CN107108708A - 用于生成抗原、抗体的组合物和方法以及免疫治疗性组合物和方法 - Google Patents

Abstract

在一些方面，本发明涉及生成抗原的组合物和方法，其中所述抗原是通过活性氧或活性氮修饰的生物分子。在一些方面，本发明涉及生成抗体的组合物和方法，所述抗体结合到通过活性氧或活性氮修饰的生物分子。在一些方面，本发明涉及生成抗体的组合物和方法，所述抗体结合到未修饰的生物分子上的新型表位。在一些方面，本发明涉及主动免疫治疗性过程的诱导(例如，使用预防性或治疗性疫苗)，所述诱导可包括施用通过本文所述的方法和组合物生成的新抗原。

Description

用于生成抗原、抗体的组合物和方法以及免疫治疗性组合物 和方法

相关申请

本申请要求2014年12月22日提交的美国临时专利申请号62/095,369的优先权，所述申请以引用的方式整体并入。

背景

氧化应激反应为免疫应答的主要部分，它与感染、炎症、老化等相关联。在临床上，病状的环境与氧化损伤相关联，所述氧化损伤包括慢性炎性疾病和自身免疫疾病、癌症以及年龄相关性病症。氧化应激反应大部分是通过活性氧(ROS)和活性氮(RNS)以及其他物质介导的。ROS是具有高化学反应性的基于氧的分子。这些分子包括生物产生的自由基(超氧化物和羟基、一氧化氮等)和非自由基物质诸如过氧化氢和过氧化亚硝酸盐。

蛋白质暴露于ROS和RNS后改变了其复合氨基酸和结构，从而生成新抗原(新抗原通常定义为先前未被认识的宿主衍生的蛋白质，所述蛋白质在物理/结构或基因修饰之后具有免疫原性)。然而，对于生物分子的氧化损伤很少是特定的，并且这取决于蛋白质的浓度、其相对于细胞氧化剂生成系统的细胞位置以及修饰的蛋白质的清除速率。

虽然自由基在导致分子水平的氧化损伤方面的直接作用已为人所知数十年，但是氧化损伤改变组织/器官功能的程度在很大程度上仍然是不清楚的。在免疫学中，氧化损伤已涉及到多种自身免疫疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)，其中针对新抗原的异常免疫应答表明免疫耐受机制受损害。诱导新抗原形成的因素包括炎症、感染、药物、ROS以及环境因素。

发明内容

在一些方面，本发明涉及生成抗原的组合物和方法，其中所述抗原是通过活性氧或活性氮修饰的生物分子。在一些方面，本发明涉及生成抗体的组合物和方法，所述抗体结合到通过活性氧或活性氮修饰的生物分子。在一些方面，本发明涉及生成抗体的组合物和方法，所述抗体结合到未修饰的生物分子上的新型表位。在一些方面，本发明涉及主动免疫治疗性过程的诱导(例如，使用预防性或治疗性疫苗)，所述诱导可包括施用通过本文所述的方法和组合物生成的新抗原。

附图简述

图1.一氧化氮(NO)的相关生物/化学反应性。NO可与相关生物蛋白质中易受影响的化学部分快速反应，即：a)例如，酪氨酸残基：硝化(不可逆)；b)例如，硫醇：S-亚硝基化(可逆)；以及c)例如，过渡金属离子：亚硝化(可逆)。

图2.B16作为小鼠黑素瘤肿瘤和免疫疗法模型。皮下模型广泛用于许多肿瘤模型中的疗法评价，所述肿瘤模型包括免疫原性差的C57BL/6衍生的B16黑素瘤。在皮下注射之后，B16将在5天至10天内形成可触知的肿瘤，并且在14天至21天内生长成最小1×1×1-cm的肿瘤，从而引起通过NO和NO相关分子增加的B16衍生的抗原免疫原性：a)重编程：将培养的B16细胞体外处理到缓慢释放NO的化合物DETA-NONOate(250μM-相对低的浓度)18小时，以便促进调节基因表达，从而引起新肿瘤相关性抗原的出现并且在通过超声裂解之后将B16细胞转化成更具有免疫原性的并用作抗原(NOVax)；b)修饰：在31μM的NO衍生的硝化剂过氧化亚硝酸盐(ONOO^-)存在下，在室温下将通过超声获得的未处理的总培养的B16细胞裂解物孵育3小时，接着在4℃下孵育48小时，并且用作抗原(NiVax)。将抗原制剂冷冻并保存在-80℃下，直至将其用于主动治疗性免疫中或用于生成用于被动治疗性治疗携带肿瘤的小鼠的抗血清。

图3.用于被动治疗性治疗(血清转移)和抗体发现的抗血清生成。A)在皮下(SC)使用100μL(～100μg的蛋白质)未处理的B16裂解物(对照Vax)、重编程的B16裂解物(NOVax)或修饰的B16裂解物(NiVax)对不携带肿瘤的C57BL/6雌性小鼠(6-12周大)进行免疫。在第7天和第21天给予使用相同剂量和浓度的抗原进行加强免疫。在最后一次加强免疫14天之后，通过心脏刺穿从CO₂安乐死的动物中采集血液。b)在肿瘤攻击之后第4天、第11天和第18天，将三个剂量(每个20μL)的来自单个实验组的合并的血清在腹膜内(IP)施用给携带肿瘤的小鼠。每周两次对肿瘤负荷进行监测。

图4.黑素瘤的主动和被动治疗性免疫。a)主动：在肿瘤攻击之后第4天、第11天和第18天，在皮下(SC)使用100μL(～100μg的蛋白质)未处理的B16裂解物(对照Vax或CVax)、重编程的B16裂解物(NOVax)或修饰的B16裂解物(NiVax)对携带B16-F0肿瘤的C57BL/6雌性小鼠(6-12周大)进行免疫。b)被动：在肿瘤攻击之后第4天、第11天和第18天，将三个剂量(每个20μL)的来自单个实验组的合并的血清在腹膜内(IP)施用给携带B16-F0肿瘤的小鼠。通过肿瘤体积(mm³)±SEM来评估肿瘤负荷。**＝P＜0.01|n＝10。

图5.修饰的B16裂解物(NiVax)生成的抗血清针对未修饰的和修饰的B16蛋白质裂解物反应。通过SDS-PAGE对从未修饰的B16-F0(B16)、过氧化亚硝酸盐修饰的B16-F0(NB16)以及非黑素瘤小鼠细胞系EL4纯化的总蛋白质裂解物进行解析，并且使用以下各项作为一级抗体对其进行免疫印迹：a)对照未免疫的抗血清；b)对照未处理的B16裂解物(对照Vax)抗血清；c)修饰的B16裂解物(NiVax)抗血清；以及d)不使用抗血清。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG作为二级抗体。

图6.人类免疫靶标识别。使用修饰的B16裂解物(NiVax)衍生的抗血清作为一级抗体针对交叉反应性筛选综合人类蛋白质表达微阵列(OriGene人类蛋白质裂解物β阵列)，并且使用HRP缀合的抗小鼠IgG作为二级抗体。

图7.潜在免疫靶标的二维电泳分析。通过二维(2-D)电泳对B16-F0总蛋白质裂解物进行解析。简言之，使用ReadyStrips/Bio-Rad(pH 3-10，非线性，7cm长)，通过等电聚焦(IEF)在第一维度上对天然B16-F0总蛋白质裂解物(～20μg)进行2-D分析。然后在12％SDS-PAGE上分离蛋白质，并且使用修饰的B16裂解物(NiVax)衍生的抗血清作为一级抗体对其进行免疫印迹，并且使用HRP缀合的抗小鼠IgG作为二级抗体。

图8.FEN1的二维电泳分析。在2-D电泳中对B16-F0总蛋白质裂解物进行解析并且使用多克隆抗FEN1抗体(细胞信号传导)对其进行免疫印迹。

图9.使用过氧化亚硝酸盐硝化的(修饰的)人类FEN1针对黑素瘤进行的主动治疗性免疫。在31μM和62μM的NO衍生的硝化剂过氧化亚硝酸盐(ONOO^-)存在下，在室温下对纯化的重组人类FEN1蛋白进行修饰3小时，接着在4℃下修饰48小时，并且用作用于免疫的抗原。在肿瘤攻击之后第4天、第11天和第18天，在皮下(SC)使用盐水溶液(对照)或100μL(～3μg的蛋白质)未修饰的FEN1对照、31μM修饰的FEN1或62μM修饰的FEN1对携带B16-F0肿瘤的小鼠进行免疫。通过肿瘤体积(mm³)±SEM来评估肿瘤负荷。**＝P＜0.01|n＝8。

图10.使用过氧化亚硝酸盐硝化的(修饰的)人类FEN1的主动治疗性免疫延长了存活。在31μM和62μM的NO衍生的硝化剂过氧化亚硝酸盐(ONOO^-)存在下，对纯化的人类FEN1蛋白质进行修饰。在肿瘤攻击之后第4天、第11天和第18天，在皮下(SC)使用盐水溶液(对照)或100μL(～3μg的蛋白质)未修饰的FEN1对照、31μM修饰的FEN1或62μM修饰的FEN1对携带B16-F0肿瘤的小鼠进行免疫。

图11.使用过氧化亚硝酸盐硝化的(修饰的)人类FEN1针对黑素瘤进行的被动治疗性免疫通过血清抗体进行介导。使用蛋白质G涂覆的磁珠(蛋白质G/生命技术)，使用未修饰的FEN1(对照抗体)或使用在31μM过氧化亚硝酸盐存在下修饰的FEN1(31PST抗体)在未携带肿瘤的小鼠中生成的抗血清是抗体消耗的(-)或未抗体消耗的(+)。在肿瘤攻击之后第4天、第7天和第10天，将三个剂量(每个20μL)的来自单个实验组的合并的血清在腹膜内(IP)施用给携带B16-F0肿瘤的小鼠。通过肿瘤体积(mm³)±SEM来评估肿瘤负荷。**＝P＜0.01|n＝8。

图12.使用修饰的人类FEN1针对黑素瘤进行的被动治疗性免疫延长了存活。使用蛋白质G涂覆的磁珠(蛋白质G/生命技术)，如先前所述地使用未修饰的FEN1(对照抗体)或使用在31μM过氧化亚硝酸盐存在下修饰的FEN1(31PST抗体)在未携带肿瘤的小鼠中生成的抗血清是抗体消耗的(-)或未抗体消耗的(+)。在肿瘤攻击之后第4天、第7天和第10天，将三个剂量(每个20μL)的来自单个实验组的合并的血清在腹膜内(IP)施用给携带B16-F0肿瘤的小鼠。

图13.针对未修饰的B16-F0总蛋白质裂解物的抗体依赖性抗血清免疫反应性。通过SDS-PAGE对从未修饰的B16-F0纯化的总蛋白裂解物进行解析并且在独立于泳道的多筛选设备(Bio-Rad)中使用以下各项对其进行免疫印迹：完整的对照未修饰的抗血清(C+)、抗体消耗的对照未修饰的抗血清(C-)、完整的修饰的FEN1抗血清(31+)或抗体消耗的修饰的FEN1抗血清。使用HRP缀合的抗小鼠IgG作为二级抗体。

图14.新型抗原决定簇的发现。在31μM过氧化亚硝酸盐存在下，在室温下对培养的恰加斯氏利什曼原虫(Leishmania chagasi)无鞭毛体进行裂解和处理3小时，接着在4℃下进行48小时并且用作抗原(L-NiVax)以对未感染的BALB/c小鼠进行免疫(100μL-SC|～200μg/剂量)，接着在第7天进行加强免疫。在最后一次加强免疫21天之后，通过心脏刺穿采集血液以用于血清分离。将抗血清制剂的相同方案用于含有以下各项的抗原制剂：盐水溶液(媒介物)、活的恰加斯氏利什曼原虫无鞭毛体+咪喹莫特(Imiquamod)(活的L+Imi)以及热杀死的恰加斯氏利什曼原虫无鞭毛体(热杀死的L)。通过SDS-PAGE对来自未处理的恰加斯氏利什曼原虫无鞭毛体的总蛋白质裂解物进行解析并且使用以下各项对其进行免疫印迹：媒介物、活的L+Imi、热杀死的L以及L-NiVax抗血清。使用HRP缀合的抗小鼠IgG作为二级抗体。

