CN104237352A - 基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极及其制备方法和应用，所述电极由氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的金电极和信号放大探针组成，以该电极为工作电极、铂电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极、含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS溶液为测试底液组建电化学生物传感器，可以快速、特异、灵敏地检测NDM-1基因，为多重耐药菌的检测提供简单、快速、灵敏、特异的工具，具有较好的市场价值。
Description
技术领域
本发明属于电化学检测领域，具体涉及基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸(1ockednucleic acid,LNA)探针修饰的电极，还涉及该电极的制备方法和应用。
背景技术
NDM-1多重耐药菌是指携带NDM-1耐药基因的细菌，属于革兰阴性耐药菌。NDM-1全称是“新德里金属-β-内酰胺酶”，是1种高效耐药酶。研究显示，目前多重耐药菌正在全球快速传播，并且已经在人类重要的致病菌志贺氏菌中发现了NDM-1。携带NDM-1耐药基因的细菌可以通过饮水等途径传染，表现症状为肠道感染，该类细菌对几乎所有抗生素都具有抗药性，患者感染后死亡高。抗生素滥用是NDM-1出现的首要原因，NDM-1是一种新的超级耐药基因，可以在细菌之间传播，从而使对抗生素敏感的细菌获得耐药性，快速上升的耐药性和新的抗菌药物开发的缺乏，预示了全球NDM-1多重耐药菌防控形势极为严峻。因此，研发NDM-1直接快速特异的检测方法，对NDM-1基因的精确检测及有效切断多重耐药菌的传播链均具有非常重要的意义。
目前，NDM-1多重耐药菌的诊断主要包括筛查、表型确认和基因确证等3个步骤。表型筛查是在细菌药物敏感性测定中，以美洛培南或亚胺培南纸片法(K-B法)或最低抑菌浓度(MIC)测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查；表型确认是采用双纸片协同实验或亚胺培南(美洛培南)/EDTA复合纸片，进行K-B法药敏试验来判定产金属酶；基因确证是采用NDM-1的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确定菌株是否携带NDM-1基因。但这些诊断方法存在着费时烦琐、敏感性和特异性较低及检测成本高等缺陷。
电化学DNA生物传感器具有分析时间短、设备微型化、灵敏度高、检测限低、使用简单以及成本低廉等著优点。特异性和灵敏是评价传感器检测性能的重要指标，目前研究报道的传感器表面固定的大多是DNA探针，其缺点是灵敏度不高和特异性不强。由于DNA探针与较长的靶序列杂交时结合力较弱常导致碱基错配，因而DNA探针的特异性相对较低。另外，由于单链DNA无法与未解旋的双链靶序列直接结合，所以待检测的标本需经PCR扩增后才能与之结合，而DNA的新型人工模拟物锁核酸可以完美解决上述问题。LNA是一种新型寡核苷酸衍生物，具有超强的刚性的缩合结构，以及与DNA/RNA的强大杂交亲和力、卓越的碱基错配识别能力等优势。
新型纳米材料石墨烯和金纳米管是良好的电极修饰材料。石墨烯是由一层碳原子构成的石墨薄片，其碳原子间靠共价键相连，是目前发现的最薄的二维材料。金纳米管能有效提高电子传输效率，具有良好的生物兼容性、导电性和极超强的生物分子吸附能力。金纳米管可有效保持生物分子的生物活性，可使修饰电极表面吸附更多的LNA的探针，从而进一步放大微小的电化学信号。石墨烯和金纳米管的有机结合，具有比表面积高、导电性能好、机械强度高、易于修饰、功能化等独特的理化性质。
利用DNA人工模拟物锁核酸的高特异性，针对NDM-1全基因组，设计NDM-1的特异性LNA探针，将LNA探针与自主合成的纳米材料氧化石墨烯和金纳米管通过优化配比固定于电化学传感器表面，创建了一种新型的电化学生物传感器，用于NDM-1耐药基因的快速特异检测，具有重要的市场价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极；本发明的目的之二在于提供基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极的制备方法；本发明的目的之三在于含有上述电极的电化学生物传感器；本发明的目的之四在于提供基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极或所述电化学传感器的应用；本发明的目的之五是利用所述检测NDM-1的电化学生物传感器检测NDM-1基因的方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极，所述电极由氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的金电极和信号放大探针组成；所述氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的金电极是在金电极表面依次修饰氧化石墨烯氧化锌溶胶-凝胶复合物、金纳米管以及锁核酸探针，最后封闭非特异性吸附位点而得，所述信号放大探针为游离的金纳米管和锁核酸探针通过巯基结合形成的复合物，所述锁核酸探针特异识别NDM-1基因。
