CN110016524A - 用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物、方法及试剂盒 - Google Patents
用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物、方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110016524A CN110016524A CN201910454967.XA CN201910454967A CN110016524A CN 110016524 A CN110016524 A CN 110016524A CN 201910454967 A CN201910454967 A CN 201910454967A CN 110016524 A CN110016524 A CN 110016524A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sleeve type
- type pcr
- porcine teschovirus
- primer
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000249107 Teschovirus A Species 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 50
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 11
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 11
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 claims description 7
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 claims description 7
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 claims description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 3
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 claims description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 241001062009 Indigofera Species 0.000 claims 1
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 claims 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 13
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 55
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 18
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 14
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 244000283207 Indigofera tinctoria Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 1
- 241000723848 Tobamovirus Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 208000008494 pericarditis Diseases 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Abstract
本发明提供用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒。本发明提供的试剂盒根据猪捷申病毒的高度保守的特异性序列设计多组套式PCR引物,并通过引物筛选以及反应体系优化,研制出一种检测灵敏性高、特异性好的套式PCR检测试剂盒。本发明提供的检测试剂盒只需要一台普通PCR仪,即可获得与实时荧光定量PCR相当的检测灵敏性,不仅可监测捷申病毒的微量潜伏感染,实现对猪捷申病的早期预警,同时检测成本低,对检测仪器设备与人员操作水平要求较低,利于在养殖生产一线得到应用和推广。
Description
技术领域
本发明属于动物疫病检测技术领域,具体涉及用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒。
背景技术
猪捷申病(Porcine teschen disease,PTD)是由小RNA病毒科捷申病毒属的猪捷申病毒(Porcine tescho virus,PTV)引起的以猪脑脊髓灰质炎、母猪繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎、心肌炎、皮肤损伤及无症状等为主要表现的一种病毒性传染病。该病于1929年首次发现于捷克斯洛伐克的捷申地区,所以又称“捷申病”,各年龄阶段的猪均易感,并具有很高的病死率(90%以上)。猪捷申病主要流行于欧洲,随后流传至北美、非洲、澳大利亚和日本等国。2003年,我国哈尔滨兽医研究所研究人员从内蒙古地区某猪场分离到一株猪捷申病毒,证实我国也有该病毒的存在。目前该病已分布到世界各地,给养猪业带来了巨大损失,已成为世界范围内猪的重要传染病之一,并且该病对我国猪场也存在潜在的影响。
常规的病毒检测技术如病理切片、免疫组化等具有周期长、损伤大、不能一次性确诊等缺点,而聚合酶链式反应(PCR)技术具有快速、灵敏和组织样品需要量小的特点,特别适用于病原监测。而在常规PCR基础上发展起来的套式PCR技术,则具有更高的灵敏性,可大幅提高病原检出率。只需要一台普通PCR仪,即可获得近似实时荧光定量PCR的检测灵敏性。因此,有必要建立对猪捷申病毒套式PCR检测技术,不仅可监测到对捷申病毒的微量潜伏感染,实现对猪捷申病的早期预警,而且对检测仪器设备与人员操作水平要求较低,检测成本也较低,利于在养殖生产一线得到应用和推广。
发明内容
有鉴于此,本发明提供用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒,该试剂盒检测成本低,对检测仪器以及操作人员的水平要求不高,同时具备较高检测灵敏性与特异性,能够精准的鉴别诊断出捷申病毒的微量潜伏感染,从而尽早实施正确的治疗方案,挽回经济损失。
