CN115843317A - 新型t细胞特异性及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开文本总体上涉及多肽构建体，并且特别是涉及对特定同源抗原具有结合亲和力的T细胞受体(TCR)构建体。本公开文本还提供了可用于产生此类构建体的组合物和方法，以及用于诊断、预防和/或治疗与表达由所述多肽构建体识别的同源抗原的细胞相关的病症的方法。

Description

新型T细胞特异性及其用途
关于联邦政府资助研发的声明
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的合同CA232568下在美国政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月24日提交的美国临时专利申请序列号63/014,960的优先权权益。以上引用的申请的公开内容通过引用以其整体(包括任何附图)明确地并入本文。
序列表的并入
所附序列表中的材料特此通过引用并入本申请。所附的名称为078430_518001WO_Sequence_Listing.txt的序列表文本文件创建于2021年4月20日，并且为15KB。
技术领域
本公开文本总体上涉及免疫学领域，并且特别是涉及对特定抗原具有结合亲和力的多肽构建体。本公开文本还提供了可用于产生此类构建体的组合物和方法，以及用于诊断、预防和/或治疗与表达由所述多肽构建体识别的同源抗原的细胞相关的健康状况的方法。
背景技术
近年来，T细胞受体(TCR)已经成为一种有前景的免疫疗法，并且在许多制药和生物技术公司进行的临床试验中成为头条。TCR已经显示具有治疗和诊断潜力，并且可以类似于抗体分子被修饰。具体地，TCR对特定抗原的亲和力使其在各种治疗策略(包括过继免疫疗法)中有价值。
近年来，广泛使用免疫检查点阻断和基于T细胞的免疫疗法来治疗患有实体瘤的患者，需要对癌症中T细胞的特异性具有更深入的了解。然而，尽管使用单细胞测序技术可以获得先进的分析T细胞状态和库的技术，绝大多数肿瘤浸润性T细胞的特异性在所有实体瘤中仍然未知。这主要是由于缺乏在高度多态性人白细胞抗原(HLA)等位基因背景下分析不同TCR库的工具。例如，虽然下一代测序技术使大量TCR的测序变得相对简单和便宜，但是主要问题围绕着如何能够分析这些非常大的库。这是因为对于相同的肽MHC特异性，可能存在成百上千个可能的TCR序列。
因此，揭示肿瘤浸润性T细胞的特异性对于理解T细胞内在因素如何影响肿瘤免疫系统相互作用以及如何影响旨在利用针对癌症的T细胞应答的疗法具有重要意义。
发明内容
本公开文本总体上涉及免疫学领域。更具体地，本文提供了对特定抗原具有结合亲和力的新型多肽构建体。本公开文本还提供了可用于产生此类多肽构建体的组合物和方法，以及用于诊断、预防和/或治疗与表达由所述多肽构建体识别的同源抗原的细胞相关的病症的方法。更具体地，还提供了已被工程化以表达如本文公开的多肽构建体并且针对目的细胞(如癌细胞)的重组细胞，如淋巴细胞T细胞。
在一方面，本文提供了多种包括至少一个互补决定区(CDR)的构建体，所述至少一个互补决定区与选自SEQ ID NO:1-14、26-33和48-49的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
所公开的构建体的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，如本文公开的构建体能够与包括与选自SEQ ID NO:15-22和44-45的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的表位结合。在一些实施方案中，所述构建体是单链构建体或双链构建体。在一些实施方案中，所述构建体选自：(a)T细胞受体(TCR)；(b)抗体；和(c)(a)或(b)的功能性衍生物或片段。在一些实施方案中，所述构建体是包括彼此共价连接的TCRα链和TCRβ链的TCR构建体。在一些实施方案中，所述构建体是在其β链中包括与选自SEQ ID NO:1-14、26-33和48-49的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3β的TCR构建体。在一些实施方案中，所述构建体在其α链中进一步包括CDR3α序列。在一些实施方案中，所述CDR3α序列与选自SEQ ID NO:24的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述构建体在其α链中进一步包括与SEQ IDNO:24的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3α。在一些实施方案中，所述CDR3α序列与SEQ ID NO:24的序列具有至少100％序列同一性，并且进一步包括SEQ ID NO:24中的被不同氨基酸残基取代的一个、两个、三个或四个氨基酸残基。
在一些实施方案中，本文公开的构建体是选自抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、单结构域抗体(sdAb)、VH结构域、VL结构域，VHH结构域、双抗体或其任一个的功能性片段的抗体构建体。
在另一方面，本文提供了重组核酸，其中所述核酸包括编码本公开文本的构建体的核酸序列。
所公开的核酸的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述核酸序列与异源核酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述核酸分子被进一步定义为表达盒或表达载体。在一些实施方案中，所述载体是质粒载体或病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体源自慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒或逆转录病毒。
在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及包括以下一种或多种的工程化细胞：(a)本公开文本的构建体和/或(b)本公开文本的重组核酸。所公开的细胞的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述工程化细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是B细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞(TH)、细胞毒性T细胞(TCTL)、记忆性T细胞、gamma delta(γδ)T细胞、另一种T细胞、造血干细胞或造血干细胞祖细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是T淋巴细胞或T淋巴细胞祖细胞。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是选自以下的CD8+T细胞毒性淋巴细胞：幼稚CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞、效应CD8+T细胞、CD8+干记忆T细胞和大量(bulk)CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是选自以下的CD4+T辅助性淋巴细胞：幼稚CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、效应CD4+T细胞、CD4+干记忆T细胞和大量(bulk)CD4+T细胞。
在相关方面，本公开文本的一些实施方案涉及细胞培养物，所述细胞培养物包括至少一种本公开文本的工程化细胞和培养基。
在另一方面，本文公开的一些实施方案涉及制备工程化细胞的方法，其中所述方法包括(a)提供能够表达蛋白质的宿主细胞；并且(b)用本公开文本的重组核酸转导所提供的宿主细胞以产生工程化细胞。因此，在相关方面，本文还提供了通过本公开文本的方法产生的工程化细胞。在进一步的相关方面，本公开文本的一些实施方案涉及细胞培养物，所述细胞培养物包括至少一种本公开文本的工程化细胞和培养基。
在一方面，本文提供了各种药物组合物，其中所述药物组合物包括药学上可接受的载体和以下中的一种或多种：(a)本公开文本的构建体；(b)本公开文本的重组核酸；和/或(c)本公开文本的工程化细胞。
所公开的药物组合物的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述组合物包含本公开文本的重组核酸和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述组合物包含本公开文本的工程化细胞和药学上可接受的载体。
在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于预防和/或治疗有需要的受试者的病症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用包括以下中的一种或多种的组合物：(a)本公开文本的构建体；(b)本公开文本的重组核酸；(c)本公开文本的工程化细胞；和d)本公开文本的药物组合物。
所公开的用于预防和/或治疗有需要的受试者的病症的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述病症是增殖性障碍。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是一种表达表位的癌症，所述表位包括与选自SEQ IDNO:15-22和44-45的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是表达TMEM161A抗原的癌症(TMEM161A阳性癌症)。在一些实施方案中，所述TMEM161A阳性癌症选自结肠癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、神经内分泌癌和睾丸癌。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是一种表达CLDN2抗原的癌症(CLDN2阳性癌症)。在一些实施方案中，所述CLDN2阳性癌症选自结直肠癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌和胃癌。在一些实施方案中，所述肺癌选自腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、非小细胞癌、腺鳞癌、小细胞肺癌、大细胞癌、肺神经内分泌癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、未分化非小细胞癌、非小细胞癌非特指型、肺鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、肉瘤样癌、多形性癌、癌肉瘤、肺母细胞瘤、原发灶不明的转移癌、原发性肺淋巴上皮瘤样癌和肺良性肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是非转移性癌、转移性癌、多药耐药性癌或复发性癌。在一些实施方案中，所施用的组合物抑制所述受试者的癌症的肿瘤生长或转移。
在一些实施方案中，本文提供了用于预防和/或治疗有需要的受试者的病症的方法，其中所述病症是与细菌感染或病毒感染相关的恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述病症是与EB病毒(EBV)或大肠杆菌(Escherichia coli)感染相关的恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述恶性肿瘤与EBV感染相关，并且选自霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌、移植后淋巴细胞增殖性疾病、B淋巴细胞增殖性疾病、T/NK淋巴细胞增殖性疾病、T/NK淋巴瘤/白血病、平滑肌肉瘤和淋巴上皮瘤样癌。
在用于预防和/或治疗有需要的受试者的病症的方法的一些实施方案中，其中所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，将所述组合物作为第一疗法(单一疗法)单独或与至少一种另外的疗法组合施用于所述受试者。在一些实施方案中，所述至少一种另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法或手术。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法伴随施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法与所述至少一种另外的疗法同时施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法依序施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法在所述至少一种另外的疗法之前施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法在所述至少一种另外的疗法之后施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法在所述至少一种另外的疗法之前和/或之后施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法轮流施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法在单一配制品中一起施用。
在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于实践本文公开的方法的试剂盒。一些实施方案涉及用于诊断、预防和/或治疗有需要的受试者的病症的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括以下中的一种或多种：本公开文本的构建体；本公开文本的重组核酸；本公开文本的工程化细胞；和本公开文本的药物组合物。
在另一方面，本文提供了以下中的一种或多种用于预防和/或治疗病症的用途：本公开文本的构建体、本公开文本的重组核酸、本公开文本的工程化细胞；和药物组合物。在一些实施方案中，所述病症是增殖性障碍。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是癌症。在一些实施方案中，所述病症是与感染相关的恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述感染是细菌感染或病毒感染。
在另一方面，本文提供了以下中的一种或多种用于制造治疗健康状况的药物的用途：本公开文本的构建体、本公开文本的重组核酸、本公开文本的工程化细胞或本公开文本的药物组合物。在一些实施方案中，所述病症是增殖性障碍。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是癌症。在一些实施方案中，所述病症是与感染相关的恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述感染是细菌感染或病毒感染。
在又另一方面，本文提供了用于获得本文公开的构建体的各种方法，所述方法包括(a)鉴定多个与健康状况相关的T细胞受体(TCR)；(b)确定存在于每个鉴定的TCR中的CDR3β的序列；(c)鉴定由CDR3β序列共同识别的一种或多种同源抗原；(c)制备包括(b)中确定的CDR3β序列的构建体，其中所述构建体能够与一种或多种同源抗原结合。在一些实施方案中，所述病症是增殖性疾病。
前述发明内容仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了本文描述的说明性实施方案和特征之外，根据附图、具体实施方式和权利要求，本公开文本的其他方面、实施方案、目的和特征将变得完全清楚。
附图说明
图1A-图1G示意性总结了用肺癌患者的TCR CDR3β序列建立特异性组的实验结果。图1A：用GLIPH2算法(通过互补位热点进行的淋巴细胞相互作用分组)进行TCR特异性推断所涉及的三个步骤的示意图。步骤1，获取T细胞受体CDR3β序列。步骤2，从多个患者中发现CDR3β序列内的短序列基序。预计这些共有基序参与与HLA分子上装载的抗原肽的直接接合。步骤3，特异性组推断。多个截止值用于推断给定的特异性组，所述特异性组包括a)Vβ基因的富集，b)不同CDR3β序列的最小数量＝3，c)患者的最小数量＝2，d)克隆扩增的CDR3β克隆型的富集，以及e)HLA等位基因的富集。图1B：肺癌中肿瘤富集TCR特异性组的疾病相关性。从TRACERx NSCLC患者的肿瘤(验证)中扩增最多的CDR3β序列属于用MD Anderson群组定义的449个肿瘤富集特异性组(发现)，而从健康和COPD患者的肺中扩增的则不属于所述特异性组。T细胞库获自两个独立的非癌症群组的肺(健康肺和COPD肺)和第二NSCLC群组的肿瘤(TRACERx联盟(consortium)，n＝202，验证)。***，p<0.001；*，p<0.05，通过配对t检验得出。图1C：396个NSCLC特异性组的网络分析，所述特异性组用定义的特异性和HLA限制性的公开可用的、源自四聚体的CDR3β序列进行注释。各组用来自流感病毒(Flu，红色)、EB病毒(EBV，绿色)和巨细胞病毒(CMV，蓝色)抗原的源自四聚体的CDR3β序列进行注释。每个点是一个特异性组，边缘指示两个特异性组中存在一个或多个相同的CDR3β序列。图1D：HLA-A*02或HLA-B*08四聚体注释的特异性组的百分比(％)，所述特异性组分别具有由GLIPH2量化的显著富集的A*02(紫色，右图)或B*08(蓝色，左图)超型的HLA I等位基因。包括用其他HLA等位基因的四聚体(其他四聚体)注释的特异性组用于比较。图1E：基于总特异性组(不管克隆扩增(n＝66,996)、克隆扩增特异性组(n＝4,300)或相同的CDR3β序列如何)的任两个给定的NSCLC患者(n＝178)之间共有特异性的百分比(％)。图1F-图1G：对HLA-A*02+或HLA-A*02-NSCLC患者(图1F)或健康供体(图1G，Emerson研究)的不同样本大小的特异性组数量(y轴，特异性组数)的自展(bootstrapping)。
图2A-图2C示意性地总结了进行的实验结果，以展示在人肺癌中具有基序“S％DGMNTE”(其中“％”表示变化的氨基酸)的肿瘤富集特异性组的优先性(Gee M.H.,等人,Cell,2018.172(3):第549-563e16页)。图2A：左，示出了通过Poisson检验在肿瘤(T)与未累及的肺(N)之间的4,300个克隆扩增的TCR特异性组的比较的火山图。y轴表示Poisson检验的负log10转换的p值，以及x轴表示肿瘤与未累及的肺之间的log2转换的倍数差异(T/N)。点大小表示克隆扩增的水平。肿瘤富集特异性组(n＝449)以红色突出显示。右，CDR3β定义的克隆型的T/N比较的火山图。属于449个肿瘤富集特异性组的CDR3β克隆型以红色突出显示。图2B：左，如(图2A，左)中的4,300个NSCLC特异性组的火山图。显著富集HLA-A*02等位基因的特异性组以红色或粉色突出显示。*，具有至少一对来自Stanford NSCLC群组的CDR3α/β序列的特异性组为红色。右，如(A，右)中的CDR3β定义的克隆型的T/N比较的火山图。属于具有基序“S％DGMNTE”的TCR特异性组的CDR3β克隆型以红色突出显示。图2C：属于具有基序“S％DGMNTE”的特异性组的CDR3β克隆型。在此特异性组中鉴定出十四种不同的CDR3β定义的克隆型。对于这些克隆型中的每一种，示出了Vβ基因使用(Vβ)、肿瘤或未累及的肺中具有每种克隆型的患者数量(患者计数)、HLA-A*02+患者数量(HLA-A*02+病例计数/总数)以及未累及的肺和肿瘤中发现的平均克隆频率。ND，未检测到。
图3A-图3D示意性地总结了这样的实验结果，其展示出在人肺癌中由肿瘤富集TCR识别的源自肿瘤和病原体的抗原的鉴定。图3A：上图：所指示的顶部20个11mer对表达优先TCRα/β链(TCR2)的Jurkat细胞的刺激水平(与未刺激对照相比，通过倍数变化得出的CD69上调)；下图：在对酵母11mer文库的第4轮筛选中富集的11mer序列的排序原始计数(log10)。图3B：蛋白质数据库搜索结果显示顶部2个模拟表位与来自人TMEM161A基因座、EBV LMP-2A和大肠杆菌(E.coli)EntS的9mer肽序列的序列相似性。所有匹配均为9mer，并且通过netMHCpan 4.0预测将以高亲和力结合HLA-A*02。图3C：左，示出了用来自以下的9mer刺激表达TCR2的Jurkat细胞的代表性FACS图：人TMEM161A基因座(TMEM9mer)、EBV的LMP-2A(LMP9mer)和大肠杆菌的EntS(EntS9mer)；右，如左图的表达TCR2的Jurkat细胞刺激的结果，一式三份。Ctrl pp：对照肽(GILGFVFTL；SEQ ID NO:20)；No pp：没有肽。图3D：用肽9mer(左)或通过293T细胞加工并且存在于HLA-A*02上的全长蛋白TMEM161A、EntS或LMP2A(右)对异位表达TCR2 TCRα/β链的原代T细胞的刺激。通过表达全长FluM1蛋白的293T-A*02细胞对异位表达TCR14的原代T细胞的刺激。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，通过t检验得出。
图4A-图4E示意性总结了展现出TMEM161A蛋白在人肺癌中高度表达的实验结果。图4A：来自4名Stanford患者的肿瘤(上图)和未累及的肺(下图)上的TMEM161A免疫组织化学的代表性图像。比例尺，100μm。最右边的小图示出了在用TMEM161A免疫组织化学(上图)和在连续切片上的H&E染色(下图)得到的患者A16肿瘤切片的放大图像。比例尺，40μm。图4B：来自Stanford NSCLC群组(n＝11)的切片上的TMEM161A免疫组织化学定量。用FIJI定量切片上的TMEM161A表达。箱形图表示具有第一和第三四分位数(第25个和第75个百分位数)的中值。包括单独数据点。图4C：如图4B在箱形图中示出了通过来自TCGA群组(n＝958)的所指示样品的大量RNA测序量化的TMEM161A表达。UI-Ctrl，未累及的肺对照。示出了相对于UI-Ctrl归一化的TMEM161A表达。图4D：基于与泛肺癌TCGA数据集(n＝958)中的TMEM161A丰度的Pearson相关性，对于排序的基因列表的基因集富集分析(GSEA)。左，指示了基于与TMEM161A丰度的Pearson相关性具有最高(蓝色)和最低(红色)归一化富集得分的基因集，并且示出了它们的富集曲线(右)。图4E：选择图4D中三个富集最多的基因集中的两个，并且针对TMEM161A表达绘制所选基因集的单样本GSEA特征得分(Sig得分)。图中示出了Pearson相关系数(cor coef)。***，p<0.001。ND，无显著差异。
图5A-图5E示意性总结了展示出分离和表征来自健康供体的外周血的交叉反应性TMEM161A特异性T细胞的实验结果。图5A：示出了用于从健康HLA-A*02+供体和NSCLC患者中鉴定TMEM161A特异性或EntS特异性T细胞克隆的程序的示意图。将细胞通过FACS直接分选到96孔板中用于单细胞RNA-seq和TCR-seq。图5B：示出了来自HLA-A*02+健康供体(He65和He66)或NSCLC患者(A6和A17)的PBMC的用加载有TMEM9mer(ALGGLLTPL，SEQ ID NO:17，顶部小图)或EntS9mer(LLGGLLTMV，SEQ ID NO:21；底部小图)的HLA-A*02四聚体分选的T细胞的代表性FACS图。图5C：来自健康供体(n＝11)和NSCLC患者(n＝7)的A*02四聚体+T细胞(如(B)中)的百分比总结于具有单独数据点的柱状图中。箱表示具有第一和第三四分位数(第25个和第75个百分位数)的中值。组间没有发现统计学显著性。图5D：来自健康供体和NSCLC患者的如图5B和图5C中的四聚体分选的T细胞中不同的CDR3β序列的百分比。柱形中的数字表示分选的细胞的计数。图5E：将用如图5B中的四聚体分选鉴定的所指示T细胞克隆型亚克隆到Jurkat细胞中，并且随后用指示的9mer肽刺激。Y轴(刺激的倍数)示出了与未刺激对照相比，通过倍数变化得出的CD69上调。*，p<0.05。
图6A-图6F示意性总结了展示出肿瘤中TMEM161A特异性T细胞的表型特征的实验结果。图6A-图6B：来自10名NSCLC患者(Stanford群组)的切除肿瘤中合并的2,950个CD3+分选的肿瘤浸润性T细胞的单细胞RNA测序(scRNA-Seq)结果的统一流形逼近与投影(UMAP)降维。具有共有细胞状态的细胞的所鉴定的集群(n＝14)用不同的颜色标记(图6A)，并且用表示克隆扩增水平的不同点大小显示(图6B)。图6C：如图6B中的2,950个分选的T细胞的克隆扩增水平被量化为克隆性(1-Pielou均一度，方法)。图6D：与4,300个克隆扩增的特异性组(顶部图)、用公共四聚体数据集注释的所推断的病毒相关特异性组(从上起第二幅)、449个肿瘤富集特异性组(从上起第三幅)和用来自肿瘤的HLA-A*02/TMEM9mer四聚体分选的特异性CD8+T细胞(底部图)相关的具有CDR3β序列的T细胞克隆型的由scRNA-Seq定义的细胞状态的分解。图6E：示出了(A)中定义的每个细胞集群所独特的特定基因表达程序的热图。突出显示了集群C5、C6和C7的选择差异性基因。图6F：示出了图6E所指示的C5、C6和C7的差异性基因在所有细胞集群中的表达的堆叠小提琴图。
