CN102146453A - 超级细菌ndm-1基因荧光定量pcr检测方法及其试剂盒 - Google Patents
超级细菌ndm-1基因荧光定量pcr检测方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种超级细菌NDM-1基因的荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所用引物和TaqMan探针是根据超级细菌NDM-1基因的保守区域设计的，用以定量检测待测样品中超级细菌的核酸拷贝数。上游引物具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列。本发明能快速、准确地检测出超级细菌NDM-1基因，对保障人类健康具有重要意义。本发明对于控制超级细菌传播和人民用药安全意义重大。本发明的检测方法及试剂盒可用于可疑超级细菌病患者多种样本、环境样本中NDM-1基因的检测，辅助临床超级细菌感染的诊断和治疗，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法，特别是涉及超级细菌NDM-1基因的荧光定量PCR检测方法及试剂盒。
背景技术
超级细菌是一个泛指的概念，是指能够耐多重抗生素的细菌，过去认为的超级细菌是指耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌和耐万古霉素的肠球菌。最近报道的被媒体称之为超级细菌的，是指含有NDM-1基因的泛耐药细菌(Kamarasamy K，Toleman MA，Walsh TR，et al.Emergence of a new antibiotic resistance in India，Pakistan，and the UK：a prospective survey.Lancet Infect Di s，2010，10：597-602)。2010年8月，Lancet.Inf.Dis杂志报道，在印度、巴基斯坦和英国发现一些泛耐药的革兰氏阴性细菌，这些细菌由于含有NDM-1基因(新德里β内酰胺酶1，New Delhi metallo-β-lactamase 1)，而对多种抗生素耐药，被称之为“超级细菌”。目前全球已有170多人感染了这种超级细菌，并已蔓延至美国、加拿大、澳大利亚、比利时、荷兰和日本等国。目前研究发现带有NDM-1基因的超级细菌主要在住院病人中引起感染，特别是免疫力低下、正常菌群失调的病人中容易引起感染，感染部位通常为血液、尿道、肺部和伤口等。
含有NDM-1基因的超级细菌对人类健康的危害目前还不可估计，但是，监测和检测含有该基因的细菌，并为临床药物治疗提供依据，对于进一步规范合理用药，预防抗生素的滥用和耐药性的产生及广泛传播具有重要意义。由于超级细菌出现不久，迄今我国仅有3例超级细菌阳性病例的报道，所以目前还没有统一的检测方法及商品化的试剂盒。
发明内容
本发明首先提供了用于对超级细菌NDM-1基因进行荧光定量PCR检测的方法。
本发明所提供的荧光定量PCR检测方法，是利用根据超级细菌NDM-1基因的保守区域设计的引物和TaqMan探针进行的实时荧光定量PCR检测，其中，所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团(R)，3’端标记有淬灭荧光基团(Q)。所述报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1。
检测中，25μL荧光定量PCR反应体系可包括：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物2.5μL(5pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。
荧光定量PCR反应条件可为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
所述检测方法还包括标准曲线的建立，方法为：用含有目的片段的质粒作为标准品，将其10倍系列稀释成I：1.0×1010拷贝/μL；II：1.0×109拷贝/μL；III：1.0×108拷贝/μL；IV：1.0×107拷贝/μL；V：1.0×106拷贝/μL；VI：1.0×105拷贝/μL；VII：1.0×104拷贝/μL；VIII：1.0×103拷贝/μL；IX：1.0×102拷贝/μL；X：1.0×101拷贝/μL；XI：1.0×100拷贝/μL。将质粒作为模板进行荧光定量PCR检测，得到用于超级细菌NDM-1基因检测的标准曲线。
所述标准曲线的25μL荧光定量PCR反应体系与上述相同；荧光定量PCR反应条件与上述相同。
本发明的另一目的是提供一种用于对超级细菌NDM-1基因进行荧光定量PCR检测的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对超级细菌NDM-1基因进行荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。
其中一种简装试剂盒，包括各自独立包装的超级细菌反应液1ml/管和Taq聚合酶(5U，每个反应0.6μL)30μl/管两个试剂管。
所述超级细菌反应液为dNTPs、MgCl2、PCR引物和荧光探针的混合液，由12.5重量份的2×buffer、1.5重量份上游引物、2.5重量份下游引物、1.0重量份TaqMan探针和1.9重量份的DEPC水混合而成；其中2×buffer用含MgCl215mM的Takara公司的10×buffer 4μL、dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成。
