WO2014058355A1 - Способ количественного анализа терминальных нуклеотидов g-цепи теломерной днк человека - Google Patents

Способ количественного анализа терминальных нуклеотидов g-цепи теломерной днк человека Download PDF

Info

Publication number
WO2014058355A1
WO2014058355A1 PCT/RU2013/000892 RU2013000892W WO2014058355A1 WO 2014058355 A1 WO2014058355 A1 WO 2014058355A1 RU 2013000892 W RU2013000892 W RU 2013000892W WO 2014058355 A1 WO2014058355 A1 WO 2014058355A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
chain
analysis
telomeric
overhangs
Prior art date
Application number
PCT/RU2013/000892
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2014058355A8 (ru
Inventor
Елена Андреевна ЧИРЯСОВА
Original Assignee
Chiryasova Elena Andreyevna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiryasova Elena Andreyevna filed Critical Chiryasova Elena Andreyevna
Priority to EP13846152.0A priority Critical patent/EP2907872B1/en
Publication of WO2014058355A1 publication Critical patent/WO2014058355A1/ru
Publication of WO2014058355A8 publication Critical patent/WO2014058355A8/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to the field of genetics and molecular biology of a cell, in particular, to molecular diagnostics of processes occurring in the terminal regions of telomeres of chromosomes during the cell cycle.
  • the claimed method is used to build profiles of terminal nucleotides of the terminal regions of the G-chain of human telomeric DNA, displaying their quantitative percentage ratio.
  • the resulting profiles are proliferative markers that indicate the activation or inhibition of cell division processes and control the duration of the cell cycle.
  • the invention is a type of DNA diagnosis of the proliferative status of cells, tissues and the body as a whole.
  • the method can find application in the diagnosis and treatment of cancer, in the determination and monitoring of the immune status of the human body, in gerontology, cosmetology, dermatology, transplantation, cell biotechnology and other areas where monitoring and targeted effects on cell division are required.
  • the object of the study of this invention is the terminal single-stranded portions of the G-chain of telomeric DNA, referred to as "overhangs" (from the English overhang "appendage").
  • overhangs from the English overhang "appendage"
  • two methods are known for identifying terminal nucleotides of G-overhangs of telomeric DNA based on the use of the ligation principle. These methods have significant methodological limitations associated with the impossibility of direct ligation to the free single chain 3'-end of the overhang.
  • this method is based on ligation with the unique oligo universal sequence, which pre-hybridizes with the complementary region of the Guide oligo sequence.
  • the authors developed six variants of Guide oligos sequences labeled with 32 P and containing, in addition to the complementary Unique oligo region, a five-nucleotide region corresponding to a possible variant of G-overhang termination.
  • Unique oligo and Guide oligo 1 sequences were first mixed in equimolar concentration. Then the obtained duplexes carrying a single-stranded region, from 5 nucleotides - one.
  • telomeric repeat variants six telomeric repeat variants, was added to the analyzed sample and ligation was performed using T4 DNA ligase. Ligation was performed at 16 ° C. overnight. After removal of the non-proliferated duplexes, the procedure was completed for completing the 3'-end of the Guide oligo sequence along the entire length of the overhang matrix using T4 DNA polymerase.
  • the criterion for the presence of one or another variant of overhang termination was the presence of corresponding fragments of labeled DNA, which could be synthesized only on condition of ligation and full correspondence of the 5'-end of the Unique oligo sequence and the 3'-end of the overhang. The presence of the resulting fragments was evaluated by the presence of a label in a polyacrylamide gel.
  • nick formation it is necessary that the guide oligo five-nucleotide region, complementary to the telomeric repeat of the overhang, be annealed at its very end.
  • Tetrahymena G-overhangs from 14 to 27 acting, the possibility of annealing to the left of the terminal prime site is not excluded.
  • the article suggests methods that allow us to study the terminal nucleotides of the ends of chromosomes for both DNA chains.
  • the Primer-Ligation Assay method was used, as well as a modification of the Single Telomere length analysis (C strand STELA) method, which are based on the principle of ligation to the free 5'-end of the C chain.
  • C strand STELA Single Telomere length analysis
  • ⁇ the article proposed ⁇ an appropriate modification of the STELA method, intended for the study of the G-rich strand of telomeric DNA (G strand STELA). This method is the closest analogue of the claimed invention.
  • each cassette included a section of 7 acting in length, corresponding to one of six variants of telomeric endings, and a sequence complementary to the universal reverse Gteltail primer.
  • the ligation of each of the six variants of cassettes was carried out only with full correspondence of its 5'-end and the 3'-end of the studied G-rich chain.
  • a reverse Gteltail primer and a direct universal subtelomeric primer specific for the region of the subtelomeric region of chromosomes were used.
  • DNA fragments separated in a denaturing agarose gel were transferred onto a nylon filter and hybridized with a 3 P-labeled subtelomeric probe formed during PCR using direct and reverse subtelomeric primers.
  • a prerequisite is the terminal annealing of the Guide platform sequence at the end of the overhang with the formation of artificial 5'-overhangs, the formation of which depends on hybridization conditions, the length of the platform, and the size of the overhang matrix.
  • the resulting 5'-overhang should be no more than 30 acting in length, since a larger size will create conditions for unstable annealing of the platform. In this case, shorter overhangs with a length of 40-50 nucleotides will receive a greater advantage in ligation than longer ones. Only such a length of the Z'-overhang provides an unambiguous formation of the 5'-overhang, sufficient for further successful analysis.
  • a difficult moment in the considered method is the analysis of the shortest overhangs of less than 30 nucleotides due to the formation of an unstable duplex during hybridization with a high temperature of 70 ° C. This limitation is partially removed by lowering the initial hybridization temperature to room temperature, which was implemented by the authors much later, in 2009.
  • the G strand STELA method was used only to determine telomere length without identifying terminal nucleotides (Yong Zhao, Agnel J. Sfeir et al. Telomere extension occurs at most chromosome ends and is uncoupled from fill-in in human cancer cells. Cell Vol. 138, No.3, 2009, pp. 463-475.).
  • telomeric G-overhang population is represented by single-chain fragments of more than one hundred and even several hundred nucleotides in length. With a length of over 60 n.a. probable annealing of several units of the platform ; over the entire length of the overhang.
  • the possibility of hybridization is always possible: a) with the formation of a blunt end, especially if the studied overhean ends in the GGG-3 'triplet, which is determined by the features of the platform termination for the 5 ' triplet - CCC; b) with the formation of a residual 3'-overhang with a minimum length and with a melting point much less than that chosen by the authors for hybridization and ligation; c) with the formation of a critically small 5'-overhang, 1-3 n.o. long, insufficient for subsequent annealing of G telorettes and ligation.
  • the main disadvantage of the analyzed method lies in the fact that matrices of overhangs of different lengths are ligated with different efficiencies. Ceteris paribus hybridization, some matrices gain an advantage, and ligation of others may be difficult.
  • the next feature of the G strand STELA method which can lead to a significant distortion of the analysis result, is the dependence of the final PCR efficiency on the priming site of the direct subtelomeric primer XpYpE2.
  • the sequence 5 TGTCTCAGGGTCCTAGTG-3 'of this primer according to the BLAST Nucleotide NCBI nucleotide sequence analysis program is present primarily in the subtelomeric region of X and Y chromosomes.
  • Other human chromosomes may have primer sites in the subtelomeric region that differ in degree of homology with the primer sequence, and, therefore, its competitive ability during PCR.
  • the telomeric DNA of those chromosomes that have the largest number of the most homologous sites will receive an advantage during amplification.
  • the DNA of X and Y chromosomes (100% homology in the subtelomeric region) turns out to be.
  • the telomeric DNA of the remaining chromosomes which has lower homology with the XpYpE2 primer sequence, runs the risk of worse amplification against the background of a rather high annealing temperature of 58 ° C. From this it follows that G-overhangs belonging to different chromosomes amplify with different efficiencies, which cannot but affect the final result of the analysis.
  • the success of the analyzed method depends on the degree of telomeric DNA degradation.
  • Final amplification can only be feasible - provided that the region between the direct subtelomeric primer and the reverse G teltail: the primer does not contain double-stranded breaks. These are areas reaching a length of several thousand. nucleotides can be destroyed during DNA extraction. It is also possible that the integrity of the subtelomeric region of individual chromosomes can be destroyed during the processing of genomic DNA with restriction enzyme EcoR1 at the initial stage of analysis.
  • the main technical objective of the invention is to develop a new effective method for the study of terminal nucleotides of the G-rich chain of telomeric DNA to eliminate the disadvantages of existing methods.
  • the technical result of the invention is to increase the specificity and sensitivity of the method, expressed in the possibility of a successful study of the total fraction of G-overhangs of different lengths and to obtain a reliable profile of telomeric DNA terminal nucleotides.
  • the problem is solved by applying a new approach to the study of terminal DNA nucleotides, which consists in combining the amplification of telomeric DNA with subsequent duplex-specific analysis.
  • the essence of the invention lies in the creation of synthetic fluorescently-labeled probes corresponding to six possible variants of telomeric endings.
  • the presence or absence of certain terminal nucleotide variants is detected during the hybridization of probes with the telomeric DNA under study and their cleavage using the duplex-specific nuclease enzyme.
  • the splitting of the probe occurs only if it is fully complementary to the sequence being studied. This ensures a high specificity of the analysis and leads to the flare-up of a specific fluorescent signal in test tubes, which is recorded fluorimetrically.
  • the degree of heating up of the probes corresponding to the six possible variants of telomeric DNA termination serves not only as a qualitative criterion for their presence, but also as a measure of their quantitative ratio.
  • the claimed method includes possible ⁇ methods - registration and interpretation of the analysis results.
  • a signal level estimation result is proposed. present in the form of a "bar graph reflecting the percentage, the content of certain variants of triplet nucleotide endings of G-overhangs and referred to as the" telomeric DNA G-chain terminal nucleotide profile ".
  • the main characteristic of the claimed method is determined by the specifics of the duplex-specific analysis in relation to the object of study of telomeric DNA.
  • Duplex-specific analysis or DSNP analysis is based on the use of the duplex-specific nuclease enzyme (SDS) from hepatopancreas of the king crab, which has the specific ability to split double-stranded DNA and remain inactive with respect to single-stranded DNA.
  • SDSNP method was developed by Russian scientists to analyze single nucleotide polymorphisms of genes and has been successfully used to study point mutations of genes (Shagin DA et al. A Novel Method for SNP Detection Using a New Duplex-Specific Nuclease From Crab Hepatopancreas. Genome Research, 2002, Vol. 12, pp. 1935-1942).
  • duplex-specific nuclease formed the basis of the developed method for studying the polymorphism of terminal nucleotides of the G-chain of human telomeric DNA using DSNP analysis, which formed the basis of the claimed method.
  • the general principle of DSNP analysis is to use short, 10-12 nucleotides long, synthetic probes (signal samples) carrying a fluorescence donor at the 5'-end and a fluorescence quencher at the opposite 3'-end. With the complete complementary interaction of the probe and the target DNA under investigation, the nuclease activity of SDS leads to the flare-up of the detected fluorescent signal. At the same time, a high sensitivity of the method was shown in connection with the ability of a duplex-specific nuclease to distinguish variations in one nucleotide.
  • the studied DNA region is amplified using a polymerase chain reaction, and then an aliquot of the PCR product is mixed with signal samples and incubated in the presence of SDS enzyme.
  • a significant difference between the proposed method and the classical duplex-specific analysis of nucleotide polymorphisms is that it is used to study not the heteronucleotide sequence of DNA genes, but the terminal sections of tandem-repeating telomere DNA.
  • the last property of the object of study determined the fundamental modification of the stages of amplification of the studied telomeric DNA by the polymerase chain reaction using> a special set of primers presented in the sequences SEQ ID NO: 1-5. Extreme 3 'end - the location of the G-overhang does not allow the use of a natural reverse primer. for its amplification.
  • dCTP telomeric repeat
  • TTAGGG natural telomeric repeat
  • RTQ1 effective quencher
  • the efficiency of using one or another variant of labeling will be determined by the spectral characteristics of the fluorophore-associated fluorescence of DNA at the current time of the study.
  • DNA possesses not only known fluorescence in the UV range, but also has a multicolor integrated spectrum of fluorophore-bound fluorescence in the visible range of light waves.
  • the specificity of this fluorescence in each of the colors of the visible spectrum depends on the nucleotide sequence of the DNA.
  • the nucleotide sequence of the probe labeled with a fluorescent dye determines the specificity of its fluorescence in the corresponding spectrum of the visible range, as well as its rate of acceleration during DSNP analysis.
  • the main characteristic of the fluorophore-associated fluorescence properties of DNA is the spectral code, which is the ratio of the fluorescence levels of the main color channels in the visible range of light waves.
  • the specificity of the background fluorescence and cleavage of the FAM-RTQ1 probes used was consistent with the current spectral DNA fluorescence code at that time. It was characterized by a pronounced emission of telomeric DNA fluorescence in the green and red spectra of visible light. In this case, the fadade of the increase in the energy potential in the green spectrum was clearly manifested for telomeric repeats that are part of the probes ending in a different number of guanine residues.
  • probe-specific coefficients were used to process the results of DSNP analysis. They reflected the specificity of probe expansion during their splitting during the DSNP analysis. It was determined by the characteristics of the fluorophore-associated fluorescence of the probe DNA sequence in the spectrum used and directly depended on its nucleotide sequence (See the implementation of the DSNP analysis in Example 1).
  • telomeric DNA using PCR and DSNP analysis.
  • First step From a sample of genomic DNA obtained by any method that preserves its nativeness, a fraction of single-chain telomeric DNA overhangs is separated. For these purposes, a duplex-specific nuclease enzyme is used, the effectiveness of which was shown in a study of the length of telomeric overhangs (Yong Zhao et al. Quantitative telomeric overhang determination using a double-strand specific nuclease. Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, No. . 3). Studies have shown that the use of SDS at a concentration of 0.2 units. for every 5 ⁇ g of genomic DNA, it is possible to efficiently split double-stranded DNA into fragments of no more than 10 base pairs and to preserve the native fraction of single-stranded overhangs.
  • the use of magnetic particles with streptavidin at a concentration of 1 mg / ml manufactured by Sileks ( Russia) with an average binding efficiency of 8 pmol of a three-fold biotinylated product per 10 ⁇ l of particles was proposed. Due to the fact that the precipitation of the fraction of overhangs of different lengths is slower than the binding of short oligonucleotides to particle-probe complexes, it is proposed to use 10 ⁇ l of particles for every 20 ⁇ g of the original genomic DNA. Such an amount is sufficient, even taking into account some loss of magnetic particles during washing.
  • duplex-specific nuclease is used, and the binding of native overhangs to complementary probes is preceded by a preliminary incubation of the latter with magnetic particles coated with streptavidin.
  • the use of washing in a low-salt buffer ensures the effective removal of probes not bound to magnetic particles in the first stage and the remains of double-stranded genomic DNA in the next stage. This sequence of steps provides a reduction in the time of precipitation of overhangs to 1.5 hours compared to the original method of Wright et al., Where the final stage of incubation of a suspension of DNA and magnetic particles was carried out overnight.
  • Raising the temperature of the final elution to 70-75 ° C allows you to more efficiently concentrate the fraction of the studied overhangs in a volume suitable for the further stage of building up the poly (s! C) tail.
  • the use of triple biotin for the modification of the STAASSSTAASSSTAASSST probe provides a stronger bond with streptavidin on magnetic particles during high-temperature elution.
  • any other method from the group of hybridization or sorption including using various membranes, columns, particles, or other surfaces, can be used to immobilize and subsequently remove the studied DNA molecules from their surface.
  • An aqueous eluent containing single-stranded G-overhangs is used as a substrate for the terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme, which extends the mononucleotides to the 3'-end of the chain.
  • dCTP mononucleotides are used as building material.
  • the area of DSNP analysis is the contact area of the natural end of the Z'-overhang and the beginning of the poly (cU) sequence. The duration of the synthesis is selected empirically and is carried out for a time sufficient to complete the sequence length ; 100-200 nucleotides; what is needed ⁇ for ensure the effectiveness of the subsequent deposition of short overhangs during their cleaning.
  • the third stage After. standard reprecipitation procedure. and purification of mononucleotides not included in the dCTP chain, the sample is used for similar construction of the pole (dA) pole (dT) using the dATP / dTTP mononucleotides and the terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme.
  • the combination of successive stages of the completion of the polydeoxycytidyl and polydeoxyoxydenyl (polythymidyl) sequences allows one to separate the investigated contact boundary of the end of the overhang and the nonn (dC) tail from the priming site during subsequent synthesis of copies of the negative chain. Preserving the nativeness of this boundary is the main condition for obtaining adequate analysis results.
  • the minus chain is synthesized using thermostable DNA polymerase and oligo dT 2 5 Adapter primer (SEQ ID NO: 1) in the case of terminal polydeoxyadenylation in the previous step.
  • the synthesis of the negative chain is carried out using oligo dA 2 5 Adapter primer (SEQ ID NO: 2), if the polythymidyl sequence (terminal polyimidylation) was attached in the third step.
  • Both variants of the primers contain at their 5'-end adapter sequence (SEQ ID NO: 3).
  • the adapter any sequence can be used that is not complementary to telomeric repeats and corresponds to the optimal annealing temperature during the synthesis of the negative chain.
  • the number of negative chain synthesis cycles is adjusted to 100-200 cycles, which is important to obtain a sufficient level of fluorescent signal in the final DSNP analysis. The latter condition is especially important with a small initial amount of DNA being analyzed.
  • the fifth stage After purification and deposition of the negative chain fraction, the 3'-end is completed by terminal transferase and dATP mononucleotides if terminal polydeoxydeadenylation of the overheng chain was used in the third stage, or dTTP mononucleotides if its polyimidylation was used.
  • oligo dT 3 o (oligo dA 30 ) primer which can partially anneal as a straight line on the poly (s1A / s1T) sequence located directly behind the adapter.
  • the design of the signal samples was selected taking into account the specifics of the studied area, namely, the boundary between the end of the Z'-overhang and the beginning of the poly () sequence.
  • the signal sample is a synthetic oligonucleotide probe with a length of 10-12 pairs of nucleotides, represented by the plus chain of the G-overhang and corresponding to one of six variants of its termination (SEQ ID NO: 6-11).
  • the structure of the probe intended for duplex-specific analysis assumes the presence of a fluorescence donor molecule at the b ' ⁇ 3'-end and the corresponding fluorescence quencher at the opposite 3' ⁇ ' end.
  • a combination of a carboxyfluorescein dye (FAM) and an RTQ1 quencher were used. It is possible to use other dyes in combination with a quencher and their corresponding fluorescence channels, including multichannel.
  • the background signal is measured, which is then subtracted when normalizing the values of fluorescence gain during the splitting of the signal samples.
  • the hydrolysis of the signal sample is carried out in the presence of a duplex-specific nuclease only when it is fully complementary to the region of the amplified minus chain of the G-overhang.
  • the sample is cleaved predominantly between the fourth and fifth or fifth and sixth nucleotides (Anisimova VE et al. Isolation, characterization and molecular cloning of Duplex-Specific Nuclease from the hepatopancreas of the Kamchatka crab. BMC Biochemistry, 2008, Vol. 9, Na14 ) Spatial separation of the dye and quencher leads to a flare up of fluorescence corresponding to a certain detection channel. For FAM, this is a wavelength of 520 nm in the green range of visible light.
  • the flare-up of a signal in a test tube with a known signal breakdown indicates the presence of the corresponding G-overhang termination. Moreover, not only a qualitative determination of the presence of a particular ending is possible, but also a semi-quantitative measurement of their content. This is very important for tracking. changes in the ratio of different variants of the end of G-overhangs during the cell-cycle.
  • the measurement of the fluorescent signal is carried out in test tubes by any known method using specially designed instruments for this purpose (spectrofluorimeters, photometer-fluorimeters, fluorescence scanners and detectors, fluorescence stereo microscopes, etc.).
  • Interpretation of the results of the splitting of the probes includes the step of normalizing the signals, which consists in subtracting the initial background (background) established before the analysis and multiplying the obtained numerical values by a probe-specific coefficient empirically calculated for each fluorescent probe.
  • the coefficients are calculated when plotting the growth curves of fluorescence over time for each signal sample during the control study of an equimolar mixture of overhangs.
  • synthetic analogues of G-overhangs are used, which have passed all stages of the analysis, starting from the synthesis of the poly (s) tail and ending with the final amplification of the negative chain, as in Example 5.
  • the coefficients are specific for each signal sample separately and for each dye-quencher combination. They represent the probe cleavage rate, which is a constant value for a given period of time for analysis and corresponds to the current spectral code of the fluorophore-bound DNA fluorescence in the visible range. As noted earlier, the coefficients reflect the specificity of the energy potential of the telomeric repeats that make up the probes. It is mainly determined by the spectral code of guanine fluorescence at the time of the study.
  • the following examples of implementation of the invention show the normalization coefficients for six variants of signal samples labeled with a combination of FAM dye and quencher RTQ1, after one and two hours of DSNP analysis (table. 1).
  • the total signal value for each probe is calculated using normalization factors for one and two hours in parallel, and then averaged.
  • the result is presented in the form of a bar graph showing the average percentage of the received signals of each probe from the total signal level received from all the probes.
  • the values are used to plot the percentage of variants of nucleotide endings (terminal triplets), G-overhangs of telomeric DNA, referred to as the terminal nucleotide profile of the G-chain of telomeric DNA (Fig. 2).
  • the essence of the invention is to use a new approach for the quantitative analysis of terminal nucleotides of the G-rich chain of telomeric DNA.
  • the claimed method differs from previously known methods in that: a) the polydeoxy-adenylated (polyimidylated) 3 ′ end of the negative chain is subjected to final amplification, containing the adapter sequence used as a direct primer taken in excess with respect to the inverse poly (aT) / poly (s1A) primer; b) the results are analyzed by hybridization with fluorescently-labeled probes in the presence of a duplex-specific nuclease enzyme; c) the results are recorded according to the degree of splitting of the probes and the level of increase in fluorescence using any hardware-software complex that allows you to display the fluorescence of tubes with probes on a computer screen and quantify the signal level in each of them.
  • the claimed method involves the amplification of the minus chains of G-overhangs of telomeric DNA using specific oligonucleotide primers shown in table 2, and subsequent duplex-specific analysis using a set of specific oligonucleotide probes shown in table 3.
  • Primers SEQ ID NO: 1 and 2 ensure the inclusion of the adapter sequence SEQ ID NO: 3 in the synthesized copies of the minus chains of polydeoxy-adenylated (polyimidylated) matrices of telomeric G-overhangs (stage 4 of the analysis).
  • the primers SEQ ID NO: 4 and 5 in combination with the adapter primer SEQ ID NO: 3 are used for the final PCR amplification of the polydeoxy-adenylated (polyimidylated) minus chains of telomeric G-overhangs (stage 6 of the analysis).
  • Fluorescence-labeled probes of SEQ ID NO: 6-11 are used for duplex-specific analysis of amplified matrices of negative chains of G-telomeric DNA overhangs to identify terminal triplets TAG, AGG, GGG, GGT, GTT and TTA, respectively (7th stage of analysis )
  • F - means a fluorescent label at the 5 ' or 3 ' end
  • Q - indicates a fluorescence quencher molecule (Quencher) at the 3 'or 5'-end.
  • Figure 1 The result of DSNP analysis of an equimolar mixture of synthetic analogues of the telomeric overhang endings in the form of a graphic file (example 5). It is a series of successive images of tubes in the green spectrum obtained using the FDG-001 fluorescence detector. The images of the tubes in the form of circular regions correspond to the optical density measurement zones in the LabWorks program (UVP, England) and are arranged line by line for each probe variant. The first line corresponds to the TAG variant of the termination of the G-chain of telomeric DNA, and the last corresponds to the TTA variant. In each line, the first zone corresponds to the starting value of the background, the second and third zones correspond to signal levels after one and two hours of DSNP analysis, respectively.
  • Figure 2 The result of the final data processing of the DSNP analysis of sample 1 in the form of constructing the profile of the terminal nucleotides of the G-chain of telomeric DNA. Further, when describing the drawings, the profile is understood as the percentage ratio of various variants of nucleotide endings (triplets) of the studied population of G-overhangs of telomeric DNA.
  • Sample 1 presents the genomic DNA isolated from a culture of human peripheral blood lymphocytes, not stimulated by division using phytohemagglutinin (example 1).
  • Figure 3 The result of the final data processing of the DSNP analysis of sample 2 in the form of constructing the profile of the terminal nucleotides of the G-chain of telomeric DNA.
  • Sample 2 presents genomic DNA isolated from a culture of lymphocytes of human peripheral blood, stimulated to divide by treatment with PHA for 2 hours (example 2).
  • Figure 4 The result of the final data processing of the DSNP analysis of sample 3 in the form of constructing the profile of the terminal nucleotides of the G-chain of telomeric DNA.
  • Sample 3 presents genomic DNA isolated from a culture of human peripheral blood lymphocytes stimulated to divide by PHA treatment for 4 hours (example 3).
  • Sample 4 represented by genomic DNA isolated from a culture of human peripheral blood lymphocytes stimulated to divide by treatment with PHA for 11 hours (example 4).
  • FIG. 6 The result of the final data processing of the DSNP analysis of sample 5 in the form of constructing a profile of the terminal nucleotides of the G-chain of telomeric DNA.
  • Sample 5 represented by a mixture of synthetic analogues of the endings of telomeric overhangs in an equimolar ratio (example 5).
  • Figure 7 Combined graph of the dynamics of changes in the profile of the terminal nucleotides of the G-chain of telomeric DNA of blood lymphocytes. The graph is based on the time scale of the effect on the culture of lymphocytes stimulating division of the factor (PHA) during the first eleven hours.
  • PHA lymphocytes stimulating division of the factor
  • Figure 8 The profile of the terminal nucleotides of the G-chain of the telomeric DNA of the leukemic culture Jurkat, synchronized in the mitotic phase.
  • Figure 9 The profile of the terminal nucleotides of the G-chain of the telomeric DNA of the leukemic culture of K-562, synchronized in the mitotic phase.
  • Example 1 Analysis of the terminal nucleotides of the G-chain of human telomeric DNA isolated from a culture of peripheral blood lymphocytes, not stimulated by division using phytohemagglutinin (PHA).
  • PHA phytohemagglutinin
  • lymphocyte culture When analyzing gene expression by RT-PCR, it was found that the used lymphocyte culture was characterized by a low natural level of expression of cyclins D2 and D3. This indicated a slight progression of the G1 phase of the cell cycle, corresponding to early preparation for division in a small part of the cells. Expression of cyclin genes of groups A, B and E was not detected, which indicated the absence of mitosis and the synthetic phase preceding it. In this regard, this lymphocyte culture met the conditions of a non-dividing state and weak activation of preparation for division in a small part of the cells. This information is important for establishing the relationship between the profile of the terminal nucleotides of the G-chain of telomeric DNA and the progression of the cell cycle.
  • telomeric DNA For. of isolating the fraction of single-stranded 3-upregions of the G-chain of telomeric DNA used a sample of genomic DNA isolated using the Diatom TM DNA kit RgerUO (Biocom, Russia). Extraction was carried out in accordance with the recommendations of the manufacturer in some modification. The incubation of the sample in lysis buffer at the first stage of extraction and the final stage of DNA elution was carried out at a temperature of 55 ° C, instead of 65 ° C, in order to avoid DNA denaturation. Next, 20 ⁇ g of genomic DNA was introduced into the reaction mixture, consisting of the following components:
  • duplex-specific nuclease buffer (Euroien, Russia);
  • duplex-specific nuclease (Eurogen, Russia).
  • reaction volume was adjusted to 40 ⁇ l and vortexed gently.
  • the cleavage reaction of double-stranded DNA was carried out at 37 ° C for 2.5 hours.
  • the SDS enzyme was removed from the reaction mixture by 3-fold treatment with a solution of the BlueSorb sorbent (Klonogen, St. Russia). For this, 6 ⁇ l of sorbent was added to the sample each time, the mixture was thoroughly shaken on a vortex and the sorbent was precipitated by short centrifugation, followed by separation of the liquid phase containing DNA.
  • BlueSorb sorbent Klonogen, St. Russia
  • the sample was incubated with magnetic particles carrying oligonucleotide probes complementary to the G-chain repeats of telomeric DNA.
  • magnetic particles carrying oligonucleotide probes complementary to the G-chain repeats of telomeric DNA For these purposes, superparamagnetic particles coated with streptavidin in a concentration of 1 mg / ml manufactured by Sileks ( Russian) and synthetic oligonucleotide probes consisting of the STAASSSTAASSSTAASSSTA sequence containing three biotin molecules at their 5 'end (Syntol, Russia) were used . The experiments showed that on average 10 ⁇ l of magnetic particles bound about 8 picomoles of probe. This amount is more than enough to precipitate single-strand overhangs.
  • the redundancy of the used number of particles and probe relative to the number of telomeric overhangs is necessary, firstly, to ensure the efficiency of binding of magnetic particles and extended telomeric sequences, and secondly, for the convenience of working with the volume of magnetic particles in order to avoid their loss during washing.
  • the magnetic particles were again washed 3 times with a 0.5x washing solution from an unbound probe, suspended in 50 ⁇ l of a 1x solution, and the test DNA sample was added after treatment with nuclease and sorbent.
  • Linking probes to native. a fraction of single-chain G-overhangs was carried out at room temperature for 40 minutes, gently mixing the contents of the tube with a pipette-dispenser every 5-7 minutes. After > this, magnetic particles with immobilized G-overhangs were washed from the residues of double-stranded genomic DNA using a 0.1x washing solution of 200 ⁇ l four times.
  • the magnetic particles were suspended in distilled purified water in a volume of 20 ⁇ l and incubated in an incubator at 70-75 ° C for 5 minutes. Temperature elution was carried out in two stages, each time collecting magnetic particles using a magnetic tripod and selecting the eluent solution with a pipette-dispenser in a new tube. The second time, elution was carried out in a volume of 15 ⁇ l. The combined eluent was used for the synthesis of the poly (c) tail (terminal polydeoxycytidylation) in a volume of 40 ⁇ l of a reaction mixture containing:
  • the volume of the reaction mixture was brought up to 40 ⁇ l using purified distilled water.
  • the reaction was carried out at a temperature of 37 ° C for 40 minutes, by delicately vortexing every 10 minutes.
  • the mixture was thoroughly mixed on a vortex and planted in a freezer at a temperature of -20 ° C for at least 12 hours.
  • Precipitation was carried out by centrifugation at 15 thousand rpm./min for 60 minutes. After careful washing of the precipitate with chilled 70% alcohol in a volume of 300 ⁇ l, centrifugation was repeated at the same speed for 30 minutes. The open-dried pellet was dissolved in 25 ⁇ l of purified water.
  • the polydeoxyoxyadenylation reaction was carried out, with the only difference being that 2 ⁇ l of a 5 mM dATP solution was added instead of the dCTP solution.
  • the reaction was carried out at a temperature of 37 ° C for 30 minutes and reprecipitation of the DNA sample was carried out as described above.
  • the precipitate * was dissolved in 25 ⁇ l of purified distilled water.
  • the synthesis of negative chains was carried out in a volume of 40 ⁇ l on a programmable thermal cycler Tertsik (DNA-Technology, Russia). Sample ⁇ after thorough mixing on a vortex was placed in a 0.5 ml PCR tube containing the following components:
  • thermostable Taq DNA polymerase (Sileks, Russia).
  • the volume of the reaction mixture was adjusted to 40 ⁇ l.
  • the synthesis was carried out in 4 rounds of 50 cycles each with the following temperature conditions: 94 ° C - 40 s, 43 ° C - 30 s, 72 ° C - 40 s.
  • the initial denaturation at 95 ° C was 30 seconds, and in subsequent rounds it increased to two minutes.
  • the final completion of the chain at 72 ° C increased to 3 minutes in the first three rounds and to 5 minutes in the last round.
  • a new batch of 2.5 units of thermostable Taq DNA polymerase enzyme was added before each subsequent round. The total number of minus chain synthesis cycles was 200.
  • the mixture was thoroughly mixed on a vortex and planted in a freezer at a temperature of -20 ° C for at least 12 hours.
  • a tRNA solution as a co-precipitator made it possible to avoid the deposition of unnumbered primers that were not included in the chain.
  • glycogen or linear polyacrylamide for these purposes is not acceptable, since they precipitate short oligonucleotides.
  • Precipitation was carried out by centrifugation at 15 thousand rpm./min for 60 minutes. After washing the precipitate gently with chilled 70% alcohol in a volume of 300 ⁇ l, centrifugation was repeated at the same speed for 30 minutes. The open-dried pellet was dissolved in 25 ⁇ l of purified distilled water.
  • the volume of the reaction mixture was adjusted to 40 ⁇ l using purified distilled water.
  • the reaction was carried out at a temperature of 37 ° C, by delicately mixing the mixture on a vortex every 10 minutes.
  • the synthesis was carried out for 30 minutes without temperature inactivation of the enzyme.
  • the mixture was thoroughly mixed on a vortex and planted in a freezer at a temperature of -20 ° C for at least 12 hours.
  • Precipitation was carried out by centrifugation at 15 thousand v / v for 60 minutes. After delicately washing the precipitate with 70% alcohol in a volume of 300 ⁇ l, centrifugation was repeated at the same speed for 30 minutes. The open-dried pellet was dissolved in 50 ⁇ l of purified water.
  • the reaction of the final asymmetric amplification of the negative chain was carried out in two 0.5 ml microtubes in the final reaction volume of 40 ⁇ l using the Tertsik programmable thermal cycler (DNA-Technology, Russia). After thorough vortex mixing, the sample was divided into two parts and transferred into two PCR tubes, each of which contained a mixture of the following components:
  • thermostable Taq DNA polymerase (Sileks, Russia).
  • the volume of the reaction mixture in each tube was adjusted to 40 ⁇ l and the contents were gently mixed. Amplification was carried out for 20 cycles with the following temperature conditions: 94 ° C - 40 s, 48 ° C - 30 s, 72 ° C - 60 s. The initial denaturation at 95 ° C was 3 minutes, the final chain completion at 72 ° C increased to 5 minutes. An increase in the number of cycles is not recommended, as it can lead to a distortion of the initial correlation of G-overhang ending options.
  • the mixture was thoroughly mixed on a vortex and planted in a freezer at a temperature of -20 ° C for 1.5 hours. Incubation for more time can lead to undesirable excessive deposition of “blank” primers.
  • Precipitation was carried out by centrifugation at 15 thousand rpm./min for 40 minutes. After washing the precipitate with 70% alcohol in a volume of 400 ⁇ l, centrifugation was repeated at the same speed for 20 minutes. The open-dried pellet was dissolved in 90 ⁇ l of purified water.
  • DSNP thin duplex
  • Oligonucleotides were synthesized by Syntol ( Russia) and contained a carboxyfluorescein (FA) molecule at the 5'-end and an RTQ1 fluorescence quencher at the opposite 3'-end.
  • FA carboxyfluorescein
  • the initial stock solution concentrations for each probe were selected empirically. They corresponded to the following concentrations: 10 ⁇ M for SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11; 7.5 ⁇ M for SEQ ID NO: 6; 5 ⁇ M for SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9; 2.5 ⁇ M for SEQ ID NO: 8. It should be noted that the indicated concentrations of the probes, as well as the conditions for conducting and processing the results of the DSNP analysis, met the conditions of the spectral code of the fluorophore-bound DNA fluorescence that existed at the time of the study (December 2010 – October 2011). )
  • DSNP analysis 15 ⁇ l of a carefully mixed aliquot of the sample was added to each tube containing SDS buffer and probe. Immediately after mixing the sample and probes, the background signal of each tube was measured using a hardware-software complex consisting of a FDG-001 fluorescence detector device (a joint development of the author of the patent and the Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Pushchino, Russia) and a data processing program LabWorks 4.6 (UVP Biolmaging Systems, England).
  • FDG-001 fluorescence detector device a hardware-software complex consisting of a FDG-001 fluorescence detector device (a joint development of the author of the patent and the Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Pushchino, Russia) and a data processing program LabWorks 4.6 (UVP Biolmaging Systems, England).
  • the FDG-001 device is designed to detect fluorescence signals in different spectra of visible light.
  • the green fluorescence detection channel of the device corresponded to the spectral characteristics of carboxyfluorescein (FAM) and had a range of exciting radiation equal to 450-490 nm, and the recorded radiation - 510-560 nm.
  • FAM carboxyfluorescein
  • the tube with probes was uniformly illuminated with blue light emitting diodes of the corresponding wavelength.
  • To obtain images of fluorescent tubes light passing through a green interference filter fell into the lens of a WAT-120N monochrome camera (Watec Co. Ltd, Japan). StudiOj M MovieBox video capture card (Pinnacle Systems GmbH, Germany) converted the analogue television signal to digital form and allowed to display test tube images on a computer screen and save it as a graphic file.
  • Processing the obtained data included the following steps:
  • 1st stage subtracting the background signal and obtaining the signal level for each probe after the 1st and 2 hours of analysis;
  • 2nd stage normalization of the signal level by multiplying by the coefficient corresponding to each probe from table 1 (carried out in parallel for the 1st and 2nd hours of analysis);
  • - 3rd stage determination of signal levels of each probe in percent after the 1st and 2 hours of analysis.
  • Stages 1-3 processing the obtained data are presented in table 4.
  • Example 2 Analysis of the terminal nucleotides of the G-chain of human telomeric DNA isolated from a culture of peripheral blood lymphocytes stimulated to divide in the presence of phytohemagglutinin (PHA) for 2 hours. Lymphocyte division was stimulated by adding phytohemagglutinin to RPMI-1640 culture medium at a final concentration of 10 ⁇ g / ml.
  • PHA phytohemagglutinin
  • lymphocyte culture met the conditions of a non-dividing state and a significant activation of early preparation for division.
  • the final result of data processing is presented by a bar graph of the average percentage values of the fluorescent signals of the probes (Fig. 3) and corresponds to the profile of the terminal nucleotides of the G-chain of the telomeric DNA of the studied fraction of lymphocytes stimulated to divide in the presence of PHA for 2 hours.
  • Example 3 Analysis of terminal nucleotides of the G-chain of human telomeric DNA isolated from a culture of peripheral blood lymphocytes stimulated to divide in the presence of phytohemagglutinin (PHA) for 4 hours.
  • PHA phytohemagglutinin
  • the final data processing result is presented by a bar graph of the average percentage values of the fluorescent signals of the probes (Fig. 4) and corresponds to the profile of the terminal nucleotides of the G-chain of the telomeric DNA of the studied fraction of lymphocytes stimulated to divide in the presence of PHA for 4 hours.
  • Table 6 The stages of mathematical data processing (example 3)
  • Example 4 Analysis of terminal nucleotides of the G-chain of human telomeric DNA isolated from a peripheral blood lymphocyte culture stimulated to divide in the presence of phytohemagglutinin (PHA) for 11 hours.
  • PHA phytohemagglutinin
  • cyclin mRNA levels with respect to the mRNA of the normalizing GAPDH gene were obtained: A2 (0.25), B1 (0.95), D2 (1.47), D3 (0.91) and E1 (0.17).
  • another part of the cells was at the synthetic stage of preparation for division (cyclins E1 and A2) and the stage of mitosis (cyclin B1).
  • this culture of lymphocytes was a mixed population of cells located at different stages of the cell cycle. Part of the cells was already in the G1 and S phases even before RNA stimulation. A further progression of the cell cycle led after 11 hours of exposure to PHA to the appearance of synthetic and mitotic phases, respectively.
  • the studied culture is of particular interest, since it allows you to establish the nature of the profile of terminal nucleotides, which exists most of the cell cycle. It allows one to determine which profile exists during the late G1 phase, the synthetic and postsynthetic phases, as well as during mitosis itself, with the exception of the period of the first hours of entering the early G1 phase, which constitutes the trigger mechanism for the initiation of cell division activation.
  • the sequential steps of processing the data obtained during the duplex-specific analysis are presented in Table 7.
  • the final result of the data processing is represented by the profile of the terminal nucleotides of the G-chain of telomeric DNA, isolated from human lymphocyte culture, stimulated to divide in the presence of PHA for 11 hours (Fig. 5).
  • Example 5 Analysis of terminal nucleotides of telomeric DNA of a sample represented by a mixture of synthetic analogues of G-overhang terminations in equimolar concentration. This sample was used as a control to establish the concentration ratios of the probes and the coefficients of normalization of the signal of their splitting during the DSNP analysis.
  • Figure 1 is a graphical representation of the fluorescence of each probe separately after one and two hours of DSNP analysis.
  • the processing of the obtained images was carried out according to the analysis procedure described in Example 1 using the LabWorks program.
  • the successive stages of processing the obtained fluorescence values for each probe and its corresponding terminal end are presented in Table 8.
  • the final result of the data processing is presented by a bar graph of the average percentage values of signal growth during probe splitting (Fig. 6).
  • the resulting diagram corresponds to the profile of terminal nucleotides of the studied equimolar mixture of synthetic analogues of telomeric overhang endings. Table 8.
  • the stages of mathematical data processing (example S)
  • the obtained profile indicates the presence of all variants of triplet nucleotide endings in an equal ratio of approximately 16.7%, which fully corresponds to the initial equimolar ratio in the mixture of synthetic analogues of G-overhang endings.
  • the maximum deviation of the values obtained during this analysis from theoretically expected is not more than 0.5%.
  • the invention may find application in the field of healthcare and science.
  • the description of the use cases of the invention is sufficient for the implementation of the claimed method of DNA diagnostics in laboratory conditions in medical and research institutions.
  • the above examples illustrate the possibility of using the claimed method not only for the qualitative determination of the presence of variants of the nucleotide endings of the G-chain of telomeric DNA, but also for the accurate quantitative assessment of their ratio during the cell cycle.
  • the claimed method is suitable for researching very short overhangs, as well as for longer ones.
  • the effectiveness of its use is shown both for the analysis of synthetic analogues of telomeric overhangs, and for natural fractions of G-overhangs, represented by polynucleotides of various lengths.
  • the claimed method due to the complete departure from the ligation procedure, the dependence of the analysis efficiency on the efficiency of its passage is removed, namely, on the length of the G-overhang matrix, which is observed in the method proposed by Agnel J.
  • the profile corresponded to a culture that was not stimulated to divide by phytohemagglutinin, a largely non-dividing state with weak natural activation at an early stage of preparation for division.
  • This profile is characterized by the presence in a rather large number of endings for triplets TAG and AGG, while the number of TTA endings was no higher than 30%.
  • Such a profile in terms of the percentage of variants of nucleotide endings is partially balanced.
  • Activation of cell division is accompanied by the appearance of an unbalanced nonequilibrium profile of terminal nucleotides, a characteristic feature of which is a sharp increase in the TTA content of the variant of termination of the G-chain of telomeric DNA. Moreover, its amount reaches the level of 60-70%, which was observed in the second and third examples of the invention, where lymphocyte cultures were studied after 2 and 4 hours of exposure to PHA (Fig. 3 and 4).
  • the profile itself resembled the figure of a “symmetrical crown” similar to the profile depicted in Fig. 5.
  • Comparison of such a symmetric profile with the profile obtained in the 1st example proves the fact that the mechanisms of activation of cell division have already been launched in the studied lymphocyte culture. This is evidenced by a drop in the content of AGG variants of the end of telomeric overhangs against the background of a moderate increase in TTA termination.
  • a further trend in the change in the profile of terminal nucleotides upon activation of fission as a result of exposure to a stimulus (PHA) for 2 and 4 hours is demonstrated by Examples 2 and 3.
  • a drop in the number of AGG endings and a simultaneous increase in the TTA of the end variant of telomeric DNA serves as a sign of the onset of activation of cell proliferation and a condition for normal division.
  • the nonequilibrium profile gradually turns into an equilibrium state. balance.
  • This process is clear.
  • the content of TTA of the telomeric DNA termination variant decreased to 18% and approximately equaled the number of TAG variants.
  • the content of AGG and GTT variants was approximately equal to a ratio of 26% each.
  • the obtained profile fully corresponds to the profile of the balanced equilibrium state of terminal nucleotides obtained for cultures that are not activated for the division of lymphocytes resting in the GO phase.
  • Using the claimed method provides a unique opportunity for the dynamic study of changes in the profile of terminal nucleotides due to the exact establishment of their percentage.
  • the ability to build graphs showing changes in the quantitative content of variants of the endings of telomeric overhangs during the cell cycle compares the claimed method from all existing analogues. Tracking such dynamics of changes in the profile of terminal nucleotides made it possible to establish the nature of their occurrence.
  • Fig. 7 where a similar dynamics is shown, it can be seen that the curves corresponding to certain variants of triplet nucleotide endings are wave-like. A change in the quantity of a certain ending variant is associated with changes in neighboring variants.
  • AGG endings as a result of sequential ponucleotide cleavage of AGG- + TAG- TTA.
  • the content of triplets GTT and GGT and GGG slightly fluctuated due to successive transitions of the endings TTA- »GTT- + GGT- * GGG. Similar transitions of adjacent endings to each other are displayed throughout the entire graph Fig. 7. At the same time, their quantitative ratios were strictly observed. If the level of one terminal triplet decreased, then the level of the neighboring triplet with a shift of one or two ⁇ nucleotides increased.
  • nucleotide clock which, on the one hand, provides a trigger mechanism for the activation of fission; and on the other hand, determine the existence of a balanced equilibrium profile of terminal nucleotides * over a longer cell cycle.
  • the existence of a balanced equilibrium profile of terminal nucleotides throughout most of the cell cycle is a protective molecular mechanism of healthy cells. It prevents the premature onset of new cell division and determines the temporal duration of the cell cycle. For healthy peripheral blood lymphocytes stimulated to divide by PHA, it is approximately 48 hours. The following unbalanced nonequilibrium profile cannot occur earlier than a specified number of hours after the start of the initial exposure to the stimulating agent. The onset of a balanced equilibrium state, starting from 10-12 hours after the onset of stimulation of division, and its maintenance during most of the cell cycle are an important diagnostic sign of healthy cells.
  • TTA is the end of the G-chain of telomeric DNA, located at the? - end of most chromosomes, is responsible for activating the expression of genes in them that determine the beginning of cell preparation for division.
  • Fig. 8 For a Jurkat culture characterized by twice the speed 1 fission compared with the other studied culture, was characterized by an extremely, unbalanced profile of terminal nucleotides (Fig. 8). This profile was> represented mainly by the end of TTA (82.3%) and the very slight presence of GTT (15.9%) and GGT (1.8%) of terminal triplets. The absence of other terminal terminal variants, especially AGG and TAG triplets, indicated the blocking of the cycle of ponucleotide transitions of the G-chain ends of telomeric DNA. Partial blocking of transitions of terminal triplets TTA- »GTT-» GGT and complete blocking of transitions GGT- »GGG-» AGG- * TAG resulted in the absence of a balanced equilibrium profile.
  • the K-562 culture also corresponded to an unbalanced profile of terminal nucleotides, but with a lesser degree of imbalance (Fig. 9).
  • Fig. 9 Against the background of the predominance of the TTA triplet (57.5%), there were endings of AGG (22.1%), GGT (14.5%) and GTT (5.9%), which indicated a decrease in the progression of the cycle of terminal nucleotide transitions towards the formation of a balanced equilibrium profile.
  • a characteristic feature of both cultures was the absence of the TAG ending variant, which is apparently due to its complete transition to the TTA triplet.
  • the application of the claimed method allows you to catch the minimum changes in the percentage of certain variants of the nucleotide endings of telomeric DNA and can serve as a universal tool for studying the cell cycle of any cells and tissues.
  • the profiles of the terminal nucleotides of the G-chain of telomeric DNA can be compiled to determine the proliferative status of a variety of cells and tissues in diagnostic and medical institutions, in research laboratories. Drawing up profiles of terminal nucleotides of telomeric DNA of immune cells can reveal the degree of their readiness for division and can be a criterion of the body's immune status.
  • the use of the claimed method for studying the proliferative potential of stem cells, as well as any capable of dividing cells, can be used in transplantation as a criterion for cell survival, in cosmetology, dermatology and gerontology as a factor in the regenerative ability of tissues and the body's potential for rejuvenation.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение предназначено для выявления изменений нуклеотидных окончаний ДНК теломерных областей хромосом,. происходящих в ходе клеточного цикла. Способ основывается на новом подходе без использования процедуры лигирования. Способ включает этапы предварительной экстракции геномной ДНК, выделения фракции однонитевых G-оверхенгов теломерной ДНК и последующую амплификацию их минусовой цепи с дуплекс-специфическим анализом. Этапы амплификации включают модификацию 3'-концов теломерных G-оверхенгов с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и осуществляются с использованием набора праймеров, представленного в последовательностях SEQ ID NO:1-5. Дуплекс-специфический анализ основан на гибридизации минусовых цепей оверхенгов с набором специфических флуоресцентно-меченных зондов (SEQ ID NO:6-11), соответствующих шести возможным вариантам нуклеотидных окончаний G-цепи теломерной ДНК человека. Степень разгорания зондов в присутствии фермента дуплекс-специфической нуклеазы служит критерием присутствия соответствующего варианта нуклеотидного окончания ДНК и мерой его количественного содержания. Полученные профили процентного содержания терминальных триплетов G-цепи теломерной ДНК служат пролиферативными маркерами, указывающими на степень активации деления клетки и определяющими временную продолжительность клеточного цикла. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности и точности количественного анализа терминальных нуклеотидов по сравнению с методами, основанными на лигировании. Способ позволяет получать диагностические результаты в иммунологии, онкологии, трансплантологии, косметологии, дерматологии, геронтологии, клеточной биотехнологии и других областях, заинтересованных в оценке пролиферативного статуса клеток и методах его направленного регулирования.