为此,本发明第一方面提供用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物,所述引物根据检测猪捷申病毒的高度保守的特异性序列设计套式PCR引物,其中,检测猪捷申病毒的套式PCR引物中的外引物,由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的反向引物组成;检测猪捷申病毒的套式PCR引物中的内引物,由SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的反向引物组成。
本发明第二方面提供用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法,包括以下步骤:
1)从待检样品中提取核酸模板;
2)将如权利要求1所述的套式PCR引物的外引物加入到套式PCR的第一轮反应体系中扩增检测步骤1)所得核酸模板,得第一轮PCR扩增产物。
3)将如权利要求1所述的套式PCR引物的内引物以及上述步骤2扩增所得的第一轮PCR扩增产物加入到套式PCR的第二轮反应体系中扩增检测步骤2)所得第一轮PCR扩增产物,得第二轮扩增产物;
4)第二轮扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,获得检测结果。
在本发明一实施例中,所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第一轮反应体系总体积为25μl,包括:20μM的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列各0.375μl,PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl,2×1Step Buffer(Dye Plus)12.5μl,Template RNA3μl,RNase Free dH2O 7.375μl。
在本发明一实施例中,所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第一轮反应条件包括:50℃,30min;94℃预变性5min后进入循环;94℃变性30sec,57℃退火30sec,72℃延伸30sec,35个循环;最后72℃延伸5min。
在本发明一实施例中,所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第二轮反应体系总体积为25μl,包括:20μM的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示核苷酸序列各0.375μl,Ex TaqVersion 2.0plus dye 12.5μl,第一轮PCR扩增产物2μl,ddH2O 9.375μl。
在本发明一实施例中,所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第二轮反应条件包括:94℃预变性5min后进入循环;94℃变性30sec,59℃退火30sec,72℃延伸30sec,35个循环;最后72℃终延伸5min。
本发明第三方面提供用于检测猪捷申病毒的套式PCR试剂盒,包括如本发明第一方面所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物,还包括第一轮反应试剂、第二轮反应试剂。
在本发明一实施例中,所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR试剂盒的第一轮反应试剂包括:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列,PrimeScript 1Step EnzymeMix,2×1Step Buffer(Dye Plus),RNase Free dH2O。
在本发明一实施例中,所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR试剂盒的第一轮反应试剂包括:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示核苷酸序列,Ex TaqVersion 2.0plus dye,ddH2O。
在本发明一实施例中,所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测试剂盒对猪捷申病毒的最低检出量可低至10copies/μl。
在本发明一实施例中,所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR试剂盒可特异性检测鉴定猪捷申病毒,不能检测出猪蓝耳病病毒(PRRSV)、塞内卡谷病毒(SVV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(SFV)中的一种或多种。
本发明第四方面提供如本发明第一方面所述的套式PCR引物、如本发明第二方面所述的套式PCR检测方法或如本发明第三方面所述的套式PCR检测试剂盒在猪捷申病毒检测中的应用,其中,所述检测不以疾病诊断治疗为目的。
本发明的有益效果在于:本发明提供的试剂盒具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点,比常规PCR方法具有更高的灵敏度和特异性,大幅提高病毒微量感染时对猪捷申病毒的检出率,而对设备和人员技能要求较低,因此,适用于对猪捷申病毒微量隐性感染时期的监测和早期预警,利于在养殖企业中得到应用和推广。
附图说明
图1为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式RT-PCR外围引物筛选电泳图,其中,泳道M为DNAMarker DL2000,泳道1~3分别代表第一组外引物PTV-1-F1/R1、第二组外引物PTV-2-F1/R1、第三组外引物PTV-1-F3/R3;
图2为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式RT-PCR内引物筛选电泳图,其中,泳道M为DNAMarker DL1000,泳道1~3分别代表第一组内引物PTV-1-F2/R2、第二组内引物PTV-2-F2/R2、第三组内引物PTV-3-F2/R2;
图3为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式RT-PCR外引物浓度优化电泳图,其中,泳道M为DNAMarker DL1000,泳道1~6分别代表0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μM的扩增电泳图;
