CN108129572A

CN108129572A - 人GDF11-Fc融合蛋白在治疗溃疡性结肠炎中的应用

Info

Publication number: CN108129572A
Application number: CN201810008965.3A
Authority: CN
Inventors: 马远方; 王耀辉; 王兰菊; 张海龙; 魏寅祥; 王珍凤
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2018-01-04
Filing date: 2018-01-04
Publication date: 2018-06-08
Anticipated expiration: 2038-01-04
Also published as: CN108129572B

Abstract

本发明公开了一种治疗溃疡性结肠炎的融合蛋白，该融合蛋白是由截短性人GDF11蛋白和免疫球蛋白Fc段构建而成，简称为GDF11‑Fc。本发明的融合蛋白具有缓解体重减轻、缓解结肠长度减少、减少炎症细胞的浸润、缓解结肠组织病变损伤的功能。因此，本发明的GDF11‑Fc融合蛋白对治疗溃疡性结肠炎的具有重要价值，适于在临床上推广。

Description

人GDF11-Fc融合蛋白在治疗溃疡性结肠炎中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及融合蛋白生长分化因子GDF11-Fc在治疗溃疡性结肠炎中的应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)是一种以慢性炎症和溃疡形成为主要病理特点的结肠黏膜层的消化道疾病。溃疡性结肠炎病程较长，病变范围广泛，病变部位多局限于粘膜层以及粘膜下层，主要为粘膜的大片充血、水肿、糜烂以及溃疡形成。UC具有急性爆发性，病死率高，发病人数多，易反复发作等特点，并与结肠癌的发病关系密切。UC临床表现为腹痛、持续性腹泻、血便、发热、腹泻等症状，近年来，随着生活方式的西方化，该病在我国的发病率也有显著增高趋势。UC发病机理较复杂，主要由遗传、环境、外界微生物、自身免疫应答状态等因素相互作用导致。目前，临床应用的主要有水杨酸类、糖皮质激素、免疫调节剂和生物制剂，但治疗效果并不理想，甚至还出现严重的副作用。

生长分化因子11(Growth Differentiation Factor 11，GDF11)，又称为骨形态发生蛋白11(Bone Morphogenetic Proteins 11，BMP11)，属于转化生长因子β(TransformingGrowth Factorβ，TGF-β)超家族的一种分泌性蛋白。早期研究发现，GDF11可以负性调控嗅觉神经元的数量；也可以通过负性调节的方式参与胎鼠视网膜的发育；在脊椎动物胚胎发育过程中，对骨骼模式的建立起着重要作用；可以诱导输尿管芽的形成，参与肾脏正确结构的构建。

最近研究发现，GDF11是存在机体血液内的一种循环因子，其水平随着年龄增长而下降。它可通过激活Smad2/3信号通路逆转年老鼠的心肌肥大，改善骨骼肌功能，并可以刺激脑血管重构，进而改善老年鼠的嗅觉功能。最近有研究报道GDF11可以通过提高胶原含量，减弱炎症反应，从而减少动脉粥样硬化板块的形成。但目前未有报道GDF11在治疗溃疡性结肠炎中的具体效果应用。

发明内容

生长分化因子11(Growth Differentiation Factor 11，GDF11)，又称为骨形态发生蛋白11(Bone Morphogenetic Proteins 11，BMP11)，属于转化生长因子β(TransformingGrowth Factorβ，TGF-β)超家族的一种分泌性蛋白。人的GDF11前体蛋白由信号肽、N端的抑制性前导肽和C端的成熟肽三部分组成。前体蛋白在内质网和高尔基体内必须将信号肽和N端的抑制性前导肽剪切后，才能形成成熟的GDF11单体蛋白，然后通过分子内和分子间的二硫键，形成具有生物活性的同源二聚体蛋白即GDF11蛋白。

抗体是由分化成熟的B细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白，即免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。免疫球蛋白可分为五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，约占人血浆丙种球蛋白的70％。免疫球蛋白具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。重链和轻链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。免疫球蛋白分子可被许多蛋白酶水解，产生不同的片段。木瓜蛋白酶将IgG分子降解成两个相同的Fab段和一个Fc段。Fab段即抗原结合片段(antigen binding fragment)，仍具有抗原结合活性。Fc段即可结晶片段(crystallizablefragment)，在一定条件下可形成结晶，Fc段不能与抗原结合，但具有许多其他生物学活性，如固定补体、亲和细胞(巨噬细胞、NK细胞和粒细胞等)、介导与细菌蛋白(如金黄色葡萄球菌蛋白A和链球菌蛋白G)的结合等。多种基因工程药物将抗体Fc段融合在活性蛋白的羧基端，能提高蛋白的表达和稳定性，并方便蛋白的纯化。