图7A-图7B示意性总结了来自MD Anderson癌症中心(MD Anderson CancerCenter)的178名HLA分型NSCLC患者的数据可用性(图7A)和特异性推断流程(图7B)。
图8描绘了来自未累及的肺的低百分比的TCR克隆型到肿瘤富集特异性组的分组。对于如图1B中的属于449个肿瘤富集特异性组的那些克隆型，对属于MD Anderson NSCLC群组(n＝178，左)和TRACERx群组(n＝63，右)的患者的未累及的肺的顶部20个最多扩增的CDR3β克隆型的百分比进行量化(肿瘤富集％，log10转换的)。对其余CDR3β克隆型(Non-exp，非扩增型)进行相同的分析。ND，在扩增克隆型与不太扩增的(less expanded)克隆型之间没有发现统计学显著性。
图9A-图9B示意性地总结了使用HLA四聚体序列的TCR特异性组的电脑模拟验证。图9A：从左到右，示出了如图1C所示着色的72个克隆扩增特异性组的网络分析；圈出两个Flu相关群体(红色)，示出了具有以红色突出显示的先前报道的短基序“RS”和“GxY”的特异性组的CDR3β成员；示出了Flu相关(具有“RS”基序)特异性组(行)的不同CDR3β成员(列)和圈中群体内特异性组之间的共有CDR3β成员水平的热图；示出了用5个Flu特异性四聚体序列注释(下图)的含有短“RS”基序(粗体)的“SIRSS％E”特异性组的例子的表。示出了来自肿瘤的不同CDR3β成员的计数和Vβ基因使用(上图)。图9B：网络中示出了用所指示的四聚体注释和着色的72个克隆扩增的特异性组。
图10A-图10B示意性总结了识别CMV、Flu和EBV的CDR3β序列在肿瘤与未累及的肺之间的分布没有差异的结果。图10A：火山图，示出了通过使用Poisson检验比较多个患者，在肿瘤(T)和未累及的肺(N)中具有对CMV(蓝色)、Flu(红色)或EBV(绿色)的推断的特异性的CDR3β序列的相对分布。y轴示出了Poisson检验的负log10转换的p值，以及x轴示出了肿瘤与未累及的肺之间的log2转换的倍数差异(T/N)。图10B：通过GLIPH2推断出识别来自EBV、CMV或Flu的抗原的在肿瘤(右)或未累及的肺(左)中的克隆型的总频率。每个点都是患者，并且总频率显示为log10转换值(第一和第三个四分位数分别示出了第25和第75个百分位数)。
图11A-图11C示意性总结了GLIPH2分析的结果，所述分析展示出TCR特异性组饱和度取决于克隆扩增水平、特异性组的绝对数量以及库的测序深度。图11A：具有来自HLA-A02+(红色)或HLA-A02-(蓝色)NSCLC患者的CDR3β序列的克隆扩增(右，n＝77)和非扩增(左，n＝77)HLA-A*02:01富集特异性组的量化的自展。通过“有放回抽样”进行自展，并且X轴表示随机采样的患者数量(样本大小，方法)，以及Y轴表示用给定采样事件量化的特异性组数量。误差条的阴影表示从给定样本大小的100个采样事件中得出的3X标准误差。图11B：用于定量具有HLA-A*02:01富集的不同截止值的HLA-A*02:01富集特异性组的自展(p<0.05，n＝1267；p<0.025，n＝319；p<0.01，n＝72)。如图11A中，X轴表示随机采样的患者数量(样本大小，方法)。Y轴表示用给定采样事件量化并且相对于使用的总特异性组的数量进行归一化的特异性组的数量(特异性分数)。误差条的阴影表示从给定样本大小的100个采样事件中得出的3X标准误差。图11C：用于量化具有不同输入CDR3β测序深度(通过随机向下采样占总输入的50％、75％、87.5％或100％)的HLA-A*02:01富集特异性组的自展。如图11B所示，X轴表示随机采样的患者数量，以及Y轴表示特异性组的归一化数量。误差条的阴影表示从给定样本大小的100个采样事件中得出的3X标准误差。
图12是组合的单细胞TCR-Seq和单细胞RNA-Seq(scRNA-Seq)程序的示意图。将CD45+CD3+T细胞从Stanford NSCLC患者的肺肿瘤样品的单细胞悬浮液中分选出来。使用如先前所述(Han等人,2014.Nat.Biotechnol.32,684)的多重巢式PCR进行单细胞TCR-Seq。根据具有如方法中详细描述的修改的先前方法(Picelli等人,2014.Nat.Protoc.9,171)进行单细胞RNseq。对于GLIPH2分析，使用TraCeR算法(Stubbington等人,2016.Nat.Methods13,329)从单细胞TCR-Seq流程和scRNA-seq数据中整合TCR库。
图13A-图13B描绘了由GLIPH2推断为识别Flu和EBV的四个TCR特异性组的实验验证。图13A：GLIPH2推断克隆TCR12、TCR13和TCR14在HLA-A*02的背景下识别流感病毒M1(FluM1)9mer肽“GILGFVFTL”(SEQ ID NO:23)；推断克隆TCR15在HLA-A*02的背景下识别EBVBMLF1 9mer肽“GLCTLVAML”(SEQ ID NO:44)。TCR12、TCR13、TCR14和TCR15克隆型的CDR3β序列分别属于具有基序“SV％SNQP”(SEQ ID NO:50)、“SIRS％YE”(SEQ ID NO:51)、“S％RSTDT”(SEQ ID NO:52)和“RTG％GNT”(SEQ ID NO:49)(其中“％”表示变化的氨基酸)的特异性组(Gee M.H.,等人,2018同上)。具有可用的配对CDR3α/β序列的选定T细胞克隆在表中以粗体突出显示，并且底部示出了两条TCRα/β链的CDR3序列。所有四个克隆都是在来自Stanford群组的2个不同NSCLC患者的肿瘤中发现的。图13B：右，将图13A中的四个选定T细胞克隆型的TCRα/β序列在Jurkat细胞中异位表达并且用指示的肽(右，FACS图上方)脉冲的T2(HLA-A02+)细胞刺激。示出了通过FACS量化的CD69表达。左，示出了先前报道为在HLA-A*02的背景下识别FluM1并且用或不用9mer肽“GILGFVFTL”(SEQ ID NO:23)刺激的表达对照TCRα/β链(Ctrl-TCR，PDB 5euo)的Jurkat细胞。Ctrl PP，对照肽。
图14A-图14B示意性地总结了显示由TCR2识别的抗原事实上为9mer的实验结果。图14A：将TCR缺陷型Jurkat细胞用携带TCR2α链、2A肽序列(2Ap)、TCR2β链、2Ap、GFP的复合编码区的慢病毒转导。随后通过FACS将转导的细胞分选为GFP+CD3+群体(左)，并且允许其扩增(右上)，并且用于体外刺激实验(右下)。在整个文章中，使用类似的策略制造其他稳定的TCR-Jurkat克隆。图14B：将稳定表达优先的TCR2α/β链的Jurkat细胞克隆用指示的肽脉冲的T2(HLA-A2+)细胞刺激，所述指示的肽包括来自酵母筛选的顶部模拟表位(11mer，AMGGLLTQLAM；SEQ ID NO:15)、可以以高亲和力结合HLA-A*02的来自顶部模拟表位的预测的9mer(AMGGLLTQL；SEQ ID NO:16)、和来自与顶部模拟表位具有序列同源性的TMEM161A编码区的9mer/11mer肽两者(分别为ALGGLLTPL；SEQ ID NO:17和ALGGLLTPLFL；SEQ ID NO:25)。通过FACS量化CD69上调。将表达对照TCRα/β链(TCR-fluM1，PDB 5euo)并且用同源9mer“GILGFVFTL”(SEQ ID NO:23)、对照肽(Ctrl PP)、无肽(无PP)刺激的Jurkat细胞或无共培养的T2细胞包括为对照。
图15A-图15C示意性地总结了展现出源自人TMEM161A的内源性肽被TCR2识别的实验结果。图15A：蛋白质数据库搜索结果示出了顶部2个模拟表位与候选编码序列的部分匹配。所有匹配均为9mer，并且通过netMHCpan 4.0预测将以高亲和力结合HLA-A*02。图15B和图15C：与图3C相似，将表达TCR2的Jurkat细胞与HLA-A02+T2细胞共培养并且用以下指示的肽脉冲：在(B)中为Ctrl PP，GILGFVFTL(SEQ ID NO:23)；顶部模拟表位11mer，AMGGLLTQLAM(SEQ ID NO:15)；TMEM161A 11mer，ALGGLLTPLFL(SEQ ID NO:25)；TMEM161A 9mer，ALGGLLTPL；四次穿膜蛋白(Tetraspanin)11mer，AMGGLLFLLGF(SEQ ID NO:34)；四次穿膜蛋白9mer，AMGGLLFLL(SEQ ID NO:35)；GRM2(谷氨酸受体)11mer，AMGSLLALLAL(SEQ ID NO:36)；GRM2 9mer，AMGSLLALL(SEQ ID NO:37)；ZNF780B(锌指蛋白780B亚型X1)11mer，KAFGLLTQLAQ(SEQ ID NO:38)；ZNF780B 9mer，KAFGLLTQL(SEQ ID NO:39)，以及在图15C中为Ctrl PP，GILGFVFTL(SEQ ID NO:23)；LMP-2A9mer，CLGGLLTMV(SEQ ID NO:19)；EntS9mer，LLGGLLTMV(SEQ ID NO:21)；mnhA1 9mer，KLGGLLTIM(SEQ ID NO:40)；NhaB 9mer，ALVGGLLMV(SEQ ID NO:41)；PA14 60530 9mer，ALGGVMTMV(SEQ ID NO:42)；TMEM161A9mer，ALGGLLTPL(SEQ ID NO:43)。将表达对照TCR(TCR-fluM1，PDB 5euo)的Jurkat细胞用同源9mer“GILGFVFTL”(SEQ ID NO:23)刺激，用于比较。***，p<0.001，通过t检验得出。
图16总结了为表明TMEM161A是非突变肿瘤抗原所进行的分析的结果。左小图：示出了根据癌症基因组图谱(TCGA)项目(泛肺癌病例，n＝1053)的全基因组测序确定的在TMEM161A基因座内所有类型的基因改变的百分比。右小图：具有指示的基因组改变的病例数。
图17A-图17C示意性总结了用于表征TMEM161A特异性CD8+T细胞的实验工作流程。在这些实验中，使用了由GLIPH2预测为携带“S％DGMNTE”(SEQ ID NO:48)基序的来自肿瘤和未累及的肺的TMEM9mer/A02四聚体+分选的T细胞。图17A：通过FACS分选来自NSCLC患者A6的切除的肿瘤和未累及的肺的HLA-A*02/TMEM9mer+CD8+T细胞。制备单细胞悬浮液，并且用抗CD4、CD8、CD3和CD45抗体、活/死标记物AquaZombie、PE缀合的四聚体HLA-A*02/病毒肽(CMV-pp65495-503和EBV-BMLF1280-288)和APC缀合的四聚体HLA-A*02/TMEM9mer染色。根据以下标准将特异性T细胞分选到96孔板上：非双联体、活细胞、CD3+CD45+、HLA-A*02/病毒肽-和HLA-A*02/TMEM9mer+。图17B：示出了来自未累及的肺和肿瘤的如图17A中的四聚体分选的CD8+T细胞的不同CDR3β序列的百分比。柱形中的数字表示分选的细胞的计数。
图18A-图18C示意性总结了所进行的实验的结果，其展现出肿瘤中具有“S％DGMNTE”(SEQ ID NO:48)CDR3β基序的T细胞的频率与肿瘤属性相关(图18A)，在有或没有携带“S％DGMNTE”(SEQ ID NO:48)CDR3β基序的所检测T细胞的情况下来自MD Anderson群组的A02+鳞状细胞肺癌(LUSC)或肺腺癌(LUAD)患者的数量。p值＝5.3x 10-3，通过Fisher精确检验得出。(图18B)分层为具有高(>500)或中等至低(<500)突变计数(n＝34)的来自MDAnderson群组的A02+患者的携带“S％DGMNTE”(SEQ ID NO:48)CDR3β基序的T细胞的总百分比(log10)。
图19A描绘了通过检测携带“S％DGMNTE”序列基序(SEQ ID NO:48)的CDR3β序列分层的MD Anderson NSCLC患者群组的临床数据的分解。图19B示出，具有含有“S％DGMNTE”序列基序(SEQ ID NO:48)的肿瘤浸润性T细胞CDR3β的患者(n＝32)相比于不具有含有“S％DGMNTE”序列基序(SEQ ID NO:48)的肿瘤浸润性T细胞CDR3β的患者(n＝49)的总体存活期(左)或无复发存活期(右)没有差异。
图20A-图20B示意性地总结了显示在健康供体外周血中发现的一些TMEM161A特异性T细胞具有效应性表型的实验结果。图20A：来自用指示的HLA-A*02四聚体从PBMC分选的CD45+CD8+CD3+T细胞(如图5A中)的scRNA-Seq结果的Seurat分析(左)通过UMAP降维方法鉴定出3种主要细胞状态(右)。病毒，fluM1肽GILGFVFTL。图20B：示出了由所鉴定的细胞状态表达的差异性基因的堆叠小提琴图。
图21示意性总结了进一步表征TMEM161特异性CD8+细胞的分析结果。此图示出了通过UMAP对先前公布的NSCLC scRNA-Seq结果的降维(Guo X.等人2018.Nat.Med.24,978)。将来自Guo等人出版物的12,346个分选的T细胞与来自当前研究(Stanford群组)的2,950个分选的T细胞合并进行联合Seurat分析。与以当前研究中鉴定的14种细胞状态着色的来自Stanford群组的细胞相比(右)，来自Zhang团队研究的细胞根据所报告的鉴定的细胞状态着色(左)。*，与当前研究中鉴定的至少一种细胞状态(*，右)基本相似的Zhang团队报告中鉴定的细胞状态(左)。
图22A-图22B总结了所进行的实验的结果，以证明TMEM161A蛋白在多种人癌症上表达。将由来自石蜡包埋切片的超过100个人癌组织和正常组织组成的组织微阵列用抗TMEM161A抗体染色。根据阳性百分比和强度对组织进行手动评分，以确定H得分。在结肠癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、神经内分泌癌和睾丸癌中观察到高水平的TMEM161A表达。示出了癌组织中TMEM161A表达的代表性例子以及通过H得分对TMEM161A表达的量化。
图23A示意性地总结了这样的实验结果，其展现出源自肿瘤的克隆TCR15对共有肿瘤抗原(CLDN2)和来自EBV的病毒抗原具有交叉反应性。示出了用来自以下的9mer对Jukat-TCR细胞的刺激的代表性FACS图：EBV BMLF1基因座“GLCTLVAML”(SEQ ID NO:44)、uniprotNP 001164563.1(CLDN2基因座，LLGTLVAML；SEQ ID NO:45)、XP 016864815.1(SERINC5基因座，YLCTLVAPL；SEQ ID NO:46)和NP 001005209.1(TMEM198基因座，HPVGEASIL；SEQ ID NO:47)。右小图：一式三份的Jurkat-TCR15细胞刺激结果。对照肽：flu M1“GILGFVFTL”(SEQ IDNO:23)。***，p<0.001；**，p<0.01，通过学生t检验得出。
具体实施方式
本公开文本总体上尤其涉及用于诊断、预防和/或治疗健康状况的组合物和方法。更具体地，本文提供了对特定同源抗原具有结合亲和力的新型多肽构建体。本公开文本还提供了可用于产生此类多肽构建体的组合物和方法，以及用于诊断、预防和/或治疗与表达由所述多肽构建体识别的同源抗原的细胞相关的病症的方法。更具体地，还提供了已被工程化以表达如本文公开的多肽构建体并且针对目的细胞(如癌细胞)的重组细胞，如淋巴细胞T细胞。
如下文将更深入地讨论的，本公开文本描述了一种结合生物信息学和抗原筛选以鉴定肺癌中新型共有肿瘤抗原的方法。在一些实施方案中，所公开的方法实施了改进版本的算法GLIPH(以互补位热点进行的淋巴细胞相互作用分组)即GLIPH2(Glanville,J.,等人,Nature,2017.547(7661):第94-98页；和Huang,H.,等人,Nat Biotechnol,2020年10月；38(10):1194-1202)，以在全局水平上推断共有抗原的T细胞特异性。使用来自178名HLA分型肺癌患者的TCR库，GLIPH2鉴定出超过400个被推断为识别在限定HLA背景下的共有肿瘤抗原的特异性组。然后对具有推断的HLA-A*02限制性的那些组进行后续分析，这确定了携带基序“S％DGMNTE”(SEQ ID NO:48)的特定特异性组在抗原鉴定时的优先性。此外，还鉴定了由候选特异性组识别的同源抗原，包括来自人TMEM161A蛋白以及来自EB病毒(EBV)和大肠杆菌的肽。此外，观察到TMEM161A在人肺癌细胞中广泛过度表达。综上所述，本文所述的方法已经应用稳健的方法推断肺癌中的T细胞特异性，以鉴定针对特定肿瘤抗原TMEM161A和病原体的新型类别的交叉反应性T细胞。
如上文所讨论，广泛使用免疫检查点阻断和基于T细胞的免疫疗法来治疗患有实体瘤的患者，需要对癌症中T细胞的特异性具有更深入的了解。然而，尽管使用单细胞测序技术可以获得先进的分析T细胞状态和库的技术，绝大多数肿瘤浸润性T细胞的特异性在所有实体瘤中仍然未知。近年来，先前描述的肿瘤浸润性T细胞的少数特异性包括识别突变抗原、非突变(共有)抗原和病毒抗原的T细胞。在免疫检查点阻断的时代，最近人们曾关注突变的抗原(例如新抗原)。由于新抗原代表一种“改变的自身”抗原类型，识别这类抗原的T细胞已经显示在肿瘤中展现出激活的表型并且应答强烈。非突变肿瘤抗原包括在正常组织对应物中表达的分化抗原(例如黑素瘤相关抗原)，或表达仅限于免疫赦免位点、种系组织或胚胎的自身抗原。已经有许多例子用过继性T细胞疗法靶向这些类型的肿瘤抗原。此外，对病毒(如HPV、EBV和梅克尔细胞多瘤病毒)具有特异性的T细胞也一直是病毒相关癌症研究的焦点。
相比之下，其他类型的T细胞特异性在实体瘤中的作用仍不明确。例如，许多报道描述了肿瘤中存在病毒特异性T细胞，如肺癌中对流感病毒(Flu)或巨细胞病毒(CMV)特异的T细胞。由于没有直接证据表明此类病毒在肺癌或其他实体瘤的发生中起作用，因此人们大多假定它们与肿瘤免疫应答无关，并且认为是“旁邻细胞”。如下文更详细地描述，本文所述的实验数据已经从癌细胞和病原体中鉴定出一类特异性CD8+T细胞及其交叉反应抗原。这一发现与维持广泛的T细胞库以抵御病毒和其他病原体可能依赖于交叉反应性的假设一致。在健康个体的外周血中检测到在胸腺中被修整但未克隆缺失(这有可能避免对病毒和其他病原体的免疫“盲点”)的对自身抗原特异的T细胞。由于癌细胞在组织学上类似于其来源组织，并且可表达自身抗原，我们考虑了一些肿瘤浸润性T细胞确实对普遍表达的非突变自身抗原具有特异性的可能性。肿瘤微环境中T细胞特异性的全面谱分析和深度表征提供了超越表型表征的对T细胞应答的基本理解，并且对免疫系统如何识别肿瘤、正常组织和病原体提供了重要见解。
大多数肿瘤浸润性T细胞仍是未知的，这主要是由于缺乏在高度多态性人白细胞抗原(HLA)等位基因背景下分析不同TCR库的工具。例如，虽然下一代测序技术使大量TCR的测序变得相对简单和便宜，但是主要问题围绕着如何能够分析这些非常大的库。
这是因为对于相同的肽MHC特异性，可能存在成百上千个可能的TCR序列。GLIPH算法(Glanville等人,2018)和最近的改进版本(GLIPH2；Huang等人,Nat Biotechnol,2020年8月；38(10):1194-1202)先前已经被开发用于系统地分析T细胞的抗原特异性并且允许仅基于CDR3β序列推断T细胞特异性。这些算法快速分析大量序列，并且将它们解析为可以预测可能的MHC等位基因限制性的TCR特异性组(也称为特异性组)。如下文更详细描述的，GLIPH2用于分析来自178名患有可手术切除疾病的HLA分型非小细胞肺癌(NSCLC)患者的778,938个不同的TCRβCDR3序列(称为CDR3β序列)。最初共获得4,300个高置信特异性组。其中，与未累及的肺组织相比，449个在肿瘤中发现富集。还发现，患者体内所有肿瘤浸润性T细胞库的高达35％被推断具有共有抗原特异性。随后，通过以下方式验证选择的特异性组：鉴定被预测为在给定HLA背景下识别已知病毒抗原的新型克隆型，并且通过实验确认这些预测。接下来，优先化在肿瘤中优先富集并且被推断为在HLA-A*02背景下识别抗原的特异性组，然后用酵母展示文库鉴定同源抗原。还发现，属于此肿瘤富集特异性组的TCR识别新型肿瘤抗原TMEM161A。值得注意的是，还发现此TMEM161A特异性TCR与来自病原体EBV和大肠杆菌的类似肽具有交叉反应。这一发现表明，一些位于肿瘤中的病原体特异性T细胞可以与癌症中过度表达的抗原发生交叉反应。在表型方面，这些交叉反应性CD8+T细胞采用效应细胞状态，表达在激活的NK细胞上发现的一些基因，但是不表达耗竭标记物PD-1或CD39。总之，我们提供了直接证据说明浸润肿瘤的T细胞可能会在识别肿瘤抗原和源自病原体的抗原方面发生交叉反应。
如下文更详细描述的，本文公开的实验数据建立了一种新型的方法用于发现共有肿瘤抗原和识别所述共有肿瘤抗原的T细胞。具体地，作为新方法的非限制性例证，已经进行了实验鉴定出一组与肺癌相关的肿瘤抗原(TMEM161A)、病毒EBV抗原LMP2和大肠杆菌EntS肽交叉反应的TCR，这进而为病原体如何影响对癌症的适应性免疫系统应答提供了重要视角。
在靶癌(例如肺癌)中发现新型的共有肿瘤抗原的方法的非限制性工作流程通常从全面分析人肺癌中的T细胞特异性情形开始。将生物信息学工具GLIPH2用于分析来自178名患者的778,938个CDR3β序列并且建立449个肿瘤富集特异性组。鉴定了一种在HLA-A*02背景下对共有肿瘤抗原具有推断的特异性的TCR，并且筛选了HLA-A*02酵母展示文库以鉴定其同源抗原。本文公开的用于T细胞抗原鉴定的平台将两种技术结合在一起。首先，GLIPH2算法用对HLA限制性的准确预测进行全局T细胞特异性的无偏推断。关于GLIPH2算法的更多信息可以在Huang等人,Nat Biotechnol,2020年8月；38(10):1194-1202中找到，将其内容通过引用明确并入。将共有特异性和HLA背景的推断用于优先化用于下游抗原发现的疾病相关TCR候选物。其次，酵母展示文库的丰富多样性极大地促进了抗原鉴定，并且允许发现交叉反应性抗原。与构建在哺乳动物细胞中的其他MHC/肽文库不同，下文所述的实验使用的酵母展示文库包含了多于108个随机排列的肽序列。先前，HLA限制性的不确定性限制了使用酵母展示文库进行抗原鉴定的成功。本文所述的研究通过在筛选酵母文库的抗原之前使用GLIPH2算法推断候选TCR的正确HLA背景来克服这一限制。
如上文所讨论，揭示肿瘤浸润性T细胞的特异性对于理解T细胞内在因素如何影响肿瘤免疫系统相互作用以及如何影响旨在利用针对癌症的T细胞应答的疗法具有重要意义。补充了目前对T细胞耗竭作为肿瘤免疫逃避机制的理解，本文所述的研究表明，对自身抗原的T细胞特异性也起作用。在不受任何特定理论限制的情况下，认为对自身抗原的T细胞特异性部分解释了为什么先前的研究观察到肿瘤浸润性T细胞对自体肿瘤的反应性很低。如下文更详细描述的，已经鉴定了一个TCR特异性组识别NSCLC中过度表达的新型共有肿瘤抗原TMEM161A的能力。值得注意的是，观察到尽管TMEM161A特异性T细胞在肿瘤中有很高的呈现，但是其对自身抗原TMEM161A(与交叉反应抗原LMP2和EntS相比)是相对较弱的应答者。如实施例部分所示，在大量表达TMEM161A蛋白的肿瘤中一致地鉴定出TMEM161A特异性T细胞，这表明在测试的患者中没有消除表达抗原的肿瘤细胞。总之，这些结果表明，对一些非突变肿瘤抗原具有特异性的T细胞本质上是弱应答者。
在本文所述的研究中，还鉴定了能够识别肿瘤抗原TMEM161A以及来自EBV LMP2和大肠杆菌EntS的源自病原体的抗原的CD8+T细胞。这一发现与这样的观察结果一致，即自身特异性T细胞存在于外周(并且在胸腺中没有缺失)以维持能够通过交叉反应对外来病原体作出应答的多种多样的TCR库。然而，这些T细胞是否在抗肿瘤免疫应答中起着重要作用在很大程度上仍不清楚。下文所述的scRNA-seq数据表明，肿瘤中的HLA-A*02/TMEM9mer特异性T细胞展现出差异表达EOMES和KLRG1的效应性表型(而不是耗竭状态)。CD39表达的缺乏与先前报道的肿瘤中发现的“旁邻细胞”病原体特异性T细胞的表型一致。本文所述的实验数据表明，肿瘤内T细胞对肿瘤抗原和源自病原体的抗原的特异性并不相互排斥。除了将肿瘤中的T细胞特异性分类为肿瘤特异性或病原体特异性之外，本文所述的研究还提出了识别肿瘤抗原和源自病原体的抗原的第三类交叉反应性T细胞。这些交叉反应性T细胞先前还没有被认识到。
此外，免疫暴露于环境病原体可影响对肿瘤的免疫应答这一概念已经于先前被理论化，但对其机制了解得很少。早在19世纪末，William Coley就率先用一种称为科利毒素(Coley’s toxin)的混合细菌疫苗治疗癌症患者，并且取得了一些成功。在现代，卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)被常规用作早期膀胱癌的免疫疗法。最近，肠道微生物群系已经被证明是癌症中免疫治疗反应的关键决定因素。在胰腺癌中，在手术后存活时间最长的患者中观察到一种独特的微生物群系。虽然这些不同例子的作用机制可能涉及先天免疫系统的细胞类型，但是识别肿瘤和病原体两者的交叉反应性T细胞可能起着至关重要的作用。此外，由于肺部暴露于呼吸道病原体，预期这些抗原与肿瘤抗原之间的交叉干扰(cross talk)对于理解对肺癌的适应性免疫应答特别重要。