图4为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式RT-PCR内引物浓度优化电泳图,其中,泳道M为DNAMarker DL1000,泳道1~6分别代表0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μM的扩增电泳图;
图5为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式RT-PCR外引物温度优化电泳图,其中,泳道M为DNAMarker DL1000,泳道1~5分别代表53℃、55℃、57℃、59℃、61℃的扩增电泳图;
图6为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式RT-PCR内引物温度优化电泳图,其中,泳道M为DNAMarker DL1000,泳道1~5分别代表55℃、57℃、59℃、61℃、63℃的扩增电泳图;
图7为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式RT-PCR的灵敏度检测电泳图,第一轮外引物一步法RT-PCR和第二轮内引物PCR灵敏度结果分析图:其中,泳道Ma为DNAMarkerDL1000、Mb为DNAMarker DL1000;泳道1a/1b、2a/2b、3a/3b、4a/4b、5a/5b、6a/6b、7a/7b、8a/8b、9a/9b、10a/10b分别代表108copies/μL、107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL和阴性对照的反应产物的一步法RT-PCR和套式PCR电泳结果图;
图8为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式RT-PCR的特异性检测电泳图,第一轮外引物一步法RT-PCR和第二轮内引物套式PCR特异性结果分析图:其中泳道Ma、Mb为DNAMarker DL1000;泳道1a/1b、2a/2b、3a/3b、4a/4b、5a/5b、6a/6b、7a/7b分别代表猪蓝耳病病毒(PRRSV)、塞内卡谷病毒(SVV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(SFV)和阴性对照的一步法RT-PCR和套式PCR电泳结果图;
图9为本发明实施例提供的猪捷申病毒的套式RT-PCR的临床样品检测电泳图,其中,泳道M为DNAMarker DL1000、泳道1-20为检测样品。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明,所用试剂及耗材均为市售商品。
本发明实施例中提及的试剂:PrimerScript 1step Enzyme Mix、2×1stepBuffer、RNase Free dH2O、TaKaRaTaq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer(Mg2++plus)均购自TAKARA生物科技有限公司,货号LMP204。
实施例1
1.检测猪捷申病毒的套式PCR引物设计与合成
检测猪捷申病毒的套式PCR引物设计
根据参考比对GenBank中猪捷申病毒PTV基因序列(Accession:GQ914053.2、Accession:KC667562.1、Accession:JQ429405.、Accession:KC667563.1、Accession:JQ664746.1、Accession:MF170941.1、Accession:MF170923.1、Accession:KC667563.1、Accession:KC667562.1),首先利用MegAlign软件进行序列比对,选择位于全基因序列中的保守基因片段5'区域作为引物设计区域,确定该核甘酸序列中的保守片段作为扩增区域,然后再利用引物辅助设计软件primer5根据确定的保守核甘酸序列设计出了三组检测PTV基因的套式RT-PCR引物组:包括正向引物PTV-X-F1、反向引物PTV-X-R1组成的外引物以及正向引物PTV-X-F2、反向引物PTV-X-R2组成的内引物(X为1、2或3,分别代表第一组、第二组、第三组引物组),由北京擎科生物科技有限公司广州分公司合成,具体序列见表1:
表1用于检测猪捷申病毒的套式PCR的特异性引物
2核酸提取
取猪小肠组织及其内容物约45mg,用核酸提取试剂盒提取总RNA作为扩增模板。
3套式PCR扩增
用步骤2所得RNA模板,进行套式PCR扩增,反应条件如下:
第一轮反应总体积25μl体系,其中,PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl,2×1Step Buffer(Dye Plus)12.5μl,上游Primer(20μM)、下游Primer(20μM)各0.5μl,RNA模板3μl,RNase Free dH2O 7.5μl;
第一轮反应条件为:50℃30min;94℃预变性5min;94℃变性30sec;55℃退火30sec;72℃延伸30sec;35cycles,最后72℃延伸5min;
第二轮反应总体积25μl体系,其中,Ex TaqVersion 2.0plus dye 12.5μl,上游Primer(20μM)、下游Primer(20μM)各0.5μl,dd H2O 9.5μl,第一轮PCR扩增产物2μl。
第二轮的反应条件为:94℃预变性5min;然后94℃变性30sec,57℃退火30sec,72℃延伸30sec,35cycles;最后72℃终延伸5min。
4套式PCR扩增产物的鉴定
将套式PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果,同时将套式PCR鉴定阳性的核酸送华大基因有限公司测序,验证套式PCR检测的准确性。
5体系优化
5.1最佳引物筛选
将步骤1设计所得三组套式PCR引物组以及步骤所得RNA模板按步骤3反应条件进行套式PCR扩增,筛选最佳引物,根据扩增的产物量及其特异性等条件,第一轮一步法RT-CR,第一组外引物扩增效果最好,如图1所示,第二轮PCR,第一组内引物扩增效果最好,如图2所示,第一组套式PCR引物组扩增效果最好,后续将以此引物组作为猪捷申病毒的套式PCR检测的优势引物组合开展下一步实验。
5.2引物浓度优化
通过单一变量,改变第一轮、第二轮引物浓度的用量,筛选最优引物浓度,结果显示,第一轮25μL反应体系中当引物的使用终浓度均为0.3μM时,扩增效果最好,目标条带最亮,如图3所示。第二轮25μL反应体系中当引物的使用终浓度均为0.3μM时,扩增效果最好,目标条带最亮,如图4所示。
5.3退火温度的优化