另一种多管试剂盒，除了上述两个试剂管，还包括各自独立包装的强阳性对照品(10-5稀释度的质粒pBlue-NDM-1)、临界阳性对照品(10-8稀释度的质粒pBlue-NDM-1)、DNA提取液(配方为：0.5％NP40，溶剂为TE缓冲液)及阴性对照品(无菌水)试剂管。
本发明提供了一种超级细菌NDM-1基因的荧光定量PCR检测方法，公开了其专用引物和TaqMan探针并提供了专用检测试剂盒。本发明是以待检样品中超级细菌的NDM-1基因为检测对象，准确度及精密度均较好。本发明具有以下优点：
1、首次建立了超级细菌NDM-1基因探针法荧光定量PCR检测方法，利用此检测方法可以对待测样本中的超级细菌NDM-1基因进行检测。
2、本检测方法与超级细菌的其它常规检测方法如细菌的分离培养鉴定、全菌ELISA法和嵌套式PCR相比，灵敏度和特异性极高，检测效率得到了很大的提高，并且有效的防止了污染。
3、本检测方法与超级细菌的其它常规检测方法，如细菌的分离培养鉴定、全菌ELISA法和嵌套式PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，并可进一步制成检测试剂盒，操作程序化，适合大面积推广和应用。
4、本检测方法不仅能够评价人的超级细菌感染状况，同时也为超级细菌的流行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。
综上所述，本发明能快速、准确地检测出超级细菌，对保障人类健康、控制超级细菌传播和人民用药安全意义重大。本发明的检测方法及试剂盒可用于多种临床样本(痰液、尿液、血液、鼻咽抽吸物、拭子)中泛耐药细菌NDM-1基因的核酸检测，辅助诊断细菌中是否含有NDM-1耐药基因，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为10倍系列稀释pBlue-NDM-1质粒标准品的荧光定量PCR扩增曲线
图2为超级细菌NDM-1基因的荧光定量PCR检测的标准曲线
图3为超级细菌NDM-1基因荧光定量PCR检测的检测应用结果
图4为超级细菌NDM-1基因荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏度检测结果
图5为超级细菌NDM-1基因荧光定量PCR检测试剂盒的特异性检测结果
具体实施方式
下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。所用引物及TaqMan探针由宝生物工程(大连)有限公司合成，所有序列测定工作均由宝生物工程(大连)有限公司完成。
下述实施例中所用细菌如表1所示：
表1实施例中所用细菌一览表
为避免出现超级细菌扩散，所有涉及的提取过程和前期特异性研究分析试验均在中国人民解放军疾病预防控制所进行。企业质控品使用的质粒，均由中国人民解放军疾病预防控制所制备稀释后提供给北京金豪制药股份有限公司使用。
实施例1、用于对超级细菌NDM-1基因进行荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针的设计及筛选
参照GenBank收录的NDM-1基因全序列(GeneBank：FN396876)，选择NDM-1基因的保守区域，采用ABI Primer Express 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成TaqMan探针及引物。引物和探针设计中允许同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选：①探针长度(L)在19-28bp之间；②Tm值在58-60℃之间；③GC％在25-75％之间；④polyN≤4bp；⑤Hairpin≤4bp；⑥覆盖率＞90％；⑦扩增产物长度控制在50-150bp之间；⑧引物Tm值比探针Tm值低10℃左右；⑨进行BLAST筛选，特异性分数＞L×0.4。最佳Tm值设定在60℃，最佳探针长度为20-25bp。探针的荧光标记选择FAM(5’端)作为报告发光基团，BHQ1(3’端)为淬灭基团。引物/探针的筛选原则为：在目的保守区中选择PCR扩增效率和探针结合效率较高的引物和探针作为候选引物和探针。具体筛选方法如下：
在引物、探针的两次筛选过程中均需选择在目的保守区中PCR扩增效率和探针结合效率较高的引物和探针(所用PCR引物和荧光探针由大连宝生物公司合成，引物要求PAGE纯化，探针要求HPLC纯化。到货时为引物或探针干粉，用无菌水复溶后，对干粉进行含量测定，探针至50pmol/μl，引物至100pmol/μl贮存液后备用。)。针对超级细菌的NDM-1基因，共设计了2组上下游引物及荧光探针，序列如下：
DM-1
上游引物(NDM-1’)：5’-GATCCTCAACTGGATCAAG-3’；
下游引物(NDM-2’)：5’-TTGGCATAAGTCGCAATC-3’。
TaqMan探针：5’FAM-CCATACCGCCCATCTTGTCC-BHQ1 3’。
DM-2
上游引物(NDM-1)：5’-AGCACACTTCCTATCTCGACATG-3’(序列表中SEQ ID NO：1)；
下游引物(NDM-2)：5’-GGTTGATCTCCTGCTTGATCCAG-3’(序列表中SEQ ID NO：2)。
TaqMan探针：5’FAM-CGCTTCCAACGGTTTGATCGTCAGG-BHQ 13’(序列表中SEQ ID NO：3)。