本文所述的实验结果表明，将肿瘤中的T细胞特异性分类为肿瘤特异性或病原体特异性旁邻细胞并不能完全覆盖T细胞抗原识别的所有可能性。如下文更详细描述的，肿瘤中的T细胞也可以对肿瘤抗原和源自病原体的抗原二者发生交叉反应，因此提供了对肿瘤中T细胞特异性的更细微理解。所公开的用于发现这种特定类别的TCR的方法还展示了用于发现另外的肿瘤抗原的新型方法。这是因为对交叉反应性T细胞如何识别肿瘤抗原和源自病原体的抗原的深入了解可以为针对癌症的细胞疗法、检查点疗法和疫苗接种策略的进展提供信息。本文公开的实验数据表明，个体遭遇环境病原体可影响针对癌症的适应性免疫应答，这一概念可用于改善患者的免疫疗法。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或用辞旨在具有本公开文本所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情形中，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括此类定义不一定应当被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。本文描述或提及的许多技术和程序是本领域技术人员良好理解的并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以采用。
除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“一种细胞”包括一种或多种细胞，包括其混合物。本文中使用“A和/或B”来包括所有的以下替代形式：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。
如本文所用，术语“约”具有其通常的含义，即大致。如果根据上下文原本不清楚近似程度，则“约”意指在提供的值的正负10％以内，或四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下包括所提供的值。在提供范围的情况下，所述范围包括边界值。
如本文所用，术语“施用”(“administration”和“administering”)是指通过包括但不限于以下施用途径来递送生物活性组合物或配制品：口服、静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、肌肉内和外用施用、或其组合。所述术语包括但不限于由医学专业人员进行的施用和自我施用。
术语“细胞”、“细胞培养物”、“细胞系”不仅指特定的主题细胞、细胞培养物或细胞系，而且指这种细胞、细胞培养物或细胞系的后代或潜在后代，而不考虑培养中的转移或传代次数。应理解，并非所有后代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响(例如，甲基化或其他表观遗传修饰)而在后代中发生，使得后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在如本文所用的术语的范围内，只要后代保留与原始细胞、细胞培养物或细胞系相同的功能即可。
本公开文本的主题构建体、核酸、细胞或组合物的术语“有效”、“治疗有效”或“药学有效”量或数量总体上是指对于构建体、核苷酸、细胞或组合物要足以实现相对于不存在组合物的情况下所陈述的目的(例如，实现其施用效果，预防或治疗疾病，抑制微生物感染，或减少健康状况的一种或多种症状)的量或数量。有效量或数量的例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量或数量，其也可以称为治疗有效量。一种或多种症状的“减轻”总体上意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或一种或多种症状的消除。构建体、核酸、细胞或组合物的确切量或数量将取决于治疗的目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；和Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,第20版,2003,Gennaro编,Lippincott,Williams&Wilkins)。
如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的物理或功能连接，这允许它们以其预期方式操作。例如，当在核酸构建体中或在工程化响应元件中的本文所述的正交DNA靶序列或启动子序列的背景下使用时，术语“可操作地连接”意指正交DNA靶序列和启动子是框内的并且在远离编码蛋白质或RNA的目的多核苷酸的适当空间和距离内，以允许通过转录因子或RNA聚合酶的相应结合对转录的影响。应当理解，可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。
在多肽构建体的背景下，“可操作地连接”是指氨基酸序列(例如，不同的区段、部分或结构域)之间的物理连接(例如，直接或间接连接)以提供构建体的所述活性。在本公开文本中，本公开文本的构建体的区域或结构域可以可操作地连接以保留细胞中构建体的适当折叠、加工、靶向、表达、结合和其他功能特性。除非另有说明，否则本公开文本的构建体的区段、部分和结构域可操作地彼此链接。本文公开的构建体的可操作连接的区段、部分和结构域可以是连续的或非连续的(例如，通过接头彼此连接)。
在两个或更多个核酸或蛋白质的背景下，如本文所用的术语“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸(例如，当在比较窗口或指定区域上比较和比对以获得最大对应时，约60％序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)，如使用采用如下所述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查所测量。参见例如，NCBI网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。此定义也指或可以应用于查询序列的互补体。此定义包括通过BLAST算法进行的序列比较，其中所述算法的参数被选择以给出在各自参考序列的全长中各自序列之间的最大匹配。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。可以在长度为至少约20个氨基酸或核苷酸的区域上，或在长度为10-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或在给定序列的整个长度上计算序列同一性。序列同一性可以使用公开的技术和广泛可用的计算机程序如GCS程序包(Devereux等人,Nucleic Acids Res(1984)12:387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人,J Mol Biol(1990)215:403)来计算。可以使用序列分析软件以所述软件的默认参数来测量序列同一性，所述序列分析软件如University of Wisconsin Biotechnology Center(威斯康星州麦迪逊，大学大道1710号，53705)的Genetics Computer Group的序列分析软件包。可以合适地用于确定氨基酸序列的相似性或同一性的另外的方法包括依赖于并入来自Rosetta的结构预测得分的位置特异性结构评分矩阵(P3SM)的那些方法，以及基于长度归一化编辑距离的那些方法，如先前描述于Setcliff等人,Cell Host&Microbe 23(6),2018年5月中。
如本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指提供用于向受试者施用一种或多种目的化合物的药学上可接受的载体、添加剂或稀释剂的任何合适的物质。因此，“药学上可接受的赋形剂”可以涵盖称为药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的添加剂和药学上可接受的载体的物质。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括但不限于与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充活性化合物(例如，抗生素和另外的治疗剂)也可以并入组合物中。
当与细胞、核酸、蛋白质或载体一起使用时，术语“重组的”表明所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过人干预而改变或产生，如例如已经通过实验室方法进行修饰或者是实验室方法的结果。因此，例如，重组蛋白质和核酸包括通过实验室方法产生的蛋白质和核酸。重组蛋白质可以包括在所述蛋白质的天然(非重组或野生型)形式内未发现的氨基酸残基，或者可以包括已经被修饰例如被标记的氨基酸残基。所述术语可以包括对肽、蛋白质或核酸序列的任何修饰。这样的修饰可以包括以下：对肽、蛋白质或核酸序列的任何化学修饰，包括对一个或多个氨基酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的任何化学修饰；肽或蛋白质中的一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代；融合蛋白(例如，包含抗体片段的融合蛋白)的产生；以及核酸序列中一个或多个核酸的添加、缺失和/或取代。术语“重组”在关于细胞使用时并非意图包括天然存在的细胞，但是涵盖已经被工程化/修饰以包括或表达在细胞未被工程化/修饰时不会存在于所述细胞中的多肽或核酸的细胞。
如本文所用，“受试者”或“个体”包括动物，如人(例如，人个体)和非人动物。在一些实施方案中，“受试者”或“个体”是在医生的护理下的患者。因此，所述受试者可以是患有、有风险患上或怀疑患有目的疾病(例如，癌症)和/或疾病的一种或多种症状的人患者或个体。所述受试者也可以是在诊断时或之后被诊断为具有目的病症的风险的个体。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物(例如，啮齿动物(例如小鼠)、非人灵长类动物和其他哺乳动物，例如像绵羊、狗、牛、鸡)和非哺乳动物(如两栖动物、爬行动物等)。
术语“载体”在本文中用于指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子或序列。转移的核酸分子通常与载体核酸分子连接，例如插入所述载体核酸分子中。通常，当与适当的控制元件缔合时，载体能够复制。术语“载体”包括克隆载体和表达载体以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包含调节区从而能够在体外和/或体内表达DNA序列和片段的载体。载体可以包含引导细胞中自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。在一些实施方案中，载体是基因递送载体。在一些实施方案中，载体用作基因递送媒介物以将基因转移至细胞中。
应理解，本文描述的本公开文本的方面和实施方案包括“包含(comprising)方面和实施方案”，“由方面和实施方案组成(consisting)”，以及“基本上由方面和实施方案组成(consisting essentially of)”。
如本文所用，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。如本文所用，“由……组成”排除在要求保护的组合物或方法中未指定的任何要素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由……组成”并不排除不会实质性地影响要求保护的组合物或方法的基本和新颖特征的材料或步骤。术语“包含”在本文中的任何叙述，特别是在组合物的组分的描述中或在方法的步骤的描述中，被理解为涵盖基本上由所列举组分或步骤组成以及由所列举组分或步骤组成的那些组合物和方法。
在提供值范围的情况下，本领域普通技术人员应理解，本文公开的所有范围涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以被容易地识别为充分描述相同的范围并使相同的范围能够分解成至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围都可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包括所列举的数字，并且是指可以随后分解成如上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员应理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个制品的组是指具有1、2或3个制品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组等等。某些范围在本文中通过前面带有术语“约”的数值呈现。本文中使用术语“约”是为了对其后的精确数字以及接近或近似所述术语后的数字的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在呈现它的上下文中提供具体列举的数字的基本等效形式的数字。
呈现标题(例如，(a)、(b)、(i)等)只是为了便于阅读说明书和权利要求。说明书或权利要求中的标题的使用不要求步骤或要素按字母或数字顺序或它们呈现的顺序进行。
应了解，为明确起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征还可以分开地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的所有组合确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种组合均单独地和明确地公开一样。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合也确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种这样的子组合均单独地和明确地在本文中公开一样。
T细胞受体
TCR是免疫球蛋白超家族的一种异二聚体细胞表面蛋白，与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白缔合。TCR和抗体是进化为识别不同种类的抗原(配体)的分子。TCR是这样的抗原特异性分子，其负责识别在抗原呈递细胞(APC)或任何有核细胞(例如，除血细胞之外的体内的所有人细胞)表面上的主要组织相容性复合体(MHC)产物的背景下呈递的抗原肽。相比之下，抗体通常识别可溶性或细胞表面抗原，并且不需要MHC呈递抗原。此系统经由其TCR赋予T细胞识别由细胞表达的全部细胞内抗原(包括病毒和细菌蛋白)阵列的潜在能力，所述细胞内抗原在细胞内被加工成短肽，与细胞内MHC分子结合，并且以肽-MHC复合物(pepMHC)的形式被递送至表面。此系统实际上允许任何外来蛋白(例如，突变的癌抗原或病毒蛋白)或异常表达的蛋白作为T细胞的靶标。
总体上，TCR以αβ和γδ的形式存在，这两种形式在结构上相似，但是在解剖学定位和可能的功能上非常不同。天然异二聚体αβTCR的细胞外部分通常由两条多肽(α链和β链)组成，每条多肽都有膜近端恒定结构域和膜远端可变结构域。恒定结构域和可变结构域中的每一个均包括链内二硫键。可变结构域含有高度多态的环，类似于抗体中的嵌入框架序列中的互补决定区(CDR)，其中一个是名为CDR3的超变区。有几种类型的α链可变(Vα)区和几种类型的β链可变(Vβ)区，它们的区别在于其框架、CDRl和CDR2序列以及部分定义的CDR3序列。TCR基因疗法的使用克服了一些当前的障碍。例如，它可以为患者自身的T细胞配备所需的特异性，并且在短时间内产生足够数量的T细胞，避免其耗竭。此外，TCR可以被转导到中央记忆T细胞或具有干细胞特征的T细胞中，这可以确保转移后更好的持久性和功能。此外，可以将TCR工程化T细胞输注到化学疗法或放疗导致淋巴细胞减少的癌症患者体内，从而实现有效的移植，但是阻抑免疫抑制。
本公开文本的组合物
如下文更详细描述的，本公开文本的一方面涉及对特定同源抗原具有结合亲和力的新型多肽构建体。还提供了编码此类多肽构建体的重组核酸，以及经工程化以表达如本文公开的多肽构建体并针对目的细胞(如癌细胞)的重组细胞。
A.本公开文本的构建体
在一方面，本文提供了多种包括至少一个互补决定区(CDR)的构建体，所述至少一个互补决定区与选自SEQ ID NO:1-14、26-33和48-49的序列具有至少70％序列同一性。
所公开的构建体的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个、至少两个或至少三个与选自SEQ IDNO:1-14和48的序列具有至少70％序列同一性的CDR。在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个、至少两个或至少三个与SEQ ID NO:6的序列具有至少70％序列同一性的CDR。在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个、至少两个或至少三个与SEQ ID NO:48的序列具有至少70％序列同一性的CDR。在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个与选自SEQ ID NO:1-14和48的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的CDR。在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个与SEQ ID NO:6的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的CDR。在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个与SEQ ID NO:48的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的CDR。
在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个、至少两个或至少三个与选自SEQID NO:26-33和49的序列具有至少70％序列同一性的CDR。在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个、至少两个或至少三个与SEQ ID NO:30的序列具有至少70％序列同一性的CDR。在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个、至少两个或至少三个与SEQ ID NO:49的序列具有至少70％序列同一性的CDR。在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个与选自SEQ ID NO:26-33的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的CDR。在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个与SEQ ID NO:30的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的CDR。在一些实施方案中，所述构建体包括至少一个与SEQ IDNO:49的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的CDR。
本文公开的构建体的CDR序列可以被修饰，例如突变。CDR序列修饰的非限制性例子包括不多于五个、不多于四个、不多于三个、不多于两个或不多于一个氨基酸残基的取代、缺失、添加或插入。在一些实施方案中，本文公开的构建体的至少一个CDR包括与选自SEQ ID NO:1-14和48的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，本文公开的构建体的至少一个CDR包括与SEQ ID NO:6的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，本文公开的构建体的至少一个CDR包括与SEQ ID NO:48的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。
在一些实施方案中，本文公开的构建体的至少一个CDR包括与选自SEQ ID NO:26-33和49的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，本文公开的构建体的至少一个CDR包括与SEQ ID NO:30的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，本文公开的构建体的至少一个CDR包括与SEQ ID NO:49的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。
在一些实施方案中，所述至少一个CDR包括与选自SEQ ID NO:1-14和48的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述至少一个CDR包括与SEQ ID NO:6的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述至少一个CDR包括与SEQ IDNO:48的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述至少一个CDR包括与选自SEQ ID NO:26-33和49的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述至少一个CDR包括与SEQ ID NO:30的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述至少一个CDR包括与SEQ ID NO:49的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。
在一些实施方案中，本文公开的构建体能够与表位结合，所述表位包括与选自SEQID NO:15-22和44-45的序列具有至少70％序列同一性的序列。本领域普通技术人员将理解，结合亲和力通常可以用作两个分子(例如，抗体或其功能性片段与抗原)之间非共价相互作用的强度的量度。在一些情形中，结合亲和力可以用于描述单价相互作用(内在活性)。两个分子之间的结合亲和力可以通过测定解离常数(KD)来定量。反过来，可以通过使用例如表面等离子体共振(SPR)方法(Biacore)测量复合物形成和解离的动力学来测定KD。对应于单价复合物的缔合和解离的速率常数分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过等式KD＝kd/ka与ka和kd相关联。解离常数的值可以通过熟知的方法直接测定，并且甚至可以通过Caceci等人(1984,Byte 9:340-362)提出的方法计算复杂混合物的解离常数的值。例如，KD可以使用双滤膜硝酸纤维素滤膜结合测定(如Wong和Lohman(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5428-5432)所公开的测定)来确立。用于评价本公开文本的工程化抗体对靶抗原的结合能力的其他标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析以及本文别处例示的其他测定。所述抗体的结合动力学和结合亲和力也可以通过本领域已知的标准测定如表面等离子体共振(SPR)例如通过使用BiacoreTM系统或KinExA来评估。在一些实施方案中，本文公开的构建体对靶抗原的结合亲和力可以通过Frankel等人,Mol.Immunol,16:101-106,1979所述的斯卡查德(Scatchard)方法评估。
在本公开文本的一些实施方案中，如本文公开的构建体能够结合表位，所述表位包括与选自SEQ ID NO:15-22和44-45的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在本公开文本的一些实施方案中，如本文公开的构建体能够结合表位，所述表位包括与SEQ ID NO:17的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在本公开文本的一些实施方案中，如本文公开的构建体能够结合表位，所述表位包括与SEQ IDNO:19的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在本公开文本的一些实施方案中，如本文公开的构建体能够结合表位，所述表位包括与SEQ ID NO:21的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在本公开文本的一些实施方案中，如本文公开的构建体能够结合表位，所述表位包括与SEQ ID NO:22的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在本公开文本的一些实施方案中，如本文公开的构建体能够结合表位，所述表位包括与SEQ ID NO:44的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在本公开文本的一些实施方案中，如本文公开的构建体能够结合表位，所述表位包括与SEQ ID NO:45的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述表位包括与选自SEQ ID NO:15-22和44-45的序列具有100％同一性并且进一步其中不多于五个、不多于四个、不多于三个、不多于两个或不多于一个氨基酸残基被不同氨基酸残基取代的序列。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:17具有100％同一性并且进一步其中不多于五个、不多于四个、不多于三个、不多于两个或不多于一个氨基酸残基被不同氨基酸残基取代的序列。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:19具有100％同一性并且进一步其中不多于五个、不多于四个、不多于三个、不多于两个或不多于一个氨基酸残基被不同氨基酸残基取代的序列。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:21具有100％同一性并且进一步其中不多于五个、不多于四个、不多于三个、不多于两个或不多于一个氨基酸残基被不同氨基酸残基取代的序列。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:22具有100％同一性并且进一步其中不多于五个、不多于四个、不多于三个、不多于两个或不多于一个氨基酸残基被不同氨基酸残基取代的序列。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:44具有100％同一性并且进一步其中不多于五个、不多于四个、不多于三个、不多于两个或不多于一个氨基酸残基被不同氨基酸残基取代的序列。