Description

Способ количественного анализа терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК человека .
Область техники
Изобретение относится к области генетики и молекулярной биологии клетки, в частности, к молекулярной диагностике процессов, происходящих в концевых областях теломер хромосом в ходе клеточного цикла. Заявленный способ используется для построения профилей терминальных нуклеотидов концевых областей G-цепи теломерной ДНК человека, отображающих их количественное процентное соотношение. Полученные профили являются пролиферативными маркерами, указывающими на активацию или угнетение процессов деления клетки и контролирующими продолжительность клеточного цикла.
Изобретение является разновидностью ДНК-диагностики пролиферативного статуса клеток, тканей и организма в целом. Способ может найти применение в диагностике и лечении онкологических заболеваний, в определении и контролировании иммунного статуса организма человека, в геронтологии, косметологии, дерматологии, трансплантологии, клеточной биотехнологии и других областях, где требуется контролирование и направленное воздействие на деление клетки.
Предшествующий уровень техники
Объектом исследования данного изобретения являются концевые однонитевые участки G-цепи теломерной ДНК, именуемые «оверхенгами» (от англ. overhang «довесок»). До настоящего времени известны два способа идентификации терминальных нуклеотидов G- оверхенгов теломерной ДНК на основе использования принципа лигирования. Эти способы имеют существенные методологические ограничения, связанные с невозможностью прямого лигирования к свободному одноцепочечному З'-концу оверхенга.
В 2001 году для исследования этого вопроса у простейшего организма Tetrahymena thermophila был предложен метод Ligation-mediated primer extension protocol, который позволял измерять длину и нуклеотидные окончания G-оверхенгов, содержащих теломерные повторы TTGGGG. Основные сведения приводятся в статье: Naduparambil К. Jacob, Rose Skopp and Carolyn M. Price. G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres.The EMBO Journal, Vol. 20, No.15, 2001 , pp. 4299-4308. Из-за невозможности прямого лигирования к одноцепочечному З'-концу оверхенга в основе этого метода лежит лигирование с универсальной последовательностью Unique oligo, которая предварительно гибридизуется с комплементарной областью Guide oligo последовательности. Авторами были разработаны шесть вариантов Guide oligos последовательностей, меченных с помощью 32Р и содержащих помимо комплементарной Unique oligo области, пятинуклеотидный участок, соответствующий возможному варианту окончания G- оверхенга. Согласно протоколу исследований сначала смешивались Unique oligo и Guide oligo 1 последовательности в эквимолярной концентрации. Затем полученные дуплексы, несущие одноцепочечный участок, из 5 нуклеотидов - одного . из шести вариантов теломерного повтора, добавляли к анализируемому образцу и осуществляли лигирование с помощью Т4 DNA лигазы. Лигирование проводили при 16° С в течение ночи. После удаления непролигированных дуплексов осуществляли процедуру достройки З'-конца Guide oligo последовательности по всей длине матрицы оверхенга с помощью Т4 DNA полимеразы. Критерием присутствия того или иного варианта окончания оверхенга являлось наличие соответствующих фрагментов меченной ДНК, которые могли синтезироваться только при условии лигирования и полного соответствия 5'-конца Unique oligo последовательности и З'-конца оверхенга. Присутствие полученных фрагментов оценивали по наличию метки в полиакриламидном геле.
Критическим моментом для достижения эффективности лигирования, а, следовательно, и успешности рассматриваемого анализа, является образование ник- подобной (nick-like) структуры между 5'-концом Unique oligo последовательности и 3'- концом оверхенга, которая сшивается с помощью лигазы. Для образования ника необходимо, чтобы пятинуклеотидный участок Guide oligo последовательности, комплементарный теломерному повтору оверхенга, отжёгся на самом его конце. Несмотря на короткие размеры G-оверхенгов Tetrahymena от 14 до 27 и.о., не исключена вероятность отжига левее терминального сайта праймирования. Последний фактор, учитывая пространственную двухцепочечную конфигурацию дуплекса, образованного Unique oligo и Guide oligo последовательностями, может мешать дальнейшему отжигу теломерного пятинуклеотидного участка на расположенном правее терминальном сайте праймирования матрицы оверхенга. Эта зависимость эффективности метода от особенностей отжига и лигирования является главным ограничивающим фактором этого метода.
Единственным способом, использовавшимся для идентификации терминальных нуклеотидов хромосом человека, содержащих теломерные повторы TTAGGG, является метод Single Telomere length analysis (STELA), предложенный Agnel J. Sfeir et at. (2005, 2006). Основные сведения приводятся в работе: Agnel J. Sfeir, Weihang Chai, Jerry W. Shay and Woodring E. Wright. Telomere-End Processing: the Terminal Nucleotides of Human Chromosomes. Molecular Cell, Vol.18, 2005, pp. 131-138.
В статье предложены методы, позволяющие исследовать терминальные нуклеотиды концов хромосом для обеих цепей ДНК. Для изучения терминальных нуклеотидов С- богатой цепи использовался метод Primer-Ligation Assay, а также модификация метода Single Telomere length analysis (С strand STELA), которые основаны на принципе лигирования к свободному 5'-концу С-цепи. Большую трудность вызывает исследование G- богатой цепи теломерной ДНК,' так как непосредственное лигирование к одноцепочечному З'-концу ' невозможно. В связи с этим · в статье была предложена · соответствующая модификация STELA метода, предназначенная для целей исследования G-богатой цепи теломерной ДНК (G strand STELA). Этот способ , является самым близким аналогом заявленного изобретения.
В рассматриваемом методе из-за невозможности непосредственного лигирования к одноцепочечному З'-концу оверхенга, так же, как и в предыдущем способе, предложена процедура отжига искусственной последовательности Guide platform [3'-ААТССС-5']ю на матрице комплементарной G-богатой цепи. Но в отличие от способа предложенного N.KJacob et al., отжиг платформы длиной 60 нуклеотидов на матрице З'-оверхенга проходил сразу на первом этапе до гибридизации с другими дополнительными последовательностями. По мнению авторов это обеспечивало образование искусственных 5'-оверхенгов, которые позволяли произвести дальнейшее лигирование синтетических 5'- фосфорилированных кассет (G telorettes) непосредственно к З'-концу оверхенга. Каждая кассета включала участок длиной 7 и.о., соответствующий одному из шести вариантов теломерных окончаний, и последовательность, комплементарную универсальному обратному G teltail праймеру. Лигирование каждой из шести вариантов кассет осуществлялось только при полном соответствии её 5'-конца и З'-конца исследуемой G- богатой цепи. Для последующей амплификации использовался обратный G teltail праймер и прямой универсальный subtelomeric праймер, специфичный для участка субтеломерной области хромосом.
Амплификация пролигированных образцов приводила к образованию продуктов различной длины, которые анализировались в геле с помощью Саузерн-блоттинга и служили мерой присутствия и количественного измерения определённых вариантов окончаний G-богатой цепи теломерной ДНК. Для этого разделённые в денатурирующем агарозном геле фрагменты ДНК переносили на нейлоновый фильтр и гибридизовали с 3 Р- меченной субтеломерной пробой, образованной в ходе ПЦР с использованием прямого и обратного субтеломерного праймеров.
Существенным ограничением рассматриваемого метода, как и метода предложенного для исследования Tetrahymena, является зависимость его эффективности от условий отжига последовательности, комплементарной G-оверхенгу. При этом обязательным условием является терминальный отжиг Guide platform последовательности на конце оверхенга с формированием искусственных 5'-оверхенгов, образование которых зависит от условий гибридизации, длины платформы и размеров матрицы оверхенга.
При прочих равных условиях гибридизации З'-оверхенгов и платформы успешность адекватного анализа разнородной по длине популяции оверхенгов, представляется затруднительным. Эффективность анализа определяется условием, при котором хотя бы одна единица платформы должна образовывать искусственный 5'-оверхенг оптимальной длины не менее 6-7 н.о., что определяется размерами теломерной последовательности в . каждой кассете. При сокращении размеров образующегося 5'-оверхенга до 1-3 н.о. эффективность последующего лигирования при заявленной температуре в 35°С снижается вплоть до отсутствия. В связи с этим преимущество при лигировании получат те кассеты, которые отжигаются с образованием 5'-оверхенгов длиной 5 н.о. и более. При этом в наиболее неблагоприятных для последующего лигирования условиях оказываются оверхенги, оканчивающиеся на триплеты GGG, AGG и TAG.
При этом нужно учитывать, что при гибридизации платформы и оверхенга при заявленной температуре в 70°С образующийся 5'-оверхенг должен быть длиной не более 30 и.о., так как больший размер создаст условия для нестабильного отжига платформы. В этом случае большее преимущество в лигировании получат более короткие оверхенги длиной 40 - 50 нуклеотидов, чем более длинные. Только такая длина З'-оверхенга обеспечивает однозначное формирование 5'-оверхенга, достаточного для дальнейшего успешного анализа.
Затруднительным моментом в рассматриваемой методике представляется анализ самых коротких оверхенгов меньше 30 нуклеотидов из-за образования нестабильного дуплекса при гибридизации с высокой температурой в 70°С. Это ограничение частично снимается при снижении температуры первоначальной гибридизации до комнатной температуры, что было осуществлено авторами гораздо позднее, в работе 2009 года. Однако, в этом исследовании метод G strand STELA использовался только для определения длины теломер без идентификации терминальных нуклеотидов (Yong Zhao, Agnel J.Sfeir et al. Telomere extension occurs at most chromosome ends and is uncoupled from fill-in in human cancer cells. Cell.Vol.138, No.3, 2009, pp. 463-475.).
Возможны случаи, при которых отжиг платформы может приводить к образованию остаточного З'-оверхенга. Вероятность его формирования повышается за счёт преимущественного отжига полноразмерных последовательностей платформы при заявленной высокой температуре гибридизации в 70°С. При этом всегда будут присутствовать такие варианты гибридизации, при которых сайт праймирования крайнего теломерного повтора ААТССС-5' платформы приходится на комплементарный ему последний полноразмерный повтор TTAGGG оверхенга. G-оверхенги, оканчивающиеся на триплет GGG, в результате образования тупого З'-конца, вообще рискуют остаться не пролигированными и полностью выпасть из анализа. Возможно, с этим связана заниженная частота встречаемости этого варианта окончания оверхенга, которую получили авторы в результате образования артефактов лигирования. В подобных жёстких условиях находятся оверхенги, оканчивающиеся на GGT, GTT и ТТА триплеты, так как могут образовывать слишком маленький остаточный З'-участок, недостаточный для отжига ещё одной единицы платформы и последующего лигирования. Значительная . часть популяции теломерных G-оверхенгов представлена одноцепочечными фрагментами длиной больше ста и даже несколько сотен нуклеотидов. При длине свыше 60 н.о. вероятен отжиг нескольких единиц платформы ; по всей протяженности оверхенга. При этом всегда не исключены возможности гибридизации: а) с образованием тупого конца, особенно если исследуемый оверхенг оканчивается на триплет GGG-3', что определяется особенностями окончания платформы на триплет 5'- ССС; б) с формированием остаточного З'-оверхенга с минимальной длиной и с температурой плавления гораздо меньше, чем выбранная авторами для гибридизации и лигирования; в) с образованием критически малого 5'-оверхенга, длиной в 1-3 н.о., недостаточного для последующего отжига G telorettes и лигирования.
Перечисленные факторы могут привести к образованию очень короткого, недостаточного для последующего анализа, 5'-оверхенга, либо к его полному отсутствию. При этом дальнейшее исследование для части оверхенгов становится невозможным и сигнал лигирования оказывается существенно заниженным. Таким образом, главный недостаток анализируемого способа заключается в том, что различные по длине матрицы оверхенгов лигируются с разной эффективностью. При прочих равных условиях гибридизации одни матрицы получают преимущество, а лигирование других может быть затруднено.
Следующей особенностью G strand STELA метода, которая может привести к существенному искажению результата анализа, является зависимость эффективности финальной ПЦР от сайта праймирования прямого субтеломерного праймера XpYpE2. Последовательность 5 TGTCTCAGGGTCCTAGTG-3' этого праймера по данным программы анализа нуклеотидных последовательностей BLAST Nucleotide NCBI присутствует, прежде всего, в субтеломерной области хромосом X и Y. Другие хромосомы человека могут иметь сайты праймирования в субтеломерной области, которые отличаются по степени гомологии с последовательностью праймера, а, следовательно, и своими конкурентными способностями в ходе ПЦР. В связи с этим преимущество при амплификации получит теломерная ДНК тех хромосом, которые обладают самым большим количеством наиболее гомологичных сайтов. В самых выгодных условиях амплификации оказывается ДНК хромосом X и Y (100% гомологии в субтеломерной области). Теломерная ДНК остальных хромосом, имеющая более низкую гомологию с последовательностью XpYpE2 праймера, рискует хуже амплифицироваться на фоне довольно высокой температуры отжига в 58°С. Из этого следует, что G-оверхенги, принадлежащие разным хромосомам, амплифицируются с разной эффективностью, что не может не отразиться на конечном результате анализа.
Кроме того, успешность применения анализируемого метода зависит от степени деградации теломерной ДНК. Конечная амплификация может быть осуществима только - при условии, что район между прямым субтеломерным праймером и обратным G teltail : праймером не содержит двухцепочечных разрывов. Эти области, достигающие длины нескольких тысяч . нуклеотидов, могут подвергаться разрушению в процессе экстракции ДНК. Не исключена также возможность разрушения целостности субтеломерной области отдельных хромосом в ходе обработки геномной ДНК рестриктазой EcoR\ на первоначальном этапе анализа.
Свидетельством того, что лигирование и амплификация в ходе G strand STELA метода каждый раз происходят по-разному, являются полученные авторами фореграммы, в которых наблюдались различные наборы полос при повторах анализа от 2 до 8 раз на каждый вариант окончания G-оверхенга.
Вышеперечисленные недостатки описанного метода, связанные с возникновением артефактов в ходе лигирования и амплификации, могут существенным образом отразиться на конечном результате анализа и привести к неверному определению частот встречаемости вариантов нуклеотидных окончаний G-оверхенга. В итоге это может привести к построению искажённого профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК, играющего ключевую роль в оценке пролиферативного статуса клеток.
Раскрытие изобретения
Основной технической задачей изобретения является разработка нового эффективного метода исследования терминальных нуклеотидов G-богатой цепи теломерной ДНК для устранения недостатков существующих методик.
Техническим результатом изобретения является повышение специфичности и чувствительности метода, выражающихся в возможности успешного исследования тотальной фракции G-оверхенгов разной длины и получения достоверного профиля терминальных нуклеотидов теломерной ДНК.
Поставленная задача решается применением нового подхода к изучению терминальных нуклеотидов ДНК, заключающегося в сочетании амплификации теломерной ДНК с последующим дуплекс-специфическим анализом.
Сущность изобретения заключается в создании синтетических флуоресцентно- меченных зондов, соответствующих шести возможным вариантам теломерных окончаний. Присутствие или отсутствие тех или иных вариантов терминальных нуклеотидов выявляют в ходе гибридизации зондов с изучаемой теломерной ДНК и расщеплении их с помощью фермента дуплекс-специфической нуклеазы. Расщепление зонда происходит только при условии его полного комплементарного соответствия с исследуемой последовательностью. Это обеспечивает высокую специфичность анализа и приводит к разгоранию специфического флуоресцентного сигнала в пробирках, который регистрируется флуориметрически. Степень разгорания зондов, соответствующих шести возможным вариантам окончаний теломерной ДНК, служит не только качественным критерием их присутствия, но и мерой их количественного соотношения. Заявленный способ включает возможные · способы - регистрации и интерпретации результатов анализа. Результат оценки уровня сигналов предлагается . представлять в виде ' столбчатой диаграммы, отражающей процентное , содержание определенных вариантов триплетных нуклеотидных окончаний G-оверхенгов и именуемой «профилем терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК».
Основная характеристика заявленного способа определяется спецификой осуществления дуплекс-специфического анализа применительно к объекту исследования теломерной ДНК. Дуплекс-специфический анализ или DSNP-анализ (от англ. Duplex- specific nuclease preference) основан на использовании фермента дуплекс-специфической нуклеазы (ДСН, DSN) из гепатопанкреаса камчатского краба, обладающего специфической особенностью расщеплять двухцепочечную ДНК и оставаться неактивным в отношении одноцепочечной ДНК. DSNP-метод был разработан российскими учеными для анализа однонуклеотидных полиморфизмов генов и успешно используется для изучения точечных мутаций генов (Shagin D.A. et al. A Novel Method for SNP Detection Using a New Duplex- Specific Nuclease From Crab Hepatopancreas. Genome Research, 2002, Vol.12, pp.1935-1942).
Показано, что эффективность ДСН-гидролиза совершенных ДНК-дуплексов значительно выше, чем несовершенных, содержащих хотя бы одно неспаренное основание. Эта особенность дуплекс-специфической нуклеазы легла в основу разработанного метода исследования полиморфизма терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК человека с помощью DSNP-анализа, который лёг в основу заявленного способа.
Общий принцип DSNP-анализа сводится к использованию коротких, длиной 10-12 нуклеотидов, синтетических зондов (сигнальных проб), несущих донор флуоресценции на 5'-конце и гаситель флуоресценции на противоположном З'-конце. При полном комплементарном взаимодействии зонда и исследуемой ДНК-мишени нуклеазная активность ДСН приводит к разгоранию детектируемого флуоресцентного сигнала. При этом показана высокая чувствительность метода в связи со способностью дуплекс- специфической нуклеазы различать вариации в один нуклеотид. При исследовании однонуклеотидных полиморфизмов при точечных мутациях генов исследуемый участок ДНК амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции, а затем аликвоту ПЦР продукта смешивают с сигнальными пробами и инкубируют в присутствии фермента ДСН.
Существенным отличием заявляемого способа от классического дуплекс- специфического анализа нуклеотидных полиморфизмов является то, что он применяется для исследования не гетеронуклеотидной последовательности ДНК генов, а концевых участков тандемно-повторяющейся ДНК теломер. Последнее свойство объекта исследования определило принципиальную модификацию этапов амплификации исследуемой теломерной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием > специального набора праймеров, представленного в последовательностях SEQ ID NO: 1-5. Крайнее 3 '-концевое - расположение G-оверхенга не позволяет использовать естественный обратный праймер . для его амплификации. Последний факт - вызвал необходимость использования искусственного наращивания З'-конца , с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и мононуклеотидов, что отразилось на структуре сигнальных проб. Разработан набор из шести сигнальных проб, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 6-11, в которых позиция мисматчевой дискриминации располагается на расстоянии 4-5 нуклеотидов от З'-конца в области естественного окончания G-оверхенга и начала мононуклеотидного поли(с ) хвоста, достроенного трансферазой.
Выбор dCTP в качестве строительного материала был обусловлен тем, что это единственный нуклеотид, непредставленный в естественном теломерном повторе TTAGGG человека, и обеспечивающий однозначную дискриминацию всех шести возможных вариантов нуклеотидных окончаний G-цепи теломерной ДНК. В примерах осуществления изобретения предложено использование комбинации карбоксифлуоресцеинового красителя (FAM) на 5'-конце и его эффективного гасителя RTQ1 на З'-конце, что позволяло осуществлять количественный анализ всех возможных вариантов окончания G-оверхенгов по интенсивности роста зеленой флуоресценции во времени. При конструировании зондов возможно использование любых красителей и гасителей в соответствующих им областях флуоресценции, в том числе и мультиканально.
При этом эффективность использования того или иного варианта мечения будет определяться спектральными характеристиками флуорофор-связанной флуоресценции ДНК на текущий момент исследования. При разработке заявляемого способа было установлено, что нуклеотидные последовательности ДНК обладают специфической флуоресценцией в видимом диапазоне волн света, связанной с установлением общего квантово-связанного спектра с молекулой флуорофора (красителя). Согласно полученным данным ДНК обладает не только известной флуоресценцией в УФ диапазоне, но и имеет мультицветовой интегрированный спектр флуорофор-связанной флуоресценции в видимом диапазоне волн света. Специфика этой флуоресценции в каждом из цветов видимого спектра зависит от нуклеотидной последовательности ДНК. В связи с этим нуклеотидная последовательность зонда, меченного флуоресцентным красителем, определяет специфику его флуоресценции в соответствующем спектре видимого диапазона, а также скорость его разгорания при проведении DSNP-анализа.
Основной характеристикой флуорофор-связанных флуоресцентных свойств ДНК является спектральный код, который представляет собой соотношение уровней флуоресценции основных цветовых каналов в видимом диапазоне волн света. На момент проведённых в 2010-2011 гг. исследований специфика фоновой флуоресценции и расщепления используемых FAM-RTQ1 зондов соответствовала текущему на тот момент спектральному коду флуоресценции ДНК. Для него было характерно ярко выраженное испускание флуоресценции теломерной ДНК в зелёном и красном спектрах видимого света. При этом чётко проявлялась фадация увеличения энергетического потенциала в зелёном спектре для теломерных повторов, входящих в состав зондов, оканчивающихся на различное число остатков гуанина. Это привело к необходимости использования в примерах осуществления изобретения различной концентрации зондов, меченных карбоксифлуоресцеином для выравнивания их фоновой флуоресценции. Кроме этого при обработке результатов DSNP-анализа использовались зонд-специфические коэффициенты. Они отражали специфику разгорания зондов при их расщеплении в ходе DSNP-анализа. Она определялась особенностями флуорофор-связанной флуоресценции ДНК-последовательности зонда в используемом спектре и напрямую зависела от его нуклеотидной последовательности (См. осуществление DSNP-анализа в примере 1).
Исследования показали, что спектральный код флуоресценции ДНК динамичен во времени и соотношение уровней флуоресценции основных цветовых каналов подвержено колебаниям (флуктуациям). Эти изменения должны своевременно контролироваться, так как напрямую затрагивают уровни фоновой флуоресценции зондов и специфику их разгорания при проведении DSNP-анализа. Адекватность использования концентраций зондов и зонд-специфических коэффициентов при проведении анализа должна проверяться контрольным исследованием эквимолярной смеси синтетических аналогов окончаний оверхенгов, аналогично примеру 5.
Принципиальная схема количественного анализа терминальных нуклеотидов
G-богатой цепи теломерной ДНК с помощью ПЦР и DSNP-анализа Первый этап. Из образца геномной ДНК, полученного любым способом, сохраняющим её нативность, отделяют фракцию одноцепочечных оверхенгов теломерной ДНК. Для этих целей используется фермент дуплекс-специфическая нуклеаза, эффективность которой была показана в работе по исследованию длины теломерных оверхенгов (Yong Zhao et al. Quantitative telomeric overhang determination using a double-strand specific nuclease. Nucleic Acids Research, 2008, Vol.36, No. 3). Исследования показали, что использование ДСН в концентрации 0,2 ед. на каждые 5 мкг геномной ДНК позволяет эффективно расщепить двухцепочечную ДНК до фрагментов длиной не более 10 пар оснований и сохранить нативную фракцию одноцепочечных оверхенгов.
Для концентрирования и очищения оверхенгов от остатков геномной ДНК в заявляемом способе предложена модификация методики с использованием покрытых стрептавидином парамагнитных частиц, описанной в статье Woodring Е. Wright et al. (Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end. Genes&Development. 1997, Vol.11 , No. 21 , pp.2801-2809). По данным авторов 40 мкг геномной ДНК содержит порядка 1 фемтомоля (fmole) теломерных концов. В соответствии с этим для преципитации даже самых длинных оверхенгов достаточно не более 1 пикомоля (pmole) биотинилированного олигонуклеотидного . зонда (СССТАА)4 и 3 мкл покрытых стрептавидином магнитных частиц в концентрации 10 мг/мл.
В примерах осуществления изобретения предложено использование магнитных частиц со стрептавидином в концентрации 1 мг/мл производства фирмы «Силекс» (Россия) с эффективностью связывания в среднем 8 пмоль трёхкратно биотинилированного продукта на 10 мкл частиц. В связи с тем, что преципитация фракции оверхенгов разной длины идёт более медленно, чем связывание коротких олигонуклеотидов с комплексами частица-зонд, предлагается использовать 10 мкл частиц на каждые 20 мкг исходной геномной ДНК. Такого количества достаточно, даже учитывая некоторую потерю магнитных частиц при отмывках.
Для предварительного расщепления геномной ДНК, вместо рестриктазы H/nfl используют дуплекс-специфическую нуклеазу, а связыванию нативных оверхенгов с комлементарными зондами предшествует предварительная инкубация последних с магнитными частицами, покрытыми стрептавидином. При этом использование отмывок в низкосолевом буфере обеспечивает эффективное удаление не связавшихся с магнитными частицами зондов на первом этапе и остатков двухцепочечной геномной ДНК на следующем этапе. Такая последовательность проведения этапов обеспечивает сокращение времени преципитации оверхенгов до 1,5 часов по сравнению с исходной методикой Wright et al., где финальный этап инкубации суспензии ДНК и магнитных частиц осуществлялся в течение ночи. Повышение температуры финальной элюции до 70-75°С позволяет более эффективно сконцентрировать фракцию исследуемых оверхенгов в объеме, подходящем для дальнейшей стадии достраивания поли(с!С) хвоста. При этом использование тройного биотина для модификации зонда СТААСССТААСССТААСССТА обеспечивает более прочную связь со стрептавидином на магнитных частицах при проведении высокотемпературной элюции. Для получения очищенной фракции одноцепочечных оверхенгов может использоваться любой другой способ из группы гибридизационных или сорбционных, в том числе с использованием различных мембран, колонок, частиц или других поверхностей с целью иммобилизации и последующего снятия с их поверхности исследуемых молекул ДНК.
Второй этап. Водный элюент, содержащий одноцепочечные G-оверхенги, используют в качестве субстрата для фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, которая достраивает мононуклеотиды к З'-концу цепи. На этапе достройки полидезоксицитидиловой последовательности (полидезокси- цитидилирования) в качестве строительного материала используют dCTP мононуклеотиды. При этом областью проведения DSNP-анализа является район контакта естественного окончания З'-оверхенга и начала поли(сЮ) последовательности. Продолжительность синтеза подбирается эмпирически и осуществляется в течение времени, достаточного для достраивания последовательности длиной ; 100-200 нуклеотидов; что необходимо · для обеспечения эффективности последующего осаждения коротких оверхенгов при их очистке.
Третий этап. После . стандартной процедуры переосаждения . и очистки от не включившихся в цепь dCTP мононуклеотидов образец используют для аналогичного достраивания πoли(dA) πoли(dT) хвоста с использованием dATP/dTTP мононуклеотидов и фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы. Сочетание последовательных этапов достраивания полидезоксицитидиловой и полидезоксиадениловой (политимидиловой) последовательностей позволяет отделить исследуемую границу контакта окончания оверхенга и nonn(dC) хвоста от сайта праймирования при последующем синтезе копий минусовой цепи. Сохранение нативности этой границы является главным условием получения адекватных результатов анализа.
Четвёртый этап. Осуществляют синтез минусовой цепи с использованием термостабильной ДНК полимеразы и oligo dT25 Adapter праймера (SEQ ID NO: 1) в случае проведения концевого полидезоксиаденилирования на предыдущем этапе. В другом варианте осуществления способа синтез минусовой цепи проводят с использованием oligo dA25 Adapter праймера (SEQ ID NO: 2), если на третьем этапе осуществлялось присоединение политимидиловой последовательности (концевое политимидилирование). Оба варианта праймеров содержат на своем 5'-конце адаптерную последовательность (SEQ ID NO: 3). В качестве адаптера может использоваться любая последовательность, не комплементарная теломерным повторам и соответствующая оптимальной температуре отжига при проведении синтеза минусовой цепи. Количество циклов синтеза минусовой цепи доводят до 100-200 циклов, что важно для получения достаточного уровня флуоресцентного сигнала при финальном DSNP-анализе. Последнее условие особенно важно при небольшом исходном количестве анализируемой ДНК.
Пятый этап. После очистки и осаждения фракции минусовой цепи осуществляют достройку её З'-конца с помощью терминальной трансферазы и dATP мононуклеотидов, если на третьем этапе использовалось концевое полидезоксиаденилирование цепи оверхенга, или dTTP мононуклеотидов, если применялось её политимидилирование.
Шестой этап. Очищенную и переосаждённую фракцию минусовых цепей с достроенным поли^А) хвостом подвергают финальной асимметричной амплификации с использованием адаптерной последовательности (SEQ ID NO: 3), либо аналогичной ей, в качестве прямого праймера и oligo dT30 праймера (SEQ ID NO: 4) в качестве обратного. Во втором варианте осуществления способа минусовые цепи с nonn(dT) хвостом амплифицируют с использованием той же адаптерной последовательности в качестве прямого праймера, но в сочетании с oligo dA30 праймером (SEQ ID NO: 5) в качестве обратного праймера. Количество циклов подбирается экспериментально, не более 18-20, так « чтобы обеспечить сохранение исходного соотношения вариантов окончания ,G- оверхенгов. Использование асимметричной ПЦР с соотношением прямого и обратного праймеров 10:1 обеспечивает преимущественный синтез минусовой цепи и условия её последующей гибридизации с сигнальными пробами. При этом доминирование адаптерного праймера приводит к вытеснению oligo dT3o(oligo dA30) праймера, который может частично отжигаться как прямой на поли(с1А/с1Т)последовательности, расположенной непосредственно за адаптерной.
Седьмой этап. Осуществление DSNP-анализа. Очищенный ПЦР продукт разделяют на шесть равных частей и смешивают с сигнальными пробами в присутствии фермента дуплекс-специфической нуклеазы.
Конструкция сигнальных проб подобрана с учётом специфики исследуемого района, а именно границы между окончанием З'-оверхенга и началом поли( ) последовательности. Сигнальная проба представляет собой синтетический олигонуклеотидный зонд длиной 10-12 пар нуклеотидов, представленный плюсовой цепью G-оверхенга и соответствующий одному из шести вариантов его окончания (SEQ ID NO: 6-11).
Структура зонда, предназначенного для дуплекс-специфического анализа, предполагает наличие молекулы донора флуоресценции на б'^З'-конце и соответствующего ему гасителя флуоресценции на противоположном З'^'-конце. В примерах осуществления изобретения использовалась комбинация красителя карбоксифлуоресцеина (FAM) и гасителя RTQ1. Возможно использование других красителей в комбинации с гасителем и соответствующих им каналов флуоресценции, в том числе и мультиканально.
После внесения сигнальных проб в соответствующую пробирку, содержащую исследуемый образец, до добавления фермента ДСН, проводят измерение фонового сигнала, который затем вычитается при нормировании значений прироста флуоресценции при расщеплении сигнальных проб. Гидролиз сигнальной пробы осуществляется в присутствии дуплекс-специфической нуклеазы только при её полном комплементарном соответствии участку амплифицированной минусовой цепи G-оверхенга. При этом происходит расщепление пробы преимущественно между четвертым и пятым или пятым и шестым нуклеотидами (Anisimova V.E. et al. Isolation, characterization and molecular cloning of Duplex-Specific Nuclease from the hepatopancreas of the Kamchatka crab. BMC Biochemistry, 2008, Vol. 9, Na14). Пространственное разобщение красителя и гасителя приводит к разгоранию флуоресценции, соответствующей определённому каналу детекции. Для красителя FAM это длина волны 520 нм в зеленом диапазоне видимого света.
Разгорание сигнала в пробирке с известной сигнальной пробой свидетельствует о присутствии соответствующего ей окончания G-оверхенга. При этом возможно не только качественное определение присутствия того или иного окончания, но и полуколичественное измерение их содержания. Это очень важно для отслеживания изменений соотношения различных вариантов окончания G-оверхенгов в ходе клеточного - цикла. Измерение флуоресцентного сигнала осуществляют в пробирках любым известным способом с помощью специально предназначенных для этой цели приборов (спектрофлуориметров, фотометров-флуориметров, флуоресцентных сканеров и детекторов, флуоресцентных стереомикроскопов и т.п.).
Интерпретация результатов расщепления зондов включает этап нормирования сигналов, заключающийся в вычитании исходного фона (background), установленного до проведения анализа, и умножении полученных числовых значений на зонд-специфический коэффициент, эмпирически рассчитанный для каждого флуоресцентного зонда. Коэффициенты вычисляют при построении кривых роста флуоресценции во времени для каждой сигнальной пробы в ходе контрольного исследования эквимолярной смеси оверхенгов. Для этой цели используют синтетические аналоги G-оверхенгов, прошедшие все этапы анализа, начиная с синтеза поли(с ) хвоста и заканчивая финальной амплификацией минусовой цепи, аналогично примеру 5.
Коэффициенты специфичны для каждой сигнальной пробы в отдельности и для каждой комбинации «краситель-гаситель». Они отображают скорость расщепления зонда, которая является константной величиной для заданного промежутка времени проведения анализа и соответствуют текущему спектральному коду флуорофор-связанной флуоресценции ДНК в видимом диапазоне. Как уже отмечалось ранее, коэффициенты отражают специфику энергетического потенциала теломерных повторов, входящих в состав зондов. В основном он определяется спектральным кодом флуоресценции гуанина на момент исследования. В приведенных ниже примерах осуществления изобретения показаны коэффициенты нормирования для шести вариантов сигнальных проб, меченных комбинацией красителя FAM и гасителя RTQ1, после одного и двух часов проведения DSNP-анализа (табл. 1).
Изменения спектрального кода флуоресценции ДНК, другие концентрационные соотношения зондов, как и другие варианты мечения, требуют нового вычисления коэффициентов нормирования значений сигналов для каждого зонда. Поэтому периодическое исследование контрольного образца эквимолярной' смеси синтетических аналогов окончаний оверхенгов с целью верификации коэффициентов нормирования сигналов является обязательным. Особую значимость это имеет в условиях нестабильных спектральных свойств ДНК.
Итоговое значение сигнала для каждого зонда вычисляется с использованием коэффициентов нормирования для одного и двух часов параллельно, а затем усредняется. Результат приводится в виде столбчатой диаграммы, отображающей усреднённое процентное содержание полученных сигналов каждого зонда от суммарного уровня сигнала, полученного от всех зондов. Значения используют для построения диаграммы процентного соотношения вариантов нуклеотидных окончаний (терминальных триплетов), G-оверхенгов теломерной ДНК, именуемого профилем терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК (Fig. 2).
Таблица 1. Коэффициенты нормирования сигналов флуоресценции
для зондов FA -RTQ1 в ходе DSNP-анализа
Figure imgf000016_0001
Сущность изобретения заключается в использовании нового подхода для количественного анализа терминальных нуклеотидов G-богатой цепи теломерной ДНК. Заявленный способ отличается от известных ранее тем, что: а) финальной амплификации подвергают полидезоксиаденилированные (политимидилированные) по 3'- концу копии минусовой цепи, содержащие адаптерную последовательность, используемую в качестве прямого праймера, взятого в избытке по отношению к обратному поли(аТ)/поли(с1А) праймеру; б) результаты анализируют с помощью гибридизации с флуоресцентно-меченными зондами в присутствии фермента дуплекс-специфической нуклеазы; в) результаты регистрируют по степени расщепления зондов и уровню разгорания флуоресценции с помощью любого аппаратно-программного комплекса, позволяющего отображать флуоресценцию пробирок с зондами на экране компьютера и количественно определять уровень сигнала в каждой из них.
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод о том, что заявленный способ принципиально отличается от вышеописанного метода G strand STELA, предложенного Agnel J. Sfeir et al., и основывается на совершенно ином подходе с применением фермента дуплекс-специфической нуклеазы без использования процедуры лигирования. Заявленный способ отличается возможностью эффективного анализа всей фракции G-оверхенгов любой длины и разных окончаний. Этот факт является главным техническим результатом заявленного изобретения, выражающимся в повышении специфичности и чувствительности анализа по сравнению с прототипом. В связи с этим заявленный способ позволяет более точно определить соотношение вариантов триплетных окончаний теломерных - оверхенгов. Построение точного г профиля терминальных нуклеотидов . G-цепи теломерной * ДНК является маркером процессов, связанных с делением клетки. Таким образом, заявленный способ может стать новым ' инструментом фундаментальных исследований в области биологии клетки и решения множества прикладных задач в сфере медицины и биотехнологии.
Свободный текст перечня последовательностей
Заявленный способ включает амплификацию минусовых цепей G-оверхенгов теломерной ДНК с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров, представленных в таблице 2, и последующий дуплекс-специфический анализ с использованием набора специфических олигонуклеотидных зондов, приведенных в таблице 3.
Праймеры SEQ ID NO:1 и 2 обеспечивают включение адаптерной последовательности SEQ ID NO:3 в синтезируемые копии минусовых цепей полидезоксиаденилированных (политимидилированных) матриц теломерных G-оверхенгов (4-й этап анализа).
Праймеры SEQ ID NO:4 и 5 в комбинации с адаптерным праймером SEQ ID NO:3 используются для финальной ПЦР амплификации полидезоксиаденилированных (политимидилированных) минусовых цепей теломерных G-оверхенгов (6-й этап анализа).
Флуоресцентно-меченные зонды SEQ ID NO:6-11 используются для проведения дуплекс-специфического анализа амплифицированных матриц минусовых цепей G- оверхенгов теломерной ДНК с целью идентификации терминальных триплетов TAG, AGG, GGG, GGT, GTT и ТТА соответственно (7-й этап анализа).
Таблица 2. Список дезоксирибоолигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров для полимеразной цепной реакции
Figure imgf000017_0001
Таблица 3. Список дезоксирибоолигонуклеотидов, используемых в качестве , флуоресцентно-меченных зондов (сигнальных проб) при проведении DSNP-анализа
Figure imgf000018_0001