通过改变第一轮、第二轮退火温度,筛选最优退火温度,结果显示,第一轮反应中,当退火温度为57℃,扩增产物条带最清晰,背景没有非特异扩增,如图5所示。第二轮反应中,当退火温度为59℃,扩增产物条带最清晰,背景没有非特异扩增,如图6所示。
6试剂盒性能
6.1灵敏度检测
取1.0×108copies/μl的猪捷申病毒阳性质粒为模板作10倍梯度稀释,得到10-108拷贝/μl的梯度模板,用本发明试剂盒检测,测试本发明试剂盒检测灵敏度,同时利用本发明试剂盒提供的第一轮反应体系作为常规PCR方法对照,结果如图7所示,常规PCR方法对照只能检测到104copies/μl,而本发明的套式PCR试剂盒在DNA模板浓度为10copies/μl时仍有明亮的条带,可见,本发明的套式PCR试剂盒的检测灵敏度是常规PCR方法的1000倍。
6.2特异性检测
利用本发明试剂盒对捷申病毒阳性样品DNA模板进行扩增,凝胶电泳结果获得了明亮的目的条带,而对其他样品如猪蓝耳病病毒、塞内卡谷病毒、猪丁型冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒的DNA模板和无DNA酶水均未出现扩增条带,如图8所示。实验结果表明,本发明试剂盒具有良好的病原特异性。
6.3临床样品检测
运用本发明的套式PCR检测试剂盒对华南地区的部分猪场猪只进行检测,同时以常规PCR检测方法作为对照,结果如图9所示,常规PCR检测方法只能检出1份阳性样品,而本发明的套式PCR检测试剂盒以及荧光定量PCR检测方法均可从20份样品中检测出3份阳性,将阳性扩增的PCR产物送华大基因公司进行测序,测序结果显示6份阳性样品的扩增产物的序列均存在与目标猪捷申病毒(PTV)相同的基因序列。可见,本发明的试剂盒检测能特异检测猪捷申病毒,并且其检测灵敏度比常规PCR高,可对猪捷申病毒进行有效扩增,显示本发明试剂盒在复杂样品检测中仍能保持良好的病原特异性。
综上所述,本发明的套式PCR检测试剂盒具备较高的检测灵敏度以及特异性,同时本发明提供的检测试剂盒对设备和人员技能要求较低,适用于对猪捷申病毒微量隐性感染时期的监测和早期预警,利于在养殖企业中得到应用和推广,可大幅增加猪捷申病毒微量感染情况下的病原检出率,能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因,有利于对症下药实施正确的治疗方案,具有很好的应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacttgwtac gctagttttg gattrt 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caactgacta tacaaagtac agacggc 27
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cattagtcyt yggacttctg ttgtgt 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtcaggcag cacaagtcca gtc 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgattttac cccwgtgmgr ac 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actacaaayg ctgtyayatc actrc 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tacacaaacy tggcatcycc 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcagaatctc cagaaaatga rtc 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcaagggcca aaaggtcaag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tccattgggt ccaagccatc 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cactgtcctg tttgttgcgt g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgggtccaag ccatcaatcc 20
Claims (10)
1.用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物,其特征在于,所述引物根据检测猪捷申病毒的高度保守的特异性序列设计套式PCR引物,其中,检测猪捷申病毒的套式PCR引物中的外引物,由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的反向引物组成;检测猪捷申病毒的套式PCR引物中的内引物,由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的反向引物组成。
2.用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法,包括以下步骤:
1)从待检样品中提取核酸模板;
2)将如权利要求1所述的套式PCR引物的外引物加入到套式PCR的第一轮反应体系中扩增检测步骤1)所得核酸模板,得第一轮PCR扩增产物;
3)将如权利要求1所述的套式PCR引物的内引物以及上述步骤2扩增所得的第一轮PCR扩增产物加入到套式PCR的第二轮反应体系中扩增检测步骤2)所得第一轮PCR扩增产物,得第二轮扩增产物;
4)第二轮扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,获得检测结果。
3.如权利要求2所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法,其特征在于,所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第一轮反应体系总体积为25μl,包括:20μM的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列各0.375μl,PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μl,2×1Step Buffer(DyePlus)12.5μl,Template RNA 3μl,RNase Free dH2O 7.375μl。
