CN101287755B

CN101287755B - 结合于人类白细胞抗原(hla)ⅰ类或ⅱ类分子的肿瘤相关肽及相关的抗癌疫苗

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Publication number: CN101287755B
Application number: CN200680038407.7A
Authority: CN
Inventors: 哈伯特·辛格; 尼尔斯·伊姆瑞希; 斯蒂芬·沃尔特; 托尼·文希恩克
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2005-09-05
Filing date: 2006-09-05
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2026-09-05
Also published as: AU2006289289A1; KR20080052647A; CA2621414A1; KR101150663B1; SI1760089T1; PT1760089E; ES2330013T3; DE602006019446D1; HRP20110240T1; DK1760089T3; ES2358802T3; EP1922334B1; NO20081690L; PL1760089T3; AU2006289289B2; UA97095C2; DK1922334T3; EP1922334A1; CA2621414C; NZ565956A

Abstract

本发明涉及免疫治疗方法、及用于免疫治疗方法的分子与细胞。特别是，本发明与癌症免疫疗法有关。本发明此外更与肿瘤相关辅助性T细胞肽表位有关，此肽表位单独的或与其它肿瘤相关肽的组合可担当疫苗组合物的活性制药成分，其刺激抗肿瘤免疫反应。特别是，本发明与两种源自人类肿瘤细胞株的HLA II类分子的新型肽序列有关，其可被使用在疫苗组合物中以引起抗肿瘤免疫反应。

Description

结合于人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类或Ⅱ类分子的肿瘤相关肽及相关的抗癌疫苗

描述

本发明是关于免疫疗法，以及用于免疫疗法的分子和细胞。特别是，本发明是有关于癌症的免疫治疗，尤其是肾脏癌症的免疫疗法。本发明还关于肿瘤相关的辅助性T细胞的肽表位，单独或与其他能激起抗癌免疫反应而作为疫苗组合物的活性制药材料。特别是，本发明是关于两种源自人类癌细胞株，I类或II类人类白细胞抗原(HLA)分子的新型肽序列，此人类癌细胞株可被使用在疫苗组合物中以引起抗癌免疫反应。

为了本发明的目的，所有被引用的资料在此作为参考文献加以整体引述。

发明背景

免疫反应的刺激取决于被宿主免疫系统视为外来者抗原的出现。从发现肿瘤相关抗原的存在上，现可提高由宿主的免疫系统去调停肿瘤成长的可能性。利用免疫系统的体液性和细胞性的各种各样的机制，现今被探究作为癌症免疫疗法。

细胞性免疫反应的专一元素是能专一地识别和摧毁肿瘤细胞。从肿瘤浸润的细胞群或从外周血液里分离出细胞毒性T细胞(CTL)，暗示这种细胞在自然免疫防御中对抗癌起重要作用(Cheever et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.1993 690：101-112)(奇弗等，纽约科学院年鉴，1993年，第六百九十册，101至112页)。特别是CD8阳性T细胞(TCD8阳性)，可识别I类主要组织相容性复合体(MHC)分子，具有通常八到十个源自细胞质蛋白质的肽残基，在这个反应中起重要作用。此人类MHC分子也被选定作为人类白细胞抗原(HLA)。

有两类的MHC分子：MHCMHC I类分子可在大多数有细胞核的细胞中发现，细胞里的肽起因于内源蛋白质和较大肽的蛋白水解。MHCMHC II类分子只在专门抗原呈递细胞(APC)中发现，细胞里的肽是由抗原呈递细胞的内吞作用而取得的外源蛋白质且随即被处理。肽与MHCMHC I类分子的复合体可被CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞所识别，肽与MHCMHC II类分子的复合体可被CD4阳性的辅助性T细胞所识别。

CD4阳性的辅助性T细胞在协同建构抗肿瘤T细胞反应的效应因子作用中起重要作用，因而对源自肿瘤相关抗原(TAA)的CD4阳性T细胞表位的确认，在触发抗肿瘤免疫反应的药品的研发中也许是非常重要的(Kobayashi，H.，R.Omiya，M.Ruiz，E.Huarte，P.Sarobe，J.J.Lasarte，M.Herraiz，B.Sangro，J.Prieto，F.Borras-Cuesta，and E.Celis.2002.Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytesfrom carcinoembryonic antigen.Clin.Cancer Res.8：3219-3225.，Gnjatic，S.，D.Atanackovic，E.Jager，M.Matsuo，A.Selvakumar，N.K.Altorki，R.G.Maki，B.Dupont，G.Ritter，Y.T.Chen，A.Knuth，and L.J.Old.2003.Survey of naturally occurring CD4+T-cell responses against NY-ESO-Iin cancer patients：Correlation with antibody responses.Proc.Natl.Acad.ScI U.S.A.100(15)：8862-7)(小林，H.、大宫R.、路易兹M.、沃尔特E.、沙鹿比P.、拉萨特J.J.、.赫拉易斯M、桑格鲁B.、普里托J.、博拉斯-科斯塔F.和赛利斯E.。2002年。从癌胚抗原确认辅助性T淋巴细胞的抗原表位。临床癌症研究，第八册，3219至3225页。格尼亚提克，S.、艾坦拿高威克D.、杰格E.、松尾M.、塞尔万库马A.、阿托其N.K.、真希R.G.、杜邦B.、利特尔G.、陈Y.T.、高德纳A.和欧得L.J.。2003年。自然发生的CD4阳性T细胞在对抗癌症患者体内的NY-ESO-1抗原反应的勘测：与抗体反应交互作用。美国国家科学院研究，第一百册，第十五号，8862至8867页)。

已知在哺乳动物的动物模型，例如小鼠，即使在缺少细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应因子细胞(即，CD8阳性T淋巴细胞)，CD4阳性T细胞足以抑制肿瘤的表现，是藉由干扰素γ(IFNγ)的分泌来抑制血管生成(Qin，Z.and T.Blankenstein.2000.CD4+T-cell-mediated tumour rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFNgamma receptor expression by nonhematopoietic cells.Immunity.12：677-686)(秦Z.和布廉奇斯坦T.。2000年。CD4阳性T细胞--介导的肿瘤排斥牵涉血管生成的抑制，这是依靠由非造血细胞的干扰素γ受体的表达。免疫性。第十二册，677至686页)。另外，已知在CD4阳性T细胞识别由HLA II类分子呈现的肿瘤相关抗原的胜肽肽，可藉由抗体(Ab)的诱发来对抗肿瘤的发展(Kennedy，R.C.，M.H.Shearer，A.M.Watts，and R.K.Bright.2003.CD4+T lymphocytes play a criticalrole in antibody production and tumour immunity against simian virus 40large tumour antigen.Cancer Res.63：1040-1045)(甘乃迪R.C.、希勒M.H.、华特A.M.和布莱特R.K.。2003年。CD4阳性T淋巴细胞在抗体产生和肿瘤免疫抗猿猴病毒四十大肿瘤抗原上起一个重要的作用。临床癌症研究，第六十三册，1040至1045页)。与肿瘤相关胜肽肽结合HLA I类分子相对比，到目前为止只有很小数量的II类肿瘤相关抗原(TAA)配体被叙述(www.cancerimmunity.org，www.syfpeithi.de)。因为HLA II类分子的组成性表达通常被限制在免疫系统里的细胞(Mach，B.，V.Steimle，E.Martinez-Soria，and W.Reith.1996.Regulation ofMHC class II genes：lessons from a disease.Annu.Rev.Immunol.14：301-331)(马克，B.、斯泰姆莱V.、马丁尼兹-索洛亚E.和丽塔W.。1996年。II类MHC分子基因的调节：由疾病而学习的功课。免疫评论年刊。第十四册，301至333页)，直接地从原发肿瘤来分离II类肽的可能性未被认为可行。因此，对标靶抗原进入抗原呈递细胞(APCs)的II类处理路径的许多策略被描述了，例如将抗原呈递细胞与令人感兴趣的抗原一起培养，使其能被吸取，被处理和被呈现(Chaux，P.，V.Vantomme，V.Stroobant，K.Thielemans，J.Corthals，R.Luiten，A.M.Eggermont，T.Boon，and B.P.van der Bruggen.1999.Identification ofMAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+)Tlymphocytes.J.Exp.Med.189：767-778)(乔克斯，P.、凡通米V.、斯特鲁班特V.、席尔曼K.、哥图斯J.、卢滕R.、艾格蒙特A.M.、布恩T.和凡得布鲁根B.P.。1999年。由HLADR分型分子对CD4阳性T淋巴细胞所呈现的MAGE-3基因表位的识别。实验医学期刊。第一百八十九册，767至778页)，或以编码为令人感兴趣的且融入不变链抗原的基因或微小基因来转染细胞，其介导抗原转位至溶酶体的II类MHC的处理和组装小室(MIIC)。

为了使肽触发(引出)一个细胞性的免疫反应，其必须结合MHC分子。这个过程依靠MHC分子的等位基因和肽的氨基酸序列的特殊多形性。MHC I类结合肽的一级氨基酸序列通常是八至十个残基长和包含两个不变残基(″锚固″)，与MHC分子的对应结合凹槽交互作用。

在没有炎症反应时，MHC II类分子的表达主要局限于免疫系统的细胞，特别是专门的抗原呈递细胞(APC)，如单核细胞、单核细胞衍生细胞、巨噬细胞、树突细胞。

被肿瘤专一的T淋巴细胞所识别的抗原，即他们的抗原表位，可能为源自所有蛋白质组的分子，譬如酶、受体、转录因子等。此外，肿瘤相关抗原，例如，也可只在肿瘤细胞呈现，以突变基因的产物为例。另一个肿瘤相关抗原重要类型是组织专一的结构，譬如CT(″肿瘤睾丸″)抗原，其表达在各种不同的肿瘤和睾丸的健康组织。

各种的肿瘤相关抗原已被识别了。此外，目前科学家正在费许多研究努力去识别额外的肿瘤相关抗原。一些肿瘤相关抗原群，且作为肿瘤特别抗原的技术品里，是组织专一的。包含但不限于，对黑色素瘤的酪氨酸酶、对前列腺癌的前列腺特别抗原(PSA)和前列腺特别膜抗原(PSMA)及染色体杂交(转移)譬如在淋巴瘤的bcr/abl融合基因。然而许多肿瘤相关抗原的识别发生在多种肿瘤类型，和一些譬如致癌蛋白质且或肿瘤抑制基因(肿瘤抑制基因可参考如由莱亨WM、华尔勒MM、日巴B为肾脏癌症所作的总览。肾脏癌症的基因依据。泌尿学期刊。2003年，十二月，第一百七十册(第一部分之六)，2163至2172页(Linehan WM，Walther MM，Zbar B.The genetic basis of cancer of thekidney.J Urol.2003 Dec；170(6 Pt 1)：2163-72))，其实际上引起的转化事件，发生在几乎所有肿瘤类型。例如，控制细胞成长和分化的正常细胞蛋白质，譬如抑癌蛋白p53(一个肿瘤抑制基因的例子)、ras、c-met、myc、pRB、VHL和HER-2/neu蛋白，由于表达的调节增加可积累突变，因此使他们成为致癌性(McCartey et al.Cancer Research 1998 15：582601-5；Disis et al.Ciba Found.Symp.1994 187：198-211)(麦可卡提等。癌症研究期刊，公元一九九八年，第十五册，第五十八号，2601至2605五页；戴席思等。西巴基金会研讨会期刊。1994年，第一百八十七册，198至211页)。

黏蛋白1(MUC1)是高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，丰富地过度表达在许多人类腺癌像乳癌和卵巢癌的细胞表面。在恶性肿瘤的异常去糖基化是普遍的，且肿瘤细胞的不遮蔽表位或许不在正常细胞呈现。而且，MUC1的表达已被展示在多发性骨髓瘤和一些B细胞非霍奇金淋巴瘤(Gendler S，Taylor-Papadimitriou J，Duhig T，Rothbard J，andBurchell J.A highly immunogenic region of a human polymorphicepithelial mucin expressed by carcinomas is made up of tandem repeats.J.Biol.Chem.263：12820-12823(1988)；Siddiqui 1988；Girling A，BartkovaJ，Burchell J，Gendler S，Gillett C，and Taylor-Papadimitriou J.A coreprotein epitope of the polymorphic epithelial mucin detected by themonoclonal antibody SM-3is selectively exposed in a range of primarycarcinomas.Int.J.Cancer 43：1072-1076(1989)；Brossart 1999；Duperray1989；Mark 1989；Delsol 1988；Apostolopoulos V and McKenzie IF.Cellular mucins：targets for immunotherapy.Crit Rev.Immunol.14：293-309(1994)；Finn OJ，Jerome KR，Henderson RA，Pecher G，Domenech N，Magarian-Blander J，and Barratt-Boyes SM.MUC-Iepithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines.Immunol.Rev.145：61-89(1995))(甘德勒S、泰勒-帕帕底米德里欧J、杜伊T、罗斯巴德J和白歇尔J。在恶性肿瘤表达的人类多形性上皮黏蛋白的一个高度致免疫区域，被串联重复组成。生物化学期刊。1988年。第二百六十三册，12820至12823页；西迪奇公元一九八八年；格林A、巴特科夫J、白歇尔J、甘德勒S、吉利特C和泰勒-帕帕底米德里欧J。被单株抗体SM-3检测到的多形性上皮黏蛋白的核心蛋白质表位，选择性地被暴露在原发癌的范围内。国际癌症期刊，第四十三册，1072至1076页(1989年)；贝罗萨特1999年；杜班来1989年；马克1989 年；戴尔索1988年；阿波斯托洛普洛斯V和麦肯锡IF。细胞黏蛋白：为免疫疗法的标靶。关键的免疫学总览，第十四册，293至309页(1994年)；芬OJ、杰若米KR、韩德森RA、皮切尔G、多明尼克N、马格利恩-布蓝德J和巴瑞特-博依斯SM。MUC1上皮组织肿瘤黏蛋白为基础的免疫和癌症疫苗。免疫学总览，第一百四十五册，61至89页(1995年))。几个最近的报告(Apostolopoulos V and McKenzie IF.Cellularmucins：targets for immunotherapy.Crit Rev.Immunol.14：293-309(1994)；Finn OJ，Jerome KR，Henderson RA，Pecher G，Domenech N，Magarian-Blander J，and Barratt-Boyes SM.MUC-I epithelial tumormucin-based immunity and cancer vaccines.Immunol.Rev.145：61-89(1995)；Barnd 1989；Takahashi 1994；Noto 1997)(阿波斯托洛普洛斯V和麦肯锡IF。细胞黏蛋白：为免疫疗法的标靶。关键的免疫学总览，第十四册，293至309页(1994年)；芬OJ、杰若米KR、韩德森RA、皮切尔G、多明尼克N、马格利恩-布蓝德J和巴瑞特-博依斯SM。MUC1上皮组织肿瘤黏蛋白为基础的免疫和癌症疫苗。免疫学总览，第一百四十五册，61至89页(1995年)；巴尔德1989年；高桥1994年；能登1997年)显示出，源自卵巢、乳房、胰脏和多发性骨髓瘤肿瘤的MHC-不受限制的细胞毒性T细胞可辨认MUC1的表位，其蛋白质核心位于串联重复。源自MUC1的两个HLAA2限制性的T细胞抗原表位已被识别了(贝罗萨特1999年，EP 1484397)。其中一个肽源自MUC1蛋白质的串联重复区域。第二个肽位于MUC1信号序列内。在晚期乳房癌或卵巢癌的患者身上以肽脉冲的树突细胞做疫苗接种，使用那些肽去诱导细胞体内的细胞毒性T淋巴反应已经成功(Brossart2000)(Wierecky 2005)(贝罗萨特2000年)(微尔斯基2005年)。谈到肾脏细胞癌，在常规肿瘤上MUC1的表达是常见的，有报告指出其表达跟肿瘤等级和分期有关(Fujita 1999；Kraus 2002；Leroy 2002；Bamias2003；Cao 2000)(藤田1999年；克劳思2002年；里罗以2002年；巴米厄思2003年；曹2000年)。对MUC1，蛋白质的过度表达与信息核醣核酸的过度表达无关联。

脂肪分化相关蛋白(Adipophilin)是一个特别分化且包含脂肪滴细胞和脂质聚集细胞有关疾病的标志物(Heid 1998)(海德1998年)。脂肪分化相关蛋白在大范围的培养细胞株产生，包括纤维母细胞、内皮细胞和上皮细胞。然而在组织里，脂肪分化相关蛋白的表达被局限于某些细胞类型，譬如泌乳乳腺上皮细胞、肾上腺皮质细胞、雄性生殖系统的支持细胞和睾丸间质细胞及酒精性肝硬化的皮脂腺病或肝细胞脂肪变性(海德1998年)。有报告指出脂肪分化相关蛋白在结直肠癌(Saha2001)(沙哈2001年)、肝细胞癌(Kurokawa 2004)(黑川2004年)和在肾脏细胞癌(Young 2001)(杨2001年)会过度表达。

c-Met编码一种有着酪氨酸激酶活性的异质二聚合跨膜受体，是由与一个β亚单位体形成双硫键的α链组成(Bottaro 1991；Rubin 1993)(伯特洛1991年；鲁宾1993年)。两个亚单位体被表达在表面，重型β亚单位体负责键结配体和肝细胞生长因子(HGF)，α亚单位体包含一个介导不同信号传递途径的活化作用的细胞内区段。c-Met信号与器官再生有关，显示在肝脏和肾脏、胚胎形成、造血作用、肌肉发育和正常活化的B细胞和单核细胞在迁移和吸附作用的调节(Zarnegar 1995；Naldini 1991；Montesano 1998；Schmidt 1995；Uehara 1995；Bladt 1995；Takayama 1996；Mizuno 1993；van，V 1997；Beilmann 2000)(萨尼格1995年；那迪尼1991年；蒙特沙诺1998年；史密德1995年；上原1995年；贝尔德1995年；高山1996年；美津厚1993年；凡，V 1997年；贝尔曼2000年)。此外，许多研究显示c-Met在恶性转化和恶性肿瘤的侵袭上会过度表达。

c-Met介导肝细胞生长因子/离散因子的多功能和潜在地致癌活性，包括促进细胞成长、活力、生存力、胞外基质溶解和血管新生(Bottaro 1991；Rubin 1993；Zarnegar 1995)(伯特洛1991年；鲁宾1993年；萨尼格1995年)。结合肝细胞生长因子至受体诱导c-Met的自磷酸化作用和活化下游信号事件，包括ras、磷脂酰肌醇3激酶、磷脂酶Cγ和丝裂素活化蛋白激酶相关的路迳(Naldini 1991；Montesano 1998；Furge 2000；Ponzetto 1993；Dong 2001；Furge 2001)(那迪尼1991年；蒙特沙诺1998年；福尔居2000年；旁类托1993年；董2001年；福尔居2001年)。c-Met基因主要地被表达在上皮细胞里，且被过度表达在几种恶性组织和细胞株(Di Renzo 1995；Ferracini 1995；Tuck 1996；Koochekpour 1997；Li 2001；Fischer 1998；Maulik 2002；Qian 2002；Ramirez 2000)(迪瑞佐1995年；法拉其尼1995年；塔克1996年；枯切科波尔1997年；李2001年；费雪1998年；茂里克2002年；钱2002年；拉米雷兹2000年)。从持续增加数量的报告显示，非上皮细胞譬如造血、神经和骨骼细胞反应至肝细胞生长因子和血液学的恶性肿瘤像多发性骨髓瘤、霍奇金病、白血病和淋巴瘤皆表达c-Met蛋白质(Gherardi 1991；Teofili 2001；Borset 1999；Jucker 1994；Pons 1998)(葛若帝1991年；提欧非力2001年；博尔塞1999年；贾克1994年；旁氏1998年)。从c-Met活化突变、c-Met的放大/过度表达和肝细胞生长因子/c-Met的自分泌环路的获得，引起致癌基因c-Met活化而解除调节侵袭性成长表达型的的控制，而给予恶性细胞侵袭与转变的性质。值得注意的是，在细胞生长因子过度表达的基因转殖小鼠上基础性活化c-Met可促进广大的肿瘤发生(Wang 2001；Takayama 1997)(王2001年；高山1997年)。

G蛋白质信号调节子5(RGS5)被认为是异质三聚体G蛋白质信号路迳的负向调节子，即使它在体内的功能依然是难了解的。G蛋白质信号调节子蛋白包括一个有着统一催化功能但多变组织分布的分子族群。他们激起内在活化的Gα亚单位体的鸟苷三磷酸酶(GTPase)活性，因此加速G蛋白质不活化作用。因而，G蛋白质信号调节子分子抑制信号令下游G蛋白质偶合的受体(De 2000)(得2000年)。最近显示在肿瘤新生血管化期间，G蛋白质信号调节子5在周细胞的诱导与活性血管重建相符。在胰脏小岛细胞致癌作用的小鼠模型，以及在高度血管生成的星形细胞瘤，显示G蛋白质信号调节子5在血管生成的开关期间伴随活性血管重建时期会在周细胞过度表达。与胰岛相比较，过度表达只局限于肿瘤的血管构造。但是在创伤愈合和排卵期间，G蛋白质信号调节子5的表达是上调的(Berger 2005)(博格2005年)。

G蛋白质信号调节子5在肾脏细胞癌表达被增加(雷2000年)。从其他研究得知，由反转录PCR反应显示了G蛋白质信号调节子5在所有被检查的肾细胞癌里有强烈的表达，且其在正常肾脏表达是非常微弱或检测不到的(在实时性的PCR反应是6.6比1)。在肾细胞癌，肿瘤内皮细胞是G蛋白质信号调节子5的主要部位(Furuya 2004)(古谷2004年)。此外，报告显示，G蛋白质信号调节子5在肝细胞癌为一个窦状内皮细胞的细胞标志(Chen 2004)(陈2004年)。