本发明解决的技术问题是：将无活性的全长GDF11蛋白进行改造使改造后的蛋白发挥治疗溃疡性结肠炎的功效。

为了解决以上技术问题采用了如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种治疗溃疡性结肠炎的融合蛋白，所述融合蛋白包括截短性GDF11蛋白、免疫球蛋白Fc段。

在本发明的具体实施方案中，所述截短性GDF11蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述截短性GDF11蛋白的编码核酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列或其简并序列。

可用于本发明的免疫球蛋白Fc片段可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4中的一个、两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。已知免疫球蛋白有很多类别，如IgA、IgD、IgE、IgM及IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，从特定免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区，是在本领域技术人员所掌握的范围之内。免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天。已经报道和公布的专利将免疫球蛋白的Fc区域与其他蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)的区域融合，创制出融合蛋白。这类融合蛋白是通过IgG Fc铰链区中的Cys残基连接的同源二聚体蛋白，结构类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。这类融合蛋白维持有原功能蛋白质的生物活性，同时大大延长了体内半衰期(参见,如Nature,337:525-531.1989；如Trends

Biotechnol.,14:52-60,1996；如美国专利No.5349053与6224867及中国专利200510084233.5)。

在本发明的具体实施方案中，免疫球蛋白Fc片段选自人IgG1，包括其铰链区、CH2、CH3区；免疫球蛋白Fc段氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码核酸序列如SEQ ID NO.4。

进一步，所述截短性GDF11蛋白的C端连接免疫球蛋白Fc段。

本发明的截短性GDF11蛋白可以与免疫球蛋白Fc段直接融合，也可以通过连接序列融合。所述连接序列具有作为间隔序列的适当长度的任意氨基酸序列。例如能够是0-10个、或0-5个任意的氨基酸的序列。

在本发明的具体实施方案中，将截短性GDF11蛋白与免疫球蛋白Fc段进行直接融合，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步，本发明的所述融合蛋白是二聚体。

本发明的融合蛋白还可以含有附加的氨基酸序列和(或)糖链等。在Fc段，其它的附加序列，既可以是提供如连接序列的立体构造上的优点的序列，也可以是例如像信号肽或纯化中利用的标签序列这样将某些功能赋予融合蛋白的序列，对具有这些序列的物质称为变异体。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种前面所述的融合蛋白的编码核酸。

进一步，所述编码核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种包含前面所述的融合蛋白的编码核酸的载体。

本发明的核酸分子可以是DNA分子或RNA分子。它们也可以是核酸类似物，诸如寡核苷酸硫代磷酸酯、取代后的核糖寡核苷酸(ribo-oligonucleotide)、LNA分子、PNA分子、GNA(二醇核酸)分子、TNA(苏糖核酸)分子、吗啉代多核苷酸、或antagomir(经胆固醇缀合的)核酸分子或其任何修饰，如本领域中已知的(对于修饰的例子，参见例如US5,525,711、US4,711,955、US 5,792,608或EP302175)。在本发明上下文中的核酸分子可以是天然存在的核酸残基或人工生成的核酸残基。核酸残基的例子是腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)、尿苷(U)、黄嘌呤(X)、和次黄嘌呤(HX)。在本发明的上下文中，胸苷(T)和尿苷(U)可以随核酸分子的相应类型而可互换使用。例如，如技术人员公知的，作为DNA部分的胸苷(T)对应于作为相应转录的mRNA部分的尿苷(U)。本发明的核酸分子可以是单链或双链的、线性或环状的、天然的或合成的，并且若没有另外指出，则没有任何大小限制。核酸分子还可以包含启动子，如在下文进一步详述的。启动子可以是同源或异源的。在一个具体的实施方案中，本发明中提供的核酸分子在此启动子的控制下。

如本文中使用的，术语“载体”具体地指质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其它在遗传工程中通常使用的载体。在一个优选的实施方案中，这些载体适用于转化细胞、真核生物细胞如真菌细胞、微生物的细胞诸如酵母或原核细胞。在一个特别优选的实施方案中，此类载体适用于细菌细胞的稳定转化，例如以转录本发明的核酸分子。