使用金豪公司配制的DNA提取液，配方为：体积浓度0.5％的NP40(壬基酚聚氧乙烯醚)，溶剂为TE缓冲液，分别对NDM-1阳性菌株以及其它特异性细菌(见表1)进行细菌基因组提取(得到NDM-1基因，经测序，与GeneBank：FN396876收录的NDM-1基因全序列相同)，同时将核酸进行梯度稀释到10-8作为第二次引物、探针筛选用模板，模板分装后于-70℃保存。PCR筛选体系为：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物2.5μL(5pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR筛选条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。根据Ct值最小和荧光信号增幅最大原则进行筛选。初步筛选显示两个组合的特异性都很高，而DM-2组合检测灵敏度和荧光信号增幅较高。因此，选择DM-2作为超级细菌DNA实时荧光定量PCR检测的引物、探针组合。
表2引物、探针组合的第二次筛选结果
实施例2、超级细菌NDM-1基因荧光定量PCR反应体系及反应条件的建立
将超级细菌提取的DNA(实施例1中扩增得到)，用无菌水以10倍梯度稀释，作为荧光定量PCR反应体系优化用模板。取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释度，编号依次对应为L1、L2、L3、L4、L5、L6。分装后于-70℃保存备用。
一、荧光定量PCR缓冲液的选择
为比较不同厂家荧光定量PCR反应缓冲液性能差异，使用相同DNA模板，选取进口Takara试剂和国产Tiangen公司试剂进行平行对比。PCR反应体系为：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物2.5μL(5pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，进口实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，并以国产实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(购自Tiangen公司)作为比较，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。实验结果显示使用进口荧光PCR反应液使荧光PCR系统Ct值略优于国产试剂(表3)，因此选用进口Takara荧光PCR反应缓冲液作为本发明实时荧光定量PCR反应缓冲液。
表3不同厂家实时荧光定量PCR缓冲液的比较结果
二、荧光定量PCR引物及荧光探针用量的优化
1、荧光定量PCR引物及荧光探针用量的第一次优化
探针量主要决定了背景荧光的高低，为了保证体系的灵敏，一般探针用量控制在背景荧光在15F到25F之间(以rotor gene3000仪器检测为准)，对几组探针不同用量的本底荧光进行检测，PCR反应体系为：TaqMan探针用量按表4(5pmol/μL)，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃ 1min，1个循环；55℃20sec，共10个循环，并收集荧光信号检测。探针量在终浓度为1.0μl×5pmole/μl和0.8μl×5pmole/μl的时候荧光本底控制的都比较好(表4)，考虑到后续试验尽量保证探针量足够，所以探针用量选择为1.0μl×5pmole/μl。
表4不同荧光探针用量的筛选
用稀释好的L1(10-4)和L2(10-5)超级细菌DNA作为引物量优化的模板，分别对引物的上下游的用量在5-12.5pmol范围内进行梯度稀释优化，PCR反应体系为：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上下游引物量见表5，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。结果如表5所示，从结果可以分析出，PCR引物在5.0-12.5pmol/反应时均可以正常工作，其中引物组合(1.0μl×5pmole/μl、2.0μl×5pmole/μl)、(1.0μl×5pmole/μl、2.5μl×5pmole/μl)、(1.5μl×5pmole/μl、2.0μl×5pmole/μl)、(1.5μl×5pmole/μl、1.5μl×5pmole/μl)、(2.0μl×5pmole/μl、2.5μl×5pmole/μl)、(2.5μl×5pmole/μl、1.5μl×5pmole/μl)反应效率最高，将上游引物量1.5-2.0μl×5pmole/μl、下游引物量2.0-2.5μl×5pmole/μl作为引物用量进行第二次筛选。
表5引物用量的第一次优化结果
注：表格中记录值均为Ct值
2、荧光定量PCR引物用量的第二次优化
为测试不同引物用量组合对于试剂灵敏度的影响，选用浓度更低的DNA模板进行测试。使用超级细菌提取的DNA(实施例1中扩增得到)进行梯度稀释取L3(10-6)、L4(10-7)、L5(10-8)作为第二次引物量优化的模板，对各组引物在第一次优化基础上进一步进行优化。PCR反应体系为：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上下游引物量见表6，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。结果如表6所示，结合图谱分析，本次优化上游引物在7.5pmol，下游引物在12.5pmol时检测结果较好，选择此浓度为本发明实时荧光定量PCR引物的使用浓度。
表6实时荧光定量PCR引物用量的第二次优化结果
以上优化结果表明，本发明超级细菌DNA实时荧光定量PCR检测试剂的基本组成和各组分含量基本如表7所示。
表7超级细菌DNA实时荧光定量PCR检测试剂的基本组成和各组分含量
| 组份 | 规格 | 用量 |
