KR100331177B1 - 돼지 유행성 설사병 바이러스의 진단 방법 및 진단키트 - Google Patents

돼지 유행성 설사병 바이러스의 진단 방법 및 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스의 진단방법 및 진단키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 돼지 전염성 설사질병의 원인체인 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체와 면역학적으로 결합성이 있는 시료내의 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원의 존재를 경제적이며 간편하게 진단할 수 있는 방법 및 그에 유용한 진단키트에 관한 것이다.

Description

돼지 유행성 설사병 바이러스의 진단 방법 및 진단키트{A method for diagnosis of Porcine epidemic diarrhea virus and a kit for diagnosis}
본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus ; PEDV)의 진단방법 및 진단키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 돼지 전염성 설사질병의 원인체인 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체와 면역학적으로 결합성이 있는 시료내의 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원의 존재를 경제적이며 간편하게 진단할 수 있는 방법 및 그에 유용한 진단키트에 관한 것이다.
코로나바이러스에 의한 돼지의 주요 전염병의 원인체로는 현재 돼지 유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV), 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus; TGEV), 호흡기 코로나 바이러스(Porcine respiratory coronavirus; PRCV) 등이 있으며, 이중 PEDV와TGEV는 국내에서도 매년 발생하면서 양돈산업에 막대한 피해를 입히고 있다. 특히, PEDV는 포유자돈 및 육성돈을 비롯한 모든 연령의 돼지에 설사를 일으키며, 포유자돈의 경우 50∼100%에 달하는 심각한 폐사율을 나타내고 있어 이에 대한 시급한 대책이 필요한 실정이다.
그러나, PEDV는 치료가 불가능하기 때문에 예방과 차단방역을 통하여 피해를 경감시켜야 하지만, 조직배양상 증식 및 세포변성효과가 미약하여 실험실내 진단에최소 일주일이상의 시간이 소요되며 돼지 전염성 위장염 바이러스 감염증과 임상증상이 동일한 관계로 방역상 많은 문제점을 안고 있다.
게다가, PEDV의 진단을 위하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법이 역전사중합효소연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ; RT-PCR Kweon et al., J. V. M. S, 59(3): 231-232, 1997)법인데, 이 방법은 진단과정에 소요되는 장비가 고가이고, 전문기술을 필요로하며, 진단상 고가의 효소 및 제반비용으로 진단 비용이 많이들고 야외에 적용하기에는 적당하지 않은 것이 현실이다.
이에, 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결할 수 있으면서 PEDV를 야외에서 손쉽게 진단할 수 있는 방법에 대하여 연구하게 되었고, 그 결과, 공지의 복합효소면역측정법(Double Sandwich Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 원리에따라 가검 시료로부터 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항원의 유·무를 검정하는 진단방법에 있어, PEDV 항원을 산란계에 접종한 후, 면역된 닭의 달걀로부터 분리된 난황항체 및 PEDV에 대한 특이 모노클로날 항체를 사용한 결과, 가검시료내의PEDV 항원에 대하여 특이도가 우수하며, 육안으로 쉽게 항원의 유·무를 판정할 수 있으므로 신속하고 간단하게 PEDV를 진단할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 돼지 유행성 설사병 바이러스를 신속하고 간단하게 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 진단하고자 하는 시료내 돼지의 유행성 설사병 바이러스 항원의 검출을 위한 진단 키트의 제작 원리를 도식화한 과정이다.
도 2는 웨스턴 블롯팅에 의해 본 발명의 모노클로날 항체의 생화학적 성상을 규명한 도면이다.
<도면 부호의 간단한 설명>
A: 1. 분변유래 돼지 유행성 설사병 바이러스
2. 돼지 유행성 설사병 바이러스 약독화주(KCTC 8641P)
B: 모노클로날 항체 41-4의 아이소타잎(isotype)
도 3은 본 발명의 진단방법에 의한 돼지 유행성 설사병 바이러스 최소 검출양을 측정한 도면이다.
도 4는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)법에 의한 돼지 유행성 설사병 바이
러스 최소 검출양을 측정한 도면이다.
<도면 부호의 간단한 설명>
1: λ DNA 사이즈 마커 2: 1kb 사이즈 마커 3: 106TCID50/㎖
4: 105TCID50/㎖ 5: 104TCID50/㎖ 4: 103TCID50/㎖
도 5는 표준 돼지 유행성 설사병 바이러스주들과 다른 코로나 바이러스들의 진단결과를 육안으로 판정한 결과이다.
<도면 부호의 간단한 설명>
CCL81: Vero 세포주 ATCC CCL81 w/T: with trypsin
w/o T: without trypsin CCL81: Vero 세포주 ATCC C1586
18-4-2: KPEDV-9주의 서브클론주 TF: trypsin free
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 PEDV의 진단방법은 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원이 접종된 산란계로부터 준비한 난황항체를 분석용 플레이트의 일종인 96웰 플레이트의 각 웰에 흡착시킨 후, 웰 내에서 흡착시킨 난황항체, 가검시료내 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 분자량 30∼33kDa의 단백질과 반응하는 모노클로날 IgG2a 항체를 다음과 같은 단계를 밟아 반응시켜 검정하는 진단방법이다.
첫째, 검사하고자 하는 시료를 각 웰내에서 시료 희석액을 사용하여 희석시키고, 적정온도에서 반응시킨다. 만약, 시료내에 돼지 유행성 설사병 바이러스의 항원이 존재한다면 항원-항체 결합체가 형성될 것이다. 항원이 없다면 항원-항체 결합체는 형성되지 않는다.
둘째, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 분자량 30∼33kDa의 단백질과 특이적으로 반응하는 모노클로날 IgG2a 항체를 각 웰내에서 상기에서와 동일한 시료희석액을 사용하여 희석시키고, 적정온도 및 적정시간에서 반응시킨다. 만약, 시료내에돼지 유행성 설사병 바이러스의 항원이 존재한다면 항원-항체 결합체가 형성될 것이다. 항원이 없다면 항원-항체 결합체는 형성되지 않는다.
셋째, 항 마우스 면역글로블린 호스래디쉬 퍼옥시다제(Anti-mouse IgG horseradish peroxidase)를 각 웰에 가함으로써, 상기 두 번째 단계에서 형성된 항원-항체 결합체의 항체 부위에 특이적으로 결합하게 한다. 이때, 항원-항체 결합체가 존재하지 않는 경우 결합이 일어나지 않아 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 접합 3차 항체는 다음 세척단계에서 제거된다.
넷째, 테트라메틸벤지딘(Tetramethyl benzidine; TMB)과 과산화수소로 구성된 발색용액을 가한다. 이때, 첫째 단계에서 시료내 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원이 존재함으로써 항원-항체 결합이 이루어지고, 다시 두 번째 단계에서 항원-모노클로날 항체 결합이 이루어지며, 이어 이 항체에 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)가 접합된 3차 항체가 결합되었을 경우, 퍼옥시다제의 테트라메틸벤지딘과의 발색반응이 일어나 푸른색을 띠게 된다. 다음, 1%의 염산으로 발색반응을 종결시킨다. 이어 최종 발색 반응물의 색도를 마이크로 웰 리더로 측정한다. 이로써 가검 시료내 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원의 존재를 판별할 수 있다.
또한, 본 발명은 플레이트에 부착된 난황항체, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 분자량 30∼33kDa의 단백질과 특이적으로 반응하는 모노클로날 IgG2a 항체 이외에 상기 진단원리에 따라 시료내의 돼지 유행성 설사병 바이러스를 진단함에 필요한 시약들로 구성된 진단키트를 포함한다.
본 발명의 진단키트를 이용하여 진단할 수 있는 시료는 그 상태에 있어서 제한점이 없이, 야외에서 돼지 유행성 설사병 바이러스로의 감염이 의심되는 돼지의 설사분변, 장내용물, 삼출물, 장기 유제 등을 사용할 수 있다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만 본 발명이 이들예로만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 난황항체의 분리
본 발명자가 기 출원한 국내 특허공개공보 제 96-23048호의 돼지 유행성 설사병 바이러스 약독화주(KCTC 8641P)를 단층이 형성된 Vero(African green monkey kidney)세포에 접종한 후 0.1∼10%의 농도로 트립토스인산브로쓰(Tryptose Phosphate Broth; TPB)와 효모추출액을 첨가하고 1∼5%로 트립신을 첨가한 α-MEM 배지를 넣어, 37℃에서 4∼7일간 배양하였다. 배양이 완료된 PEDV는 Chu등(Am. J. Vet. Res. 25:103-107, 1985)이 보고한 방법으로 폴리에틸렌글리콜(M.W. 6000∼8000)로 처리하고 원심분리에 의해 농축수확한 후, TEN 완충용액(10mM Tris-Cl, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH 7.0∼8.0)에 용해시키고, Freund's complete adjuvant(FCA), Freund's incomplete adjuvant(FIA), 상품화된 오일 등의 보조제와 함께 유화 현탁한 후, 백색 레그혼계 산란계에 1마리당 0.2∼1㎖로 근육주사하였다. 주사는, 3∼4주간 2회, 합계 3회 반복한 후, 항체가의 유지를 위하여 4∼6주마다 1회의 면역을 실시하고, 주기별로 수집한 달걀로부터 난황을 분리하여 이를 난황항체로 하였다.
[실시예 2] 모노클로날 항체의 생산 및 항체의 특성
모노클로날 항체는 Goding(J. Immunological Meth 39:285-308, 1983)이 보고한 방법에 의해 마우스의 임파구와 골수종 세포를 융합시켜 하이드리도마를 작성하고, 이를 배양하여 생산하였다.
항원인 돼지 유행성 설사병 바이러스 약독화주(KCTC 8641P)를 FCA와 혼합한후, Balb/c 마우스의 복강내에 접종하고, 3∼4주후 다시 FIA와 혼합한 항원을 추가 접종하였다. 이후, 정제항원을 2∼3주 간격으로 2∼3회 반복면역하였으며, 5∼6주후에 세포융합시험에 이를 사용하였다.
세포융합을 위해 융합 3∼4일전에 마우스를 정제항원으로 면역시킨 후, 무균적으로 비장을 적출하고, 이로부터 임파구를 분리하였다. 그 다음, 혼입된 적혈구를 저장(低張)성 용액으로 제거하고, PEG(분자량 4,000)를 융합촉진제로 사용하여 Sp2/O 골수종세포(myeloma cell)와 융합하는데, 세포융합 방법은 하기와 같다.
생존세포가 95%이상의 양호한 골수종 세포와 분리된 임파구를 1:5의 비율로 튜브에 섞은후 가볍게 원심침전하여 상층액을 버리고 튜브의 밑면에 골고루 퍼지게 한 뒤 37℃로 미리 가온해 놓은 PEG용액 및 혈청을 가하지 않은 DMEM을 이용하여 다음과 같이 연속적으로 융합을 수행한다. 최초 PEG용액 1㎖를 1분에 걸쳐 일정한 속도로 반응시킨 다음 DMEM 1㎖을 1분간 1회, 1회 반복, 2㎖을 1분간 1회, 7㎖을 1분간 1회 연속적으로 반응시켜 융합을 실시하였다. 여기에 조심스럽게 배지를 40㎖까지 채워 가볍게 원심침전하고 1회 세척한 후 융합세포를 5×10-3M 하이포잔틴, 2×10-3M 아미노프테린, 8×10-4M 티미딘(HAT)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium) 선택배지로 부유시켜 조직배양용 플레이트에웰당 100㎕씩 분주하였다. 분주된 세포를 5% CO2가 공급되는 37℃ 인큐베이터에서 10∼14일간 배양한 후, 배양액의 항체 역가를 ELISA방법으로 결정하고, 목적하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포만을 선택하였다.
선택된 하이브리도마 세포를 일반적인 한계희석법(limiting dilution method), 즉, 하이브리도마 세포가 웰에 약 15%이상 자라 배양배지가 노랗게 변하게 되면 그 웰의 상층액을 일부 취해 항체 역가를 확인하여 양성일 경우 그 세포를 수확하여 세포수를 세고 이를 96웰 마이크로 플레이트에 계단희석하여 최종적으로한계 희석에 도달했을 때 웰당 0.5∼1개씩 세포가 들어가도록 계산하여 플레이트에분주하고 이를 배양하여 단일 클론으로 생각되는 웰에 대해 다시 상층액을 검사하여 양성일 경우 상기 희석, 배양 및 항체가 검사과정을 2회 반복한다. 이렇게 3회 클로닝하면 거의 확실하게 최종적으로 모노클로날 항체를 안정하게 생산하는 단일 클론의 하이브리도마 세포를 얻을 수 있으며, 이러한 방법으로 최종적으로 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 PEDV 41-4를 작성하게 되었다.
상기 하이브리도마 PEDV 41-4는 1999년 6월 28일자로 한국세포주 연구재단에 미생물기탁에 관한 부다페스트 조약하에 기탁되어 각각 KCLRF-BP-00023의 수탁번호를 부여받았다.
하이브리도마 PEDV 41-4(KCLRF-BP-00023)를 배양 용기의 단면적을,예를 들어 24웰, 6웰, 25㎠, 75㎠순으로 늘려가며 대량 배양하면 배양 상층액으로부터 대량의 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 이 중 일부 하이브리도마 세포는 액체질소에 동결보존하고, 나머지는 107개 정도로 조절하여 Balb/c 마우스 복강내에 접종하여 암을 유발시키면 접종후 약 1주 전후에 마우스 복강내에 많은 복수가 차게되고, 주사기를 이용 이를 수확하여 높은 역가의 마우스 복수 모노클로날 항체(41-4)를 생산하였다.
생산된 모노클로날 항체(41-4)의 특성은 다음과 같다.
(1) 모노클로날 항체(41-4)의 특이성
본 발명에 사용되는 모노클로날 항체 41-4의 돼지 유행성 설사바이러스에 대한 특이성은 야외분변유래 돼지 유행성 설사병 바이러스와 돼지 유행성 설사병 바이러스 약독화주(KCTC 8641P)를 Vero 세포에 감염시킨후 특이성을 면역블롯팅(immunoblotting)법으로 검사하였다.
즉, 바이러스감염시킨 후 수확한 베로세포에 동량의 SDS sample buffer(3% SDS, 2% 2-머캅토에탄올, 2mM EDTA, 62.5mM Tris, 0.001% 브로모페놀블루, pH 6.8)를 첨가하여 감염세포를 융해한 다음 100℃에서 3분간 열처리하였다. 열처리한 시료의 원심상층액을 10% 폴리아크릴아마이드 겔에서 Laemmli(Nature : 227 ; 680, 1970) 방법에 따라 전기영동하였으며, 전개된 단백질은 Burnette(Anal. Bioch: 112 ; 195. 1981)의 전기블롯팅(electroblotting)법으로 니트로셀룰로오스 페이퍼(NCP, Bio-rad제품)에 전사하였다. 이때 사용한 블롯팅 완충용액(pH 8.3)은 20mM Tris, 160mM 글리신 및 20% 메탄올을 함유한 것으로, 150∼200mA에서 16∼18시간 동안 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 다음 니트로셀룰로오스페이퍼를 겔에서 분리하여 3% 우태아혈청으로 1시간동안 블로킹하였으며, 이후 모노클로날 항체(복수 모노클로날 항체 희석액 또는 하이브리도마 세포 배양상층액)와 12∼16시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 니트로셀룰로오스페이퍼는 0.05% tween 20이 첨가된 생리식염수로 5분간 3회 세척하고, 토끼 항-마우스 면역글로블린 퍼옥시다제 결합체(Pierce사 제품, PBS로 1:3,000의 비율로 희석)와 1시간동안 반응하였다.
이와 같은 과정이 끝난 니트로셀룰로오스페이퍼는 Tris-PBS(50mM Tris, 200mM NaCl, pH 7.4)로 5분간 3회 세척한 후, 기질(0.05% 4-클로로-1-나트톨, 0.01% H2O2)로 발색시켜 특이항원 폴리펩티드를 검출하였다. 이 실험에서 비감염세포도 동일한 방법으로 처리하여 대조항원으로 사용하였으며, 전기영동으로 분석한 단백질의 분자량은 분자량 마커 단백질(Sigma 제품)과 비교하여 분석하였다. 그 결과는 도 2의 A와 같다. 도 2의 A로부터 모노클로날 항체 41-4는 돼지 유행성 설사병 바이러스의 분자량 30∼33kDa의 단백질에 특이적으로 반응하는 항체임을 알 수 있다.
(2) 모노클로날 항체의 아이소타잎(isotype) 측정
돼지 유행성 설사병 바이러스에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체의 아이소타잎을 다음의 방법으로 알아보았다. 즉, 모노클로날 하이브리도마 세포 약 1×108개를 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 이를 100㎕의 생리식염수에 부유시켜 3회 동결융해처리하였다. 그 다음, 이를 다시 원심분리하고, 상층액을 사용하여면역확산법(immunodiffusion)으로 아이소타잎을 검사하였다. 사용된 표준혈청은 토끼 항-마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA의 H 사슬 특이항체(Heavy chain specific antibody)(B.M. 제품)을 이용하였다. 그 결과, 모노클로날 항체 41-4는 IgG2a(κ 체인) 클래스로 판정되었다(도 2의 B).
[실시예 3] 진단키트의 제조 및 진단방법
진단키트 제조에 사용되는 항체는 실시예 1의 난황항체와 실시예 2의 모노클로날 IgG2a 항체(41-4)이다.
즉, 난황항체(혈청중화역가 16∼32배)를 흡착용코팅완충액(50mM 탄산염 완충액, pH 9.5)으로 희석시킨 후, 마이크로플레이트에 100㎕씩 분주하여 난황항체를 흡착시켰다.
흡착이 끝난 후, 마이크로플레이트에 10% 스킴밀크가 함유된 인산완충액(PBS, pH 7.2)을 분주한 후, 1시간 동안 항체가 흡착되지 않은 부위를 차단하였다. 그 다음, 난황항체가 흡착된 플레이트 웰을 건조하였다.
이렇게 제조된 난황항체 흡착 플레이트 웰 및 하기에서 언급되는 진단키트를구성하는 시약들을 이용하여 다음과 같이 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV) 항원을 진단할 수 있다.
먼저, 가검 시료를 10% 스킴 밀크가 함유된 인산완충액(PBS, pH 7.2)에 10%의 농도로 부유시킨 희석액 100㎕를 각 웰에 분주한 후, 37℃에서 1시간동안 반응시켜 PEDV 항원과 웰에 흡착된 난황항체의 결합반응이 일어나게 한다. 이어, 0.5% Tween 20이 함유된 인산완충액(PBS, pH 7.2)으로 3회 세척한 후, 다시 10% 스킴밀크를 함유하는 인산완충액(PBS, pH 7.2)으로 2,000∼3,000배 희석시킨 모노클로날 IgG2a 항체 희석액 100㎕를 각 웰에 분주한 후, 37℃에서 1시간정도 반응시켜 항원-항체 결합체의 PEDV 항원과 결합반응이 일어나게 한다. 이어, 0.5% Tween 20이 함유된 인산완충액(PBS, pH 7.2)으로 3회 세척한다. 세척된 웰에 인산완충액(PBS, pH 7.2)으로 2,000∼3,000배 희석시킨 항마우스 IgG 호스래디쉬 퍼옥시다제(Horseradish Peroxidase, Pierce, USA) 희석액을 각 웰당 100㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 인산완충액(PBS, pH 7.2)으로 3회 세척한 후, 테트라메틸벤지딘(Kpl) 용액을 각웰 당 100㎕씩 가하여 실온에서 30분간 발색시킨후 1N HCl을 100㎕씩 가하여 반응을 정지시켰다. 이때 발색도는 450nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 판정하였다.
결과의 판정은 음성 대조와의 비교치가 2배이상 높을 경우 양성으로 판정하였다.
[실시예 4] 돼지 유행성 설사병 바이러스의 최소검출한계
가검시료로서, 돼지 유행성 설사병 바이러스 약독화주(KCTC 8641P)를 적용하여 실시예 2의 진단방법으로 최소검출한계를 조사하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3으로부터, 본 발명의 진단방법은 돼지 유행성 설사병 바이러스를 2.5×103TCID50/㎖까지 검출할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 5] 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 돼지 유행성 설사병 바이러스의 최소검출한계
본 발명의 진단효율과 역전사효소중합방법을 비교하기 위하여 권등(kweon et al., J. V. M. S, 59(3):231, 1997)이 보고한 역전사효소중합방법(reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)에 의한 최소검출한계를 측정하였다. 즉, 정제된 돼지 유행성설사 바이러스로부터 Ultraspec-3 키트(U.S.A)를 이용하여 바이러스 RNA를 추출하고, P3 프라이머(5'-GCC ATA AAG TTT CTG TTT AGA CTT A-3')를 가하고, 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 유전자증폭기(Thermal cycler, Perkin Elmer, USA)에서 다음의 조건하에서 P1 프라이머(5'-GGA CAC ATT CTT GGT GGT CT)와 P2 프라이머(5'-GTT TAG ACT AAA TGA AGC ACTTTC-3')를 이용하여 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응조건은 94℃에서 2분, 58℃에서 2분 및 72℃에서 2분을 1회; 94℃에서 1분, 58℃에서 1분 및 72℃에서 1분을 40회; 및 94℃에서 2분, 58℃에서 2분 및 72℃에서 2분을 1회로 실시하였다
반응이 끝난 PCR증폭산물을 1.8∼2%의 아가로스겔에서 전기영동을 실시한 다음 에티듐브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여, 증폭된 유전자를 확인하였다.
그 결과는 도 4와 같다. 도 4로부터 증폭된 377bp의 DNA단편은 103TCID50/㎖까지 돼지 유행성 설사바이러스를 검출할 수 있음을 알 수 있다.
상기 실시예 4와 5의 결과로부터, 본 발명의 진단방법은 역전사중합효소연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)법에 의한 최소 검출한계와 거의 대등한 수준의 진단 민감도를 갖는 방법이라는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 저렴한 비용으로 돼지 유행성 설사병 바이러스를 진단할 수 있는 방법임을 알 수 있다.
[실시예 6]
스위스 유래 돼지 유행성 설사병 바이러스, 일본 유래 돼지 유행성 설사병바이러스 및 가검분변과 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV, Pyung-tag strain), 호흡기 코로나 바이러스 악독화주(Porcine respiratory coronavirus, PRCV; KFCC-10899)를 실시예 3의 방법으로 진단하고, 그 결과를 표 1 및 도 5에 나타내었다.
전염성(Log10) KCTC 8641P 스위스유래 PEDV 일본유래PEDV 베로세포 상청액 분변유래PEDV 분변 분변유래 TGEV 공백
4.000 0.748 0.707 0.467 0.146 0.512 0.187 0.158 0.137
3.699 0.502 0.418 0.289
3.495 0.433 0.278 0.243
표 1로부터, 본 발명의 진단방법은 돼지 유행성 설사병 바이러스만 특이적으로 진단할 수 있는 방법임을 알 수 있다.
그리고, 도 5로부터, 표준 돼지 유행성 설사병 바이러스가 첨가된 플레이트에서는 발색을 확인할 수 있었으나, 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV) 및 호흡기 코로나 바이러스(Porcine respiratory coronavirus, PRCV)는 음성반응을 나타내므로, 본 발명의 방법의 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 특이성이 육안적으로 쉽게 판정될 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 7] 야외적용
실제 본 발명의 진단효율을 야외에 적용하고자 어린 자돈을 분변에서 분리된유행성 설사 바이러스로 인공감염시킨 후, 매일 매일 수집한 설사재료를 사용하여 실시예 3의 방법으로 진단하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
자돈 포스트 접종 본 발명의 진단방법 역전사중합효소연쇄반응법
1 0 시간 0.187 -
2 24 시간 0.213 +
3 43 시간 0.413 ND*
4 48 시간 0.213 +
5 48 시간 0.368 ND
6 48 시간 0.665 ND
7 72 시간 0.522 +
8 120 시간 0.516 ND
9 120 시간 1.12 ND
분변분리 PEDV 2.23 +
분변분리 TGEV 0.158 -
* ND : no detection
상기 표 2로부터, 두 방법 모두 감염 24시간이후에는 양성진단이 가능하다는 것을 알 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 진단방법은 돼지 유행성 설사바이러스에만 특이성을 가지므로, 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV)를 정확하게 진단할 수 있으며, 본 발명의 진단키트를 이용하면 특별한 장비가 필요하지 않으므로 저렴한 비용으로 진단할 수 있고, 야외에서 간단하게 PEDV를 진단하는 것이 가능하다.

Claims (3)

  1. 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV) 항체를 플레이트에 결합시킨 후, 검사하고자 하는 시료와 반응시키고, 다시 특이항원과 반응시켜 항원-항체 복합체의 형성을 검정함으로써 돼지 유행성 설사병 바이러스를 진단함에 있어서, 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원을 산란계에 접종한 후, 면역된 닭의 달걀로부터 분리된 난황항체 및 특이항체로 하이브리도마 PEDV 41-4(KCLRF-BP-00023)로부터 생산되고, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 분자량 30∼33kDa의 단백질과 반응하는 모노클로날 IgG2a 항체를 사용함을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사병 바이러스의 진단 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 시료는 돼지의 설사분변, 장내용물, 삼출물 또는 장기유제액임을 특징으로 하는 진단방법.
  3. 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원을 산란계에 접종한 후, 면역된 닭의 달걀로부터 분리된 난황항체 및 하이브리도마 PEDV 41-4(KCLRF-BP-00023)로부터 생산되고, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 분자량 30∼33kDa의 단백질과 반응하는 모노클로날 IgG2a 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 진단키트.
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