因而，在本发明的一个方面，提供的载体是表达载体。一般而言，已经在文献中广泛描述了表达载体。通常，它们包含对截短性GDF11进行编码的序列、以及对免疫球蛋白Fc段进行编码的序列以外，通常还通过可动连接方式含有转录启动子、分泌信号肽序列、转录终止子、多聚腺苷酸(polyA)信号等要素，进而通常还含有耐药基因等选择标记。在启动子和终止信号之间，优选地，有至少一个限制性位点或多接头，其使得能够插入期望表达的核酸序列/分子。

必须理解的是，当通过利用现有技术中已知的表达载体来生成本文中提供的载体时，将核酸分子以如下的方式插入所述载体中，使得所得的载体优选地仅包含一个适合于在本发明上下文中采用的启动子。一般地，启动子可以是异源或同源的。本文中描述的载体还可以涵盖超过一个启动子，每个相应的启动子可以是异源或同源的。技术人员已知如何实施这类插入。例如，可以在连接前从核酸构建体或从表达载体切出启动子。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种包含前面所述的载体的宿主细胞。

可以将本发明的融合蛋白的核酸分子和/或其中克隆有本发明的融合蛋白的载体转导、转化或转染、或者以其它方式导入宿主细胞中。例如，宿主细胞是真核或原核细胞，优选地真核细胞。作为一个非限制性例子，宿主细胞是哺乳动物细胞。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种治疗溃疡性结肠炎的药物组合物，所述药物组合物包含前面所述的融合蛋白、前面所述的表达载体、或前面所述的宿主细胞。

进一步，所述药物组合物可以进一步包含药学可接受载体、赋形剂和/或稀释剂。一般地，合适的药用载体的例子是本领域中公知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂诸如油/水乳剂、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。可以通过公知的常规方法配制包含这类载体的药物组合物。可以通过不同方式，例如经肠、口服(例如丸剂、片剂、含服、舌下、崩散剂、胶囊剂、薄膜、液体溶液或悬浮液、粉末、固体晶体或液体)、直肠(例如栓剂、灌肠剂)、经由注射(例如静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、皮内)、经由吸入(例如支气管内)、表面、阴道、皮肤上(epicutaneously)或鼻内实现或执行药物组合物的施用。剂量方案会由主治内科医生和临床因素决定。如医学领域中公知的，针对任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者体格、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和路径、一般健康、和同时施用的其它药物。可以局部或系统施用所述药物组合物；可以静脉内或皮下进行施用；也可以对靶部位直接施用所述药物组合物。供胃肠外施用的制剂包括无菌水或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油、和可注射有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格(Ringer)氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸盐林格氏(lactated Ringer’s)、或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如那些基于林格氏右旋糖的)，等等。也可以存在防腐剂和其它添加剂诸如，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的融合蛋白、前面所述的表达载体、或前面所述的宿主细胞在制备产品中的应用，所述产品的功能为以下功能中的至少一种：

(1)缓解体重减轻；

(2)缓解结肠长度减少；

(3)减少炎症细胞的浸润；

(4)缓解结肠组织病变损伤。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的融合蛋白、前面所述的表达载体、或前面所述的宿主细胞在制备治疗溃疡性结肠炎的药物制剂中的应用。

本发明的融合蛋白可以按照以下方法来制备：

本发明的融合蛋白能够通过基因重组进行制造。能够将截短性GDF11蛋白的编码核酸序列与免疫球蛋白Fc段的编码核酸序列采用通常的方法进行连接、构建含有在所需宿主细胞中进行表达所必需的其它要素的表达载体，并将该载体导入宿主细胞中以表达融合蛋白，从细胞或培养基中回收已表达的融合蛋白。

对本发明的融合蛋白等进行编码的核酸分子，能够根据公知的序列和标准的基因操作技术进行设计、制备。对截短性GDF11蛋白和免疫球蛋白Fc段进行编码的基核酸，能够通过使用基于公知的核酸或氨基酸序列的探针、根据通常可利用的各种基因组文库或cDNA文库进行克隆、或者采用聚合酶链反应(PCR)法进行合成来获得。也可以对这些基因加入所需的变异或导入突变。

本发明的融合蛋白能够通过基因重组动物而在这些动物中产生。例如，通过在绵羊、山羊等非人动物的基因组中插入对本发明的融合蛋白进行编码的核酸分子，能够使本发明的融合蛋白分泌于乳汁中。

本发明的融合蛋白能够从基于本发明的表达载体得到转化的宿主细胞的培养基等中适当采用硫酸铵沉淀法、凝胶过滤法、离子交换色谱法和亲和色谱法等各种色谱技术进行分离提纯。

优选地，通过重组手段生成本发明的融合蛋白。优选地，在真核细胞中表达蛋白质，随后分离多肽，并通常纯化到药学可接受的纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码其蛋白质的核酸插入表达载体中。在合适的稳定真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞中实施表达，并且从所述细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收蛋白质。

在本发明的具体实施方案中，本发明的所述GDF11-Fc融合蛋白的获得方式为利用CHO系统表达重组蛋白。

文中术语“融合蛋白”是指利用DNA重组技术得到的两个不同的基因组合后的表达产物，即融合基因的表达产物。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次构建了截短性GDF11-Fc融合蛋白，本发明的融合蛋白具有缓解体重减轻、缓解结肠长度减少、减少炎症细胞的浸润、缓解结肠组织病变损伤的功能。因此，GDF11-Fc融合蛋白对治疗溃疡性结肠炎具有重要价值。

附图说明

图1显示利用SDS-PAGE和WB鉴定GDF11-Fc的结果图，其中，A：流穿液和洗脱液进行SDS-PAGE；B：洗脱液经透析除菌进行SDS-PAGE；C：WB；

图2显示GDF11-Fc对DSS诱导UC小鼠体重影响的结果图；

图3显示GDF11-Fc对DSS诱导UC小鼠DAI评分影响的分析图；

图4显示GDF11-Fc对DSS诱导UC小鼠结肠长度影响的分析图，其中，A：实物图；B：统计图；

图5显示GDF11-Fc对DSS诱导UC小鼠结肠组织结构影响的结果图，其中，A：Normal，B：Enberl，C：DSS，D：GDF11-Fc，E：hIgG，F：GDF11。

具体实施方式

本发明不限于本文所述的特定方法学、方案、细胞系、载体或试剂，因为这些是可以变化的。另外，本文所用术语只是为了描述特定的实施方案而无限制本发明的范围之意。

除非另外限定，则本文所用的所有技术和学术术语和任何缩写均具有与本领域技术人员普遍理解的含义相同的含义。尽管在实施本发明时可以使用与本文所述相似或相同的任何方法和材料，但本文还是描述了使用设备和材料。

实施例1 利用CHO系统表达融合蛋白GDF11-Fc

1、重组质粒pGS-GDF11-Fc的构建：

1)由金维智公司合成人截短性GDF11基因片段(SEQ ID NO.2)，插入到pGS-Fc载体上，得到重组质粒pGS-GDF11-Fc并测序。测序结果表明，重组质粒pGS-GDF11-Fc的骨架载体为pGS-Fc，在EcoRI和HindIII酶切位点之间插入了人截短性GDF11蛋白的编码序列。

2)将重组质粒pGS-GDF11-Fc瞬时转染293T细胞，经WB验证，该质粒表达GDF11-Fc融合蛋白。

2、获得表达GDF11-Fc蛋白的稳定细胞株

1)采用电转法(电转仪购自Lonza；电转试剂购自Lonza，货号VCA-1002)，将步骤1)得到的重组质粒pGS-GDF11-Fc导入CHO-K1细胞，然后将电转细胞转移到3.5cm小皿，加入2ml 302Medium(含L-Glu)进行培养；

2)取细胞上清做ELISA表达检测，经验证有GDF11-Fc蛋白表达；

3)取电转细胞离心重悬于302Medium(无L-Glu，加25μm MSX，添加1xGSSupplement)，铺96孔板，进行加压筛选；

4)25μm MSX加压2～3周后，将ELISA检测的阳性孔细胞转入48孔培养板或24孔板(视细胞数量而定)，将MSX浓度升至50μm MSX继续培养；

5)50μm MSX加压1周后，将的阳性孔细胞转入48孔培养板或24孔板(视细胞数量而定)，将MSX浓度升至100μm MSX继续培养；

6)100μm MSX加压1周后，将ELISA检测高表达的阳性孔细胞，转入6孔板或者T25培养瓶内；

7)将步骤6)中高表达的细胞株进行培养，当细胞活力恢复至90％以上，将细胞进行冻存保种，冻存密度3～10x10E6/ml，每株保存4管以上；

8)为进行亚克隆筛选，需要将7)中高表达细胞株做PCD实验、生长曲线实验，在此基础上挑选3个高表达株进行亚克隆；

9)将准备进行亚克隆的细胞株培养到5～6x10E5，活力大于95％，更换50％新鲜Medium(50μm MSX+1xGS Supplement)，

旧培养基制备：取密度1x10E6宿主母细胞接种至90ml新鲜培养基中，培养24h收货备用。[细胞悬液离心：1500rpm，5min，取上清过0.2μm滤膜后使用]。制备时不加L-Glu；

