merck). As -84- células foram analisadas num citômetro de fluxo FACSCalibur de quatro cores (Becton Dickinson). Os resultados são mostrados ilustrativamente em detalhe para o IMA-MET-001 tanto para o método A como o método B. Os resultados para os outros peptideos HLA classe I são sintetizados na Tabela 8. A. Eliminação citotóxica do alvo

Os resultados foram publicados por (Schag 2004). As informações relevantes são sintetizadas a seguir.

No primeiro passo, a citotoxicidade do linfócito T citotóxico induzido foi analisada num ensaio padrão de liberação de 51Cr usando células T2 carregadas com peptideos e células dendriticas autólogas como alvo. Como mostrado na Figura 3, a linhagem de linfócito T citotóxico obtida depois de duas semanas de re-estimulações evidenciou eliminação especifica de antigénio. AS células T somente reconheceram células T2 ou células dendriticas revestidas com o peptídeo cognato, enquanto que não lisaram células alvo pulsadas com peptideos irrelevantes que se ligaram a HLA-A2 derivados de proteína sobrevivente ou transcriptase reversa de HIV-1, confirmando a especificidade da actividade citolítica.

NO segundo passo, foi analisada 3. capacidade do linfócito T citotóxico induzido in vitro de lisar células tumorais que expressam proteína c-Met de forma endógena. A análise foi feita com linhagens de células HLA-A*02 positivas HCT 116 (cancro de cólon), A498, MZ 1257 (carcinoma de células renais, CCR), MCF-7 (cancro de mama), Mel 1479 (melanoma maligno) e U266 (mieloma múltiplo) que expressam c-Met como alvo num ensaio padrão de liberação de 51Cr. A linhagem Croft de célula B transformada EBV (HLA-2+/c-Met) e a linhagem de células de cancro de ovário SK-)V-3 (HLA-A3+/c-Met+) foram incluídas para determinar a especificidade de a restrição ao HLA do linfócito T citotóxico. Como mostrado na Figura 4, o linfócito T citotóxico específico de peptídeo c-Met foi capaz de lisar de forma eficiente as células malignas que -85- expressaram o HLA-A2 e o c-Met. Não houve reconhecimento de células de cancro de ovário SK-OV-3 ou células Croft demonstrando que a apresentação do peptideo c-Met no contexto de moléculas HLA-A2 nas células tumorais é necessária para uma lise eficiente das células alvo e para confirmar a especificidade antigénica e a restrição MHC do CTL. As células T induzidas in vitro não reconheceram as células K 562, indicando que a actividade citotóxica não foi mediada por células NK.

Para confirmar ainda mais a especificidade antigénica e a restrição MHC das linhagens de linfócito T citotóxico induzidas in vitro, realizamos ensaios de inibição de alvo a frio. A lise das células alvo (U 266 e A 498) pôde ser bloqueada em ensaios de inibição de alvo a frio. A adição de células T2 frias (não marcadas com 51Cr) pulsadas com o peptideo cognato reduziu a lise das células tumorais, enquanto que as células T2 pulsadas com um peptideo irrelevante não mostraram nenhum efeito (Figura 5). B, Detecção de células T com tetrâmeros HLA. Células T CD8 enriquecidas de um doador A*02 sadio foram estimuladas 3 vezes com esférulas revestidas na presença de 10 nM de anticorpo CD28 mais 10 nM de um complexo A*02 irrelevante (painel esquerdo) ou A*02 redobrados com os antigénios indicados (painéis central e direito). Os antigénios indicados eram os peptideos NLVPMVATV de CMV pp65 (Wills 1996), o peptideo modificado ELAGIGILTV de Melan-A/MART-1 (Kawakami 1994) e o pp IMA-MET-001. Todas as linhagens de células T foram coradas na superfície com anticorpo CD8-PerCP, tetrâmero-PE cognato (Figura 6, painéis esquerdo e central) e tetrâmero APC A*02/ILKEPVHGV (painel direito). O percentual de células tetraméricas positivas entre os linfócitos CD8+ é indicado em cada gráfico. -86-

Imunogenicidade in vitro do peptídeo HLA classe II IMA-MMP-001 contidos no IMA. O IMA contém um peptídeo HLA classe II de metaloproteinase matricial 7, o IMA-MMP-001. Para testar os peptídeos no que concerne sua imunogenicidade in vitro e sua características de ligar- -se promiscuamente, foram geradas células T CD4+ a partir de células mononucleares autólogas de sangue periférico (PBMC) de doadores sadios com diferentes genótipos HLA usando o peptideo IMA-MMP-001 e a actividade dessas células T auxiliares foi testada com coloração de citoquina intracelular em citometria de fluxo.

Primeiramente, as células T CD4+ foram condicionadas (primed) in vitro por estimulação repetida de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de doadores sadios com o peptideo especifico a ser testado na presença de IL-12. 0 condicionamento foi feito usando-se células dendriticas autólogas geradas de monócitos sanguíneos dos doadores. No segundo passo, a actividade das células T CD4+ específicas para aquele peptídeo determinado foi testada via medição da produção de IFNy por coloração de IFNy intracelular usando-se anticorpo marcado com fluorescência. A análise foi feita por citometria de fluxo (FACS).

Geração de células dendriticas (CDs) Células dendriticas humanas foram preparadas a partir de PBMCs de sangue recém tirado de doadores sadios. Os PBMCs foram isolados usando-se um gradiente de densidade Ficoll (Lymphocite Separation Médium, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Áustria). As células obtidas foram lavadas, ressuspendidas em meio X-Vivo 15 suplementado com 50 U/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina (BioWhittaker, Verviers, Bélgica) e colocadas na placa a uma densidade de 7 x 106 células/ml. Depois de 2 horas a 37 °C, os monócitos aderidos foram cultivados durante 6 dias em meio X-Vivo com 100 ng/ml de GM-CSF e 40 ng/ml de IL-4 (AL- -87-

ImmunoTools, Friesoythe, Alemanha). No sétimo dia, as células dendríticas imaturas foram activadas com 10 ng/ml de TNF-a (R&D Systems, Wiesbaden, Alemanha) e 20 pg/ml de poli(IC) (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha) por 3 dias. O estado de diferenciação das células dendríticas foi examinado por citometria de fluxo, as células dendríticas maduras sendo predominantemente CD14-, CD40-positivas, CD80-positivas CD83-positivas, CD86-positivas e HLA-DR+ (dados não exibidos).

Geração de células τ CD4+ específicas de antigénio

Para gerar células T CD4+, 106 PBMCs foram estimulados com 2 x 105 células dendríticas autólogas. Depois do condicionamento, a reestimulação foi feita a cada 6 a 8 dias com PBMCs autólogos criopreservados. Para a estimulação, as células foram pulsadas com 5 pg/ml de peptídeo por 90 minutos a 37 °C e irradiadas (60 Gy, Gammacell 1000 Elite, Nordion International Inc., Ontário, Canadá). AS células foram incubadas em placas de microtitulação de 96 poços (7 poços por doador e por peptídeo) com meio para célula T: RPMI 1640 contendo HEPES e L-glutamina (Gibco, Paisley, RU) suplementado com 10% de soro humano inactivado por calor (PAA, Cõlbe, Alemanha), 50 U/ml de penicilina, 50 pg/ml de streptomicina e 20 pg/ml de gentamicina (BioWhittaker) na presença de 10 ng/ml de IL-12 (Promocell, Heidelberg, Alemanha). Depois de 3 a 4 dias de co-incubação a 37°C, foi acrescentado meio fresco com 80 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, EUA) e 5 ng/ml de IL-7 (Promocell) . As análises foram realizadas depois da terceira e da quarta estimulação por coloração de iFNy intracelular.

Coloração de IFNy intracelular

As PBMCs criopreservadas foram descongeladas, lavadas duas vezes em meio X-Vivo 15 a 107 células/ml de meio de célula T e cultivadas por uma noite para reduzir a produção de IFNy não específico {PROVENZANO2002}. No dia seguinte, as -88- PBMCs foram pulsadas com 5 pg/ml de peptídeo durante 2 horas, lavadas três vezes com meio x-vivo 15 e incubadas com células efectoras na proporção de 1:1 durante 6 horas. Acrescentou-se Golgi-Stop (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) para as últimas 4 horas de incubação. As células foram analisadas usando-se o kit Cytofix/Cytoperm Plus (Becton Dickinson) e anticorpos SKl clonados CD4-FITC- (ImmunoTools), IFNy-PE e CD8-PerCP (Becton Dickinson). Após coloração, as células foram analisadas num citómetro de fluxo FACSCalibur de três cores (Becton Dickinson) .

Para gerar células T CD4+ especificas de antigénio, as PBMCs de 4 doadores sadios com diferentes alelos HLA-DR (Figura 7) foram estimuladas com o uso de células dendriticas autólogas pulsadas com antigénios. 0 sistema usado para leitura de produção de células T CD4+ especificas de antigénio foi avaliar a produção de IFNy pro citometria de fluxo. As células T foram analisadas depois da terceira e da quarta estimulação por coloração de IFNy intracelular mais coloração de CD4-FITC e CD8-PerCP para determinar o percentual de células produtoras de IFNy em subpopulações especificas de células T. Em todos os experimentos, as estimulações com peptideos irrelevantes e sem peptídeos foram realizadas como controlos negativos. A resposta IFNy foi considerada positiva se a detecção de células T CD4+ produtoras de IFNy é mais de duas vezes maior do que o controlo negativo. (Horton 2004). Em três dos quatro doadores foi possível gerar células T CD4+ que reagiam especificamente com o peptídeo objecto de interesse (Figura 7). Não foi possível observar respostas das células T no doador 4 nem depois da terceira e nem da quarta estimulação. As frequências maiores de células T CD4+ produtoras de IFNy específicas para IMA-MMP-001 foram observadas nos doadores 1 e 2, respectivamente.

Assim, o IMA-MMP-001 é um ligante promíscuo capaz de provocar respostas de células T CD4+ em 3 entre 4 doadores sadios portando diferentes alelos HLA. De acordo com as -89- previsões de ligação e os resultados obtidos, é bem provável que o peptídeo seja apresentado por hla-drb1*0101, HLA-DRBl*0401/*408 eHLA-DRBl*1101. Todos os quatro alelos têm resíduo glicina na posição 86 e resíduo de ácido aspártico na posição 57 de suas cadeias β (dados não exibidos).

Portanto, eles têm motivos de ligação bastante similares, compartilhando características de ligação para seus bolsos de ligação PI e P4 (Rammensee 1997; Hammer 1993; Marshall 1994) . O doador 4 porta junto alelos HLA-DRB1*0318 e DRB1*1401 com motivos de ligação bem diferentes. Isso explicaria porque não foi possível provocar uma resposta de célula T com células desse doador, quando se utilizou os peptídeos antes mencionados.

Os efeitos nos Seres Humanos

Peptídeos curtos, semelhantes no comprimento e na distribuição aos aminoácidos aqui descritos, foram introduzidos em milhares de pacientes em diferentes testes clínicos de fase 1 a 3 desde 1996. Em nenhum desses estudos foram relatados eventos adversos graves. Além disso, o peptídeo IMA-MUC-001 contido no IMA já foi utilizado para vacinação, tendo sido carregado em células dendríticas em um teste iniciado pelos pesquisadores na Universidade de Ttibingen, Alemanha, e foi muito bem tolerado (Wierecky 2005) .

Os peptídeos com SEQ ID-No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 foram ensaiados em 30 pacientes, dos quais 26 completaram um curso completo de vacinação em um período de dez semanas. Uma alta proporção de pacientes, 74% apresentaram uma resposta imune específica contra sequências peptídicas incluídas na vacina. Já neste conjunto de pequena fase I, a função biológica in vivo de 8 dos 9 peptídeos (SEQ-ID-No. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) ligando ao MHC de classe I (alelo HLA-A*02) pôde ser confirmada de acordo com ELISPOT amplificado e/ou resultados do ensaio de coloração tetrâmero realizado como -90- descrito abaixo. Os peptídeos com SEQ ID-No. 1 (IMA-MMP-001) para o qual uma leitura que poderia ter sido exiqida não pôde ser testada devido à disponibilidade limitada de PBMC do sangue do paciente.

Parâmetros Imunológicos Específicos (Monitorização Imunológico)

Até a presente data, o monitoramento imunológico é prática comum em milhares de pacientes de diversos estudos de vacinação terapêutica (Romero 2004). Até hoje foram reportados inúmeros métodos diferentes de monitoramento imunológico, entre eles ensaios funcionais e específicos. Os componentes imunogénicos da vacina terapêutica IMA são peptídeos que se ligam a HLA que deveriam induzir linfócitos T específicos in vivo. Esta activação irá levar à sua proliferação e aquisição de funções efectoras, que incluem sua capacidade de secretar citoquinas quando do contacto com antigénios.

Como um marcador substituto da activação de células T, é possível testar por meio de ensaios ELISPOT a Frequência das células mononucleares secretoras de citoquinas específicas no sangue. Esses ensaios são especialmente adequados para esse propósito, uma vez que se baseiam em célula única e resultam num parâmetro (i.e., o número de células que formam manchas entre as células mononucleares) que se espera estarem directamente ; relacionadas com a verdadeira frequência dos linfócitos T específicos de antigénios secretores de citoquinas em amostras de sangue Dessa forma, os ensaios também permitem processar quantidades relativamente grandes de amostras e peptídeos em paralelo, sendo que eles já têm sido amplamente usados em estudos de monitoramento imunológico em vários estudos clínicos até agora (Schmittel 2000).

Resposta imune A actividade/eficácia imunológica pode ser descrita pela análise da resposta das células T. A experiência e os -91 - resultados de diferentes estudos clínicos em relação à resposta imune para diferentes indicações pode ser encontrada na literatura. As respostas de células T de até 100% foram descritas por Disis et al., 1999, em pacientes com cancro de ovário e de mama. A disseminação de epítopos em 84% dos pacientes (n = 64) num estudo de 3 braços com antigénio Her2/neu mais GM-CSF foi relatada por Disis et al. em 2000 em pacientes com cancro de ovário e de mama e em carcinoma de pulmão de células não pequenas. Outros autores publicaram resultados relativos a respostas de células T de 33% e 83% em pacientes com melanoma (Keilholz/Schadendorf, 2003; Slingluff et al., 2004). Gaudernack/Gjertsen, 2003 reportaram acerca de resposta imune de diversos clones de células T CD$-positivas e CD8+ específicas para o antigénio usado nesse estudo.

Além disso, foram apresentados resultados por Wierecky et al.; ASCO 2005: células dendríticas derivadas de monócitos maduros autólogos foram pulsadas com dois peptídeos que se ligam a HLA-A2 deduzidos do peptídeo MUC1. Para o recrutamento e a activação das células 7 CD4+, as células dendríticas foram novamente incubadas com os peptídeos PADRE que se ligam a PAN-DR. As vacinações foram aplicadas de forma subcutânea a cada duas semanas, quatro vezes, e repetidas mensalmente até a progressão do tumor nessa abordagem terapêutica. Após a 5a injecção de células dendríticas, os pacientes receberam ainda 3 injecções/semana de IL-2 de baixa dosagem (1 Mi IE/m2). O aumento do precursor de célula T foi monitorizado via IFN-γ ELISPOT e ensaios de liberação de 51Cr. Além disso, a capacidade das PBMC de produzir citoquinas em resposta a desafio com epitopos relacionados a vacina foi testada via reacção em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa e em tempo real.

Nesse estudo de Wierecky et al., foram detectadas respostas in vivo de células T específicas do peptídeo MUC1 em células PBMC de todos os pacientes com OR. Essas células T induzidas in vivo conseguiram reconhecer células alvo pulsadas -92- com o peptídeo cognato ou células tumorais alogénicas combinadas (A498) expressando MUCl constitutivamente de forma antigénio e HLA restrita depois de reestimulação in vivo. Nos pacientes que respondem ao tratamento, puderam ser detectadas respostas das células T aos antigénios não usados na vacinação, como por exemplo adipofilina, telomerase ou OFA, indicando que poderia ocorrer espalhamento de epitopos. Foi possível detectar respostas proliferactivas ao peptídeo PADRE em 11/16 pacientes, sendo que em alguns pacientes isso ocorreu já após a segunda vacinação. Conclusão: a análise da disseminação dos epitopos em pacientes vacinados pode ser um parâmetro útil para correlacionar respostas clínicas e imunológicas. RESPOSTAS IMUNES IN VIVO Formulação do Teste Clínico A formulação do teste clínico de ima consiste em: - Liofilizado, incluindo 11 peptídeos em ampolas de 3 ml - Diluente (bicarbonato de sódio a 4,2%)

Formas de dosagem de IMA Pó para injecção, em ampolas de vidro de 3 ml. Informação de embalagem: 4 ampolas por caixa. 0 diluente consiste em 700 μΐ de bicarbonato de sódio embalado em frascos de 250 ml. 1 ampola de ima é reconstituída pela adição de 700 μΐ de bicarbonato de sódio a 4,2% (diluente). A fim de dissolver o IMA, a ampola e o diluente é agitados vigorosamente por 3 minutos e ultra-sonicados por 1 minuto. Posteriormente, o frasco é agitado novamente por 1 minuto. 500 μΐ desta solução são administrados dentro de 30 minutos após a reconstituição.

Vacinação

Neste estudo pacientes com carcinoma avançado de células renais recebem oito vacinas durante um período de dez semanas. Ao todo, um total de 24 pacientes do HLA-A*02 positivo de tipo -93- HLA foram registrados. A vacinação intradérmica (GM-CSF plus IMA) foi aplicada nos dias 1, 2, 3, 8, 15, 22, 36 e 64. Amostras de sangue foram realizadas em diferentes momentos durante o estudo e as células T contidas no interior das células mononucleares do sangue periférico do paciente (PBMCs) foram isoladas de sangue heparina por centrifugação gradiente de densidade, contados usando hemocitómetros e foram preservadas para serem armazenadas em temperatura criogénica até o momento do ensaio. Dois diferentes ensaios ELISPOT de rotina e um ensaio de rotina tetrâmero foram então realizados pelo aplicante.

Ensaio ELISPOT amplificado

No ensaio "ex vivo ELISPOT", as células são descongeladas em momentos diferentes, o número de células vivas é contada e as amostras são analisadas através da incubação de um dia com diferentes peptideos ou controlos em tanque triplicado. O ensaio de ELISPOT ex vivo fornece dados quantitativos de forma muito mais rápida em comparação com os outros ensaios abaixo. Além disso, este é apenas o ensaio que permite a medição do peptídeo HLA de classe II (IMA-MMP-001) contida no IMA. No entanto, este ensaio é de uma sensibilidade limitada e os dados positivos foram esperados apenas no caso de respostas muito fortes de células T comparável com respostas imunes à memória (recall) perante o vírus.

No ensaio "ELISPOT amplificado", células de diferentes intervalos de tempo são agrupadas, contadas e pré-estimuladas com antigénios por aprox. duas semanas para permitir que as células específicas se dividam. As células são então colhidas da cultura, recontadas e, em seguida, ensaiadas como explicado acima para a produção de mancha lFN-γ através de reestimulação de um dia com antígeno. As células que são activadas sob tais condições secretam IFN-γ, que é detectado por um método sanduíche de anticorpos ligados a enzimas. Manchas são -94- visualizadas por uma reacção formada de modo colorido e contada com uma câmara digital de alta resolução automatizada (aqui chamada de "leitor de ELISPOT"). 0 número de pontos que se correlacionam com a verdadeira frequência de linfócitos T activados específicos de antigeno na amostra é determinado por um algoritmo de software a partir de imagens captadas pelo leitor ELISPOT. Este ensaio tem sido frequentemente utilizado para detecção de resposta de células T a antigénios tumorais vacinados em vários ensaios clínicos realizado por terceiros. A possibilidade de dados falsos-positivos devido ao "condicionamento in vitro" de células T é excluída usando-se vários controlos neste ensaio. Em comparação com o ensaio tetrâmero abaixo, este ensaio fornece informações funcionais adicionais, ou seja, liberação de citocinas γ-IFN.

0 ensaio amplificado ELISPOT foi realizado para 28 pacientes do estudo e todos os antigénios presentes na IMA antes e durante o protocolo de vacinação em diferentes momentos. A Figura 10 mostra exemplos representativos de uma resposta IMA de células T induzida identificada pelo ensaio ELISPOT amplificado para o mesmo paciente e antigeno. A coluna superior e inferior representam antigénios de controlo negativo HIV-001 e TUMAP IMA-CCN-001 simples usados para leitura, respectivamente. O número de células positivas é dado para cada experimento. A coluna esquerda mostra ELiSPOTs de amostras colectivas tomadas antes da vacinação, enquanto a coluna da direita mostra ELISPOTs de amostras colectivas feitas durante o protocolo de vacinação. Enquanto o antigénio de controlo não levou a um aumento no número de manchas após a indução de uma resposta imune, a injecção de IMA levou a uma multiplicação de números de manchas para o IMA-CCN-001. O número de resultados positivos, ou seja, células IFN-γ secretoras, aumentadas de 27-34 antes da vacinação de 100-141 após a quarta e quinta injecção. O tratamento com o IMA -95- resultou em um aumento da frequência de linfócitos T activados específicos para o antígeno ima-CCN-001 neste paciente.

Ensaio tetrâmero amplificado

No ensaio "tetrâmero amplificado", células de diferentes intervalos de tempo foram deslocadas, contadas e pré-estimuladas com antigénios por aprox. duas semanas para permitir que as células T específicas se dividam. As células são colhidas da cultura e, em seguida, contadas e coradas com multímeros MHC marcados com fluorocromo PE e APC e com anticorpos para definir células T CD8+ (um tanque por coloração e período). Multímeros MHC são complexos de peptídeos MHC recombinante que são multimerizados e conjugados com um corante fluorescente. Foram utilizados apenas multímeros HLA-A*0201 tetraméricos que são totalmente equivalentes àqueles originalmente introduzidos no campo (Altmann 1996), que são aqui brevemente chamados de tetrâmeros. As amostras coradas e fixadas foram analisadas em um citómetro de fluxo, utilizando os procedimentos padrão conhecidos na arte, resultando em um conjunto de dados baseado em uma célula única para cada amostra. Este ensaio "tetrâmero amplificado" é de uma sensibilidade muito alta, mas menos quantitativa em relação aos ensaios ex vivo.

Para a análise primária dos dados tetrâmero, o número de células T CD8 + totalmente avaliadas, células tetrâmero positivo simples e células duplo-tetrâmero positivas por amostra foi contado por via electrónica a partir da lista de arquivos de citometria utilizando software comercial. Células T CD8+ foram identificadas pelo espalhamento da frente e lateral agrupando em linfócitos vivos e subagrupando sobre eventos CD8+ CD3+ baseados em fluorescência de anticorpo. Definição de agrupamentos de linfócitos CD3/CD8 foi idêntica para todas as colorações de um paciente dentro de um ensaio. Populações tetrâmero positivos foram identificadas a partir de células T CD8+ pela análise de parcelas de ponto de tetrâmero -96- duplo com quadrantes ou portões. Definição de células tetrâmero+ foi idêntica para cada condição de coloração para um determinado paciente em um ensaio e baseada na população de células reconhecíveis. 0 ensaio amplificado tetrâmero foi realizado para 28 pacientes do estudo e todos os antigénios presentes na IMA antes e durante o protocolo de vacinação em diferentes momentos. A Figura 11 mostra dois exemplos representativos da IMA induzido de respostas de célula T identificadas pelo teste ampliado de coloração tetrâmera. Painéis superiores e médios representam parcelas de ponto bidimensionais com delimitação de linfócitos CD3 + , painéis inferiores são fechados em CD3+ CD8+ linfócitos. Pacientes, instantes e colorações foram indicados para cada coluna. Na Figura 11, a resposta imunológica a IMA-CCN-001 em 03-004 paciente, que já foi mostrada pelo ensaio de ELISPOT (Figura 10) foi confirmada pelo ensaio tetrâmero. A população de células positivas para CD3+ e tetrâmero IMA-CCN-001 foi identificada após a quarta e quinta injecção da IMA (V6+V7; painel do meio), enquanto que nenhuma população foi positiva para o tetrâmero K67-001 (painel superior). As células IMA-CCN-001 positivas aumentaram de 0,03% antes da vacinação para 0,78% dos linfócitos (V6 + V7; painel inferior) após as primeiras três injecções. 0 paciente 03-003 não apresentou nenhuma resposta imunológica contra peptídeo RGS-001 (Fig. 11B; painel superior), mas desenvolveu resposta tetrâmera IMA-CCN-001 positiva durante o curso do tempo do protocolo de vacinação (SI + VI: amostras colhidas antes da vacinação; V4 + V5: amostras colhidas nos dias 8 e 15; V6 + V7: amostras colhidas no dia 22 e dia 36; V8+FU: amostras colhidas no dia 64 (última vacinação) e após 85-92 dias; final do estudo). No painel do meio, coluna 3 e 4 mostram populações distintas de células positivas para a CNN- 001 e CD3+. Durante o momento da vacinação, a quantidade -97- dessas células aumentaram de 0,02% antes da vacinação para 0,8% dos linfócitos (Painel inferior, coluna 3) após as primeiras três injecções, e diminuíram para 0,31% após o dia 64 (painel inferior, coluna 4; V8+FU).

Para pacientes seleccionados, o ensaio tetrâmero amplificados foi realizado em pontos de uma vez, ou seja as amostras de sangue não foram agrupadas, permitindo uma avaliação mais precisa da cinética de células T a exemplo do que é mostrado na Figura 12. A cinética de magnitude observada na célula T em um ensaio tetrâmero amplificado em um único período, como mostrado para o paciente 05-001. Os antigénios associados a tumor presentes na IMA (grupo TUMAP) foram maiores nos dias 22, 36 e 64 (V6, V7 e V8), enquanto a resposta ao peptídeo IMA-CCN-001 atingiu seu pico no dia 22 (V6) . O controlo HBV-001 positivo resultou em uma resposta ainda mais rápida que atingiu o seu máximo no dia 15 (V5).

Dois pacientes com uma resposta muito alta ao IMA-CCN-001 foram seleccionados para confirmar os resultados do ensaio tetrâmero amplificado em um experimento não amplificado. Estes ensaios tetrâmeros ex vivo foram realizados sem cultivar as células por duas semanas.

Os resultados são resumidos na Tabela 9 abaixo. São mostrados todos os resultados avaliados a partir de tetrâmero ex vivo e ensaios tetrâmero ampliados combinados com paciente / antígeno onde uma resposta induzida pela vacina foi detectada no teste ampliado. Para o método "ex vivo", é indicado o % de tetrâmero+ entre o total de células T CD8 +. Quanto ao método de avaliação de "amplificada, de rotina", as subpopulações de células T linfócitas CD8+ podem ser analisadas, uma segunda reavaliação dos dados de rotina é exibida ("amplificada, quantitativa") com os cálculos com base no total de linfócitos CD8 +. O "factor de amplificação" foi calculado se uma -98- população tetrâmera+ discreta foi observada ex vivo e em ensaio tetrâmero amplificado.

Os resultados demonstram claramente que as respostas imunológicas medidas com o ensaio tetrâmero amplificado não foram geradas devido a expansão das células durante o período de incubação de duas semanas, mas sim baseadas nos linfócitos anteriormente "ex vivo" presentes no sangue do paciente. -99-

Tabela 9: Comparação de magnitudes de resposta das células T calculadas a partir de ensaios ex vivo e ensaios tetrâmeros amplificados, PACIENTE Ensaio ID Ponto de tempo Método Antigénio $ Tetrâmerot entre linfócitos T CD8+ Factor de amplificação 01-001 TET-0013/20060511a S2 ex vivo MUC-001 0,003 01-001 TET-0013/20060511a VI ex vivo MUC-001 0,004 01-001 TET-0013/20060511a V4 ex vivo MUC-001 0,007 01-001 TET-0013/20060511a V5 ex vivo MUC-001 0,003 01-001 TET-0013/20060511a V6 ex vivo MUC-001 0,001 01-001 TET-0013/20060511a V7 ex vivo MUC-001 0,003 01-001 TET-0013/20060511a V8 ex vivo MUC-001 0,004 01-001 TET-0013/20060511a FU ex vivo MUC-001 0,005 01-001 TET-0001/20060425a S2; VI amplificado, de rotina MUC-001 2,976* 01-001 TET-0001/20060425a LO amplificado, de rotina MUC-001 2,391* 01-001 TET-0001/20060425a V6;V7 amplificado, de rotina MUC-001 4,502* 01-001 TET-0001/20060425a V8; FU amplificado, de rotina MUC-001 4,900* 01-001 TET-0001/20060425a S2; VI amplificado, quantitativo MUC-001 3,044* 01-001 TET-0001/20060425a LO amplificado, quantitativo MUC-001 2,485* 01-001 TET-0001/20060425a V6;V7 amplificado, quantitativo MUC-001 -k LO LO 01-001 TET-0001/20060425a V8; FU amplificado, quantitativo MUC-001 5,037* 01-003 20060727a VI ex vivo HBV-001 0,006 01-003 20060727a V7 ex vivo HBV-001 0,021* 01-003 TET-0007/20060510b VI amplificado, quantitativo HBV-001 0,036* 01-003 TET-0007/20060510b V7 amplificado, quantitativo HBV-001 2,587* 123 01-003 TET-0007/20060510b VI amplificado, de rotina HBV-001 (0,084*) 01-003 TET-0007/20060510b V7 amplificado, de rotina HBV-001 (5,186*) (247) 01-009 20060727a VI ex vivo rCCN-001 0,010* 01-009 20060727a V5 ex vivo rCCN-001 0,092* 01-009 20060727a V6 ex vivo rCCN-001 0,052* 01-009 TET-0026/20060711a VI amplificado, quantitativo TUMAP Grupot 0,051 01-009 TET-0026/20060711a V5 amplificado, quantitativo TUMAP Grupot 5,323* 58 01-009 TET-0026/20060711a V6 amplificado, quantitativo TUMAP Grupot 1,398* 27 01-009 TET-0026/20060711a VI amplificado, de rotina TUMAP Grupo# (0.059) 01-009 TET-0026/20060711a V5 amplificado, de rotina TUMAP Grupot (16,961*) (184) 01-009 TET-0026/20060711a V6 amplificado, de rotina TUMAP Grupot (6,181*) (119) 03-009 20060727a VI ex vivo rCCN-001 0,009 03-009 20060727a V7 ex vivo rCCN-001 0,034* 03-009 TET-0015/20060531a VI amplificado, quantitativo TUMAP Grupot 0,124 03-009 TET-0015/20060531a V7 amplificado, quantitativo TUMAP Grupot 7,521* 221 03-009 TET-0015/20060531a VI amplificado, de rotina TUMAP Grupot (0.247) 03-009 TET-0015/20060531a V7 amplificado, de rotina TUMAP Grupot (18,953*) (557) *: População de tetrâmero+ discreto detectada f: 0 ensaio separado mostrou evidências claras de que a resposta do grupo TUMAP apenas poderia ser contribuída pelo RCCN-001, -101-

Responsividade geral do paciente

Respostas das células T, medidas pelos ensaios acima descritos, foram avaliadas em todos os peptideos contidos no IMA para 28 pacientes em diferentes momentos do estudo. Um paciente foi marcado como "responsivo", ou seja mostrou uma resposta imune induzida pela vacina, se uma das amostras de sangue colhidas em um momento após o momento da vacinação contenha linfócitos tetrâmeros positivos ou secretados através de estimulação de um dos peptideos.

Como esperado, os pacientes reagiram individualmente aos diferentes peptideos contidas na IMA. Tendo em conta o pequeno número de pacientes, uma reacção surpreendentemente boa foi alcançada, já que a maioria dos pacientes (23 dos 27 pacientes avaliáveis) desenvolveram uma resposta imune a pelo menos um dos peptideos. 8 de 27 pacientes avaliados (30%) até apresentaram uma resposta de célula T contra TUMAPs múltiplos.

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Ref Type: Abstract

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LISTAGEM DE SEQÚÊNCIA <110> Immatics biotechnolog 'ies GmbH <120> Peptideos associados a tumore; I ou II do antigénio leucocitár: vacina anti-cancerigena <130> FB19804PT <160> 11 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211 > 16 <212> PRT < 213 > Homo sapiens <400> 1 Ser Glr i Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gin : 1 5 <210> 2 <211> 9 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Vai Met . Ala Gly Asp Ile Tyr Ser Vai 1 5 <210> 3 <211 > 9 <212> PRT < 213 > Homo sapiens <400> 3 Ser Vai . Ala Ser Thr Ile Thr Gly Vai 1 5 <210> 4 <211> 9 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Ler [ Ala Asp Gly Vai Gin Lys Vai 1 5 10 15 <210> 5 -115 <211> 9 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Vai 1 5 <210> <211> 6 9 <212> PRT < 213 > Homo sapiens <400> 6

Ser Vai Phe Ala Gly Vai Vai Gly Vai 1 5 <210> <211> 7 9 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Ala Leu Phe Asp Gly Asp Pro His Leu 1 5 <210> <211> 8 9 <212> PRT < 213 > Homo sapiens <400> 8

Tyr Vai Asp Pro Vai Ile Thr Ser Ile 1 5 <210> <211> 9 9 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Ser Thr Ala Pro Pro Vai His Asn Vai 1 5 <210> <211> 10 9 <212> PRT < 213 > Homo sapiens <400> 10 -116 -

Leu Ala Ala Leu Pro His Ser Cys Leu 1 5 <210> 11 <211> 10 < 212 > PRT <213> Hepatitis B vírus <400> 11

Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Vai 15 10

Claims (5)

1 Mills ύφψ 14/14

·,( '1 í 3 10 10 10 10

Z Φ Ll 10 é!

13" F io; 10S FU-H .„4 1iJ 10" 10' \i 1Í FM

1 Reivindicações 1. Um peptídeo associado a tumor de acordo com SEQ ID No. 2 (VMAGDIYSV) ou um peptídeo de acordo com SEQ ID No. 2, na qual as cadeias laterais de um ou dois resíduos de aminoácidos são alteradas, tendo a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humana (MHC) de classe I. HLA-A*02. 2. 0 peptídeo associado a tumor de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, onde o peptídeos citados incluem ligações não peptídicas.

2/14

3/14 Ftgata 3

3. Uma proteína de fusão compreendendo peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em particular, ainda mais compreendendo aminoácidos do terminal N da cadeia invariante de antígeno associado a HLA-DR (li).

4/14

% í~s?>e Especsfjca %. Líse IEs

5/14 Figura 5 Â 60 re 50 õ E 40 φ 30 £L m oq lil $ 10 ~J 0 ^ -10 ir~ *- ··>- .....á ·- A 41 ···*··· U266 + I2/SurviVi;rsa -*-U266 (J2B6 + T2C41ÊT "T-r-rrrr" 10E:T -τ-η 100 o sKí. υ φ α «ι ui φ φ 80 ί 70 -| 80 -I 50 -j 40 ] 30 -jr^ 2 0 -] 10 "{θ'-·— 0 ·] -10 Á-r- / / !T*m ir-.A 498 + T2/Survivina A 498 A 498 + T2/C4VET 1 10 E:T 100 6/14 Figura, ΐ> Complexo Complexo Complexo Principal de Principal de Principal de cc c ΟΪ O O LU 0- *2 i Φ J-—

LO <X> CL CL > O < * c m ULJ CD8-PerCP *-► 7/14 Figura 7 Doador 1 DRHPOIO! DRBP0701. Doador 2 DRB! -4).804 Doador 3

Doador 4 DRB 1 * 03! 8 DRB i * 1401 MMROCR

8/14 FigtirilA *&#*» mf m < ί m m m« <$» {«:«**: $:.»>..& totó*. $*?&' Wi

9/14 RWI jt;t j 88 MUOM: «SM» UISS135

10/14 Paciente N“ 3

ll GFA-1 1G250 □ Telomerasa LlSurvivínal Adípofilina | Paciente N° 8

Figura Λ γ> 11/14 03-004 03-004 S2'f-Vl V6+V7 43 58 ' 36 ' 38 :1:¾¾¾¾¾¾¾ 33 35 34 100 27 124 30 141 ^ 12/14 .q ura 11A χçj u. Χ2-Α?1 ΎΙΛ : ·;ΑΑ ;·Ί·;· ; ΐ'Κο '/'-·ιΗ::1. Í‘L‘5; ν'ί-ΟΟΛ VA.vA.V 5Í1.1 : ΑΙΑ: ::Α>:7-ΑΑ1 Α··4: ί'/ΑΙνΆΟΙ

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10y IO1 to2 10a ÍÔ4 FL1-H 5 -j 10 10aio1 10° 3.. 0.03% 0,00% W 0.01% 10° io1 10" f L2-H ur io4

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4. Um ácido nucleico, que consiste de uma sequência que codifica um peptídeo de acordo com a Reivindicação 1. 5. 0 ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 4, que é dna, cDNA, PNA, CNA, RNA ou combinações dos mesmos.

6. Um vector de expressão capaz de expressar um ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 4 ou 5.

7. Um peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 3, um ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 4 ou 5, ou um vector de expressão de acordo com a Reivindicação 6 para uso na medicina. 2

8. Uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 4 ou 5, ou um vector de expressão de acordo com a Reivindicação 6.

9. A célula hospedeira de acordo com a Reivindicação 8 que é uma célula recombinante RCC ou Awells.

10. Uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um peptideo associado a tumor de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 3, um ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 4 ou 5, ou um vector de expressão de acordo com a Reivindicação 7, e um portador farmaceuticamente aceitável.

11. A composição farmacêutica acordo com a Reivindicação 10, que compreende ainda um peptideo de acordo com SEQ ID No. 1 ou um peptideo de acordo com a SEQ ID No. 1, na qual suas cadeias laterais de um ou dois resíduos de aminoácidos são alteradas, tendo a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humana (MHC) de classe li.

12. A composição farmacêutica acordo com a Reivindicação 10 ou 11, que compreende ainda pelo menos um peptideo contendo uma sequência adicional de acordo com qualquer uma das SEQ ID No. 3a SEQ ID No. 11.

13. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 14, onde pelo menos um peptideo inclui ligações não peptidicas.

14. A composição farmacêutica de acordo com algumas das Reivindicações 10 a 13, compreendendo peptídeos composto por sequências de aminoácidos de acordo com SEQ ID No. 1 e SEQ ID No. 2, e SEQ ID No. 3a SEQ ID No. 11. 3

15. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 14, compreendendo ainda ao menos um adjuvante apropriado.

16. A composição farmacêutica acordo com a Reivindicação 15, onde o dito adjuvante seja seleccionado do grupo de factores estimulantes de colónias, tais como o Factor Estimulante de Colónias de Granulócitos e Macrófagos (GM-CSF) . 17. 0 uso de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 10 a 16 para a preparação de uma vacina contra o cancro.

18. Um método de produzir um peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, o método compreendendo o cultivo da célula hospedeira acordo com a Reivindicação 8 e o isolamento dos peptídeos da célula hospedeira ou do seu meio de cultura.

19. Uso de um peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 3 ou um ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 4 ou 5, ou um vector de expressão de acordo com a Reivindicação 6 no fabrico de um medicamento para matar as células cancerígenas em um paciente, no qual as células cancerígenas expressam aberrantemente um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos conforme o apresentado na Reivindicação 1.

20. Um método in vitro para a produção de linfócitos T citotóxicos (CTL), o método compreendendo o contacto CTL in vitro com moléculas humanas MHC da classe I carregadas com antigénio expressas na superfície de uma célula adequada que apresenta antigénio por um período de tempo suficiente 4 para activar os ditos CTL de maneira antigénica especifica, na qual o dito antigénio é um peptideo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3. 21. 0 método de acordo com a Reivindicação 20, onde o antigénio é carregado para moléculas mhc da classe I expressas na superfície de um antigénio adequado apresentador de células entrando em contacto com uma quantidade suficiente de antigénios com uma célula apresentadora de antigénios. 22. 0 método de acordo com a Reivindicação 20, onde a célula que apresenta antigénio compreende um vector de expressão de acordo com a Reivindicação 6.

23. Linfócitos T citotóxicos (CTL) activados, produzidos pelo método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 20 a 22, que reconhecem selectivamente uma célula, que expressa um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme o citado na Reivindicação 1.

24. Uso de um peptideo associado a tumor de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 3, um ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 4 ou 5, um vector de expressão de acordo com a Reivindicação 6, uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das Reivindicações 10 a 16 na fabricação de um medicamento para eliminar células de cancro em um paciente.

25. Uso de acordo com a reivindicação 24, onde as células cancerígenas referidas são células renais cancerígenas. 1/14

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