Примечание. F - означает флуоресцентную метку на 5' или З'-конце, Q - обозначает молекулу гасителя флуоресценции (Quencher) на 3' или 5'-конце.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Результат DSNP-анализа эквимолярной смеси синтетических аналогов окончаний теломерных оверхенгов в виде графического файла (пример 5). Представляет собой ряды последовательных снимков пробирок в зелёном спектре, полученных с помощью прибора флуоресцентного детектора FDG-001. Изображения пробирок в виде круглых областей соответствуют зонам измерений оптической плотности в программе LabWorks (UVP, England) и расположены построчно для каждого варианта зонда. Первая строка соответствует TAG варианту окончания G-цепи теломерной ДНК, а последняя - ТТА варианту. В каждой строке первая зона соответствует стартовому значению фона, вторая и третья зоны - уровням сигнала после одного и двух часов проведения DSNP-анализа соответственно.
Фигура 2. Результат конечной обработки данных DSNP-анализа образца 1 в виде построения профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК. В дальнейшем при описании чертежей под профилем понимают процентное соотношение различных вариантов нуклеотидных окончаний (триплетов) исследуемой популяции G-оверхенгов теломерной ДНК. Образец 1 представлен геномной ДНК, выделенной из культуры лимфоцитов периферической крови человека, не стимулированной к делению с помощью фитогемагглютинина (пример 1).
Фигура 3. Результат конечной обработки данных DSNP-анализа образца 2 в виде построения профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК. Образец 2, представлен геномной ДНК, выделенной из культуры лимфоцитов периферической крови человека, стимулированной к делению обработкой ФГА в течение 2 часов (пример 2).
Фигура 4. Результат конечной обработки данных DSNP-анализа образца 3 в виде построения профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК. Образец 3, представлен геномной ДНК, выделенной из культуры лимфоцитов периферической крови человека, стимулированной к делению обработкой ФГА в течение 4 часов (пример 3).
Фигура 5. Результат конечной обработки данных DSNP-анализа образца 4 в виде построения профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК. Образец 4, представлен геномной ДНК, выделенной из культуры лимфоцитов периферической крови человека, стимулированной к делению обработкой ФГА в течение 11 часов (пример 4).
Фигура 6. Результат конечной обработки данных DSNP-анализа образца 5 в виде построения профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК. Образец 5, представлен смесью синтетических аналогов окончаний теломерных оверхенгов в эквимолярном соотношении (пример 5).
Фигура 7. Совмещённый график динамики изменений профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК лимфоцитов крови. График построен по шкале времени воздействия на культуру лимфоцитов стимулирующего деление фактора (ФГА) в течение первых одиннадцати часов.
Фигура 8. Профиль терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК лейкемической культуры Jurkat, синхронизированной в митотической фазе.
Фигура 9. Профиль терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК лейкемической культуры К-562, синхронизированной в митотической фазе.
Лучший вариант осуществления изобретения
Пример 1. Анализ терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК человека, выделенной из культуры лимфоцитов периферической крови, не стимулированной к делению с помощью фитогемагглютинина (ФГА).
При анализе экспрессии генов методом ОТ-ПЦР было установлено, что используемая культура лимфоцитов характеризовалась невысоким естественным уровнем экспрессии циклинов D2 и D3. Это свидетельствовало о незначительной прогрессии G1 фазы клеточного цикла, соответствующей ранней подготовке к делению у незначительной части клеток. Экспрессия генов циклинов групп А, В и Е не была детектирована, что говорило об отсутствии митоза и предшествующей ему синтетической фазы. В связи с этим данная культура лимфоцитов удовлетворяла условиям неделящегося состояния и слабой активации подготовки к делению у незначительной части клеток. Эти сведения важны для установления взаимосвязи профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК и прогрессии клеточного цикла.
Для . выделения фракции однонитевых 3 -оверхенгов G-цепи теломерной ДНК использовали образец геномной ДНК, выделенный с помощью набора Diatom™ DNA РгерЮО («Биоком», Россия). Экстракцию проводили в соответствии с рекомендациями - производителя в некоторой модификации. Инкубацию образца в лизирующем буфере на - первом этапе экстракции и финальный этап элюции ДНК проводили при температуре 55°С, - вместо 65°С, во избежание денатурации ДНК. Далее 20 мкг геномной ДНК вносили в реакционную смесь, состоящую из следующих компонентов:
4 мкл буфера для дуплекс-специфической нуклеазы («Евроиен», Россия);
0,8 ед. дуплекс-специфической нуклеазы («Евроген», Россия).
Объём реакционной смеси доводили до 40 мкл и деликатно перемешивали на вортексе.
Реакцию расщепления двухцепочечной ДНК проводили при 37°С в течение 2,5 часов.
Затем фермент ДСН удаляли из реакционной смеси 3-кратной обработкой раствором сорбента BlueSorb («Клоноген», Санкт-Петербург). Для этого к образцу каждый раз добавляли по 6 мкл сорбента, смесь тщательно встряхивали на вортексе и осаждали сорбент кратковременным центрифугированием с последующим отделением жидкой фазы, содержащей ДНК.
После удаления нуклеазы образец инкубировали с магнитными частицами, несущими на своей поверхности олигонуклеотидные зонды, комплементарные повторам G-цепи теломерной ДНК. Для этих целей использовали суперпарамагнитные частицы, покрытые стрептавидином в концентрации 1 мг/мл производства фирмы «Силекс» (Россия) и синтетические олигонуклеотидные зонды, состоящие из последовательности СТААСССТААСССТААСССТА, содержащие на своём 5 '-конце три молекулы биотина («Синтол», Россия). Эксперименты показали, что в среднем 10 мкл магнитных частиц связывали около 8 пикомоль зонда. Этого количества более чем достаточно для преципитации однонитевых оверхенгов. Избыточность используемого количества частиц и зонда по отношению к количеству теломерных оверхенгов необходима, во-первых, для обеспечения эффективности связывания магнитных частиц и протяжённых теломерных последовательностей, а во-вторых, для удобства работы с объёмом магнитных частиц во избежание их потери при отмывках.
Все манипуляции с магнитными частицами производили согласно рекомендациям производителя, используя оригинальные отмывочные растворы и магнитный штатив. Ресуспендированные магнитные частицы в количестве 10 мкл трижды отмывали 0,5х отмывочным раствором по 200 мкл, суспендировали в 100 мкл того же раствора и инкубировали с 10 пикомолями ЗхВюАп-зонда. Конъюгацию стрептавидина и биотина проводили при комнатной температуре в течение 30 минут. При этом образец аккуратно суспендировали с помощью пипетки-дозатора каждые 5-7 минут. Затем магнитные частицы снова отмывали 3 раза 0,5х отмывочным раствором от несвязавшегося зонда, суспендировали в 50 мкл 1х раствора и добавляли исследуемый образец ДНК после обработки нуклеазой и сорбентом. Связывание зондов с нативной . фракцией одноцепочечных G-оверхенгов осуществляли при комнатной температуре в течение 40 минут, аккуратно перемешивая содержимое пробирки с помощью пипетки-дозатора каждые 5-7 минут. После > этого магнитные частицы с иммобилизованными G-оверхенгами отмывали от остатков двухцепочечной геномной ДНК с помощью 0,1х отмывочного раствора по 200 мкл четыре раза. После тщательного удаления остатков отмывочного буфера магнитные частицы суспендировали в дистиллированной очищенной воде в объёме 20 мкл и инкубировали в термостате при 70-75'С в течение 5 минут. Температурную элюцию проводили в два этапа, каждый раз собирая магнитные частицы с помощью магнитного штатива и отбирая раствор элюента пипеткой-дозатором в новую пробирку. Второй раз элюцию осуществляли в объёме 15 мкл. Объединённый элюент использовали для реакции синтеза поли(с ) хвоста (концевого полидезоксицитидилирования) в объёме 40 мкл реакционной смеси, содержащей:
водный элюент оверхенгов;
8 мкл 5х буфера для дезоксинуклеотидилтрансферазы («Силекс», Россия);
2 мкл 5 мМ раствора dCTP («Силекс», Россия);
2,5 ед. терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы («Силекс», Россия).
Объём реакционной смеси при необходимости доводили до 40 мкл, используя очищенную дистиллированную воду.
Реакцию проводили при температуре 37°С в течение 40 минут, осуществляя деликатное перемешивание на вортексе каждые 10 минут.
Без специальной инактивации фермента осуществляли переосаждение образца ДНК, для чего в реакционную смесь последовательно добавляли:
1 мкл раствора соосадителя гликогена с концентрацией 20 мг/мл («Силекс», Россия); 25 мкл 7 М раствора ацетата аммония;
165 мкл 96% охлаждённого этилового спирта.
Смесь тщательно перемешивали на вортексе и высаживали в морозильной камере при температуре -20°С в течение не менее 12 часов.
Осаждение осуществляли центрифугированием при 15 тысячах об./мин в течение 60 минут. После осторожной промывки осадка охлаждённым 70% спиртом в объеме 300 мкл осуществляли повторное центрифугирование при тех же оборотах в течение 30 минут. Подсушенный при открытой пробирке осадок растворяли в 25 мкл очищенной воды.
Далее в этой же пробирке, аналогично описанному выше способу, осуществляли реакцию полидезоксиаденилирования, с единственным отличием, что вместо раствора dCTP добавляли 2 мкл 5 мМ раствора dATP. Реакцию проводили при температуре 37°С в течение 30 минут и осуществляли переосаждение образца ДНК описанным выше методом. После финального центрифугирования осадок* растворяли, в 25 мкл очищенной дистиллированной воды. Реакцию синтеза минусовых цепей проводили в объёме 40 мкл на программируемом термоциклёре «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Образец < после тщательного перемешивания на вортексе помещали в 0,5 мл ПЦР пробирку, содержащую следующие компоненты:
4 мкл 10х буфера для Taq ДНК-полимеразы, содержащего 25 mM MgCI2 («Силекс»,
Россия);
3 мкл 5 мМ раствора dNTP («Силекс», Россия);
4 мкл 20 мкМ раствора праймера SEQ ID NO: 1;
2,5 ед. термостабильной Taq ДНК-полимеразы («Силекс», Россия).
Объём реакционной смеси доводили до 40 мкл. Синтез проводили в 4 раунда по 50 циклов каждый со следующим температурным режимом: 94°С - 40 с, 43°С - 30 с, 72°С - 40 с. В первом раунде первоначальная денатурация при 95°С составляла 30 секунд, а в последующих раундах увеличивалась до двух минут. Завершающая достройка цепи при 72°С увеличивалась до 3 минут в первых трёх раундах и до 5 минут в последнем раунде. Перед проведением каждого последующего раунда добавлялась новая порция фермента термостабильной Taq ДНК-полимеразы в количестве 2,5 ед. Суммарное количество циклов синтеза минусовой цепи составило 200.
После проведения последнего раунда образец переносили в микропробирку объемом 1,5 мл, куда добавляли равный объём хлороформа. После интенсивного встряхивания на вортексе проводили центрифугирование при 10 тысячах об./мин в течение 3 минут. К отобранному супернатанту добавляли:
1 мкл раствора соосадителя тРНК с концентрацией 10 мг/мл («Силекс», Россия); 25 мкл 7М раствора ацетата аммония;
165 мкл 96% охлаждённого этилового спирта.
Смесь тщательно перемешивали на вортексе и высаживали в морозильной камере при температуре -20°С в течение не менее 12 часов. Использование в качестве соосадителя раствора тРНК позволило избежать осаждения не включившихся в цепь «холостых» праймеров. Применение для этих целей гликогена или линейного полиакриламида не приемлемо, так как они осаждают короткие олигонуклеотиды.
Осаждение осуществляли центрифугированием при 15 тысячах об./мин в течение 60 минут. После деликатной промывки осадка охлаждённым 70% спиртом в объеме 300 мкл осуществляли повторное центрифугирование при тех же оборотах в течение 30 минут. Подсушенный при открытой пробирке осадок растворяли в 25 мкл очищенной дистиллированной воды.
Реакцию полидезоксиаденилирования 3 '-конца полученной фракции минусовой цепи проводили в этой же микропробирке, куда последовательно вносили:
8 мкл 5х буфера для дезоксинуклеотидилтрансферазы («Силекс», Россия); ,
4 мкл 5 мМ раствора dATP («Силекс», Россия);- 15 ед. терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы («Силекс»; Россия).
Объём ~ реакционной смеси - доводили до 40 мкл, используя очищенную дистиллированную воду. Реакцию проводили при температуре 37°С, осуществляя деликатное перемешивание смеси на вортексе каждые 10 минут. Синтез осуществляли в течение 30 минут без температурной инактивации фермента.
Сразу после реакции для проведения переосаждения ДНК последовательно добавляли:
1 мкл раствора соосадителя гликогена с концентрацией 20 мг/мл («Силекс», Россия);
25 мкл 7 М раствора ацетата аммония;
165 мкл 96% охлаждённого этилового спирта.
Смесь тщательно перемешивали на вортексе и высаживали в морозильной камере при температуре -20°С в течение не менее 12 часов.
Осаждение осуществляли центрифугированием при 15 тысячах об./ ин в течение 60 минут. После деликатной промывки осадка 70% спиртом в объеме 300 мкл осуществляли повторное центрифугирование при тех же оборотах в течение 30 минут. Подсушенный при открытой пробирке осадок растворяли в 50 мкл очищенной воды.
Реакцию финальной асимметричной амплификации минусовой цепи проводили в двух микропробирках объёмом 0,5 мл в конечном объёме реакции 40 мкл на программируемом термоциклёре «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Образец после тщательного перемешивания на вортексе разделяли на две части и переносили в две ПЦР пробирки, каждая из которых содержала смесь из следующих компонентов:
4 мкл 10х буфера для Taq ДНК-полимеразы, содержащего 25 mM MgCI2 («Силекс», Россия);
4 мкл 5 мМ раствора dNTP («Силекс», Россия);
4 мкл раствора, содержащего смесь адаптерного праймера (SEQ ID NO: 3) и Oligo сТзо праймера (SEQ ID NO: 4) в концентрации 20 мкМ и 2 мкМ соответственно;
5 ед. термостабильной Taq ДНК-полимеразы («Силекс», Россия).
Объём реакционной смеси в каждой пробирке доводили до 40 мкл и деликатно перемешивали содержимое. Амплификацию осуществляли в течение 20 циклов со следующим температурным режимом: 94°С - 40 с, 48°С - 30 с, 72°С - 60 с. Первоначальная денатурация при 95°С составляла 3 минуты, финальная достройка цепи при 72°С увеличивалась до 5 минут. Увеличение количества циклов не рекомендуется, так как может привести к искажению исходного соотношения вариантов окончания G- оверхенгов.
После проведения полимеразной цепной реакции образцы тщательно отбирали из- под масла и переносили в общую микропробирку объемом 1,5 мл, куда добавляли равный объём хлороформа. После интенсивного встряхивания на вортексе проводили центрифугирование - при 10 тысячах - об./мин в течение . 3 минут. К отобранному супернатанту добавляли:
1 ,5 , мкл - раствора ' соосадителя гликогена с концентрацией 20 · мг/мл 1 («Силекс», Россия);
50 мкл 7М раствора ацетата аммония;
329 мкл 96% охлаждённого этилового спирта;
Смесь тщательно перемешивали на вортексе и высаживали в морозильной камере при температуре -20°С в течение 1,5 часов. Инкубирование в течение большего количества времени может привести к нежелательному чрезмерному осаждению «холостых» праймеров.
Осаждение осуществляли центрифугированием при 15 тысячах об./мин в течение 40 минут. После промывки осадка 70% спиртом в объеме 400 мкл осуществляли повторное центрифугирование при тех же оборотах в течение 20 минут. Подсушенный при открытой пробирке осадок растворяли в 90 мкл очищенной воды.
Для проведения дуплекс-специфического (DSNP) анализа готовили 6 тонкостенных
ПЦР пробирок фирмы «Ахудеп» объёмом 0,5 мл, в каждую из которых добавляли:
2 мкл 10х буфера для дуплекс-специфической нуклеазы («Евроген», Россия);
3 мкл раствора одного из 6 зондов, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 6-11 в следующей модификации. Олигонуклеотиды были синтезированы компанией «Синтол» (Россия) и содержали молекулу карбоксифлуоресцеина (FA ) на 5'-конце и гасителя флуоресценции RTQ1 на противоположном З'-конце.
Исходные стоковые концентрации растворов для каждого зонда подбирались эмпирически. Они соответствовали следующим концентрациям: 10 мкМ для SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11; 7,5 мкМ для SEQ ID NO: 6; 5 мкМ для SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9; 2,5 мкМ для SEQ ID NO: 8. Следует отметить, что приведённые концентрации зондов, а также условия проведения и обработки результатов DSNP-анализа удовлетворяли условиям существовавшего на момент исследования спектрального кода флуорофор-связанной флуоресценции ДНК (декабрь 2010-октябрь 2011 гг.).
Существенные изменения спектрального кода требуют перерасчёта значений концентраций стоковых растворов и коэффициентов нормирования сигналов для каждого зонда в таблице 1. Использование других красителей в отличных от зелёного спектрах флуоресценции также требует отдельного установления концентраций растворов зондов и коэффициентов нормирования сигналов в соответствии с текущим спектральным кодом флуоресценции ДНК. Их определение осуществляется в ходе исследования контрольного образца, представляющего собой эквимолярную смесь различных окончаний синтетических аналогов теломерных оверхенгов (пример 5). В связи с возможностями спектральной нестабильности флуоресцентных свойств ДНК периодическое исследование контрольного образца является крайне целесообразным и необходимым. Для проведения DSNP-анализа в каждую пробирку, содержащую ДСН-буфер и зонд, вносили по 15 мкл тщательно перемешанной аликвоты образца. Сразу после смешивания образца и зондов проводилось измерение фонового сигнала (background) каждой пробирки с использованием аппаратно-программного комплекса, состоящего из прибора флуоресцентного детектора FDG-001 (совместная разработка автора патента и института теоретической и экспериментальной биофизики, Пущино, Россия) и программы обработки данных LabWorks 4.6 (UVP Biolmaging Systems, Англия).
Прибор FDG-001 предназначен для выявления сигналов флуоресценции в разных спектрах видимого света. Зелёный канал детекции флуоресценции прибора соответствовал спектральным характеристикам карбоксифлуоресцеина (FAM) и имел диапазон возбуждающего излучения равный 450-490 нм, а регистрируемого излучения - 510-560 нм. Для возбуждения флуоресценции оптической метки пробирка с зондами равномерно освещалась светодиодами синего света соответствующей длины волны. Для получения изображения флуоресцирующих пробирок свет, проходя через зелёный интерференционный светофильтр, попадал в объектив монохромной камеры WAT-120N (Watec Со Ltd, Япония). Плата видеозахвата StudiOjMMovieBox (Pinnacle Systems GmbH, Германия) преобразовывала аналоговый телевизионный сигнал в цифровую форму и позволяла отображать изображения пробирок на экране компьютера и сохранять в виде графического файла.
После сохранения изображения фонового сигнала для каждого зонда в каждую пробирку добавляли по 0,125 ед. фермента дуплекс-специфической нуклеазы (ДСН). Расщепление зондов осуществляли в течение двух часов при 37°С, деликатно перемешивая на вортексе каждые 30 минут. После одного и двух часов проведения анализа осуществляли видеозахват каждой пробирки в виде окружности фиксированной площади подобно изображению Fig.1 , полученному для примера 5.
Ряды последовательных снимков пробирок в зелёном спектре анализировали в программе LabWorks, позволяющей производить измерения уровня оптической плотности заданной области изображения. Полученные с помощью программы величины значимой оптической плотности (Mean Density) в условных единицах служили мерой интенсивности флуоресцентного сигнала зонда в соответствующей пробирке. Для измерения уровня флуоресцентного сигнала возможно применение любых флуориметрических приборов и аппаратно-программных комплексов.
Обработка полученных данных включала следующие этапы:
1-й этап: вычитание фонового сигнала и получение уровня сигнала для каждого зонда после 1-го и 2-х часов проведения анализа;
2-й этап: нормирование уровня сигнала умножением на соответствующий каждому зонду коэффициент из таблицы 1 (осуществляется параллельно для 1-го и 2-х часов проведения анализа); - 3-й этап: определение уровней сигналов каждого зонда в процентах после 1-го и 2-х часов проведения анализа.
Этапы 1-3 обработки полученных данных представлены в таблице 4.
Таблица 4. Этапы математической обработки данных (пример 1)
Figure imgf000026_0001
4-й этап: усреднение процентного содержания уровней сигналов, полученных после одного и двух часов проведения анализа. Результатом конечной обработки данных явилось построение столбчатой диаграммы, отображающей усреднённое процентное соотношение вариантов нуклеотидных окончаний (терминальных триплетов) G-оверхенгов, и именуемой «профилем терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК» (Fig. 2).
Пример 2. Анализ терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК человека, выделенной из культуры лимфоцитов периферической крови, стимулированной к делению в присутствии фитогемагглютинина (ФГА) в течение 2 часов. Стимуляцию деления лимфоцитов осуществляли добавлением фитогемагглютинина к культуральной среде RPMI-1640 в конечной концентрации 10 мкг/мл.
Изучение экспрессии генов циклинов в культуре лимфоцитов методом стандартной ОТ-ПЦР выявило резкое возрастание количества мРНК циклина D2 на фоне отсутствия циклинов А2, В1, D3 и Е1. Это свидетельствовало о значительной прогрессии ранней G1 фазы клеточного цикла у значительной части клеток. Отсутствие детектируемой экспрессии генов циклинов групп А, В и Е свидетельствовало об отсутствии митоза и предшествующей ей синтетической фазы. В связи с этим данная культура лимфоцитов удовлетворяла условиям неделящегося состояния и значительной активации ранней подготовки к делению.
Все этапы анализа проводили аналогично методике, описанной в примере 1. Последовательные этапы обработки данных, полученных в ходе дуплекс-специфического анализа, представлены в таблице 5. Таблица 5. Этапы математической обработки данных (пример 2)
Figure imgf000027_0001
Конечный результат обработки данных представлен столбчатой диаграммой усреднённых процентных значений флуоресцентных сигналов зондов (Fig. 3) и соответствует профилю терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК исследованной фракции лимфоцитов, стимулированной к делению в присутствии ФГА в течение 2 часов.
Пример 3. Анализ терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК человека, выделенной из культуры лимфоцитов периферической крови, стимулированной к делению в присутствии фитогемагглютинина (ФГА) в течение 4 часов.
Изучение экспрессии генов циклинов в этой культуре лимфоцитов так же, как в предыдущем примере, выявило высокий уровень мРНК циклина D2 (1,19) на фоне отсутствия циклинов А2, В1, D3 и Е1. В связи с этим данная культура лимфоцитов, как и культура в предыдущем примере, удовлетворяла условиям неделящегося состояния и значительной активации ранней подготовки к делению.
Все этапы анализа проводили аналогично методике, описанной в примере 1. Последовательные этапы обработки данных, полученных в ходе дуплекс-специфического анализа, представлены в таблице 6.
Конечный результат обработки данных представлен столбчатой диаграммой усреднённых процентных значений флуоресцентных сигналов зондов (Fig. 4) и соответствует профилю терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК исследованной фракции лимфоцитов, стимулированной к делению в присутствии ФГА в течение 4 часов. Таблица 6. Этапы математической обработки данных (пример 3)
Figure imgf000028_0001
Пример 4. Анализ терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК человека, выделенной из культуры лимфоцитов периферической крови, стимулированной к делению в присутствии фитогемагглютинина (ФГА) в течение 11 часов.
Изучение экспрессии генов циклинов в культуре лимфоцитов методом стандартной ОТ-ПЦР выявило присутствие всех детектируемых циклинов. Были получены следующие значения уровней мРНК циклинов по отношению к мРНК нормировочного гена GAPDH: А2 (0,25), В1 (0,95), D2 (1,47), D3 (0,91) и Е1 (0,17). Высокие уровни мРНК циклинов D2 и D3 свидетельствовали о существенной прогрессии G1 фазы клеточного цикла у значительной части клеток. В то же время другая часть клеток находилась на синтетическом этапе подготовки к делению (циклины Е1 и А2) и этапе митоза (циклин В1). Видимо, изначально данная культура лимфоцитов представляла собой смешанную популяцию клеток, находящихся на разных этапах клеточного цикла. Часть клеток ещё до стимуляции РНА уже находилась в G1 и S фазах. Дальнейшая прогрессия клеточного цикла привела через 11 часов воздействия ФГА к появлению синтетической и митотической фаз соответственно.
Исследуемая культура представляет особый интерес, так как позволяет установить характер профиля терминальных нуклеотидов, существующий большую часть клеточного цикла. Она позволяет определить, какой профиль существует в течение поздней G1 фазы, синтетической и постсинтетической фаз, а также во время самого митоза, за исключением периода первых часов вхождения в раннюю G1 фазу, составляющего триггерный механизм начала активации деления клетки.
Все этапы анализа проводили аналогично методике, описанной в примере 1.
Последовательные этапы обработки данных, полученных в ходе дуплекс- специфического анализа, представлены в таблице 7. Конечный результат обработки данных представлен профилем терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК, выделенной из культуры лимфоцитов человека, стимулированной к делению в присутствии ФГА в течение 11 часов (Fig. 5).
Таблица 7. Этапы математической обработки данных (пример 4)
Figure imgf000029_0001
Пример 5. Анализ терминальных нуклеотидов теломерной ДНК образца, представленного смесью синтетических аналогов окончаний G-оверхенгов в эквимолярной концентрации. Данный образец использовался в качестве контрольного для установления концентрационных соотношений зондов и коэффициентов нормирования сигнала их расщепления при проведении DSNP-анализа.
В эппендорфовской микропробирке объемом 1,5 мл готовили смесь анализируемой
ДНК, для чего добавляли по 0,5 пикомоль каждого из шести вариантов окончаний G-оверхенга. Синтетические аналоги оверхенгов представляли собой синтетические дезоксирибоолигонуклеотиды длиной 25 нуклеотидов, синтезированные стандартным фосфорамидитным методом в компании «Евроген» (Россия) и заканчивающиеся на своём З'-конце триплетами: TAG, AGG, GGG, GGT, GTT и ТТА. Смесь использовали для реакции полидезоксицитидилирования в конечном объеме 40 мкл. Все последующие этапы полидезоксиаденилирования, синтеза минусовой цепи и т.д. осуществляли согласно методике, описанной в примере 1.
Фигура 1 представляет собой графическое изображение флуоресценции каждого зонда в отдельности после одного и двух часов проведения DSNP-анализа. Обработку полученных изображений проводили согласно описанной в примере 1 процедуре анализа с помощью программы LabWorks. Последовательные этапы обработки полученных значений флуоресценции для каждого зонда и соответствующего ему терминального окончания представлены в таблице 8. Конечный результат обработки данных представлен столбчатой диаграммой усреднённых процентных значений прироста сигнала при расщеплении зондов (Fig. 6). Полученная диаграмма соответствует профилю терминальных нуклеотидов исследуемой эквимолярной смеси синтетических аналогов окончаний теломерных оверхенгов. Таблица 8. Этапы математической обработки данных (пример S)
Figure imgf000030_0001
Как видно из диаграммы, полученный профиль указывает на присутствие всех вариантов триплетных нуклеотидных окончаний в равном соотношении приблизительно по 16,7%, что полностью соответствует исходному эквимолярному соотношению в смеси синтетических аналогов окончаний G-оверхенгов. Максимальное отклонение полученных в ходе этого анализа значений от теоретически ожидаемых составляет не более 0,5%. Проведение подобных исследований контрольных образцов с известным заранее количественным соотношением окончаний теломерных оверхенгов выявил предел погрешности заявляемого способа не более 1%. Этот факт позволяет применять заявленный способ для получения результатов с высокой степенью достоверности.
Промышленная применимость
Изобретение может найти применение в сфере здравоохранения и науки. Описание вариантов использования изобретения достаточно для осуществления заявленного способа ДНК-диагностики в лабораторных условиях в медицинских и научно- исследовательских учреждениях.
Рассмотренные выше примеры иллюстрируют возможность применения заявленного способа не только для качественного определения присутствия вариантов нуклеотидных окончаний G-цепи теломерной ДНК, но и для точной количественной оценки их соотношения в ходе клеточного цикла. Заявленный способ подходит как для исследования очень коротких оверхенгов, так и для более протяжённых. Показана эффективность его применения как для анализа синтетических аналогов теломерных оверхенгов, так и для естественных фракций G-оверхенгов, представленных разнообразными по длине полинуклеотидами. В заявленном способе за счёт полного ухода от процедуры лигирования, снимается зависимость результативности анализа от эффективности её прохождения, а именно от длины матрицы G-оверхенга, которая наблюдается в способе, предложенном Agnel J. Sfeir et al. Этот факт демонстрирует бесспорное техническое преимущество .заявленного способа перед существующими аналогами. Оно · позволяет выявлять неизвестные ; ранее изменения терминальных нуклеотидов теломерных оверхенгов, происходящие в первые часы после активации клеточного деления. Было установлено существование и взаимный : переход < равновесного и неравновесного состояния сбалансированности профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК человека, который определяет временную продолжительность клеточного цикла.
Были получены ярко выраженные различия между профилем терминальных нуклеотидов в 1-м примере и профилями во 2-м и 3-м примерах. В первом примере профиль соответствовал культуре, не стимулированной к делению с помощью фитогемагглютинина, в основном неделящегося состояния со слабой естественной активацией на раннем этапе подготовки к делению. Для этого профиля характерно присутствие в достаточно большом количестве окончаний на триплеты TAG и AGG, при этом количество ТТА окончания было не выше 30%. Такой профиль по процентному соотношению вариантов нуклеотидных окончаний относится к частично сбалансированным.
Активация клеточного деления сопровождается возникновением несбалансированного неравновесного профиля терминальных нуклеотидов, характерной особенностью которого является резкое возрастание содержания ТТА варианта окончания G-цепи теломерной ДНК. При этом его количество достигает уровня 60-70 %, что наблюдалось во втором и третьем примерах осуществления изобретения, где исследовались культуры лимфоцитов после 2-х и 4-х часов воздействия ФГА (Fig. 3 и 4).
Анализ культур лимфоцитов в фазе покоя (G0) без видимой прогрессии G^ фазы выявил наличие полностью сбалансированного равновесного профиля терминальных нуклеотидов. Для него характерно выполнение следующего соотношения процентного содержания терминальных триплетов:
(TAG=TTA=16-20%) + (GGG=GGT=5-7%) = (AGG=GTT=25-27%).
При этом сам профиль напоминал фигуру «симметричной короны» подобно профилю, изображённому на Fig. 5. Сравнение такого симметричного профиля с профилем, полученным в 1-м примере, доказывает тот факт, что в исследованной культуре лимфоцитов уже были запущены механизмы активации деления клеток. Об этом свидетельствует падение содержания AGG варианта окончания теломерных оверхенгов на фоне умеренного прироста ТТА окончания. Дальнейшую тенденцию изменения профиля терминальных нуклеотидов при активации деления в результате воздействия стимула (ФГА) в течение 2-х и 4-х часов демонстрируют примеры 2 и 3.
Таким образом, падение количества AGG окончания и одновременное возрастание ТТА варианта окончания теломерной ДНК служит признаком начала активации пролиферации клетки и условием нормального прохождения деления. В ходе подготовки клетки к делению, при условии её немалигнизации, неравновесный профиль постепенно переходит в равновесное состояние . сбалансированности. Этот процесс , наглядно . демонстрирует 4-й пример осуществления изобретения, в котором исследовалась культура лимфоцитов после 11 часов воздействия фитогемагглютинина. При этом содержание ТТА варианта окончания теломерной ДНК снизилось до 18 % и приблизительно сравнялось с количеством TAG варианта. Содержание AGG и GTT вариантов составило приблизительно в равном соотношении по 26% каждый. Как видно из диаграммы Fig. 5, полученный профиль полностью соответствует профилю сбалансированного равновесного состояния терминальных нуклеотидов, полученному для культур, не активированных к делению лимфоцитов, покоящихся в GO фазе.
Впервые с помощью заявленного способа было показано, что инициация клеточного деления под воздействием какого-либо стимула, например ФГА, осуществляется мгновенно и сопровождается перестройками терминальных нуклеотидов теломерной ДНК. При этом переход большинства нуклеотидных окончаний G-цепи теломерной ДНК в окончание ТТА является триггерным механизмом запуска подготовки клетки к делению, а именно, перехода GO фазы в раннюю G1 фазу.
Использование заявленного способа предоставляет уникальную возможность динамического исследования изменений профиля терминальных нуклеотидов за счёт точного установления их процентного соотношения. Возможность построения графиков, отображающих изменения количественного содержания вариантов окончаний теломерных оверхенгов в ходе клеточного цикла выгодно отличает заявляемый способ от всех существующих аналогов. Отслеживание подобной динамики изменений профиля терминальных нуклеотидов позволило установить характер их возникновения. При рассмотрении Fig. 7, где изображена подобная динамика видно, что кривые, соответствующие определённым вариантам триплетных нуклеотидных окончаний , имеют волнообразный характер. Изменение количества определённого варианта окончания сопряжено с изменениями соседних вариантов. Это свидетельствует о взаимном переходе одних вариантов окончаний оверхенгов в другие в результате экзонуклеазного воздействия. Такие переходы одних вариантов окончания оверхенга в другие чётко прослеживались в первые 11 часов воздействия стимула к делению и осуществлялись по направлению: AGG-»TAG-»TTA-*GTT->GGT-+GGG -+AGG.
В первые два часа сигнал ТТА окончания стремительно возрастал за счёт TAG и
AGG окончаний в результате последовательного понуклеотидного отщепления AGG-+TAG- TTA. В этот же интервал времени незначительно колебалось содержание триплетов GTT и GGT и GGG за счёт последовательных переходов окончаний TTA-»GTT-+GGT-*GGG. Подобные переходы соседних вариантов окончаний друг в друга отображены на протяжении всего графика Fig. 7. При этом чётко соблюдались их количественные соотношения. Если снижался уровень одного терминального триплета, то возрастал уровень соседнего с ним триплета со сдвигом в один-два < нуклеотида. Существующий механизм понуклеотидного смещения окончаний теломерных оверхенгов является своеобразными «нуклеотидными часами», которые с - одной стороны , обеспечивают триггерный механизм активации деления; а с другой стороны, определяют существование сбалансированного равновесного профиля терминальных нуклеотидов в* течение большего времени клеточного цикла.
Существование сбалансированного равновесного профиля терминальных нуклеотидов на протяжении большей части клеточного цикла является защитным молекулярным механизмом здоровых клеток. Он предотвращает преждевременное начало нового клеточного деления и определяет временную продолжительность клеточного цикла. Для здоровых лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью ФГА, он составляет приблизительно 48 часов. Следующий несбалансированный неравновесный профиль не может возникнуть ранее, чем через установленное количество часов после начала первичного воздействия стимулирующего агента. Наступление сбалансированного равновесного состояния, начиная с 10-12 часов после начала стимуляции деления, и его поддержание в ходе большей части клеточного цикла являются важным диагностическим признаком здоровых клеток.
Сокращение продолжительности клеточного цикла за счёт более раннего наступления следующего неравновесного состояния профиля терминальных нуклеотидов и его существование в течение более длительного времени, чем фаза G1 клеточного цикла, является характерной особенностью малигнизации клеток. При этом нарушения в образовании сбалансированного равновесного профиля терминальных нуклеотидов, а именно блокировка цикла понуклеотидных переходов окончаний G-цепи теломерной ДНК, могут приводить к длительному преобладанию ТТА варианта её окончания. Предположительно ТТА окончание G-цепи теломерной ДНК, находясь на?- конце большинства хромосом, ответственно за активацию в них экспрессии генов, определяющих начало подготовки клетки к делению. В результате длительного преобладания ТТА окончания G-цепи теломерной ДНК создаются условия постоянной активации деления клетки и сокращения продолжительности клеточного цикла, что может являться причиной ракового перерождения.
С помощью заявленного способа было проведено исследование лейкемических культур лимфоцитов человека Jurkat и К-562, синхронизированных в митотической фазе клеточного цикла. Синхронизация клеток осуществлялась в течение 12 часов при добавлении колхицина в культуральную среду RPMI-1640 в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Большая длительность воздействия колхицина обеспечила максимальное накопление клеток в митотической фазе. Синхронизация лейкемических клеток в метафазе митотического деления выявила отсутствие сбалансированного равновесного профиля терминальных нуклеотидов. При этом степень нарушения сбалансированности профиля 4 коррелировала со степенью * злокачественности клеток и - скоростью их размножения. , Для культуры Jurkat, характеризующейся в два раза большей скоростью 1 деления по сравнению с другой исследуемой культурой, был характерен крайне , несбалансированный профиль терминальных нуклеотидов (Fig. 8). Этот профиль был > представлен в основном окончанием ТТА (82,3%) и очень незначительным присутствием GTT (15,9%) и GGT (1,8%) терминальных триплетов. Отсутствие других вариантов терминальных окончаний, особенно AGG и TAG триплетов, свидетельствовало о блокировке цикла понуклеотидных переходов окончаний G-цепи теломерной ДНК. Результатом частичной блокировки переходов терминальных триплетов TTA-»GTT-»GGT и полной блокировки переходов GGT-»GGG-»AGG-*TAG явилось отсутствие образования сбалансированного равновесного профиля.
Культуре К-562 также соответствовал несбалансированный профиль терминальных нуклеотидов, но с меньшей степенью несбалансированности (Fig.9). На фоне преобладания ТТА триплета (57,5%) присутствовали окончания AGG (22,1%), GGT (14,5%) и GTT (5,9%), которые свидетельствовали о снижении прогрессии цикла понуклеотидных переходов окончаний в сторону образования сбалансированного равновесного профиля. Характерной особенностью обоих культур явилось отсутствие TAG варианта окончания, что, видимо, связано с его полным переходом в ТТА триплет.
Таким образом, установление наличия или отсутствия сбалансированного равновесного профиля терминальных нуклеотидов, а также степени его несбалансированности при синхронизации клеток в специфичных для него фазах клеточного цикла (например, митотической), является важным диагностическим критерием в онкологии. Изучение изменений терминальных нуклеотидов в ходе клеточного цикла раковых клеток, а именно, продолжительности существования неравновесного профиля и нарушений, связанных с возникновением его равновесного состояния, может служить признаком, определяющим степень малигнизации клеток.
Применение заявленного способа позволяет уловить минимальные изменения в процентном содержании тех или иных вариантов нуклеотидных окончаний теломерной ДНК и может служить универсальным инструментом исследования клеточного цикла любых клеток и тканей. Профили терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК могут составляться для определения пролиферативного статуса разнообразных клеток и тканей в диагностических и лечебных учреждениях, в научно-исследовательских лабораториях. Составление профилей терминальных нуклеотидов теломерной ДНК иммунных клеток может выявлять степень их готовности к делению и являться критерием иммунного статуса организма. Использование заявленного способа для исследования пролиферативного потенциала стволовых клеток, а также любых способных к делению клеток может найти применение в трансплантологии как критерий приживаемости клеток, в косметологии, дерматологии и геронтологии как фактор регенерационных способностей тканей и потенциала организма к омоложению.

Claims

Формула изобретения ;
1. Способ количественного анализа терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК человека, включающий следующие этапы:
а) экстракция геномной ДНК с последующим выделением фракции 3 '-выступающих однонитевых концов теломерной ДНК (G-оверхенгов) при помощи магнитных частиц с иммобилизованными на их поверхности зондами, комплементарными повторам G-цепи теломерной ДНК;
б) амплификация полученной фракции G-оверхенгов, осуществляемая в следующие подэтапы: 1) З'-модифицирование за счёт присоединения полидезоксицитидиловой и расположенной за ней полидезоксиадениловои последовательностей с помощью фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы; 2) амплификация с использованием праймера SEQ ID NO: 1 с целью получения минусовых копий, содержащих адаптерную последовательность SEQ ID NO: 3; 3) З'-модифицирование минусовых копий за счёт присоединения полидезоксиадениловой последовательности с помощью фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы; 4) финальная ПЦР амплификация минусовых цепей с использованием пары праймеров, указанных в SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, в условиях избытка адаптерной последовательности;
в) проведение дуплекс-специфического анализа полученной фракции минусовых цепей G-оверхенгов с использованием олигонуклеотидных зондов, флуоресцентно- меченных красителем FAM и гасителем RTQ1, соответствующих шести возможным вариантам триплетных нуклеотидных окончаний G-цепи теломерной ДНК человека и указанных в SEQ ID NO: 6-11 ;
г) регистрация результатов дуплекс-специфического анализа с помощью детектора FDG-001 и программы LabWorks 4.6, включающая измерение уровней флуоресценции зондов в ходе гидролиза в присутствии фермента дуплекс-специфической нуклеазы, математическую обработку данных, заключающуюся в нормировании сигналов за счёт вычитания догидролизного фона и умножения на специфические коэффициенты, представленные в таблице, и конечную оценку количественного соотношения уровней сигналов зондов, соответствующих терминальным триплетам G-оверхенгов в виде построения профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК в процентах. Таблица. Коэффициенты нормирования сигналов флуоресценции
для зондов FAM-RTQ1 в ходе DSNP-анализа„
Figure imgf000036_0001
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения фракции теломерных G-оверхенгов на этапе (а) используют способ, сохраняющий нативность одноцепочечной ДНК из группы гибридизационных или сорбционных методов с применением различных мембран, колонок, частиц или других поверхностей с целью иммобилизации и последующего снятия с их поверхности исследуемых молекул.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для амплификации фракции теломерных G-оверхенгов на этапе (б) после полидезоксицитидилирования проводят политимидилирование с помощью фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, далее последовательно осуществляют амплификацию минусовой цепи с использованием праймера SEQ ID NO:2, З'-модифицирование полученных минусовых копий через присоединение политимидиловой последовательности с помощью фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и их финальную амплификацию с использованием пары праймеров, состоящей из указанных в SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:5 последовательностей, при условии избытка адаптерного праймера.
4. Способ по п.1 или 3, отличающийся тем, что для амплификации фракции G- оверхенгов на этапе (б) в качестве адаптерной последовательности, содержащейся в SEQ
ID NO:1-3, используется подходящая по структуре и температуре отжига олигонуклеотидная последовательность, не комплементарная повторам G-цепи теломерной ДНК человека.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что при проведении дуплекс-специфического анализа на этапе (в) вместо зондов, представленных в SEQ ID NO: 6-11 , используются варианты длиной 10-12 нуклеотидов.
6. Способ по п.1,' отличающийся тем, что при проведении дуплекс-специфического , анализа на этапе (в) используется один вид - или сочетание нескольких , видов флуоресцентного мечения зондов с комбинацией «флуорофор-гаситель» на любом из противоположных концов зонда, состоящей - из красителей FITC, FAM, R110, ТЕТ, R6G, HEX, JOE, VIC, YakimaYellow, TAMRA, СуЗ, ROX, SuperROX, Cy 3.5, Cy5, Су 5.5, Cy7, Су 7.5 и аналогичных им и соответствующих гасителей из ряда RTQ, BHQ, Dabcyl и подобных им.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что для регистрации результатов дуплекс- специфического анализа на этапе (г) используются виды аппаратно-программного обеспечения, позволяющие количественно определять уровень значимого флуоресцентного сигнала для каждого зонда, в том числе и мультиканально при сочетании нескольких видов мечения по п.6.
8. Способ по п.1 , отличающийся тем, что математическая обработка уровней сигналов при регистрации результатов дуплекс-специфического анализа на этапе (г) заключается в нормировании значений умножением на коэффициенты, приведённые в таблице, для каждого зонда из группы FA -RTQ1 после 1 и 2 часов проведения анализа.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что математическая обработка уровней сигналов при регистрации результатов дуплекс-специфического анализа на этапе (г) заключается в нормировании значений умножением на коэффициенты, отличные от таблицы и рассчитанные для вариантов зондов в различных концентрационных соотношениях, включая указанные, для групп флуоресцентного мечения по п.6 и соответствующие текущему состоянию спектральных свойств флуорофор-связанной флуоресценции ДНК на момент исследования.
10. Способ по п.1 , отличающийся тем, что полученные в ходе его осуществления результаты применяются для целей медицинской диагностики заболеваний и старения организма, оценки пролиферативных свойств и тканеспецифических функций клеток и тканей, определения прогноза их развития и выбора специфической терапии с использованием в качестве критерия определённого профиля терминальных нуклеотидов G-цепи теломерной ДНК человека.
11. Набор специфических дезоксирибоолигонуклеотидов, представленных в SEQ ID NO: 1-5, используемых в качестве праймеров для амплификации минусовых цепей теломерных G-оверхенгов в ходе ПЦР в способе по п.1.
12. Набор специфических дезоксирибоолигонуклеотидов по п.11, используемых в качестве праймеров для амплификации минусовых цепей теломерных G-оверхенгов в ходе ПЦР, отличающийся тем, что в качестве адаптерной последовательности, содержащейся в SEQ ID NO:1-3, используется подходящая по структуре и температуре отжига дезоксирибоолигонуклеотидная последовательность, не комплементарная повторам G- цепи теломерной ДНК человека.
13. Набор специфических дезоксирибоолигонуклеотидов, представленных в SEQ ID NO: .6-11, используемых в качестве флуоресцентно-меченных зондов при проведении дуплекс-специфического анализа в способе по п.1.
14. Набор специфических дезоксирибоолигонуклеотидов по п.13, используемых в качестве флуоресцентно-меченных зондов длиной 10-12 нуклеотидов.
15. Набор специфических дезоксирибоолигонуклеотидов по п.13, используемых в качестве флуоресцентно-меченных зондов при проведении дуплекс- специфического анализа, в котором применяется один вид или сочетание нескольких видов флуоресцентного мечения с комбинацией «флуорофор-гаситель» на любом из противоположных концов зонда, состоящей из красителей FITC, FAM, R110, ТЕТ, R6G, HEX, JOE, VIC, YakimaYellow, TAMRA, СуЗ, ROX, SuperROX, Cy 3.5, Cy5, Cy 5.5, Cy7, Cy 7.5 и аналогичных им и соответствующих гасителей из ряда RTQ, BHQ, Dabcyl и подобных им.
PCT/RU2013/000892 2012-10-10 2013-10-09 Способ количественного анализа терминальных нуклеотидов g-цепи теломерной днк человека WO2014058355A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13846152.0A EP2907872B1 (en) 2012-10-10 2013-10-09 Methods and compositions for the quantitive analysis of terminal nucleotides of a g chain of human telomeric dna

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012143263 2012-10-10
RU2012143263/10A RU2508407C9 (ru) 2012-10-10 2012-10-10 Способ количественной оценки терминальных нуклеотидов g-цепи теломерной днк человека с помощью полимеразной цепной реакции и дуплекс-специфического анализа, наборы синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов для осуществления этого способа

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2014058355A1 true WO2014058355A1 (ru) 2014-04-17
WO2014058355A8 WO2014058355A8 (ru) 2017-08-17

Family

ID=49119867

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2013/000892 WO2014058355A1 (ru) 2012-10-10 2013-10-09 Способ количественного анализа терминальных нуклеотидов g-цепи теломерной днк человека

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2907872B1 (ru)
RU (1) RU2508407C9 (ru)
WO (1) WO2014058355A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834545A (zh) * 2017-03-13 2017-06-13 苏州市立医院 高危人乳头瘤病毒试剂盒及检测方法
US10604794B2 (en) 2017-05-10 2020-03-31 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Method to measure the shortest telomeres

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009021518A1 (en) * 2007-08-10 2009-02-19 Tina Holding Aps Method for estimating telomere length

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5741677A (en) * 1995-06-07 1998-04-21 Geron Corporation Methods for measuring telomere length
ZA200108461B (en) * 2000-10-27 2002-06-06 Celanese Chem Europe Gmbh Process of telomerizing conjugated dienes.
JP2004536599A (ja) * 2001-06-23 2004-12-09 ユニバーシティ オブ ウェールズ カレッジ オブ メディスン テロメア長の決定方法
US20090306182A1 (en) * 2002-02-20 2009-12-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MAP KINASE GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
RU2434940C1 (ru) * 2010-07-20 2011-11-27 Александр Борисович Смолянинов Способ измерения длины теломер клеток лейкоконцентрата пуповинной крови

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009021518A1 (en) * 2007-08-10 2009-02-19 Tina Holding Aps Method for estimating telomere length

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGNEL J. SFEIR; WEIHANG CHAI; JERRY W. SHAY; WOODRING E. WRIGHT: "Telomere-End Processing: the Terminal Nucleotides of Human Chromosomes", MOLECULAR CELL, vol. 18, 2005, pages 131 - 138
ANISIMOVA V.E. ET AL.: "Isolation, characterisation and molecular cloning of Duplex-Specific Nuclease from the hepatopancreas of Kamchatka crab", BMC BIOCHEMISTRY, vol. 9, 2008, pages NQ14
BAOMIN LI ET AL.: "Sequence-specific processing of telomeric 3' overhangs by the Werner syndrome protein exonuclease activity.", AGING, vol. 1, no. 3, 2009, pages 289 - 302, XP055199434 *
NADUPARAMBIL K. JACOB; ROSE SKOPP; CAROLYN M. PRICE: "G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres", THE EMBO JOURNAL, vol. 20, no. 1 5, 2001, pages 4299 - 4308
NEAL S. YOUNG.: "Telomere Biology and Telomere Diseases: Implications for Practice and Research", HEMATOLOGY, 2010, pages 30 - 35, XP055199427 *
SANDRA ZIELKE ET AL.: "Telomeres and Telomerase Activity in Scleractinian Corals and Symbiodinium spp.", BIOL. BULL., vol. 218, no. 2, 2010, pages 113 - 121, XP055199432, Retrieved from the Internet <URL:http://www.biolbull.Org/content/218/2/113.full> *
SHAGIN D.A. ET AL.: "A Novel Method for SNP Detection Using a New Duplex-Specific Nuclease from Crab Hepatopancreas", GENOME RESEARCH, vol. 12, 2002, pages 1935 - 1942
WOODRING E. WRIGHT ET AL.: "Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end", GENES & DEVELOPMENT., vol. 1 1, no. 21, 1997, pages 2801 - 2809
YONG ZHAO ET AL.: "Quantitative telomeric overhang determination using a double-strand specific nuclease", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 36, no. 3, 2008
YONG ZHAO; AGNEL J. SFEIR ET AL.: "Telomere extension occurs at most chromosome ends and is uncoupled from fill-in in human cancer cells", CELL, vol. 138, no. 3, 2009, pages 463 - 475

Also Published As

Publication number Publication date
EP2907872A4 (en) 2016-02-24
EP2907872B1 (en) 2017-12-20
RU2508407C9 (ru) 2014-05-20
RU2012143263A (ru) 2013-02-20
RU2508407C2 (ru) 2014-02-27
EP2907872A1 (en) 2015-08-19
WO2014058355A8 (ru) 2017-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1941050B1 (en) Methods and composition to generate unique sequence dna probes, iabeling of dna probes and the use of these probes
US11434540B2 (en) Ultraspecific nucleic acid sensors for low-cost liquid biopsies
JP4294092B2 (ja) テロメア長を測定するための方法
ES2656958T3 (es) Medición de la longitud de telómeros en muestras fijadas en formalina, embebidas en parafina (FFPE) por PCR cuantitativa
US20100120097A1 (en) Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US20050186601A1 (en) Nucleic acid detection
RU2753883C2 (ru) Набор зондов для анализа образцов днк и способы их использования
JP7389551B2 (ja) Ｍｅｔエキソン１４欠失の検出と、関連する治療法
JP2002517981A (ja) 核酸配列を検出するための方法
WO2014115779A1 (ja) WT1 mRNAの発現量定量方法
KR101070349B1 (ko) ａｂｌ 유전자 변이의 검출용 프로브 및 그 용도
RU2508407C9 (ru) Способ количественной оценки терминальных нуклеотидов g-цепи теломерной днк человека с помощью полимеразной цепной реакции и дуплекс-специфического анализа, наборы синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов для осуществления этого способа
AU2006226873A1 (en) Nucleic acid detection
JP6153758B2 (ja) 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キット
WO2002074951A1 (fr) Procede de construction d&#39;un marqueur d&#39;adnc servant a identifier un gene exprime, et procede d&#39;analyse de l&#39;expression d&#39;un gene
EP3907298A1 (en) Single nucleic acid for real-time detection of genetic variation of single target gene, and detection method using same
KR101733855B1 (ko) Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법 및 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물
CN110612355B (zh) 用于定量pcr扩增的组合物及其应用
EP2235218B1 (fr) Methode, procede, et kit de diagnostic, pronostic du cancer colorectal
JP7297902B2 (ja) 分析方法及びキット
JP5687414B2 (ja) 多型の識別方法
Freeman Differential Display of Gene Expression
KR20150133016A (ko) 내열성 dna 중합효소를 이용한 유전자 변이 검출 방법
CN117625748A (zh) 一种检测基因序列中单核苷酸多态性的方法
JP2010246400A (ja) 多型の識別方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13846152

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013846152

Country of ref document: EP