CN110129460A - 超级细菌两种耐药基因的双重qPCR试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒及检测方法，所述的超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒包括两对引物及相应的两种TaqMan探针，它们分别针对blaNDM‑1基因和mcr‑1基因；所述的超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR检测方法是同时检测blaNDM‑1基因和mcr‑1基因的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。本发明针对blaNDM‑1基因和mcr‑1基因序列设计特异性引物和TaqMan探针，优化扩增反应条件，获得特异性强、敏感性高、重复性好的双重荧光定量PCR检测方法，为blaNDM‑1基因和mcr‑1基因的快速精确检测提供了有效的技术手段。

Description

超级细菌两种耐药基因的双重qPCR试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR（qPCR）试剂盒及检测方法。
背景技术
2009年12月，世界上首次报道在印度发现携带新德里金属β-内酰胺酶1 (NewDelhi metallo-β-lactamase-1，简称NDM-1)、具有超强耐药性的肺炎克雷伯氏菌，除对替加环素和多粘菌素敏感外，对β-内酰胺类、碳青霉烯类、大环内酯类、氨基糖苷类及喹诺酮类的多种抗菌药物均具有耐药性。此后，这种耐药的“超级细菌”陆续在巴尔干半岛各国、美国、加拿大、荷兰、中国等国家报道，呈世界性分布。目前，携带blaNDM-1基因的细菌分布广泛，主要发现于肠杆菌科的大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、沙门氏菌以及莫拉菌科的鲍曼不动杆菌等。经研究，发现blaNDM-1基因存在于细菌的质粒上，能够在微生物中发生“水平转移”而广泛传播。理论上，任何细菌只要获得这种质粒，就会产生相应的超级耐药性。
2016年，我国科学家在世界上首次报道从来自养殖场的大肠杆菌分离株中发现黏菌素耐药基因mcr-1基因，并证实其编码的MCR-1蛋白具有磷酸乙醇胺转移酶活性，可催化磷酸乙醇胺与脂多糖表面类脂A结合，介导黏菌素耐药。此后，在丹麦、泰国、尼日利亚、法国、英国、加拿大、美国、德国、突尼斯、日本、越南等国家也相继报道。迄今，携带mcr-1基因的细菌主要发现于肠杆菌科的大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、索氏志贺菌等。
最近，陆续报道同时携带blaNDM-1基因和mcr-1基因的大肠杆菌、阴沟肠杆菌、无丙二酸枸橼酸杆菌等，加上blaNDM-1基因和mcr-1基因均可通过质粒在相同和不同菌种间水平和垂直传播，使得临床致病菌的耐药性和多重耐药性问题日益严重，给临床医学、兽医学及食品安全等带来严峻挑战，加强对携带blaNDM-1基因和mcr-1基因的细菌的监测和防控尤为重要。当前，国内外许多学者针对blaNDM-1基因和mcr-1基因已研究建立了一些快速检测方法，能够针对blaNDM-1基因或mcr-1基因进行单独检测，这些方法主要包括普通PCR、荧光定量PCR（可简写为qPCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）、基因芯片技术等，特别是荧光定量PCR （qPCR），具有操作简单、检测时间短、结果精确等优点，但是迄今未见能同时精确检测blaNDM-1基因和mcr-1基因的快速检测方法。
发明内容
针对上述不足，本发明的目的在于提供了一种能够同时、快速、精确地检测并区分blaNDM-1基因和mcr-1基因的双重荧光定量PCR（qPCR）试剂盒及检测方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：
针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR（qPCR）试剂盒，包括两对引物及相应的两种TaqMan探针，它们分别针对blaNDM-1基因和mcr-1基因；
所述的两对引物分别为：
用于检测blaNDM-1基因的引物：
NDM-F：5′-CCTGATCAAGGACAGCAA-3′（序列表的序列1），大小为126 bp；
NDM-R：5′-TGGCTCATCACGATCATG-3′（序列表的序列2），大小为126 bp；
用于检测mcr-1基因的引物：
mcr-F：5′-CACGGTCTATGATACGAC-3′（序列表的序列3），大小为107 bp；
mcr-R：5′-CACCCAAACCAATGATAC-3′（序列表的序列4），大小为107 bp；
所述的两种TaqMan探针分别为：
用于检测blaNDM-1基因的TaqMan探针：
NDM-P：JOE-CAAGTCGCTCGGCAATCTCG-BHQ1（序列表的序列5），大小为126 bp；
用于检测mcr-1基因的TaqMan探针：
mcr-P：FAM-CTACAGACCGACCAAGCCGA-BHQ1（序列表的序列6），大小为107 bp。
本发明的针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR（qPCR）检测方法是同时检测blaNDM-1基因和mcr-1基因的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。
针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR（qPCR）检测方法，具体包括以下步骤：
1）重组质粒标准品构建：根据GenBank上发表的blaNDM-1基因和mcr-1基因的序列，体外合成blaNDM-1基因和mcr-1基因的DNA片段，接着将上述DNA片段分别作为模板进行PCR扩增，然后使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒回收、纯化得到PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞，阳性克隆经过增菌培养，然后使用Mini Plasmid Kit 质粒提取试剂盒提取质粒，进行PCR、酶切及测序鉴定，将经鉴定正确的重组质粒作为阳性标准品，分别命名为p-NDM-1和p-mcr-1；
2）待检测样品处理：取待测样品进行总DNA的提取，具体是使用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0核酸抽提试剂盒提取总DNA，然后将得到的总DNA置于-20℃下保存备用；
3）TaqMan荧光定量PCR扩增反应：将步骤1）中得到的阳性标准品和步骤2）中得到的总DNA分别作为检测模板进行TaqMan荧光定量PCR扩增反应，将两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒中的引物和TaqMan探针分别用双蒸水稀释成25pmol/μL的溶液，然后与检测模板、Premix Ex TaqTM试剂、Rox参比染料和双蒸水混合得到扩增反应体系溶液，所述的扩增反应体系溶液具体由以下体积的组分组成：Premix Ex TaqTM 10μL，Rox参比染料 0.2μL，NDM-F 0.6μL，NDM-R 0.6μL，mcr-F 0.6μL，mcr-R 0.6μL，NDM-P 0.4μL，mcr-P 0.4 μL、检测模板2.0μL、双蒸水4.6μL；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：42℃预热5min，95℃预变性30s，95℃变性5s，56℃退火延伸30s，重复循环进行上述的变性和退火延伸程序共40次，同时收集荧光信号；
4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定。
进一步，上述双蒸水是经过常规灭菌得到的双蒸水。
进一步，步骤4）中所述的结果判定方法是根据扩增曲线和 Ct值，当Ct值≤35个循环时可判断结果为阳性，否则即为阴性。
进一步，步骤1）中所述的酶切是使用EcoRⅠ内切酶和Hind Ⅲ内切酶。
本发明方法与现有技术相比较具有以下有益效果：
本发明为了同时精确检测超级细菌耐药基因blaNDM-1基因和mcr-1基因，分别针对blaNDM-1基因和mcr-1基因的基因序列设计特异性引物和TaqMan探针，并且对双重TaqMan荧光定量PCR检测过程中各种反应条件进行针对性优化改进，建立了同时精确检测blaNDM-1基因和mcr-1基因的双重荧光定量PCR方法。通过试验分析，本发明方法可以特异性扩增blaNDM-1基因和mcr-1基因，对超级细菌两种耐药基因的检出下限均为1.63×101copies/μL，比常规的PCR检测方法的敏感性高100倍，组内和组间重复试验的变异系数均小于2%，由此可见，本发明方法具有操作简便、高通量、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，为blaNDM-1基因和mcr-1基因的快速精确检测提供了有效的技术手段。
附图说明
图1是实施例1中通过重组质粒标准品的标准曲线制作得到的p-NDM-1和p-mcr-1的扩增曲线，图中曲线1～7分别表示 p-NDM-1的浓度为：1.63×108copies/μL，1.63×107copies/μL，1.63×106copies/μL，1.63×105copies/μL，1.63×104copies/μL，1.63×103copies/μL，1.63×102copies/μL；曲线8表示阴性对照；曲线9～15分别表示p-mcr-1的浓度为：1.63×108copies/μL，1.63×107copies/μL，1.63×106copies/μL，1.63×105copies/μL，1.63×104copies/μL，1.63×103copies/μL，1.63×102copies/μL。
图2是实施例1中通过重组质粒标准品的标准曲线制作得到的p-NDM-1和p-mcr-1的标准曲线，图中曲线1为p-NDM-1的标准曲线：R2=1；图中曲线2为p-mcr-1的标准曲线：R2=0.99。
图3是实施例1中特异性试验所得到的扩增曲线：曲线1为p-NDM-1，曲线2为p-mcr-1，曲线3为鸡白痢沙门氏菌，曲线4为鼠伤寒沙门氏菌，曲线5为大肠杆菌，曲线6为多杀性巴氏杆菌，曲线7为肺炎克雷伯氏菌，曲线8为变形杆菌，曲线9为金黄色葡萄球菌，曲线10为枯草芽孢杆菌，曲线11为阴性对照。
图4是实施例1中采用本发明方法检测p-NDM-1和p-mcr-1的敏感性试验所得到的p-NDM-1和p-mcr-1的扩增曲线：图中曲线1～7分别表示 p-NDM-1的浓度为：1.63×107copies/μL，1.63×106copies/μL，1.63×105copies/μL，1.63×104copies/μL，1.63×103copies/μL，1.63×102copies/μL，1.63×101copies/μL；曲线8表示阴性对照；曲线9～15分别表示p-mcr-1的浓度为：1.63×107copies/μL，1.63×106copies/μL，1.63×105copies/μL，1.63×104copies/μL，1.63×103copies/μL，1.63×102copies/μL，1.63×101copies/μL。
图5是实施例1中采用常规PCR方法检测p-NDM-1的敏感性试验所得到的p-NDM-1的电泳图：图中M：DNA分子质量标准（DL1000），1～7分别表示p-NDM-1的浓度为：1.63×107copies/μL，1.63×106copies/μL，1.63×105copies/μL，1.63×104copies/μL，1.63×103copies/μL，1.63×102copies/μL，1.63×101copies/μL；8表示阴性对照。
图6是实施例1中采用常规PCR方法检测p-mcr-1的敏感性试验所得到的p-mcr-1的电泳图：图中M：DNA分子质量标准（DL1000），1～7分别表示p-mcr-1的浓度为：1.63×107copies/μL，1.63×106copies/μL，1.63×105copies/μL，1.63×104copies/μL，1.63×103copies/μL，1.63×102copies/μL，1.63×101copies/μL；8表示阴性对照。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR（qPCR）试剂盒，包括两对引物及相应的两种TaqMan探针，它们分别针对blaNDM-1基因和mcr-1基因；
所述的两对引物分别为：
用于检测blaNDM-1基因的引物：
NDM-F：5′-CCTGATCAAGGACAGCAA-3′（序列表的序列1），大小为126 bp；
NDM-R：5′-TGGCTCATCACGATCATG-3′（序列表的序列2），大小为126 bp；
用于检测mcr-1基因的引物：
mcr-F：5′-CACGGTCTATGATACGAC-3′（序列表的序列3），大小为107 bp；
mcr-R：5′-CACCCAAACCAATGATAC-3′（序列表的序列4），大小为107 bp；
所述的两种TaqMan探针分别为：
用于检测blaNDM-1基因的TaqMan探针：
NDM-P：JOE-CAAGTCGCTCGGCAATCTCG-BHQ1（序列表的序列5），大小为126 bp；
用于检测mcr-1基因的TaqMan探针：
mcr-P：FAM-CTACAGACCGACCAAGCCGA-BHQ1（序列表的序列6），大小为107 bp。
本发明的针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR（qPCR）检测方法是同时检测blaNDM-1基因和mcr-1基因的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。
针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR（qPCR）检测方法，具体包括以下步骤：
1）重组质粒标准品构建：根据GenBank上发表的blaNDM-1基因和mcr-1基因的序列，体外合成blaNDM-1基因和mcr-1基因的DNA片段，接着将上述DNA片段分别作为模板进行PCR扩增，然后使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒回收、纯化得到PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞，阳性克隆经过增菌培养，然后使用Mini Plasmid Kit 质粒提取试剂盒提取质粒，进行PCR、酶切及测序鉴定，将经鉴定正确的重组质粒作为阳性标准品，分别命名为p-NDM-1和p-mcr-1，应用核酸蛋白分析仪测定浓度，计算拷贝数，拷贝数=质粒浓度×6.02×1023/（660×质粒总长度）；所述的酶切是使用EcoRⅠ内切酶和Hind Ⅲ内切酶；
2）待检测样品处理：取待测样品进行总DNA的提取，具体是使用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0核酸抽提试剂盒提取总DNA，然后将得到的总DNA置于-20℃下保存备用；
3）TaqMan荧光定量PCR扩增反应：将步骤1）中得到的阳性标准品和步骤2）中得到的总DNA分别作为检测模板进行TaqMan荧光定量PCR扩增反应，将两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒中的引物和TaqMan探针分别用双蒸水稀释成25pmol/μL的溶液，然后与检测模板、Premix Ex TaqTM试剂、Rox参比染料和双蒸水混合得到扩增反应体系溶液，所述的扩增反应体系溶液具体由以下体积的组分组成：Premix Ex TaqTM 10μL，Rox参比染料 0.2μL，NDM-F 0.6μL，NDM-R 0.6μL，mcr-F 0.6μL，mcr-R 0.6μL，NDM-P 0.4μL，mcr-P 0.4 μL、检测模板2.0 μL、双蒸水4.6 μL；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：42℃预热5min，95℃预变性30s，95℃变性5s，56℃退火延伸30s，重复循环进行上述的变性和退火延伸程序共40次，同时收集荧光信号；
4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定；所述的结果判定方法是根据扩增曲线和Ct值，当Ct值≤35个循环时可判断结果为阳性，否则即为阴性。
上述双蒸水是经过常规灭菌得到的双蒸水。
对本实施例所述的针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒及检测方法分别进行特异性、敏感性和重复性的试验分析，具体试验分析过程如下：
S1、重组质粒标准品的标准曲线制作：先将阳性标准品p-NDM-1、p-mcr-1分别进行10倍系列稀释成1.63×102~1.63×108 copies/μL，然后将同一稀释浓度的p-NDM-1和p-mcr-1溶液等比例混合后作为检测模板，并且将常规灭菌的双蒸水作为阴性对照，按照本实施例所述的方法进行PCR扩增，获得双重TaqMan荧光定量PCR的扩增曲线和标准曲线，结果见图1和图2。结果显示，两种质粒起始模板量与Ct值之间存在良好的线性关系，p-NDM-1和p-mcr-1的相关系数R2 分别为1和0.99。
S2、特异性试验：将从大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌标准株中提取的基因组DNA作为检测模板，以p-NDM-1和p-mcr-1作为阳性对照、灭菌双蒸水为阴性对照，分别按照本实施例所述的方法检测获得相对应的扩增曲线，结果见图3。结果显示，只有作为阳性对照的质粒标准品p-NDM-1和p-mcr-1出现特异性扩增，而以其它细菌基因组DNA为模板时无扩增曲线，表明本发明方法具有很强的特异性。
S3、敏感性试验：将S1中得到的2种重组质粒标准品p-NDM-1和p-mcr-1进行10倍系列稀释成终浓度为1.63×101~1.63×107 copies/μL，然后将同一稀释浓度的p-NDM-1和p-mcr-1溶液等比例混合后作为检测模板，按照本实施例所述的方法和常规PCR检测方法分别进行检测，结果见图4、图5、图6。结果采用本发明方法检测两种耐药基因的检出下限均为1.63×101copies/μL（图4），常规PCR检测方法检测两种耐药基因的检出下限均为1.63×103copies/μL（图5和图6），本发明方法比常规PCR方法的敏感性高100倍。
S4、重复性试验：将S1中得到的2种重组质粒标准品p-NDM-1和p-mcr-1分别10倍系列稀释成1.63×101~1.63×107 copies/μL，然后将同一个稀释浓度的p-NDM-1和p-mcr-1溶液按等比例混合，分别取稀释浓度为1.63×103copies/μL、1.63×104copies/μL、1.63×105 copies/μL的质粒混合物作为检测模版，按照本实施例所述的方法进行检测，分别进行组内和组间重复性试验，组间重复性试验间隔1周进行，具体结果见表1。结果显示，组内和组间重复性试验的变异系数为0.58%～1.90%，均小于2%，具有良好的重复性。
表1 双重TaqMan荧光定量PCR的重复性分析
S5、样品检测试验：
选取已确认同时携带blaNDM-1基因和mcr-1基因的大肠杆菌进行培养后稀释均等分成100份样品，每份样品中的菌落总数达到50 CFU/mL，接着按照本实施例所述的检测方法对该100份样品进行检测，其中检测到同时携带blaNDM-1基因和mcr-1基因的阳性样品99份；
选取已确认携带blaNDM-1基因的沙门氏菌进行培养后稀释均等分成50份样品，每份样品中的菌落总数达到50 CFU/mL，接着按照本实施例所述的检测方法对该50份样品进行检测，检测到携带blaNDM-1基因的阳性样品50份；
选取已确认携带mcr-1基因的大肠杆菌进行培养后稀释均等分成50份样品，每份样品中的菌落总数达到50 CFU/mL，接着按照本实施例所述的检测方法对该50份样品进行检测，检测到携带mcr-1基因的阳性样品50份；
由上述结果显示，本发明方法适合用于检测耐药菌中携带的blaNDM-1基因和mcr-1基因。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心
<120> 超级细菌两种耐药基因的双重qPCR试剂盒及检测方法
<141> 2019-03-21
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctgatcaag gacagcaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggctcatca cgatcatg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacggtctat gatacgac 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacccaaacc aatgatac 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caagtcgctc ggcaatctcg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctacagaccg accaagccga 20

Claims (5)

1.针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括两对引物及相应的两种TaqMan探针，它们分别针对blaNDM-1基因和mcr-1基因；
所述的两对引物分别为：
用于检测blaNDM-1基因的引物：
NDM-F：5′-CCTGATCAAGGACAGCAA-3′，大小为126 bp；
NDM-R：5′-TGGCTCATCACGATCATG-3′，大小为126 bp；
用于检测mcr-1基因的引物：
mcr-F：5′-CACGGTCTATGATACGAC-3′，大小为107 bp；
mcr-R：5′-CACCCAAACCAATGATAC-3′，大小为107 bp；
所述的两种TaqMan探针分别为：
用于检测blaNDM-1基因的TaqMan探针：
NDM-P：JOE-CAAGTCGCTCGGCAATCTCG-BHQ1，大小为126 bp；
用于检测mcr-1基因的TaqMan探针：
mcr-P：FAM-CTACAGACCGACCAAGCCGA-BHQ1，大小为107 bp。
2.针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述方法是同时检测blaNDM-1基因和mcr-1基因的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。
3.根据权利要求2所述的针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：其具体包括以下步骤：
重组质粒标准品构建：根据GenBank上发表的blaNDM-1基因和mcr-1基因的序列，体外合成blaNDM-1基因和mcr-1基因的DNA片段，接着将上述DNA片段分别作为模板进行PCR扩增，然后使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒回收、纯化得到PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞，阳性克隆经过增菌培养，然后使用Mini Plasmid Kit 质粒提取试剂盒提取质粒，进行PCR、酶切及测序鉴定，将经鉴定正确的重组质粒作为阳性标准品，分别命名为p-NDM-1和p-mcr-1；
待检测样品处理：取待测样品进行总DNA的提取，具体是使用MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.5.0核酸抽提试剂盒提取总DNA，然后将得到的总DNA置于-20℃下保存备用；
TaqMan荧光定量PCR扩增反应：将步骤1）中得到的阳性标准品和步骤2）中得到的总DNA分别作为检测模板进行TaqMan荧光定量PCR扩增反应，将超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR试剂盒中的引物和TaqMan探针分别用双蒸水稀释成25pmol/μL的溶液，然后与检测模板、Premix Ex TaqTM试剂、Rox参比染料和双蒸水混合得到扩增反应体系溶液，所述的扩增反应体系溶液具体由以下体积的组分组成：Premix Ex TaqTM 10μL，Rox参比染料 0.2μL，NDM-F 0.6μL，NDM-R 0.6μL，mcr-F 0.6μL，mcr-R 0.6μL，NDM-P 0.4μL，mcr-P 0.4 μL、检测模板2.0 μL、双蒸水4.6 μL；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：42℃预热5min，95℃预变性30s，95℃变性5s，56℃退火延伸30s，重复循环进行上述的变性和退火延伸程序共40次，同时收集荧光信号；
4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定。
4.根据权利要求3所述的针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述双蒸水是经过常规灭菌得到的双蒸水。
5.根据权利要求3所述的针对超级细菌两种耐药基因的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤1）中所述的酶切是使用EcoRⅠ内切酶和Hind Ⅲ内切酶。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117417989A (zh) * 2023-11-17 2024-01-19 河北省畜牧兽医研究所 一种用于检测耐药基因的多重荧光定量pcr试剂盒和方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102002528A (zh) * 2010-11-22 2011-04-06 浙江省疾病预防控制中心 一种抗生素耐药ndm-1基因的荧光检测试剂盒及检测方法
CN102146453A (zh) * 2011-01-24 2011-08-10 北京金豪制药股份有限公司 超级细菌ndm-1基因荧光定量pcr检测方法及其试剂盒
CN102146452A (zh) * 2011-01-24 2011-08-10 中国人民解放军疾病预防控制所 超级细菌ndm-1基因荧光定量pcr检测的引物、探针及其应用
CN102181543A (zh) * 2011-04-08 2011-09-14 北京爱普益生物科技有限公司 用于检测blaNDM-1基因的引物、探针、试剂盒及其检测方法
CN102899414A (zh) * 2012-10-10 2013-01-30 南方医科大学 超级细菌ndm和kpc基因双重荧光定量pcr检测方法及其试剂盒
JP2015039320A (ja) * 2013-08-21 2015-03-02 日鉄住金環境株式会社 複数細菌の同時検出及び／又は定量方法
US20170253917A1 (en) * 2016-03-07 2017-09-07 Opgen, Inc. Methods and systems for determining antibiotic susceptibility
CN107460242A (zh) * 2017-08-15 2017-12-12 北京紫萌医药科技有限公司 一种能同时检测多种高耐药基因的检测试剂盒及其应用
WO2017218789A1 (en) * 2016-06-15 2017-12-21 Streck, Inc. Assays and methods for determining microbial resistance
WO2018086263A1 (zh) * 2016-11-10 2018-05-17 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种实时荧光定量pcr检测方法及其标准品和检测试剂盒

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102002528A (zh) * 2010-11-22 2011-04-06 浙江省疾病预防控制中心 一种抗生素耐药ndm-1基因的荧光检测试剂盒及检测方法
CN102146453A (zh) * 2011-01-24 2011-08-10 北京金豪制药股份有限公司 超级细菌ndm-1基因荧光定量pcr检测方法及其试剂盒
CN102146452A (zh) * 2011-01-24 2011-08-10 中国人民解放军疾病预防控制所 超级细菌ndm-1基因荧光定量pcr检测的引物、探针及其应用
CN102181543A (zh) * 2011-04-08 2011-09-14 北京爱普益生物科技有限公司 用于检测blaNDM-1基因的引物、探针、试剂盒及其检测方法
CN102899414A (zh) * 2012-10-10 2013-01-30 南方医科大学 超级细菌ndm和kpc基因双重荧光定量pcr检测方法及其试剂盒
JP2015039320A (ja) * 2013-08-21 2015-03-02 日鉄住金環境株式会社 複数細菌の同時検出及び／又は定量方法
US20170253917A1 (en) * 2016-03-07 2017-09-07 Opgen, Inc. Methods and systems for determining antibiotic susceptibility
CN109196122A (zh) * 2016-03-07 2019-01-11 奥普根股份有限公司 用于确定抗生素敏感性的方法和系统
WO2017218789A1 (en) * 2016-06-15 2017-12-21 Streck, Inc. Assays and methods for determining microbial resistance
CA3027953A1 (en) * 2016-06-15 2017-12-21 Streck, Inc. Assays and methods for determining microbial resistance
WO2018086263A1 (zh) * 2016-11-10 2018-05-17 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种实时荧光定量pcr检测方法及其标准品和检测试剂盒
CN107460242A (zh) * 2017-08-15 2017-12-12 北京紫萌医药科技有限公司 一种能同时检测多种高耐药基因的检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YANG WANG等: "Comprehensive resistome analysis reveals the prevalence of NDM and MCR-1 in Chinese poultry production", 《NATURE MICROBIOLOGY》, vol. 2, pages 16260 - 7 *
施开创;尹彦文;温丽霞;屈素洁;王海清;胡杰;: "黏菌素耐药基因mcr-1 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立", 南方农业学报, no. 07, pages 197 - 202 *
施开创;李凤梅;张步娴;黎宗强;莫胜兰;许心婷;: "超级细菌bla_(NDM-1)基因TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立", 中国预防兽医学报, no. 12, pages 60 - 64 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117417989A (zh) * 2023-11-17 2024-01-19 河北省畜牧兽医研究所 一种用于检测耐药基因的多重荧光定量pcr试剂盒和方法
CN117417989B (zh) * 2023-11-17 2024-05-14 河北省畜牧兽医研究所 一种用于检测耐药基因的多重荧光定量pcr试剂盒和方法

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