载脂蛋白L1(APOL1)是结合载脂蛋白A-I的分泌的高密度脂蛋白。载脂蛋白A-I是相对地多量的血浆蛋白质且是高密度脂蛋白的主要载脂蛋白。它参与在血浆中多数胆固醇酯的形成，并且促进细胞中胆固醇的外排。载脂蛋白L1也许在贯穿整个身体的脂质交换和运输上起一定的作用，以及从外周细胞到肝脏的反向胆固醇运输。血浆蛋白是一个有着明显约40千道尔顿分子量的单链多肽(Duchateau 1997；Duchateau 2001)(杜查途1997年；杜查途2001年)。载脂蛋白L1互补去氧核醣核酸自一个活化的内皮细胞的互补去氧核醣核酸基因库被分离，显示是被肿瘤坏死因子-α所上调，而肿瘤坏死因子-α是一有效的促炎细胞因子。(Monajemi 2002)(莫纳贾米2002年)。

KIAA0367基因从佐藤互补去氧核醣核酸计划被识别，目的在于识别未知且长的编码为推定蛋白质的人类转录本(Ohara 1997)(大原1997年)。虽然KIAA0367基因推定的820个氨基酸长的蛋白质产物的功能是未知的，它包含一个位于C端的CRAL-TRIO脂质键结区段剖面，可结合小疏水分子并且是存在于几个核苷酸交换因子和在于BCL2/腺病毒E1B 19-千道尔顿分子量蛋白质交互作用的蛋白质2(BNIP-2)。BNIP-2涉及在不同细胞功能的控制包括细胞形态学、迁移、内嗜作用和细胞周期进展(Zhou 2005)(周2005年)。KIAA0367位于染色体区域9q21。在许多肿瘤里，这个地区被描述为纯合性缺失的一个共同的标靶(Gursky 2001；Weber 2001)(古尔斯基2001年；韦柏2001年)或异合子性的丧失(Louhelainen 2000；Tripathi 2003)(隆合雷南2000年；特里帕西2003年)。

可溶解鸟苷酸环化酶(sGC)，是异质二聚体的蛋白质包括一个α和一个β亚单位体(1个血红素群组)，催化鸟苷三磷酸转化成第二信使环鸟苷酸和作为一氧化氮和硝基血管扩张剂药物的主要受体(Zabel1998)(萨贝尔1998年)。在人的神经胶质瘤里，鸟苷酸环化酶a3和 b3基因会过度表达。转染反义的鸟苷酸环化酶1A3基因或鸟苷酸环化酶1B3基因减少了裸鼠里的血管再生和肿瘤生长。这也许归结于血管内皮生长因子被环鸟苷酸所诱导的事实(Saino 2004)(圣诺2004年)。鸟苷酸环化酶1A3促进小鼠乳房肿瘤细胞株的肿瘤细胞迁移(Jadeski2003)(杰德斯基2003年)。

周期蛋白D1属于高度恒定的周期蛋白族，对周期蛋白D亚族更具专一性(Xiong 1991；Lew 1991)(熊1991年；刘1991年)。周期蛋白作用为CDKs(周期蛋白依赖激酶)的调节子。不同的周期蛋白展示不同的表达和降解样式，有助于每次有丝分裂事件的时态协同(Deshpande2005)(德许庞帝2005年)。周期蛋白D1与细胞周期蛋白依赖性激酶4或周期蛋白依赖性激酶6形成复合体且作为其调节亚单位体，其活性对细胞周期G1/S转变是必须的。细胞周期调控基因1与细胞周期蛋白依赖性激酶4或周期蛋白依赖性激酶6形成一种为丝氨酸/苏氨酸激酶全酶的复合体，给予底物对此复合体的专一性(Bates 1994)(贝兹1994年)。此蛋白质显示与肿瘤抑制蛋白质Rb交互作用(Loden 2002)(罗丹2002年)且这个基因的表达是由肿瘤抑制蛋白质Rb正向地调节(Halaban 1999)(哈拉班1999年)。这个基因的突变、放大作用和过度表达而改变细胞周期进展，在各种各样的肿瘤中频繁地被观测到且也许引起肿瘤的发生的原因(Hedberg 1999；Vasef 1999；Troussard 2000)(海德博格1999年；凡赛夫1999年；特劳萨尔德2000年)。

基质金属蛋白酶(MMP)族的蛋白质涉及在正常生理过程中细胞外基质的破坏，譬如胚胎发育、生殖和组织重建和在如关节炎和瘤转移的致病过程，(Mott 2004)(摩特2004年)。基质金属蛋白酶7(MMP7)被分泌为不具活性分子量为29.6千道尔顿的原蛋白，由细胞外蛋白质酶切割而被活化。此活化酶的分子量是19.1千道尔顿且每个亚单位体可结合两个锌离子和两个钙离子(Miyazaki 1990；Browner 1995)(宫崎1990年；布朗尼尔1995年)。基质金属蛋白酶7降解明胶、纤维连接蛋白和酪蛋白(Miyazaki 1990；Quantin 1989)(宫崎1990年；瓜尔定1989年)且与多数基质金属蛋白酶家族成员不同，因为它缺乏一个恒定的C端蛋白质区段Gaire 1994)(盖尔1994年)。基质金属蛋白酶7经常被发现在恶性组织里会过度表达(Lin 2004；Bramhall 1997；Denys2004)(林2004年；布蓝霍尔1997年；丹尼斯2004年)，且显示其可促进细胞体内肿瘤细胞的侵袭(Wang 2005)(王2005年)。

在多类型癌症里，这些蛋白质可作为肿瘤专一免疫反应的标靶。

B型肝炎病毒核心抗原肽HBV-001不是源自内源的人类肿瘤相关抗原，而是源自B型肝炎病毒核心抗原。首先，允许定量比较由肿瘤相关肽诱导的T细胞反应大小，因此允许在关于刺激抗肿瘤反应能力上下重要结论。第二，在患者缺乏任何T细胞反应病例下，可作为重要阳性对照。第三，并且允许在患者的免疫活性状态予以归纳。

B型肝炎病毒(HBV)感染是肝脏疾病的主要起因，影响约全世界三亿五千万人(Rehermann 2005)(雷赫曼2005年)。基于简易的水平和垂直的传输且也许导致肝硬化和肝细胞癌的慢性疾病的潜力，B型肝炎病毒在全世界许多国家代表对公共卫生系统的一种主要冲击。B型肝炎病毒基因体(Previsani 2002)(普雷文森特尼2002年)包括部份地双股环状去氧核醣核酸。在B型肝炎病毒的病毒粒子，与核心蛋白质和其他蛋白质被包装在一起形成核衣壳，其核衣壳由含脂质和表面蛋白质族(并且叫做包膜蛋白质)的一个外包膜所包围。与核心蛋白质和表面蛋白质连结的抗原决定簇，分别作为B型肝炎核心抗原和B型肝炎病毒表面抗原。这些与抗原相关的血清学，即在患者血液中发现的抗体反应，是在临床上作为为B型肝炎病毒感染诊断最有用的抗原抗体系统。对先前没被B型肝炎病毒感染的所有个人，B型肝炎核心蛋白质代表一种新奇的外来抗原。由于此抗原为知名的致免疫肽(Bertoletti1993；Livingston 1997)(贝尔托拉提1993年；利文斯通1997年)，在IMA内源自B型肝炎核心抗原的十氨基酸肽被选择作为阳性对照抗原。B型肝炎核心蛋白肽专一的细胞毒性T淋巴细胞的诱导将被作为患者免疫活性和成功接种的标记。

在癌症患者上的免疫疗法针对专一地免疫系统细胞的活化，特别是所谓的细胞毒性T细胞(CTL，亦称为″杀伤细胞″，亦称为CD8阳性T细胞)，对抗肿瘤细胞但不是对抗健康组织。肿瘤细胞与健康细胞的相异处为肿瘤细胞能表达肿瘤相关蛋白质。HLA分子在细胞表面对外部呈现细胞的内容，如此使一个细胞毒性T细胞可区分健康和肿瘤细胞。这是由裂解细胞里的所有蛋白质至短肽，其短肽附着在HLA分子，然后在细胞表面呈现而被了解(Rammensee 1993)(罗曼席1993年)。在肿瘤细胞所呈现的肽，但不呈现或非常少的呈现在身体的健康细胞，叫做肿瘤相关肽(TUMAPs)。

第一次使用肿瘤相关肽的临床试验，由布恩和其同事在90年代中期就开始，主要作为黑色素瘤的检测。临床反应的最佳试验范围从10到30％。在任何使用以肽为基础的疫苗单一疗法的临床试验，严重的副作用或严重的自体免疫未曾被报告。以黑色素瘤相关肽治疗的一些患者，轻微形式的白癜风已被报告。

但是诱导一种细胞毒性T细胞通常是不足以消灭所有肿瘤细胞。肿瘤是非常突变的而能迅速地反应细胞毒性T细胞的攻击，藉由改变他们的蛋白质样式而逃避细胞毒性T细胞的识别。为了还击肿瘤躲避机制，各种专一的肽被用于疫苗接种。这样宽广的同步攻击可藉由几种细胞毒性T细胞株来同时展开对抗肿瘤。这也许可减少肿瘤躲避免疫反应的机会。在一项临床研究中治疗晚期黑色素瘤患者上，这个假说最近被证实了。除了少数例子之外，患者有至少三个显著的T细胞反应显示客观临床反应或病情稳定(Banchereau 2001)(班雪侯2001年)并且可增加存活机会(与班雪侯J.的个人通信)，而大多数少于三个T细胞反应的病人被诊断为进展性疾病。

直到现在，许多标靶抗原至第二或第一类处理路迳的策略被描述了。为了被摄入和被处理，抗原呈递细胞(APCs)可与令人感兴趣的抗原一起培养(Chaux，P.，Vantomme，V.，Stroobant，V.，Thielemans，K.，Corthals，J.，Luiten，R.，Eggermont，A.M.，Boon，T.&van der，B.P.(1999)J.Exp.Med.189，767-778.Dengjel J，Schoor O，Fischer R，ReichM，Kraus M，Muller M，Kreymborg K，Altenberend F，Brandenburg J，Kalbacher H，Brock R，Driessen C，Rammensee HG，Stevanovic S.Autophagy promotes MHC class II presentation of peptides fromintracellular source proteins.Proc Natl Acad Sci U S A.2005May31；102(22)：7922-7.)(乔克斯，P.、凡通米V.、斯特鲁班特V.、席尔曼 K.、哥图斯J.、卢滕R.、艾格蒙特A.M.、布恩T.和凡得布鲁根B.P.(1999年)实验医学期刊，第一百八十九册，767至778页。丹杰尔J、叔尔O、费雪R、雷奇M、克劳斯M、目勒M、克雷姆博格K、亚特贝雷德F、白兰德博格J、卡尔巴策H、布鲁克R、德瑞森C、罗曼席HG、史提芬奴域S。自体吞噬促进源自细胞内源蛋白质的MHC II类肽的呈现。美国国家科学院研究，2005年五月三十一日，第一百零二册，第二十二号，7922至7927页。)。其他策略使用包含溶酶体标靶序列的融合蛋白质。在抗原呈递细胞里表达，这样的融合蛋白质指导抗原进入II类处理隔间(Marks，M.S.，Roche，P.A.，van Donselaar，E.，Woodruff，L.，Peters，P.J.& Bonifacino，J.S.(1995)J.Cell Biol.131，351-369，Rodriguez，F.，Harkins，S.，Redwine，J.M.，de Pereda，J.M.& Whitton，J.L.(2001)J.Virol.75，10421-10430)(马克斯，M.S.、罗奇，P.A.、凡唐塞勒，E.、伍卓夫，L.、皮特斯，P.J.和博尼法奇诺，J.S.。(1995年)细胞生物学期刊。第一百三十一册，351至369页。罗德里格兹，F.、赫尔肯斯，S.、雷德丸，J.M.、德布雷特J.M.和惠顿，J.L.。(2001年)病毒学期刊。第七十五册，10421至10430页)。

为了使蛋白质被细胞毒性T淋巴细胞识别为肿瘤专一抗原和可被使用在治疗上面，必须履行特殊前提。抗原应该主要在肿瘤细胞里表达，而不是在正常健康组织里表达或在肿瘤细胞里表达相当少量。更令人满意的是，个别的抗原不仅只在某一类型肿瘤表达而且是高厚度的(例如每细胞的拷贝数)。根本的是在抗原的氨基酸序列的表位的存在，因为这样源自肿瘤相关抗原的肽(″致免疫的肽″)应该引导细胞体外或细胞体内T细胞反应。

大约30％患者患有转移性的肿瘤疾病和另外25％患者有着局部地晚期肿瘤。40％个体接受外科切除术终将产生癌症转移。在个体中有着转移性的疾病者，大约75％显示肺部转移，36％有淋巴结且或软组织转移，20％有骨头转移，并且18％有肝脏转移。5年的存活率依罗布森分期组而异。总而言之，肾细胞癌在几乎80％患者中是致命的(Senn HJ，Drings P，Glaus A，Jungi WF，Pralle HB，Sauer R，and SchlagPM.Checkliste Onkologie，5th edition.Georg Thieme Verlag， Stuttgart/New York(2001)，Vokes EE，and Golomb HM.OncologicTherapies，2nd edition.Springer-Verlag，Berlin/Heidelberg(2003))(尚恩HJ、得林斯P、葛劳斯A、锺吉WF、普瑞尔HB、萨澳R和西勒格PM.肿瘤名册，第5编辑，乔治信牡弗雷格，斯图加特/纽约(2001年)。福克斯EE和哥伦布HM.。肿瘤疗法，第2编辑，施普林格-弗雷格，柏林/海德堡(2003年))。

肾脏细胞癌的分类是根据国际抗癌联盟的TNM分期系统所完成(Guinan P.TNM Staging of Renal Cell carcinoma.Presented at′Diagnosisand prognosis of Renal Cell Carcinoma：1997 Workshop′，Rochester，Minnesota，March21-22，Communication of the UICC-Union InternationaleContre Ie Cancer，and AJCC-American Joint Committee on Cancer，published by ASC-American Society Cancer(1997)，Communication of theUICC)(桂南P.TNM肾脏细胞癌分期。在肾脏细胞癌诊断和预测：1997年研讨会提出，罗切斯特，明尼苏达州，三月21至22日，国际抗癌协会通讯和美国癌症联合委员会，由美国防癌协会出版(1997年)，国际抗癌协会通讯)参见下列表A和B。

表A：肾脏细胞癌的国际抗癌联盟的TNM分期系统

T1小或等于七公分，只限于肾脏细胞 N1一个区域淋巴结

T2大于七公分，只限于肾脏细胞 N2多于一个区域淋巴结

T3侵入大静脉，肾上腺或肾周围的侵袭 M0无远处转移

T4侵入肾筋膜之外 M1远处转移

美国癌症联合委员会的分期国际抗癌联盟的TNM分期

第一期 T1 N0 M0

第二期 T2 N0 M0

第三期 T1 N1 M0

T2 N1 M0

T3 N0，N1 M0

第四期 T4 N0，N1 M0

任何T N2 M0

任何T 任何N M1

表B：肾脏细胞癌的罗布森分期法与五年存活率

罗布森分期组五年存活率

第一/二期 75％至86％

第三期 41％至64％

第四期(T4) 15％至18％

第四期(M1) 0％至3％

*泌尿科疾病美国基金会

肾脏细胞癌的标准治疗是根本肾切除术(在所有分期)。放射治疗也许可减少癌细胞的扩散，但肾脏细胞癌对放射线经常是有抵抗性的。荷尔蒙疗法也许在某些情况下可减少肿瘤的成长(少于10％％)。在这种疾病，迄今化疗未展现任何重大成效。长春碱、5-氟尿嘧啶(5-FU)和脱氧氟尿苷(FUDR)是被研究最多的化疗药物，但只有5-氟尿嘧啶和它的代谢产物脱氧氟尿苷显示了10至12％活性效率(Vokes EE，andGolomb HM.Oncologic Therapies，2nd edition.Springer-Verlag，Berlin/Heidelberg(2003))(福克斯EE和哥伦布HM.。肿瘤疗法，第2编辑。施普林格-弗雷格，柏林/海德堡(2003年))。吉西他滨和5-氟尿嘧啶的组合导致17％的反应效率。

免疫学治疗譬如干扰素α(IFNα)或白细胞介素-2(IL-2)近年来由在美国和欧洲的管理当局评估了其对晚期肾脏细胞癌的治疗。最新地高剂量白细胞介素-2治疗仍然是唯一被粮食与药物管理局所批准的免疫学方案。干扰素α单一疗法初时曾被报告有25至30％的反应速度，但许多额外的试验建议了仅仅大约10％的真正反应效率(Vokes EE，andGolomb HM.Oncologic Therapies，2nd edition.Springer-Verlag，Berlin/Heidelberg(2003))(福克斯EE和哥伦布HM.。肿瘤疗法，第2编辑。施普林格-弗雷格，柏林/海德堡(2003年))。与干扰素α比较，白细胞介素-2似乎有相似的整体反应效率，大约5％患者可达到耐久完全的缓解(Rosenberg 1987)(罗森博格1987年)。最近对超过6,000名晚期肾脏细胞癌患者的综合分析得出了结论，以细胞因子疗法例如干扰素α，高剂量白细胞介素-2团注射或白细胞介素-2吸入平均只能达到12.9％临床反应效率。同样分析显示了安慰剂有4.3％反应和在非免疫疗法对照组的2.5％反应(Cochrane Database Syst Rev.2000；(3)：CD001425.Immunotherapy for advanced renal cell cancer.Coppin C，Porzsolt F，Awa A，Kumpf J，Coldman A，Wilt T)(柯克伦资料库系统总览，2000年，(3)：CD001425。对晚期肾脏细胞癌的免疫疗法。科宾C、波兹所特F、阿娃A、库姆夫J、克尔德曼A、威尔特T)。

虽然新疗法在许多肿瘤实体显示了临床效力且近年来已被证实，但在最近十年之内肾脏细胞癌的存活率并未显著改变。当前可获得的系统治疗选择方案，化疗和免疫疗法，显示了相当贫瘠的效力结果且更要的是被显著的系统毒性所限制。结果，对肾脏细胞癌新的治疗选择方案有着实质地不能被满足的医疗需求。

在抗肿瘤免疫方面，辅助性T细胞在统协细胞毒性T细胞的效应因子功能上起一个重要作用。触发TH1型辅助性T细胞反应的辅助性T细胞表位，支援CD8阳性杀伤T细胞的效应因子功能，包括细胞毒素的作用引导抗肿瘤细胞来展现肿瘤相关肽或MHC在其细胞表面。藉此肿瘤相关辅助性T细胞肽表位，单独或与其他肿瘤相关肽的组合，可担当疫苗组合物的活性制药成分而刺激抗肿瘤免疫反应。

在肿瘤疫苗发展的主要工作是新奇的肿瘤相关抗原和源于其中的致免疫的辅助性T细胞表位的鉴定和描述特性，其可被CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞所识别，特别是TH1的CD4阳性T细胞。因此本发明的目标为，对这样有能力结合人类MHC(MHC)I类(HLA I类)或II类分子(HLA II类)的肽提供新奇的氨基酸序列。本发明的进一步目标为，提供至少一部分是根据前述的新奇肽的有效抗癌疫苗。

根据本发明，第一目标由提供肿瘤相关肽而解决，被挑选的肽包括至少一个根据任何附上序列目录的SEQ ID No.1(SEQ ID No.1)或SEQ ID No.2(SEQ ID No.2)的序列，由其中肽有能力结合MHCII类 (HLA II类)的分子，而其他肽有能力结合MHC)I类(HLA I类)的分子，提供其肽不是完整的人类肿瘤相关多肽。

在本发明，发明者显示可能直接地从哺乳动物肿瘤，人类肿瘤为优先地，最好像是肾脏细胞癌，来分离和描述肽结合HLA I类或II类分子的特性。

本发明提供根源于抗原相关肿瘤发生的肽，且有能力充分地结合HLA II类分子而触发人类白细胞的免疫反应，特别是淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞，尤其是CD4阳性T淋巴细胞，尤其是介导TH1类型免疫反应的CD4阳性T淋巴细胞。

本发明并且提供根源于抗原相关肿瘤发生的肽，且有能力充分地结合HLA I类分子而触发人类白细胞的免疫反应，特别是淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞，尤其是CD8阳性细胞毒素T淋巴细胞。

根源于肿瘤相关抗原的肽，特别是源于有功能的肿瘤相关抗原，如蛋白质水解、血管新生、细胞生长、细胞周期调节、细胞分裂、转录的调节、翻译的调节、组织入侵包括如源自基质金属蛋白酶7(MMP7；SEQ ID No.1)的肿瘤相关肽和脂蛋白原L1(APOL1；SEQ IDNo.4)。

在本发明，发明者提供确凿的证据，即肿瘤相关肽充分混杂地结合HLA II二类分子，特别是那些由人类基因体的人类白细胞组织抗原DR分型基因座编码的HLA II类等位基因，能引出由人类CD4阳性T细胞介导的免疫反应。CD4阳性T细胞自人类外周血液被分离出，显示申请专利范围的肽是适合的在触发人类免疫系统的T细胞反应来对抗肿瘤细胞肽组选择的肽。依照以下源自基质金属蛋白酶7(SEQ IDNo.1)肽的例子，发现这混杂的人类白细胞组织抗原DR分型结合的肿瘤相关肽可被CD4阳性T细胞所识别。

同样地，肿瘤相关肽充分地结合HLA I类分子，能引出由人类CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞介导的免疫反应，并且显示申请专利范围的肽是适合的在触发人类免疫系统的反应来对抗肿瘤细胞肽组选择的肽。

因为肽可被化学地合成和可被使用作为制药准备的活性制药成分，所以本发明所提供的肽可被用在免疫疗法，优先地用在癌症免疫疗法。

为了识别源于肿瘤相关抗原的HLA I类或II类分子配体而作为以肽为基础的免疫疗法的发展，发明者试图直接地从坚硬肿瘤来分离肽，特别是从肾脏细胞癌(RCC)来分离(参见下面例子)。

重心放在肾脏细胞癌的原因是为了显示概念的技术证据如下：每年全世界大约150,000个人新近被诊断肾脏细胞癌，此疾病伴随着高死亡率，导致每年大约78,000人死亡(Pavlovich，CP.and L.S.Schmidt.2004.Searching for the hereditary causes of renal-cell carcinoma.Nat.Rev.Cancer 4：381-393)(普拉维奇C.P.和L.S.舒密。2004年。寻找肾脏细胞癌的遗传性起因。国际癌症总览，第四册，381至393页)。如果转移被诊断出，一年的存活率减少到大约60％(Jemal，A.，R.C.Tiwari，T.Murray，A.Ghafoor，A.Samuels，E.Ward，EJ.Feuer，and MJ.Thun.2004.Cancer statistics，2004.CA Cancer J.Clin.54：8-29)(杰摩，A.、泰瓦里R.C.、墨瑞T.、加福尔A.、萨姆尔A.、华尔德E.、福威尔E.J.和图恩M.J.。2004年。临床医生癌症期刊。第五十四册，8至29页)，由此特徵强调高度未能满足的医疗需求。由于这样的事实，肾脏细胞癌似乎是一个产生免疫的肿瘤(Oliver RTD，Mehta A，BarnettMJ.A phase 2 study of surveillance in patients with metastatic renal cellcarcinoma and assessment of response of such patients to therapy onprogression.MoI Biother.1988；1：14-20.Gleave M，Elhilali M，Frodet Y，et al.Interferon gamma-Ib compared with placebo in metastatic renal cellcarcinoma.N Engl J Med.1998；338：1265)(奥丽维尔RTD、梅塔A、巴尔尼特MJ。对肾脏细胞癌转移病人第二阶段研究的监测和评估这种患者对疗法的进展。分子生物疗法。1988年，第一册，14至20页。格利芙M、爱尔喜拉利M、福罗德特Y等。在转移的肾脏细胞癌里干扰素γ1b和安慰剂相比。新英格兰医学期刊。1998年，第三百三十八册，1265页)，由肿瘤反应和肿瘤浸润的细胞毒性T淋巴细胞的存在所显示(Finke，J.H.，P.Rayman，J.Alexander，M.Edinger，R.R.Tubbs，R.Connelly，E.Pontes，and R.Bukowski.1990.Characterization of the cytolytic activity of CD4+and CD8+tumor-infiltrating lymphocytes inhuman renal cell carcinoma.Cancer Res.50：2363-2370)(芬克，J.H.、雷曼P.、亚利山卓J.、艾丁戈尔M.、塔布斯R.R.、康纳利R.、旁特氏E.和布考斯基R.。1990年。在人类肾脏细胞癌CD4阳性和CD8阳性肿瘤浸润的淋巴细胞的溶细胞活性的特性描述。癌症研究。第五十册，2363至2370页)，临床试验已起始开发以肽为基础的抗肿瘤免疫接种(Wierecky J，Mueller M，Brossart P.Dendritic cell-based cancerimmunotherapy targeting MUC-I.Cancer Immunol Immunother.2005Apr 28)(维尔斯基J、谬勒M、普罗萨特P。树突细胞为基础的标靶黏蛋白1的癌症免疫疗法。癌症免疫学的免疫疗法。2005年4月28日)。但是，由于缺乏源自肿瘤相关抗原的辅助性T细胞表位，分子定义的疫苗通常包括只作为I类配体功能的肽。

本发明的第二个目标由提供制药制备来解决问题，最好以疫苗的形式，其对抗癌细胞是有效的，特别是细胞实体肿瘤，包括有效量的根据发明的肽，或包括编码此种肽的核酸。疫苗进一步能包含额外的的肽且或赋形剂而使其更加有效，下面将进一步解释。

肽或编码肽的核酸并且可构成肿瘤或癌症疫苗。它也许直接地对患者施用，进入受侵袭的器官或系统，或以间接体内方式应用在从患者来的细胞或人类细胞株，随后施用于患者，或以细胞体外方式取自患者免疫细胞所选择亚群，然后再施用于患者。

在发明的第一方面所提供的肽，包括根据SEQ IDNo.1(SQDDIKGIQKLYGKRS)或SEQ ID No.2(VMAGDIYSV)的氨基酸序列或由此的变体，不是完整的氨基酸序列起源的人类多肽(即其中之一的全长序列照表列在基因座连接识别号(登录号，参见下面的附表1))。

根据以下所述，形成本发明基础的肽藉由MHC I类或II类呈载细胞(肾脏细胞癌)的呈现，都已被确认了。因此，这些特殊肽以及其他肽包含序列(即衍生的肽)全部引起专一的T细胞反应，虽然这样将被诱发的反应程度在个别肽之间也许有些差异。例如由于前述肽的突变也能导致不同的反应(参见下面)。在本领域所属技术人员能够明了本发明的方法可应用在确定被个别肽所诱发的反应程度，特别是关于在此的例子和相关的文献。

尽可能地，根据本发明的肽根本上包含的氨基酸序列是依照SEQID No.1或SEQ ID No.2或由此的变体。

“根本上包括”意味根据本发明的肽，除了根据任何序列识别一号至序列识别十一号或由此的变体的序列之外，包含额外位于氨基酸延伸的N-且或C-端，其不一定构成肽的部分，作为肽的核心序列的功能包括结合基序和作为致免疫的辅助性T细胞表位。

然而根据本发明，为了提供肽高效率地引入细胞，这些延伸可能很重要。在本发明的一个实施方案中，本发明的肽包括人类白细胞组织抗原DR分型抗原相关不变链(p33，在以下的“Ii”)的80个N端氨基酸，源于美国国立生物技术信息中心，数据库登录号X00497(Strubin，M.，Mach，B.and Long，E.O.The complete sequence of the mRNA forthe HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with anunusual transmembrane polarity EMBO J.3(4)，869-872(1984))(史楚宾，M.、马克，B.和龙，E.O。信使核醣核酸的完整序列对人类白细胞组织抗原DR分型抗原相关不变链显示多肽的异常介膜极性。欧洲分子生物学期刊。第三册，第四号，869至872页(1984年))。

由指定氨基酸序列的“变体”，我们意指侧链，例如修改一或两个氨基酸残基(例如用其他自然发生的氨基酸残基侧链或一些其他侧链来替换他们)这样的肽仍能结合HLA分子和包含的指定氨基酸序列的肽实质的作用方式一样。例如，肽也许被修改以便如不能改善至少维持与合适的MHC分子交互作用与结合的能力，譬如HLA-DRB1分型在HLA II类分子情况下，或HLA-A2分型在HLA I类分子情况下，以致于如不能改善至少维持产生活化的细胞毒性T淋巴细胞，其能识别和杀伤有着异常表达的包含在发明方面被定义的氨基酸序列的多肽，或者有能力激发对CD8阳性T细胞提供帮助的辅助性T细胞或藉由分泌细胞因子直接地攻击目标细胞。如以下所描述的能从资料库里取得，HLA-DR分型结合的肽的某些位置是典型的锚固残基，其形成核心序列撮合HLA结合槽的结合基。这些和其他涉及在结合HLA DR 分型残基的修饰，也许在没有改变细胞毒性T淋巴细胞的辨认下可提高结合性。

不与T细胞受体基本地交互作用的那些氨基酸残基可藉由置换其他的氨基酸而修饰，其掺入并不实质地影响T细胞反应性也不消除与相关的MHC的结合。因而，除所给的附文之外，发明的肽也许是任何肽(由此项我们包括寡肽或多肽)其包括因此所给与的氨基酸序列或部份或变体。

此外为人所知对MHC II类呈现的肽，这些肽是由“核心序列”组成，其有某种HLA专一的氨基酸基序和，可选择地，并不干扰核心序列作用的N-且或C端延伸(即被视为与肽和T细胞的交互作用无关)。N-且或C端可能是各自地延伸到1到10个氨基酸长。因而，本发明较好的肽展示整体长度在9至100个，更好的在9至30个，和最好的在9至16个氨基酸。根据下面描述这些肽可能被使用直接地为了装载MHC II类分子或此序列可能被克隆入载体。因为这些肽形成在细胞内更大肽处理的最终产品，更长的肽也可被使用。发明的肽可以是任何大小，但他们基本上是少于100,000道尔顿分子量，优选少于50,000道尔顿分子量，优选少于10,000道尔顿分子量和典型地约5,000道尔顿分子量。以氨基酸残基的数量而言，发明的肽可以少于1000个残基，少于500个残基较好，少于100个残基更好。

在本发明其他方面，对MHC II类分子与以上所说明的情况相似，发明的肽也许被使用在触发MHC I类专一的反应，因为此肽可同时显示HLA I类分子的核心或部份序列。本发明较好的MHC I类专一的肽显示整体长度在9至16个，更好地在9至12个氨基酸。应该了解那些肽可被使用(例如在疫苗里)为更长的肽，与MHC II类肽相似。识别MHC I类专一的“核心序列”，此序列有某种针对HLA I类分子的HLA专一的氨基酸基序，的方法为有技术人员所熟悉的，且可被预测的，例如由电脑程式PAProC(http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)和SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de)(参见下面)。

发明的肽在免疫治疗方法上为使T细胞能识别有着异常表达出形成本发明肽为基础的多肽之细胞是特别有用的。因为这些专一的肽包括指定的氨基酸序列结合HLA I类或HLA II类分子，最优选结合HLAI类或HLA II类分子的发明的肽，且当如此时，结合HLA肽复合体是呈现在一个适合的抗原呈递细胞的表面，其能引起可识别异常表达出包含指定氨基酸序列多肽的T细胞的激发。

假如大于约12个氨基酸残基的肽直接地被使用在结合MHC分子，优选核心HLA键结侧区的氨基酸残基不能实质地影响肽专一地结合MHC分子结合槽或对T细胞提呈肽的能力。但是，如以上述，最好使用较大的肽，特别是当由多核苷酸所编码的，因为这些较大的肽可被适合的抗原呈递细胞分段。

例子如MHC配体肽、基序、变体以及某些例子为N-且或C端延伸，例如从资料库SYFPEITHI所获得(Rammensee H，Bachmann J，Emmerich NP，Bachor OA，Stevanovic S.SYFPEITHI：database for MHCligands and peptide motifs.Immunogenetics.1999 Nov；50(3-4)：213-9.Review.)(罗曼席H，巴哈曼J，艾莫里契NP，巴策尔OA，史提芬奴维奇S。SYFPEITHI：资料库为MHC配体和肽基序。免疫遗传学。1999年11月；第五十册，第三至四号，213-219页。总览。)在http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/和依照被援引在其中的参考文献。

作为非局限的例子，在资料库里为HLA-DR分型的某些肽是K HK V Y A C E V T H Q G L S S源自免疫球蛋白轻链188至203(Kovatset al.Eur J Immunol.1997 Apr；27(4)：1014-21)(科瓦茨等。欧洲免疫学期刊。1997年四月，第二十七册，第四号，1014至1021页)；K V Q WK V D N A L Q S G N S源自免疫球蛋白轻链145至159(Kovats et al.Eur J Immunol.1997 Apr；27(4)：1014-21)(科瓦茨等。欧洲免疫学期刊。1997年四月，第二十七册，第四号，1014至1021页)；L P R L I A F TS E H S H F源自谷氨酸脱羧酶65270至283(Endl et al.J ClinInvest.1997 May 15；99(10)：2405-15)(恩朵等。临床探究期刊。1997年5月15日，第九十九册，第十号，2405至2415页)或F F R M V I S NP A A T H Q D I D F L I源自谷氨酸脱羧酶65 556至575(Endl et al.JClin Invest.1997 May 15；99(10)：2405-15)(恩朵等。临床探究期刊。1997年5月15日，第九十九册，第十号，2405至2415页)。另外，肽也可源自抗原突变的序列，譬如A T G F K Q S S K A L Q R P V A S源自bcr-abl 210千道尔顿分子量融合蛋白质(ten Bosch et al.Blood.1996Nov 1；88(9)：3522-7)(坦巴哈等。血液。1996年11月1日，第八十八册，第九号，3522至3527页)，G Y K V L V L N P S V A A T源自第一型C型肝炎病毒NS3 28至41蛋白Diepolder et al.J Virol.1997Aug；71(8)：6011-9)(代波尔德等。病毒学期刊。1997年八月，第七十一册，第八号，6011至6019页)，或F R K Q N P D I V I Q Y M D D L YV G源自第一型人类免疫缺陷病毒的D(HXB2)反转录酶326至345(van der Burg et al.J Immunol.1999 Jan 1；162(1)：152-60)(凡德博格等。免疫学期刊。1999年1月1日，第一百六十二册，第一号，152至160页)。所有“锚固”氨基酸(参见Friede et al.，Biochim Biophys Acta.1996Jun 7；1316(2)：85-101；Sette et al.J Immunol.1993 Sep15；151(6)：3163-70.；Hammer et al.Cell.1993 M 16；74(1)：197-203.，andHammer et al.J Exp Med.1995 May 1；181(5)：1847-55.As examples forHLA-DR4)(福莱迪等，生物化学与生物物理学报。1996年6月7日，第一千三百一十六册，第二号，85至101页；萨特等。免疫学期刊。9月1993年15日，第一百五十一册，第六号，3163至3170.页；汉姆尔等。细胞。1993年7月16日，第七十四册，第一号，197至203页，和汉姆尔等。实验医学期限刊。19955月1日，第一百八十一册，第五号，1847至1855页。以HLA-DR4分型为例)以粗体字形表示，推论的核心序列以下面划线表示。

所有上面被描述的肽由术语“变体”所包含的指定的氨基酸序列。

从“肽”的想法，发明者包括不仅将分子里氨基酸残基由肽键(-CO-NH-)联结而且在分子里肽键是反向的。这样的反逆向的模拟肽学能以巧妙的方法运用，譬如那些被描述在Meziere et al(1997)J.Immunol.159，3230-3237(梅利尔等(1997年)免疫学期刊。第一百五十九册，3230至3237页)，由此合并参考文献。这种研讨方法涉及制做伪肽，包含的变动涉及骨架，和不是侧链的方位。梅利尔等(1997年)显示，这些伪肽是有用的至少在对MHC II类和辅助性T细胞反应。反逆向的肽，包含以NH-CO键取代CO-NH肽键，对蛋白水解作用是有非常有抵抗性。

基本上，如果在抗原呈递细胞表达，发明的肽可被处理而导致片段产生，其能结合适合的MHC分子且可由一个适当的细胞呈现而引出一个适当的T细胞反应。由肽产生的片段也可是发明的肽是令人受到重视的。方便地，发明的肽含有一部份，包括指定的氨基酸序列或部份或因此部份的变体和一个给予令人满意特质的较远部份。例如，此较远部份可包含一个较远的T细胞表位(不管是否源自与第一个T细胞表位包含的部份相同之多肽)或者可包括载体蛋白质或肽。因此，在发明的肽的实施方案中，是被截短的人类蛋白质或蛋白质片段和其他提供在人类部份包含一个或更多有创新的氨基酸序列的多肽部份之融合蛋白质。

于特别优选的实施方案中，发明的肽包括发明的氨基酸序列和至少一个较远的T细胞表位，其中较远的T细胞表位能促进T细胞反应的产生，由在异常表达肿瘤相关抗原的肿瘤类型所指引。因此，发明的肽包括所谓的“细绳上悬的珠子”多肽，并且可被使用作为疫苗。这样的肽可被化学连接器分隔开，其也许包含氨基酸(譬如G-延展)，但其可额外或交替地-包含化学连接组(即除了提供特殊间距之外无作用)。

由“异常表达”我们包括其含意为，与正常表达水平相比较多肽是过度表达或源自肿瘤的组织基因是不表达的但是在肿瘤里却是表达的。由″过度表达″我们意为，多肽呈现在水平上至少是在正常组织的1.2倍，最优选至少2倍，优选5倍或10倍的呈现。

肽(至少那些包含在氨基酸残基之间的肽联结)可由固相肽合成的9-芴甲氧羰基-聚醯胺方式所合成，由卢等揭露在(1981年)有机化学期刊，第四十六册，433至3436页(Lu et al(1981)J.Org.Chem.46，3433-3436，在其中作为参考文献。9-芴甲氧羰基(Fmoc)基给予N-氨基组暂时的保护。此高度碱性不安定保护基的反覆裂解由使用在N，N二甲基甲醯胺溶剂里20％哌啶来达成。侧链功能可以丁基醚(在丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸情况下)，丁基酯(在谷氨酸和天门冬氨酸情况下)，丁氧甲酰基衍生物(在赖氨酸和组氨酸情况下)，三苯甲基衍生物(在半胱氨酸情况下)和4-甲氧基2，3，6三甲苯磺酰基衍生物(在精氨酸情况下)的形式所保护。而谷氨酰氨酸或天门冬酰氨酸是C端残基，使用4，4′-二甲氧基二苯甲基作为侧链氨基功能的保护。固相支持为多二甲基-丙烯酰胺聚合物，其由三个单体的二甲基丙烯酰胺(骨架单体)，双丙稀酰乙烯二胺(交联剂)和丙烯酰肌胺酸甲酯(机能试剂)所构成。对酸不安定的4-羟基甲基苯氧基乙酸的衍生物作为肽对树脂可劈开的连接剂。所有氨基酸衍生物以其形成的对称酐衍生物加入反应，除天门冬酰胺氨酸和谷氨酰胺氨酸之外，其加入是使用被反转的N，N-二环己基-碳二醯胺/1羟基苯并三唑介导的偶合程序。所有偶联和去保护反应以茚三酮、三硝基苯磺酸或靛红试验程序来监测。在合成完成时，肽从树脂支撑被劈开且伴随去除侧链保护剂藉由95％三氟乙酸含50％净化剂混合物品来处理。净化剂常用的是乙二硫醇、酚、苯甲醚和水，确切的选择则根据构成氨基酸的被合成肽。

三氟乙酸在真空中被蒸发去除，随后以乙醚研粉成粗制肽。所有净化剂以简单的提取程序在水相冷冻干燥中被去除成无净化剂的粗制肽。肽合成试剂一般可从英国诺丁汉NG72QJ的肯尔生物化学-诺芙生物化学(英国)有限公司得到。

纯化技术可被任何一个，或任何组合影响，如尺寸排除色谱法、离子交换色谱法和(通常)反相阶段高效液相色谱分析。

对肽的分析可使用薄层色谱法、反相阶段高和效液相色谱法、在酸水解以后的氨基酸分析和由快速原子撞击(FAB)质谱仪分析，基体辅助激光解吸和电喷洒离子化-Q-飞行时间之质谱仪分析所执行。

发明的进一步方面提供编码为发明的肽的核酸(即多核苷酸)。根据本发明的核酸可以是去氧核糖核酸、互补去氧核糖核酸、肽核酸、循环核酸、核糖核酸或由此的组合，只要它编码为肽包或不包含内含子皆可。当然，只有包含由自然发生的肽键连接之自然发生的氨基酸残基的肽是由多核苷酸编码。发明的更进一步方面提供表达载体能表达根据发明的多肽。

各种的方法已被开发来施行地连接多核苷酸，特别是去氧核糖核酸，通过载体例如经由互补的黏接端。例如，互补均质聚物短道可以加入来去氧核糖核酸片段使其可被插入载体去氧核糖核酸。然后载体和去氧核糖核酸片段在互补均质的尾巴之间以氢键接合而形成重组去氧核糖核酸分子。

合成的连接端包含一个或更多限制位点，提供衔接去氧核糖核酸片段到载体供选择的方法。去氧核糖核酸片段，如早先所描述的由限制性内切酶切生成，以噬菌体T4去氧核糖核酸聚合酶或大肠杆菌去氧核糖核酸聚合酶I处理，酶以其3′-5′-核酸外切活性来去除3′单股端凸处，和以其聚合活性填装3′端凹处。

这些活性的组合因此生成平端的去氧核糖核酸片段。此平端片段然后与大量克分子剩余的连接端分子和能催化平端去氧核糖核酸分子连接的酶一起培养，如噬菌体T4去氧核糖核酸连接酶。因此，在其末端的反应产品是去氧核糖核酸片段携带聚合的连接端序列。这些去氧核糖核酸片段然后以适合的限制酶切开和连接到表达载体，此表达载体已被酶切开而产生能与此去氧核糖核酸片段相容的端点。

合成连接端包含的各种限制性内切酶位点从一定数量来源的商业上可取得包括位于美国康涅狄格州纽黑文市之国际生技公司。

一个合意的方式修饰编码为发明的多肽之去氧核糖核酸，是使用由佐伯等发明的PCR反应(1988年)科学，第二百三十九册，487至491页(Saiki et al(1988)Science 239，487-491)。这个方法可被使用为引介去氧核糖核酸至适合的载体，例如由设计适合的限制性位点，或用其他知名技术的有用方式修改去氧核糖核酸。此方法以酶作用放大去氧核糖核酸是被两个专一的引物接在侧面，引物本身被并入放大的去氧核糖核酸。前述专一的引物可包含限制性内切酶辩识位点，运用已知技术的方法可被克隆至表达载体。

去氧核糖核酸(或在反转录载体情况下，核糖核酸)然后被在一个适合的宿主表达使产生包含发明的复合物多肽。因此，编码为构成发明的复合物多肽的去氧核糖核酸针对已知的技术可被使用，依此中包含的教学观点适当地修改而建构表达载体，然后使用来转化一个适合的宿主细胞作为表达和产生发明的多肽。包括的那些技术被批露在美国专利第4,440,859号在1984年4月3日对鲁特尔等发布，第4,530,901 号在1985年7月23日对威斯曼发布，第4,582,800号在1986年4月15日对克劳尔发布，第4,677,063号在1987年6月30日对马克等发布，第4,678,751号在1987年7月7日对高德尔发布，第4,704,362号在1987年11月3日对Itakura等发布，第4,710,463号在1987年12月1日对莫瑞发布，第4,757,006号在1988年7月12日对图尔，Jr.发布，第4,766,075号在1988年8月23日对高德尔等发布并且第4,810,648号在1989年3月7日对斯德克发布，通过参考在此合并。

编码为构成发明的复合物多肽的去氧核糖核酸(或在反转录载体情况下，核糖核酸)可被连接各种各样的其他去氧核糖核酸序列以引入适当的宿主。此去氧核糖核酸同伴将取决于宿主的本质，去氧核糖核酸引入宿主的方式和是否如预期的游离基因维护或整合。

通常，去氧核糖核酸被插入表达载体譬如质粒，在适当的取向和正确解读框架所表达。如果需要，去氧核糖核酸可与被预期的宿主所识别之适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，虽然这样的调控在表达载体上普遍是可获得的。然后载体经由标准技术被引入宿主。通常，不是所有宿主可被载体转化。所以，在选择被转化的宿主细胞将是必要的。一个选择技术涉及合并去氧核糖核酸序列入表达载体，以所有必要的控制元素，其在被转化的细胞编码一个可筛选的特徵如抗生素抗药性。

交互选择地，此可筛选的特徵的基因可能是在另一个载体上，被共同转化至被预期的宿主细胞。

由发明的重组去氧核糖核酸转化了宿主细胞，然后以此中揭露的教导观点技艺上所知的技术在充足的时间和在适当的情况下培养而允许多肽的表达，其然后可被回收。

许多已知的表达系统，包括细菌(例如大肠杆菌和枯草杆菌)、酵母菌(例如酿酒酵母)、纤维状真菌(例如麹霉菌)、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。更好地，此系统可以是肾脏细胞癌或阿威尔斯细胞。

启动子是由去氧核糖核酸序列形成的表达控制元素，允许核糖核酸聚合酶和转录本结合的发生。启动子序列与示范性细菌宿主相容是典型地由质粒载体提供，质粒载体包含方便的限制性位点以便插入本发明的去氧核糖核酸片段。典型的原核载体质粒是pUC18、pUC19、pBR322和pBR329，可从宝瑞德实验室得到(美国加州里士满市)，pTrc99A和pKK223-3可从位于美国纽泽西州皮斯卡塔威市的法玛西娅得到。

典型的哺乳动物细胞载体质粒是pSVL可从位于美国纽泽西州皮斯卡塔威市的法玛西娅得到。此载体使用猿猴病毒40晚期启动子驱使被克隆的基因表达，最高水平的在T抗原产生细胞里表达被发现，如COS-1细胞。可诱导的哺乳动物表达载体的例子是pMSG，也可从法玛西娅得到。此载体使用小鼠乳房肿瘤病毒长端重复的糖皮质激素可诱导的启动子驱使被克隆的基因表达。有用的酵母菌质粒载体是pRS403至406和pRS413至416，通常是可从位于美国加州拉荷亚市邮政编码92037的史催特基因克隆系统得到。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合质粒(Yips)并且并入酵母筛选标志HIS3、TRP1、LEU2和URA3。质粒pRS413至416是酵母着丝点质粒(Ycps)。其他公知技术的载体和表达系统是使用在各种各样的宿主细胞。

本发明也与宿主细胞以本发明的多核苷酸载体建构的转化有关。宿主细胞可以是原核的或真核的。在某些情况下细菌细胞是较好的原核宿主细胞而典型地是大肠杆菌株，例如大肠杆菌株DH5可从位于美国明尼苏达州毕士大市的研究实验室公司得到，和大肠杆菌株RR1可从位于美国明尼苏达州罗克维尔市的美国典型物种保藏中心(ATCC)得到(号码ATCC 31343)。较好的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞、优选脊椎动物细胞如那些从小鼠、大鼠、猴子或人类的成纤维细胞和肾脏细胞系。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，通常可从位于美国加州拉荷亚市邮政编码92037的史催特基因克隆系统得到。较好的哺乳动物的宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可从美国典型物种保藏中心的CCL61细胞得到；美国国立卫生研究院瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3，可从美国典型物种保藏中心的CRL 1658细胞得到；猴子肾脏衍生的COS-1细胞可从美国典型物种保藏中心之人类胚胎肾脏细胞的CRL 1650和293细胞得到。较好的昆虫细胞是Sf9细胞，能以杆状病毒表达载体转染。

以本发明的去氧核糖核酸建构转化适当的细胞宿主是以知名的方法完成，其典型地取决于所使用的载体类型。关于原核宿主细胞的转化，例如，参见Cohen et al(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69，2110and Sambrook et al(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.(科恩等(1972年)美国国家科学院研究。第六十九册，2110页和塞姆布鲁克等(1989年)分子克隆实验室手册，纽约州冷泉港实验室)。酵母细胞的转化被描述在Sherman et al(1986)Methods In Yeast Genetics，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，NY(谢尔曼等(1986年)酵母遗传学方法的实验室手册，纽约州冷泉港实验室)。贝格斯方法也是有用的(1978年)自然第二百七十五册，104至109页(Beggs(1978)Nature 275，104-109)。关于脊椎动物的细胞，在转染这样细胞的有用试剂，例如磷酸钙和二乙氨乙基-葡聚糖或微脂粒配方，可从史催特基因克隆系统或位于美国麻里兰州盖士堡市区域号码20877的生命科技公司得到。电穿孔也是有用的于转化且或转染细胞，且是知名技术在转化酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物的细胞。

成功地被转化的细胞，即包含本发明的去氧核糖核酸建构的细胞，可靠知名的技术确认。例如，由本发明的表达建构之引介而造成的细胞可以生长而产生发明的多肽。细胞可被采收和被分解且审查其去氧核糖核酸内容作为去氧核糖核酸的呈现，运用的方法如由Southem(1975)J.MoI.Biol.98，503or Berent et al(1985)Biotech.3，208(南方(1975年)分子生物学期刊，第九十八册，503页所描述或贝兰特等(1985年)生物技术，第三册，208页)。交互选择地，在上层清液蛋白质的出现可能被如下所述的抗体检测到。

除直接地检测重组去氧核糖核酸存在之外，当重组去氧核糖核酸能指导蛋白质的表达，成功的转化即可由公知的免疫学方法证实。例如，以表达载体成功地转化细胞，产生的蛋白质显示适当的抗原性。怀疑被转化的细胞样品被采收且使用适当的抗体检测蛋白质。因此，除被转化的宿主细胞本身，本发明也立意那些细胞的培养，优选单株的(无性繁殖系地均质的)培养，或在一个营养培养基里源自单株培养的培养。

令人感谢的是，在准备发明的肽上发明的某些宿主细胞是有用的，例如细菌、酵母和昆虫细胞。但是，在某些治疗方法上其他宿主细胞也是有用的。例如抗原呈递细胞，如树突细胞，使用在表达发明的肽上也是有用地，这样他们也可被装载入适当的MHC分子。

较好的宿主细胞是重组肾脏细胞癌或阿威尔斯细胞。较好的方法产生依照本发明的肿瘤相关肽，方法包括培养依照本发明的宿主细胞和由宿主细胞或其培养基分离肽，根据标准方法。

发明的进一步方面提供产生肽的方法作为口腔、直肠、鼻或舌的摄入，静脉(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射、肌肉内(i.m.)注射。肽注射的较好方式是皮下、皮内、腹膜内、肌肉内和静脉注射。去氧核糖核酸注射较好的方式是皮内、肌肉内、皮下、腹膜内和静脉注射。可给予药量在0.1至500毫克的肽或去氧核糖核酸，且如下所列述。

发明的进一步方面与对根据发明的肿瘤相关肽的用途有关、根据发明的核酸或根据发明在医学的表达载体。

本发明的目标，由此进一步方面，由制药组合物解决，其包含至少一种由根据发明的SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的肿瘤相关肽、根据发明的核酸或根据发明的表达载体，和制药可接受的载体。此组合物被使用为胃肠外给药，如皮下、皮内、腹膜内、静脉内、肌肉内或口服。为此，肽被溶解或悬浮在一个制药可接受地，较好地含水载体。另外，此组合物可包含赋形剂，如缓冲液、结合剂、爆破剂、稀释剂、香味、润滑剂等。此肽并可与免疫刺激物质一起服用，如细胞因子。一个广泛目录的赋形剂可被使用在这样的组合物，例如，可以采取从A.Kibbe，Handbook of Pharmaceutical Excipients，3.Ed.，2000，American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press(A.基比，制药赋形剂手册，第三版。埃德，2000年，美国配药协会和配药新闻)。此组合物可能被作为疾病防治、预防且或腺瘤性或癌性疗法。

此制药预备，含至少一个本发明的肽包括SEQ ID No.1且或SEQ ID No.2，依照发明的核酸或依照发明的表达载体，施用在遭受伴随着各别肽或抗原的腺瘤性或癌性的患者。藉此，T细胞介导的免疫反应可被触发。根据本发明的制药组合物更好包括至少另一种的肿瘤相关肽，包含根据任何SEQ ID No.3至SEQ ID No.10的序列，各别的核酸或各别的表达载体。

通常，存在于根据发明的肽的制药组合物，如上所述在本发明的肽包含SEQ ID No.1且或SEQ ID No.2的相同性质。因此，其能有整体长度在9至100个氨基酸，较好在9至30个氨基酸，最好在9至16个氨基酸。此外，至少一个依照任何SEQ ID No.1至SEQ ID No.11的肽可包括非肽键。此外，可编码为在9至100个氨基酸，较好在9至30个氨基酸，最好在9至16个氨基酸的各别核酸。

根据发明更好的制药组合物包括(特别是肿瘤相关)肽含氨基酸序列依照SEQ ID No.1且或SEQ ID No.2和SEQ ID No.3至SEQ IDNo.11。

根据发明更好的制药组合物，在其中根据发明的相当数量(特别是肿瘤相关)肽、核酸或根据发明的表达载体所呈现在前述组合物里是组织、癌症且或患者专一的。此肽也可被标记，或是作为融合蛋白质，或是一个杂交分子。此肽也可是实质上纯净的，或与免疫激发佐剂组合，或与免疫激发细胞因子组合，或以一个适合的传送系统施行，例如脂质体。其他适和的佐剂包括阿魁拉的刺激子(位于美国麻州渥斯特的阿魁拉生物技术)源自皂素、分枝杆菌萃取物和合成的细菌细胞壁仿造物，和专有的佐剂如利比的排毒剂。魁尔A，另一种源自皂素的佐剂，也可被使用(丹麦超弗氏)。其他佐剂如弗氏佐剂也是有用的。让肽接合钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或甘露聚糖也是有用的(参见WO95/18145和Longenecker et al(1993)Ann.NY Acad.Sci.690，276-291(隆杰内克等(1993年)纽约科学院年鉴，第六百九十册，276至291页))。因为佐剂被定义为加强对抗原的免疫反应物质(医疗线上医学字典，美国国家卫生研究院)有此功能可用的其他物质包括但不限于toll样受体激动剂(TLR激动剂)，较好的物质是能与TLR 3，7，8和9协同地交互作用，优选与TLR 9作用，如鱼精蛋白稳定核糖核酸、 CpG寡核苷酸、CpR寡核苷酸、细菌去氧核糖核酸、咪唑喹啉等。

在技术中已知是适合加强免疫反应的其他物质包括但不限于对可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶(ARG1)、吲哚胺2，3双加氧酶(IDO)、血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR-1)、血管内皮细胞生长因子(VEG)、环氧化酶-2(COX-2)、β-转化生长因子受体I(TGF-beta-RI)抑制剂。这些抑制剂也是，例如，单株抗体对抗前述分子或小分子。在技术中已知的小分子和单株抗体对以上所述的因子有抑制作用，因此是免疫反应加强作用，例如1-MT、阿司匹林衍生物NCX-4016、罗菲可西保、希乐保、BEC、ABH、nor-NOHA、SB-505124、SD-208、LY580276、AMD3100、阿西替尼、贝伐珠单抗、JSI-124、CPA-7、XL-999、ZD2171、帕若盘尼、CP-547632和血管内皮细胞生长因子陷阱。并且，减少调节T细胞(CD4阳性、CD25阳性、FoxP3阳性)数量的物质作为佐剂是适和的。这些包括但不限于，例如环磷酰胺(癌得星)、安泰克斯(白介素2融合毒素)、舒尼替尼、抗-细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(MDX-010，CP-675206)、抗-CD25、抗-人类巨噬细胞来源的趋化因子和抗-糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体。

在另一优选的实施方案中，疫苗是核酸疫苗。已知以核酸疫苗接种，如编码为多肽的去氧核糖核酸疫苗，可导致T细胞反应。它可直接地被施用入患者，至受影响的器官或全力身系统性，或间接体内地应用在源自患者或人类细胞株的细胞，随后对患者施用，或被使用以选择源自患者的免疫细胞亚群，然后再对患者施用。如果对体外培养的细胞施行核酸，可以转染细胞以便共同表达免疫刺发细胞因子，如白细胞介素2或巨噬细胞集落刺激因子。核酸疫苗也可与如卡介苗或明矾的佐剂一起施用。然而，优选在没有佐剂下施用核酸疫苗。

多核苷酸是实质地不含杂物的，或包含在一个适合的载体或传送系统。适合的载体和传送系统包括病毒的系统，如根据腺病毒、痘苗病毒、反转录病毒、疱疹病毒、腺病毒相关病毒或包含超过一种以上病毒元素的杂交种。非病毒传送系统包括负离子脂质和负离子聚合物在去氧核糖核酸传送是知名的技术。物理传送，如通过″基因枪″也可被使用。肽或由编码肽的核酸可以是融合蛋白质，例如可激发CD4阳性T细胞的破伤风类毒素表位。

对患者适当地施用任一核酸都是无菌的和无致热原的。裸露去氧核糖核酸可以肌肉内或皮内或皮肤下地注射方式给予。肽也可由肌肉内、皮内或皮肤下地注射方式给予。

核酸疫苗可方便地包括任何适当的核酸传送方式。此核酸，优选去氧核糖核酸，可以是裸露的(即以实质上无其他成分被施行)或是以脂质体传送或作为病毒载体传送系统的一部分。

一般相信，由专门抗原呈递细胞如树突细胞之核酸的舍摄入和编码为多肽的表达可能是免疫反应的激活机制；然而，树突细胞不能被转染但仍是重要的因为他们可以从组织中转染的细胞里拾取表达的肽(″交叉激活″，如托马斯AM、圣塔席若LM、鲁兹ER、阿姆斯壮TD、陈YC、黄LQ、拉合如DA、高根斯M、哈鲁班RH、杰菲EM。间皮素专一的CD8阳性T细胞反应由抗原呈递细胞在被接种的胰脏癌症患者上提供体内交叉激活的证据。实验医学期刊。2004年8月2日；第二百册，第三号，297至306页)。

核酸疫苗如去氧核糖核酸疫苗，优选在肌肉施用，肽疫苗优选在皮下或皮内施用。如果疫苗施用入皮肤也是较好的。此核酸疫苗在没有佐剂下可施用。此核酸疫苗也可与佐剂如卡介苗或明矾一起施用。其他适合的佐剂包括阿魁拉的的刺激子(位于美国麻州渥斯特的阿魁拉生物技术)源自皂素、分枝杆菌萃取物和合成的细菌细胞壁仿造物，和专有的佐剂如利比的去毒剂。魁尔A，另一种源自皂素的佐剂，也可被使用(丹麦超弗氏)。如果核酸疫苗在没有佐剂下施用是较好的。其他佐剂如弗氏佐剂也是有用的。让肽接合钥孔虫戚血蓝蛋白是也有用的，较好与佐剂一起施用。

癌症的多核苷酸介导疫苗疗法被描述在Conry et al(1996)Seminars in Oncology 23，135-147；Condon et al(1996)Nature Medicine2，1122-1127；Gong et al(1997)Nature Medicine 3，558-561；Zhai et al(1996)J.Immunol.156，700-710；Graham et al(1996)Int J.Cancer65，664-670；and Burchell et al(1996)pp 309-313In：Breast Cancer，Advances in biology and therapeutics，Calvo et al(eds)，John Libbey Eurotext(康里等(1996年)在肿瘤学研讨会第二十三册，135至147页；康顿等(1996年)自然医学第二册，1122至1127页；巩等(1997年)自然医学第三册，558至561页；翟等(1996年)免疫学期刊第一百五十六册，700至710页；格瑞汉等(1996年)国际癌症期刊第六十五册，664至670页；和布尔歇尔等(1996年)309至313页，在：乳癌，生物和治疗学进展，卡尔夫等(eds)，约翰利比欧洲文献)，所有在此作为参考文献加以整体引述。

在标靶疫苗至特别细胞群也是有用的，例如抗原呈递细胞，以标靶载体和传送系统的注射，或从患者将这样的细胞群选择性纯化和间接体内肽或核酸的施用(例如树突细胞可被分类如描述在Zhou et al(1995)Blood 86，3295-3301；Roth et al(1996)Scand.J.Immunology43，646-651)(周等(1995年)血液第八十六册，3295至3301页；罗斯等(1996年史坎德，免疫学期刊第四十三册，646至651页)。例如，标靶载体可包括组织或肿瘤专一的启动子，指导在一个适当的地方的抗原表达。

关于发明的制药组合物的进一步方面，包含一个或更多前述根据发明的肽。此组合物被使用为肠外施用如皮下、皮内、肌肉内或口服。为此，肽被溶解或悬浮在一个制药可接受更好地含水载体。另外，此组合物可包含赋形剂，譬如缓冲液、结合剂、爆破剂、稀释剂、香味、润滑剂等。此肽并可与免疫刺激物质一起服用，如细胞因子。一个广泛目录的赋形剂可被使用在这样的组合物，例如，可以采取从A.Kibbe，Handbook of Pharmaceutical Excipients，3.Ed.，2000，AmericanPharmaceutical Association and pharmaceutical press(A.基比，制药赋形剂手册，第三版。埃德，2000年，美国配药协会和配药新闻)。此组合物可能被作为疾病防治、预防且或腺瘤性或癌性疗法。

此制药预备，含至少一个包括SEQ ID No.1且或SEQ ID No.2的本发明的肽，施用在遭受伴随着各别肽或抗原的腺瘤性或癌性的患者。藉此，T细胞介导的免疫反应可被触发。

在本发明其他方面，两个或几个根据本发明肽的组合可被使用作为疫苗，可直接组合或在同样治疗方案范围内。此外，与其他肽的组合，例如MHC I类或II类专一的肽可被使用。有技巧的人经由测试能选择较好致免疫肽的组合，例如在体外T细胞的世代并且其效率和整体呈现、增殖、某些T细胞亲合力和扩展对某些肽、和T细胞的功能如由分析干扰素-γ的产生(也参见如下例子)。通常，最有效率的肽然后被结合作为疫苗为如上所述目的。

适合的疫苗优选包含1至20个肽，优选2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个不同肽，优选6、7、8、9、10或11个不同肽，最优选11个不同肽。用于癌症疫苗的肽长度可以是任一适合的肽。特别是，它可以是适合的9单体单元肽或适合的7单体单元或8单体单元或10单体单元或11单体单元肽或12单体单元。更长的肽也是适合的，如在附表1所描述的9单体单元或10单体单元肽对MHC I类的肽是较好的。

肽构成肿瘤或癌症疫苗。它可直接地被施用入患者，至受影响的器官或全身系统，或间接体内地应用在源自患者或人类细胞株的细胞随后对患者施行，或使用在体外培养以选择源自患者的免疫细胞亚群，然后再对患者施行。此肽也可接合适合的载体如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或甘露聚糖(参见WO 95/18145和Longenecker et al(1993)Ann.NY Acad.Sci.690，276-291(隆杰内克等(1993年)纽约科学院年鉴，第六百九十册，276至291页))。此肽疫苗在没有佐剂下也可被施行。此肽疫苗也可与佐剂如卡介苗或明矾一起施行。其他适合的佐剂包括阿魁拉的的刺激子(位于美国麻州渥斯特的阿魁拉生物技术)源自皂素、分枝杆菌萃取物和合成的细菌细胞壁仿造物，和专有的佐剂如利比的去毒剂。魁尔A，另一种源自皂素的佐剂，也可被使用(丹麦超弗氏)。其他佐剂如弗氏佐剂也是有用的。让肽结合钥孔虫戚血蓝蛋白，有佐剂下较好。其他佐剂如那些以上所提及，也可被使用。此肽也可被标记、或是融合蛋白质、或是一个杂交分子。本发明的此肽序列被预期可激发CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞。然而，在CD4阳性T细胞所提供的帮助下其激发是更有效率的。因此，一个杂交分子的融合伙伴或分段适当地提供激发CD4阳性T细胞的表位。CD4阳性刺激表位在技术科中是知名的且包括那些在破伤风类毒素里被识别的。

根据发明的肽疫苗的特别优选的实施方案，前述疫苗在肾脏细胞癌的治疗上是多发性肽肿瘤疫苗。前述疫苗优选包括一组根据SEQ IDNo.1至SEQ ID No.10的肿瘤相关肽，位于和已被识别在原发性肾脏癌细胞。此组包括HLA I类和II类肽。此肽组也可包含至少一个肽如从B型肝炎病毒核心抗原，被使用为正向调控肽作为免疫标志来测试皮内注射的效率。在一特别实施方案中，此疫苗包括11个各别的肽(根据SEQ ID No.1至SEQ ID No.11)大约1500微克至大约75微克，较好为大约1000微克至大约750微克，更好在大约500微克至大约600微克，最好每一个肽大约是578微克，以上所有肽可由高效液相色谱法和离子交换色谱法纯化，呈现出白色至米色粉末。此冷冻干粉末优选溶在碳酸氢钠里，且在室温重建以后30分钟内以皮内方式注射。根据本发明，较好的肽数量可在大约0.1至100毫克变化，更好在大约0.1到1毫克，最优选每500毫升溶液中有大约300毫克至80毫克。此中术语为″大约″将意味给予量的加或减10％，如果无不同地陈述。有技巧的人能调整使用的实际肽数量根据几个因素，如个别患者的免疫状态且或呈现在特殊类型癌症的相当数量肿瘤相关肽。本发明的肽也许以其他适当的形式(无菌的溶液等)被提供以代替冷冻干粉末。

在本发明所给予的一些肽序列被预期可激发CD8阳性T细胞(CTL)。然而在CD4阳性T细胞所提供的帮助下其激发是更有效率的。因此，一个杂交分子的融合伙伴或分段适当地提供激发CD4阳性T细胞的表位。CD4阳性刺激表位在技术中是知名的且包括那些在破伤风类毒素里被识别的或由这个发明提供源自基质金属蛋白酶7的肽。

终于，根据发明的疫苗可以用于特别类型癌症，被治疗的患者是正受苦于疾病状态、早期的治疗方式、患者的免疫状态，且当然，患者的HLA-单倍型的状态。此外，根据发明的疫苗可包含被个别有特性的成分，根据特殊患者的个人需要。例子是根据关于肿瘤相关抗原表达的不同数量的肽用在前述特殊患者上，由于个人过敏或其他治疗而导致的不需要的副作用，在第一轮或治疗计划之后可接着调整做二次治疗。

本发明的更进一步方面为关于使用根据发明的肽，或编码为这样的肽的多核苷酸或表达载体在药剂的制造作为杀伤在患者的标靶细胞，其标靶细胞异常表达包括发明的氨基酸序列的多肽。较好使用作为制药组合物的是抗癌疫苗。

本发明的更进一步方面为关于使用根据发明的肽，或编码为这样的肽的多核苷酸或表达载体在药剂的制造作为诱发免疫反应，特别在细胞的免疫反应，更特别在T细胞介导对抗实体肿瘤细胞的免疫反应，此实体肿瘤细胞在其表面表达人类I类和II类MHC分子和呈现包括发明的氨基酸序列的多肽。

令人惊奇地发现在本发明的实体肿瘤细胞状况，与同样组织的健康细胞相反的，在其表面表达HLAII类分子。这个事实只被描述了一次在布瑞萨南克等(Brasanac D，Markovic-Lipkovski J，Hadzi-Djokic J，Muller GA，Muller CA.Immunohistochemicai analysis of HLA class IIantigens and tumor infiltrating mononuclear cells in renal cell carcinoma：correlation with clinical and histopathological data.Neoplasma.1999；46(3)：173-8.(布瑞萨南克D、马可威克-利普科弗斯基J、哈德兹-乔基奇J、莫勒GA、莫勒CA。在肾脏细胞癌的HLA II类抗原和肿瘤浸润单核细胞的免疫组织化学分析：与临床和组织病理学资料相关。肿瘤，1999年，第四十六册，第三号，173至178页))，37个肾脏细胞癌(RCC)的冷冻切片-25个透明细胞型，10个颗粒状和2个嫌色细胞型--被研究了以间接免疫过氧化物酶方法应用单株抗体(MoAb)对抗HLADR、DP和DQ分型抗原在HLA II类抗原的分析，和抗CDl4、CD3、CD4和CD8单株抗体在肿瘤浸润单核细胞(TIM)。阳性反应细胞的数字以半定量地估计，且免疫组织化学调查的结果与临床(患者年龄和性别人、肿瘤大小和TNM分期)和肾脏细胞癌的组织病理(细胞学、组织学、等级)特徵有关联。所有肾脏细胞癌表达HLADR分型，92％表达DQ分型和7％表达DP分型抗原，以表达的水平阶层是DR大于DQ大于DP分型，但非统计地重要关联能以任何组织病理或临床参数分析建立。单核细胞比T淋巴细胞更多量而CD4阳性比CD8阳性T细胞更多量，但是肿瘤以T淋巴细胞占优势且CD4阳性和CD8阳性T细胞的数量近乎相等，有最大平均直径。由肿瘤细胞的T淋巴细胞的不充分活化作用(不管抗原呈现的能力)可能是此参数相关的原因，显示以异常的HLA HLAII类抗原在肾脏细胞癌表达的更加侵袭性的肿瘤行为。

本发明的更进一步方面为提供使用根据发明的肽，或编码为这样的肽的多核苷酸或表达载体在药剂的制造作为杀伤在患者的标靶细胞，其标靶细胞异常表达包含被给予的SEQ ID No.1至SEQ ID No.10的氨基酸序列的多肽。

发明的更进一步方面因此提供在细胞体内或细胞体外产生活化T淋巴细胞的方法。第一个方法包含以抗原负载的人类I类或II类MHC分子联系体外T细胞，此抗原负载的人类I类或II类MHC分子在一个适合的抗原呈递细胞的表面表达一段时期足以来活化，以抗原专一方式，前述的T细胞而其抗原是根据发明的肽。第二个方法，是较好的，由华尔特等所描述。(Walter S，Herrgen L，Schoor O，Jung G，WernetD，Buhring HJ，Rammensee HG，Stevanovic S.Cutting edge：predetermined avidity of human CD8 T-cells expanded on calibratedMHC/anti-CD28-coated microspheres.J Immunol.2003 Nov15；171(10)：4974-8)(华尔特S、荷尔根L、史舒尔O、容G、韦内特D、布合林HJ、罗曼席HG、史提芬奴维奇S。先锋：人类CD8T细胞预定的亲和力扩展在被标定的MHC/抗CD28包覆的微球体。免疫学期刊，2003年11月15日，第一百七十一册，第十号，4974至4978页)。

MHC II类分子可在任何适合的细胞表面表达，且优选假如细胞是一个不自然表达MHC II类分子(在此情况下细胞被转染而表达这样的分子)或，假如可以，在抗原处理或抗原呈递的途迳是有缺陷的。这样，是有可能的在细胞表达MHC II类分子以被选上的肽抗原实质地完全地预先诱导，在活化细胞毒性T淋巴细胞之前。

抗原呈递细胞(或刺激品细胞)典型地有MHC I类或II类分子在其表面，且优选实质上本身不能以选择的抗原负载前述的MHC I类或II类分子。以下更详细地描述，MHC I类或II类分子能以细胞体外选择的抗原轻易地负载。

优选哺乳动物细胞的TAP肽转运体缺乏或减少量或减低作用。缺乏TAP的适当的细胞包括T2、RMA-S和果蝇细胞。TAP是抗原处理相关转运体。

人类肽负载缺少细胞株T2可从美国典型物种保藏中心得到，地址是美国马里兰州洛克维尔市公园草坪道12301号邮递区号20852，在目录下号码CRL 1992；果蝇细胞系谢德株2可从美国典型物种保藏中心在目录下号码CRL 19863得到；小鼠RMA-S细胞株被描述在Karre and Ljunggren(1985)J.Exp.Med.162，1745(卡雷和雍博瑞(1985年)实验医学期刊，第一百六十二册，1745页)。

前述宿主细胞在转染之前合宜地表达实质上无MHC I类分子。并且优选假如刺激子细胞表达分子对T细胞共刺激是重要的，如任何B7.1、B7.2、胞间质黏着分子-1和淋巴细胞功能相关抗原3。

在一个更进一步的实施方案中，HLA分子的组合可能也被使用。

重组多表位疫苗的用途为传送多发的CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞表位，被描述在Thomson et al(1996)J.Immunol.157，822-826(汤姆森等(1996年)免疫学期刊，第一百五十七册，822至826页)和WO96/03144，二者通过参考在此合并。关于本发明合乎需要和有利的包括在单一疫苗，肽(或编码肽的核酸)，其中的肽包括，以任何次序，本发明的氨基酸序列和CD4阳性T细胞刺激的表位(如源于基质金属蛋白酶7)。在治疗癌症上这样的疫苗会是特别有用的。

许多其它方法可被使用作为在细胞体外产生细胞毒性T淋巴细胞。例如，方法被描述在Peoples et al(1995)Proc.Natl.Acad.ScL USA92，432-436and Kawakami et al(1992)J Immunol.148，638-643(皮普氏等(1995年)美国国家科学院研究，第九十二册，432至436页和川上等(1992年)免疫学期刊，第一百四十八册，638至643页)，利用自体肿瘤浸润淋巴细胞在细胞毒性T淋巴细胞的产生。Plebanski et al(1995)Eur.J.Immunol.25，1783-1787(普利班斯基等(1995年)欧洲免疫学期刊，第二十五册，1783至1787页)，利用自体外周血液淋巴细胞(PLBs)在细胞毒性T淋巴细胞的准备。Jochmus et al(1997)J.Gen.Virol.78，1689-1695(求切莫氏等(1997年)普通病毒学期刊，第七十八册，1689 至1695页)，描述自体细胞毒性T淋巴细胞的产生藉由使用以肽或多肽脉冲的树突细胞，或经由以重组病毒的传染。Hill et al(1995)J.Exp.Med.181，2221-2228and Jerome et al(1993)J.Immunol.151，1654-1662(希尔等(1995年)实验医学期刊，第一百八十一册，2221至2228页和杰诺米等(1993年)免疫学期刊，第一百五十一册，1654至1662页)，利用B细胞在自体细胞毒性T淋巴细胞的产生。另外，巨噬细胞以肽或多肽脉冲，或以重组病毒的传染，可被使用在自体细胞毒性T淋巴细胞的准备。

异基因的细胞也可被使用在细胞毒性T淋巴细胞的准备且这个方法被详细地描述在WO 97/26328，通过参考在此合并。例如，除了果蝇细胞和T2细胞，其它细胞也可被使用在提呈抗原如CHO细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞、细菌、酵母菌、牛痘病毒感染的标靶细胞。另外植物病毒也可被使用(参见，例如Porta et al(1994)Virology 202，449-955(波尔塔等(1994年)病毒学，第二百零二册，449至955页)，描述豇豆嵌纹病毒发育作为外来肽呈现的高产系统。

根据本发明较好的方法，抗原呈递细胞包含如上所述的表达载体。

被指挥对抗发明的肽的活化T细胞在治疗上是有用的。因此，发明的进一步方面提供活化的T细胞，可由发明的前述方法获得。

发明的更进一步方面提供活化的T细胞，此活化的T细胞有选择性地识别细胞有异常表达含发明的氨基酸序列的多肽。更好地，T细胞识别前述细胞藉由与HLA和肽复合体的交互作用(例如，结合)。T细胞是有用的在杀伤患者体内标靶细胞的方法上，其标靶细胞异常地表达含发明的氨基酸序列的多肽，在此患者被施用有效数量的活化T细胞。对患者施用的T细胞也源于患者再被如上所述的方式活化(即他们是自体T细胞)。交互选择地，T细胞不是源自患者而是源自其它个体。当然，优选假如个体是健康个体。由″健康个体″发明者意味个体通常是有好身体，较好能有称职的免疫系统，和更好的是不患有任何可被容易测试和查出的疾病。

此活化的T细胞表达的T细胞受体(TCR)，涉及在识别表达异常多肽细胞。它是有用的假如编码T细胞受体的去氧核糖核酸从活化的 T细胞被克隆且转移入更多的T细胞而表达。

在细胞体内，此标靶细胞为根据本发明的实施方案的CD4阳性T细胞可以是肿瘤(有时表达MHC II类)且或包围肿瘤的基质细胞(肿瘤细胞)(有时也表达MHC II类)。

对发明肽专一的发明T细胞克隆的T细胞受体被克隆。在T细胞克隆里T细胞受体用途由使用(i)T细胞受体易变区域专一的单株抗体和(ii)用对Va和Vp基因族专一的引物之反转录PCR式反应，来决定。从T细胞克隆提取出的多腺嘌呤核苷酸的信使核糖核酸来制备互补去氧核糖核酸基因库。可使用对T细胞受体C端部份的A和P链和N端部份已被确认的Va和P片段专一的引物。对T细胞受体A和P链的完全互补去氧核糖核酸以高精度去氧核糖核酸聚合酶放大，且此被放大的产品被克隆入适当的克隆载体。被克隆的A和P链基因可被组装至单链T细胞受体，方法被描述在Chung et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，12654-12658(锺等(1994年)美国国家科学院研究，第九十一册，12654至12658页)。在此单链构造VaJ片段之后接V DJ片段，之后接Cp片段之后接CD3链的跨膜和细胞质片段。此单链T细胞受体然后被插入反转录表达载体(载体盘区可被使用是根据其感染成熟人类CD8阳性T淋巴细胞和介导基因表达的能力：反转录载体系统Kat是一种更好的可能性(参见Finer et al(1994)Blood 83，43(芬纳等(1994年)血液第八十三册，43页))。高滴定量两性特质的反转录病毒被使用在感染被纯化的自患者肿瘤外周血液分离出的CD8阳性或CD4阳性T淋巴细胞(遵循实验草案由Roberts et al(1994)Blood 84，2878-2889(罗伯特等在(1994年)血液第八十四册，2878至2889页)所出版，通过参考在此合并)。抗CD3抗体被使用在触发被纯化的CD8阳性T细胞的增生，促进反转录病毒的整合和单链T细胞受体的稳定表达。反转录病毒转导效率由被感染的CD8阳性T细胞以对单链T细胞受体专一的抗体的染色而确定。被转导的CD8阳性T细胞的细胞体外分析建立，显示肿瘤专一杀伤与源自最初被克隆的T细胞受体链的异基因限制T细胞克隆一样。有着预期专一性的被转导的CD8阳性T细胞群可被使用在肿瘤患者的过继免疫疗法。患者可被治疗以介于 10的8次方至10的11次方的被自体转导的T细胞。与CD8阳性细胞类似地，可产生被转导的CD4阳性T辅助性细胞运载相关的建构。

其它适当的系统作为引介基因入T细胞被描述在Moritz et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，4318-4322(摩里兹等(1994年)美国国家科学院研究，第九十一册，4318至4322页)，通过参考在此合并。Eshhar et al(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，720-724and Hwuet al(1993)J.Exp.Med.178，361-366(艾许豪等(1993年)美国国家科学院研究，第九十册，720至724页和胡等(1993年)实验医学期刊，第一百七十八册，361至366页)，并描述T细胞的转导。因此，发明的更进一步方面提供T细胞受体识别异常表达含发明的氨基酸序列多肽的细胞，从活化的T细胞上T细胞受体是可获得。

和T细胞受体一样，对T细胞受体的功能上等效分子在发明里被包含。这些包括与T细胞受体是功能上等效的可执行和T细胞受体一样作用的任何分子。特别是，这样分子包括基因工程的三个领域之单链T细胞受体，做成的方法被描述在Chung et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，12654-12658(锺等(1994年)美国国家科学院研究，第九十一册，12654至12658页)，通过参考在此合并，与以上所提及的。此发明并包括编码T细胞受体或功能作用相等的分子的多核苷酸，和编码T细胞受体或就其功能作用相等的分子的表达载体。作为表达发明的T细胞受体的适当表达载体包括那些上述提及关于发明的肽之表达。

然而，更好的表达载体是继转导之后在T细胞能表达T细胞受体。

发明的更进一步方面提供在患者上杀伤标靶细胞方法，其标靶细胞异常表达含发明的氨基酸序列多肽，方法包括对患者施用有效数量根据发明的肽，或有效数量的编码前述的肽的多核苷酸或表达载体，或有效数量的以上定义的T淋巴细胞，其前述肽的数量或前述多核苷酸的数量或表达载体或T细胞是有效的挑起抗标靶细胞免疫反应在前述患者上。标靶细胞典型地是肿瘤或癌细胞，特别是实体肿瘤，在其表面表达人类MHC I类或II类分子且呈现含以上所给的氨基酸序列的多肽。

发明的更进一步方面提供杀伤在患者标靶细胞方法，其标靶细胞异常表达含发明的氨基酸序列多肽，方法包括步骤(1)从患者获得T细胞；(2)引介入前述细胞编码T细胞受体或一个作用上等效分子的多核苷酸，依照以上所定义；并且(3)引介在步骤(2)产生的细胞至患者。

发明的更进一步方面提供在患者上杀伤标靶细胞方法，其标靶细胞异常表达含依照以上所定义的氨基酸序列多肽，方法包括步骤(1)获得抗原呈递细胞，譬如源自前述患者的树突细胞；(2)依照被定义在发明的第一或第二或第三个方面的肽与前述抗原呈递细胞联系，或以编码这样肽的多核苷酸，间接体内；并且(3)再引介如此被处理的抗原呈递细胞至患者。

更好地，抗原呈递细胞是树突细胞。适当地，树突细胞是以抗原性肽脉冲的自体树突细胞。抗原性肽可以是任何引起合适的T细胞反应的适当的抗原性肽。T细胞疗法使用自体树突细胞以源自肿瘤相关抗原的肽脉冲，被透露在Murphy et al(1996)The Prostate 29，371-380and Tjua et al(1997)The Prostate 32，272-278(墨菲等(1996年)前列腺，第二十九册，371至380页和天均等(1997年)前列腺，第三十二册，272至278页)。

在一个更进一步的实施方案中，抗原呈递细胞，譬如树突细胞，与编码发明的肽之多核苷酸联系。多核苷酸可以是任何适当的多核苷酸并且它优选能转染树突细胞，如此造成肽的呈现和免疫的诱发。

方便地，多核苷酸可以包含在病毒多核苷酸或病毒中。例如，腺病毒传感树突细胞被显示诱发抗原专一抗肿瘤免疫关于粘蛋白1(参见Gong et al(1997)Gene Ther.4，1023-1028(巩等(1997年)基因治疗，第四册，1023至1028页))。同样地，基于腺病毒的系统可被使用(参见，例如，Wan et al(1997)Hum.Gene Ther.8，1355-1363(万等(1997年)人类基因治疗，第八册，1355至1363页)；反转录病毒系统也可使用(Specht et al(1997)J Exp.Med.186，1213-1221)(史贝刻特等(1997年)实验医学期刊。第一百八十六册，1213至1221页)和Szabolcs et al(1997年)血液粒子介导的转移至树突细胞也可被使用(Tuting et al(1997)Eur.J.Immunol.27，2702-2707)(图汀等(1997年)欧洲免疫学期刊，第二十七册，2702至2707页))；和核糖核酸也可被使用(Ashley et al(1997)J.Exp.Med.186，11771182)(艾许利等(1997年)实验医学期刊。第一百八十六册，1177至1182页)。

被赞赏地，关于杀伤在患者的标靶细胞方法，是特别认为较好为标靶细胞是癌细胞，更好为肾脏或结肠癌细胞。

在优选的实施方案中，在患者的HLA单体型在治疗之前被确定。HLA单体型分析可使用任何适当的方法来执行；这样的方法在技术方面众所皆知。

发明尤其包括使用发明的肽(或编码它们的多核苷酸)为积极的细胞体内接种；为自体树突细胞在细胞体外的操作随后由在细胞体内如此被操作的树突细胞的引介来活化T细胞反应；来活化在细胞体外的自体T细胞随后有过继疗法(即如此被操作的T细胞被引介至患者)；并且从健康捐赠者来活化T细胞(MHC配对或不配对)体外的研究随后有过继疗法。

在优选的实施方案中，本发明的疫苗以单独地或与其它癌症疗法的组合施行至宿主抑制或压制肿瘤的形成。

此肽疫苗可在没有佐剂下被施用。此肽疫苗也可与佐剂一起施行如卡介苗或明矾。其它适当的佐剂如上所述。

根据发明的肽也可被使用作为诊断试剂。使用此肽其可以被分析，是否在T细胞群其T细胞是存在的，是专一地被指导对抗肽或由治疗来激发。此外，前驱体T细胞增量可被测试以显示反应性对抗被定义的肽的那些肽。此外，肽可被使用作为标志为了监测肿瘤的疾病的进展，此肿瘤表达由前述抗原而来的肽。

在附表1列出被确认的肽。另外，肽源自在表中被选定的蛋白质，并且肽的各别位置在各别蛋白质里。此外被给予的个别的Acc序列号与美国国家卫生院的″美国国家生物技术信息中心″的基因库有关(参见http:www.ncbi.nlm.nih.gov)。

在其它优选的实施方案中，肽被使用为白细胞的染色，特别是T淋巴细胞。这个用途有特殊好处假如它可被证明，是否在细胞毒性T淋巴细胞群里被指挥对抗肽的专一的细胞毒性T淋巴细胞是存在。此外肽可能被使用作为标志以确定在腺瘤性或癌性疾病或病害上疗法的进展。

在其它优选的实施方案中，肽被使用为抗体的产生。多株抗体可以由动物免疫的标准方式获得，经由肽注射和随后免疫球蛋白的纯化。单株抗体可被产生根据标准实验规约所描述，例如，在MethodsEnzymol.(1986)，121，Hybridoma technology and monoclonalantibodies(酶学方法(1986年)121页，杂交瘤技术和单株抗体)。

在抗肿瘤免疫疗法上T细胞相关抗原的辅助性T细胞表位的确认依然是一项重要任务。直到现在，不同的策略已被执行了为确认源自T细胞相关抗原的I类或II类肽，范围从以感兴趣的抗原来培养抗原呈递细胞以便被摄取和被处理(Chaux，P.，V.Vantomme，V.Stroobant，K.Thielemans，J.Corthals，R.Luiten，A.M.Eggermont，T.Boon，and B.P.van der Bruggen.1999.Identification of MAGE-3epitopes presented byHLA-DR molecules to CD4(+)T lymphocytes.J.Exp.Med.189：767-778)(乔克斯，P.、V.凡通米、V.斯特鲁班特、K.席尔曼、J.哥图斯、R.卢滕、A.M.艾格蒙特、T.布恩和B.P.凡得布鲁根。1999年，MAGE-3表位的确认由HLA-DR分型分子对CD4阳性T淋巴细胞所呈现。实验医学期刊，第一百八十九册，767至778页)，到以融合蛋白质的各种各样转染策略(Dengjel，J.，P.Decker，O.Schoor，F.Altenberend，T.Weinschenk，H.G.Rammensee，and S.Stevanovic.2004.Identification ofa naturally processed cyclin D1T-helper epitope by a novel combinationof HLA class II targeting and differential mass spectrometry.Eur.J.Immunol.34：3644-3651)(丹杰尔，J.、P.戴克尔、O.史舒尔、F.艾尔坦博兰德、T.温斯玄克、H.G.罗曼席和S.史提芬奴维奇。2004年。自然地被处理的细胞周期蛋白D1T-辅助性表位的确认由HLA II类靶向和差别的质谱仪分析的一个新颖组合。欧洲免疫学期刊，第三十四册，3644至3651页)。所有这些方法都非常费时的且经常保持不明，假如识别的HLA配体由人类组织实际上在细胞体内呈现。

发明者识别了一个配体证明是从基质金属蛋白酶7的核心序列。发明者发现了此蛋白质在肾脏细胞癌被过度表达，另外，它被描述了与肿瘤相关(Miyamoto，S.，K.Yano，S.Sugimoto，G.Ishii，T.Hasebe，Y.Endoh，K.Kodama，M.Goya，T.Chiba，and A.Ochiai.2004.Matrixmetalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth factor bioavailabilitythrough its proteinase activity on insulin-like growth factor bindingprotein 3.Cancer Res.64：665-671；Sumi，T.，T.Nakatani，H.Yoshida，Y.Hyun，T.Yasui，Y.Matsumoto，E.Nakagawa，K.Sugimura，H.Kawashima，and O.Ishiko.2003.Expression of matrix metalloproteinases7and 2in human renal cell carcinoma.Oncol.Rep.10：567-570)(宫本S.、K.矢野、S.杉本、G.石井、T.长谷部、Y.远藤、K.儿玉、M.戈雅、T.千叶和A.落合。2004年。基质金属蛋白酶7促进类胰岛素生长因子生物相容性通过其蛋白酶活性在类胰岛素生长因子结合蛋白质3。癌症研究，第六十四册，665至671页；岛本，T.、T.中谷、H.吉田、Y.贤、T.安井、Y.松本、E.中川、K.杉村、H.川岛和O.石河。2003年，基质金属蛋白酶7和2在人类肾脏细胞癌的表达。肿瘤学报告，第十册，567至570页)。此肽杂乱地结合至HLA第二分子和能活化从不同的健康捐赠者的CD4阳性T细胞。因而，发明者的方法将是有用的从肿瘤相关抗原识别新的II类肽候选者而用于临床疫苗接种方案。

理解其发明的特点在此被透露和被描述，可被使用不仅在依照被表明的各自组合而且用单一方式没有背离本发明的计划的范围。

发明以下列图形、序列目录和例子的参考下，现在作更详细描述。下列例子只为说明性的目而提供并无打算限制发明。

SEQ ID No.1至SEQ ID No.2显示T细胞表位的肽序列，包含根据本发明由MHC I类或II类所呈现的肽。

SEQ ID No.3至SEQ ID No.11显示被使用在本发明疫苗的肽之肽序列，后来被称为“IMA”。

图1显示c-Met的原致癌基因推导的肽IMA-MET-001存在于原发肿瘤样品肾脏细胞癌013。奈米毛细现象高性能液相层析电喷雾电离质谱技术应用在从肾脏细胞癌013上洗脱的肽。此质量层析图为1006.54正负0.5道尔顿显示峰顶在滞留时间47.8分钟。碰撞引起衰减的质量光谱从质量对电荷比例1006.54，被记录在第二次液相层析- 质谱行程在指定的滞留时间并且显示在插图里，证实了IMA-MET-001的存在(温斯钱科2002年)。

图2显示c-Met的原致癌基因(MET)的组织表达。基因表达以寡核苷酸阵列分析。拷贝数与肾脏是相对的，被设置在1.0。″P″意指基因是存在，″A″是不存在和″M″是边界，根据统计绝对指令算法。″I″意指基因的表达显著的增加相对于肾脏，″D″代表减少的表达，并且″NC″意指在表达上没有变化。表达值相对于肾脏从信号对数比率和显示在杆的顶部被计算。水平虚线显示在正常组织的最高的表达(肺脏在这种情况下)。

图3显示以IMA-MET-001诱导的细胞毒性T淋巴细胞对肽负载标靶细胞的杀伤。

图4显示以IMA-MET-001诱导的细胞毒性T淋巴细胞对恶性细胞的杀伤。

图5显示冷靶抑制分析。

图6显示对微球体驱使扩展的四聚体分析。

图7显示IMA-MMP-001的细胞体外免疫原性-典型的细胞内干扰素γ对CD4四个健康捐赠者的染色。捐赠者1，2和3显示了CD4阳性T细胞反应对抗IMA-MMP-001在第三和第四刺激以后。捐赠者4总是阴性的。

图8显示在肿瘤和健康组织上差异的肽呈现-(A)两个肽种类的质谱其质量对电荷比例739.96和741.95，各别地源自正常肾脏和患者RCC100的肾脏细胞癌组织。质谱显示四倍脂肪分化相关蛋白肽的在肾脏细胞癌组织过度表达，与对应的自体正常组织相比(B)从质量对电荷比例741.95的碰撞引起衰减的质量光谱仪分析(肿瘤)显露肽序列IMA-ADF-003，此肽序列源自脂肪分化相关蛋白。

图9显示细胞体内免疫对抗IMA-ADF-001-T细胞免疫在二名肾脏细胞癌患者上，对抗几个非疫苗接种的肽在以两个源自黏蛋白的肿瘤相关肽脉冲自体树状细胞的患者。对IMA-ADF-001(″脂肪分化相关蛋白″)专一的T细胞，在接种之前是不存在的且在6次接种以后在第三号患者被检测出(上格)和在8次接种以后在第八号患者被检测出(下格)。

图10显示典型IMA诱发T细胞反应的例子，由被放大的酶联免疫斑点分析识别对同样患者和抗原。上列和下列分别地代表阴性对照组抗原HIV-001和单一肿瘤相关肽IMA-CCN-001其被使用为资料分析。左列显示合并样品的酶联免疫斑点分析被采取在接种之前在筛选第二天(S2)并且立刻在第一次注射之前(V1)。右列显示合并样品的酶联免疫斑点分析被采取在接种实验方案期间在第二十二天(V6)和第三十六天(V7)。每个实验皆给予阳性细胞的数量。

图11：IMA典型诱发T细胞反应的例子由被放大的四聚体染色分析确认。上格和中格代表二维点图门控CD3阳性淋巴细胞，下格门控CD3阳性CD8阳性淋巴细胞。患者、时间点和染色依各列表明的那样。S1+V：样品被采取在接种之前；V4+V5：样品被采取在第八天和第十五天；V6+V7：样品被采取在第二十二天和第三十六天；V8+FU：样品被采取在第六十四天(最后接种)并且在八十五到九十二天以后(研究的结尾)

A：患者03-004的资料证实对IMA-CCN-001的免疫学反应被显示在图10。一个细胞群阳性的在CD3阳性和IMA-CCN-001四聚物可被识别在第四次和第五次的IMA注射以后(V6+V7；中格)占0.78％淋巴细胞(V6+V7；下格)。阳性群未被发现在K67-001四聚物(上格)。

B：患者03-003的资料展示无免疫学反应对抗IMA-RGS-001肽(上格)但发展IMA-CCN-001四聚物阳性反应在接种实际方案期间(中格，第三列和第四列)占直到0.8％淋巴细胞(下格；第三列)。

图12：T细胞量动力学的观察在单一时间点被放大的四聚物分析。结果显示在患者05-001单一时间点资料分析，其疫苗诱发的T细胞反应以合并样品的定期放大的四聚物分析已被侦测出。结果被给予在所有肿瘤相关抗原呈现在IMA(肿瘤相关肽库)且特别是在IMA-CCN-001肽。另外，HIV-001和IMA-HBV-001控制组在同样单一时间点分析被显示。

实施例

辞汇解释

术语或缩写描述

AE 不良事件

AJCC 美国癌症联合会

BfArM 联邦药物与医疗器械所

CTL 细胞毒性T细胞

DC 树突细胞

GM-CSF rhuGM-CSF(重组人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因

rhuGM-CSF 子)

HBV B型肝炎病毒

HLA 人类白细胞抗原

IARC 国际癌症研究署

IMP 试验用药品

INF 干扰素

MAA 营销授权申请

MHC MHC

RCC 肾脏细胞癌

SAE 严重不良事件

SmPC 产品特点概述

TUMAP 肿瘤相关抗原

I.本发明的肽的特性描述

关于从基因产品里得到的IMA肽之表达数据

从原发肾细胞癌组织被识别的肽，被选择作为包括进疫苗IMA(参见下面)，根据一种内部等级制度主要基于已知抗原的特性而由此推导出已被确认的肽之基因表达分析、文宪和资料库查寻。所有自然地被提呈的肽在肾细胞癌组织是非常过度表达的与正常的肾组织和多种其他有重要的器官和组织相比。这样选择是必要的在(1)选择肽能诱发T细胞以高专一性在肿瘤但非其它组织的识别使被IMA接种诱发的自体免疫的机会减到最小，和(2)保证在患者群的多数肿瘤由诱发的T细胞所识别。

被推导的肽包含在IMA里的抗原的平均发生率是68％(在肾细胞癌与重要器官和组织过度表达，在n等于24的肾细胞癌样品)范围从54％到96％为单一抗原。这显然比在标准肿瘤抗原里高，譬如Her 2/neu发生率：25％至30％)。

全球性基因表达描述档以一个商业可利用的高密度微阵列系统(艾飞矩阵)而执行。核糖核酸从组织被分离、被处理和杂染至高密度寡核苷酸微阵列。在染色和洗涤以后，列阵被扫描且各个点的荧光强度在阵列代表基因表达水平的种类配对寡核苷酸的去氧核糖核酸序列。几种寡核苷酸在阵列包含各个基因序列。在统计软件分析以后，两两的相对表达值在两个样品之间对各个基因能被获得。以一个恒定的样品作为基础线使不同的样品之所有资料的正常化，在所有样品之间允许表达水平的相对量化。

核糖核酸来源-来自人类组织的总核糖核酸可在商业上获得(英国杭廷顿的安比昂；德国海得尔堡的克隆科技；荷兰阿姆斯特丹的史楚特基因；德国海得尔堡的生物链)。来自一些个体的总核糖核酸被混合，用从每个单独个体的核糖核酸被相等地衡量的方式。质量和数量被确定在安捷伦2100芯片分析系统(德国沃尔特布隆的安捷伦)以核糖核酸6000奈米芯片实验室试剂盒(安捷伦)。

高密度寡核苷酸阵列分析-双股去氧核糖核酸被合成从5至8微克的总核糖核酸以速克隆反转录酶II(德国卡尔斯鲁厄的生命技术公司)和引物(比利时瑟兰的欧洲基因科技)依照由艾飞矩阵手册所给予的指示。细胞体外转录以生物芯片公司高产量核糖核酸转录标记的试剂盒(纽约法明达里的安诺诊断有限公司)，碎裂、杂交在艾飞矩阵U133A或U133升级2.0版基因芯片(艾飞矩阵，圣塔克来拉，加州)，和以链酶亲和素-藻红素和生物素化抗链酶亲和素抗体染色(荷兰莱顿的分子探针)遵循制造商的实验规约(艾飞矩阵)。艾飞矩阵基因扫描器被使用且以微阵列分析组件5.0软件或基因芯片操作软件(GCOS)分析资料。为规范化，使用由艾飞矩阵提供的100个家务基因。两两相比的计算使用在肾脏里表达值作为基础线。相应地，所有表达值的计算是以相对于肾脏的信号对数比率，被设置为1。显著的差别表达由″变动″值判断，其值由统计算法软件实施。对于绝对表达的检测，使用统计算法资料被再一次分析。基因表达的存在或缺乏由绝对指令算法确定。

一个典型组织表达格对c-Met原致癌基因(MET)的基因表达被显示在表2。在分析96％肾细胞癌(n等于24，右边)MET是过度表达的，但在几个选择的重要健康组织和器官与免疫学上重要组织和细胞是不表达或非常低的表达(在表2左边)：

表1总结包含在发明的疫苗IMA的肽，且包括根据发明的肽。

表1：根据本发明的肽

内部序列识别号	抗原	序列	SEQ ID NO.
				IMA-MMP-001	基质金属蛋白酶-7	S QDDIKGIQKLYGKRS	1
IMA-ADF-002	脂肪分化相关蛋白	VMAGDIYSV	2
				IMA-ADF-001	脂肪分化相关蛋白	SVASTITGV	3
IMA-APO-001	载脂蛋白L1	ALADGVQKV	4
				IMA-CCN-001	周期蛋白D1	LLGATCMFV	5
IMA-GUC-001	鸟苷酸环化酶1A3	SVFAGVVGV	6
				IMA-K67-001	焦磷酸法尼酯合成酶0367	ALFDGDPHL	7
IMA-MET-001	c-met原致癌基因	YVDPVITSI	8
				IMA-MUC-001	黏蛋白11	S TAPPVHNV	9
IMA-RGS-001	G蛋白信号途径调节蛋白-5	LAALPHSCL	10
				IMA-HBV-001	B型肝炎病毒	FLPSDFFPSV	11

表2总结表达结果在所有编码为包含在发明的疫苗IMA的肽的抗原，且包括根据发明的肽。

表2：在肾细胞癌(n等于24)抗原的过度表达频率

内部序列识别号	抗原	显著的过度表达肾细胞癌对肾脏¹	过度表达肾细胞癌对所有正常组织²
				IMA-ADF-001 & 002	脂肪分化相关蛋白	83％	75％
IMA-APO-001	载脂蛋白L1	67％	58％
				IMA-CCN-001	周期蛋白D1	58％	63％
IMA-GUC-001	鸟苷酸环化酶1A3	88％	71％
				IMA-K67-001	焦磷酸法尼酯合成酶 0367	54％	54％³
IMA-MET-001	c-met原致癌基因	96％	96％
				IMA-MUC-001	黏蛋白1	无过度表达在核糖核酸水平	无过度表达在核糖核酸水平
IMA-RGS-001	G蛋白信号途径调节蛋白-5	96％	58％
				IMA-MMP-001	基质金属蛋白酶-7	58％	67％

1根据由统计算法所给予的“变动”值在软件实施(“I”的数目)

2有更高表达的肾细胞癌与有最高表达的正常组织比较在所有正常组织的数目

3脑是免役豁免的因此未被考虑

在肾细胞癌的最少的过度表达对所有正常组织是54％，最大值是96％。这是显著较高的比在标准肿瘤抗原里譬如Her-2/neu(发生率：25％至30％)。

1.黏蛋白是例外的，没有过度表达被查出在黏蛋白核糖核酸。但是，接下来的出版报告必须考虑到：在恶性细胞的异常去糖基化是常见的且在肿瘤细胞里无遮蔽的表位也许不被呈现在正常细胞。这样的机制也发生在肾细胞癌是非常可能的。这可解释表达黏蛋白的肿瘤细胞株的专一杀伤(Brossart 1999)(布鲁萨尔特1999年)。也请参见章节4.1.5在黏蛋白的特性。

2.在杜宾根大学的研究员起始的试验里，IMA-MUC-001与自体树突细胞一起被施用。此试验最近在2003年的美国临床肿瘤医学会(Mueller 2003)(谬勒2003年)被提出并且后续资料在2005年的美国临床肿瘤医学会(Wierecky 2005)(维瑞基2005年)被提出，会议中无自体免疫的作用被报告。

3.从临床研究的其它报告显示，在乳癌(Rentzsch 2003)(蓝兹科2003年)和结直肠癌患者(Dittmann 2004)(戴特曼2004年)对IMA-MUC-001专一的细胞毒性T细胞自然地发生(无需免疫接种)。在这些患者无自体免疫的作用被报告。这强调IMA-MUC-001-专一的T细胞的自然角色。

根据这支持性的资料IMA-MUC-001的施用被认为是安全的，虽然无黏蛋白抗原过度表达被检测出在单独的信使核糖核酸水平上。IMA-MMP-001的杂乱结合至几个HLA-DR分型等位基因

IMA-MMP-001是结合HLA-DR分型的肽，是HLA II类分子。II类肿瘤相关肽活化T辅助性细胞，在协助被II类肿瘤相关肽活化的细胞毒性T细胞作用的一个关键的角色。杂乱结合HLA-DR分型的肽是重要的在保证以IMA治疗的多数(大于50％)HLA-A^*02-阳性患者，还能引起对IMA-MMP-001的T细胞反应。对IMA-MMP-001结合的电子分析显示，IMA-MMP-001杂乱地结合几个HLA-DR分型等位基因(DRB1^*0101，^*0301，^*0401，^*1101和^*1501)包含总共至少69.6％的HLA-A2阳性高加索人群。杂乱结合的IMA-MMP-001由细胞体外产生免疫性资料实验性地证实。

测试的原理

使用在杜宾根大学开发的SYFPEITHI算法(Rammensee 1997；Rammensee 1999)(罗曼席1997年；罗曼席1999年)，IMA-MMP-001 结合几个共同的HLA-DR分型等位基因(参见下表)被排等级。从大范围的抗原，此算法已成功地使用在识别I类和II类表位，例如从人类肿瘤相关抗原酪氨酸酶相关蛋白2(I类)(Sun 2000)(孙2000年)和滑膜肉瘤X断点2(II类)(Neumann 2004)(纽曼2004年)。被分析的HLA-DR分型等位基因包含至少69.6％的HLA-A2阳性高加索人群(Mori 1997)(莫理1997年)。结合阀被定义在比分18依照对已知发表的杂乱HLA-DR分型配体结合比分的分析。杂乱结合被定义为HLA-DR分型肽结合好几个HLA-DR分型等位基因，其被表达在至少50％高加索人群。

HLA-A和HLA-DR分型基因座是在连锁不平衡产生HLA-A2和专一的HLADRs的组合，与其他相比较是倾向产生此组合(表3)。

表3：北美洲高加索人单元体频率-被显示是血清学单元体。N.a.代表没被指定(Mori 1997)(莫理1997年)。

某些MHC分子配体携带化学相关氨基酸在于其一级序列的某些位置，容许肽基序的定义在每个MHC等位基因(FaIk 1991)(法尔克1991年)。SYFPEITHI使用推论自细化基序的基序矩阵，完全根据由埃德曼降解法和串联质谱检测的自然配体分析(Schirle 2001)(西尔勒2001年)。这些矩阵允许所指定的呈现在MHC I类或II类分子上蛋白质序列的肽确切预测(Rotzschke 1991)(罗兹杰克1991年)。

表4：IMA-MMP-001结合比分对常见的HLA-DR分型等位基因

显示在高加索人群IMA-MMP-001SYFPEITHI结合比分对最常见的HLA-DRB1分型等位基因。HLA-A2分型阳性的高加索人对应的血清学单元体频率被测量在括弧里。肽被认为结合HLA分子，当比分是等于或大于18。

根据SYFPEITHI算法所预测IMA-MMP-001可能结合几个HLA-DR分型等位基因(DRB1^*0101，^*0301，^*0401，^*1101和^*1501)包含至少69.6％的HLA-A2分型阳性的高加索人群。因为HLA-DR15分型频率资料不可获得，此等位基因在演算里被省略了。因而是非常可能的，此人群所包含的范围比69.9％更高。实验性确认IMA-MMP-001的杂乱结合可由细胞体外产生免疫性资料获得(参见下面)。

抗原的表达和衍生肽的呈现在肿瘤和自体正常组织的比较。

过度表达的抗原应该是在细胞表面上HLA分子被过度表达。示范地，源自脂肪分化相关蛋白的HLA-A^*03肽，是一个过度表达的抗原，两个包含在IMA的HLA-A^*02肽IMA-ADF-001和IMA-ADF-002源自此抗原肽，以QUALITEA策略显示其高度过度表达在肾脏细胞癌组织当与患者肾细胞癌100的自体正常组织比较。这显示出在这个示范案例，抗原的过度表达(在此案例为脂肪分化相关蛋白)与同样抗原的衍生肽的过度表达相关联。

此方法被详细描述在(Lemmel 2004)(勒梅尔2004年)。QUALITEA代表一个作为从肿瘤和正常组织洗脱的HLA肽的差异定量的策略。源自两个不同来源的HLA配体是由¹H_x-或²D_x-试剂和组合来衍生化N端。由高性能液相色谱降低肽复杂度以后，根据其峰面积以电喷雾质谱分析定量肽。一对被衍生化的肽(¹H_x-衍生作用和²D_x-衍生作用)物理化学上相同的且容易地被检测，因其基本上共洗脱在色谱分析的系统。此外，有一个恒定的质量差异被测量在质谱扫瞄。此差异取决于在衍生物的稳定同位素数目。配体的序列识别由电喷雾串联质谱分析显示和光谱的电脑辅助的资料库查寻被记录。因而，此分析提供关于呈现在肿瘤和正常组织的肽定性和定量方面的资讯。

HLA肽差异性呈现在过度表达抗原的肿瘤和正常组织的一个例子被显示在表8。肽IMA-ADF-003在肿瘤组织是4倍的过度呈现对肾细胞癌编号100患者的健康肾脏组织，由碰撞引起的衰减质谱分析在许多相等地呈现的肽之中被确认。此在肿瘤组织过度呈现的肽源自脂肪分化相关蛋白。对同样患者肾细胞癌编号100的基因表达分析，也是2.64倍的脂肪分化相关蛋白过度表达在这个肿瘤组织与健康肾脏比较(资料没被显示)。这资料证实在这个特殊案例，在肿瘤组织的基因水平上过度表达导致在肿瘤细胞表面的肽过度呈现。

细胞活体内产生免疫性对抗IMA-ADF-001

从肾细胞癌患者产生的自体树突细胞(DCs)以两个源自黏蛋白的肿瘤相关肽脉冲，在这些IMA-MUC-001之中。IMA-ADF-001未被接种。接种是以皮下注射方式每两个星期四次且每月重复的执行直到肿瘤发展。在第五次树突细胞注射以后患者另外接受了三次每星期低药量白细胞介素-2(1Mio IE/m2)的皮下注射。T细胞前驱体的活化作用被以干扰素γ的酶联免疫斑点试验监测。除T细胞的诱导对抗两个被接种的肽以外，且T细胞活性对抗几个其它已知的肿瘤相关肽，在他们之中IMA-ADF-001被测试。

此结果最近被显示，由彼得·布罗萨特博士(杜宾根大学)在美国临床肿瘤学会(ASCO)的2005年的年会上发表，此完全的发表被出版在ASCO网站。在二名患者(患者8号和患者13号)以两个黏蛋白肽脉冲在对其它肽的自体树突细胞T细胞免疫性上接种，然后被接种的患者在接种以后被检测(图9)。由于在接种之前免疫不是存在的，非常有可能这样的T细胞被表位扩展所诱导。表位扩展可发生当肿瘤细胞破裂(例如坏死、被疫苗诱导的T细胞所溶解等)并且释放出抗原然后被抗原呈递细胞(APCs，即树突细胞)所吸收。这些抗原呈递细胞然后可在细胞内处理抗原且呈现T细胞表位(即肿瘤相关肽)指示T细胞反应。此资料强调IMA-ADF-001的强烈潜在作用为自然发生的T细胞抗原。II.根据发明对疫苗“IMA”的生产和用途

IMA是包含一组肿瘤相关肽的疫苗，位于和被识别在原发肾癌细胞。此组包括HLA I类和II类肽。此肽组且包含一个源自B形肝炎病毒核心抗原的肽，被使用为阳性对照肽作为免疫标志来测试皮内注射的效率。肽疫苗接种通常需要被辅助，所以例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子将被开发作为辅药在此疫苗接种时间表(人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子是商业可得的在沙格司亭、鲁克恩、博勒克思)。

在十个肿瘤肿瘤相关肽中有八个包含在IMA，用以下所述之XPRESIDENT技术所识别。对这些肽自然呈现在由肿瘤表达的HLA分子背景，因此被直接的证据证明。肽IMA-MUC-001和IMA-CCN-001以其它技术识别。对两后者肽，这些肽在肿瘤细胞株里自然呈现被基于在细胞体外产生免疫性检测的间接证据所证明(参见下面)。

测试原理

HLA分子从冲击冷冻处理的原发肾细胞癌组织被纯化且HLA相关肽被分离。这些肽或是由高效液相色谱法离线式分离且分组物被分析或质谱的序列分析由联机的高效液相色谱-串联质谱仪实验完成。因此产生的序列由被识别的肽合成与被识别的和被合成的肽的片段图谱之比较所证实。如同被识别的肽是直接地源自原发性肿瘤的HLA分子，这些结果呈现直接证据在原发性肾细胞癌组织里被识别的肽之自然处理和呈现。

方法

方法详细被描述在(温斯钱科2002年)。简要地，冲击冷冻的患者样品从度宾根大学泌尿学系获得的(被当地方道德委员会批准)被溶解了，HLA分子使用HLA I类专一的抗体W6/32或HLA-A^*02-专一的抗体BB7.2或(在IMA-MMP-001的例子)HLA-DR-专一的抗体L243的亲合色谱法所纯化。HLA相关肽由酸处理所洗脱且以超滤法分离MHCα链蛋白质。被分离的肽或者是由反相高性能液相色谱法离线式分离并且分组物由奈米-电喷雾质谱分析在一台混杂四极正交加速时间飞行串联质谱仪(Q-TOF I或Q-TOF Ultima，沃特斯)或是使用同样仪器的联机的液相-串联质谱法分析所完成。空白的运转总是包括的用以保证系统免于肽干扰。每天至少校正一次且在适当的间期完成标准化合物的分析以保证系统的最佳表达。片段图谱的解释用人工完成。分析的证明由资料库查寻和假定肽序列的固相合成及被确认与合成的肽片段图谱的比较所获得。所有肽包含在IMA(资料没被显示)除了IMA-MUC-001和IMA-CCN-001以相同形式被识别，证实这些肽在原发性肾细胞癌组织的自然呈现。

IMA成分

在此临床发展的肽由标准和建立很好的9-甲酸芴甲酯化学合成。肽的纯化以制备的高效液相色谱和离子交换法完成。重要地，肽的性质和纯度能以容易地和高准确性地质谱和高效液相色谱分析所确定。IMA的配方包括十一种各别的药物物质，在下面被进一步仔细描述。

表5：在IMA的抗原

	肽识别号	类型	抗原	常见缩略词和同义词
					1	IMA-ADF-001	I类肿瘤相关肽	脂肪分化相关蛋白	脂肪分化相关蛋白，ADRP
2	IMA-ADF-002	I类肿瘤相关肽	脂肪分化相关蛋白	参见上面
					3	IMA-APO-001	I类肿瘤相关肽	载脂蛋白L1	APOL1
4	IMA-CCN-001	I类肿瘤相关肽	周期蛋白D1	细胞周期蛋白D1，PRAD1，副甲状腺上皮增生1型， BCL-1
					5	IMA-GUC-001	I类肿瘤相关肽	鸟苷酸环化酶 1A3	可溶性鸟苷酸环化酶1α3
6	IMA-K67-001	I类肿瘤相关肽	焦磷酸法尼酯合成酶0367
					7	IMA-MET-001	I类肿瘤相关肽	c-met原致癌基因	MET，HGF(肝细胞生长因子)受体，肝细胞生长因子受体
8	IMA-MUC-001	I类肿瘤相关肽	黏蛋白1	黏蛋白，CD227，上皮细胞粘蛋白，上皮膜抗原
					9	IMA-RGS-001	I类肿瘤相关肽	G蛋白信号途径调节蛋白-5	G蛋白信号途径调节蛋白-5
10	IMA-MMP-001	II类肿瘤相关肽	基质金属蛋白酶-7	基质金属蛋白酶-7，基质赖胺酸，子宫
					11	IMA-HBV-001	病毒对照肽	B型肝炎病毒核心抗原	B型肝炎核心蛋白，B型肝炎核心蛋白抗原，核心抗原

所有肽由9-甲酸芴甲酯固相化学合成和由高效液相色谱和离子交换色谱法纯化至大于95％的纯度。正确结构由氨基酸分析和质谱分析确定。

表6：在IMA之肽的物理化学的特性

药品IMA以冻干粉呈现作为皮内施用，其包含11个肽-每一个肽是578微克-以盐(醋酸盐)的形式。在对患者的临床试验配方的施用上，注射的粉末包含578微克的各个肽被溶化在700毫升的碳酸氢钠(4.2％)。在回收500毫升的溶液后(均等的413微克的各个肽单一药量在每次注射和4.5毫克IMA总单一药量在每次注射)将以皮内方式注射。

表7：在IMA其它成分

注射用水*	溶剂	根据欧洲药典
			醋酸*	溶剂	根据欧洲药典
氮气*	钝气	根据欧洲药典

^*在制造过程期间被去除

IMA的质量因为使用满足欧洲药典要求的有效成分和赋形剂被保证。

包含在IMA肽的细胞体外致免疫性

IMA包含九个HLA I类肿瘤相关肽、一个HLA II类肿瘤相关肽和一个HLA I类病毒对照组肽。细胞体外致免疫性能被为大多数包含在IMA的肽证明。

细胞体外致免疫性能被为包含在IMA之十个HLA I类序列中的八个证明，主要是以二种T细胞检测：A.在铬释放法之标靶细胞的细胞毒杀且或B.由HLA四聚物检测T细胞。这些分析证明专一的前驱体细胞存在于HLA-A^*02阳性捐赠者血液并且这样专一的T细胞在杀伤标靶细胞的能力之证据。像在后者案例且几种肿瘤细胞株内在地表达抗原是被识别的。这给予额外的(间接)指证在被使用的肽的自然呈现在肿瘤细胞，且显示以这些肽产生的细胞毒性T细胞有一个大的亲合力在肿瘤细胞的识别。细胞体外致免疫性被为包含在IMA的HLAII类肽IMA-MMP-001以细胞内细胞因子染色之流式细胞分析仪所证明(参见下面)。

表8：为包含在IMA的肽之细胞体外致免疫性资料总结

#	肽识别号	细胞体外致免疫性	参考文献
				1	IMA-ADF-001	杀伤细胞分析	舒密等，2004年
2	IMA-ADF-002	四聚体检测	未发表
				3	IMA-APO-001	不可得	未发表
4	IMA-CCN-001	杀伤细胞分析(异源性T细胞)	萨都尼可娃等，1998 年
				5	IMA-GUC-001	不可得	未发表
6	IMA-K67-001	四聚体检测	未发表
				7	IMA-MET-001	杀伤细胞分析，细胞因子染色，四聚体检测	史查格等，2004年
8	IMA-MUC-001	杀伤细胞分析，细胞因子释	布罗萨特等，1999年

		出
				9	IMA-RGS-001	四聚体检测	未发表
10	IMA-MMP-001	细胞因子染色	未发表
				11	IMA-HBV-001	杀伤细胞分析	温特沃什等，1995年

杀伤细胞分析：标靶的细胞毒杀由铬释放分析所测量；细胞因子释出：细胞因子的释出由T细胞以酶免疫分析法测量；细胞因子染色：细胞因子的合成由T细胞以细胞内流式细胞分析仪测量；四聚体检测：由HLA四聚体检测肽专一T细胞。

包含在IMA的HLA I类肽之细胞体外致免疫性

IMA包含10个HLA I类结合肽。为测试肽关于其细胞体外致免疫性，CD8阳性细胞毒性T细胞以包含在IMA的单一肽从健康捐赠者的自体外周血液单核细胞(PBMC)产生，并且这些细胞毒性T细胞的活性以铬释出分析所测试与在流式细胞分析仪里以HLA四聚体检测T细胞。详细的资料被显示在一示范性的肽(IMA-MET-001)的两个方法，有关其它肽的资料被总结在以上之表8。

在第一步，细胞毒性T细胞的产生(诱导)是在细胞体外由外周血液单核细胞(PBMC)的重复的刺激，此外周血液单核细胞是源自健康的HLA-A^*02阳性捐赠者以专一肽所测试。此诱导可使用从捐赠者的血液单核细胞产生的自体树突细胞或使用HLA四聚体装载的小珠来完成。

A.标靶的细胞毒杀伤：在第二步，这样被诱导的细胞毒性T细胞(CTLs)的细胞毒性被测试以放射性铬标记标靶细胞和将测试标靶细胞与产生的细胞毒性T细胞一起培养。放射性铬释放入上层清液的数量可直接地与被杀伤的标靶细胞的比例关联。

B.以HLA四聚体检测T细胞：交互选择地，在第二步被诱导的细胞毒性T细胞对一指定的肽的专一性以HLA四聚体所查出。四聚体包括四个肽装载的HLA-A^*02分子互相连结。这些建构允许同源T细胞受体的专一标记，其识别在四聚体里之HLA肽复合物，且以荧光染色标记四聚体随后在流式细胞分析仪(FACS)被分析。

以树突细胞诱导细胞毒性的T细胞。

在细胞毒性T细胞诱导，5×10⁵的树突细胞以每毫升50微克合成的肽IMA-MET-001脉冲2小时，洗涤，与2.5×10⁶的自体外周血液单核细胞一起培养在RP10培养基。培养7天以后，细胞被再激发以自体肽脉冲外周血液单核细胞和每毫升1纳克的人类重组合白细胞介素-2(R&D系统)于第一天，第三天和第五天被加入。被诱导的细胞毒性T细胞的细胞溶解活性在第五天的最后再刺激以后以标准51铬释放分析(Brossart 1999)(布罗萨特1999年)。(参见下面)以四聚体装载的小珠的细胞毒性T细胞体外诱导。

细胞体外诱导由以前所描述的执行(Walter 2003)(华尔特2003年)或较小幅度的修改。简要地，生物素化重组的HLA-A^*0201分子缺乏跨膜区段且是依照早先所描述的在重链羧基末端被生物素化(Altman1996)(艾尔特曼1996年)。纯化的共激小鼠IgG2a抗人类CD28抗体9.3(Jung 1987)(容1987年)是在由制造商建议的情况下(德国波昂的普达生物科技公司)以磺基-N-羟基琥珀酰亚胺生物素行化学地生物素化。微球体被使用是5.60微米直径链霉亲和素覆上的聚丙乙烯微粒，有着结合容量大约0.06微克的生物素异硫氰酸荧光黄在每毫克微球体(美国伊利诺洲费雪的班氏实验室)。在微球体处理上，使用无菌的磷酸盐/牛血清白蛋白/乙二胺四乙酸缓冲液。为偶联至生物素化分子，微球体被洗涤和使重新悬浮为2×10⁶微粒在每毫升包含各种厚度的生物素化的MHC且或抗体的缓冲液。在室温下振动30分钟以促使结合。包覆小珠被洗涤三次，使重新悬浮在上述的缓冲液和被存放在摄氏4度在使用之前达4个星期。

外周血液单核细胞与新鲜的白细胞层以标准梯度分离培养基(德国维尔茨堡-贝廷根的连纳瑞斯或奥地利林兹的PAA实验室)分离。未接触的CD8T细胞以CD8T细胞分离试剂盒在制造商的条件下(德国贝尔吉施-格拉德巴赫的天旎生物技术公司)藉由阴性消耗而磁性地富取，使得CD8阳性T细胞受体阳性的细胞纯净度超过80％。细胞体外刺激被起始在24孔板里，每个孔有5×10⁶反应器细胞加上1×10⁶ 抗原呈递细胞或微球体在1.5毫升T细胞培养基。如果没陈述则每毫升5纳克人类白细胞介素-12p70(R&D)与抗原呈递细胞或微球体一起加入。在3至4天于摄氏37度下共培养以后，新鲜培养基和每毫升20单位的人类白细胞介素-2(R&D)被加入且细胞进一步被培养在摄氏37度3至4天。这个刺激周期被重复两次。

细胞毒性T细胞的标靶细胞杀伤由使用铬释放分析。

标准51铬释放分析如所描述的执行(Brossart 2001).(布罗萨特2001年)。标靶细胞以每毫升5纳克的肽脉冲2小时和以51铬酸钠标记在RP10培养基在摄氏37度1小时。10⁴个细胞被转移到一个96孔板的圆底孔。变化数目的细胞毒性T细胞加入以给予最后的体积为200微升和被培养在摄氏37度4小时。在分析的结尾上清液(每孔50微升)被收集和以β板计数器计数。百分比专一的溶解被计算为：100x(实验性释放减掉自发性释放除以最大释放减掉自发性释放)。自发和最大的释放被决定于各自存在的培养基或2％曲拉通X-100。肿瘤细胞的抗原专一性进一步被确定在一个冷标靶抑制分析，由分析肽容量脉冲未标志的T2细胞以阻拦肿瘤细胞溶解在20比1的比率(抑制剂对标靶的比率)。

以HLA四聚体检测细胞毒性T细胞。

四聚体染色如以前所描述的(Walter 2003)(华尔特2003年)或以小幅度修改来执行。简要地，生物素化重组的HLA-A^*0201分子缺乏跨膜区段且是依照早先所描述的在重链羧基末端被生物素化(Airman1996)(艾尔特曼1996年)。萤光四聚物的产生由共培养生物素化HLA-A^*0201与链霉亲和素-藻红蛋白或链霉亲和素-别藻蓝蛋白(荷兰莱顿的分子探针)以4比1的莫耳比率。在四聚体的分析，细胞以磷酸盐/牛血清白蛋白/乙二胺四乙酸包含每毫升10毫克的叠氮化钠(德国达姆施塔特的默克)洗涤并且被染色在摄氏4度20分钟在同样缓冲液包含抗体CD4-异硫氰酸荧光黄和CD8-多甲藻素-叶绿素蛋白克隆SK1(两个都来自贝克顿迪更生)。在微球体刺激实验后，每毫升100微克未标志的链霉亲和素(斯格码)是包括的。细胞被洗涤在磷酸盐缓冲液包含2百分以热灭活的胎牛血清(德国艾丹巴赫的潘生物技术公司)，2毫克分子的乙二胺四乙酸和每毫升10毫克的叠氮化钠，且四聚体被染色在摄氏4度30分钟在磷酸盐/胎牛血清/乙二胺四乙酸/叠氮化钠但其胎牛血清是50％。四聚体试剂总被使用在每毫升5微克的MHC厚度。染色的细胞被彻底地在磷酸盐/胎牛血清/乙二胺四乙酸/叠氮化钠溶液洗涤和以1％的甲醛(默克)固定。细胞以四颜色FACSCalibur流式细胞仪(贝克顿迪更生)分析。此结果被详细地示范显示在IMA-MET-001于方法A和方法B。此结果对其它HLA I类肽被总结在表8。

A.标靶细胞毒杀

结果被发表在(Schag 2004)(史查格2004年)。相关的信息在以下被总结。

在第一步，被诱导的细胞毒性T细胞的细胞毒性以肽装载的T2细胞和自然体的树突细胞作为标靶的标准51铬释放检测而分析。依照图3所显示，在二次每周再刺激后获得的细胞毒性T细胞系展示了抗原专一杀伤。此T细胞只识别T2细胞或覆上此同源肽的树突细胞，当他们没有溶解标靶细胞其以源自存活素蛋白质或人类免疫缺陷病毒-1反转录酶之毫不相关的HLA-A2结合肽脉冲，证实其溶细胞活性的专一性。

在第二步，细胞体外诱导的细胞毒性T细胞溶解内在地表达c-Met蛋白质的肿瘤细胞之能力被分析，以使用表达c-Met为标靶的HLA-A^*02阳性细胞系HCT 116(结肠癌)、A498、MZ 1257(肾脏细胞癌)、MCF-7(乳癌)、Mel 1479(恶性黑色素瘤)和U266(多发性骨髓瘤)在标准51铬释放分析。以艾伯斯坦-巴尔病毒转化的B细胞株 Croft(HLA-2阳性/c-Met阴性)和卵巢癌细胞株SK-OV-3(HLA-A3阳性/c-Met阳性)被包括以确定细胞毒性T细胞的专一性和HLA限制性。依照表4所展示，此c-Met肽专一的细胞毒性T细胞能高效率地溶解表达HLA-A2和c-Met的恶性细胞。卵巢癌细胞SK-OV-3或Croft细胞的不能识别显示出，肿瘤细胞上在HLA-A2分子序列之c-Met肽的呈现作为标把细胞高效率的溶解是必需的且证实细胞毒性T细胞的抗原专一性和MHC限制性。细胞体外诱导的T细胞不能识别K 562细胞显示，细胞毒素的活性不是自然杀伤细胞介导的。

为进一步证实细胞体外诱导的胞毒性T细胞系的抗原专一性和MHC限制性我们执行冷标靶抑制分析。标靶细胞(U 266和A 498)的溶解能被阻拦在冷标靶抑制分析。以同源肽脉冲冷的(没有以51铬标记)T2细胞减少了肿瘤细胞的溶解但是T2细胞以毫不相关的肽脉冲则是无效的(图5)。

B.以HLA四聚体检测T细胞

富集的A^*02阳性健康捐赠者之CD8T细胞被刺激三次以小珠覆上10纳米分子的CD28抗体加上10纳米分子的毫不相关的A^*02复合体(左格)或以被指示的抗原之A^*02重摺叠(中间和右格)。被指示的抗原是源自锯细胞病毒pp65抗原的肽NLVPMVATV(Wills 1996)(威尔斯1996年)，修饰过的肽ELAGIGILTV源于黑色素-A或T细胞识别黑色素瘤抗原-1(Kawakami 1994)(川上1994年)和肽IMA-MET-001。所有T细胞株在表面以CD8-多甲藻素-叶绿素蛋白抗体，同源四聚物-藻红蛋白染色(图6；左和中间格)和毫不相关的A^*02/ILKEPVHGV四聚体-将别藻蓝蛋白(右格)。在CD8阳性淋巴细胞中的四聚体阳性细胞的百分比被表明在各种图面。

包含在IMA的HLA II类肽之细胞体外致免疫性

IMA包含源自基质金属蛋白酶-7的HLA II类结合肽，IMA-MMP-001。为测试肽关于其细胞体外致免疫性和关于其杂乱结合特性，CD4阳性T细胞以IMA-MMP-001肽从有着不同的HLA基因型的健康捐赠者的自体外周血液单核细胞(PBMC)而产生，且这些辅助性T细胞的活性被以细胞内细胞因子染色在流式细胞分析仪所测试。

从健康捐赠者的外周血液单核细胞(PBMC)用在白细胞介素-12的情况下被测试的专一的肽在细胞体外重复的刺激而产生(诱导)CD4阳性T细胞。使用从捐赠者的血液单核细胞产生的自体树突细胞来执行此诱导。在第二步，对指定的肽专一的被诱导的CD4阳性T细胞之活性由干扰素γ产生的测量而测试，此测量为由细胞内干扰素γ以萤光标记的抗体染色。此分析由流式细胞分析仪(FACS)完成。

树突细胞(DCs)的产生

人类树突细胞由从健康捐赠者新鲜地抽取的血液之外周血液单核细胞所制备。外周血液单核细胞以聚蔗糖密度梯度(淋巴细胞分离培养基，奥地利柏斯澄的德国PAA实验室)被分离。被获得的细胞被洗涤，重新悬浮在X-Vivo 15培养基以每毫升50单位的青霉素、每毫升50微克的链霉素和2毫克分子的左旋麸醯胺酸(比利时韦尔维耶的百威泰克)补充并且被装在每毫升7×10⁶个细胞的密度。在摄氏37度2个小时以后，附着的单核细胞被培养了6天在X-Vivo培养基以每毫升100纳克的粒巨噬细胞集落刺激因子和每毫升40纳克的白细胞介素-4(德国福莱莎勒的艾尔免疫工具。在第7天发育未全的树突细胞以每毫升10纳克的肿瘤坏死因子-α(德国威斯巴登的R&D系统)和每毫升20克的多(IC)(德国施泰因海姆的斯格码-奥德利驰)活化3天。树突细胞分化状态由流式细胞分析仪审查，成熟的树突细胞主要地是CD14阴性、CD40阳性、CD80阳性、CD83阳性、CD86阳性和HLA-DR分型阳性(资料没被显示)。

抗原专一的CD4阳性T细胞的产生

为产生CD4阳性T细胞，10⁶个外周血液单核细胞以2×10⁵的自体树突细胞刺激。在诱导以后，以冷冻保存的自体外周血液单核细胞每6到8天进行再刺激。对于刺激步骤，细胞以每毫升5微克的肽在摄氏37度下90分钟脉冲和被放射线照射(60格雷；加拿大安大略诺迪安国际公司的珈玛细胞1000优良辐照仪)。细胞被培养在96-孔的平板(每位捐赠者和每种肽7个孔)在T细胞培养基：RPMI 1640包含4-羟乙基乙磺酸缓冲液和左旋麸醯胺酸(英国佩兹利的吉贝科)补充以10％的热灭活人类血清(德国柯尔贝的PAA)、每毫升50个单位的青霉素、每毫升50微克的链霉素和每毫升20微克的硫酸庆大霉素(百威泰克)以及每毫升10纳克的白细胞介素-12(德国海得尔堡的普罗姆细胞)。在摄氏37度下3到4天共培养以后，加入新鲜的有着每毫升80个单位的白细胞介素-2(美国加州爱蜜莉维尔的普留净和雪然股份有限公司)和每毫升5纳克的白细胞介素-7(普罗姆细胞)的培养基。以细胞内干扰素γ染色的分析被执行在第三和第四次刺激以后。

细胞内干扰素γ染色

冷冻保存的外周血液单核细胞被解冻，以X-Vivo 15培养基洗涤二次，使重新悬浮以每毫升10⁷细胞在T细胞培养基和被隔间培养使减少不专一的干扰素γ产生(Provenzano 2002)(普罗文扎诺2002年)。在次日，外周血液单核细胞以每毫升5微克的肽脉冲2小时，以X-Vivo15培养基洗涤三次并且与效应因子细胞以1比1的比例一起培养小时。加入高基氏体抑制剂(德国海得尔堡的贝克顿迪更生)在最后4小时的培养。细胞以细胞固定/细胞穿透试剂盒(贝克顿迪更生)分析并且CD4-异硫氰酸荧光黄-(免疫工具)、干扰素γ-藻红蛋白-和CD8-多甲藻素-叶绿素蛋白克隆SK1抗体(贝克顿迪更生)。染色以后，细胞在三色的FACSCalibur(贝克顿迪更生)被分析。

为产生抗原专一的CD4阳性T细胞和为测试肽的杂乱结合，四位健康捐赠者有着不同的HLA-DR分型等位基因的外周血液单核细胞(图7)以肽脉冲的自体树突细胞刺激。作为在干扰素γ产生的抗原专一的CD4阳性T细胞的读取系统，是由流式细胞分析仪所评估。在第三和第四次刺激以后，T细胞以细胞内干扰素γ染色加上CD4-异硫氰酸荧光黄和CD8-多甲藻素-叶绿素蛋白染色进行分析以确定在专一的T细胞亚群中干扰素γ产生的细胞的百分比。在所有实验里，以毫不相关的肽和无肽施行刺激以作为阴性对照组。干扰素γ的反应被认为是阳性的假如干扰素γ引起的CD4阳性T细胞的检测与阴性对照组比较是超过二倍。(豪尔顿2004年)。在四位捐赠者中的三位对感兴趣的肽能引起CD4阳性T细胞专一地反应(图7)。T细胞反应不能被观测到在捐赠者四既非在第3次之后也非在第4次刺激之后。生产为IMA-MMP-001专一的CD4阳性T细胞的干扰素γ的最高的频率分别被在捐赠者1和2看见。

因此，IMA-MMP-001是一种杂乱结合剂能引出CD4阳性T细胞反应在四位中的三位携带不同的HLA等位基因的健康捐赠者。根据结合预测和被获得的结果，肽由HLA-DRB1^*0101、HLA-DRB1^*0401/^*0408和HLA-DRB1^*1101所呈现是非常有可能的。所有四个等位基因在其β链有甘氨酸残基在位置86和天门冬氨酸残基在位置57(资料没被显示)。所以，他们有非常相似的结合基序在其结合囊P1和P4分享结合特徵(Rammensee 1997；Hammer 1993；Marshall 1994)(罗曼席1997年；汉姆尔1993年；马歇尔1994年)。捐赠者4携带HLA-DRB1^*0318和DRB1^*1401等位基因有非常不同的结合基序。这将解释为什么用来自这位捐赠者使用上述的肽以细胞引出T细胞反应是不可能的。

在人类的作用

自1996年以来，对那些被描述在此有着相似长度和氨基酸分布的短肽已被用来免疫治疗数以万计的患者以各种各样的阶段1到3临床试验。在这些研究中无任何严重有害事件被报告。另外，包含在IMA的肽IMA-MUC-001已经被使用于接种疫苗，其被装载在由德国杜宾根大学调查员起创始试验的树突细胞，且有非常好地奈受性(Wierecky 2005)(维瑞基2005年)。

SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的肽被测试在30名患者，其中26名在10周的时间完成一全套接种疫苗。比例高达74％的患者，对包含在疫苗内的肽序列显示专一的免疫反应。已经在这小的第一阶段群组内，细胞体内生物作用的8和9肽(序列识别号为2、3、4、5、6、7、8、9)结合MHC I类(等位基因HLA-A^*02)可能依照被放大的酶联免疫斑点法且或四聚体染色分析结果所证实像在下面描述的那样处理。需要不同的读取有着序列识别号为1的肽(IMA-MMP-001)不能被测试的原因归结于从患者血液中外周血液单核细胞的有限的可及性。

专一的免疫学参数(免疫监测)

迄今，免疫监测是普遍做法在数以万计患者以各种的治疗性疫苗接种研究(Romero 2004)(罗密罗2004年)。许多不同的免疫监测的方法迄今被报告了，包括功能的和专一的分析检测。治疗性疫苗IMA的致免疫成分为HLA结合肽，在细胞体内应该诱导专一的T淋巴细胞。这活化作用将导致他们的增殖和获得效应因子的功能，包括当抗原接触时其分泌细胞因子的能力。

作为一个替代品标志在T细胞活化作用，在血液中专一的细胞因子分泌的单核细胞频率可被酶联免疫斑点法分析所测试。这样的分析检测是特别适当的为此目的，因为他们是单一细胞为基础的并且导致一个参数(即斑点形成细胞的数目在单核细胞之中)被预期与细胞因子分泌的抗原专一的T淋巴细胞之真实频率直接地被关联在血液样本。因为这样，分析检测也能同步处理相对地很大数量的样品和肽，他们到目前为止已经广泛被应用在免疫监测的研究在很大数量的临床研究上(Schmittel 2000)(舒密特尔2000年)。

免疫反应

免疫学活性或效能可由T细胞反应分析所描述。关于免疫反应之不同的指徵从不同的临床研究之经验和结果可在文献被发现。在有卵巢和乳癌患者中达100％的T细胞反应由戴西斯等于1999年(Disis etal.，1999)描述。表位扩展在84％的卵巢、乳房和非小细胞肺癌患者中(64人)以Her2/neu抗原加上粒巨噬细胞集落刺激因子的3方研究由戴西斯于2002年(Disis et al.in 2002)报告。其它作者出版了结果关于33％至83％的黑色素瘤患者T细胞反应(Keilholz/Schadendorf，2003；Slingluff et al.，2004)(卡尔霍兹/史查德道尔夫2003年；史林鲁夫等 2004年)。Gaudernack/Gjertsen，2003(高德纳克/杰特森，2003年)报告关于在这项研究内几种对抗原专一的CD4阳性和CD8阳性T细胞克隆之免疫反应。

并且，结果由Wierecky et al.，ASCO 2005(维尔基等在2005年的美国临床肿瘤协会)提出：源自树突细胞(DC)的自体成熟单核细胞以二种从黏蛋白1肽所推导的HLA-A2结合肽脉冲。为招揽和活化CD4阳性T细胞，树突细胞进一步与PAN-DR结合肽PAN-DR辅助性T细胞表位一起培养。疫苗接种是以皮下方式每两个星期注射一次，共四次，并且每月重复的直到用这种治疗方法的肿瘤发展。在第五次树状细胞注射以后患者另外接受了每周三次注射低药量白细胞介素-2(1Mio IE/m2)。T细胞前驱体的强化以干扰素γ酶联免疫斑点法和51铬释放分析所监测。此外以疫苗相关表位挑战生产细胞因子的外周血液单核细胞的能力被定时定量PCR反应测试。

由维瑞基等所做的这项研究中，细胞体内黏蛋白1肽专一的T细胞反应在所有患者外周血液单核细胞被检测。这些细胞体内诱导的T细胞能够识别脉冲以同源肽的标靶细胞或配对的异源肿瘤细胞(A498)，其结构性地表达黏蛋白1在抗原和HLA限制的方式在细胞体内再次次激以后。在患者对治疗所起的反应中，对抗原的T细胞反应没被使用在疫苗接种像脂肪分化相关蛋白、端粒酶或肿瘤相关胎抗原蛋白能被检测出，显示也许发生表位扩展。对PAN-DR辅助性T细胞表位肽的增殖反应是可检测的在16个患者中的11个，在一些患者已经在第2次接种以后。结论：在被接种的患者上对表位扩展的分析而关联临床和免疫学反应也许是一个有用的参数。

细胞体内免疫反应

临床试验配方

IMA的临床试验配方包括：

-包含11种肽在3毫升小瓶里的冷冻干燥粉末

-稀释剂(碳酸氢钠4.2％)

IMA剂形

注射用的粉末在3毫升玻璃小瓶里。包装信息：4个小瓶被装入箱子。稀释剂包括700微升的碳酸氢钠被包装在250毫升瓶。1小瓶IMA由加入700微升的4.2％之碳酸氢钠溶液(稀释剂)重新组成。为了溶化IMA小瓶和稀释剂使劲地被摇动3分钟和由超声波处理1分钟。尔后小瓶再次被摇动1分钟。500微升的这样溶液在重新组成后30分钟内被施用。

疫苗接种

在这项研究中晚期的肾脏细胞癌患者在十个星期的时期接受了八次接种。总共，共计有HLA-A^*02阳性的HLA类型之24名患者参与。皮内接种(粒巨噬细胞集落刺激因子加上IMA)被给予在第1、2、3、8、15、22、36天和第64天。在研究期间血样被采取在不同的时间点并且T细胞包含在患者的外周血液单核细胞之内(PBMCs)从肝素血液里由密度梯度离心法被分离，使用血球计数器来计数和被保存以存放在冷冻的温度直到分析检测。二种不同的常规酶联免疫斑点法分析和一种常规四聚物分析然后由申请人施行。

被放大的酶联免疫斑点法分析

在“间接体内的酶联免疫斑点法”分析，细胞被解冻从不同的时间点，活细胞的数目被计数并且样品与不同的肽或在三份孔里的对照组培养1天后被分析检测或控制。间接体内的酶联免疫斑点法分析提供定量资料以更快的方式与其它的分析方法比较。另外，这是唯一的分析法允许一种包含在IMA的HLA II类肽(IMA-MMP-001)的测量。然而，这个分析法的敏感性有限并且阳性资料只被预期在非常强烈的T细胞反应情况下与对病毒的记忆(回忆)免疫反应可比较。

在“被放大的酶联免疫斑点法”分析，从不同时间点的细胞被合并、被计数和以抗原被前刺激大约两个星期而允许专一的细胞分化。细胞然后从培养皿里被收集，重新计数然后被分析检验如上所述为干扰素γ斑点产生在1天的以抗原再次刺激。在这样情况下被活化的细胞分泌干扰素γ，由酶连接的三明治抗体方法被检测。由颜色形成反应斑点可视见且斑点以一台自动化的高解析率数字照相机(此中叫做“酶联免疫斑点法读取者”)被计数。斑点的数量与在样品中被活化的抗原专一T淋巴细胞真频关联，是由软体算法以酶联免疫斑点法读取者所采取的图像确定。这个分析经常被使用来检测T细胞反应对被接种的肿瘤抗原在各种的第三方临床试验。基由于T细胞的“细胞体外诱导”的假阳性资料可能性可以使用在此分析的各种控制而排除。与下面的四聚体分析相比较，此分析提供额外的功能信息，即干扰素γ细胞因子的释放。

在此研究放大的酶联免疫斑点法分析被执行在28名患者并且所有抗原预先和在接种期间实验规约于不同的时间点呈现在IMA。图10显示IMA诱导的T细胞反应的代表性例子由被放大的酶联免疫斑点法分析识别在同样的患者和抗原。上部和下部的栏柱代表阴性对照抗原HLA-001和单一肿瘤相关肽IMA-CCN-001各自地被使用读取。在各个实验阳性细胞的数量被给予。左栏显示合并在接种之前被采取的样品的酶联免疫斑点法，而右栏显示合并在接种规约期间被采取的样品的酶联免疫斑点法。当对照抗原没有导致斑点数量的增加在免疫反应的诱导以后，IMA的注射导致了斑点数量的增殖为IMA-CCN-001。阳性的数字，即干扰素γ分泌细胞，在接种之前从27至34增加到100至141在第四和第五次注射以后。以IMA治疗在这名患者导致被活化的T淋巴细胞专一的为IMA-CCN-001抗原频率的增加。

被放大的四聚体分析

在“被放大的四聚体”分析从不同的时间点的细胞被解冻，被计数和以抗原前刺激大约两个星期而允许专一的细胞分化。细胞然后从培养皿里被收集，重新计数和以藻红蛋白-和将别藻蓝蛋白-萤光染料标记的主要组织相容性复合多体多聚体加上抗体所染色而定义CD8阳性T细胞(一个孔在每个染色和每个时间点)。MHC多聚体是重组的肽-MHC的复合体，多聚体形成和共轭于一种萤光染料。只有完全相当于最初引进到领域(艾尔特曼1996年)的那些四聚体的HLA-A^*0201 多聚体，此中简要地称四聚体被使用了。被染色的和被固定的样品以在技术知名的标准程序之流式细胞分析仪所分析，导致一个基于单细胞的每个样品的数据集。这“被放大的四聚体”分析是非常高敏感性但与间接体内分析比较下较不定量的。

为对四聚体资料的主要分析完全被评估的CD8阳性T细胞的数量，每样品的单一四聚体阳性和双重四聚体阳性细胞的数量以使用商业软件之细胞分析仪列入表方式文件所电子计数。CD8阳性T细胞被识别由前向和侧向的散射门控在活的淋巴细胞和次门控在根据抗体荧光的CD8阳性CD3阳性项目。淋巴细胞闸门和CD3/CD8闸门的定义是相同的为一名患者所有染色在分析检测之内。四聚体阳性群从CD8阳性T细胞以象限或闸门分析双重四聚体点图所识别。四聚体阳性细胞的定义是相同的为分析上在一名指定患者的各个染色的条件和根据可识别的细胞群。被放大的四聚体分析检测在研究里28名患者上被执行并且所有抗原预先和在接种期间实验规约于不同的时间点呈现在IMA。

图11显示由被放大的四聚体染色分析IMA诱导的T细胞反应的代表性例子。上格和中格代表二维点图门控在CD3阳性淋巴细胞，下格门控在CD3阳性CD8阳性淋巴细胞。患者、时间点和染色是依各个栏柱所表明。在表11A患者03-004对IMA-CCN-001的免疫学反应，已由酶联免疫斑点法分析(图10)显示由四聚体分析证实。一个为CD3阳性的阳性细胞群且IMA-CCN-001四聚体被识别在IMA的第四和第五次注射以后(V6+V7；中格)当无阳性群被为K67-001四聚体发现时(上格)。IMA-CCN-001阳性细胞在前三次注射之后从接种疫苗之前的0.03％增加到0.78％的淋巴细胞(V6+V7；下格)。

患者03-003陈列无免疫学反应抗RGS-001肽(图11B；上格)但发展IMA-CCN-001四聚体阳性反应在接种疫苗规约的时间过程(S1+V1：样品被采取在接种之前；V4+V5：样品被采取在第8天和第15天；V6+V7：样品被采取在第22天和第36天；V8+FU：样品被采取在第64天(最后一次接种)并且在第85至第92天以后；研究结束)。在中格，第3和第4栏显示明显的细胞群阳性为CNN-001和 CD3阳性。在疫苗接种的时间过程这些细胞数量在前三次注射之后从接种疫苗之前的0.02％增加到0.8％的淋巴细胞(下格；第3栏)在第64天以后则减少到0.31％(下格；第4栏；V8+FU)。

在被选择的患者上被放大的四聚体分析在单一时间点进行，即血样未被合并，允许被描述在图12之T细胞动能学的例子更加精确的评估。被观察的T细胞大小值动能学在单一时间点被放大的四聚体分析所显示于患者05-001。肿瘤相关抗原呈现在IMA(肿瘤相关肽合并库)在第22、36天和第64天(V6、V7和V8)是最高的而对IMA-CCN-001肽的反应的最高峰为较早的第22天(V6)。B型肝炎病毒-001阳性对照组引起更加快速的反应在第15天达其最高值(V5)。

对IMA-CCN-001有非常高反应的二名病人被选择在一个非被放大的实验里以确认被放大的四聚体分析的结果。这些间接体内的四聚体分析被执行于两个星期没有培育细胞。

结果被总结在下面表9。其显示所有可评量的结果从间接体内的四聚体和患者与抗原配对的被放大的四聚体分析，由此一个疫苗诱导的反应在被放大的分析所检测。在“间接体内”方法，四聚体阳性在总CD8阳性T细胞之中的百分比被表明。至于“放大，常规”评估方法，CD8阳性T淋巴细胞的亚群可被分析，常规资料的第二次再估价被显示(“放大，定量”)以演算根据总CD8阳性T淋巴细胞。“放大作用因子”被计算假如离散的四聚体阳性群在间接体内和被放大的四聚体分析中被检测到。

此结果清楚地展示，免疫学反应以被放大的四聚体分析所测量不归结于在两个星期培养期间的细胞扩展而是根据早先“间接体内”淋巴细胞在患者血液的呈现。

整体患者反应性

T细胞反应由以上所述的分析检测在包含于IMA的所有肽为28名患者在研究的不同的时间点被评估。患者被计分为“反应的”即显示了疫苗诱导的免疫反应，假如被采取在接种时间点之后这血样之一包含四聚体阳性淋巴细胞或分泌干扰素γ以其中之一肽刺激。

依所期望，患者对包含于IMA不同的肽个别地起反应。考虑到小的患者的数量，一个令人吃惊好的反应性被取得，因为多数患者(27名可评估患者中的23名)对至少其中之一肽发展免疫反应。27名可评估患者中的8名(30％)甚至显示抗多种肿瘤相关肽的T细胞反应。结合。

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序列表

<110>伊玛提克斯生物技术有限公司

<120>结合于人类白细胞抗原(HLA)I类或II类分子的肿瘤相关肽及相关的抗癌疫苗

<130>I30559PCT

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser

1 5 10 15

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Val Met Ala Gly Asp Ile Tyr Ser Val

1 5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>3

Ser Val Ala Ser Thr Ile Thr Gly Val

1 5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Ala Leu Ala Asp Gly Val Gln Lys Val

1 5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>5

Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Val

1 5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>6

Ser Val Phe Ala Gly Val Val Gly Val

1 5

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>7

Ala Leu Phe Asp Gly Asp Pro His Leu

1 5

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>8

Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr SerIle

1 5

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>9

Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val

1 5

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>10

Leu Ala Ala Leu Pro His Ser Cys Leu

1 5

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>Hepatitis B virus

<400>11

Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val

1 5 10

Claims

1.肽组合物，包含SEQ ID No.1序列的肽及SEQ ID No.2序列的肽。

2.核酸组合物，其包含两种核酸，分别编码SEQ ID No.1序列的肽以及SEQ ID No.2序列的肽。

3.如权利要求2所述的核酸组合物，其是DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA或前述的混合。

4.能够表达权利要求2所述核酸组合物的表达载体。

5.权利要求1的肽组合物、权利要求2或3的核酸组合物或权利要求4的表达载体在制备药物中的用途。

6.含有权利要求2或3的核酸组合物或权利要求4的表达载体的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其是重组的RCC或Awells细胞。

8.药物组合物，其包含选自权利要求1的肽组合物、权利要求2或3的核酸组合物或权利要求4的表达载体中的至少一种，及制药学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其还包含由SEQ ID No.3序列的肽、SEQ ID No.4序列的肽、SEQ ID No.5序列的肽、SEQID No.6序列的肽、SEQ ID No.7序列的肽、SEQ ID No.8序列的肽、SEQ ID No.9序列的肽、SEQ ID No.10序列的肽及SEQ IDNo.11序列的肽组成的肽组合物。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其还含有至少一种适合的佐剂。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述佐剂为集落刺激因子或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

12.权利要求8所述的药物组合物在制备抗肾细胞癌疫苗的用途。

13.生产权利要求1的肽组合物的方法，所述方法包含培养权利要求6所述的宿主细胞以及从所述宿主细胞或其培养基中分离所述的肽。

14.权利要求1的肽组合物或权利要求2或3的核酸组合物或权利要求4的表达载体在制备用于杀伤患者的肾细胞癌细胞的药物中的用途，所述患者的肾细胞癌细胞异常表达权利要求1所述肽组合物中含有的肽，其中所述肽组合物的量或所述核酸组合物的量或所述表达载体的量，对激发所述患者中抗肾细胞癌细胞的免疫反应是有效的。

15.权利要求1的肽组合物、权利要求2或3的核酸组合物或权利要求4的表达载体在制造用于杀伤患者的肾细胞癌细胞的药物中的用途，所述患者的肾细胞癌细胞异常表达权利要求1所述肽组合物中含有的肽。

16.体外产生活化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，所述方法包含将CTL与载有抗原的人类MHC I类或II类分子体外接触足够的时间，该人类MHC I类或II类分子在适合的抗原提呈细胞表面上表达，从而以抗原特异的方式活化所述CTL，其中所述抗原为权利要求1所述的肽组合物。

17.如权利要求16所述的方法，通过将充足量的所述抗原与抗原提呈细胞接触，从而将所述抗原载入MHC I类或II类分子，所述MHC I类或II类分子在适合的抗原提呈细胞的表面上表达。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述抗原提呈细胞包含权利要求4所述的表达载体。

19.权利要求16所述的方法产生的活化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其选择性识别异常表达权利要求1所述肽组合物的细胞。

20.权利要求19定义的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在制备用于杀伤患者的肾细胞癌细胞的药物中的用途，所述患者的肾细胞癌细胞异常表达权利要求1所述肽组合物中的肽。

21.权利要求1的肽组合物、权利要求2或3的核酸组合物、权利要求4的表达载体、权利要求8-11中任一权利要求的药物组合物在制造用于杀伤患者的肾细胞癌细胞的药物中的用途。