CN101833002A - 一种鉴别免疫动物感染a型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法 - Google Patents

一种鉴别免疫动物感染a型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鉴别免疫动物是否感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法。该方法是用昆虫杆状病毒表达A型流感病毒NA蛋白作为抗原，建立抗体间接免疫荧光试验方法，检测A型流感病毒NA蛋白血清抗体。表达的蛋白可直接作为抗原，不需要纯化。本发明建立的方法是A型流感病毒“标记”疫苗的配套检测方法，用于鉴别接种了A型流感“标记”疫苗的动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒；作为一种筛选方法，该方法可用于临床血清样品检测，判定接种了A型流感“标记”疫苗的动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒，以便尽早采取相应的防控措施，有利于根除和消灭临床上流行的相应A型流感病毒。

Description

一种鉴别免疫动物感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别接种了A型流感“标记”疫苗动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法，具体涉及一种检测A型流感病毒NA蛋白血清抗体的间接免疫荧光试验方法，是A型流感“标记”疫苗的配套检测方法。
背景技术
A型流感，如H5N1亚型禽流感、H1N1甲型流感是一种严重的人畜共患病，既可给养禽业造成巨大的经济损失，又可以导致人的死亡，在世界许多国家流行，其中包括我国。经典的预防A型流感(如禽流感H5N1亚型)的措施包括采取严格的生物安全措施、限制有感染流感病毒风险动物的移动，扑杀感染病毒的动物。疫苗接种是防控流感的一种非常有效地手段，尽管免疫接种能提高动物的抵抗力，使免疫动物不表现出临床症状和感染动物减少排毒数量，但并不能完全阻止病毒的感染，也就是说接种了疫苗的动物接触到病毒后，可能成为健康的带毒者。所以，作为免疫接种的配套手段，需要严密的监测接种了疫苗的动物，检测动物群是否存在健康带毒禽，以便采取相应的措施，以防病毒随着带毒动物的移动而向外传播，更不利于该病的控制。
鉴别免疫动物，如禽、猪等是否携带A型流感病毒历来是动物疫病防控措施难点，尤其是通过检测抗体进行鉴别诊断。一个有效方法是给动物，如禽、猪等免疫接种“标记”疫苗，然后针对疫苗的“标记”，检测相应蛋白抗体，可鉴别诊断出免疫动物是否感染A型流感病毒。例如给鸡接种表达H5N1病毒HA基因的重组鸡痘病毒疫苗或用与流行病毒(H5N1)不同NA亚型的病毒(H5N3)制备灭活疫苗等，通过检测血清中N1蛋白抗体(这种抗体只有病毒能够诱导产生，而“标记”疫苗不能产生)判定免疫了“标记”疫苗的鸡是否感染H5N1亚型流感病毒，一旦检测到N1抗体就表明该禽感染了禽流感病毒(H5N1亚型)。
现有技术中一般采用“哨兵”动物，来判定免疫动物群是否感染A型流感病毒。所谓的“哨兵”动物是指没有免疫的动物，即不含有相应A型流感病毒的抗体。把“哨兵”动物随机放到免疫动物群中，经过与免疫动物接触一段时间，检测“哨兵”动物血清中相应亚型流感病毒的抗体，如果为阳性，则判定该动物群有相应亚型流感病毒流行。用“哨兵”动物来判定免疫动物群是否感染A型流感病毒存在以下缺点：
1.成本高。“哨兵”动物必须是无特定病原动物，即不能含有某种病原，如A型流感病毒，才能作为“哨兵”动物，在使用“哨兵”动物前，必须饲养在特殊的环境中，因此，“哨兵”动物的成本很高，而且在使用时需要投放一定数量。
2.难以大范围使用。为了鉴别动物群是否感染野毒，必须对每群动物投放一定比例的“哨兵”动物，这在实际操作中不具有可行性，只能针对风险性最高的动物群实施，因此，难以大范围应用。
3.只能在群体水平进行鉴别。使用“哨兵”动物只能在群体水平鉴别动物群是否感染野毒，不能了解和掌握动物群感染的比例和状态。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种鉴别免疫动物，如禽、猪等是否感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验。通过检测A型流感病毒NA蛋白血清抗体进行判断，该方法操作简单，结果判定直观，特异性好。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种检测A型流感病毒NA蛋白血清抗体的间接免疫荧光试验方法，包括如下步骤：
(1)采集接种了A型流感“标记”疫苗的动物，如禽、猪等血液，分离血清，并用PBS溶液稀释；
(2)表达NA基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，并表达NA蛋白；
(3)将步骤(1)中稀释的禽血清加入到步骤(2)中表达NA蛋白的昆虫细胞上，室温作用一段时间；
(4)用PBS溶液漂洗，然后加入适量FITC标记的兔抗鸡二抗，室温作用一段时间；
(5)用PBS溶液漂洗，然后加入适量碳酸甘油缓冲液，在荧光显微镜下观察是否有荧光出现；
(6)根据观察的结果判断动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒。
进一步，如上所述的鉴别免疫动物感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法，在步骤(2)中获得接种了表达NA基因的重组杆状病毒，具体方法如下：
①使用RT-PCR技术扩增A型流感病毒NA基因；
②把NA基因克隆到昆虫杆状病毒表达载体(pFast-Bac)中，获得表达NA基因的重组杆状病毒；
③把重组杆状病毒接种到昆虫细胞上表达NA蛋白，一段时间后，去掉细胞培养上清液，用丙酮固定细胞，直接作为抗原检测NA血清抗体。
进一步，如上所述的鉴别免疫动物感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法，在步骤(6)中，如果观察无特异荧光，判为阴性，动物，如禽、猪等没有受到相应亚型流感病毒感染；如果观察出现特异荧光，判为阳性，动物，如禽、猪等受到相应亚型流感病毒感染。
进一步，如上所述的鉴别免疫动物感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法，其特征在于：该方法是A型流感“标记”疫苗的配套检测方法，用于判定接种了“标记”疫苗的动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒；该方法适用临床样品检测，是判定接种了“标记”疫苗的动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒的筛选方法。
本发明的有益效果如下：1)本发明采用昆虫杆状病毒表达系统，表达A型流感病毒NA蛋白，表达的NA蛋白，作为一种真核表达系统，保证了NA蛋白的正确折叠和糖链修饰，保持更好的抗原性。2)本发明建立的间接免疫荧光操作简单，不需要计算阳性/阴性阈值；本发明结果判定直观，阴性和阳性结果非常容易判定，从而节省了判定的时间。3)本发明是A型流感“标记”疫苗的配套检测方法，用于鉴别接种了A型流感“标记”疫苗的动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒；作为一种筛选方法，该方法可用于临床血清样品检测，判定接种了A型流感“标记”疫苗的动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒，以便尽早采取相应的防控措施，有利于根除和消灭临床上流行的相应A型流感病毒。
附图说明
图1为本发明实施例的方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
如图1所示，鉴别免疫动物，如禽、猪等是否感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验，包括如下步骤：
(1)采集接种了A型流感“标记”疫苗的动物，如禽、猪等的血液，分离血清并稀释，具体过程如下：
①动物，如禽、猪等免疫接种A流感(如H5亚型)“标记”疫苗；
②采集接种了A型流感“标记”疫苗的动物，如禽、猪等的血液，分离血清；
③用PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)将血清稀释到100～1000倍数。
(2)获得表达A型流感病毒NA基因的重组杆状病毒，并接种昆虫细胞(sf9)，表达NA蛋白，具体过程如下：
①使用RT-PCR技术扩增A型流感病毒(如H5N1)NA基因，RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术，为本领域的公知技术；
②把NA基因克隆到昆虫杆状病毒表达载体(pFast-Bac)中，获得表达NA基因的重组杆状病毒；
③把重组杆状病毒接种到昆虫细胞(sf9)上，36～48小时后，去掉细胞培养上清液，用冷丙酮固定细胞。
上述步骤(1)和步骤(2)可以同时进行。
(3)将步骤(1)中100～200微升稀释的动物血清加入到步骤(2)中得到的昆虫细胞上，室温作用2～3小时。同时设阴性对照和阳性对照。
(4)用PBS溶液漂洗三次，干燥后加入适量FITC标记的兔抗鸡二抗(1∶50～100稀释)，室温作用1小时；
(5)用PBS溶液漂洗三次，干燥，在荧光显微镜下观察；
(6)在阳性和阴性对照结果成立的条件下，如果观察无特异荧光，判为阴性，禽类没有受到禽流感病毒感染；如果观察出现特异荧光，判为阳性，禽类受到禽流感病毒感染。
通过以上的具体实施例可见，本发明用昆虫杆状病毒表达A型流感病毒NA蛋白，重组昆虫杆状病毒接种昆虫细胞(sf9)，表达的NA蛋白直接作为抗原，不需要纯化。本发明是A型流感“标记”疫苗的配套检测方法，用于鉴别接种了A型流感“标记”疫苗的动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒；作为一种筛选方法，该方法可用于临床血清样品检测，判定接种了A型流感“标记”疫苗的动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒，以便尽早采取相应的防控措施，有利于根除和消灭临床上流行的相应A型流感病毒。
本发明所述的方法并不限于具体实施方式中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。

Claims (4)

1.一种鉴别免疫动物感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法，包括如下步骤：
(1)采集接种了A型流感“标记”疫苗的动物的血液，分离血清，并用PBS溶液稀释；
(2)表达NA基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，并表达NA基因；
(3)将步骤(1)中稀释的禽血清加入到步骤(2)中表达NA蛋白的昆虫细胞上，室温作用一段时间；
(4)用PBS溶液漂洗，然后加入适量FITC标记的兔抗鸡二抗，室温作用一段时间；
(5)用PBS溶液漂洗，然后加入适量碳酸甘油缓冲液，在荧光显微镜下观察是否有荧光出现；
(6)根据观察的结果判断动物是否感染相应亚型流感病毒。
2.如权利要求1所述的鉴别免疫动物感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法，其特征在于：步骤(2)中获得接种了表达NA基因的重组杆状病毒，具体方法如下：
①使用RT-PCR技术扩增A型流感病毒NA基因；
②把NA基因克隆到昆虫杆状病毒表达载体pFast-Bac中，获得表达NA基因的重组杆状病毒；
③把重组杆状病毒接种到昆虫细胞上表达NA蛋白，一段时间后，去掉细胞培养上清液，用丙酮固定细胞，直接作为抗原检测NA血清抗体。
3.如权利要求1或2所述的鉴别免疫动物感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法，其特征在于：在步骤(6)中，如果观察无特异荧光，判为阴性，接种“标记”疫苗的动物没有受到相应亚型流感病毒感染；如果观察出现特异荧光，判为阳性，接种“标记”疫苗的动物受到相应亚型流感病毒感染。
4.如权利要求1、2或3所述的鉴别免疫动物感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法，其特征在于：该方法是A型流感“标记”疫苗的配套检测方法，用于鉴别接种了A型流感“标记”疫苗的动物是否感染相应亚型流感病毒；作为一种筛选方法，该方法可用于临床血清样品检测，以便尽早采取相应的防控措施，有利于根除和消灭临床上流行的相应A型流感病毒。
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