优选的，所述锁核酸探针的序列如SEQ ID NO.1所示。
2、所述基于氧化石墨烯、金纳米管以及锁核酸探针修饰的电极的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备氧化石墨烯氧化锌溶胶-凝胶复合物：取氧化石墨烯用水溶解后，超声制备成氧化石墨烯悬浮液，然后与氧化锌溶胶-凝胶和无水乙醇混匀，制备成氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶复合物；
(2)预处理电极：将金电极打磨，抛光，清洁，干燥，得预处理的电极，备用；
(3)修饰电极：将步骤(1)制备的氧化石墨烯ZnO凝胶-凝胶复合物滴涂于步骤(2)所得预处理的电极表面，晾干后，浸入金纳米管溶液中，然后清洗，再在金纳米管修饰的电极表面滴加含锁核酸探针的溶液，固定后清洗，最后用巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，制备成氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的金电极；
(4)制备信号放大探针：将锁核酸探针加入到金纳米管溶液中，振荡混匀、充分反应，然后将反应液离心，收集沉淀物，沉淀物用PBS洗涤后再离心，得信号放大探针溶于PBS溶液中，保存备用。
优选的，所述步骤(1)中，氧化石墨烯悬浮液的浓度为1mg/ml，氧化石墨烯悬浮液、氧化锌溶胶-凝胶和无水乙醇的体积比为3:1:2。
优选的，所述步骤(2)是将金电极分别用0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末打磨抛光，每次打磨后用水洗净，再分别于硝酸、丙酮和水中各超声洗涤，干燥，备用。
优选的，所述步骤(3)中，将步骤(1)制备的氧化石墨烯ZnO凝胶-凝胶复合物滴涂于步骤(2)所得预处理的电极表面，晾干后，浸入金纳米管溶液中浸泡2小时，然后清洗，再在金纳米管修饰的电极表面滴加浓度为1.5μmol/L的锁核酸溶液，固定后清洗，最后用1mmol/L的巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，制备成氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的金电极。
优选的，所述步骤(4)中，将10mmol/L锁核酸探针按体积比为6：50加入到金纳米管溶液中，混匀20小时、充分反应，然后将反应液在4℃、1500rpm条件下离心20min，收集沉淀物，沉淀物用PBS洗涤后再离心，得信号放大探针，溶于PBS溶液中，保存备用。
3、检测NDM-1的电化学生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极和测试底液；所述工作电极为权利要求1或2所述基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极，所述对电极为铂电极，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述测试底液为pH7.4的含2mmol/LK3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和5mmolKCl的PBS溶液。
4、所述基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极或检测NDM-1的电化学生物传感器在检测NDM-1基因中的应用。
5、利用所述检测NDM-1的电化学生物传感器检测NDM-1基因的方法，包括如下步骤：将基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极与样品溶液杂交后，然后以基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，pH 7.4的含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS溶液为测试底液构建电化学生物传感器，采用循环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-0.3V～0.7V，电位扫描速率为50mv/s，根据杂交前后峰电流变化检测NDM-1基因浓度。
本发明的有益效果在于：本发明利用锁核酸(LNA)的高特异性，然后结合石墨烯和金纳米管材料的理化优势，制备氧化石墨烯、金纳米管以及锁核酸修饰的电极，同时将锁核酸和金纳米管通过巯基结合形成的复合物加入反应体系作为游离状态的信号放大探针，再与电化学技术相融合获得检测NDM-1基因的电化学生物传感器，从而构建检测NDM-1基因的平台，为临床药物和食品中潜在超级细菌的检测提供简单、快速、灵敏、特异、高通量的工具。同时本发明通过将电化学领域的检测手段引入到生物医学的领域，并探索了石墨烯、金纳米管和LNA电化学生物传感器在液相中的响应机理，为电化学生物传感器在生物医学检测中的应用奠定了坚实的理论基础。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为不同修饰电极的循环伏安图。a：氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶和金纳米管修饰电极；b：氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶、金纳米管和锁核酸探针；c：巯基己醇封闭氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶、金纳米管和锁核酸探针修饰电极；d：裸电极；e：氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶修饰电极；f：巯基己醇封闭氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶、金纳米管和锁核酸探针修饰电极检测NDM-1。
图2为不同检测物质对传感器响应电流的影响。
图3为电化学生物传感器检测NDM-1的标准曲线。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明利用锁核酸(LNA)的高特异性，针对NDM-1全基因组，设计一条与NDM-1互补的特异性锁核酸探针，锁核酸探针的序列为：5'-SH-(CH2)6-gcttttggtggctgcctgat-3'(SH代表巯基基团，下划线部分碱基经锁核酸修饰)(SEQ ID NO.1)，首先将该探针固定在电极表面作为固相捕获探针，其次将该探针加入反应体系作为游离状态的信号放大探针。上述探针的5’端均修饰有巯基，并且与目标基因的部分序列相互补，然后结合石墨烯和金纳米管材料的理化优势，利用电化学方法创建了一种用于检测NDM-1的基于氧化石墨烯、金纳米管、锁核酸修饰的电极。制备方法是：首先在电极表面静电吸附一层氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶，再通过电沉积将金纳米管沉积到电极表面，然后再利用金纳米管具有极超强的生物分子吸附能力将锁核酸探针固定于电极表面，当在溶液中含有目标基因时，捕获探针和信号放大探针分别与其对应的互补序列进行杂交，此时信号放大探针5’端标记有巯基可通过Au-S键的化学键将杂交液中的金纳米管结合到电极表面，形成“三明治”结构的核酸杂交复合物，形成的杂交复合物在电极表面发生氧化还原反应，从而产生电化学信号，将组装好的生物传感器置于pH7.4的含2mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和5mmol/l KCl的PBS溶液，利用循环伏安法表征修饰电极的电化学行为。如果检测液中含有错配序列，锁核酸探针不能和序列很好的形成“三明治”结构的杂交复合物，几乎不产生电化学信号。
实施例1
基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极的制备方法，包括如下氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰金电极和制备信号放大探针步骤：
(1)氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶复合物的制备：称取0.001g氧化石墨烯于小烧杯中，加入1mL的超纯水，然后置于超声仪中超声制备成氧化石墨烯悬浮液，取90μL氧化石墨烯悬浮液、30μL ZnO溶胶-凝胶和60μL无水乙醇混匀，制备成氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶混合液，置4℃避光保存备用；
(2)预处理的电极：取电极分别用0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末打磨抛光成镜面，每次打磨后均用超纯水冲洗，再分别于硝酸、丙酮及超纯水中各超声洗涤5min，干燥，得预处理的电极，备用；
(3)制备基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的金电极，取20μL步骤(1)制备的氧化石墨烯ZnO凝胶-凝胶复合物滴涂于经预处理的电极表面，室温晾干后，将该修饰电极浸入金纳米管溶液中浸泡2h，用超纯水清洗后，将20μL浓度为1.5μmol/L的锁核酸探针固定于上述方法处理的电极表面，放置于4℃冰箱中10小时，取出用超纯水清洗，最后将修饰电极浸入1mmol/L巯基己醇溶液于37℃封闭电极表面的非特异性附位点1小时，制备成氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极，制成的氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极不用时悬置于PBS溶液中，4℃下储存；
(4)制备金纳米管和锁核酸探针复合物组成的信号放大探针：将60μl 10mmol/L锁核酸探针加入到500μl金纳米管溶液中，避光室温下振荡混匀24小时；反应完成后，将反应液在4℃、1500rpm条件下离心20min，取沉淀物，用PBS液洗涤2次，再离心，得信号放大探针，将修饰好的信号放大探针溶于400μl PBS(pH7.4，0.1mol/L PBS溶液)溶液中，置4℃避光保存备用。
实施例2、组建电化学生物传感器
以氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极作为对电极，组建电化学生物传感器。将组建的电化学生物传感器连入电化学工作站，于pH7.4的含2mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和5mmolKCl的PBS中进行循环伏安扫描，工作电位为-0.3V～0.7V，扫描速度为50mV/s。
杂交反应：将氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的金电极浸入到在150μl不同浓度的NDM-1靶序列溶液中(10-6μg/L，10-5μg/L，10-4μg/L，10-3μg/L，10-2μg/L，10-1μg/L，1.0μg/L，101，102μg/L)，再将信号放大探针加入到此反应体系中，于37℃恒温杂交45分钟。利用待测NDM-1靶序列的桥联作用，可成功的将氧化石墨烯/ZnO凝胶凝胶/金纳米管修饰电极与信号放大探针连接到一起，形成“三明治型”结构，实现痕量NDM-1的快速精确检测。杂交过程中传感器采用三电极体系测量电流变化。
上述电化学生物传感器检测NDM-1的原理为：通过电极表面的锁核酸探针与NDM-1靶序列发生核酸杂交反应，生成的杂交复合物阻碍了电极表面的电子传递，使传感器响应电流变化值增大。该信号变化的大小ΔI与发生在电极表面核酸杂交反应进行的程度有关，ΔI值越大，表明与电极表面固定的LNA探针结合的检测物的量越多。用制备好的LNA探针修饰的电极测定的初始还原峰电流记为I0；当核酸杂交反应结束后，以测定的还原峰电流并记为I；则峰电流在核酸杂交反应前后变化ΔI＝I－I0。
实施例3、基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针的分步表征
利用循环伏安法表征电极在修饰及检测过程中的电化学特性，具体检测方法为：将修饰电极浸入到150μL浓度为100μg/L的NDM-1靶序列溶液中，然后向反应体系中加入锁核酸探针溶液，于37℃恒温杂交45分钟，杂交过程中传感器采用三电极体系测量电流变化，获得不同电极在pH7.4含2mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和5mmol/l KCl的PBS溶液中的循环伏安曲线(CV)图，如图1所示。
图1中，曲线a为氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶和金纳米管修饰电极在pH7.4含有2mmol/LK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和5mmol/l KCl的PBS溶液中的循环伏安曲线，由于金纳米管具有良好的导电性，能够更好的促进电极表面的电子传递，所以在电极表面再修饰金纳米管时氧化还原峰的峰电流明显增大，界面峰电流值最大；曲线b是氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶、金纳米管和锁核酸探针的循环伏安曲线，锁核酸探针固定电极表面之后，由于锁核酸的磷酸骨架带负电荷，溶液中的[Fe(CN)6]3-同样带有负电荷，同种电荷相排斥，导致[Fe(CN)6]3-的电子在金电极表面传递速度减慢，在一定程度上阻碍了溶液中导电离子在电极表面的电子传递，因此氧化还原峰的峰电流值有所降低；当锁核酸探针修饰电极后，为了防止锁核酸探针“倒伏”在电极表面而出现非特异吸附，采用巯基己醇来封闭非特异性吸附位点；曲线c为巯基己醇封闭氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶、金纳米管和锁核酸探针修饰电极，巯基己醇在封闭非特异性吸附位点的同时也阻碍了电子的传输，所以峰电流值也进一步有所减小；曲线d为裸金电极在pH7.4含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和5mmol/l KCl的PBS溶液中的循环伏安曲线，出现了一对准可逆的氧化还原峰；曲线e为氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶修饰电极在pH7.4含2mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和5mmol/l KCl的PBS溶液中的循环伏安曲线，由于氧化石墨烯含有大量的含氧官能团如-COOH，导电性能差，阻碍了电子传递，及氧化石墨烯电极表面的负电荷排斥铁氰化物和亚铁氰化物离子通过电荷传递达到电极表面，此外，ZnO凝胶-凝胶薄膜在一定程度上液阻碍了溶液中导电离子再电极上的电子传递，因此峰电流值明显降低；曲线f为巯基己醇封闭氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶、金纳米管和锁核酸探针修饰电极与含有100μg/L NDM-1的溶液反应的循环伏安曲线，由于电极表面的核酸杂交复合物是没有电活性的生物大分子，进一步阻碍了电极表面的电子传输，与曲线c相比，氧化还原峰的峰电流在孵育前后响应电流大幅降低。以上不同修饰电极的电化学表征，表明基于氧化石墨烯、金纳米管、锁核酸探针修饰的电极能够检测NDM-1靶序列，并且组建的电化学生物传感器也能检测NDM-1靶序列。
实施例4、检测NDM-1的电化学生物传感器的灵敏度和特异性
(1)电化学生物传感器的特异性
将基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极分别与以下溶液共孵育30分钟：溶液①含有100μg/L NDM-1标准品；溶液②含有100μg/L NDM-1标准品及干扰物质(1mg/L大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)；③只含有干扰物质(1mg/L大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)；④空白(PBS溶液)。孵育完成后，将基于氧化石墨烯/金纳米管/锁核酸探针修饰的电极与铂电极、饱和参比电极构建成电化学生物传感器，以pH7.4含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和5mmol/l KCl的PBS溶液为测试底液，在室温下采用循环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-0.3V～0.7V，电位扫描速率为50mv/s，分别记录响应电流值，并将所得峰电流值进行比较，评价电化学生物传感器的特异性，评价结果如图2所示。结果显示，在溶液①及溶液②中孵育的电极在孵育前后响应电流变化值(ΔI)分别为42.9μA和39.3μA，而在仅含有干扰物质的溶液③和空白溶液④中孵育的电极在孵育前后响应电流基本保持不变。上述结果表明，本发明构建的电化学生物传感器抗干扰能力强，对NDM-1具有良好的选择性，并能对NDM-1进行精确检测。
(2)电化学生物传感器的灵敏度
用检测一个周期的基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极再检测终浓度分别为10-6μg/L，10-5μg/L，10-4μg/L，10-3μg/L，10-2μg/L，10-1μg/L，1.0μg/L，101μg/L，102μg/L的NDM-1浓度，操作步骤相同。检测靶序列溶液进行杂交反应所引起的电流响应差值△I及反应所需时间，并对响应电流变化差值△I与NDM-1浓度做线性回归，实验重复3次取平均值，结果如图3所示。实验结果表明，在杂交反应初始阶段，随着NDM-1浓度从10-6μg/L增加到100μg/L，杂交反应引起的相位变化值呈先上升后趋于饱和的曲线方式，且以102μg/LNDM-1浓度为饱和点。并且NDM-1浓度在10-6μg/L～102μg/L的范围内时，其浓度的对数值与峰电流呈良好的线性关系。其中线性回归方程为：y＝5.3015x+31.662，相关系数为0.9916。这是由于在NDM-1浓度逐渐升高的过程中，电极表面固定的特异性LNA探针也逐渐结合上更多的NDM-1，从而引起了更大的响应电流变化值，当NDM-1浓度升高至102μg/L时，电极表面固定的特异性探针与NDM-1的结合已全部饱和，因此当继续增加NDM-1浓度时，已经无法引起更大的响应电流变化值。同样，当NDM-1浓度低于10-6μg/L时，由于电极表面固定的特异性探针无法结合到足够数量的NDM-1而无法进行精确检测。以上实验结果表明，本发明组建的电化学生物传感器具有较宽的线性范围和较低的检测限。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极，其特征在于：所述电极由氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的金电极和信号放大探针组成；所述氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的金电极是在金电极表面依次修饰氧化石墨烯氧化锌溶胶-凝胶复合物、金纳米管以及锁核酸探针，最后封闭非特异性吸附位点而得，所述信号放大探针为游离的金纳米管和锁核酸探针通过巯基结合形成的复合物，所述锁核酸探针特异识别NDM-1基因。
2.根据权利要求1所述基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极，其特征在于：所述锁核酸探针的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述基于氧化石墨烯、金纳米管以及锁核酸探针修饰的电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备氧化石墨烯氧化锌溶胶-凝胶复合物：取氧化石墨烯用水溶解后，超声制备成氧化石墨烯悬浮液，然后与氧化锌溶胶-凝胶和无水乙醇混匀，制备成氧化石墨烯ZnO溶胶-凝胶复合物；
(2)预处理电极：将金电极打磨，抛光，清洁，干燥，得预处理的电极，备用；
(3)修饰电极：将步骤(1)制备的氧化石墨烯ZnO凝胶-凝胶复合物滴涂于步骤(2)所得预处理的电极表面，晾干后，浸入金纳米管溶液中，然后清洗，再在金纳米管修饰的电极表面滴加含锁核酸探针的溶液，固定后清洗，最后用巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，制备成氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的金电极；
(4)制备信号放大探针：将锁核酸探针加入到金纳米管溶液中，振荡混匀、充分反应，然后将反应液离心，收集沉淀物，沉淀物用PBS洗涤后再离心，得信号放大探针，溶于PBS溶液中，保存备用。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，氧化石墨烯悬浮液的浓度为1mg/ml，氧化石墨烯悬浮液、氧化锌溶胶-凝胶和无水乙醇的体积比为3:1:2。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)是将金电极分别用0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末打磨抛光，每次打磨后用水洗净，再分别于硝酸、丙酮和水中各超声洗涤，干燥，备用。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，将步骤(1)制备的氧化石墨烯ZnO凝胶-凝胶复合物滴涂于步骤(2)所得预处理的电极表面，晾干后，浸入金纳米管溶液中浸泡2小时，然后清洗，再在金纳米管修饰的电极表面滴加浓度为1.5μmol/L的锁核酸溶液，固定后清洗，最后用1mmol/L的巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，制备成氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的金电极。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，将10mmol/L锁核酸探针按体积比为6：50加入到金纳米管溶液中，振荡混匀24小时、充分反应，然后将反应液在4℃、1500rpm条件下离心20min，收集沉淀物，沉淀物用PBS洗涤后再离心，得信号放大探针，溶于PBS溶液中，保存备用。
8.检测NDM-1的电化学生物传感器，其特征在于：包括工作电极、对电极、参比电极和测试底液；所述工作电极为权利要求1或2所述基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极，所述对电极为铂电极，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述测试底液为pH7.4的含2mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和5mmolKCl的PBS溶液。
9.权利要求1～2任一项所述基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极或权利要求8所述检测NDM-1的电化学生物传感器在检测NDM-1基因中的应用。
10.利用权利要求8所述检测NDM-1的电化学生物传感器检测NDM-1基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：将基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极与样品溶液杂交后，然后以基于氧化石墨烯、金纳米管和锁核酸探针修饰的电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，pH 7.4的含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS溶液为测试底液构建电化学生物传感器，采用循环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-0.3V～0.7V，电位扫描速率为50mv/s，根据杂交前后峰电流变化检测NDM-1基因浓度。
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