| 实时荧光定量PCR反应缓冲液 | 2× | 12.5μl |
| Taq DNA聚合酶 | 5U | 0.6μl(厂家推荐量) |
| 引物用量 | 5pmol/μl | 上游1.5μl，下游2.5μl |
| 探针用量 | 5pmol/μl | 1.0μl |
| 无菌水 | 补齐至25μl |
三、超级细菌NDM-1基因荧光定量PCR反应体积和模板用量的选择
考虑到不同荧光PCR仪器之间的通用性能，本发明选择25μl反应体系，已在lightcycle、rotorgene3000、ABI、Bio-Rad系列等仪器上经过测试。
DNA模板上样量的选择：防止上样量太少容易导致漏检，太多容易对反应体系造成破坏，本品的上样量规定为5μl/反应。
四、超级细菌NDM-1基因实时荧光定量PCR反应条件的选择
考虑到北京金豪制药股份有限公司DNA系列检测试剂盒反应条件，所以在超级细菌NDM-1基因检测试剂盒反应条件选择上首先选择了一致的反应条件，考虑到DNA检测试剂盒在反应时易出现假阳性，因此将退火温度提高了5℃，并进行一些实验验证退火温度提高5℃对整个反应效率无影响，最后确定选用(表8)的反应条件最合适，这样也正好把本发明实时荧光定量PCR反应及其试剂盒的反应条件和公司其它检测试剂盒的反应条件做成一致。表8条件为本发明优选，但显然也为非限制性的，技术人员还可以按照常规方法选择实时荧光定量PCR反应条件。
表8超级细菌DNA实时荧光定量PCR检测的反应条件
实施例3、超级细菌NDM-1基因荧光定量PCR检测
一、标准曲线的建立
1、构建pBlue-NDM-1重组质粒
由上海生工公司合成NDM-1序列，并克隆至pBluescript II SK(+)(购自Takara公司)载体多克隆位点的HindIII和BamHI酶切位点之间，得到重组载体pBlue-NDM-1。
2、标准品检测
将pBlue-NDM-1质粒DNA作为模板进行超级细菌探针法荧光定量PCR检测，建立标准曲线。具体操作如下：将质粒DNA进行10倍系列稀释成I：1.0×1010拷贝/μL；II：1.0×109拷贝/μL；III：1.0×108拷贝/μL；IV：1.0×107拷贝/μL；V：1.0×106拷贝/μL；VI：1.0×105拷贝/μL；VII：1.0×104拷贝/μL；VIII：1.0×103拷贝/μL；IX：1.0×102拷贝/μL；X：1.0×101拷贝/μL；XI：1.0×100拷贝/μL。每个稀释度重复平行试验3次。
标准品检测反应体系为25μl，依次加入下列成分：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物2.5μL(5pmol/μL)，质粒DNA 5μL(7×101至7×10-9mg/mL)，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。
检测反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
标准品探针法实时荧光定量PCR扩增曲线如图1所示(图1，横坐标为Ct值，纵坐标为荧光值，1：1.0×108拷贝/μL；2：1.0×107拷贝/μL；3∶1.0×106拷贝/μL；4：1.0×105拷贝/μL；5：1.0×104拷贝/μL；6：1.0×103拷贝/μL；7：1.0×102拷贝/μL；8：1.0×101拷贝/μL；9：1.0×100拷贝/μL；)
3、标准曲线的绘制
根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值绘制标准曲线(图2，横坐标为拷贝数的对数，纵坐标为Ct值)，由图2可知，实时荧光定量PCR检测超级细菌的线性范围是5×108～5×100拷贝/反应体系，标准曲线的相关系数R平方值为0.9963(y＝-3.1372x+38.201)，荧光定量PCR反应的扩增效率为102.5％。标准曲线显示：本发明建立的超级细菌NDM-1基因探针法实时荧光定量PCR检测方法有9个数量级的线性检测范围，进一步说明该检测方法的具有非常高的灵敏度。
二、超级细菌探针法荧光定量PCR检测20份临床样本
将1份确诊的超级细菌感染性病人痰液标本DNA及19份耐碳青霉烯类抗生素的细菌感染患者痰液样本DNA作为模板进行超级细菌NDM-1基因探针法荧光定量PCR检测。每份样本重复平行试验3次。
注：由于超级细菌感染在临床上常见于耐碳青霉烯类抗生素的细菌感染患者之中，所以选取的临床样本为耐碳青霉烯类抗生素的细菌感染患者样本。
临床样本检测体系为25μL，依次加入下列成分：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物2.5μL(5pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。
检测反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
结果如图3所示(横坐标为Ct值，纵坐标为荧光值)，结果显示：以确诊的超级细菌感染性病人痰液标本DNA为模板时出现了目的荧光扩增曲线，以其余19份样本的DNA为模板时，均无扩增曲线。
实施例4、超级细菌NDM-1基因荧光定量PCR检测试剂盒
本发明超级细菌NDM-1基因荧光定量PCR检测试剂盒包括各自独立包装的超级细菌反应液1ml/管和Taq聚合酶(5U，每个反应0.6μL)30μl/管，两试剂管再共同组装在一外包装盒中。
其中，超级细菌反应液为含有dNTPs、MgCl2、PCR引物和荧光探针的混合液，由12.5uL的2×buffer(用购自Takara公司的10×buffer(含MgCl215mM)4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)、实施例1确定的DM-2组合中1.5uL上游引物、2.5uL下游引物、1.0uL探针和1.9ul的DEPC水按比例混合，配制时将每一组分乘以一个系数(如10000，根据生产量定)，混匀后，分装，每支1mL。
为方便检测，所述试剂盒还可以包括另外各自独立包装的强阳性对照品(10-5稀释度的质粒pBlue-NDM-1)、临界阳性对照品(10-8稀释度的质粒pBlue-NDM-1)、DNA提取液(配方为：体积浓度0.5％的壬基酚聚氧乙烯醚NP40，溶剂为TE缓冲液)及阴性对照品(无菌水)，并与超级细菌反应液和Taq聚合酶试剂管共同组装在外包装盒中。
将人工构建超级细菌DNA质粒pBlue-NDM-1利用TE缓冲液进行10倍梯度稀释，进行PCR扩增，PCR反应体系：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物2.5μL(5pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。结果(表9-10)表明，经过5次重复测定结果比较稳定，确定为本发明试剂盒的阳性对照。
表9阳性对照的测试结果
| 重复 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Ct值 | 22.41 | 22.99 | 22.13 | 23.01 | 22.42 |
表10临界阳性对照的测试结果
| 重复 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Ct值 | 30.73 | 30.61 | 30.67 | 30.8 | 30.63 |
用试剂盒的反应液对无菌水进行10复管测定，结果如表11所示，每管均为阴性，所以本发明试剂盒的阴性对照选择无菌水。
表11阴性对照品测试结果
| 重复 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Ct值 | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct |
实施例5、超级细菌NDM-1基因定量PCR检测试剂盒的性能评估
为对本发明试剂盒的性能进行评估，按照产品优化后的工艺多次配制出产品小样对试剂盒的灵敏度、特异性、精确度、以及稳定性，以及用试生产的产品进行临床试验，以考查产品的性能。
1、试剂盒检测的线性范围和灵敏度测试
将超级细菌NDM-1基因人工构建质粒pBlue-NDM-1用DEPC水稀释液进行10倍系列梯度稀释至10-9，即灵敏度质控品(取L1(10-4稀释度)、L2(10-5稀释度)、L3(10-6稀释度)、L4(10-7稀释度)、L5(10-8稀释度)、L6(10-9稀释度)作为评价试剂盒灵敏度的质控品，编号L1-L6。分装后于-70℃保存备用。)，使用本发明试剂盒进行检测。PCR反应体系：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物2.5μL(5pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。结果(表12和图4，横坐标为Ct值，纵坐标为荧光值，1为L1，2为L2，3为L3，4为L4，5为L5)显示，10-9稀释度(L6)样本不能检出，在10-8稀释度(L5)时候试剂盒多数情况下均可检出，所以本发明试剂盒最低可检出含10-8稀释度的超级细菌人工构建质粒，具有较高的灵敏度。
对不同批次的产品小样进行灵敏度及线性分析，结果显示引物均可稳定测出10-8稀释度的超级细菌DNA样品，对于10-9稀释度样品，本发明试剂盒不能检出。故设10-8稀释度为最低检出值。
表12本发明试剂盒线性范围的测试结果
| 稀释梯度 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Ct值 | 19.36 | 22.34 | 25.99 | 29.30 | 32.56 | No ct |
2、试剂盒检测的特异性分析
采用不同批次的产品小样对10支特异性质控品(收集大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎军团菌、布鲁氏菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌、鲍曼不动杆菌、霍乱弧菌、李斯特菌的DNA，作为特异性质控品(N1-N10)，按200μl/管分装冷冻保存。)进行检测。PCR反应体系：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物2.5μL(5pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。结果(表13和图5，横坐标为Ct值，纵坐标为荧光值)N1-N10均未检出Ct值，证明本发明的试剂盒具有良好的特异性。
表13本发明试剂盒特异性的测试结果
| 样品 | N1 | N2 | N3 | N4 | N5 | N6 | N7 | N8 | N9 | N10 |
| Ct值 | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct |
3、试剂盒检测范围
试剂盒可检测多种临床样本(痰液、尿液、血液、鼻咽抽吸物、拭子)中泛耐药细菌NDM-1基因，诊断细菌中是否含有NDM-1耐药基因。
4、试剂盒批内检测的精密性