发明详述

在一些方面，本发明涉及以下发现：通过特定的一氧化氮(NO)相关性化合物对靶向蛋白进行的氧化/亚硝化修饰(例如，硝化)的选择性诱导通过促进对新型抗原决定簇的识别来产生新型改变疾病的免疫原。由ROS/RNS诱导的氧化/亚硝化损伤还可使得在脂质和蛋白质中生成不可逆的、非变性的改变，从而产生具有高度免疫原性的新抗原。在自身免疫中观察到的氧化诱导的免疫原性增强需要对于其他非生物可用的氧化剂/硝化剂的加强免疫性的能力进行系统性分析，其目标为产生更有效的疫苗、免疫治疗性手段以及诊断工具。

定义

除非本文另外定义，否则本申请中所使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。通常，与本文所述的化学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、药理学、遗传学和蛋白质及核酸化学结合使用的命名以及其技术是本领域中熟知和常用的那些命名和技术。

向受试者“施用(Administering/administration)”物质、化合物或药剂可以使用本领域的技术人员已知的各种方法之一来实施。例如，化合物或药剂可通过以下方式施用：静脉内、动脉内、真皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、经眼、舌下、经口(通过摄取)、经鼻(通过吸入)、脊柱内、脑内以及经皮(通过吸收，例如通过皮肤管)。化合物或药剂还可以适当地通过可再充电或可生物降解聚合物装置或其他装置例如贴片和泵，或者提供对化合物或药剂的延长的、缓慢的或受控的释放的制剂引入。施用还可例如进行一次、多次和/或在一个或多个延长时间段内进行。向受试者施用物质、化合物或药剂的适当方法还将取决于例如受试者的年龄和/或身体状况以及化合物或药剂的化学和生物特性(例如，溶解性、可消化性、生物可用性、稳定性以及毒性)。在一些实施方案中，化合物或药剂例如通过摄取向受试者口服施用。在一些实施方案中，口服施用的化合物或药剂处于延长释放或缓慢释放的制剂中，或者使用用于此缓慢或延长释放的装置来施用。

“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可通常由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法来测量。

术语“抗体”在本文中以最广泛意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们展现所需的抗原结合活性即可。

“抗体片段”是指非完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分并且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物质，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物质的抗体。

如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At²¹¹、1¹³¹、1¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²以及Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如，甲胺蝶呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥、道诺霉素(daunorubicin)或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶以及其片段，诸如核分解酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及以下公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。

“人类抗体”是具有某一氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人类或人类细胞产生的抗体或来源于利用人类抗体谱或其他人类抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列。人类抗体的这种定义明确排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。

“人源化”抗体是指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人类FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域的大致上全部，其中全部或大致上全部HVR(例如，CDR)对应于非人类抗体的HVR，并且全部或大致上全部FR对应于人类抗体的FR。人源化抗体任选地可包含衍生自人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人类抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。

“分离的抗体”是已与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至纯度大于95％或99％，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所测定的。对于用于评估抗体纯度的方法的评述，参见，例如Flatman等，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。

“分离的核酸”是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含有的核酸分子，但核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从大致上均质的抗体群体获得的抗体，即，除可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中出现的变体，这些变体通常以少量存在)之外，构成所述群体的个别抗体是相同的和/或结合相同表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇的。因此，修饰语“单克隆”指示如从大致上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何具体方法来产生抗体。例如，待根据本发明使用的单克隆抗体可通过各种技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或一部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法以及用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中进行描述。

术语“一氧化氮供体”或“NO供体”是指提供、释放和/或直接或间接转移一氧化氮物质的化合物。

术语“患者”、“受试者”或“个体”可互换使用并且是指人类或非人类动物。这些术语包括哺乳动物诸如人类、灵长类动物、家畜动物(包括牛、猪等)、伴侣动物(例如，犬、猫科动物等)以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。

短语“药学上可接受的”是本领域认可的。在某些实施方案中，所述术语包括在合理医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织相接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的组合物、赋形剂、佐剂、聚合物以及其他材料和/或剂型。

“药学上可接受的盐”或“盐”在本文中用于是指适用于治疗患者或与患者的治疗相容的酸加成盐或碱加成盐。

如本文所用的术语“药学上可接受的酸加成盐”意指任何无毒的有机或无机盐。形成合适的盐的例示性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及金属盐诸如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾。形成合适的盐的例示性有机酸包括一元羧酸、二元羧酸和三元羧酸，诸如乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水杨酸以及磺酸，诸如对甲苯磺酸和甲磺酸。可形成一元酸盐或二元酸盐，并且此类盐可以水合形式、溶剂化形式或大致上无水形式存在。适当盐的选择将是本领域的技术人员所已知的。

如本文所用的术语“药学上可接受的碱加成盐”意指任何酸化合物的任何无毒的有机或无机碱加成盐。形成合适的盐的例示性无机碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钡。形成合适的盐的例示性有机碱包括脂族、脂环族或芳香族有机胺，诸如甲胺、三甲胺和甲基吡啶或氨。适当盐的选择将是本领域的技术人员所已知的。

如本文所用的术语“药学上可接受的载体”意指适用于配制用于医学或治疗性用途的药物的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体助滤剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。

术语“预防”是本领域认可的，并且当相对于病状诸如局部复发(例如，疼痛)、疾病诸如癌症、征候诸如心力衰竭或任何其他医学病状使用时，是在本领域中所熟知的，并且包括向无症状受试者施用组合物，相对于不接受所述组合物的受试者，所述组合物减少所述无症状受试者的医学病状的症状的频率或严重性，或延缓其发病。因此，癌症的预防例如包括例如以统计上和/或临床上显著的量，减少接受预防性治疗的患者群体相对于未治疗对照群体的可检测癌性生长的数量，和/或延缓治疗群体相对于未治疗对照群体的可检测癌性生长的出现。感染的预防包括例如减少治疗群体相对于未治疗对照群体的感染的诊断的数量，和/或延缓治疗群体相对于未治疗对照群体的感染的症状的发病。疼痛的预防包括例如减小治疗群体相对于未治疗对照群体中的受试者所经历的疼痛感的强度或可替代地延缓疼痛感。

疗法或药剂(诸如激动剂、拮抗剂或抑制剂)的“治疗有效量”(“有效量”)或“治疗有效剂量”是药物或疗法当向受试者施用时将具有预期的治疗性作用的量。完全的治疗性作用并不一定通过施用一次剂量而出现，而可能仅在施用一系列剂量之后才出现。因此，可以一次或多次施用来施用治疗有效量。受试者所需的精确有效量将取决于例如受试者的身材、健康和年龄，以及受治疗的病状的性质和程度。熟练技术人员可易于通过常规实验确定给定情况的有效量。

“治疗”病状或患者是指采取措施以获得有益的或所需的结果，包括临床结果。如本文所用以及本领域中所熟知的，“治疗”是用于获得有益的或所需的结果(包括临床结果)的方式。有益的或所需的临床结果可以包括但不限于一种或多种症状或病状的缓解或改善、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病扩散的预防、疾病进程的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分缓解或是全部缓解)，无论是可检测的或是不可检测的。“治疗”还可意指与未接受治疗时期望的存活相比延长存活。

I.生物分子、修饰的生物分子和抗原

在一些实施方案中，本发明涉及一种抗原，其包括通过活性氧(ROS)或活性氮(RNS)修饰的生物分子。在一些实施方案中，本发明涉及一种抗原，其包括通过活性卤素物质(RHS)修饰的生物分子。抗原可以是修饰的生物分子。生物分子可以是蛋白质，诸如糖蛋白、脂质或碳水化合物。生物分子可通过细胞系(诸如癌细胞系或病原体)表达。在一些实施方案中，生物分子是分离的和/或纯化的。例如，生物分子可以是重组蛋白或合成肽。修饰的生物分子或抗原可以是重组蛋白或合成肽。抗原可以是隐性抗原。

修饰的生物分子或抗原可以是包含修饰的氨基酸的蛋白质或肽，所述氨基酸诸如硝基酪氨酸、二硝基酪氨酸、氯酪氨酸、二氯酪氨酸、二酪氨酸、2-氨基-3-(3，4-二氧代-环己-1，5-二烯基)-丙酸、间酪氨酸、邻酪氨酸、L-DOPA(3，4-二羟苯丙氨酸)、硝基苯基丙氨酸、氯苯基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、瓜氨酸(例如，其中瓜氨酸替换精氨酸)、N-γ-硝基精氨酸、S-硝基半胱氨酸、半胱次磺酸、半胱亚磺酸、半胱氨酸磺酸、2-氧代组氨酸、天冬酰胺(例如，其中天冬酰胺替换组氨酸)、天冬氨酸(例如，其中天冬氨酸替换组氨酸)、羟脯氨酸、吡咯烷酮、谷氨酸半醛、2-氨基-3-酮丁酸、α-氨基己二酸半醛、羟基色氨酸、2-氧代-色氨酸、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、羟基赖氨酸、2-氨基己二酰-半醛、MDA-赖氨酸、HNE-赖氨酸、丙烯醛-赖氨酸、羧甲基赖氨酸或pHA-赖氨酸。修饰的氨基酸可以是修饰的半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸或苯丙氨酸。修饰的生物分子或抗原可包括S-硝基谷胱甘肽。修饰的生物分子或抗原可包括4-羟基壬烯醛(“HNE”)或丙二醛(“MDA”)。修饰的生物分子可包括13-羟基-9Z，11E-十八碳二烯酸、13-羟基-9E，11E-十八碳二烯酸、9-羟基-10E，12-E-十八碳二烯酸(9-EE-HODE)、11-羟基-9Z，12-Z-十八碳二烯酸、4-羟基壬烯醛、13-羟基-9Z，11E-十八碳二烯酸、9-羟基-10E，12-Z-十八碳二烯酸、10-羟基-8E，12Z-十八碳二烯酸、12-羟基-9Z-13-E-十八碳二烯酸、13-羟基十八碳二烯酸或9-羟基十八碳二烯酸。

生物分子可选自以下各项：皮瓣结构-特异性内切核酸酶1(FEN1)；高尔基体重组堆叠蛋白1(GORASP1)、具有GTP酶结构域-锚蛋白重复序列和PH结构域的ArfGAP1(AGAP1)；微管相关蛋白tau(MAPT)；线粒体核糖体蛋白L46(MRPL46)；以及原钙粘着蛋白β6(PCDHB6)。生物分子可以是包含编码FEN1、GORASP1、AGAP1、MAPT、MRPL46或PCDHB6的氨基酸序列的子序列的肽。生物分子可以是包含与编码FEN1、GORASP1、AGAP1、MAPT、MRPL46或PCDHB6的氨基酸序列的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的肽。子序列长度可以是至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。

生物分子可以是tau、α-突触核蛋白、淀粉样蛋白β或淀粉样蛋白β前体蛋白。生物分子可以是包含与编码tau、α-突触核蛋白、淀粉样蛋白β或淀粉样蛋白β前体蛋白的氨基酸序列的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的肽。

生物分子可以是abri蛋白、胰岛淀粉样多肽(胰淀素)、对应于亨廷顿蛋白(huntingtin)的外显子1的肽、孕激素α、雄激素受体蛋白的氨基端结构域、共济失调蛋白(ataxin)-1、DRPLA蛋白(萎缩蛋白-1)、超氧化物歧化酶I、β-2-微球蛋白或降钙素。生物分子可以是包含与编码以下各项的氨基酸序列的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的肽：abri蛋白、胰岛淀粉样多肽(胰淀素)、对应于亨廷顿蛋白的外显子1的肽、孕激素α、雄激素受体蛋白的氨基端结构域、共济失调蛋白-1、DRPLA蛋白(萎缩蛋白-1)、超氧化物歧化酶I、β-2-微球蛋白或降钙素。