在一些实施方案中，所述表位包括与选自SEQ ID NO:15-22和44-45的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:17具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:19具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:21具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:22具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:44具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:45具有100％同一性的序列，其中所述序列中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与选自SEQ ID NO:15-22和44-45的序列具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:17具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:19具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:21具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:22具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQ ID NO:44具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述表位包括与SEQID NO:45具有100％同一性的序列，其中所述序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。
在一些实施方案中，本公开文本的构建体可以是(a)TCR；(b)抗体；或(c)(a)或(b)的功能性衍生物或片段。随后本领域技术人员将容易理解，术语“其功能性片段”或“其功能性衍生物”是指与衍生所述片段或衍生物的野生型分子具有共同的定量和/或定性生物活性的分子。例如，抗体的功能性片段或功能性衍生物是这样的，其保留了与衍生所述功能性片段或功能性衍生物的抗体基本上相同的结合相同表位的能力。例如，能够与表位结合的抗体可以在N末端和/或C末端处截短，并且使用本领域技术人员已知的测定评估其表位结合活性的保留。
在一些实施方案中，所述构建体是包括彼此共价连接的TCRα链和TCRβ链的TCR构建体。本公开文本提供了单链TCR构建体和多链TCR构建体两者。在一些实施方案中，本公开文本的TCR构建体可以作为单链α或β、或γ和δ分子或可替代地作为由α和β链两者或γ和δ链两者构成的双链构建体提供。
在一些实施方案中，本公开文本的TCR构建体可以作为单链TCR(scTCR)提供。scTCR可以包括第一TCR链(例如，α链)的可变区的多肽和整个(全长)第二TCR链(例如，β链)的多肽，或反之亦然。在一些实施方案中，所述多肽彼此直接连接。在一些实施方案中，所述scTCR可以任选地包含将两个或更多个多肽连接在一起的一个或多个接头。在一些实施方案中，所述接头可以是合成化合物接头，例如像化学交联剂。市场上可获得的合适的交联剂的非限制性例子包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺酒石酸酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)和双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)。
在一些实施方案中，所述接头可以是肽接头，其将两条单链连接在一起，如本文所述。在一些实施方案中，肽接头序列的长度和氨基酸组成可以被优化以改变多肽相对于彼此的取向和/或邻近度，以实现本文所公开的构建体(例如，TCR构建体)的期望活性。
根据本公开文本的构建体还可以以包括至少两个scTCR分子的多聚体复合物的形式提供，其中所述scTCR分子各自与至少一个生物素部分或其他相互连接的分子/接头融合，并且其中所述scTCR通过生物素-链霉亲和素相互作用互连，以允许形成所述多聚体复合物。本领域中已知的用于生成多聚体TCR的类似方法也被考虑并且包括在本公开文本中。因此，还提供了包含多于两个的本公开文本的scTCR的更高阶多聚体复合物。
制备融合多肽的合适方法是本领域已知的，并且包括例如重组方法。在一些实施方案中，本公开文本的构建体、TCR(及其功能性片段和功能性衍生物)和多肽可以被表达为包括连接α链和β链和/或连接γ链和δ链的接头肽的单个蛋白质。在这方面，本公开文本的构建体、TCR(及其功能性片段和功能性衍生物)和多肽包括本公开文本的TCR可变区的氨基酸序列，并且可以进一步包括接头肽。在一些实施方案中，接头肽可有利地促进构建体或TCR(包括其功能性片段和功能性衍生物)在宿主细胞中的表达。原则上，接头肽可以包含任何合适的氨基酸序列。用于单链TCR构建体的接头序列是本领域熟知的。在一些实施方案中，这种单链构建体可以进一步包含一个或两个恒定结构域序列。在宿主细胞表达包括接头肽的构建体时，接头肽也可能被切割，从而产生分离的α链和β链以及分离的γ链和δ链。
在一些实施方案中，本公开文本的TCR构建体包括至少一个TCRα或γ和/或TCRβ或δ可变结构域。通常，它们包括TCRα可变结构域和TCRβ可变结构域两者，可替代地包括TCRγ可变结构域和TCRδ可变结构域两者。在一些实施方案中，TCR构建体包括αβ/γδ异二聚体或可以呈单链形式。在一些实施方案中，为了用于过继疗法，可以(例如)转染作为具有胞质结构域和跨膜结构域的全长链的αβ或γδ异二聚体TCR。如果需要，可以在相应的恒定结构域的残基之间存在引入的二硫键。
在一些实施方案中，本公开文本的TCR构建体作为单链α或β、或γ和δ分子或可替代地作为由α和β链两者或γ和δ链两者构成的双链构建体提供。因此，在一些实施方案中，所述TCR构建体是如下单链TCR构建体，所述单链TCR构建体在其β链中包括与选自SEQ IDNO:1-14、26-33和48-49的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的CDR3β。在另外的或可替代的实施方案中，TCR构建体可以进一步包括CDRl和/或CDR2结构域序列。在一些实施方案中，本公开文本的TCR构建体包括至少一个、优选全部三个CDR序列CDRl、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，本公开文本的TCR构建体作为由α和β链两者或γ和δ链两者构成的双链构建体提供。因此，在一些实施方案中，本公开文本的TCR构建体作为包含α和β链两者的双链构建体提供，其中其β链包括与选自SEQ ID NO:1-14、26-33和48-49的序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的CDR3β。在一些实施方案中，TCR构建体在其α链中进一步包括CDR3α序列。在一些实施方案中，所述CDR3α序列与SEQ ID NO:24具有至少70％序列同一性。在一些实施方案中，所述CDR3α序列与SEQ IDNO:24具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性。在一些实施方案中，所述CDR3α包括与SEQ ID NO:24的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述CDR3α序列与SEQ ID NO:24的序列具有至少100％序列同一性，并且进一步包括SEQ ID NO:24中的被不同氨基酸残基取代的一个、两个、三个或四个氨基酸残基。
如上所概述，在一些实施方案中，可以在特异性结合本文所述的抗原的抗体构建体或其功能性片段的框架中提供本公开文本的构建体。抗体构建体可以是本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。例如，抗体构建体可以是任何同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗体构建体可以是单克隆的或多克隆的。抗体构建体可以是天然存在的抗体，例如从哺乳动物例如人细胞分离和/或纯化的抗体。可替代地，抗体构建体可以是基因工程化抗体，例如人源化抗体或嵌合抗体。抗体构建体可以呈单体或聚合物形式。在一些实施方案中，本文公开的构建体是选自抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、单结构域抗体(sdAb)、VH结构域、VL结构域，VHH结构域、双抗体或其任一个的功能性片段的抗体构建体。
B.核酸
在一方面，本文提供了包含编码本公开文本的构建体的核苷酸序列的各种核酸分子，包括含有这些核酸分子的表达盒和表达载体，所述这些核酸分子与异源核酸序列(例如允许在宿主细胞或离体无细胞表达系统中体内表达构建体的调节序列)可操作地连接。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且是指RNA分子和DNA分子两者，包括包含以下的核酸分子：cDNA、基因组DNA、合成DNA、以及含有核酸类似物的DNA或RNA分子。核酸分子可以是双链或单链的(例如，有义链或反义链)。核酸分子可包含非常规或经修饰的核苷酸。如本文所用的术语“多核苷酸序列”和“核酸序列”可互换地指多核苷酸分子的序列。本文公开的多核苷酸和多肽序列使用如37CFR§1.82)中所述的对于核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写显示，所述规定通过引用并入WIPO标准ST.25(1998)附录2的表1-表6。
本公开文本的核酸分子可以是任何长度的核酸分子，包含通常在约0.5Kb与约50Kb之间，例如在约0.5Kb与约20Kb之间、在约1Kb与约15Kb之间、在约2Kb与约10Kb之间，或在约5Kb与约25Kb之间，例如在约10Kb与15Kb之间、约15Kb与约20Kb之间、约5Kb与约20Kb之间、约5Kb与约10Kb之间，或约10Kb与约25Kb之间的核酸分子。在一些实施方案中，本公开文本的核酸分子在约1.5Kb与约50Kb之间、在约5Kb与约40Kb之间、在约5Kb与约30Kb之间、在约5Kb与约20Kb、或在约10Kb与约50Kb之间，例如在约15Kb至30Kb之间、在约20Kb与约50Kb之间、在约20Kb与约40Kb之间、在约5Kb与约25Kb之间、或在约30Kb与约50Kb之间。
在本文公开的一些实施方案中，本公开文本的核酸分子包括编码包括至少一个互补决定区(CDR)的构建体的核苷酸序列，所述至少一个互补决定区与选自SEQ ID NO:1-14、26-33和48-49的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述构建体能够与包括与选自SEQ IDNO:15-22和44-45的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的表位结合。在一些实施方案中，所述构建体是单链构建体或双链构建体。在一些实施方案中，所述构建体选自：(a)TCR；(b)抗体；和(c)(a)或(b)的功能性衍生物或片段。在一些实施方案中，所述构建体是包括彼此共价连接的TCRα链和TCRβ链的TCR构建体。在一些实施方案中，所述构建体是在其β链中包括与选自SEQ ID NO:1-14、26-33和48-49的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3β的TCR构建体。在一些实施方案中，所述构建体在其α链中进一步包括CDR3α序列。在一些实施方案中，所述CDR3α与SEQ ID NO:24的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述CDR3α序列与SEQ ID NO:24的序列具有至少100％序列同一性，并且进一步包括SEQ ID NO:24中的被不同氨基酸残基取代的一个、两个、三个或四个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述核苷酸序列被并入表达盒或表达载体中。应理解，表达盒通常包含遗传物质的构建体，所述构建体含有编码序列和足够的调控信息以引导编码序列在体内和/或离体的受体细胞中恰当转录和/或翻译。通常，可以将所述表达盒插入用于靶向期望的宿主细胞的载体中和/或个体中。因此，在一些实施方案中，本公开文本的表达盒包含：如本文公开的构建体的编码序列，所述编码序列可操作地连接至表达控制元件如启动子，以及任选的影响编码序列转录或翻译的其他核酸序列中的任一个或组合。
在一些实施方案中，所述核苷酸序列被并入表达载体中。本领域技术人员将理解，术语“载体”通常是指如下重组多核苷酸构建体，其被设计用于在宿主细胞之间转移并且可用于转化的目的，例如将异源DNA引入宿主细胞中。因此，在一些实施方案中，所述载体可以是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，可以在其中插入另一个DNA区段以引起插入区段的复制。在一些实施方案中，所述表达载体可以是整合载体。
在一些实施方案中，所述表达载体可以是病毒载体。如本领域技术人员将理解的，术语“病毒载体”广泛用于指包含衍生自病毒的核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)或指介导核酸转移的病毒颗粒，所述衍生自病毒的核酸元件典型地有助于将核酸分子转移或整合到细胞的基因组中。病毒颗粒将典型地包括各种病毒组分，并且有时还包括除了一种或多种核酸以外的宿主细胞组分。术语病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或者指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要源自病毒的结构性和/或功能性遗传元件。在一些实施方案中，所述病毒载体是杆状病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要源自逆转录病毒的结构性和功能性遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”是指含有包含主要源自慢病毒(为逆转录病毒的属)的结构性和功能性遗传元件或其部分(包括LTR)的病毒载体或质粒。
因此，本文还提供了含有编码本文公开的任何构建体的核酸分子中的一个或多个核酸分子的载体、质粒或病毒。所述核酸分子可以包含在载体内，所述载体能够引导所述核酸分子在例如已用所述载体转化/转导的细胞中表达。用于真核细胞和原核细胞的合适载体是本领域已知的，并且是可商购的或容易由技术人员制备的。
可以经由常规转化或转染技术将DNA载体引入真核细胞中。可以在Sambrook等人(2012年，同上)和其他标准分子生物学实验室手册中找到用于转化或转染细胞的合适方法，如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载(scrape loading)、弹道引入、核穿孔、流体动力冲击、和感染。
可以在本公开文本中使用的病毒载体包括例如杆状病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒、猿猴病毒40(SV40)和牛乳头瘤病毒载体(参见例如，Gluzman(编),Eukaryotic Viral Vectors,CSH Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.)。例如，如本文公开的嵌合受体可以在真核细胞如哺乳动物细胞(例如，COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞)中产生。这些细胞可从许多来源获得，包括美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)。在选择表达系统时，应注意确保组分彼此相容。技术人员或普通技术人员能够做出这样的决定。另外，如果在选择表达系统时需要指导，则技术人员可以查询P.Jones,“Vectors:Cloning Applications”,John Wiley and Sons,NewYork,N.Y.,2009)。
所提供的核酸分子可以含有天然存在的序列，或与天然存在的那些序列不同，但是由于遗传密码的简并性而编码相同多肽(例如，抗体)的序列。这些核酸分子可以由RNA或DNA(例如，基因组DNA、cDNA，或合成DNA(如通过基于亚磷酰胺的合成产生的DNA))或这些类型的核酸内的核苷酸的组合或修饰组成。此外，所述核酸分子可以是双链或单链的(例如，有义链或反义链)。
核酸分子不限于编码多肽(例如，抗体)的序列；也可以包含位于编码序列(例如，嵌合受体的编码序列)上游或下游的一些或全部非编码序列。分子生物学领域的普通技术人员熟悉用于分离核酸分子的常规程序。它们可以例如通过用限制性核酸内切酶处理基因组DNA或通过进行聚合酶链式反应(PCR)来产生。在核酸分子是核糖核酸(RNA)的情况下，分子可以例如通过体外转录产生。
在另一方面，本文提供包括至少一种如本文所公开的工程化细胞和培养基的细胞培养物。通常，所述培养基可以是用于培养本文所述的细胞的任何合适的培养基。用于转化多种多样的上述细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。因此，包含至少一种如本文公开的工程化细胞的细胞培养物也在本申请的范围内。适合于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。
C.工程化细胞和细胞培养物
可以将本公开文本的重组核酸引入细胞，例如像人T淋巴细胞，以产生含有所述核酸分子的工程化细胞。因此，本公开文本的一些实施方案涉及制备工程化细胞的方法，所述方法包括(a)提供能够表达蛋白质的宿主细胞；并且用本公开文本的重组核酸转导所提供的宿主细胞以产生工程化细胞。将本公开文本的核酸分子引入细胞可以通过本领域技术人员已知的方法进行，所述方法例如病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质体转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。
因此，在一些实施方案中，可以将核酸分子通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物引入宿主细胞中以产生工程化细胞。例如，所述核酸分子可以稳定地整合在工程化细胞的基因组中，或者可以以附加体复制，或者作为微环表达载体存在于工程化细胞中以用于瞬时表达。因此，在一些实施方案中，所述核酸分子在所述重组宿主细胞中作为附加体单元维持和复制。在一些实施方案中，所述核酸分子作为微环表达载体存在于工程化细胞中以用于瞬时表达。在一些实施方案中，所述核酸分子稳定地整合到所述工程化细胞的基因组中。稳定整合可以使用经典的随机基因组重组技术或使用更精确的技术来实现，所述更精确的技术如指导RNA引导的CRISPR/Cas9基因组编辑，或用NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌Argonaute)进行的DNA指导的核酸内切酶基因组编辑，或TALEN基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。
核酸分子可以被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中，或者可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送手段和方法如电穿孔来递送。例如，可以通过病毒转导实现核酸向细胞中的引入。在一个非限制性例子中，杆状病毒或腺相关病毒(AAV)可以被工程化为通过病毒转导将核酸递送至靶细胞。已经描述了若干种AAV血清型，并且所有已知的血清型可以感染来自多种不同组织类型的细胞。AAV能够在体内转导广泛的物种和组织，没有毒性证据，并且它产生相对温和的先天性和适应性免疫应答。
源自慢病毒的载体系统也可用于经由病毒转导进行核酸递送和基因疗法。慢病毒载体作为基因递送媒介物提供了若干种有吸引力的特性，包括：(i)通过将载体稳定整合到宿主基因组中进行持续的基因递送；(ii)能够感染分裂细胞和非分裂细胞二者；(iii)具有广泛的组织趋性，包括重要的基因疗法靶细胞类型和细胞疗法靶细胞类型；(iv)载体转导后不表达病毒蛋白；(v)能够递送复杂遗传元件，如多顺反子序列或含内含子的序列；(vi)具有可能更安全的整合位点特征；以及(vii)为相对容易的用于载体操纵和产生的系统。
在一些实施方案中，可以用例如本公开文本的载体构建体对宿主细胞进行基因工程化(例如，转导或转化或转染)，所述载体构建体可以是例如病毒载体或用于同源重组的载体(包含与宿主细胞基因组的一部分同源的核酸序列)，或者可以是用于表达目的多肽的表达载体。宿主细胞可以是未转化的细胞或已经用至少一种核酸分子转染的细胞。
在一些实施方案中，所述工程化细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞在体内。在一些实施方案中，所述细胞是离体的。在一些实施方案中，所述细胞在体外。在一些实施方案中，所述工程化细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人灵长类动物细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是免疫系统细胞，例如B细胞、单核细胞、NK细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞(TH)、细胞毒性T细胞(TCTL)、记忆性T细胞、gamma delta(γδ)T细胞、另一种T细胞、造血干细胞或造血干细胞祖细胞。
在一些实施方案中，所述免疫系统细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是T淋巴细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是T淋巴细胞祖细胞。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。适用于本文公开的组合物和方法的CD8+T细胞毒性淋巴细胞的非限制性例子包括幼稚CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞、效应CD8+T细胞、CD8+干记忆T细胞和大量(bulk)CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是CD4+T辅助性淋巴细胞。合适的CD4+T辅助性淋巴细胞包括但不限于幼稚CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、效应CD4+T细胞、CD4+干记忆T细胞和大量(bulk)CD4+T细胞。
如上所概述，本公开文本的一些实施方案涉及制备本公开文本的工程化细胞的各种方法，所述方法包括：(a)提供能够表达蛋白质的宿主细胞；并且用本公开文本的重组核酸转导所提供的宿主细胞以产生工程化细胞。所公开的用于制备工程化细胞的方法的非限制性示例性实施方案还可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，通过对从受试者获得的样品进行的白细胞单采术获得细胞，并且离体转导所述细胞。在一些实施方案中，所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述方法还包括分离和/或纯化产生的细胞。因此，通过本文公开的方法产生的工程化细胞也在本公开文本的范围内。