使用精密性质控品(将人工构建的含超级细菌NDM-1基因的质粒pBlue-NDM-1稀释至1.0×10-5作为精密性质控品(J)用于对超级细菌DNA检测试剂盒的质量控制。对反应体系分别进行10次重复检测，PCR反应体系：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物2.5μL(5pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。10个精密度质控品Ct值的CV％＜10％(表14)，证明本发明的试剂盒具有良好的精密性。
表14本发明试剂盒的精密度测试结果
| 样本 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | CV％ |
| Ct值 | 22.01 | 22.00 | 22.17 | 22.04 | 22.11 | 22.09 | 22.10 | 22.28 | 22.91 | 22.65 | 1.4 |
5、试剂盒的准确性测定
采用测序方法进行确认本发明试剂盒的准确性。对扩增产物进行测序，序列与预期结果完全一致，证明本发明试剂盒的检测结果是准确的。
6、试剂盒的稳定性测定
(1)试剂盒的稳定性
产品的稳定性取决于各个组成成份的稳定性。本发明中配制超级细菌实时荧光定量PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阳性对照品在实验室使用中，在-20℃保存，取出后一直保存至4℃冰箱，最长保存一周仍未见性能下降。
在为临床试验准备的产品运输中，全套产品(包括超级细菌实时荧光定量PCR反应液、Taq DNA聚合酶、试剂盒对照品)，在先后经历为期3天的-20℃冷冻、4℃长途运输、-20℃冷冻、复融等一系列往返过程，使用质控品检测，检测结果未见有显著差异。表明本发明试剂盒的各个组份相当稳定。
(2)对照品的稳定性
对照品的稳定性对试验结果的分析判断有很大影响，本试剂盒的对照品主要为了是对反应体系进行质量控制。本试剂盒使用了一份强阳性对照、一份临界阳性和一份阴性对照，对其进行冻融检测。实验结果如表15所示，结果表明本发明试剂盒中的对照品也具有良好的稳定性。
表15阳性对照品的冻融试验结果
7、产品使用仪器的评估
不同荧光PCR仪对试剂检测的影响主要集中在两个方面，即PCR热循环条件的差异和反应体系的差异。
本发明所采用的PCR反应条件为一个相对标准化和开放的工作条件，对于各种荧光PCR仪使用该条件均可以保证仪器正常完成PCR扩增循环和荧光信号收集过程，在各种型号的荧光PCR仪上(ABI7500、RG3000、MX3000P，BIO-Rad IQTM5等)进行试验，结果未发现差异。另外对于罗氏Lightcycler系列产品，在实际观察时发现由于其升温速度较快常导致暂时实际温度高于设置温度，为避免Taq DNA聚合酶活性下降，因此在使用该系列产品时其变性温度由95℃调整为93℃，其余条件不变。
为实现试剂在不同荧光PCR分析仪器上的通用性，配制的25μl体积的反应液装入Lightcycler系列、RG3000、ABI7500、MX3000P、Bio-Rad IQTM5等全自动荧光PCR扩增仪上的PCR光学管中均可保持适当的液体高度，满足收集荧光信号的要求。
本发明的研制和生产过程质检均在RG3000全自动荧光PCR仪上进行，此外，还使用成品试剂盒对在其它仪器如LightCycler、MX3000P、ABI7500等荧光PCR仪上的使用情况进行测试(表16-表23)，通过使用相同的样本进行测试，结果显示这几种仪器均可以通过灵敏度质控品测试(L1-L4检测阳性)及精密度测试(CV＜10％)。
使用成品试剂盒和阳性质控品在LightCycler荧光PCR仪上进行精密性和灵敏性检测的结果如下：
表16使用LightCycler检测试剂盒灵敏度
| 稀释梯度 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Ct值 | 19.85 | 22.95 | 26.46 | 29.63 | 32.19 | ＞35 |
表17使用LightCycler检测试剂盒精密度
| 样本 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | CV％ |
| Ct值 | 21.82 | 22.23 | 22.28 | 22.33 | 22.22 | 22.33 | 22.20 | 22.18 | 22.52 | 22.07 | 0.83 |
使用成品试剂盒和企业质控品在MX3000P荧光PCR仪上进行精密性和灵敏性检测的结果如下：
表18使用MX3000P检测试剂盒灵敏度
| 稀释梯度 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Ct值 | 20.14 | 23.78 | 26.54 | 30.02 | 33.36 | No Ct |
表19使用MX3000P检测试剂盒精密度
| 样本 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | CV％ |
| Ct值 | 23.94 | 23 | 22.63 | 22.5 | 22.61 | 23 | 22.79 | 22.41 | 22.69 | 22.31 | 2.04 |
使用成品试剂盒和企业质控品在RotorGene3000荧光PCR仪上进行精密性和灵敏性检测的结果如下：
表20使用RotorGene3000检测试剂盒灵敏度
| 稀释梯度 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Ct值 | 18.94 | 22.19 | 26.15 | 29.05 | 32.15 | No Ct |
表21使用RotorGene3000检测试剂盒精密度
| 样本 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | CV％ |
| Ct值 | 22.01 | 22.00 | 22.17 | 22.04 | 22.11 | 22.09 | 22.10 | 22.28 | 22.91 | 22.65 | 1.4 |
使用成品试剂盒和企业质控品在ABI7500荧光PCR仪上进行精密性和灵敏性检测的结果如下：
表22使用ABI7500检测试剂盒灵敏度
| 稀释梯度 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Ct值 | 18.96 | 22.79 | 25.67 | 30.55 | 35.01 | No ct |
表23使用ABI7500检测试剂盒精密度
| 样本 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | CV％ |
| Ct值 | 22.73 | 22.57 | 22.67 | 22.81 | 23.00 | 22.84 | 23.00 | 22.64 | 22.94 | 22.26 | 1.0 |
8、药物干扰实验性能测试
考虑到本次临床标本的特殊性，在整个临床研究过程都没有收集到药物干扰相关的标本。为了证实治疗超级细菌类药物对本试剂盒的性能是否有干扰作用，进行了一个模拟药物干扰的实验。购买两种药物，批号：090606(罗红霉素胶囊，海南海力制药有限公司)和批号：090901(阿莫西林胶囊，山西兰花七佛山制药有限公司)。把两种药物分别稀释到1mL的DEPC水中，编号为：A管(产品说明书规定药物使用量为每次150mg)、B管(产品说明书规定药物每次使用量为每次500mg)、C管(C管为1mL DEPC水)。然后将同样的浓度的超级细菌质粒DNA分别稀释到A管、B管和C管中。将三组模板用本发明试剂盒及检测方法，检测结果如表24所示，显示两种药物对该试剂盒检测结果无影响。
表24药物干扰实验对比数据
Claims (10)
1.一种超级细菌NDM-1基因的荧光定量PCR检测方法，是利用根据超级细菌NDM-1基因的保守区域设计的引物和TaqMan探针进行的实时荧光定量PCR检测，所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ IDNO：2的核苷酸序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团(R)FAM，3’端标记有淬灭荧光基团(Q)BHQ1。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：25μL荧光定量PCR反应体系包括：TaqMan探针1.0μL(5pmol/μL)，上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物2.5μL(5pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 4μL，加dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成)，补充无菌水至25μL。
4.根据权利要求1或2或3所述的检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
5.根据前述任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括标准曲线的建立，方法为：用含有目的片段的质粒作为标准品，将其10倍系列稀释成I：1.0×1010拷贝/μL；II：1.0×109拷贝/μL；III：1.0×108拷贝/μL；IV：1.0×107拷贝/μL；V：1.0×106拷贝/μL；VI：1.0×105拷贝/μL；VII：1.0×104拷贝/μL；VIII：1.0×103拷贝/μL；IX：1.0×102拷贝/μL；X：1.0×101拷贝/μL；XI：1.0×100拷贝/μL。将质粒作为模板进行荧光定量PCR检测，得到用于超级细菌检测的标准曲线。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述标准曲线的25μL荧光定量PCR反应体系与权利要求3相同，荧光定量PCR反应条件与权利要求6相同。
7.一种用于对超级细菌NDM-1基因进行荧光定量PCR检测的试剂盒，包括权利要求1或2所述用于对超级细菌NDM-1基因进行荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，包括各自独立包装的超级细菌反应液1ml/管和Taq聚合酶(5U，每个反应0.6μL)30μl/管两个试剂管。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述超级细菌反应液为dNTPs、MgCl2、PCR引物和荧光探针的混合液，由12.5重量份的2×buffer、1.5重量份上游引物、2.5重量份下游引物、1.0重量份TaqMan探针和1.9重量份的DEPC水混合而成；其中2×buffer用含MgCl215mM的Takara公司的10×buffer 4μL、dNTP 3.5μL和DEPC水5μL配制而成。
10.根据权利要求7或8或9所述试剂盒，其特征在于，还包括各自独立包装的强阳性对照品(10-5稀释度的质粒pBlue-NDM-1)、临界阳性对照品(10-8稀释度的质粒pBlue-NDM-1)、DNA提取液(配方为：0.5％NP40，溶剂为TE缓冲液)及阴性对照品(无菌水)。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104237352A (zh) * | 2014-10-20 | 2014-12-24 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极及其制备方法和应用 |