生物分子可以是半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)c、甲状腺素运载蛋白、β2微球蛋白、血清淀粉样蛋白A、免疫球蛋白轻链可变结构域、胰岛素、溶菌酶(例如，人类溶菌酶)、α乳清蛋白、应乐果甜蛋白(monellin)、雄激素受体蛋白的配体结合结构域或DNA结合结构域、乳凝集素(例如，medin)、凝溶胶蛋白、载脂蛋白A1、纤维蛋白原或心房利钠因子。生物分子可以是包含与编码以下各项的氨基酸的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的肽：半胱氨酸蛋白酶抑制剂c、甲状腺素运载蛋白、β2微球蛋白、血清淀粉样蛋白A蛋白、免疫球蛋白轻链可变结构域、胰岛素、溶菌酶(例如，人类溶菌酶)、α乳清蛋白、应乐果甜蛋白、雄激素受体蛋白的配体结合结构域或DNA结合结构域、乳凝集素(例如，medin)、凝溶胶蛋白、载脂蛋白A1、纤维蛋白原或心房利钠因子。

生物分子可以是CD52、白细胞介素2受体、CD30、表皮生长因子受体、CD38、白细胞介素-1β、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、CD20、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、CD3、免疫球蛋白E、呼吸道合胞病毒F蛋白、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2(HER2/neu)、受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-3(HER3)、整合蛋白α4β7、白细胞介素12、白细胞介素23、白细胞介素6受体或整合蛋白α4亚基。

生物分子可以是4-1BB、活化素受体类型-2B、活化素受体样激酶1、AGS-22M6、甲胎蛋白、淀粉样蛋白α、淀粉样蛋白β、淀粉样蛋白前体蛋白、血管生成素-2、炭疽毒素、B细胞活化因子(BAFF)、癌症抗原125(CA-125/粘蛋白16)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、C-C趋化因子受体类型4(CCR4)、C-C趋化因子受体类型5(CCR5)、C-C基序趋化因子11(CCL11)、CD2、CD3、CD3ε、CD4、CD6、CD11、CD15、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40配体(CD40L)、CD44、CD51、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79B、CD80、CD125、CD147、CD152、CD154、CD200、CD221、CD274、CEA相关抗原、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、密封蛋白-18、集落刺激因子1受体(CSF1R)、补体成分5、含铜胺氧化酶3(AOC3)、巨细胞病毒糖蛋白B、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、死亡受体-5(DR5/TRAILR2)、δ样配体4(DLL4)、二肽基肽酶4、大肠杆菌志贺毒素类型-1、大肠杆菌志贺毒素类型-2、含EGF样结构域的蛋白7、唾液酸蛋白、内毒素、表皮生长因子受体(HER1)、上皮唾蛋白(episialin)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、因子D、成纤维细胞活化蛋白α、叶酸受体1、卷曲受体(Frizzled receptor)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子8、鸟苷酸环化酶2C、热休克蛋白90、乙型肝炎表面抗原、肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)、人类分散因子受体激酶、亨廷顿蛋白、免疫球蛋白E、免疫球蛋白ε链C区、流感血球凝集素(HA)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、整合蛋白α4亚基、整合蛋白α4β7、整合蛋白α5β1、整合蛋白α7β7、整合蛋白αIIbβ3、整合蛋白αv亚基、整合蛋白αvβ3、整合蛋白β2亚基、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、干扰素α、干扰素γ、干扰素γ诱导蛋白、干扰素α/β受体、白细胞介素1β、白细胞介素2受体、白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素6、白细胞介素6受体、白细胞介素9、白细胞介素12、白细胞介素17、白细胞介素17A、白细胞介素17F、白细胞介素22、白细胞介素23、白细胞介素31受体A、低密度脂蛋白、L-选择蛋白、淋巴细胞功能相关性抗原1(CD11a)、淋巴毒素-α、赖氨酰氧化酶同系物2(LOXL2)、巨噬细胞迁移抑制因子(MMIF)、间皮素、金属还原酶STEAP1、髓磷脂相关糖蛋白、肌生长抑制素、神经生长因子(NGF)、神经细胞凋亡调节蛋白酶1、神经毡蛋白-1、NOGO-A、Notch受体、PD-1、磷酸钠共转运蛋白、血小板衍生生长因子受体α、血小板衍生生长因子受体β、程序性细胞死亡蛋白1(CD279)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9(PCSK9)、狂犬病病毒糖蛋白、核因子κB配体的受体活化剂(RANKL)、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2(HER2/neu)、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3(HER3)、呼吸道合胞病毒F蛋白、网状内皮素-4、Rh血型D抗原、恒河猴因子、硬化蛋白(SOST)、选择蛋白P、SLAM家族成员7、粘结蛋白聚糖1、腱生蛋白C、转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β2(TGF-β2)、跨膜糖蛋白NMB、滋养层糖蛋白、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤相关性钙信号转导蛋白2、肿瘤相关性糖蛋白72(TAG-72)、TWEAK受体、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2或波形蛋白。

生物因子可以是与选自以下各项的细菌传染病的病变相关的分子：炭疽病、细菌性脑膜炎、肉毒中毒、布氏杆菌病(Brucellosis)、弯曲杆菌病(Campylobacteriosis)、猫抓病、霍乱、白喉、淋病、脓疱病、军团杆菌病(Legionellosis)、麻疯病(汉森氏病(Hansen′sDisease))、钩端螺旋体病(Leptospirosis)、李斯特菌病(Listeriosis)、莱姆病(Lymedisease)、类鼻疽病、MRSA感染、诺卡菌病(Nocardiosis)、百日咳(Pertussis/Whooping Cough)、鼠疫、肺炎球菌肺炎(Pneumococcal pneumonia)、鹦鹉病(Psittacosis)、Q热病、落基山斑疹热(Rocky Mountain Spotted Fever，RMSF)、沙门氏菌病(Salmonellosis)、猩红热、志贺氏菌病(Shigellosis)、梅毒、破伤风、沙眼、结核病、兔热病(Tularemia)、伤寒、斑疹伤寒(包括流行性斑疹伤寒)以及尿道感染。

生物分子可以是与选自以下各项的寄生虫传染病的病变相关的分子：阿米巴病(Amoebiasis)、蛔虫病(Ascariasis)、焦虫病(Babesiosis)、恰加斯病(Chagas Disease)、华支睾吸虫病(Clonorchiasis)、隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)、猪囊尾蚴病(Cysticercosis)、裂头绦虫病(Diphyllobothriasis)、麦地那龙线虫病(Dracunculiasis)、包虫病(Echinococcosis)、蛲虫病(Enterobiasis)、肝片吸虫病(Fascioliasis)、姜片虫病(Fasciolopsiasis)、丝虫病(Filariasis)、自生阿米巴感染、贾第虫病(Giardiasis)、颚口线虫病(Gnathostomiasis)、膜壳绦虫病(Hymenolepiasis)、孢子球虫病(Isosporiasis)、黑热病(KaIa-azar)、利什曼病(Leishmaniasis)、疟疾、后殖吸虫病(Metagonimiasis)、蝇蛆病、盘尾丝虫病(Onchocerciasis)、虱病(Pediculosis)、蛲虫感染、疟原虫、疥疮、血吸虫病(Schistosomiasis)、绦虫病(Taeniasis)、弓蛔虫病(Toxocariasis)、弓形体病(Toxoplasmosis)、横膈旋毛虫病(Trichinellosis)、旋毛虫病(Trichinosis)、鞭虫病(Trichuriasis)、滴虫病(Trichomoniasis)以及锥虫病(Trypanosomiasis)(包括非洲锥虫病)。

生物分子可以是与选自由以下组成的组的病毒性传染病的病变相关的分子：AIDS、AIDS相关综合症、水痘(Chickenpox/Varicella)、普通感冒、巨细胞病毒感染(Cytomegalovirus Infection)、科罗拉多蜱热(Colorado tick fever)、登革热(Denguefever)、埃博拉出血热(Ebola haemorrhagic fever)、手足口病、肝炎、单纯疱疹(Herpessimplex)、带状疱疹(Herpes zoster)、HPV、流感(Influenza/Flu)、拉沙热(Lassa fever)、麻疹、马尔堡出血热(Marburg haemorrhagic fever)、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、脊髓灰质炎、进行性多灶性脑白质病(Progressive multifocal leukencephalopathy)、狂犬病、风疹、SARS、天花(Smallpox/Variola)、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗病(West Nile disease)以及黄热病。流感可以是甲型流感、乙型流感或丙型流感，并且甲型流感可以是亚型H3N2、H1N1或H5N1。体液人类免疫系统识别来自病毒的两种主要免疫原性蛋白，即血凝素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)。HA分子的头部或顶部已知的表位区对应于高变区。这些序列是高度可变的并且分离的序列在此区域内具有变型。生物分子可以是流感的血凝素、神经氨酸苷酶或M2质子通道(例如，M2e肽)。生物分子可以是HIV的分化体B gag、蛋白酶、逆转录酶、gp120、nef肽、脂肽、gp41或env。生物分子可以是丙型肝炎的包膜糖蛋白(E1/E2)。

生物分子可以是经历原纤维生成的球状蛋白，并且与一种或多种蛋白构象症状相关联，所述生物分子包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂c、甲状腺素运载蛋白、β2微球蛋白、血清淀粉样蛋白A以及其片段、亨廷顿蛋白以及其片段(包括亨廷顿蛋白的外显子I)、免疫球蛋白轻链可变结构域、胰岛素、溶菌酶(具体地是人类溶菌酶)、α乳清蛋白、应乐果甜蛋白、雄激素受体蛋白的配体结合结构域和DNA结合结构域、乳凝集素以及更具体地其片段(例如，氨基酸残基245-294；medin)、凝溶胶蛋白、载脂蛋白A1、纤维蛋白原以及其片段以及心房利钠因子。

作为具体实例，在阿尔茨海默氏病中，病变与4kDa淀粉样蛋白β(Aβ)肽的存在强烈相关，所述4kDa淀粉样蛋白β(Aβ)肽是Aβ肽前体(APP)通过酶早老素1(PS1)裂解的部分。研究指示，Aβ1-40的纤维状形式刺激小胶质细胞，并且当前被认为在阿尔茨海默氏病的发病中起到重要作用(Jekabsone，A.等，J.Neuroinflammation 3：24(2006))。Aβ1-40的肽序列在表2中示出。在另一方面，Aβ1-42被认为有助于引发纤维状Aβ的形成，所述Aβ1-42是斑块形成Aβ的微小部分。这种肽的“长形式”在表2中进行描述。生物分子可以是例如Aβ1-40、Aβ1-42或前述任一者的子序列。

另一个具体实例是帕金森氏病(PD)。PD是影响1％-2％年龄超过50岁的个体的退行性神经病症。神经病理学标志的特征在于在称为路易体(LB)的嗜酸性内含物、细胞浆内含物、蛋白质内含物存在下黑质密部中的多巴胺能神经元进行性丧失。α-突触核蛋白是路易体中最丰富的蛋白质，并且它看起来在PD中是毒性的重要介体，甚至可能是病因因素。因此，减少毒性α-突触核蛋白被认为对于PD患者是有益的。衍生自全长蛋白质的C端区的一种此类小鼠α-突触核蛋白肽的序列在表2中示出。此外，消除或隔离硝化的α-突触核蛋白以及其片段看起来对于患有PD的患者具有有利的作用。在本发明的一些实施方案中，生物分子是包含人类α-突触核蛋白的氨基酸121-137(DNEAYEMPSEEGYQDYE)的片段。在一些实施方案中，α-突触核蛋白片段(121-137)序列在不同物质中在位置121和位置122处被取代，在每个Y(酪氨酸)位置处被三硝化，和/或在S129处被磷酸化。

在一些实施方案中，生物分子是基于与朊病毒疾病相关的肽序列。各种物质的朊病毒序列通过Harmeyer，S.等，J Gen Virol.79(Pt4)：937-45(1998)进行公开，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，生物分子是基于衍生自超氧化物歧化酶I(SOD1)的肽序列。已知SOD1突变与一些形式的家族性ALS的病变具有因果关系。据报道，针对SOD1的突变体形式(人类G93A SOD1重组蛋白)产生的抗血清对于携带G37R突变体SOD1的ALS小鼠模型具有保护性作用，所述小鼠模型过度表达的SOD1蛋白比内源性小鼠SOD1高4倍。

错折叠蛋白在亨廷顿氏病(Huntington′s disease)中也起作用，所述亨廷顿氏病是由亨廷顿蛋白(htt)中的聚谷氨酰胺(polyQ)通道的病理扩张而导致的遗传症状，引起神经变性和过早死亡。结合到由亨廷顿蛋白的N-端17个氨基酸形成的表位的单链抗体(Lecerf，J-M等，Proc Nat’l Acad Sci USA 98(8)：4764-4769(2001))已显示减少亨廷顿氏病的果蝇模型(Drosophila model)中的病状。(Wolfgang，WJ等，Proc Nat’l Acad SciUSA.102(32)：11563-11568(2005))。

另一个具体实例是透析相关性淀粉样变性(DRA)。DRA可能是由不同形式的血液过滤导致的，所述血液过滤诸如血液透析、血液过滤或连续不卧床腹膜透析(CAPD)。DRA在透析超过15年的患者中具有大于95％的发病率，其中β-2-微球蛋白(B2M)淀粉样变性是普遍的并且随时间可预测地增加。已在临床环境下观察到B2M的构象异构体。B2M是人类白细胞抗原(HLA)I类分子的部分，并且它具有淀粉样蛋白原纤维的突出的β折叠结构特征。已知B2M作为分布在细胞外空间的未结合单体进行循环。B2M经历原纤维生成而在各种组织中形成淀粉样沉积物。此沉积造成肾衰竭，所述肾衰竭造成B2M的合成和释放增加，从而使病状恶化。因此，在本发明的一个实施方案中，生物分子可以是β2微球蛋白或其片段。B2M的示例性片段是表2中跨氨基酸残基21-40的片段，其适用作本发明的生物分子。

生物分子可以是包含与编码任一种前述生物分子的氨基酸序列的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的肽。子序列长度可以是至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400或500个氨基酸。对疾病状态或不良反应具有一些重要性的肽序列可通过对相关表位的实验研究来识别。这些序列可包括非天然存在的肽序列，例如适用于治疗疾病或病状的序列(参见，例如WO 2006/031727和US 6,930,168，其各自以引用的方式整体并入本文)。

此外，表位可通过以下方式凭经验确定：通过对合成组合肽文库进行位置扫描来识别候选序列，或通过制备感兴趣的整个蛋白质的重叠肽序列，并且使用例如适用于此类目的的任何读出测定来测试那些肽的免疫反应性，所述读出测定诸如HI测定、病毒攻击模型或对于疾病或物质(针对其寻找新型抗原或抗体)适当的体外或体内测定系统。候选分子可包括在合成过程中或在合成之后通过例如糖添加和/或修饰糖添加(诸如糖基化和糖合成，N-连接的或S-连接的)、脂肪酸修饰(诸如十四烷基化)或二硫键形成来修饰的肽。在识别候选表位之后，一组另外的相关表位可使用亚株变体、集群变体、滑移变体、位移变体或者通过在可易于获得的参考文献(例如，WO 2000/042559，它以引用的方式并入本文)中描述的建模和预测算法来生成。可用作本发明的生物分子的各种子序列在表1和表2中呈现。

表1.可用作本发明的生物分子的病毒蛋白的子序列

表2.可用作本发明的生物分子的人类蛋白质的子序列

修饰的生物分子可包含的表位相对于未修饰的生物分子上的相同表位具有增加的免疫原性。

在一些实施方案中，生物分子通过RNS进行修饰，所述RNS是一氧化氮或过氧化亚硝酸盐。生物分子可以是通过酪氨酸的硝化、硫醇的S-亚硝基化或金属离子的亚硝化进行修饰的蛋白质。生物分子可通过金属离子的亚硝化进行修饰，其中所述金属离子是铁。金属离子可以是铜、铬、锰或钴。在一些实施方案中，生物分子包括卟啉(诸如血红素，例如血红素A、血红素B、血红素C或血红素O)，并且生物分子通过对结合到卟啉的金属离子进行亚硝化来修饰。生物分子可包括钴胺素，诸如甲基钴胺素或腺苷钴胺。

生物分子可使用以下各项修饰：过氧化亚硝酸、过氧化亚硝酸盐、一氧化氮、二氧化氮、二氧化氮基、三氧化二氮、亚硝鎓阳离子、亚硝基硫酸盐、亚硝基高氯酸盐、四氟硼酸亚硝鎓、亚硝基过氧碳酸盐、硝鎓阳离子、碳酸根、过氧化一碳酸根、羧基、过氧化物、过氧化氢、有机过氧化氢、过氧基、烷氧基、超氧化物、单线态氧、羟基、臭氧、氧硫基、次卤酸盐、次氯酸盐、次溴酸盐、次硫氰酸盐、硝酰氯、卤胺、单氯胺、溴胺、二氧化氯或磷酸根。

II.抗体、抗体片段以及嵌合抗原受体

在一些实施方案中，本发明涉及一种选择性地结合到修饰的生物分子的抗体，其中抗体对于修饰的生物分子的亲和力大于抗体对于未修饰的生物分子的亲和力。例如，抗体对于修饰的生物分子的亲和力可比抗体对于未修饰的生物分子的亲和力高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、10,000％或100,000％。

在某些实施方案中，抗体对于修饰的生物分子的亲和力与抗体对于未修饰的生物分子的亲和力大约相同。例如，抗体对于修饰的生物分子的亲和力可以是抗体对于未修饰的生物分子的亲和力的0.1倍与10倍之间。

在一些实施方案中，本发明涉及一种选择性地结合到未修饰的生物分子的抗体，其中抗体对于未修饰的生物分子的亲和力大于抗体对于修饰的生物分子的亲和力。例如，抗体对于未修饰的生物分子的亲和力可比抗体对于修饰的生物分子的亲和力高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、10,000％或100,000％。

抗体可以是分离的抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。抗体可以是人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4抗体。

在某些方面，本发明涉及一种编码抗体的分离的核酸。在某些方面，本发明涉及一种包含编码抗体的外源核酸的细胞。在某些方面，本发明涉及一种产生抗体的方法，所述方法包括培养表达编码所述抗体的核酸的细胞。

在某些方面，本发明涉及一种包含抗体的组合物，其中所述抗体缀合到细胞毒性剂。

在某些方面，本发明涉及一种抗体片段，所述抗体片段包含抗体的抗原结合区。抗体片段可以是单链可变片段(scFv)。抗体片段可以是抗原结合片段(Fab)、化学地连接的Fab片段或Fab片段，其包括铰链区F(ab’)₂、二聚体scFv(双scFv)、单结构域抗体(sdAb)、三官能抗体(3funct)或双特异性T细胞接合器(BiTE)。

在某些方面，本发明涉及一种编码所述抗体片段的核酸。在某些方面，本发明涉及一种包含编码所述抗体片段的外源核酸的转化的细胞。在某些方面，本发明涉及产生抗体片段的方法，所述方法包括培养表达编码所述抗体片段的核酸的细胞。在某些方面，本发明涉及一种包含抗体片段的组合物，其中所述抗体片段缀合到细胞毒性剂。

在一些实施方案中，本发明涉及一种包含如本文所述的抗体或抗体片段诸如scFv的嵌合抗原受体。在某些方面，本发明涉及一种编码所述嵌合抗原受体的核酸。在某些方面，本发明涉及一种包含编码所述嵌合抗原受体的外源核酸的转化的细胞。在某些方面，本发明涉及一种包含所述嵌合抗原受体的转化的细胞。包含所述嵌合抗原受体的转化的细胞可以是淋巴细胞，诸如T细胞。转化的细胞可以是外周血单核细胞。包含所述嵌合抗原受体的转化的细胞可以是人类淋巴细胞，诸如人类T细胞。

III.克隆细胞、表达细胞以及治疗性细胞

在一些方面，本发明涉及一种包含如本文所述的抗体、抗体片段或嵌合抗原受体的细胞。在一些实施方案中，细胞包含编码如本文所述的抗体、抗体片段或嵌合抗原受体的核酸。在一些实施方案中，细胞表达如本文所述的抗体、抗体片段或嵌合抗原受体。

细胞可选自以下各项：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌、蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)、烟草(Nicotiana)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、原鸡(Gallus gallus)、小家鼠(Mus musculus)、野猪(Sus scrofa)、绵羊(Ovis aries)、野山羊(Capra aegagrus)、奶牛(Bos taurus)、Sf9细胞、Sf21细胞、Schneider 2细胞、Schneider 3细胞、High Five细胞、NS0细胞、中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞、幼仓鼠肾脏细胞、COS细胞、Vero细胞、HeLa细胞以及HEK293细胞。例如，细胞可包含编码抗体、抗体片段或嵌合抗原受体的核酸，并且所述细胞可以是大肠杆菌，例如以用于克隆所述核酸。细胞可包含编码抗体或抗体片段的核酸，并且所述细胞可以是CHO细胞，例如以用于表达所述抗体或抗体片段。

细胞可以是淋巴细胞，诸如T细胞或外周血单核细胞。细胞可以是淋巴细胞并且包含编码嵌合抗原受体的核酸。细胞可以是淋巴细胞并且包含嵌合抗原受体。细胞可以是淋巴细胞并且所述淋巴细胞可表达嵌合抗原受体。细胞可以是T细胞并且所述T细胞表达嵌合抗原受体，例如，其中所述嵌合抗原受体选择性地结合到修饰的生物分子。细胞可例如通过缺失一个或多个HLA蛋白来进行修饰以用于同种异体移植。

IV.疫苗

在某些方面，本发明涉及一种包含抗原的疫苗。抗原可以是如本文所述的修饰的生物分子。疫苗还可包含药学上可接受的载体。

包含修饰的生物分子的疫苗可促进针对靶标生物分子的主动免疫，所述靶标生物分子包含或不包含存在于疫苗中的修饰。例如，包含修饰的生物分子的疫苗可诱导受试者生成针对自身抗原的自身免疫应答，所述自身抗原诸如与癌症、炎性疾病或神经变性疾病相关联的自身抗原。类似地，包含修饰的生物分子的疫苗可诱导受试者生成针对存在于病原体或毒素上的抗原的免疫应答，所述抗原通常不会激发免疫应答，诸如所述病原体的隐性表位。另外，包含修饰的生物分子的疫苗可诱导受试者生成针对生物分子的特异性表位的免疫应答，所述生物分子可引起的免疫应答比针对未修饰的生物分子引起的免疫应答更有利(例如，更耐久、更强烈或两者)。例如，修饰的生物分子可包含的表位相对于未修饰的生物分子上的相同表位具有增加的免疫原性，从而增加针对所述表位的免疫应答。

V.用于产生抗原的方法

在某些方面，本发明涉及一种产生抗原的方法，所述方法包括将细胞与活性氧(ROS)或活性氮(RNS)接触，其中ROS或RNS对由细胞产生的生物分子进行修饰，并且抗原是修饰的生物分子或修饰的生物分子上的表位。在某些方面，本发明涉及一种产生抗原的方法，所述方法包括将细胞与活性卤素物质(RHS)接触，其中RHS对由细胞产生的生物分子进行修饰，并且抗原是修饰的生物分子或修饰的生物分子上的表位。

在某些方面，本发明涉及产生抗原的方法，所述方法包括将生物分子与活性氧(ROS)或活性氮(RNS)接触，其中ROS或RNS对生物分子进行修饰，并且抗原是修饰的生物分子或修饰的生物分子上的表位。在某些方面，本发明涉及一种产生抗原的方法，所述方法包括将细胞与活性卤素物质(RHS)接触，其中RHS对生物分子进行修饰，并且抗原是修饰的生物分子或修饰的生物分子上的表位。

生物分子可以是蛋白质或脂质。例如，生物分子可选自以下各项：皮瓣结构-特异性内切核酸酶1(FEN1)；高尔基体重组堆叠蛋白1(GORASP1)、具有GTP酶结构域-锚蛋白重复序列和PH结构域的ArfGAP1(AGAP1)；微管相关蛋白tau(MAPT)；线粒体核糖体蛋白L46(MRPL46)；以及原钙粘着蛋白β6(PCDHB6)。生物分子可以是以上部分I中所描述的任一种生物分子。

所述方法可包括将生物分子与一氧化氮、一氧化氮供体(例如，NONOate)或亚硝化剂(例如，过氧化亚硝酸盐)接触。例如，所述方法可包括将生物分子与NONOate化合物一起孵育，其中所述方法包括将生物分子与一氧化氮接触，并且NONOate化合物产生一氧化氮。所述方法可包括将生物分子与NONOate化合物一起孵育，其中所述方法包括将生物分子与一氧化氮供体接触，并且NONOate化合物是一氧化氮供体。NONOate化合物可以是二亚乙基三胺NONOate。所述方法可包括将生物分子与过氧化亚硝酸盐或任何其他亚硝化化合物接触。

在一些实施方案中，组合物包含生物分子，所述组合物诸如包含细胞的组合物(即，其中所述细胞包含所述生物分子)、包含细胞裂解物的组合物、包含病毒的组合物(即，其中所述病毒包含所述生物分子)或包含生物分子和溶剂(例如，水)的组合物。所述方法可包括将组合物与一氧化氮、一氧化氮供体(例如，NONOate)或亚硝化剂(例如，过氧化亚硝酸盐)接触。例如，所述方法可包括将组合物与NONOate化合物一起孵育，其中所述方法包括将组合物与一氧化氮接触，并且NONOate化合物产生一氧化氮。所述方法可包括将组合物与NONOate化合物一起孵育，其中所述方法包括将组合物与一氧化氮供体接触，并且NONOate化合物是一氧化氮供体。NONOate化合物可以是二亚乙基三胺NONOate。所述方法可包括将组合物与过氧化亚硝酸盐或任何其他亚硝化化合物接触。

方法可包括将生物分子与以下各项接触：过氧化亚硝酸、过氧化亚硝酸盐、一氧化氮、二氧化氮、二氧化氮基、三氧化二氮、亚硝鎓阳离子、亚硝基硫酸盐、亚硝基高氯酸盐、四氟硼酸亚硝鎓、亚硝基过氧碳酸盐、硝鎓阳离子、碳酸根、过氧化一碳酸根、羧基、过氧化物、过氧化氢、有机过氧化氢、过氧基、烷氧基、超氧化物、单线态氧、羟基、臭氧、氧硫基、次卤酸盐、次氯酸盐、次溴酸盐、次硫氰酸盐、硝酰氯、卤胺、单氯胺、溴胺、二氧化氯或磷酸根。

组合物可与ROS或RNS一起孵育至少5分钟，诸如至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时或至少18小时。

在一些实施方案中，接触包括与活性氧、活性氮或活性卤素物质一起孵育至少5分钟，诸如至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时或至少18小时。

在一些实施方案中，抗原可通过合成生物分子(例如，通过合成“修饰的生物分子”)产生。例如，抗原可以是肽，并且产生抗原可包括例如使用复制氧化损伤的特征的一种或多种氨基酸(或氨基酸混合物)来合成肽。例如，肽可在肽的氨基酸序列中的一个或多个位置处使用硝基酪氨酸(即，包含合适的保护基团，例如用于FMOC或tBOC化学)代替酪氨酸来合成。类似地，肽可在肽的氨基酸序列中的一个或多个位置处使用硝基酪氨酸和酪氨酸的混合(例如，以1∶10、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1的比率)来合成。

VI.用于识别抗体的方法

在一些方面，本发明涉及一种识别抗体的方法，所述方法包括将细胞与活性氧(ROS)或活性氮(RNS)接触，其中ROS或RNS对生物分子进行修饰；以及选择结合到修饰的生物分子的抗体。

在一些实施方案中，本发明涉及识别抗体的方法，所述方法包括：将生物分子与活性氧(ROS)或活性氮(RNS)接触以便对生物分子进行修饰；以及选择结合到修饰的生物分子的抗体。生物分子可以是蛋白质、脂质或碳水化合物。生物分子可以是本文所述的任一种生物分子。例如，生物分子可以是皮瓣结构-特异性内切核酸酶1(FEN1)；高尔基体重组堆叠蛋白1(GORASP1)、具有GTP酶结构域-锚蛋白重复序列和PH结构域的ArfGAP1(AGAP1)；微管相关蛋白tau(MAPT)；线粒体核糖体蛋白L46(MRPL46)；或原钙粘着蛋白β6(PCDHB6)。生物分子可以是包含与编码FEN1、GORASP1、AGAP1、MAPT、MRPL46或PCDHB6的氨基酸序列的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列的肽或多肽。生物分子可以是包含氨基酸序列的肽或多肽，所述氨基酸序列是编码FEN1、GORASP1、AGAP1、MAPT、MRPL46或PCDHB6的氨基酸序列的子序列。

所述方法可包括将生物分子与一氧化氮、一氧化氮供体或亚硝化剂接触。例如，所述方法可包括在NONOate化合物产生一氧化氮的条件下与NONOate化合物一起孵育。NONOate化合物可以是二亚乙基三胺NONOate(DETA-NONOate)或二乙基胺NONOate(DEA-NONOate)。所述方法可包括将生物分子与过氧化亚硝酸盐接触。方法可包括将生物分子与以下各项接触：过氧化亚硝酸、过氧化亚硝酸盐、一氧化氮、二氧化氮、二氧化氮基、三氧化二氮、亚硝鎓阳离子、亚硝基硫酸、亚硝基高氯酸盐、四氟硼酸亚硝鎓、亚硝基过氧碳酸盐、硝鎓阳离子、碳酸根、过氧化一碳酸根、羧基、过氧化物、过氧化氢、有机过氧化氢、过氧基、烷氧基、超氧化物、单线态氧、羟基、臭氧、氧硫基、次卤酸盐、次氯酸盐、次溴酸盐、次硫氰酸盐、硝酰氯、卤胺、单氯胺、溴胺、二氧化氯或磷酸根。

在一些实施方案中，接触包括与活性氧、活性氮或活性卤素物质一起孵育至少5分钟，诸如至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时或至少18小时。

在一些实施方案中，接触包括与过氧化亚硝酸盐一起孵育至少5分钟，诸如至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时或至少18小时。

选择抗体可包括将动物暴露于修饰的生物分子，以及分离动物所产生的抗体。

选择抗体可包括将动物暴露于修饰的生物分子；将产生抗体的细胞从动物分离；分离由所述细胞产生的抗体；以及确认抗体结合到修饰的生物分子。

动物可以是小鼠、大鼠、兔、猪、马或羊。

在一些实施方案中，选择抗体包括通过噬菌体展示选择抗体。

VII.用于治疗受试者的方法

在一些方面，本发明涉及一种用于治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含如本文所述的修饰的生物分子的组合物(主动免疫)。在其他方面，本发明涉及一种用于治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含如本文所述的抗体或抗体片段的组合物(被动免疫)。在一些方面，本发明涉及一种用于治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含如本文所述的细胞的组合物，例如，其中细胞包含嵌合抗原受体和/或编码嵌合抗原受体的核酸。在一些方面，本发明涉及一种用于治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含如本文所述的核酸的组合物，例如，其中核酸编码如本文所述的抗体、抗体片段或嵌合抗原受体。

在一些方面，本发明涉及一种用于预防或治疗受试者中的疾病或病状的方法，所述方法包括向受试者施用包含如本文所述的修饰的生物分子的组合物(主动免疫)。在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗受试者中的疾病或病状的方法，所述方法包括向受试者施用包含如本文所述的抗体或抗体片段的组合物(被动免疫)。在一些方面，本发明涉及一种用于预防或治疗受试者中的疾病或病状的方法，所述方法包括向受试者施用包含如本文所述的细胞的组合物，例如，其中细胞包含嵌合抗原受体和/或编码嵌合抗原受体的核酸。在一些方面，本发明涉及一种用于预防或治疗受试者中的疾病或病状的方法，所述方法包括向受试者施用包含如本文所述的核酸的组合物，例如，其中核酸编码如本文所述的抗体、抗体片段或嵌合抗原受体。

受试者可选自啮齿类动物、兔类动物、猫科动物、犬科动物、猪科动物、羊科动物、牛科动物、马科动物以及灵长类动物。受试者可以是人类受试者。

受试者可患有瘤，并且所述方法可以是一种用于治疗所述瘤的方法。受试者可患有癌症，诸如结肠癌、黑素瘤、卵巢癌或乳腺癌。受试者可患有前列腺癌、胃癌(stomachcancer)、成神经细胞瘤、胰腺癌或肺癌。

例如，受试者可患有病毒感染，并且所述方法可以是用于治疗所述病毒感染的方法。例如，受试者可患有细菌感染，并且所述方法可以是用于治疗所述细菌感染的方法。例如，受试者可患有寄生虫感染(诸如利什曼病)，并且所述方法可以是用于治疗所述寄生虫感染的方法。

所述疾病或病状可以是瘤。所述瘤可以是癌症。所述瘤可以是成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、腺癌、转移性脑癌、肾上腺皮质癌、肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌(gastric cancer)、胃肠癌、结肠直肠癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、头颈癌、鼻咽癌、胰腺癌或肾细胞癌。

所述疾病或病状可以是病毒感染、细菌感染或寄生虫感染。所述疾病或病状可以是艰难梭菌(Clostridium difficile)、HIV、脓毒症、埃博拉、利什曼病、流感、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、假丝酵母(Candida)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒或狂犬病。受试者可处于发展以下疾病的风险下：艰难梭菌、HIV、脓毒症、埃博拉、利什曼病、流感、金黄色葡萄球菌、假丝酵母、铜绿假单胞菌、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒或狂犬病。所述疾病或病状可以是AIDS、AIDS相关综合症、水痘、普通感冒、巨细胞病毒感染、科罗拉多蜱热、登革热、埃博拉出血热、手足口病、肝炎、单纯疱疹、带状疱疹、人乳头瘤病毒(HPV)、流感、拉沙热、麻疹、马尔堡出血热、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、脊髓灰质炎、进行性多灶性脑白质病、风疹、SARS、天花、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗病或黄热病。受试者可处于发展以下疾病的风险下：AIDS、AIDS相关综合症、水痘、普通感冒、巨细胞病毒感染、科罗拉多蜱热、登革热、埃博拉出血热、手足口病、肝炎、单纯疱疹、带状疱疹、HPV、流感、拉沙热、麻疹、马尔堡出血热、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、脊髓灰质炎、进行性多灶性脑白质病、狂犬病、风疹、SARS、天花、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗病或黄热病。所述疾病或病状可以是阿米巴病、蛔虫病、焦虫病、恰加斯病、华支睾吸虫病、隐孢子虫病、猪囊尾蚴病、裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、包虫病、蛲虫病、肝片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、自生阿米巴感染、贾第虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、孢子球虫病、黑热病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、蛲虫感染、疟原虫、疥疮、血吸虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、横膈旋毛虫病、旋毛虫病、鞭虫病、滴虫病或锥虫病(包括非洲锥虫病)。受试者可处于发展以下疾病的风险下：阿米巴病、蛔虫病、焦虫病、恰加斯病、华支睾吸虫病、隐孢子虫病、猪囊尾蚴病、裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、包虫病、蛲虫病、肝片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、自生阿米巴感染、贾第虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、孢子球虫病、黑热病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、蛲虫感染、疟原虫、疥疮、血吸虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、横膈旋毛虫病、旋毛虫病、鞭虫病、滴虫病或锥虫病。受试者可暴露于毒素，诸如炭疽。

所述疾病或病状可以是炎性疾病。所述疾病或病状可以是炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、类风湿性关节炎、斑块型银屑病、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、青少年特发性关节炎、多发性硬化症、狼疮、哮喘、系统性硬皮病、皮肌炎或多发性肌炎。

所述疾病或病状可以是神经变性疾病。所述疾病或病状可以是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、散发性肌萎缩性侧索硬化、拉福拉病(Lafora disease)或亨廷顿氏病。所述疾病或病状可以是荷兰遗传性脑出血伴随淀粉样变性(脑血管淀粉样变性)、嗜刚果红血管病(congophilic angiopathy)、皮克氏病(Pick′s disease)、进行性核上性麻痹、家族性英国型痴呆症、路易体相关性疾病、多系统萎缩症、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、脊髓小脑型共济失调、神经元核内包涵体疾病、遗传性齿状核红核-苍白球底丘脑核萎缩(hereditary dentatorubral-pallidoluysian atrophy)、朊病毒相关性疾病、绵羊疯痒病、牛海绵状脑病、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、格-施-沙综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome)、库鲁病(kuru)、致命性家族性失眠症(fatal familial insomnia)、遗传性半胱氨酸蛋白酶抑制剂c淀粉样血管病或拳击员痴呆症。

所述疾病或病状可以是阿斯佩各综合征(Asperger syndrome)、孤独症、ADHD、高胆固醇血症、血脂异常、动脉粥样硬化、心肌梗塞、心力衰竭、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、血栓栓塞、肌营养不良、脆性X综合征(fragile X syndrome)、镰状红细胞病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、早老症、扁平苔藓、白癜风、支气管肺发育不良、成人呼吸窘迫综合征、肺气肿、阑尾炎、胰腺炎、急性胰腺炎、酒精中毒、糖尿病、黄斑变性、葡萄膜炎、白内障生成、骨质疏松、少肌症、慢性疲劳综合征或坐骨神经痛。

受试者可经历过移植，诸如同种异体移植或异种移植。受试者可处于器官移植排斥的风险下。受试者可患有移植物抗宿主疾病。

受试者可患有缺血或血栓栓塞，或者患者可处于缺血或发展栓塞的风险。受试者可患有心脏病或缺血性中风，或者受试者可处于患心脏病或缺血性中风的风险下。

所述疾病或病状可以是癌症，并且修饰的生物分子可以是修饰的FEN1蛋白或其一部分。所述方法可包括例如在向受试者施用包含修饰的生物分子、抗体、细胞或核酸的组合物之前，鉴定患有过度表达FEN1的癌症的受试者。过度表达FEN1的癌症包括结肠癌、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、成神经细胞瘤、胰腺癌以及肺癌。

所述疾病或病状可以是神经变性疾病，诸如阿尔茨海默氏病或帕金森氏病，并且修饰的生物分子可以是修饰的tau蛋白或其一部分。所述方法可包括鉴定患有与tau相关联的神经变性疾病的受试者。与tau相关联的神经变性疾病包括阿尔茨海默氏病和帕金森氏病。

所述疾病或病状可以是利什曼病，并且修饰的生物分子可以是修饰的利什曼原虫蛋白。所述方法可包括鉴定患有利什曼病的受试者。所述方法可包括例如通过在向受试者预防性地施用如本文所述的修饰的生物分子、抗体或抗体片段预防受试者中的利什曼病。

施用可包括注射组合物。注射组合物可包括静脉内注射、皮下注射、肌内注射或瘤内注射。

此公开将根据以下实验细节得到更好的理解。然而，本领域的技术人员将易于理解，所讨论的具体方法和结果仅仅是说明性的，在随后的实施方案中将对本公开进行更充分的描述。

例证

实施例1-使用B16细胞和细胞裂解物生成抗原和抗体的方法

B16作为小鼠黑素瘤肿瘤和免疫疗法模型。皮下模型广泛用于评价在许多肿瘤模型中的疗法，所述肿瘤模型包括免疫原性差的C57BL/6衍生的B16黑素瘤(图2)。在皮下注射之后，B16将在5天至10天内形成可触知的肿瘤，并且在14天至21天内生长为最小1×1×1-cm的肿瘤，从而产生通过NO和NO相关分子增加的B16衍生的抗原免疫原性。将培养的B16细胞体外处理到缓慢释放NO的化合物二亚乙基三胺NONOate(DETA-NONOate)(250μM-相对低的浓度)18小时，以便促进基因表达的调节，从而引起新肿瘤相关性抗原的出现并且在通过超声裂解之后将B16细胞转化成更具有免疫原性的并用作抗原(NOVax)。

修饰。在31μM的NO衍生的硝化剂过氧化亚硝酸盐(ONOO^-)存在下在室温下将通过超声获得的未处理的总培养的B16细胞裂解物孵育3小时，接着在4℃下孵育48小时，并且用作抗原(NiVax)。将抗原制剂冷冻并保存在-80℃下，直至将其用于主动治疗性免疫中或用于生成用于被动治疗性治疗携带肿瘤的小鼠的抗血清。

用于被动治疗性治疗(血清转移)和抗体发现的抗血清生成。在皮下(SC)使用100μL(～100μg的蛋白质)未处理的B16裂解物(对照Vax)、重编程的B16裂解物(NOVax)或修饰的B16裂解物(NiVax)对未携带肿瘤的C57BL/6雌性小鼠(6-12周大)进行免疫。在第7天和第21天给予使用相同剂量和浓度的抗原进行加强免疫。在最后一次加强免疫14天之后，通过心脏刺穿从CO₂安乐死的动物中采集血液。在肿瘤攻击之后第4天、第11天和第18天，将三个剂量(每个20μL)的来自单个实验组的合并的血清在腹膜内(IP)施用给携带肿瘤的小鼠。每周两次对肿瘤负荷进行监测。给药方法在图3中进行描绘。

黑素瘤的主动治疗性免疫。在肿瘤攻击之后第4天、第11天和第18天，在皮下(SC)使用100μL(～100μg的蛋白质)未处理的B16裂解物(对照Vax或CVax)、重编程的B16裂解物(NOVax)或修饰的B16裂解物(NiVax)对携带B16-F0肿瘤的C57BL/6雌性小鼠(6-12周大)进行免疫。

黑素瘤的被动治疗性免疫。在肿瘤攻击之后第4天、第11天和第18天，将三个剂量(每个20μL)的来自单个实验组的合并的血清在腹膜内(IP)施用给携带B16-F0肿瘤的小鼠。通过肿瘤体积(mm³)±SEM来评估肿瘤负荷。**＝P＜0.01|n＝10。

结果。与使用未处理的B16裂解物(对照Vax或CVax)相比，使用重编程的B16裂解物(NOVax)或修饰的B16裂解物(NiVax)的主动免疫以治疗性方式使用，显著减少了肿瘤生长。然而，仅修饰的B16裂解物(NiVax)在被动血清转移治疗性方式中显示出显著的肿瘤生长延迟，这表明在重编程的B16裂解物(NOVax)处理的小鼠中不存在的肿瘤抑制性因子存在于修饰的B16裂解物(NiVax)免疫的小鼠的血清中(图4)。

实施例2-使用B16细胞和细胞裂解物生成抗原和抗体的方法

修饰的B16裂解物(NiVax)生成的抗血清针对未修饰的和修饰的B16蛋白质裂解物反应。通过SDS-PAGE对从未修饰的B16-F0(B16)、过氧化亚硝酸盐修饰的B16-F0(NB16)以及非黑素瘤小鼠细胞系EL4纯化的总蛋白质裂解物进行解析，并且使用以下各项作为一级抗体对其进行免疫印迹：a)对照未免疫的抗血清；b)对照未处理的B16裂解物(对照Vax)抗血清；c)修饰的B16裂解物(NiVax)抗血清；以及d)不使用抗血清。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG作为二级抗体。

结果。修饰的B16裂解物(NiVax)抗血清证实了针对修饰的和未修饰的黑素瘤B16-F0纯化的蛋白质，而不是针对非黑素瘤EL4(C57BL/6衍生的鼠胸腺瘤细胞系)纯化的蛋白质的选择性免疫反应性活性，这表明选择性免疫反应性抗体的生成不限于特定的蛋白质修饰(硝化)(图5)。

实施例3-抗原的识别

人类免疫靶标识别。使用修饰的B16裂解物(NiVax)衍生的抗血清作为一级抗体针对交叉反应性筛选综合人类蛋白质微阵列(OriGene人类蛋白质裂解物β阵列)，并且使用HRP缀合的抗小鼠IgG作为二级抗体(图6)。

结果。使用修饰的B16裂解物(NiVax)衍生的抗血清作为免疫筛选工具来识别六种新型交叉反应性人类免疫靶标：1)皮瓣结构-特异性内切核酸酶1(FEN1)；2)高尔基体重组堆叠蛋白1(GORASP1)；3)具有GTP酶结构域-锚蛋白重复序列和PH结构域的ArfGAP1(AGAP1)；4)微管相关蛋白tau(MAPT)；5)线粒体核糖体蛋白L46(MRPL46)；以及6)原钙粘着蛋白β6(PCDHB6)。这些结果表明这些免疫靶标单独或组合地作为用于诊断的新型黑素瘤相关性抗原或作为免疫治疗性工具的潜在用途。

实施例4-抗原的识别

潜在免疫靶标的二维电泳分析。通过二维(2-D)电泳对B16-F0总蛋白质裂解物进行解析。简言之，使用ReadyStrips/Bio-Rad(pH 3-10，非线性，7cm长)，通过等电聚焦(IEF)在第一维度上对天然B16-F0总蛋白质裂解物(～20μg)进行2-D分析。在12％SDS-PAGE上分离蛋白质，并且使用修饰的B16裂解物(NiVax)衍生的抗血清作为一级抗体并使用HRP缀合的抗小鼠IgG作为二级抗体对其进行免疫印迹(图7)。检测到一个显著的免疫反应性信号，所述信号与先前使用人类蛋白质微阵列免疫筛选进行识别的交叉反应性人类免疫靶标中的一个相符，所述人类免疫靶标即具有大约8的IEF和大约42kDa的分子量的FEN1。

FEN1的二维电泳分析。在如上所述的2-D电泳中对B16-F0总蛋白质裂解物进行解析并且使用多克隆抗FEN1抗体(细胞信号传导)对其进行免疫印迹。特定信号揭示具有大约8的IEF和大约42kDa的分子量的免疫反应性蛋白，所述蛋白质与由修饰的B16裂解物(NiVax)衍生的抗血清生成的显著信号中的一个相符(图8)。此数据表明FEN1可用于免疫疗法或用作诊断工具。

实施例5-使用修饰的FEN1进行的免疫

使用过氧化亚硝酸盐硝化的(修饰的)人类FEN1针对黑素瘤进行的主动治疗性免疫。在31μM和62μM的NO衍生的硝化剂过氧化亚硝酸盐(ONOO^-)存在下，在室温下对纯化的重组人类FEN1蛋白进行修饰3小时，接着在4℃下修饰48小时，并且用作用于免疫的抗原。在肿瘤攻击之后第4天、第11天和第18天，在皮下(SC)使用盐水溶液(对照)或100μL(～3μg的蛋白质)未修饰的FEN1对照、31μM修饰的FEN1或62μM修饰的FEN1对携带B16-F0肿瘤的小鼠进行免疫。通过肿瘤体积(mm³)±SEM来评估肿瘤负荷。**＝P＜0.01|n＝8。与使用未修饰的FEN1对照或62μM修饰的FEN1相比，使用31μM修饰的FEN1的主动免疫以治疗性方式使用，显著减少了肿瘤生长，这表明为了激发有效的抗肿瘤应答，用于纯化的人类FEN1硝化的过氧化亚硝酸盐的最佳浓度为31μM(图9)。

使用过氧化亚硝酸盐硝化的(修饰的)人类FEN1的主动治疗性免疫延长了存活。如上所述，在31μM和62μM的NO衍生的硝化剂过氧化亚硝酸盐(ONOO^-)存在下，对纯化的人类FEN1蛋白进行修饰。在肿瘤攻击之后第4天、第11天和第18天，在皮下(SC)使用盐水溶液(对照)或100μL(～3μg的蛋白质)未修饰的FEN1对照、31μM修饰的FEN1或62μM修饰的FEN1对携带B16-F0肿瘤的小鼠进行免疫。与未处理和未修饰的对照相比，使用31μM或62μM修饰的FEN1的主动免疫显著增加携带肿瘤的小鼠的存活率(图10)。

实施例6-从接种FEN1的小鼠获得的抗体的使用。

使用过氧化亚硝酸盐硝化的(修饰的)人类FEN1针对黑素瘤进行的被动治疗性免疫通过血清抗体进行介导。使用蛋白质G涂覆的磁珠(蛋白质G/生命技术)，如先前所述地使用未修饰的FEN1(对照抗体)或使用在31μM过氧化亚硝酸盐存在下修饰的FEN1(31PST抗体)在未携带肿瘤的小鼠中生成的抗血清是抗体消耗的(-)或未抗体消耗的(+)。在肿瘤攻击之后第4天、第7天和第10天，将三个剂量(每个20μL)的来自单个实验组的合并的血清在腹膜内(IP)施用给携带B16-F0肿瘤的小鼠。通过肿瘤体积(mm³)±SEM来评估肿瘤负荷。**＝P＜0.01|n＝8(图11)。血清转移显著减小肿瘤体积。然而，与来自31μM修饰的FEN1免疫的小鼠的全血清相比，来自31μM修饰的FEN1免疫的小鼠的抗体消耗型抗血清的被动血清转移以治疗性方式使用，不能控制肿瘤生长，这表明含有抗体的血清在来自31μM修饰的FEN1免疫的小鼠的被动转移血清的治疗效用中的特定作用。

使用修饰的人类FEN1针对黑素瘤进行的被动治疗性免疫延长了存活。使用蛋白质G涂覆的磁珠(蛋白质G/生命技术)，如先前所述地使用未修饰的FEN1(对照抗体)或使用在31μM过氧化亚硝酸盐存在下修饰的FEN1(31PST抗体)在未携带肿瘤的小鼠中生成的抗血清是抗体消耗的(-)或未抗体消耗的(+)。在肿瘤攻击之后第4天、第7天和第10天，将三个剂量(每个20μL)的来自单个实验组的合并的血清在腹膜内(IP)施用给携带B16-F0肿瘤的小鼠(图12)。血清转移延长了存活。然而，与来自31μM修饰的FEN1免疫的小鼠的全血清相比，来自31μM修饰的FEN1免疫的小鼠的抗体消耗型抗血清的被动血清转移当以治疗性方式使用时在肿瘤攻击20天之后不能维持存活，这表明含有抗体的血清在来自31μM修饰的FEN1免疫的小鼠的被动转移血清的治疗效用中的特定作用。

实施例7-从B16黑素瘤细胞系的FEN1接种的小鼠靶标裂解物获得的抗体

针对未修饰的B16-F0总蛋白质裂解物的抗体依赖性抗血清免疫反应性。通过SDS-PAGE对从未修饰的B16-F0纯化的总蛋白质裂解物进行解析并且在独立于泳道的多筛选设备(Bio-Rad)中使用以下各项对其进行免疫印迹：完整的对照未修饰的抗血清(C+)、抗体消耗的对照未修饰的抗血清(C-)、完整的修饰的FEN1抗血清(31+)或抗体消耗的修饰的FEN1抗血清。使用HRP缀合的抗小鼠IgG作为二级抗体。从FEN1接种的小鼠获得的血清特异性地针对B16-F0总蛋白质裂解物反应，如在图13中的相对光密度分析上所反映的。

实施例8-使用硝化剂生成结合到未修饰的生物分子上的新型表位的抗体。

在31μM过氧化亚硝酸盐存在下，在室温下对培养的恰加斯氏利什曼原虫无鞭毛体进行裂解和处理3小时，接着在4℃下进行48小时并且用作抗原(L-NiVax)以对未感染的BALB/c小鼠进行免疫(100μL-SC|～200μg/剂量)，接着在第7天进行加强免疫。在最后一次加强免疫21天之后，通过心脏刺穿采集血液以用于血清分离。将抗血清制剂的相同方案用于含有以下各项的抗原制剂：盐水溶液(媒介物)、活的恰加斯氏利什曼原虫无鞭毛体+咪喹莫特(Imiquamod)(活的L+Imi)以及热杀死的恰加斯氏利什曼原虫无鞭毛体(热杀死的L)。通过SDS-PAGE对来自未处理的恰加斯氏利什曼原虫无鞭毛体的总蛋白质裂解物进行解析并且使用媒介物、活的L+Imi、热杀死的L以及L-NiVax抗血清对其进行免疫印迹。使用HRP缀合的抗小鼠IgG作为二级抗体。与其他免疫标准模式相比，当使用L-NiVax时，蛋白质印记显示针对裂解的、未处理的恰加斯氏利什曼原虫无鞭毛体的显著强烈的免疫反应性带(图14)。这些结果证实硝化的抗原可揭开新型的、非硝化的抗原决定簇。

以引用的方式并入

本文所引用的所有专利、公开专利申请以及非专利文献均以引用的方式并入本文。

等效物

本领域技术人员仅仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案意图通过以下权利要求书涵盖。

Claims (89)

1.一种抗原，所述抗原包括通过活性氧(ROS)或活性氮(RNS)修饰的生物分子。

2.如权利要求1所述的抗原，其中所述生物分子是蛋白质或脂质。

3.如权利要求2所述的抗原，其中所述生物分子选自以下各项：皮瓣结构-特异性内切核酸酶1(FEN1)；高尔基体重组堆叠蛋白1(GORASP1)、具有GTP酶结构域-锚蛋白重复序列和PH结构域的ArfGAP1(AGAP1)；微管相关蛋白tau(MAPT)；线粒体核糖体蛋白L46(MRPL46)；以及原钙粘着蛋白β6(PCDHB6)。

4.如前述权利要求中任一项所述的抗原，其中所述生物分子通过RNS进行修饰，并且所述RNS是一氧化氮或过氧化亚硝酸盐。

5.如前述权利要求中任一项所述的抗原，其中所述生物分子是通过酪氨酸的硝化、硫醇的S-亚硝基化或金属离子的亚硝化进行修饰的蛋白质。

6.如权利要求5所述的抗原，所述抗原通过金属离子的亚硝化进行修饰，其中所述金属离子是铁。

7.如权利要求5或6所述的抗原，其中所述生物分子包含卟啉，并且所述生物分子通过结合到所述卟啉的金属离子的亚硝化进行修饰。

8.一种分离的抗体，所述分离的抗体选择性地结合如前述权利要求中任一项所述的抗原，其中所述抗体对于所述修饰的生物分子的亲和力大于所述抗体对于所述未修饰的生物分子的亲和力。

9.一种分离的抗体，所述分离的抗体选择性地结合到如权利要求1至7中任一项所述的抗原，其中所述抗体对于所述修饰的生物分子的亲和力与所述抗体对于所述未修饰的生物分子的亲和力大约相同。

10.如权利要求8或9所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

11.如权利要求8至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

12.如权利要求8至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4抗体。

13.一种抗体片段，所述抗体片段包含如权利要求8至12中任一项所述的抗体的抗原结合区。

14.一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含如权利要求8至12中任一项所述的抗体的抗原结合区。

15.一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体选择性地结合如权利要求1至7中任一项所述的抗原，其中所述嵌合抗原受体对于所述修饰的生物分子的亲和力大于所述嵌合抗原受体对于所述未修饰的生物分子的亲和力。

16.一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体选择性地结合如权利要求1至7中任一项所述的抗原，其中所述嵌合抗原受体对于所述修饰的生物分子的亲和力与所述嵌合抗原受体对于所述未修饰的生物分子的亲和力大约相同。

17.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如权利要求8至12中任一项所述的抗体、如权利要求13所述的抗体片段或如权利要求14至16中任一项所述的嵌合抗原受体。

18.一种细胞，所述细胞包含编码如权利要求8至12中任一项所述的抗体、如权利要求13所述的抗体片段或如权利要求14至16中任一项所述的嵌合抗原受体的外源核酸。

19.如权利要求18所述的细胞，其中所述细胞选自以下各项：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌、蜥蜴利什曼原虫、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、烟草、黑腹果蝇、草地贪夜蛾、粉纹夜蛾、原鸡、小家鼠、野猪、绵羊、野山羊、奶牛、Sf9细胞、Sf21细胞、Schneider 2细胞、Schneider 3细胞、High Five细胞、NS0细胞、中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞、幼仓鼠肾脏细胞、COS细胞、Vero细胞、HeLa细胞以及HEK 293细胞。

20.如权利要求18所述的细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。

21.如权利要求20所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。

22.一种产生抗体或抗体片段的方法，所述方法包括培养如权利要求18或19所述的细胞。

23.一种组合物，所述组合物包含如权利要求8至12中任一项所述的抗体或如权利要求13所述的抗体片段，其中所述抗体或所述抗体片段缀合到细胞毒性剂。

24.一种抗体片段，所述抗体片段包含如权利要求8至12中任一项所述的抗体的抗原结合区。

25.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如权利要求24所述的抗体。

26.一种转化的细胞，所述转化的细胞包含编码如权利要求25所述的抗体片段的外源核酸。

27.一种产生抗体片段的方法，所述方法包括培养表达核酸的细胞，所述核酸编码如权利要求24所述的抗体片段。

28.一种组合物，所述组合物包含如权利要求24所述的抗体片段，其中所述抗体片段缀合到细胞毒性剂。

29.一种疫苗，所述疫苗包含如权利要求1至7中任一项所述的抗原。

30.一种产生抗原的方法，所述方法包括将包含细胞的组合物与活性氧(ROS)或活性氮(RNS)接触，其中所述ROS或所述RNS对由所述细胞产生的生物分子进行修饰，并且所述抗原是所述修饰的生物分子。

31.一种产生抗原的方法，所述方法包括将包含生物分子的组合物与活性氧(ROS)或活性氮(RNS)接触，其中所述ROS或所述RNS对所述生物分子进行修饰，并且所述抗原是所述修饰的生物分子。

32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述生物分子是蛋白质或脂质。

33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述生物分子选自以下各项：皮瓣结构-特异性内切核酸酶1(FEN1)；高尔基体重组堆叠蛋白1(GORASP1)、具有GTP酶结构域-锚蛋白重复序列和PH结构域的ArfGAP1(AGAP1)；微管相关蛋白tau(MAPT)；线粒体核糖体蛋白L46(MRPL46)；以及原钙粘着蛋白β6(PCDHB6)。

34.如权利要求30至33中任一项所述的方法，所述方法包括将所述组合物与一氧化氮、一氧化氮供体(例如，NONOate化合物)或亚硝化剂(例如，过氧化亚硝酸盐)接触。

35.如权利要求34所述的方法，所述方法包括将所述组合物与NONOate化合物一起孵育，其中所述方法包括将所述组合物与一氧化氮接触，并且所述NONOate化合物产生所述一氧化氮。

36.如权利要求34所述的方法，所述方法包括将所述组合物与NONOate化合物一起孵育，其中所述方法包括将所述组合物与一氧化氮供体接触，并且所述NONOate化合物是所述一氧化氮供体。

37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述NONOate化合物是二亚乙基三胺NONOate。

38.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述组合物与所述NONOate化合物一起孵育至少5分钟，诸如至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时或至少18小时。

39.如权利要求34所述的方法，所述方法包括将所述组合物与过氧化亚硝酸盐一起孵育，其中所述方法包括将所述组合物与亚硝化剂接触，并且过氧化亚硝酸盐是所述亚硝化剂。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述组合物与过氧化亚硝酸盐一起孵育至少5分钟，诸如至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时或至少18小时。

41.一种识别抗体的方法，所述方法包括：

将细胞与活性氧(ROS)或活性氮(RNS)接触，其中所述ROS或所述RNS对生物分子进行修饰；以及

选择结合到所述修饰的生物分子的抗体。

42.一种识别抗体的方法，所述方法包括：

将生物分子与活性氧(ROS)或活性氮(RNS)接触以便对所述生物分子进行修饰；以及

选择结合到所述修饰的生物分子的抗体。

43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述生物分子是蛋白质或脂质。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述生物分子是皮瓣结构-特异性内切核酸酶1(FEN1)；高尔基体重组堆叠蛋白1(GORASP1)、具有GTP酶结构域-锚蛋白重复序列和PH结构域的ArfGAP1(AGAP1)；微管相关蛋白tau(MAPT)；线粒体核糖体蛋白L46(MRPL46)；或原钙粘着蛋白β6(PCDHB6)。

45.如权利要求41至44中任一项所述的方法，其中接触包括与一氧化氮、一氧化氮供体(例如，NONOate)或亚硝化剂(例如，过氧化亚硝酸盐)一起孵育。

46.如权利要求45所述的方法，其中接触包括在NONOate化合物产生一氧化氮的条件下与所述NONOate化合物一起孵育。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述NONOate化合物是二亚乙基三胺NONOate。

48.如权利要求46或47所述的方法，所述方法包括与所述NONOate化合物一起孵育至少5分钟，诸如至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时或至少18小时。

49.如权利要求45所述的方法，其中接触包括与过氧化亚硝酸盐一起孵育。

50.如权利要求49所述的方法，其中接触包括与过氧化亚硝酸盐一起孵育至少5分钟，诸如至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时或至少18小时。

51.如权利要求41至50中任一项所述的方法，其中选择抗体包括：

将动物暴露于所述修饰的生物分子；以及

分离所述动物产生的抗体。

52.如权利要求41至50中任一项所述的方法，其中选择抗体包括：

将动物暴露于所述修饰的生物分子；

从所述动物分离产生抗体的细胞；

分离由所述细胞产生的抗体；以及

确认所述抗体结合到所述修饰的生物分子。

53.如权利要求51或52所述的方法，其中所述动物是小鼠或兔。

54.如权利要求41至50中任一项所述的方法，其中选择抗体包括通过噬菌体展示选择抗体。

55.一种产生抗原生物分子的方法，所述方法包括将生物分子与活性氧、活性氮或活性卤素物质接触。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述活性氧、所述活性氮或所述活性卤素物质选自以下各项：一氧化氮、一氧化氮供体(例如，NONOate)、亚硝化剂、过氧化亚硝酸、过氧化亚硝酸盐、二氧化氮、二氧化氮基、三氧化二氮、亚硝鎓阳离子、亚硝基硫酸盐、亚硝基高氯酸盐、四氟硼酸亚硝鎓、亚硝基过氧碳酸盐、硝鎓阳离子、碳酸根、过氧化一碳酸根、羧基、过氧化物、过氧化氢、有机过氧化氢、过氧基、烷氧基、超氧化物、单线态氧、羟基、臭氧、氧硫基、次卤酸盐、次氯酸盐、次溴酸盐、次硫氰酸盐、硝酰氯、卤胺、单氯胺、溴胺、二氧化氯或磷酸根。

57.如权利要求55或56所述的方法，其中将所述生物分子与活性氧、活性氮或活性卤素物质接触包括将分离的生物分子、细胞、病毒或细胞裂解物与活性氧、活性氮或活性卤素物质接触。

58.如权利要求55至57中任一项所述的方法，其中所述生物分子与编码FEN1、GORASP1、AGAP1、MAPT、MRPL46或PCDHB6的氨基酸序列的子序列具有至少95％序列同源性，其中所述子序列的长度是至少6个氨基酸。

59.如权利要求55至57中任一项所述的方法，其中所述生物分子与编码tau、α-突触核蛋白、淀粉样蛋白β或淀粉样蛋白β前体蛋白的氨基酸序列的子序列具有至少95％序列同源性，其中所述子序列的长度是至少6个氨基酸。

60.如权利要求55至57中任一项所述的方法，其中所述生物分子与编码以下各项的氨基酸序列的子序列具有至少95％序列同源性：4-1BB、活化素受体类型-2B、活化素受体样激酶1、AGS-22M6、甲胎蛋白、血管生成素-2、炭疽毒素、B细胞活化因子(BAFF)、癌症抗原125(CA-125/粘蛋白16)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、C-C趋化因子受体类型4(CCR4)、C-C趋化因子受体类型5(CCR5)、C-C基序趋化因子11(CCL11)、CD2、CD3、CD3ε、CD4、CD6、CD11、CD15、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40配体(CD40L)、CD44、CD51、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79B、CD80、CD125、CD147、CD152、CD154、CD200、CD221、CD274、CEA相关抗原、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、密封蛋白-18、集落刺激因子1受体(CSF1R)、补体成分5、含铜胺氧化酶3(AOC3)、巨细胞病毒糖蛋白B、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、死亡受体-5(DR5/TRAILR2)、δ样配体4(DLL4)、二肽基肽酶4、大肠杆菌志贺毒素类型-1、大肠杆菌志贺毒素类型-2、含EGF样结构域的蛋白7、唾液酸蛋白、内毒素、表皮生长因子受体(HER1)、上皮唾蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、因子D、成纤维细胞活化蛋白α、叶酸受体1、卷曲受体、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子8、鸟苷酸环化酶2C、热休克蛋白90、乙型肝炎表面抗原、肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)、人类分散因子受体激酶、亨廷顿蛋白、免疫球蛋白E、免疫球蛋白ε链C区、流感血球凝集素(HA)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、整合蛋白α4亚基、整合蛋白α4β7、整合蛋白α5β1、整合蛋白α7β7、整合蛋白αIIbβ3、整合蛋白αv亚基、整合蛋白αvβ3、整合蛋白β2亚基、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、干扰素α、干扰素γ、干扰素γ诱导蛋白、干扰素α/β受体、白细胞介素1β、白细胞介素2受体、白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素6、白细胞介素6受体、白细胞介素9、白细胞介素12、白细胞介素17、白细胞介素17A、白细胞介素17F、白细胞介素22、白细胞介素23、白细胞介素31受体A、低密度脂蛋白、L-选择蛋白、淋巴细胞功能相关性抗原1(CD11a)、淋巴毒素-α、赖氨酰氧化酶同系物2(LOXL2)、巨噬细胞迁移抑制因子(MMIF)、间皮素、金属还原酶STEAP1、髓磷脂相关糖蛋白、肌生长抑制素、神经生长因子(NGF)、神经细胞凋亡调节蛋白酶1、神经毡蛋白-1、NOGO-A、Notch受体、PD-1、磷酸钠共转运蛋白、血小板衍生生长因子受体α、血小板衍生生长因子受体β、程序性细胞死亡蛋白1(CD279)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9(PCSK9)、狂犬病病毒糖蛋白、核因子κB配体的受体活化剂(RANKL)、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2(HER2/neu)、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3(HER3/neu)、呼吸道合胞病毒F蛋白、网状内皮素-4、Rh血型D抗原、恒河猴因子、硬化蛋白(SOST)、选择蛋白P、SLAM家族成员7、粘结蛋白聚糖1、腱生蛋白C、转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β2(TGF-β2)、跨膜糖蛋白NMB、滋养层糖蛋白、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤相关性钙信号转导蛋白2、肿瘤相关性糖蛋白72(TAG-72)、TWEAK受体、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2或波形蛋白，其中所述子序列的长度是至少6个氨基酸。

61.如权利要求58至60中任一项所述的方法，其中所述子序列的长度是至少100个氨基酸。

62.一种抗原，所述抗原通过如权利要求55至61中任一项所述的方法产生。

63.一种抗体、抗体片段或嵌合抗原受体，所述抗体、抗体片段或嵌合抗原受体特异性地结合到如权利要求62所述的抗原。

64.一种如权利要求63所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段缀合到细胞毒性剂。

65.一种核酸，所述核酸编码如权利要求63所述的抗体、抗体片段或嵌合抗原受体。

66.一种细胞，所述细胞包含如权利要求65所述的核酸。

67.如权利要求66所述的细胞，其中所述细胞选自以下各项：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌、蜥蜴利什曼原虫、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、烟草、黑腹果蝇、草地贪夜蛾、粉纹夜蛾、原鸡、小家鼠、野猪、绵羊、野山羊、奶牛、Sf9细胞、Sf21细胞、Schneider 2细胞、Schneider 3细胞、High Five细胞、NS0细胞、中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞、幼仓鼠肾脏细胞、COS细胞、Vero细胞、HeLa细胞以及HEK 293细胞。

68.如权利要求66所述的细胞，其中所述核酸编码嵌合抗原受体并且所述细胞是淋巴细胞。

69.一种预防或治疗受试者中的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含如权利要求68所述的多个细胞的组合物。

70.一种预防或治疗受试者中的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含如权利要求63或64所述的抗体或抗体片段的组合物。

71.一种预防或治疗受试者中的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含如权利要求62所述的抗原的组合物。

72.如权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状是瘤。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述瘤是成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、腺癌、转移性脑癌、肾上腺皮质癌、肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胃肠癌、结肠直肠癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、头颈癌、鼻咽癌、胰腺癌或肾细胞癌。

74.如权利要求72或73所述的方法，所述方法还包括鉴定患有瘤的受试者。

75.如权利要求74所述的方法，所述方法还包括鉴定患有过度表达FEN1的瘤的受试者，其中所述生物分子是FEN1。

76.如权利要求75所述的方法，其中所述瘤是胰腺癌、结肠癌、胃癌、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、成神经细胞瘤或肺癌。

77.如权利要求72至74中任一项所述的方法，其中所述瘤是黑素瘤，并且所述生物分子是FEN1、GORASP1、AGAP1、MAPT、MRPL46或PCDHB6。

78.如权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状是病毒感染、细菌感染或寄生虫感染。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述疾病或病状是艰难梭菌、HIV、脓毒症、埃博拉、利什曼病、流感、金黄色葡萄球菌、假丝酵母、铜绿假单胞菌、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒或狂犬病。

80.如权利要求78或79所述的方法，所述方法还包括鉴定患有病毒感染、细菌感染或寄生虫感染的受试者。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述疾病或病状是利什曼病，并且鉴定患有病毒感染、细菌感染或寄生虫感染的受试者包括鉴定患有利什曼病的受试者。

82.如权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状是炎性疾病。

83.如权利要求82所述的方法，其中所述疾病或病状是炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、斑块型银屑病、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、青少年特发性关节炎、多发性硬化症、狼疮、哮喘、系统性硬皮病、皮肌炎或多发性肌炎。

84.如权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状是神经变性疾病。

85.如权利要求84所述的方法，其中所述疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、拉福拉病或亨廷顿氏病。

86.如权利要求84或85所述的方法，所述方法还包括鉴定患有神经变性疾病的受试者。

87.如权利要求86所述的方法，其中所述生物分子是tau，并且鉴定患有神经变性疾病的受试者包括鉴定患有阿尔茨海默氏病或帕金森氏病的受试者。

88.如权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状是阿斯佩各综合征、孤独症、ADHD、高胆固醇血症、血脂异常、动脉粥样硬化、心肌梗塞、心力衰竭、缺血性中风、血栓栓塞、肌营养不良、脆性X综合征、镰状红细胞病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、早老症、扁平苔藓、白癜风、支气管肺发育不良、成人呼吸窘迫综合征、肺气肿、阑尾炎、急性胰腺炎、酒精中毒、糖尿病、黄斑变性、葡萄膜炎、白内障生成、骨质疏松、少肌症、慢性疲劳综合征或坐骨神经痛。

89.如权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述受试者经历过来自同种异体供体或异种供体的移植。