在另一方面，本文提供包括至少一种如本文所公开的工程化细胞和培养基的细胞培养物。通常，所述培养基可以是用于培养本文所述的细胞的任何合适的培养基。用于转化多种多样的上述细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。因此，包含至少一种如本文公开的工程化细胞的细胞培养物也在本申请的范围内。适合于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。
E.药物组合物
本公开文本的构建体、核酸、工程化细胞和/或细胞培养物可以被并入组合物(包括药物组合物)中。此类组合物通常包括本文提供和描述的一种或多种构建体、核酸、工程化细胞和/或细胞培养物，以及药学上可接受的赋形剂(例如载体)。在一些实施方案中，本公开文本的药物组合物被配制用于治疗、预防、改善疾病(如癌症)或用于减少或延迟疾病的发作。
因此，本公开文本的一方面涉及药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和以下中的一种或多种：(a)本公开文本的构建体；(b)本公开文本的重组核酸；和(c)本公开文本的工程化细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物包括(a)本公开文本的构建体和(b)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物包括(a)本公开文本的重组核酸和(b)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，本公开文本的药物组合物包括(a)本公开文本的工程化细胞和(b)药学上可接受的载体。
适合于注射使用的药物组合物包含无菌水溶液(水溶性的)或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应是无菌的并且应是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下应是稳定的并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散液的情况下维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)，维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情形中，所述组合物中通常将包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和/或氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量并入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。
本公开文本的方法
本文所述的治疗组合物中的任一种(例如，构建体、核酸、工程化细胞和药物组合物)的施用可以用于治疗受试者以治疗相关疾病，如癌症、免疫疾病和慢性感染。在一些实施方案中，可以将如本文所述的构建体、核酸、工程化细胞和药物组合物并入治疗剂中以用于预防和/或治疗具有、怀疑具有或者可能有高风险发生一种或多种健康状况(如增殖性障碍或细菌感染)的受试者的方法中。示例性增殖性障碍可以包括而不限于血管生成性疾病、转移性疾病、致瘤性疾病、肿瘤性疾病和癌症。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是癌症。
因此，在一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于预防和/或治疗有需要的受试者的病症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用包括以下中的一种或多种的组合物：(a)本公开文本的构建体；(b)本公开文本的重组核酸；(c)本公开文本的工程化细胞；和d)本公开文本的药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物包括治疗有效量或数量的：(a)本公开文本的构建体；(b)本公开文本的重组核酸；(c)本公开文本的工程化细胞；和/或本公开文本的药物组合物。
在一些实施方案中，所公开的药物组合物被配制为与其预期的施用途径相容。本公开文本的重组多肽可以口服或通过吸入给予，但是它们更可能将通过肠胃外途径施用。肠胃外施用途径的例子包括例如静脉内、皮内、皮下、透皮(外用)、经粘膜、和直肠施用。用于肠胃外应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱(如磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠、盐酸或氢氧化钠)来调节pH(例如，调节至约7.2-7.8，例如7.5的pH)。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
可以在细胞培养物或实验动物中通过用于例如确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)的标准药学程序来确定本公开文本的此类主题重组多肽的剂量、毒性和治疗功效。毒性效应与治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，并且其可表示为LD50/ED50的比率。展现高治疗指数的化合物通常是合适的。尽管可以使用展现毒性副作用的化合物，但是应谨慎设计将这样的化合物靶向至受影响组织部位的递送系统，以使对未感染细胞的潜在损伤降至最低，并且由此减小副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选地在包括ED50而具有很小或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于在本公开文本的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以首先根据细胞培养测定估计。可以在动物模型中配制剂量以实现包括如在细胞培养物中确定的IC50(例如，测试化合物的实现对症状的半最大抑制的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可以用于更准确地确定人中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱测量血浆中的水平。
本公开文本的主题重组多肽的治疗有效量(例如，有效剂量)取决于所选多肽。例如，可以施用在约0.001mg/kg患者体重至0.1mg/kg患者体重的范围内的单一剂量；在一些实施方案中，可以施用约0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.05mg/kg。在一些实施方案中，施用600,000IU/kg(IU可以通过淋巴细胞增殖生物测定法确定，并且以国际单位(IU)表示)。可以将所述组合物每天一次或多次至每周一次或多次施用；包括每隔一天一次。本领域技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时程，这些因素包括但不限于，疾病的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外，使用治疗有效量的本公开文本的主题重组多肽治疗受试者可以包括单一治疗，或者可以包括一系列治疗。在一些实施方案中，将组合物每8小时施用持续五天，随后是2至14天(例如9天)的休息时间，然后另外五天每8小时施用。
向受试者施用工程化细胞
在一些实施方案中，本文所公开的治疗方法涉及将有效量或数量的工程化细胞施用于需要此类治疗的受试者。此施用步骤可以使用本领域中的任何植入递送方法来完成。例如，可以将工程化细胞直接输注入个体的血流中或以其他方式施用于个体。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括将工程化细胞通过导致将引入的细胞至少部分定位在期望部位从而产生一种或多种期望的作用的方法或途径施用(该术语与术语“引入”、“植入”和“移植”可互换使用)于受试者。可以通过任何适当的途径施用工程化细胞或其分化的后代，所述适当的途径导致递送至个体的期望位置，所施用的细胞或细胞组分的至少一部分在此位置保持存活。在施用于受试者后细胞的活力时间段可以短至数小时，例如二十四小时，至数天，至长至数年，或甚至个体的寿命，即长期移植。
当预防性提供时，可以将本文所述的工程化细胞在待治疗的疾病或病症的任何症状出现之前施用于受试者。因此，在一些实施方案中，工程化细胞群的预防性施用预防疾病或病症的症状的发生。
当在一些实施方案中以治疗方式提供时，在疾病或病症的症状或指征发作时(或之后)，例如在疾病或病症发作时，提供工程化细胞。
为了在本文所述的各种实施方案中使用，如本文公开的工程化细胞的有效量或数量可以是至少102个细胞、至少5×102个细胞、至少103个细胞、至少5×103个细胞、至少104个细胞、至少5×104个细胞、至少105个细胞、至少2×105个细胞、至少3×105个细胞、至少4×105个细胞、至少5×105个细胞、至少6×105个细胞、至少7×105个细胞、至少8×105个细胞、至少9×105个细胞、至少1×106个细胞、至少2×106个细胞、至少3×106个细胞、至少4×106个细胞、至少5×106个细胞、至少6×106个细胞、至少7×106个细胞、至少8×106个细胞、至少9×106个细胞、或其倍数。所述工程化细胞可以源自一个或多个供体或者可以从自体来源获得。在一些实施方案中，将所述工程化细胞在施用于需要治疗的受试者之前在培养物中扩增。
在一些实施方案中，通过方法或途径将工程化细胞组合物(例如，包括根据本文所述的任何细胞的多个工程化细胞的组合物)递送至个体体内导致将细胞组合物至少部分定位于期望部位。可以通过任何导致个体中的有效治疗的适当途径施用包括工程化细胞的组合物，例如，施用导致递送至个体中的期望位置，在该期望位置处所递送组合物的至少一部分例如至少1×103个细胞被递送至期望部位保持一段时间。施用方式包括注射、输注和滴注。“注射”包括而不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、珠网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施方案中，所述途径是静脉内的。对于细胞的递送，通过注射或输注进行递送是标准的施用方式。
在一些实施方案中，将所述工程化细胞例如经由输注或注射全身施用。例如，不是直接将工程化细胞群施用于靶部位、组织或器官，而是使其进入个体的循环系统，从而进行代谢和其他类似的生物过程。
包含本文提供的任何组合物的用于治疗疾病或病症的治疗的功效可以由熟练的临床医生确定。然而，本领域技术人员将理解，如果疾病的任何一种或全部体征或症状或标记物得到改善或改进，则认为治疗是有效的。还可以通过如由减少住院治疗或对医疗干预的需要(例如，疾病进展停止或至少减缓)所评估的受试者恶化的失败来测量疗效。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。治疗包括对受试者或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)并且包括：(1)抑制疾病，例如，停止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病，例如，导致症状消退；以及(3)预防或减少症状发展的可能性。
如上文所讨论，工程化细胞的治疗有效数量是指当施用于受试者(如患有、怀疑患有或有风险患上疾病的受试者)时，足以促进提供治疗或管理疾病(例如，癌症)中的治疗益处、或足以延迟或最小化与疾病相关的一种或多种症状的工程化细胞的数量。在一些实施方案中，有效数量包括足以预防或延迟疾病的症状的发展、改变疾病的症状的进程(例如但不限于，减缓疾病的症状的进展)或逆转疾病的症状的数量。在一些实施方案中，有效数量包括足以抑制个体中肿瘤生长或癌症转移的数量。在一些实施方案中，有效数量包括足以增加细胞因子产生、抑制(例如，杀伤)癌细胞或感染细胞的数量。
在所公开的方法的一些实施方案中，所述个体是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述个体患有或怀疑患有与增殖性障碍或疾病(如癌症)相关的病症。术语癌症总体上是指具有致癌细胞典型特征(如不受控制的增殖、永生性、转移潜能、快速的生长和增殖速率，以及某些特征性的形态特征)的细胞的存在。通常观察到癌细胞聚集成肿瘤，但是此类细胞可以单独存在于动物受试者体内，或者可以是非致瘤性癌细胞，如白血病细胞。因此，术语“癌症”可以涵盖对实体瘤、软组织肿瘤或转移性病变的提及。如本文所用，术语“癌症”包括癌前以及恶性癌症。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤、软组织肿瘤或转移病灶。
适于通过本公开文本的组合物和方法治疗的病症的例子包括与癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病和感染性疾病相关的病症。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是癌症或微生物感染。可以通过本公开文本的组合物和方法适当治疗的癌症的非限制性例子包括表达这样一种抗原的癌症，所述抗原包括与选自SEQ ID NO:15-22的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的表位。在一些实施方案中，所述癌症的特征在于抗原的量和/或活性增加，所述抗原包括与选自SEQ ID NO:15-22的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的表位。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是表达TMEM161A抗原的癌症(例如，TMEM161A阳性癌症)。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是与参考非癌细胞(例如非癌性或获自作为癌症起源的原始组织/细胞的匹配组织的细胞)相比与TMEM161A抗原的量和/或活性增加相关的癌症。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是以以下水平表达TMEM161A的癌症：与至少一种参考非癌细胞相比高至少10％(如至少10％)，高于约10％、至少高于约20％、至少高于约30％、至少高于约40％、至少高于约50％、至少高于约60％、至少高于约70％、至少高于约80％、至少高于约90％、至少高于约2倍、高于约三倍、高于约四倍、高于约五倍、高于约六倍、高于约七倍、高于约八倍、高于约九倍、高于约20倍、高于约50倍、高于约100倍、高于约200倍。
可以通过本公开文本的组合物和方法适当诊断、预防和/或治疗的癌症的例子包括结肠癌、乳腺癌、肾癌、肺癌和卵巢癌。可以通过本公开文本的组合物和方法适当诊断、预防和/或治疗的另外的癌症包括但不限于胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、神经内分泌癌和睾丸癌。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。
可以通过本公开文本的组合物和方法适当治疗的癌症的另外的例子包括表达这样一种抗原的癌症，所述抗原包括与选自SEQ ID NO:44-45的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的表位。在一些实施方案中，所述癌症的特征在于抗原的量和/或活性增加，所述抗原包括与选自SEQ ID NO:44-45的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的表位。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是表达CLDN2抗原的癌症(例如，CLDN2阳性癌症)。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是与参考非癌细胞(例如非癌性或获自作为癌症起源的原始组织/细胞的匹配组织的细胞)相比与CLDN2抗原的量和/或活性增加相关的癌症。在一些实施方案中，所述增殖性障碍是以以下水平表达CLDN2的癌症：与至少一种参考非癌细胞相比高至少10％(如至少10％)，高于约10％、至少高于约20％、至少高于约30％、至少高于约40％、至少高于约50％、至少高于约60％、至少高于约70％、至少高于约80％、至少高于约90％、至少高于约2倍、高于约三倍、高于约四倍、高于约五倍、高于约六倍、高于约七倍、高于约八倍、高于约九倍、高于约20倍、高于约50倍、高于约100倍、高于约200倍。
可通过本公开文本的组合物和方法适当诊断、预防和/或治疗的另外的癌症包括但不限于结直肠癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌和胃癌。
在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。原则上，本发明没有特别限制于可以通过本文公开的组合物和方法适当诊断、预防和/或治疗的肺癌。合适的肺癌的例子包括腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、非小细胞癌、腺鳞癌、小细胞肺癌、大细胞癌、肺神经内分泌癌、非小细胞肺癌(NSCLC)。可以通过本文所公开的组合物和方法适当诊断、预防和/或治疗的另外的肺癌包括但不限于未分化非小细胞癌、非小细胞癌非特指型、肺鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、肉瘤样癌、多形性癌、癌肉瘤、肺母细胞瘤、原发灶不明的转移癌、原发性肺淋巴上皮瘤样癌和肺良性肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是NSCLC。
在一些实施方案中，所述癌症是多药耐药性癌症或复发性癌症。设想到了此处公开的组合物和方法适用于非转移性癌症和转移性癌症。因此，在一些实施方案中，所述癌症是非转移性癌症。在一些其他实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，施用于受试者的组合物抑制受试者中癌症的转移。在一些实施方案中，施用的组合物抑制受试者的肿瘤生长。
在另一方面，本文提供了用于帮助预防和/或治疗有需要的受试者的病症的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用第一疗法，所述第一疗法包括如本文公开的一种或多种构建体、重组核酸、工程化细胞或药物组合物；以及向所述受试者施用至少一种另外的疗法，其中所述第一疗法和至少一种另外的疗法一起预防和/或治疗所述受试者的病症。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用第一疗法，所述第一疗法包括有效数量的如本文公开的工程化细胞，其中所述工程化细胞治疗所述病症。
如下文更详细描述的，例如实施例29和图3，本公开文本的各种构建体能够结合源自病毒和细菌病原体的抗原。在本公开文本的一些实施方案中，本文提供了用于诊断、预防和/或治疗与微生物感染相关的恶性肿瘤的方法。在一些实施方案中，所述恶性肿瘤与细菌感染相关。与细菌感染相关的恶性肿瘤的非限制性例子包括与牛链球菌(Streptoccocusbovis)感染相关的结肠癌和与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染相关的胃癌。在一些实施方案中，所述细菌感染是大肠杆菌感染。常见的大肠杆菌感染的例子包括胆囊炎、菌血症、胆管炎、尿路感染(UTI)和旅行者腹泻，以及其他临床感染(如新生儿脑膜炎和肺炎)。与大肠杆菌相关的另外的疾患包括血性腹泻(出血性结肠炎)、非血性腹泻、溶血性尿毒症综合征和血栓性血小板减少性紫癜。
在一些实施方案中，本文提供了用于诊断、预防和/或治疗与病毒感染相关的恶性肿瘤的方法。在一些实施方案中，最初发现EB病毒(EBV)感染与伯基特淋巴瘤相关，但此后与所述EB病毒感染相关的恶性肿瘤已经与显著广泛的淋巴增殖性病变和B、T和NK细胞起源的恶性淋巴瘤相关。可以通过使用本文公开的组合物和方法适当诊断、预防和/或治疗的EBV相关恶性肿瘤的例子包括霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌、移植后淋巴细胞增殖性疾病、B淋巴细胞增殖性疾病。可以通过使用本文公开的组合物和方法适当诊断、预防和/或治疗的另外的EBV相关恶性肿瘤包括但不限于T细胞淋巴细胞增殖性疾病、NK细胞淋巴细胞增殖性疾病、N细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤、T细胞白血病、平滑肌肉瘤和淋巴上皮瘤样癌。
另外的疗法
如上文所讨论，本公开文本的一些实施方案提供了用于预防或治疗受试者的病症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用作为单个疗法(例如，单一疗法)的如本文公开的组合物。此外，在本公开文本的一些实施方案中，将所述组合物作为第一疗法单独或与至少一种另外的疗法(例如，至少一种、两种、三种、四种或五种另外的疗法)组合施用于所述受试者。有待与本公开文本的组合物组合施用的合适疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法伴随施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法与所述至少一种另外的疗法同时施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法依序施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法在所述至少一种另外的疗法之前施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法在所述至少一种另外的疗法之后施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法在所述至少一种另外的疗法之前和/或之后施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法轮流施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法在单一配制品中一起施用。
在又另一方面，本文提供了用于获得本文公开的构建体的各种方法，所述方法包括(a)鉴定多个与健康状况相关的TCR；(b)确定存在于每个鉴定的TCR中的CDR3β的序列；(c)鉴定由CDR3β序列共同识别的一种或多种同源抗原；(c)制备包括(b)中确定的CDR3β序列的构建体，其中所述构建体能够与一种或多种同源抗原结合。在一些实施方案中，所述病症是增殖性疾病。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述病症是与细菌感染或病毒感染相关的恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述病症是与EB病毒(EBV)或大肠杆菌感染相关的恶性肿瘤。
试剂盒
本文还提供了用于实践本文所述方法的各种试剂盒。特别地，本公开文本的一些实施方案提供了用于诊断受试者的病症的试剂盒。一些其他实施方案涉及用于在有需要的受试者中预防病症的试剂盒。一些其他实施方案涉及用于在有需要的受试者中治疗病症的方法的试剂盒。例如，在一些实施方案中，本文提供了试剂盒，所述试剂盒包括如本文提供和描述的构建体、重组核酸、工程化细胞或药物组合物中的一种或多种，以及制备和使用它们的书面说明书。
在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒进一步包括可用于将所提供的构建体、重组核酸、工程化细胞或药物组合物中的任一种施用于个体的一种或多种装置。例如，在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒进一步包括一个或多个注射器(包括预充注射器)和/或导管(包括预充注射器)，以用于将所提供的构建体、重组核酸、工程化细胞或药物组合物中的任一种施用于个体。在一些实施方案中，试剂盒可以具有一种或多种另外的治疗剂，所述一种或多种另外的治疗剂可与其他试剂盒组分同时或依序施用以用于期望目的，例如用于诊断、预防或治疗有需要的受试者的病症。
任何上述试剂盒还可以包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：稀释缓冲液、重构溶液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照表达载体、阴性对照构建体、阳性对照构建体、适用于体外产生构建体的试剂。
在一些实施方案中，所述试剂盒的组分可以在单独容器中。在一些其他实施方案中，所述试剂盒的组分可以在单个容器中合并。
在一些实施方案中，试剂盒还可以包含使用试剂盒的组分来实践本文所公开方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，所述说明书可以印刷在基材上，如纸或塑料等。所述说明书可以作为包装插入物存在于试剂盒中、试剂盒的容器或其组分的标签中(例如，与包装或分包装相关联)等。所述说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、软盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件而存在。在一些情形下，实际说明书不存在于所述试剂盒中，而是可以提供用于从远程源(例如，经由互联网)获得所述说明书的装置。这个实施方案的例子是包含网址的试剂盒，在其中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，可以将这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
本公开文本中所提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同确切且单独地指示每个单独出版物或专利申请都通过引用并入一般。
不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论内容陈述了其作者所主张的观点，并且本申请人保留对所引用文件的准确性和针对性提出质疑的权利。应清楚地理解，尽管本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但是该提及并不意味着承认这些文件中的任何文件构成了本领域中公知常识的一部分。
本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本之后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本申请的精神和范围内。
在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅以说明方式提供，而并非旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。
实施例
除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术人员熟知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。这样的技术充分解释于文献中，如Sambrook,J.,&Russell,D.W.(2012).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory以及Sambrook,J.和Russel,D.W.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版).Cold SpringHarbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory(在本文中联合称为“Sambrook”)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology.New York,NY:Wiley(包括至2014年的补充)；Bollag,D.M.等人(1996).Protein Methods.New York,NY:Wiley-Liss；Huang,L.等人(2005).Nonviral Vectors for Gene Therapy.San Diego:AcademicPress；Kaplitt,M.G.等人(1995).Viral Vectors:Gene Therapy and NeuroscienceApplications.San Diego,CA:Academic Press；Lefkovits,I.(1997).The ImmunologyMethods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques.San Diego,CA:Academic Press；Doyle,A.等人(1998).Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology.New York,NY:Wiley；Mullis,K.B.,Ferré,F.和Gibbs,R.(1994).PCR:The Polymerase Chain Reaction.Boston:Birkhauser Publisher；Greenfield,E.A.(2014).Antibodies:A Laboratory Manual(第2版).New York,NY:ColdSpring Harbor Laboratory Press；Beaucage,S.L.等人(2000).Current Protocols inNucleic Acid Chemistry.New York,NY:Wiley,(包括至2014年的补充)；以及Makrides,S.C.(2003).Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells.Amsterdam,NL:Elsevier Sciences B.V.，所述文献的公开内容通过引用并入本文。
实施例1
临床样品
用于收集人体组织和血液的方案由斯坦福大学机构审查委员会(StanfordInstitutional Review Board)(IRB 15166和IRB 21319)批准。纳入标准包括成人患者(年龄>＝18岁)、已知或疑似诊断为NSCLC、原发性肿瘤>2cm并且同意研究。接受新辅助疗法的患者或具有潜在肺部感染、炎症或纤维化疾病的患者被排除在外。在Stanford治疗的患有可手术切除的NSCLC的总共21名患者被纳入此研究。从外周血PBMC(Qiagen)中提取DNA用于HLA分型。
实施例2
组织处理
手术后2小时内处理组织。将组织分割，并且一部分用于细胞悬浮液，另一部分用于组织学。通过将组织切碎，然后用胶原酶III(200IU/mL)和DNA酶(100U/mL)(WorthingtonBiochemical)在RPMI中消化40分钟并且通过70um过滤器，以产生细胞悬浮液。将用于组织学的切片用4％多聚甲醛固定，并且第二天转移到70％乙醇溶液中。
实施例3
FACS分析
通过抗体染色然后在5激光FACSAria Fusion(Stanford FACS设备)(使用基金购自Parker Institute for Cancer Immunotherapy)上分选细胞来从肿瘤单细胞悬浮液分离T细胞。将肿瘤细胞悬浮液在PBS中用Zombie Aqua染料(Biolegend)染色以进行活力评估。随后，将其在具有2％ FBS的PBS中在Fc封闭溶液(Biolegend)加以下抗体中染色：抗CD4(OKT4，Biolegen)、抗CD8(SK1，Biolenged)、抗CD3(OKT3，Bioleged)、抗CD45(H130，Biolelegen)、抗CD25(BC96，Bioregend)、抗PD-1(EH12.2H7，Bioledgegend)、抗CD137(4B4-1，BD Biosciences)、抗HLA-DR(L243，Biolegogend)。将CD3+CD45+AquaZombie细胞直接索引分选到预装载4uL捕获缓冲液的96孔板中，在干冰上快速冷冻，并且在-80℃下储存。
实施例4
GLIPH2分析和T细胞特异性组的建立
实施GLIPH2算法以使用来自MD Anderson NSCLC数据集的778,938个不同的CDR3β序列建立T细胞特异性组(Reuben,A.,等人,Nat Commun,2020.11(1):第603页)。简言之，通过与来自12名健康个体的273920种不同的CDR3β序列(CD4和CD8两者)的参考数据集进行比较，GLIPH2首次发现了共有如前所述(Huang,H.,等人,Nat Biotechnol,2020年10月38(10):1194-1202)的全局或局部基序的CDR3β序列的集群。具有共有序列基序的CDR3β集群的输出伴随着多重统计测量，以便于调用高置信特异性组，包括Vβ基因使用、CDR3β长度分布(仅关于局部基序相关)、集群大小、HLA等位基因使用和克隆扩增方面的偏倚。为了利用NSCLC数据集建立高置信度特异性组，优先化具有来自最少2名不同患者的至少3个不同CDR3β成员的TCR特异性组，所述TCR特异性组与参考数据集相比在Vβ基因使用和CDR3β克隆扩增方面具有显著偏倚。这导致发现了4,300个特异性组，为整个研究的进一步分析奠定了基础。
实施例5
具有源自四聚体的CDR3β序列的特异性组的注释
为了注释来自肺癌患者的推断的特异性组，使用MD Anderson肺癌患者CDR3β序列和公开可用的源自四聚体的CDR3β序列进行组合GLIPH分析(Glanville,J.,等人,Nature,2017.547(7661):第94-98页；Shugay,M.,等人,Nucleic Acids Res,2018.46(D1):第D419-D427页；和Song,I.,等人,Nat Struct Mol Biol,2017.24(4):第395-406页)。为此，首先通过对来自四聚体数据集的总共10,051个CDR3β序列进行独立的GLIPH分析来鉴定可能形成TCR特异性组的源自四聚体的CDR3β序列。这导致形成了含有1,561个CDR3β序列的395个特异性组。然后将这些1,561个CDR3β序列与来自MD Anderson肺癌数据集的778,938个CDR3β序列组合用于上述GLIPH2分析。包括来自四聚体数据的至少一个CDR3β序列的任何特异性组被认为是“注释的”，并且将根据一个或多个相关的四聚体序列分配特异性和HLA限制性。值得注意的是，在给定特异性组中发现多个源自四聚体的CDR3β序列的所有情况中，仅涉及一个占优势的四聚体定义的特异性/HLA。
实施例6
HLA限制性推断的电脑模拟验证
对于上述四聚体注释的特异性组(n＝72)，验证了通过GLIPH2算法针对四聚体确定的HLA限制性作出的HLA限制性的推断。选择以HLA-A*02(n＝72个中的50个)或HLA-B*08(n＝72个中的8个)四聚体注释的特异性组进行验证，因为它们是最常见的。为了验证富集HLA-A*02等位基因的特异性组，首先构建了一个列联表，所述列联表具有特异性组中的总患者(查询患者)数、携带一个或多个HLA-a*02超型等位基因的查询患者数(Huang,H.,等人,Nat Biotechnol,2020年10月；38(10):1194-1202)、所有NSCLC患者数(n＝178)和携带一个或多个HLA-A*02超型等位基因的所有NSCLC患者数(n＝79)。然后通过使用超几何检验(R中的phyper)计算p值。将显著富集HLA-A*02超型等位基因的特异性组的数量(通过超几何检验，p<0.05)报告为相对于用HLA-A*02四聚体注释的特异性组的数量(n＝50个中的18个)的分数。显著富集HLA-A*02超型等位基因的特异性组的数量也被报告为相对于用非HLA-A*02四聚体注释的特异性组数量(n＝22个中的0个)的分数。将用于验证富集的特异性组的方法用HLA-B*08超型等位基因重复。
实施例7
HLA-A*02:01特异性组量化的自展
为了估计HLA-A*02:01+NSCLC患者的数量，需要覆盖所有HLA-A*02:01富集特异性组(n＝77)的50％，通过具有增加的样本大小的患者的随机采样来进行自展过程。首先，首先建立了77个特异性组(来自4,300个NSCLC富集特异性组)，这些特异性组显著富集了HLA-A*02:01等位基因(p<0.05)。采用随机采样(有放回)对1至160名患者进行100次自展。对于每个采样事件，使用来自采样患者的CDR3β序列(特异性计数，图1F和图1G)计算发现的HLA-A*02:01富集特异性组的总和。然后计算自展过程中特异性计数的平均值和标准误差。作为内部对照，我们对其余HLA-A*02:01-NSCLC患者重复自展过程。为了与来自健康群组的特异性组进行比较，从公共可用数据集(Emerson数据集，Emerson,R.O.,等人,Nat Genet,2017.49(5):第659-665页)使用了来自304个HLA-A*02:01+健康供体的PBMC的总共989,816个不同CDR3β序列和来自362个HLA-A*02-健康供体的PBMC的1,153,600个CDR3β序列。为了调整测序深度的差异(下文)，GLIPH分析包括来自每个健康供体的5000个CDR3β序列(频率最高)。为了了解克隆扩增对特异性组量化的影响，将上文提及的HLA-A*02:01富集特异性组与相等数量的无克隆扩增的HLA-A*02:01富集特异性组(n＝77)的自展结果进行比较。使用类似的策略来了解特异性组的总数量如何影响此结果。使用HLA-A*02富集的不同富集截止值进行自展(p<0.05，n＝1,267；p<0.025，n＝319；p<0.01，n＝72个特异性组)。最后，为了了解测序深度对特异性组量化的影响，在自展过程中，按指定比例(50％、25％、12.5％或0％下采样)对总输入CDR3β序列进行随机下采样。
实施例8
TCGA数据的GSEA分析
从NCI GDC Legacy Archive下载来自癌症基因组图谱(TCGA)的人NSCLC切除肿瘤和未累及的肺的大量RNA Seq分析的归一化基因表达数据(对于肿瘤，n＝1,017；以及对于未累及的肺，n＝110)。为了用TCGA数据集进行基因集富集分析(GSEA)，首先使用Pearson相关性计算任何基因与TMEM161A之间的相关系数。然后，将基于与TMEM161A基因表达的相关系数的分选基因列表用Prerank工具(v2.2.2，Broad Institute)和所有标志(hallmark)基因集用于GSEA。使用如前所述的单一样品GSEA方法(ssGSEA，Abazeed,M.E.,等人,CancerRes,2013.73(20):第6289-98页；和Barbie,D.A.,等人,Nature,2009.462(7269):第108-12页)，使用指示的标志特征的基因列表得出特征得分。
实施例9
HLA-A*02四聚体+CD8 T细胞的FACS分选
如前所述(Altman,J.D.和M.M.Davis,Curr Protoc Immunol,2003.第17章:p.Unit 17 3)合成或商业购得(Biolegend)具有UV可交换肽的重组HLA-A*02单体。使用Strategene UV Stratalinker 2400用在PBS中的1mM肽经20分钟进行UV肽交换。第二天递增添加链霉亲和素缀合的荧光团，得到最终4:1摩尔比的MHC:链霉亲和素。在室温下在PBS加2％ FBS中在Fc封闭溶液(Biolegend)中进行四聚体染色持续1小时。对于外周血样品，随后将细胞用抗TCRγδ(B1，Biolegend)、抗CD19(H1B19，Biolegend)、抗CD14(M5E2，Biolegend)、抗CD3(OKT3，Biolegend)、抗CD4(RPA-T4，Biolegend)、抗CD8(HIT8a，Biolegend)和活/死近IR染料(Invitrogen)染色。对于肿瘤样品，将细胞用抗CD4(OKT4，Biolegend)、抗CD8(HIT8a，Biolenged)、抗CD3(UCHT1，Bioleged)、抗CD45(H130，Biolelegend)染色。
实施例10
用Smart-seq2方法制备单细胞RNA-seq(scRNA-Seq)样品
根据有一些修改的先前报道的程序(Picelli,S.,等人,Nat Protoc,2014.9(1):第171-81页)在单细胞水平上生成来自FACS分选的T细胞的全转录组。然后根据制造商的方案(Takara Bio)用Takara的SMARTScribe逆转录酶试剂盒生成第一链cDNA。与先前报告的Smart-Seq2 RT步骤相比的显著变化包括：捕获缓冲液中包括2mM的dNTP和2μM的寡聚dT；RT反应缓冲液中包括1M甜菜碱和另外的6mM MgCl2。然后将cDNA样品用KAPA文库定量试剂盒扩增22-25个周期(Roche)。将1μL的扩增的cDNA(总共25/孔)用于单细胞TCR测序，从而绕过先前报道的RT步骤(Han,A.,等人,Nat Biotechnol,2014.32(7):第684-92页)。为了进行scRNA-Seq，首先将全长cDNA样品用0.6-0.8x体积的预校准AMPure XP珠(BeckmanCoulter)清理以排除小于500个碱基对的DNA片段。使用自动液体处理器Biomek FXP自动化工作站(Beckman Coulter)以消除细胞间的变化性。用AATI片段分析仪(Agilent)验证纯化的全长cDNA的品质。随后，使用片段分析仪的测量结果，以用Mantis液体处理器(Formulatrix)对cDNA输入进行归一化。然后将cDNA样品用Mosquito X1液体处理器(TTPlabtech)合并到384孔板(LVSD)中。转移后，使用Mosquito HTS液体处理器(TTP labtech)制备Illumina测序文库。使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒(Illumina，FC-131-1096)，每孔仅使用0.4uL(总共23uL)的cDNA来制备全转录组文库。在单个测序运行中将定制的i5和i7独特8-bp索引引物(IDT)用于多路复用的384个孔。在具有384孔反应模块(Bio-rad)的C1000 TouchTMThermal Cycler上扩增文库。将池化的文库用Agilent 2100生物分析仪(Stanford PAN设备)检查，并且在Hiseq 4000测序系统(Illumina)上获得配对末端序列(150bp x 2)，所述测序系统是用用于斯坦福功能基因组学机构(Stanford FunctionalGenomics Facility，SFGF)的NIH基金(S10OD018220)购买的。
实施例11
TCRα/β链的单细胞测序
如上所述，在用于scRNA-Seq样品制备的方法中分选和捕获单个T细胞。第一链cDNA合成(Takara)和扩增(Roche)后，将一微升的扩增的cDNA(总共25uL/孔)用于单细胞TCR测序，从而绕过先前报道的RT步骤(Han,A.,等人,Nat Biotechnol,2014.32(7):第684-92页)。用携带多路复用条形码的TCRα/β引物进行巢式PCR，所述多路复用条形码使得能够在单次Miseq运行中池化CDR3α/β测序。将配对的测序读段连接，解复用，并且映射到来自具有定制脚本的国际ImMunoGeneTics
Figure BDA0004001017560000341
(IMGT)的人TCR参考物，如先前报道(Han,A.,等人,Nat Biotechnol,2014.32(7):第684-92页)。
实施例12
scRNA-Seq结果的数据分析
首先将测序读段解复用并且归入单独的fastq文件中，所述文件与单独T细胞的全转录组相对应。将STAR比对器(2.7.1a)用于相对于来自UCSC基因组浏览器中的人基因组参考GRCh38(v21)以默认参数映射读段。将映射读段用samtools(1.4)分选和索引。首先通过使用以下设置，用htseq-count(HTSeq 0.9.1)对映射到基因的读段进行计数来定量基因表达：--stranded＝no--type＝exon--idattr＝gene_name--mode＝intersection-nonempty。除非另有说明，否则对所有单细胞T细胞状态均使用原始读段计数用R中的Seurat(3.1.4)包进行分析。为了从scRNA-Seq结果中获得TCR库，首先使用如前所述的TraCeR算法(Stubbington,M.J.T.,等人,Nat Methods,2016.13(4):第329-332页)重新构建映射到TCRα和TCRβ基因两者的读段。然后将重新构建的DNA序列提交至IMGT，以通过HighV-QUEST调用基因区段使用和CDR3氨基酸序列。
实施例13
对来自TRACERx NSCLC群组的CDR3β序列的GLIPH2分析
如报道的(Joshi,K.,等人,Nat Med,2019.25(10):第1549-1559页)，从ShortRead Archive下载来自NSCLC的TRACERx群组的大量CDR3β核苷酸序列的原始fastq文件(n＝202)。随后通过使用先前建立的定制流程(Han,A.,等人,2014同上)得到CDR3β的氨基酸序列、V基因使用和克隆计数。为了量化图1C所示的肿瘤富集特异性组的百分比，首先使用来自MD Anderson群组(n＝778,938)的组合CDR3β序列和来自TRACERx群组的每个肿瘤样品的大量CDR3β序列进行联合GLIPH2分析。然后，为每个肿瘤(n＝202)得出属于449个肿瘤富集特异性组的前20个克隆扩增的以及其余的CDR3β克隆型的总百分比(％)。
实施例14
用于酵母筛选的可溶性生物素化TCRα/β链
如前所述(Gee,M.H.,等人,Cell,2018.172(3):第549-563页e16)，制备用于酵母选择的可溶性TCRα/β链。简言之，将N末端截短的TCRα或TCRβ链V的合成基因块
Figure BDA0004001017560000343
和经修饰的C基因片段通过Gibson组装(New England BioLabs)组装到杆状病毒pAcGP67a构建体(BD Biosciences)中。用/>
Figure BDA0004001017560000342
6(Promega)将最终的杆状病毒质粒与Bestbac2.0(Expression systems)共转染到SF9细胞(ATCC)中，以制备粗病毒上清液(P0)。随后，将病毒在30-50mL培养物中以1x 106个细胞/mL的密度以1:500的稀释度传代，以产生更高滴度的病毒(P1)。为了生成可溶性TCRα/β链，将多达4升的High Five(Hi5，ThermoFisherScientific)细胞以2x 106个细胞/mL的密度以1:500-1:1000的稀释度用P1杆状病毒感染一周，然后进行蛋白纯化。在室温下将重组TCRα/β链与Ni-NTA树脂(QIAGEN)在Hi5细胞培养基中结合3小时，在pH 7.2的1X HBS中用20mM咪唑洗涤，并且在pH 7.2的1X HBS中在200mM咪唑中洗脱。用30kDa过滤器(Millipore)缓冲液交换至pH 7.2的1X HBS后，在4℃下，在100μM生物素、pH 8.3的40mM Bicine、10mM ATP和10mM乙酸镁的存在下，将纯化的蛋白质用birA连接酶生物素化过夜。将生物素化蛋白使用AKTAPurifier Superdex 200柱(GEHealthcare)通过尺寸排阻色谱纯化，并且在SDS-PAGE凝胶上用过量链霉亲和素验证以确认化学计量学和生物素化。
实施例15
用HLA-A02酵母文库鉴定新型T细胞抗原
为了揭示候选TCRα/β的同源抗原，使用了酵母HLA-A*02文库，所述文库展示了4种不同长度的高度多样性肽(Gee,M.H.,等人,2018同上)。简言之首先将携带不同长度肽的四种单独的幼稚HLA-A*02文库在SDCAA pH 6.0中扩增超过10x多样性，然后用SGCAA诱导肽-HLA-Aga2p复合蛋白。将诱导的文库用于基于亲和力的选择，其中在0.5％牛血清白蛋白和1mM EDTA的存在(以减少背景)下，生物素化的可溶性TCRα/β链与链霉亲和素包被的磁性MACS珠(Miltenyi)偶联。将SDCAA中选择的酵母克隆培养至汇合，然后在SGCAA中诱导汇合细胞2-3天，然后进行下一轮选择。重复选择四次，然后用20个菌落的Sanger测序确认同源抗原的富集。一旦确认，通过miniprep(Zymoprep II试剂盒，Zymo Research)从每轮筛选的5-10x 107个酵母细胞中制备质粒DNA。将肽编码区用具有Illumina P5/P7 Truseq索引衔接子的复合寡核苷酸进行PCR扩增，并且对Miseq测序仪(2x150V2试剂盒)上的池化测序进行凝胶纯化。
实施例16
慢病毒TCR转导
TCRα链、P2A接头和TCRβ链融合基因片段购自IDT，并且将它们克隆到EF1a-MCS-GFP-PGK-puro慢病毒载体的MCS中(Glanville,J.,等人,Nature,2017.547(7661):第94-98页)。转染前一天，将HEK-293T细胞以在10mL DMEM中的7.5x 106个细胞的密度铺板在10cm平皿上。在120μL Opti-MEM(ThermoFisher Scientific)中将293T用与33μL PEI预先混合的3.3μg慢病毒质粒、2.5μg gag-pol质粒和0.83μg VSV-G包膜质粒共转染。24小时后，补充培养基，并且24小时和48小时后收集病毒上清液。将TCR缺陷型Jurkat细胞(下文)用病毒上清液转导，通过流式细胞术评估TCR表达，并且将表达TCR的细胞根据GFP、CD3和转导的TCRα/β链的表达进行分选。对于表达全长EntS、LMP2和FluM1的慢病毒，还从IDT购买了基因片段，并且将其克隆到EF1a-MCS-GFP-PGK-puro慢病毒载体的MCS中。用于表达人TMEM161A(NM_017814)的慢病毒购自GeneCopoeia。如上所述产生慢病毒，并且将稳定表达HLA-A*02的293T细胞(293A2)用病毒上清液转导。将转导的293A2细胞根据GFP表达进行分选并且用于体外T细胞刺激。
实施例17
逆转录病毒TCR转导
对于原代T细胞中逆转录病毒介导的TCR2表达，将TCRα链、P2A接头和TCRβ链从慢病毒载体(上文所述)中进行PCR扩增，并且使用In-Fusion Cloning(Takara)克隆到基于MSGV1的逆转录病毒载体(来自Steve Rosenberg实验室的馈赠)的MCS中。对于原代T细胞中逆转录病毒介导的TCR14表达，从IDT购买了TCRα链、P2A接头和TCRβ链融合基因片段，并且将其克隆到基于MSGV1的逆转录病毒载体的MCS中。
实施例18
细胞培养
缺乏TCRα和TCRβ两者的Jurkat 76T细胞系由Shao An Xue博士(伦敦大学学院免疫学系)提供。使Jurkat细胞和原代T细胞在含有10％ FBS、25mM HEPES、290μg/mL L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、1mM丙酮酸钠和1x非必需氨基酸的完全RPMI(ThermoFisher)中生长。使T2细胞在含有20％ FBS、290μg/mL L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的IMDM(Fisher Scientific)中生长。稳定表达HLA-A*02的293T细胞由Steve Feldman博士(斯坦福医学院)提供，并且使其在具有10％ FBS、290μg/mL L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM(ThermoFisher)中生长。
实施例19
Jurkat T细胞克隆的体外刺激
如上所详述，将表达外源目的TCR的Jurkat 76细胞进行分选并且与T2细胞在完全RPMI中共培养。将肽以20mM储备浓度溶解于DMSO中，并且稀释至2mM的终浓度。刺激18小时后，将细胞洗涤并且用抗CD3(OKT3，Biolegend)、抗CD69(FN50，Biolenged)和抗TCRα/β(IP26，Biolegend)抗体进行染色。使用FACS Fortessa(BD Biosciences)自动高通量采样器采集细胞，并且使用FlowJo软件(Treestar)分析数据。
实施例20
表达候选TCRα/β的原代T细胞的体外刺激
将T细胞使用RosetteSep人T细胞富集混合物(Stem Cell Technologies)从来自斯坦福大学机构血库的HLA-A*02阳性健康供体的减白细胞系统室分离T细胞，并且有活力地储存在液氮中。对于T细胞激活，将T细胞解冻并且在IL-2(100IU/mL)的存在下用抗CD3/CD28珠(Life Technologies)刺激。在第1天和第2天，将激活的T细胞在含有100IU/mL IL-2的培养基中使用Retronectin(Takara)包被的板进行逆转录病毒转导。在第3天去除抗CD3/CD28珠，并且每2天补充一次含有IL-2的培养基。体外扩增8天后，将T细胞与单独表达全长TMEM161A、EntS、LMP2、FluM1或GFP的293A2细胞以1:1的比率共培养。孵育18小时后，将细胞用抗CD3(OKT3，Biolegend)、抗CD69(FN50，Biolenged)、抗TCRα/β(IP26，Biolegend)、抗CD137(4B4-1，BD Biosciences)和活/死近IR染料(Invitrogen)进行染色。使用FACSFortessa(BD Biosciences)自动高通量采样器采集数据，并且使用FlowJo软件(Treestar)分析数据。
实施例21
多种人癌症中TMEM161A表达的免疫组织化学
进行另外的实验以证明多种人癌症表达TMEM161A蛋白。在这些实验中，将由来自石蜡包埋切片的超过100个人癌组织和正常组织组成的组织微阵列用抗TMEM161A抗体染色。根据阳性百分比和强度对组织进行手动评分，以确定H得分。
根据斯坦福大学人类病理学/组织学服务中心(Stanford Human Pathology/Histology Service Center)的标准程序，对石蜡包埋组织进行TMEM161A染色。将抗TMEM161A抗体以1:50(abcam ab180954)染色，然后进行HRP缀合的二抗染色。将组织用苏木精复染。使用ImageJ(Rueden,C.T.,等人,Bioinformatics,2017.18(1):第529页)连同Fiji成像处理包(Schindelin,J.,等人,Nat Methods,2012.9(7):第676-82页)进行自动成像分析。
如图22A-图22B所示，观察到多个人癌症表达TMEM161A蛋白。在结肠癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、神经内分泌癌和睾丸癌中观察到高水平的TMEM161A表达。示出了癌组织中TMEM161A表达的代表性例子以及通过H得分对TMEM161A表达的量化。
实施例22
全外显子组测序
如前所述(Hellmann,M.D.,等人,Clin Cancer Res,2020)，通过输入75ng的剪切的基因组DNA进行肿瘤DNA和匹配种系白细胞DNA的全外显子组测序，以用于用KAPAHyperPrep试剂盒(Roche)(对制造商的说明书有一些修改)制备文库。根据制造商的说明，用SeqCap EZ MedExome试剂盒(NimbleGen)捕获文库制备的样品。如前所述(Newman,A.M.,等人,Nat Med,2014.20(5):第548-54页)，将测序数据解复用并且使用定制生物信息学流程映射到hg19。使用VarScan 2(Koboldt,D.C.,等人,Genome Res,2012.22(3):第568-76页)、Mutect(Cibulskis,K.,等人,Nat Biotechnol,2013.31(3):第213-9页)和Strelka(Saunders,C.T.,等人,Bioinformatics,2012.28(14):第1811-7页)以调用变量(使用默认参数)。然后，通过规定以下来过滤通过至少两种方法调用的变体：1)变异等位基因频率为至少2.5％；2)肿瘤和种系样品两者的深度至少为30X；3)种系读段为零；和4)基因组聚集数据库(Genome Aggregation database)中的群体等位基因频率小于0.1％(Lek,M.,等人,Nature,2016.536(7616):第285-91页)。
实施例23
统计分析
除非另有说明，否则在用GLIPH2寻找高置信特异性组时进行的所有统计分析均为使用CDR3β查询集(特异性组)和参考集的列联表的Fisher精确检验(Huang,H.,等人,2020同上)。将Poisson检验用于确定肿瘤与未累及的肺之间的不同CDR3β序列或特异性组的比较中的代表性偏倚。将学生t检验用于评估来自所有体外测定的结果。将统计学显著性定义为p值<0.05。
实施例24
建立来自人肺癌中肿瘤浸润性T细胞的特异性组
此实施例描述了在肺癌中鉴定识别共有肿瘤抗原的T细胞所进行的实验的结果。
为了鉴定肺癌中识别共有肿瘤抗原的T细胞，使用GLIPH2建立特异性组。如前所述，将以高概率共有特异性的TCR克隆型根据嵌入TCR可变CDR3β区内的短氨基酸序列基序进行分组(Glanville,J.,等人,2017同上)。改进的GLIPH2提供了分析大T细胞库数据集并鉴定携带具有更大容量的局部或全局序列基序的特异性组的优势(Huang,H.,等人,2020同上)。将GLIPH2算法应用于最近发布的T细胞库数据集，所述数据集具有来自178名患有可手术切除疾病的HLA分型非小细胞肺癌(NSCLC)患者的778,938个不同的CDR3β序列(Reuben,A.,等人,Nat Commun,2020.11(1):第603页)(图7A)。值得注意的是，来自大量测序的T细胞克隆型源自手术切除的肿瘤以及未累及的肺两者(图7A)。利用此数据集，在应用一组标准(包括Vβ基因富集和克隆扩增，后者指示T细胞抗原识别)后，建立了来自NSCLC患者的肿瘤中富集的449个特异性组(图1A和图7B)。为了鉴定与这些患者中共有抗原相关的特异性组，将特异性组进一步定义为包括来自最少2名患者的至少3个不同的CDR3β序列。确定了克隆型(即如上文所定义的特异性组的成员)的分数。发现肿瘤中显著更高百分比的扩增最多的TCR克隆型属于肿瘤富集特异性组(图1B)。相比之下，来自患者未累及的肺的TCR克隆型示出了属于肿瘤富集特异性组的低得多的百分比(图8)。接下来确定的是，449个肿瘤富集特异性组与肺癌相关，而不仅仅与正常肺组织或其他类型的肺部疾病相关。在来自代表68名NSCLC患者的202个肿瘤样品的7,363,492个克隆型的验证群组中(Joshi,K.,等人,NatMed,2019.25(10):第1549-1559页)，与未扩增的TCR克隆型相比，显著更高百分比的肿瘤中顶部扩增的对应物属于449个肿瘤富集特异性组(图1B)。相比之下，在来自健康供体和COPD患者(无癌症诊断)的肺组织中，观察到较低百分比的属于肿瘤富集特异性组的TCR克隆型(Reuben,A.,等人,2020同上)，而与克隆扩增无关(图1B)。总之，本文所述的实验数据已经鉴定了一组被预测为识别NSCLC患者中共有肿瘤抗原的特异性组。
实施例25
使用HLA四聚体序列对TCR特异性组的计算机模拟验证
为了验证由GLIPH2建立的特异性组，包括来自各种HLA四聚体数据库的公开可用的CDR3β序列与MD Anderson CDR3β序列组合用于联合GLIPH2分析(Glanville,J.,等人,2017supra；Shugay,M.,等人,Nucleic Acids Res,2018.46(D1):D419-D427页；和Song,I.,等人,Nat Struct Mol Biol,2017.24(4):第395-406页)。可从四聚体数据集获得的CDR3β序列主要覆盖病毒特异性，并且实验证明在它们各自的HLA的背景下结合表位。这允许我们用来自与实验建立的抗原特异性和HLA限制性相关的四聚体数据库的序列注释一些特异性组。联合分析产生396个特异性组的注释(图1C)。在这些特异性组中，克隆扩增并且用11种不同的四聚体注释了72个组(图9)。如预期的，发现对Flu、EB病毒(EBV)或CMV抗原具有推断特异性的克隆型在肿瘤中与未累及的肺相比没有优先定位(图10A)。27个克隆扩增的FluM1注释的特异性组中有十二个携带“RS”或“GxY”基序，已知所述基序对它们与FluM1-四聚体HLA-A*02/GILGFVFTL(SEQ ID NO:23)的接合至关重要，进一步支持了注释的有效性(图9A)(Song,I.,等人,2017同上)。此外，网络分析将这些共有一些相同CDR3β序列成员的四聚体注释的特异性组组织到多个群体中(图1C和图9)。属于给定群体的特异性组始终用相同的HLA四聚体注释(图1C和图9)，这表明一些抗原特异性组，尽管共有不同的序列基序，但是仍可能与相同的特异性和HLA限制性相关。
实施例26
HLA限制性的推断
此实施例描述了验证由GLIPH v2预测的HLA等位基因所进行的实验的结果。在这些实验中，检查了HLA等位基因在特异性组内的富集反映由四聚体注释的HLA背景的程度。将所有72个特异性组中属于给定超型的HLA等位基因的富集用来自四聚体数据集的CDR3β序列注释(Sidney,J.,等人,BMC Immunol,2008.9:第1页；和Harjanto,S.等人,PLoS One,2014.9(1):第e86655页)。此分析集中于属于HLA-A*02和HLA-B*08超型的HLA等位基因，因为这些四聚体定义的HLA背景在MD Anderson数据集中最丰富(图9B)。假设如果给定的特异性组由HLA/肽四聚体注释，则通过GLIPH2观察到富集属于同一超型的一种或多种HLA等位基因的可能性更高。确实，所有HLA-A*02四聚体注释的特异性组中有36.0％富集HLA-A*02超型等位基因，而非A*02四聚体注释的组中没有一个富集所述等位基因(图1D)。类似地，虽然62.5％的HLA-B*08四聚体注释的特异性组富集HLA-B*08超型等位基因，但是只有3.13％的非B*08四聚体注释的组富集HLA B*08超型等位基因(图1D)。因此，特异性组内给定的HLA等位基因的富集准确地反映了同源抗原的HLA背景。先前的工作还通过在报告T细胞中表达TCR异源二聚体并鉴定其肽MHC特异性的更费力和更低通的方法验证了推断的HLA限制元件(Glanville,J.,等人,2017同上和Huang,H.,等人,2020同上)。
实施例27
源自NSCLC患者的一组全面的TCR特异性组的建立
用GLIPH2建立TCR特异性组的主要优点之一是它有助于跨个体进行TCR库分析。这之前受到了TCR序列的巨大多样性的限制，使得从TCR深度测序中得到描述水平之外的有意义的信息变得极其有挑战性(Robins,H.S.,等人,Sci Transl Med,2010.2(47):第47ra64页和Arstila,T.P.,等人,Science,1999.286(5441):第958-61页)。鉴于MD Anderson肺癌数据集的测序深度，任何两个患者之间仅共有平均约0.4％的库，这与先前的报道一致(图1E)。然而，当考虑源自NSCLC患者的4,300个特异性组时，测量这种共有特异性的可能性增加到1.9％，或者如果使用所有特异性组而不考虑克隆扩增时，则测量这种共有特异性的可能性增加到5.3％(图1E)。为了进一步说明GLIPH2特异性推断可以估计源自四聚体的测量结果，进一步示出具有推断病原体特异性的克隆型的估计频率在先前报道的由HLA四聚体染色测量的范围内(图10B)(Simoni,Y.,等人,Nature,2018.557(7706):第575-579页和Rosato,P.C.,等人,Nat Commun,2019.10(1):第567页)。
接下来，推测如果特定疾病背景下存在有限数量的共有抗原，则患者足够时特异性组的数量也应达到饱和。与此推理一致，观察到特异性组在给定HLA等位基因背景下达到饱和(图1F)。然后，估计了覆盖富集给定HLA等位基因的一半特异性组所需的最少患者数量。通过从携带至少一个最普遍的HLA-A*02:01等位基因拷贝的患者进行自展，发现需要来自至少9名患者的库来解释一半的富集HLA-A*02:01的克隆扩增特异性组(n＝77)(图1F)。相比之下，来自A*02:01-患者的并行自展能够解释更少的A*02:01富集特异性组(图1F)。此外，达到最大特异性组一半所需的患者数量取决于克隆扩增水平、特异性组的绝对数量以及库的测序深度(图11)。此外，在独立、健康的A02+群组中观察到类似的低覆盖度，强调了这些特异性组在具有a*02:01等位基因的NSCLC患者中更为普遍(图1G)。因此，可以用有限的患者数量建立一组完整的肺癌共有TCR特异性组。此外，这些结果表明，通过包括特定HLA等位基因的富集的另外的截止值，T细胞特异性的推断得到加强。
实施例28
GLIPH2推断的特异性的实验验证
为了实验验证肽-MHC特异性，需要来自单个T细胞的TCRαβ对的序列。因此，进行了来自在Stanford治疗的15名早期NSCLC患者的单细胞TCR测序(TCR-seq)。从手术切除的标本制备肿瘤浸润性T细胞，并且通过FACS进行分选，然后测序(图12)。总共对4,704对CDR3α和CDR3β序列进行测序，并且将CDR3β序列与来自MD Anderson的数据集合并。选择三个被推断为识别Flu的特异性组[TCR12(“SV％SNQP”CDR3β基序；SEQ ID NO:50)、TCR13(“SIRS％YE”CDR3β基序，SEQ ID NO:51)和TCR14(“S％RSTDT”CDR3β基序；SEQ ID NO:52)]和一个被推断识别EBV的特异性组(TCR15，“RTG％GNT”CDR3β基序；SEQ ID NO:49)进行验证。使用工程化为表达四种TCR候选物的Jurkat细胞克隆，并且将它们在各自的肽的存在下与作为抗原呈递细胞的T2细胞共培养(图13)。发现其中三种TCR13、TCR14和TCR15在HLA-A*02的背景下对预测抗原有应答，这表明了使用GLIPH2推断T细胞特异性的稳健性(图13)。
图23示出了用来自以下的9mer对Jukat-TCR细胞的刺激的代表性FACS图：EBVBMLF1基因座“GLCTLVAML”(SEQ ID NO:44)、uniprot NP 001164563.1(CLDN2基因座，LLGTLVAML；SEQ ID NO:45)、XP 016864815.1(SERINC5基因座，YLCTLVAPL；SEQ ID NO:46)和NP 001005209.1(TMEM198基因座，HPVGEASIL；SEQ ID NO:47)。右小图：一式三份的Jurkat-TCR15细胞刺激结果。对照肽：flu M1“GILGFVFTL”(SEQ ID NO:23)。***，p<0.001；**，p<0.01，通过学生t检验得出。总之，实验结果表明，源自肿瘤的克隆TCR15可能对共有肿瘤抗原(CLDN2)和来自EBV的病毒抗原具有交叉反应性。因此，本公开文本中描述的CDR3βTCR15序列可用于开发治疗性靶向CLDN2阳性癌症的重组T细胞受体。先前已经报道了多种人癌症表达CLDN2蛋白。特别地，先前在结直肠癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌和胃癌中观察到高水平的CLDN2。这方面的更多信息可以例如在人蛋白质图谱中找到，所述人蛋白质图谱可以在www.proteinatlas.org/ENSG00000165376-CLDN2/pathology上公开获得。
实施例29
人肺癌中与源自肿瘤和病原体的抗原交叉反应的T细胞特异性组的鉴定
为了鉴定新型共有肿瘤抗原，利用来自NSCLC患者的肿瘤和未累及的肺两者的库以及肿瘤中富集的优先的TCR特异性组(图2A和图7)。具体地，使用Poisson检验比较肿瘤与未累及的肺之间4,300个克隆扩增特异性组的CDR3β频率(图2A)。这导致449个特异性组的鉴定，这些特异性组显著富集了定位于肿瘤中的CDR3β克隆型，这表明这些克隆型可以识别多个患者之间共有的肿瘤抗原(图2A)。在449个肿瘤富集特异性组中，优先化满足以下标准的那些组：(1)具有来自Stanford群组的配对TCRα/β克隆型和(2)显著富集HLA-A*02等位基因(图2B和图2C)。这导致我们鉴定出具有“S％DGMNTE”CDR3β基序(SEQ ID NO:48)(其中氨基酸“％”是变化的)的特异性组(图2C)。因此，选择携带CDR3α序列CAVLMDSNYQLIW(SEQ IDNO:24)和CDR3β序列CASSGDGMNTEAFF(SEQ ID NO:6)的候选TCRα/β克隆型(称为TCR2)用于抗原鉴定(图3A)。
为了筛选候选克隆TCR2的同源表位，在野生型HLA-A*02:01的背景下使用先前报道的展示4种不同长度(8-11个氨基酸)的肽的酵母文库(Gee,M.H.,等人,2018同上)。将酵母克隆用重组TCR2α/β可溶性蛋白进行四轮基于亲和力的选择，导致肽序列(模拟表位)仅在11mer文库中富集(数据未显示)。用顶部20个富集的模拟表位进行体外刺激测定，并且显示当与HLA-A*02+T2细胞共培养时顶部两个序列“AMGGLLTQLAM”(SEQ ID NO:15)和“KLGGLLTMVGV”(SEQ ID NO:18)刺激表达TCR2的Jurkat细胞(图3A和图14A)。蛋白质数据库搜索(UniParc)导致鉴定多个内源性9mer，所述多个内源性9mer类似于来自酵母文库筛选的顶部两个模拟表位并且被预测为用由6个而不是8个氨基酸分开的锚定物(图3B)结合HLA-A*02:01。确实，顶部两个富集的模拟表位的9mer变体刺激Jurkat TCR2克隆至11mer对应物的可比水平(图14B)。这一结果表明，所鉴定的HLA-A*02抗原事实上为9mer。
在酵母文库筛选中对类似于顶部两个模拟表位的候选内源肽刺激表达TCR2的Jurkat细胞的能力进行功能性测试(图3C和图15)。发现当与HLA-A*02+T2细胞共培养时来自以下的9mer和11mer均能刺激Jurkat TCR2克隆：哺乳动物蛋白TMEM161A(TMEM9mer，ALGGLLTPL，SEQ ID NO:17和TMEM11mer，ALGGLLTPLFL，SEQ IDNO:25)、来自EBV的潜伏膜蛋白2a(LMP9mer，CLGGLLTMV，SEQ ID NO:19和LMP11mer，CLGGLLTMVSA，SEQ ID NO:20)和来自大肠杆菌的肠杆菌素输出蛋白(enterobactin exporter)(EntS9mer，LLGGLLTMV，SEQ IDNO:21和EntS11mer，LLGGLLTMV，SEQ ID NO:22)(图3C和图15)。此外，为了证明全长蛋白TMEM161A、LMP2和EntS可以被加工、呈现并且装载到HLA-A*02:01上并且激活T细胞，随后使这些全长蛋白在HLA-A*02+293T细胞中过度表达，并且测量来自表达TCR2的共培养原代T细胞的应答。与脉冲肽类似，来自TMEM161A、LMP2和EntS的全长蛋白均可以被加工成刺激表达TCR2的原代T细胞的肽，其中人TMEM161A显现是这三种刺激物中最弱的一种(图3D)。更重要的是，TCR2的同源抗原的鉴定进一步证明GLIPH2正确预测了“S％DGMNTE”(SEQ ID NO:48)特异性组的HLA限制性。总之，结合GLIPH2和酵母抗原文库筛选，我们鉴定了T细胞特异性组和来自肿瘤和病原体的交叉反应性抗原。
实施例30
TMEM161A在人肺癌上过度表达
发现与未累及的肺相比，在人肺癌中TMEM161A蛋白表达水平显著更高(图4A和图4B)。特别地，发现TMEM161A在人NSCLC肿瘤上广泛表达(参见例如，图4A、图4B和图4C；n＝约900名受试者)。为了在更大的肺癌群组中检查TMEM161A表达，使用癌症基因组图谱(TCGA)数据集检查TMEM161A RNA表达。与蛋白表达一致，发现与来自NSCLC患者的未累及的肺相比，在肿瘤中TMEM161A的表达水平更高。此外，与腺癌相比，肺鳞状细胞癌中TMEM161A的表达水平更高(图4C)。来自Stanford群组的样本的全外显子组测序未在TMEM161A基因座的编码区内鉴定出任何突变，这支持其作为非突变肿瘤抗原的作用(数据未显示)。类似地，在泛肺癌TCGA数据集中发现TMEM161A基因座的有害突变小于1％(n＝6/1053，图16)。有趣的是，基因集富集分析(GSEA)显示肺癌中TMEM161A表达与细胞增殖程序和原癌基因MYC靶标相关的特征相关(图4D和图4E)。相比之下，TMEM161A表达显现与炎症反应相关的基因集呈负相关(图4D和图4E)。总之，GSEA分析的结果表明，肿瘤中TMEM161A的表达与抗肿瘤免疫应答相关基因的表达呈逆相关。
除了检查TMEM161A在肿瘤中的表达外，还进行了另外的实验以进一步表征TMEM161A特异性CD8+T细胞。使用装载有TMEM9mer的HLA-A*02四聚体从来自HLA-A*02+患者的肿瘤细胞的单细胞悬浮液中分选T细胞，其中这些T细胞是首次鉴定的(患者A6)。来自肿瘤和未累及的肺的这些TMEM9mer/A02四聚体+T细胞的单细胞TCR-seq证实了它们携带“S％DGMNTE”基序(SEQ ID NO:48)，这与它们在体内识别TMEM161A一致(图17)。接下来，检查了肿瘤特征如何影响HLA-A02+患者中具有“S％DGMNTE”CDR3β基序(SEQ ID NO:48)的T细胞募集的问题。观察到，与腺癌相比，具有“S％DGMNTE”CDR3β基序(SEQ ID NO:48)的T细胞在鳞状细胞癌中更常见，这与TMEM161A在这些肿瘤中的表达模式一致(图18A和图4C)。还观察到，与突变计数>500的肿瘤相比(n＝34)，突变计数<500的肿瘤中这些T细胞更丰富，这表明识别过度表达的共有抗原的肿瘤浸润性T细胞的存在可能是具有低至中等突变负担的肿瘤的更常见特征(图18B)。肿瘤中存在或不存在具有“S％DGMNTE”CDR3β基序(SEQ IDNO:48)的T细胞并不影响患者的临床结局(图19)。然而，具有“S％DGMNTE”CDR3β基序(SEQ ID NO:48)的T细胞与肿瘤的基因属性的相关进一步支持了它们在体内识别肿瘤抗原TMEM161A和非病原体衍生的抗原。一致地，先前关于TCGA数据集的报告显示，在肺癌中很少检测到EBV。总之，本文所述的实验数据显示，TMEM161A在NSCLC中广泛且高度表达，并且在30/78(38％)的HLA-A*02+患者中发现识别此抗原的T细胞。
实施例31
在健康供体中检测到识别肿瘤和病原体抗原的交叉反应性CD8+T细胞
为了表征所有交叉反应性TMEM161A特异性和病原体特异性克隆型，使用装载有TMEM9mer或EntS9mer的HLA-A*02四聚体通过FACS从HLA-A*02+健康供体和NSCLC患者的外周血中分选CD8+T细胞(图5A)。在健康供体和肺癌患者中观察到HLA-A*02/TMEM9mer+CD8 T细胞的频率没有差异(图5B和图5C)，这表明由于对源自病原体的抗原的识别，这些T细胞的频率可能保持不变。此外，如通过四聚体直接测量或通过GLIPH2估计的，这些特异性T细胞的频率约为每103-105个T细胞中有一个[四聚体测量：0.0032％-0.0980％；GLIPH2推断：0-0.2643％]，这高于典型的基线范围(每105-106个T细胞中有一个)。
无论是TMEM9mer/A*02四聚体还是EntS9mer/A*02四聚体用于分选外周血T细胞，分选的细胞的CDR3β序列始终富集“S％DGMNTE”序列基序(SEQ ID NO:48)(图5D)。事实上，发现了共有“S％DGMNTE”基序(SEQ ID NO:48)(其中％可能是甘氨酸、谷氨酸或丝氨酸)的多种CDR3β序列，证实了携带此基序的GLIPH2特异性组中所观察到的多样性(图5D)。此外，scRNA-Seq数据表明，分选的细胞大多具有效应T细胞状态，这表明它们甚至在健康个体中也遇到了其同源抗原(图20)。为了在功能上验证来自四聚体分选的克隆的CDR3α/β序列，产生了表达用四聚体鉴定的TCRα/β链的稳定Jurkat细胞。然后量化在HLA-A*02:01的背景下，它们对TMEM9mer和源自病原体的9mer两者的反应性。发现具有“S％DGMNTE”CDR3β基序(SEQID NO:48)的Jurkat细胞克隆仅在与容许的TCR2α链(CDR3α：CAVLMDSNYQLIW，图5E)配对时才能与TMEM9mer、EntS9mer和LMP9mer肽发生交叉反应。此外，还测试了在CDR3β序列内不携带“S％DGMNTE”基序(SEQ ID NO:48)的用四聚体分选鉴定的A*02:01/TMEM9mer特异性克隆型(图5E)。这种克隆型显现对TMEM9mer刺激具有轻微的反应，但是对其他肽没有交叉反应(图5E)。总之，当与容许的α链配对时，具有“S％DGMNTE”CDR3β基序(SEQ ID NO:48)的CD8+T细胞可与肿瘤抗原TMEM161A和源自病原体的抗原EntS和LMP2发生交叉反应。
实施例32
TMEM161A特异性CD8+T细胞的表型表征
为了评估肿瘤浸润性T细胞的细胞状态，使用SMART-Seq方法(scRNA-Seq)，对来自10名未经治疗的NSCLC患者的2,950个分选T细胞用单细胞RNA测序生成了全转录组谱。将这些数据与分选的T细胞的TCR谱数据(配对的CDR3α/β)相关联(图12)。鉴定了十四种主要的细胞状态。其中的13种可以映射到先前在不同NSCLC患者群组中描述的那些(图6A和图21)。克隆扩增最多的细胞状态集群包括c5、c6、c12(具有效应性表型的CD8+T细胞)、c7和c10(具有驻留记忆表型的CD8+T细胞)(图6B和图6C)。为了了解细胞状态与针对共有抗原的特异性之间的关系，使用合并的Stanford和MD Anderson群组建立了特异性组，并且检查了它们的scRNA-Seq谱。发现来自Stanford群组的2.9％的T细胞(n＝86/2950)属于克隆扩增特异性组(n＝4,300，图6D)。此外，这些T细胞中的12个是449个肿瘤富集特异性组的成员，而这些T细胞的13个被推断为病毒特异性的(图6D)。有趣的是，虽然属于所有4,300个克隆扩增特异性组的T细胞在其细胞状态中没有展现出偏倚，但是属于肿瘤富集特异性组的T细胞偏向效应性表型(c5、c6)并且差异性表达EOMES、KLRG1和激活的NK细胞中表达的其他基因(图6D、图6E和图6F)。一致地，来自肿瘤的HLA-A*02/TMEM9mer四聚体分选的CD8+T细胞在c5和c6中也优先展现出效应T细胞表型(图6D、图6E和图6F)。推断为病毒特异性的T细胞展现出包括效应性表型(c5、c6、c12)和组织驻留记忆表型(c7)两者在内的细胞状态。总之，发现TMEM161A特异性CD8+T细胞揭示了肿瘤中的效应T细胞状态。
尽管已经公开了本公开文本的特定替代方案，但是应理解，各种修改和组合是可能的并且涵盖于所附权利要求的真实精神和范围内。因此，无意限制于本文呈现的确切摘要和公开文本。
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序列表
<110> 小利兰·斯坦福大学董事会
<120> 新型T细胞特异性及其用途
<130> 078430-518001WO
<140> 随同提交
<141> 随同提交
<150> US 63/014,960
<151> 2020-04-20
<160> 52
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
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<220>
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<221> 尚未归类的特征
<223> 第2模拟表位
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<221> 尚未归类的特征
<223> 大肠杆菌(E. coli) EntS 11mer
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Leu Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ser Ala
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 对照肽
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Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 24
<211> 13
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
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<220>
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<220>
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1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR15
<400> 27
Cys Ala Ser Arg Thr Gly Pro Gly Asn Thr Ile Tyr Phe
1 5 10
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR15
<400> 28
Cys Ser Ala Arg Thr Gly Thr Gly Asn Thr Ile Tyr Phe
1 5 10
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR15
<400> 29
Cys Ala Ser Arg Thr Gly Asp Gly Asn Thr Ile Tyr Phe
1 5 10
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR15
<400> 30
Cys Ser Ala Arg Thr Gly Val Gly Asn Thr Ile Tyr Phe
1 5 10
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR15
<400> 31
Cys Ser Val Arg Thr Gly Ala Gly Asn Thr Ile Tyr Phe
1 5 10
<210> 32
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR15
<400> 32
Cys Ala Tyr Arg Thr Gly Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe
1 5 10
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR15
<400> 33
Cys Ala Ser Arg Thr Gly Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe
1 5 10
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 四次穿膜蛋白11mer
<400> 34
Ala Met Gly Gly Leu Leu Phe Leu Leu Gly Phe
1 5 10
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 四次穿膜蛋白9mer
<400> 35
Ala Met Gly Gly Leu Leu Phe Leu Leu
1 5
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> GRM2(谷氨酸受体) 11mer
<400> 36
Ala Met Gly Ser Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
1 5 10
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> GRM2 9mer
<400> 37
Ala Met Gly Ser Leu Leu Ala Leu Leu
1 5
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> ZNF780B(锌指蛋白780B同种型 X1) 11mer
<400> 38
Lys Ala Phe Gly Leu Leu Thr Gln Leu Ala Gln
1 5 10
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> ZNF780B 9mer
<400> 39
Lys Ala Phe Gly Leu Leu Thr Gln Leu
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> mnhA1 9mer
<400> 40
Lys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Ile Met
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NhaB 9mer
<400> 41
Ala Leu Val Gly Gly Leu Leu Met Val
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> PA14 60530 9mer
<400> 42
Ala Leu Gly Gly Val Met Thr Met Val
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> TMEM161A 9mer
<400> 43
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Thr Pro Leu
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> EBV BMLF1 9mer
<400> 44
Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CLDN2基因座
<400> 45
Leu Leu Gly Thr Leu Val Ala Met Leu
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> SERINC5基因座
<400> 46
Tyr Leu Cys Thr Leu Val Ala Pro Leu
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> TMEM198基因座
<400> 47
His Pro Val Gly Glu Ala Ser Ile Leu
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR2基序共有序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 48
Ser Xaa Asp Gly Met Asn Thr Glu
1 5
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR15基序共有序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 49
Arg Thr Gly Xaa Gly Asn Thr
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR12基序共有序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 50
Ser Val Xaa Ser Asn Gln Pro
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR13基序共有序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 51
Ser Ile Arg Ser Xaa Tyr Glu
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CDR3β TCR14基序共有序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 52
Ser Xaa Arg Ser Thr Asp Thr
1 5

Claims (59)

1.一种包含至少一个互补决定区(CDR)的构建体，所述至少一个互补决定区与选自SEQID NO:1-14、26-33和48-49的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
2.根据权利要求1所述的构建体，其中所述构建体能够与包含与选自SEQ ID NO:15-22和44-45的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的表位结合。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的构建体，其中所述构建体是单链构建体或双链构建体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的构建体，其中所述构建体选自：(a)T细胞受体(TCR)；(b)抗体；和(c)(a)或(b)的功能性衍生物或片段。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的构建体，其中所述构建体是包含彼此共价连接的TCRα链和TCRβ链的TCR构建体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的构建体，其中所述构建体是在其β链中包含与选自SEQ ID NO:1-14、26-33和48-49的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3β的TCR构建体。
7.根据权利要求6所述的构建体，其中所述构建体在其α链中进一步包含CDR3α序列。
8.根据权利要求7所述的构建体，其中所述CDR3α序列与SEQ ID NO:24的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的构建体，其中所述构建体是选自抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、单结构域抗体(sdAb)、VH结构域、VL结构域，VHH结构域、双抗体或其任一个的功能性片段的抗体构建体。
10.一种重组核酸，所述重组核酸包含编码根据权利要求1至8中任一项所述的构建体的核酸序列。
11.根据权利要求10所述的核酸，其中所述核酸序列与异源核酸序列可操作地连接。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的核酸，其中所述核酸分子被进一步定义为表达盒或载体。
13.根据权利要求12所述的核酸，其中所述载体是质粒载体或病毒载体。
14.根据权利要求13所述的核酸，其中所述病毒载体源自慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒或逆转录病毒。
15.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含：
a)根据权利要求1至9中任一项所述的构建体；和/或
b)根据权利要求10至14中任一项所述的重组核酸。
16.根据权利要求15所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是真核细胞。
17.根据权利要求16所述的工程化细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
18.根据权利要求17所述的工程化细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
20.根据权利要求19所述的工程化细胞，其中所述免疫细胞是B细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞(TH)、细胞毒性T细胞(TCTL)、记忆性T细胞、gammadelta(γδ)T细胞、另一种T细胞、造血干细胞或造血干细胞祖细胞。
21.根据权利要求20所述的工程化细胞，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
22.根据权利要求21所述的工程化细胞，其中所述淋巴细胞是T淋巴细胞或T淋巴细胞祖细胞。
23.根据权利要求22所述的工程化细胞，其中所述T淋巴细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
24.根据权利要求22至23中任一项所述的工程化细胞，其中所述T淋巴细胞是选自以下的CD8+T细胞毒性淋巴细胞：幼稚CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞、效应CD8+T细胞、CD8+干记忆T细胞和大量CD8+T细胞。
25.根据权利要求22至23中任一项所述的工程化细胞，其中所述T淋巴细胞是选自以下的CD4+T辅助性淋巴细胞：幼稚CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、效应CD4+T细胞、CD4+干记忆T细胞和大量CD4+T细胞。
26.一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括：
a)提供能够表达蛋白质的宿主细胞；并且
b)用根据权利要求10至14中任一项所述的重组核酸转导所提供的宿主细胞以产生工程化细胞。
27.通过根据权利要求26所述的方法产生的工程化细胞。
28.一种细胞培养物，所述细胞培养物包含至少一种根据权利要求15-25和27中任一项所述的工程化细胞和培养基。
29.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体以及：
a)根据权利要求1至9中任一项所述的构建体；
b)根据权利要求10至14中任一项所述的重组核酸；和/或
c)根据权利要求15-25和27中任一项所述的工程化细胞。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述组合物包含根据权利要求10至14中任一项所述的重组核酸以及药学上可接受的载体。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。
32.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述组合物包含根据权利要求15-25和27中任一项所述的工程化细胞。
33.一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下的组合物：
a)根据权利要求1至9中任一项所述的构建体；
b)根据权利要求10至14中任一项所述的重组核酸；
c)根据权利要求15-25和27中任一项所述的工程化细胞；和/或
d)根据权利要求29至32中任一项所述的药物组合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述病症与增殖性障碍相关。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述增殖性障碍是一种表达表位的癌症，所述表位包含与选自SEQ ID NO:15-22和44-45的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
36.根据权利要求34至35中任一项所述的方法，其中所述增殖性障碍是表达TMEM161A抗原的癌症(TMEM161A阳性癌症)。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述TMEM161A阳性癌症选自结肠癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、神经内分泌癌和睾丸癌。
38.根据权利要求34至35中任一项所述的方法，其中所述增殖性障碍是一种表达CLDN2抗原的癌症(CLDN2阳性癌症)。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述CLDN2阳性癌症选自结直肠癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌和胃癌。
40.根据权利要求37或39所述的方法，其中所述肺癌选自腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、非小细胞癌、腺鳞癌、小细胞肺癌、大细胞癌、肺神经内分泌癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、未分化非小细胞癌、非小细胞癌非特指型、肺鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、肉瘤样癌、多形性癌、癌肉瘤、肺母细胞瘤、原发灶不明的转移癌、原发性肺淋巴上皮瘤样癌和肺良性肿瘤。
41.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中所述癌症是非转移性癌、转移性癌、多药耐药性癌或复发性癌。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所施用的组合物抑制所述受试者的癌症的肿瘤生长或转移。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述病症是与细菌感染或病毒感染相关的恶性肿瘤。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述病症是与EB病毒(EBV)或大肠杆菌(Escherichia coli)感染相关的恶性肿瘤。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述恶性肿瘤与EBV感染相关，并且选自霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌、移植后淋巴细胞增殖性疾病、B淋巴细胞增殖性疾病、T/NK淋巴细胞增殖性疾病、T/NK淋巴瘤/白血病、平滑肌肉瘤和淋巴上皮瘤样癌。
46.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
48.根据权利要求33至47中任一项所述的方法，其中将所述组合物作为第一疗法单独或与至少一种另外的疗法组合施用于所述受试者。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述至少一种另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。
50.根据权利要求48至49中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法伴随施用。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法与所述至少一种另外的疗法同时施用。
52.根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法依序施用。
53.根据权利要求52所述的方法，其中将所述第一疗法在所述至少一种另外的疗法之前施用。
54.根据权利要求52所述的方法，其中将所述第一疗法在所述至少一种另外的疗法之后施用。
55.根据权利要求52所述的方法，其中将所述第一疗法在所述至少一种另外的疗法之前和/或之后施用。
56.根据权利要求48至55中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法轮流施用。
57.根据权利要求48至49中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述至少一种另外的疗法在单一配制品中一起施用。
58.一种用于诊断、预防和/或治疗有需要的受试者的病症的试剂盒，所述系统包括：
a)根据权利要求1至9中任一项所述的构建体；
b)根据权利要求10至14中任一项所述的重组核酸；
c)根据权利要求15-25和27中任一项所述的工程化细胞；和/或
d)根据权利要求29至32中任一项所述的药物组合物。
59.一种用于获得根据权利要求1所述的构建体的方法，所述方法包括：
a)鉴定多个与健康状况相关的T细胞受体(TCR)；
b)确定在每个鉴定的TCR中存在的CDR3β的序列；
c)鉴定由这些CDR3β序列共同识别的一种或多种同源抗原；
c)制备包含(b)中确定的CDR3β序列的构建体，其中所述构建体能够与所述一种或多种同源抗原结合。
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