| CN110129460A (zh) * | 2019-03-21 | 2019-08-16 | 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 | 超级细菌两种耐药基因的双重qPCR试剂盒及检测方法 |
| CN111763774A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-10-13 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 用于DuHCV和DuMV双重实时荧光定量PCR检测的引物组和探针组 |
| CN111996271A (zh) * | 2020-09-18 | 2020-11-27 | 山东省兽药质量检验所（山东省畜产品质量检测中心） | 超级细菌耐药基因ndm-1的rpa检测引物组、试剂盒和方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010062001A1 (en) * | 2008-11-25 | 2010-06-03 | Goodgene Inc. | Dna chip, kit for detecting or genotyping bacteria causing sexually transmitted diseases, genotyping antibacterial drug resistance and detecting or genotyping method using the same |
| CN101948920A (zh) * | 2010-09-10 | 2011-01-19 | 杨瑞馥 | 耐药基因pcr检测阳性对照模板、制备方法及试剂盒 |
-
2011
- 2011-01-24 CN CN 201110025791 patent/CN102146453B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010062001A1 (en) * | 2008-11-25 | 2010-06-03 | Goodgene Inc. | Dna chip, kit for detecting or genotyping bacteria causing sexually transmitted diseases, genotyping antibacterial drug resistance and detecting or genotyping method using the same |
| CN101948920A (zh) * | 2010-09-10 | 2011-01-19 | 杨瑞馥 | 耐药基因pcr检测阳性对照模板、制备方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DONGEUN YONG ET AL.: "Characterization of a New Metallo-b -Lactamase Gene, blaNDM-1, and a Novel Erythromycin Esterase Gene Carried on a Unique Genetic Structure in Klebsiella pneumoniae Sequence Type 14 from India", 《ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY》 * |
| KARTHIKEYAN K KUMARASAMY ET AL.: "Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study", 《THE LANCET INFECTIOUS DISEASES》 * |
| 曲芬等: "NDM - 1超级细菌", 《中国卫生检验杂志》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104237352A (zh) * | 2014-10-20 | 2014-12-24 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极及其制备方法和应用 |
| CN110129460A (zh) * | 2019-03-21 | 2019-08-16 | 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 | 超级细菌两种耐药基因的双重qPCR试剂盒及检测方法 |
| CN111763774A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-10-13 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 用于DuHCV和DuMV双重实时荧光定量PCR检测的引物组和探针组 |
| CN111996271A (zh) * | 2020-09-18 | 2020-11-27 | 山东省兽药质量检验所（山东省畜产品质量检测中心） | 超级细菌耐药基因ndm-1的rpa检测引物组、试剂盒和方法 |
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| PB01 | Publication | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |