CN109321565A - 一种对粪便样品进行预处理的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种对粪便样品进行预处理的方法及其应用。对粪便样品进行预处理的方法包括如下步骤：向采集到的粪便样品中加入灭菌PBS缓冲液，经机械震荡、离心和过滤得到样品悬液，所述粪便样品与PBS缓冲液的用量之比为(5‑7)：(3‑5)，所述粪便样品以g计，所述PBS缓冲液以ml计。该对粪便样本进行预处理的方法适用于多种动物粪便样品的处理，提取得到的RNA的浓度和纯度高。

Description

一种对粪便样品进行预处理的方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种对粪便样本进行预处理的方法及其应用。

背景技术

粪便作为一种非损伤性取样方法，无疑是一种理想的样本材料，但粪便同时是一种特殊材料，含有较为复杂的物质，受暴露时间、保存方法、温度及取样方法等影响，粪便中微生物RNA很容易发生降解，对后续实验产生不利影响，甚至导致失败。此外采集到的粪便样本不能直接用于RNA或DNA的提取，需要将其均质化后才可用于提取其中的全部核酸。因此，粪便样本的采集、保存、均质化等预处理对于后续提取有效核酸是至关重要的。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种对粪便样品进行预处理的方法，以及该对粪便样品进行预处理的方法的应用。

本发明的对粪便样本进行预处理的方法采用如下技术方案：一种对粪便样品进行预处理的方法，包括如下步骤：向粪便样品中加入灭菌PBS缓冲液，所述粪便样品与PBS缓冲液的用量之比为(5-7)：(3-5)，所述粪便样品以g计，所述PBS缓冲液以ml计，经机械震荡、离心和过滤得到样品悬液。

优选的，所述粪便样品通过用取样勺挑开新鲜粪便表面，插入粪便内部挑取得到或取自-80℃环境中的冻存粪便样品。

优选的，还包括对粪便样品进行储存的步骤：从新鲜样品内部挑取得到粪便样品后将粪便样品暂存于-20℃以下的环境中(如携带有干冰的泡沫箱等)或储存于-80℃环境中。

优选的，所述样品悬液的制备包括如下步骤，向离心管中加入PBS灭菌缓冲液，将粪便样品加入所述离心管，用机械震荡器震荡至固体样本充分溶解；用冷冻离心机在12000rpm条件下离心10min；吸取所述离心管内的上清液，用0.45μm滤膜过滤2次，收集滤液，即得所述样品悬液。

优选的，所述样品悬液冻存于-20℃以下的环境中。

优选的，所述粪便样品为猪粪样品、羊粪样品或牛粪样品。

优选的，所述粪便样品为猪粪混合样品，所述猪粪混合样品取自同一养殖地的产房、保育舍、母猪舍、育肥舍和公猪舍，按照质量比1:1:1:1:1混合。

如上所述的对粪便样品进行预处理的方法在从粪便样品中提取核酸方面的应用。

优选的，所述的对粪便样品进行预处理的方法在从粪便样品中提取RNA方面的应用，其中所述RNA的提取方法为天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒法。

本发明的有益效果是：本发明的对粪便样品进行预处理的方法操作简便，得到的样品悬液用于核酸提取等后续实验，该预处理方法适用于多种动物粪便的预处理。

该对粪便样品进行预处理的方法与天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒法配合使用提取得到的RNA的总量和纯度高，质量好，可用于构建测序文库等后续实验。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：对猪群体样本进行采集、预处理并提取RNA。

1、样品采集：在同一养猪场内，按照产房(哺乳仔猪、母猪)、保育舍(保育猪)、母猪舍(经产母猪、后备母猪)、育肥舍(育肥舍)和公猪舍的顺序依次取样，具体取样步骤如下：用无菌采样勺采取猪群刚排泄到地面的新鲜粪便，用勺挑开猪粪便表面，插入粪便内部挑取粪便，每种粪便标本采集量是100g。采集后立即放入无菌采样自封袋内，标记清楚样本信息后，将样品暂存于装有干冰的泡沫箱内(-20℃以下)，立即送达实验室处理，需长期保存的样本存于-80℃冰箱，避免反复冻融。

2、样品悬液的制备：将取自产房、保育舍、母猪舍、育肥舍和公猪舍的样品分别等量称取，混合备用；取3支50ml无菌圆底离心管，分别向1号离心管、2号离心管、3号离心管加入25mlPBS缓冲液，在生物安全柜中分别向1-3号离心管中加入猪粪样品25g、35g、20g，用机械震荡器剧烈震荡2-5min，至固体样本充分溶解；用冷冻离心机在12000rpm条件下离心10min；分别用10ml灭菌注射器吸取1号-3号离心管内的上清液，用0.45μm滤膜过滤2次，分别收集滤液于新的4-6号无菌离心管(4号离心管对应于1号离心管中的样品，5号离心管对应于2号离心管中的样品，6号离心管对应于3号离心管中的样品)中即得到样品悬液。

3、以步骤2所得到的样品悬液为原料，提取RNA，具体步骤如下：(1)向500μL样品悬液(分别取自4号-6号离心管)依次加入50μL蛋白酶K和500μLGB buffer，56℃孵育15min；(2)孵育结束后，加入250μL无水乙醇，涡旋、混匀，静置5min并将液体转入放置在收集管内的吸附柱中，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；(3)向吸附柱中加入500μL溶液GD，盖上盖子，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管；(4)加入600μL溶液PW静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管，并重复一次；(5)加入500μL无水乙醇，盖上盖子，8000rpm离心1min弃废液；再12000rpm离心2min，弃废液；(6)将吸附柱移入新离心管中，室温放置3min，后加入20μLRNase-FreeddH₂O，盖上盖子，室温放置5min,12000rpm离心1min，即得RNA提取液。利用Qubit检测提取得到的RNA的浓度和纯度，提取结果如下：(见表1)

表1

备注：(1)所用到的蛋白酶K、GB buffer、无水乙醇、吸附柱、溶液GD、溶液PW和RNase-Free ddH₂O选自目录号为DP315，版本号为：DP140916的天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，将该试剂盒用于提取本发明的猪粪悬液中RNA的提取，且提取到的RNA的总量高，OD260/OD280值可稳定在1.8-2.0之间，RNA的纯度高，提取效果好，可用于cDNA文库构建等后续实验。

(2)表1中的RNA浓度采用Qubit3.0测得，OD268/OD280采用NanoDrop 2000微量分光光度计测得。

实施例二：另取一份样品悬液，用Qubit法测得该样品的核酸浓度17ng/μL，分别取出3份，每份500μL，用于提取RNA。分别以下述方法提取样品中的RNA。

1.采用天根试剂盒提取样品中的RNA，具体提取方法同实施例一；

2.采用康为世纪病毒RNA提取试剂盒(目录号CW0586S，版本号02/2017)提取样品中的RNA，具体提取步骤按照说明书执行：(1)室温下取500μL样品加到1.5ml离心管中；(2)向上步溶液中加入50μL Proteinase K，混匀；(3)加入500μL Buffer GL，涡旋震荡15s；(4)56℃孵育15min，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底；(5)加入250μL无水乙醇，涡旋震荡15s，室温孵育5min，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底；(6)将步骤5得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分2次转入，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(7)向吸附柱中加入500μLBuffer RW1,12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(8)向吸附柱中加入500μLBuffer RW2,12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(9)向吸附柱中加入500μL无水乙醇，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(10)12000rpm离心3min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

3.采用TRIZOL法提取样品中的RNA，具体提取步骤如下：(1)取600μL猪粪悬液，加入900μL TRIZOL，室温孵育5min，12000rpm，4℃离心10min。(2)将上清转移至一个新的Ep管中(如果上清中有脂肪，将脂肪去掉)。(3)加入180μL氯仿，充分震荡，12000rpm，4℃离心15min,弃上清。(4)向Ep管中加入100％的乙醇0.36ml，上下颠倒混匀，室温孵育2-3min，2000rpm，4℃离心5min,弃上清。

(5)加入1.8ml 75％的乙醇，将沉淀吹起，室温孵育10min，上下颠倒混匀,2000rpm，4℃离心5min，弃上清。(6)重复步骤(5)一次。

(7)敞口5-10min，自然晾干。

(8)加入适量TE溶解DNA，溶解后的DNA进行DNA/RNA定量。

利用Qubit法(Qubit 3.0)对提取得到的RNA浓度进行检测，并用NanoDrop 2000微量分光光度计对提取得到的RNA的纯度进行检测，检测结果如下表表2所示：

表2

从上表可知，本发明的RNA提取方法(同实施例一，采用天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒)提取得到的RNA的纯度高，可用于cDNA文库构建等后续实验；康为世纪病毒RNA提取试剂盒提取得到的RNA少，采用Qubit法未检出；结合表2中分别采用天根试剂盒和康为世纪试剂盒提取相同样品中的RNA的实验数据可知：由于粪便样品的成分复杂，且粪便样品中所含的RNA的量少，因此并非所有病毒RNA提取试剂盒均适用于从粪便样品中提取RNA。TRIZOL法提取得到的RNA虽然较多，但纯度低。

实施例三：从牛粪和羊粪样品中提取RNA。

1.(1)对牛粪样品进行预处理：用无菌采样勺采集刚排泄到地面的新鲜粪便，用勺挑开粪便表面，插入粪便内部挑取粪便，粪便标本采集量是100g。采集后立即放入无菌采样自封袋内，标记清楚样本信息后，将样品暂存于装有干冰的泡沫箱内(-20℃)，立即送达实验室处理，需长期保存的样本存于-80℃冰箱，避免反复冻融。

(2)对羊粪样品进行预处理：捡拾新鲜羊粪样品，采集后立即放入无菌采样自封袋内，标记清楚样本信息后，将样品暂存于装有干冰的泡沫箱内(-20℃)，立即送达实验室处理，需长期保存的样本存于-80℃冰箱，避免反复冻融。

2.制备样品悬液：取无菌圆底离心管，加入灭菌PBS缓冲液，在生物安全柜中加入羊粪或牛粪样品，用机械震荡器剧烈震荡2-5min，至固体样本充分溶解；用冷冻离心机在12000rpm条件下离心10min；分别用10ml灭菌注射器吸取离心管内的上清液，用0.45μm滤膜过滤2次，分别收集滤液于新的无菌离心管中，即得到样品悬液。

3.从样品悬液中提取RNA：提取方法同实施例一

4.具体的实验数据如下表3所示：

表3

结合上表可知，本发明的对动物粪便进行预处理的方法、以及从所制得的样品悬液中提取RNA的方法也适用于牛粪、羊粪等其他动物粪便。此外，另有实验表明本发明的对粪便样品进行预处理的方法也适用于宠物猫狗等其他动物粪便样品的预处理，此处不再赘述。

实施例四：本发明的样品预处理方法可起到减少RNA降解的作用：

按照本发明的方法用新采集到的粪便样品和灭菌PBS缓冲液配制样品悬液：

1.用Qubit法检测样品悬液中核酸浓度为27.8ng/μL，储存于-20℃冰箱，2个月后用Qubit法再次检测，样品悬液的核酸浓度为18.6ng/μL。

2.从样品悬液中提取得到的RNA，经Qubit法检测，RNA浓度为22ng/μL，储存于-20℃冰箱，2个月后再次用Qubit法检测，未检测到RNA。

具体实验结果见下表4：

表4

其中，表4中的RNA的浓度是通过对不同猪粪样品进行预处理得到样品悬液后采用本发明的方法从样品悬液中提取得到的RNA的浓度。

从上述实验可知，本发明的样品悬液可起到显著减少RNA降解的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种对粪便样品进行预处理的方法，其特征在于，包括如下步骤：向粪便样品中加入灭菌PBS缓冲液，所述粪便样品与PBS缓冲液的用量之比为(5-7)：(3-5)，所述粪便样品以g计，所述PBS缓冲液以ml计，经机械震荡、离心和过滤得到样品悬液。

2.根据权利要求1所述的对粪便样品进行预处理的方法，其特征在于，所述粪便样品通过用取样勺挑开新鲜粪便表面，插入粪便内部挑取得到或取自-80℃环境中的冻存粪便样品。

3.根据权利要求2所述的对粪便样品进行预处理的方法，其特征在于，还包括对粪便样品进行储存的步骤：从新鲜样品内部挑取得到粪便样品后将粪便样品暂存于-20℃以下的环境中或储存于-80℃环境中。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的对粪便样品进行预处理的方法，其特征在于，所述样品悬液的制备包括如下步骤，向离心管中加入PBS灭菌缓冲液，将粪便样品加入所述离心管，用机械震荡器震荡至固体样本充分溶解；用冷冻离心机在12000rpm条件下离心10min；吸取所述离心管内的上清液，用0.45μm滤膜过滤2次，收集滤液，即得所述样品悬液。

5.根据权利要求4所述的对粪便样品进行预处理的方法，其特征在于，所述样品悬液冻存于-20℃以下的环境中。

6.根据权利要求4所述的对粪便样品进行预处理的方法，其特征在于，所述粪便样品为猪粪样品、羊粪样品或牛粪样品。

7.根据权利要求4所述的对粪便样品进行预处理的方法，其特征在于，所述粪便样品为猪粪混合样品，所述猪粪混合样品取自同一养殖地的产房、保育舍、母猪舍、育肥舍和公猪舍，按照质量比1:1:1:1:1混合。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的对粪便样品进行预处理的方法在从粪便样品中提取核酸方面的应用。

9.根据权利要求1-7任意一项所述的对粪便样品进行预处理的方法在从粪便样品中提取RNA方面的应用，其中所述RNA的提取方法为天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒法。