10)次日取9)准备的细胞株计数计活，活力需要>95％，将细胞重悬于302Medium(30％旧培养基，无L-Glu，加50μm MSX+IGF-1 10ng/ml+1xGS Supplement)，铺96孔板，150μl细胞悬液/孔(1.5个细胞/孔)；

11)铺板后3周每天观察96孔板，发现单克隆细胞孔，取上清进行ELISA检测，挑选高表达株进行扩增培养；

12)挑取高表达细胞株进行冻存，冻存密度3～10xE6/ml，1ml/支，每株保存4管以上。

3、GDF11-Fc蛋白的分离纯化

a)将步骤2得到的高表达细胞株进行扩大培养(起始接种密度为3x10E5/ml)，每天记录细胞生长情况，当达到生长曲线的稳定期时，进行33℃降温；

b)当步骤a)中的细胞活力下降到50-60％，将培养液4000rpm/min离心20min，所得上清经0.45um滤膜过滤，所得滤液；

c)根据理论等电点(预测pI＝7.08)，我们采用Protein A亲和层析柱(购自GEHealthcare，货号17-0402-01)；

d)固定Protein A亲和层析装置，并用4-5倍柱体积的平衡缓冲液A(0.02M的PB，PH＝7.8)冲洗柱子，至A280为0mAU；

e)将上清浓缩液以2ml/min的流速流经Protein A亲和层析柱；

f)4-5倍柱体积平衡缓冲液A再次平衡柱子，洗去未结合的蛋白，至A280回归基线；

g)用蛋白洗脱液(0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH3.6)洗脱目的蛋白，在A280>10mAU时，开始收集蛋白洗脱液至A280<10mAU停止收集。同时柱子依次用平衡缓冲液A、去离子水和20％乙醇洗涤，并保存于4℃；

h)目的蛋白洗脱液透析在PB(pH＝7.8)溶液中，透析24h后，用0.22μm滤器过滤除菌，之后将其分装成若干小份(1ml/份)，-20℃保存。

i)每升步骤3得到的培养液上清纯化后可以获得10mg纯度90％以上的GDF11-Fc蛋白。

4、GDF11-Fc蛋白的鉴定

将培养液上清原液、亲和层析时流穿液和洗脱液进行10％SDS-PAGE，然后考马斯亮蓝染色，结果见图1A。

图1B显示，亲和洗脱后的洗脱液经透析除菌，其中的GDF11-Fc蛋白纯度很高。

将除菌后的GDF11-Fc蛋白进行Western Blot，一抗为兔抗GDF11抗体(购自abcam，货号为ab124721)和HRP-Fc抗体(购自abcam，货号为ab97225)，结果见图1C。图1C显示，纯化后的GDF11-Fc蛋白具有良好的免疫原性。

实施例2 GDF11-Fc蛋白功能研究

1、实验材料

1.1实验动物

SPF级C57小鼠，雌性，5-6周，购于北京维通利华公司(合格证编号：11400700225035)实验动物分笼饲养，每2天更换一次垫料，饲养2周，期间自由饮水和进食。饲养环境温度为24±2℃，相对湿度为60％，每天12小时光照和12小时黑夜循环。

1.2实验试剂

造模给药试剂：葡聚糖硫酸钠(DSS，lot:Q3526，M.W.36000-50000，MPBiomedicals)；

切片相关试剂：乙醇、二甲苯、盐酸，国药集团化学试剂有限公司；H&E染色，上海金穗公司；

RT-PCR测定相关试剂：Trizol Reagent，DEPC水，Takara；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；反转录试剂盒，全式金公司；RT-PCR mix，Roche公司。

Western Blot测定相关试剂：RIPA裂解液，碧云天公司；蛋白酶抑制剂cocktail，Millipore；BCA蛋白定量试剂盒，康为世纪；蛋白Marker，Thermo Fisher Scientific公司；SDS，甘氨酸，北京索莱宝科技有限公司；NC膜，Merck Millipore公司；β-actin抗体，sigma公司；IL-1β抗体，F4/80抗体，abcam公司；F4/80抗体(PE标)，CD206抗体(APC标)，CD11b抗体(FITC标)，BD公司；HRP标山羊抗兔抗体，HRP标山羊抗鼠抗体，Thermo Fisher Scientific公司。

1.3实验仪器

MULTIFUGE X1台式高速离心机，MULTISKAN GO全波长酶标仪，NANODROP 2000超微全波长分光光度计，Thermo；BIQ-RAD PCR仪，BIQ-RAD；7500FAST定量PCR仪，AppliedBiosystems；DYY-6C电泳仪，北京六一仪器厂，流式细胞仪(美国BD FACS Calibur)。

1.4供试药品

造模药3％DSS配制：精密称取18g的DSS溶于600ml双蒸水中，混匀搅拌30min，配成浓度为3％的造模药；

阴性对照组供试液：hIgG蛋白，Sigma公司，配置浓度为0.120mg/ml。

阳性对照组供试液：Enbrel蛋白，上海中信国建公司，配置浓度为2mg/ml。其中Enbrel可减轻炎性反应，已批准用于治疗类风湿关节炎、银屑病及强直性脊柱炎，而用于IBD的治疗仍处于临床实验阶段。

GDF11-Fc融合蛋白为上述实施例1中获得的，其浓度为0.120mg/ml。

GDF11蛋白购自Peprotech公司，配置浓度为0.04mg/ml，与GDF11-Fc药物浓度(mole/ml)的量保持相同。

2、实验方法

2.1动物分组及模型建立

2.1.1动物分组：实验开始前对小鼠称重并标记，按体重随机分为：正常组、模型组、hIgG组、Enbrel组、GDF11-Fc组、GDF11组；正常组为3只，其余各组为5只。

2.1.2模型建立：除正常组外，其余各组给予3％DSS，共6天，以诱导急性溃疡性结肠炎模型；正常组一直饮用纯净水直到实验结束，共6天。

2.1.3给药方式及剂量：在建模的第0d，第2d，第4d，各组老鼠给予相应药物进行治疗，hIgG组和GDF11-Fc组均按0.6mg/kg的剂量给予腹腔注射，每只0.1ml；GDF11组按0.2mg/kg的剂量给予腹腔注射，每只0.1ml，与GDF11-Fc药物浓度(mole/ml)的量保持相同；Enbrel组按10mg/kg的剂量给予腹腔注射，每只0.1ml。

2.2疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分

0079实验过程中，每天记录小鼠体重、粪便形状、便血情况。DAI评分按以下标准进行，体重变化评分：体重未变化，记为0分；体重下降1-5％，记为1分；下降5-10％，记为2分；下降10-20％，记为3分；下降大于20％，记为4分。大便形状评分：正常，0分；粪便较软，1分；湿软，2分；半稀便，3分；稀便，4分。便潜血评分：无血便，0分；稍有血便，2分；明显血便，4分。评分后计算3部分评分并求得平均值。

2.3取材及结肠长度观察

实验结束后，剖取结肠组织，测量结肠长度并拍照比较。拍照后，用PBS对结肠冲洗干净，放入4％多聚甲醛中固定，用于HE染色。

2.4结肠组织结构观察(HE)

2.4.1将4％多聚甲醛固定后的结肠组织，进行包埋、切片，组织切片放60℃，4h。

2.4.2脱蜡、复水：二甲苯I、Ⅱ、Ⅲ各10min，无水乙醇I、Ⅱ、90％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各5min，流水冲10min。

2.4.3苏木素染核2min，流水冲10min，镜下观察染核情况。

2.4.4 1％盐酸酒精分化2s，流水冲10min。

2.4.5伊红染质2min，流水冲1min，90％乙醇、95％乙醇、100％乙醇各1s，放入二甲苯2min。

2.4.6用中性树胶封片，封片后，于显微镜下观察拍照。

2.5统计分析

所有需要统计的实验结果，用Prism 5处理，多组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两个样本用独立样本t检验，P<0.05说明有统计学意义，反之则无。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。

3、实验结果

3.1、GDF11-Fc对UC模型小鼠一般症状的影响

本申请研究发现，正常小鼠体重未有明显变化；造模后，各组小鼠前4天体重均成下降趋势，第5天开始，各组小鼠体重均明显下降；而GDF11-Fc组、GDF11组和Enbrel组体重下降有所缓解。但在第6天，GDF11-Fc组较DSS组的体重百分比有明显升高(P<0.001)，而GDF11-Fc组和Enbrel组的体重百分比升高不明显，各组体重百分比变化如图2所示。

同时，第4天开始，除正常组外，各组小鼠便血情况、拉稀情况有所加重；而GDF11-Fc组能明显缓解上述症状。结合体重变化和排便症状进行DAI评分，第6天得出结果如图3所示，DSS组小鼠较正常组评分明显要高(P<0.001)，hIgG、Enbrel组和GDF11组无改善作用，而GDF11-Fc组较DSS组的小鼠评分明显降低(P<0.001)。

另外，对结肠长度进行统计分析，得出结果如图4所示，DSS组较正常组明显缩短(P<0.001)；hIgG组、Enbrel组和GDF11组较DSS组无改善作用，而GDF11-Fc组(P<0.01)较DSS组的结肠长度有所增加。

上述结果表明，GDF11-Fc融合蛋白可改善DSS诱导的UC模型的宏观表现，具有抗UC的作用，而GDF11在本次给药方法中的治疗效果不明显。

3.2、GDF11-Fc对UC模型小鼠结肠组织结构的保护作用

由结肠组织病理切片HE染色结果(图5)可见，正常组小鼠结肠组织结构表现为：完整，粘膜无明显缺损，腺体排列整齐，无萎缩，粘膜固有层无明显的炎细胞浸润。DSS组有大量炎细胞浸润粘膜下层，粘膜固有层的腺体萎缩，大部分消失，取而代之的是大量的炎细胞，并有明显的炎细胞团反应。

药物治疗后，hIgG组同DSS组一样，无改善作用；Enbrel组和GDF11组也无明显改善作用；而GDF11-Fc组较DSS组有明显改善作用，表现为粘膜固有层的腺体排列整齐，炎细胞浸润减少。

上述结果表明，DSS诱导的UC模型小鼠结肠组织结构出现明显紊乱，并伴有大量炎细胞浸润，而GDF11-Fc能有效改善结肠组织结构，减轻炎症症状，表明其具有抗UC的作用。

综上，GDF11-Fc融合蛋白与GDF11蛋白相比，能明显缓解体重减轻，增加结肠长度，并能修复结肠组织病变损伤，降低结肠组织的炎性细胞浸润，从而减轻肠道炎性反应和粘膜损伤，具有抗UC的效果。

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 河南大学

<120> 人GDF11-Fc融合蛋白在治疗溃疡性结肠炎中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Gly Leu Ala Cys Ala Gly His Ser Ser Gly Ser Ala Cys

1 5 10 15

Cys Ala Thr Pro Leu Thr Val Ala Pro Gly Ala Pro Gly Thr Ala Thr

20 25 30

Ile Ile Ala Pro Leu Ala Thr Leu Ala Ala Thr Cys Ser Gly Gly Cys

35 40 45

Gly Thr Met Pro Met Gly Leu Thr Pro His Thr His Leu Val Gly Gly

50 55 60

Ala Ala Pro Ala Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Leu Met

65 70 75 80

Ser Pro Ile Ala Met Leu Thr Pro Ala Ala Leu Gly Gly Ile Ile Thr

85 90 95

Gly Leu Ile Pro Gly Met Val Val Ala Ala Cys Gly Cys Ser

100 105 110

<210> 2

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacctgg gtctggactg cgacgagcac tcaagcgagt cccgctgctg ccgatatccc 60

ctcacagtgg actttgaggc tttcggctgg gactggatca tcgcacctaa gcgctacaag 120

gccaactact gctccggcca gtgcgagtac atgttcatgc aaaaatatcc gcatacccat 180

ttggtgcagc aggccaatcc aagaggctct gctgggccct gttgtacccc caccaagatg 240

tccccaatca acatgctcta cttcaatgac aagcagcaga ttatctacgg caagatccct 300

ggcatggtgg tggatcgctg tggctgctct 330

<210> 3

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Pro Gly Pro Leu Ser Cys Ala Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ala Pro Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Pro Leu Pro Pro Pro

20 25 30

Leu Pro Leu Ala Thr Leu Met Ile Ser Ala Thr Pro Gly Val Thr Cys

35 40 45

Val Val Val Ala Val Ser His Gly Ala Pro Gly Val Leu Pro Ala Thr

50 55 60

Thr Val Ala Gly Val Gly Val His Ala Ala Leu Thr Leu Pro Ala Gly

65 70 75 80

Gly Gly Thr Ala Ser Thr Thr Ala Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

85 90 95

His Gly Ala Thr Leu Ala Gly Leu Gly Thr Leu Cys Leu Val Ser Ala

100 105 110

Leu Ala Leu Pro Ala Pro Ile Gly Leu Thr Ile Ser Leu Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Ala Gly Pro Gly Val Thr Thr Leu Pro Pro Ser Ala Ala Gly Leu

130 135 140

Thr Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Leu Gly Pro Thr Pro

145 150 155 160

Ser Ala Ile Ala Val Gly Thr Gly Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ala Ala

165 170 175

Thr Leu Thr Thr Pro Pro Val Leu Ala Ser Ala Gly Ser Pro Pro Leu

180 185 190

Thr Ser Leu Leu Thr Val Ala Leu Ser Ala Thr Gly Gly Gly Ala Val

195 200 205

Pro Ser Cys Ser Val Val Met His Gly Ala Leu His Ala His Thr Thr

210 215 220

Gly Leu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Leu

225 230

<210> 4

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaattcgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 60

ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 120

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 180

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 240

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 300

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 360

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 420

tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 480

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 540

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 600

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 660

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 702

<210> 5

<211> 344

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Leu Gly Leu Ala Cys Ala Gly His Ser Ser Gly Ser Ala Cys

1 5 10 15

Cys Ala Thr Pro Leu Thr Val Ala Pro Gly Ala Pro Gly Thr Ala Thr

20 25 30

Ile Ile Ala Pro Leu Ala Thr Leu Ala Ala Thr Cys Ser Gly Gly Cys

35 40 45

Gly Thr Met Pro Met Gly Leu Thr Pro His Thr His Leu Val Gly Gly

50 55 60

Ala Ala Pro Ala Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Leu Met

65 70 75 80

Ser Pro Ile Ala Met Leu Thr Pro Ala Ala Leu Gly Gly Ile Ile Thr

85 90 95

Gly Leu Ile Pro Gly Met Val Val Ala Ala Cys Gly Cys Ser Gly Pro

100 105 110

Gly Pro Leu Ser Cys Ala Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

115 120 125

Pro Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Pro Leu Pro Pro Pro Leu Pro

130 135 140

Leu Ala Thr Leu Met Ile Ser Ala Thr Pro Gly Val Thr Cys Val Val

145 150 155 160

Val Ala Val Ser His Gly Ala Pro Gly Val Leu Pro Ala Thr Thr Val

165 170 175

Ala Gly Val Gly Val His Ala Ala Leu Thr Leu Pro Ala Gly Gly Gly

180 185 190

Thr Ala Ser Thr Thr Ala Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gly

195 200 205

Ala Thr Leu Ala Gly Leu Gly Thr Leu Cys Leu Val Ser Ala Leu Ala

210 215 220

Leu Pro Ala Pro Ile Gly Leu Thr Ile Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ala

225 230 235 240

Gly Pro Gly Val Thr Thr Leu Pro Pro Ser Ala Ala Gly Leu Thr Leu

245 250 255

Ala Gly Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Leu Gly Pro Thr Pro Ser Ala

260 265 270

Ile Ala Val Gly Thr Gly Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ala Ala Thr Leu

275 280 285

Thr Thr Pro Pro Val Leu Ala Ser Ala Gly Ser Pro Pro Leu Thr Ser

290 295 300

Leu Leu Thr Val Ala Leu Ser Ala Thr Gly Gly Gly Ala Val Pro Ser

305 310 315 320

Cys Ser Val Val Met His Gly Ala Leu His Ala His Thr Thr Gly Leu

325 330 335

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Leu

340

<210> 6

<211> 1032

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaacctgg gtctggactg cgacgagcac tcaagcgagt cccgctgctg ccgatatccc 60

ctcacagtgg actttgaggc tttcggctgg gactggatca tcgcacctaa gcgctacaag 120

gccaactact gctccggcca gtgcgagtac atgttcatgc aaaaatatcc gcatacccat 180

ttggtgcagc aggccaatcc aagaggctct gctgggccct gttgtacccc caccaagatg 240

tccccaatca acatgctcta cttcaatgac aagcagcaga ttatctacgg caagatccct 300

ggcatggtgg tggatcgctg tggctgctct gaattcgagc ccaaatcttg tgacaaaact 360

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 420

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 480

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 540

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 600

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 660

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 720

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 780

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 840

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 900

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 960

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1020

tctccgggta aa 1032

Claims

1.一种治疗溃疡性结肠炎的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括截短性GDF11蛋白、免疫球蛋白Fc段。

2.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，截短性GDF11蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，免疫球蛋白Fc段的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

4.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，所述截短性GDF11蛋白的C端连接免疫球蛋白Fc段。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是二聚体。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

7.权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白的编码核酸，包含所述编码核酸的载体，或包含所述载体的宿主细胞；优选地，所述编码核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

8.一种治疗溃疡性结肠炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的载体、或权利要求7所述的宿主细胞。

9.权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的载体、或权利要求7所述的宿主细胞在制备产品中的应用，所述产品的功能为以下功能中的至少一种：

(1)缓解体重减轻；

(2)缓解结肠长度减少；

(3)减少炎症细胞的浸润；

(4)缓解结肠组织病变损伤。

10.权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的载体、或权利要求7所述的宿主细胞在制备治疗溃疡性结肠炎的药物制剂中的应用。