4.如权利要求2所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法,其特征在于,所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第一轮反应条件包括:50℃,30min;94℃预变性5min后进入循环;94℃变性30sec,57℃退火30sec,72℃延伸30sec,35个循环;最后72℃延伸5min。
5.如权利要求2所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法,其特征在于,所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第二轮反应体系总体积为25μl,包括:20μM的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示核苷酸序列各0.375μl,Ex Taq Version 2.0 plus dye 12.5μl,第一轮PCR扩增产物2μl,ddH2O 9.375μl。
6.如权利要求2所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法,其特征在于,所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第二轮反应条件包括:94℃预变性5min后进入循环;94℃变性30sec,59℃退火30sec,72℃延伸30sec,35个循环;最后72℃终延伸5min。
7.用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物,还包括第一轮反应试剂、第二轮反应试剂,其中第一轮反应试剂包括:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列,PrimeScript 1 StepEnzyme Mix,2×1 Step Buffer(Dye Plus),RNase Free dH2O;第二轮反应试剂包括:SEQID NO:3、SEQ ID NO:4所示核苷酸序列,Ex Taq Version 2.0 plus dye,ddH2O。
8.如权利要求7所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测试剂盒,其特征在于,所述套式PCR检测试剂盒对猪捷申病毒的最低检出量可低至10copies/μl。
9.如权利要求7所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测试剂盒,其特征在于,所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR试剂盒可特异性检测鉴定猪捷申病毒,不能检测出猪蓝耳病病毒(PRRSV)、塞内卡谷病毒(SVV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(SFV)中的一种或多种。
10.如权利要求1所述的套式PCR引物、如权利要求2所述的套式PCR检测方法、如权利要求7所述的套式PCR检测试剂盒在猪捷申病毒检测中的应用,其中,所述检测不以疾病诊断治疗为目的。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910454967.XA CN110016524A (zh) | 2019-05-29 | 2019-05-29 | 用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物、方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910454967.XA CN110016524A (zh) | 2019-05-29 | 2019-05-29 | 用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物、方法及试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110016524A true CN110016524A (zh) | 2019-07-16 |
Family
ID=67194501
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910454967.XA Pending CN110016524A (zh) | 2019-05-29 | 2019-05-29 | 用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物、方法及试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110016524A (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040058312A1 (en) * | 2002-02-19 | 2004-03-25 | Instituto Nacional De Investigacion Y Tecnologia Agraria Y Alimentaria (Inia) | Method to identify environmental contamination by detecting enteric viruses |
CN103060477A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-04-24 | 上海市动物疫病预防控制中心 | 猪Kobu病毒套式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法 |
CN104561369A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-04-29 | 周建芳 | 一种手足口病肠道病毒巢式pcr检测试剂盒及非诊断性分型方法 |
CN104962663A (zh) * | 2015-08-05 | 2015-10-07 | 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 | 一种猪捷申病毒通用型荧光定量rt-pcr检测方法 |
-
2019
- 2019-05-29 CN CN201910454967.XA patent/CN110016524A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040058312A1 (en) * | 2002-02-19 | 2004-03-25 | Instituto Nacional De Investigacion Y Tecnologia Agraria Y Alimentaria (Inia) | Method to identify environmental contamination by detecting enteric viruses |
CN103060477A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-04-24 | 上海市动物疫病预防控制中心 | 猪Kobu病毒套式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法 |
CN104561369A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-04-29 | 周建芳 | 一种手足口病肠道病毒巢式pcr检测试剂盒及非诊断性分型方法 |
CN104962663A (zh) * | 2015-08-05 | 2015-10-07 | 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 | 一种猪捷申病毒通用型荧光定量rt-pcr检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
PRODELALOVA 等: "Genotyping of porcine teschoviruses isolated from 1960 to 1980 in the former Czechoslovakia and new Porcine teschovirus isolates obtained from piglets with diarrhoea", 《VETERINARNI MEDICINA》 * |
庄金秋等: "猪捷申病毒检测方法研究进展", 《动物医学进展》 * |
王建峰 等: "猪捷申病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用" * |
赵国洪等: "云南猪群中猪捷申病毒感染分子生物学诊断", 《养猪》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106947838B (zh) | 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
CN107513584B (zh) | 一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒 | |
Orru et al. | Rapid detection and quantitation of Bluetongue virus (BTV) using a Molecular Beacon fluorescent probe assay | |
CN107475459A (zh) | 同时鉴别美洲型prrsv经典毒株、变异毒株及新型病毒类nadc30毒株的检测方法 | |
CN110656187B (zh) | 多重raa以及多重pcr检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒及检测方法 | |
CN109781981A (zh) | 检测非洲猪瘟病毒的分子探针、试剂盒及其应用 | |
CN112094953A (zh) | 用于同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的试剂盒及引物和探针 | |
CN105400910B (zh) | 猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法 | |
CN105603123A (zh) | 快速检测猪细小病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用途 | |
CN105886667A (zh) | 猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒及其检测方法 | |
CN105463132A (zh) | 犬细小病毒的遗传标记物及其特异性引物和探针 | |
CN106435031A (zh) | 一种特异检测ⅰ群禽腺病毒pcr检测试剂盒及其检测方法 | |
CN106435032B (zh) | 一种用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的二重rt-pcr引物、试剂盒和方法 | |
CN110257561B (zh) | 用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用 | |
CN105296669A (zh) | 传染性造血器官坏死病毒(ihnv)的rt-lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
CN108624713A (zh) | 一种猪伪狂犬病疫苗毒与野毒鉴别检测的方法及试剂盒 | |
CN104831000A (zh) | 用于樱桃病毒检测的多重rt-pcr试剂盒及检测方法 | |
CN108034765A (zh) | 快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的引物和探针、方法 | |
CN107513583A (zh) | 检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量pcr引物及试剂盒 | |
CN107190103A (zh) | 同时检测三种鱼类病毒的多重pcr引物组、试剂盒及方法 | |
CN110438264A (zh) | 利用二重实时荧光定量rt-pcr检测猪流行性腹泻病毒和b型猪肠道病毒的方法 | |
Zhang et al. | Rapid detection of pigeon Megrivirus using TaqMan real-time PCR technology | |
CN110305986A (zh) | Sva、o型fmdv和a型fmdv的一步法三重实时荧光定量pcr检测引物和探针 | |
CN112941240B (zh) | 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法 | |
CN108950080A (zh) | 一种基于双重荧光pcr法联合检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的引物探针组及试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190716 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |