CN116287330A

CN116287330A - 一种可检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量pcr芯片及其检测方法

Info

Publication number: CN116287330A
Application number: CN202211722466.3A
Authority: CN
Inventors: 朱永官; 谢舒婷; 丁龙君; 乔敏
Original assignee: Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Current assignee: Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-12-30
Also published as: CN116287330B

Abstract

本发明公开了一种可检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量PCR芯片及其检测方法，所述方法含有能检测微生物毒力基因的引物序列合集，如SEQ ID NO:1‑240为所述目标毒力基因的引物序列，其中SEQ ID NO：1为上游引物，SEQ ID NO：2为对应的下游引物；SEQ ID NO：3为上游引物，SEQ ID NO：4为对应的下游引物；以此类推至SEQ ID NO:240。本发明针对4种典型人畜致病菌的96个毒力基因共设计了120对目标引物。应用该引物集于高通量qPCR平台可实现在相同的扩增条件下一次性进行5184个定量PCR的毒力基因检测，检测效率得到提高，同时具有特异性好，灵敏度高，可重复性强的优点。降低检测成本，可成功应用于环境样品中的微生物毒力基因检测研究。

Description

一种可检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量PCR芯片及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种针对四种典型人畜致病菌的毒力基因的高通量qPCR芯片检测方法。本发明还涉及该芯片在检测特定微生物毒力基因中的应用。

背景技术

由于人畜共患病病原体在全球范围内构成了重大的公共卫生风险，它们携带的毒力基因是环境中潜在风险的基础。肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌被世界卫生组织列为重点关注的典型致病菌。毒素、细胞膜粘附、分泌系统、免疫规避/入侵和铁吸收是毒力基因主要涉及的五种功能。然而，由于缺乏有效和可靠的量化工具，环境中的相关毒力基因的研究仍处于起步阶段。

以往与细菌病原体所携带的毒力因子和毒力基因相关的研究主要是基于传统的单基因PCR或定量PCR(qPCR)扩增，由于其技术限制，很难实现对各种毒力基因和大量样本的快速检测。另一方面，近年来，宏基因组学开始被应用于探索毒力因子的相关研究，但这种方法受到高测序成本和复杂耗时的数据处理和分析的限制，也很难验证测序结果。而基于qPCR的方法更好地平衡了信息量和可行性，有助于各类环境样品的快速准确检测。HT-qPCR方法通过对目的基因进行定向扩增，具有成本更低和信息更丰富的潜在优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于研究环境中特定微生物的毒力基因的高通量定量PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明提供一种可并行检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量PCR引物，针对肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、致病性大肠杆菌和伤寒沙门氏菌这四种典型的人畜致病菌的毒力基因进行引物设计。

本发明提供一种可并行检测多种毒力基因的荧光定量PCR引物组合物，所述组合物由下述120种引物对组成：

A1)由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A2)由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A3)由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A4)由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A5)由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A6)由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A7)由SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A8)由SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A9)由SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A10)由SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A11)由SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A12)由SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A13)由SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A14)由SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A15)由SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A16)由SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A17)由SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A18)由SEQ ID No.35和SEQ ID No.36所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A19)由SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A20)由SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A21)由SEQ ID No.41和SEQ ID No.42所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A22)由SEQ ID No.43和SEQ ID No.44所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A23)由SEQ ID No.45和SEQ ID No.46所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A24)由SEQ ID No.47和SEQ ID No.48所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A25)由SEQ ID No.49和SEQ ID No.50所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A26)由SEQ ID No.51和SEQ ID No.52所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A27)由SEQ ID No.53和SEQ ID No.54所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A28)由SEQ ID No.55和SEQ ID No.56所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A29)由SEQ ID No.57和SEQ ID No.58所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A30)由SEQ ID No.59和SEQ ID No.60所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A31)由SEQ ID No.61和SEQ ID No.62所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A32)由SEQ ID No.63和SEQ ID No.64所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A33)由SEQ ID No.65和SEQ ID No.66所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A34)由SEQ ID No.67和SEQ ID No.68所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A35)由SEQ ID No.69和SEQ ID No.70所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A36)由SEQ ID No.71和SEQ ID No.72所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A37)由SEQ ID No.73和SEQ ID No.74所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A38)由SEQ ID No.75和SEQ ID No.76所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A39)由SEQ ID No.77和SEQ ID No.78所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A40)由SEQ ID No.79和SEQ ID No.80所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A41)由SEQ ID No.81和SEQ ID No.82所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A42)由SEQ ID No.83和SEQ ID No.84所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A43)由SEQ ID No.85和SEQ ID No.86所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A44)由SEQ ID No.87和SEQ ID No.88所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A45)由SEQ ID No.89和SEQ ID No.90所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A46)由SEQ ID No.91和SEQ ID No.92所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A47)由SEQ ID No.93和SEQ ID No.94所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A48)由SEQ ID No.95和SEQ ID No.96所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A49)由SEQ ID No.97和SEQ ID No.98所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A50)由SEQ ID No.99和SEQ ID No.100所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A51)由SEQ ID No.101和SEQ ID No.102所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A52)由SEQ ID No.103和SEQ ID No.104所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A53)由SEQ ID No.105和SEQ ID No.106所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A54)由SEQ ID No.107和SEQ ID No.108所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A55)由SEQ ID No.109和SEQ ID No.110所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A56)由SEQ ID No.111和SEQ ID No.112所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A57)由SEQ ID No.113和SEQ ID No.114所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A58)由SEQ ID No.115和SEQ ID No.116所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A59)由SEQ ID No.117和SEQ ID No.118所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A60)由SEQ ID No.119和SEQ ID No.120所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A61)由SEQ ID No.121和SEQ ID No.122所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A62)由SEQ ID No.123和SEQ ID No.124所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A63)由SEQ ID No.125和SEQ ID No.126所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A64)由SEQ ID No.127和SEQ ID No.128所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A65)由SEQ ID No.129和SEQ ID No.130所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A66)由SEQ ID No.131和SEQ ID No.132所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A67)由SEQ ID No.133和SEQ ID No.134所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A68)由SEQ ID No.135和SEQ ID No.136所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A69)由SEQ ID No.137和SEQ ID No.138所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A70)由SEQ ID No.139和SEQ ID No.140所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A71)由SEQ ID No.141和SEQ ID No.142所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A72)由SEQ ID No.143和SEQ ID No.144所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A73)由SEQ ID No.145和SEQ ID No.146所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A74)由SEQ ID No.147和SEQ ID No.148所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A75)由SEQ ID No.149和SEQ ID No.150所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A76)由SEQ ID No.151和SEQ ID No.152所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A77)由SEQ ID No.153和SEQ ID No.154所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A78)由SEQ ID No.155和SEQ ID No.156所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A79)由SEQ ID No.157和SEQ ID No.158所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A80)由SEQ ID No.159和SEQ ID No.160所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A81)由SEQ ID No.161和SEQ ID No.162所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A82)由SEQ ID No.163和SEQ ID No.164所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A83)由SEQ ID No.165和SEQ ID No.166所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A84)由SEQ ID No.167和SEQ ID No.168所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A85)由SEQ ID No.169和SEQ ID No.170所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A86)由SEQ ID No.171和SEQ ID No.172所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A87)由SEQ ID No.173和SEQ ID No.174所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A88)由SEQ ID No.175和SEQ ID No.176所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A89)由SEQ ID No.177和SEQ ID No.178所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A90)由SEQ ID No.179和SEQ ID No.180所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A91)由SEQ ID No.181和SEQ ID No.182所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A92)由SEQ ID No.183和SEQ ID No.184所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A93)由SEQ ID No.185和SEQ ID No.186所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A94)由SEQ ID No.187和SEQ ID No.188所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A95)由SEQ ID No.189和SEQ ID No.190所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A96)由SEQ ID No.191和SEQ ID No.192所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A97)由SEQ ID No.193和SEQ ID No.194所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A98)由SEQ ID No.195和SEQ ID No.196所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A99)由SEQ ID No.197和SEQ ID No.198所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A100)由SEQ ID No.199和SEQ ID No.200所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A101)由SEQ ID No.201和SEQ ID No.202所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A102)由SEQ ID No.203和SEQ ID No.204所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A103)由SEQ ID No.205和SEQ ID No.206所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A104)由SEQ ID No.207和SEQ ID No.208所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A105)由SEQ ID No.209和SEQ ID No.210所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A106)由SEQ ID No.211和SEQ ID No.212所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A107)由SEQ ID No.213和SEQ ID No.214所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A108)由SEQ ID No.215和SEQ ID No.216所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A109)由SEQ ID No.217和SEQ ID No.218所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A110)由SEQ ID No.219和SEQ ID No.220所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A111)由SEQ ID No.221和SEQ ID No.222所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A112)由SEQ ID No.223和SEQ ID No.224所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A113)由SEQ ID No.225和SEQ ID No.226所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A114)由SEQ ID No.227和SEQ ID No.228所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A115)由SEQ ID No.229和SEQ ID No.230所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A116)由SEQ ID No.231和SEQ ID No.232所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A117)由SEQ ID No.233和SEQ ID No.234所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A118)由SEQ ID No.235和SEQ ID No.236所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A119)由SEQ ID No.237和SEQ ID No.238所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A120)由SEQ ID No.239和SEQ ID No.240所示的两条单链DNA分子组成的引物对。

其中，所述引物组检测毒力基因为肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌的毒力基因。进一步的，所述毒力基因共96种，如具体实体实施中表2所示。

本发明还提供一种可并行检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量PCR芯片，所述芯片包括上述由120种引物对组成的引物组合物和42种样品液，所述120种引物对和42种样品液在芯片上按照SmartChip多样品纳米分配器仪器的标准排布。

所述样品液包括待测样本、标准品和阴性对照样，所述阴性对照样为无菌水。所述标准品为由120种引物对对应的标准阳性质粒等拷贝数浓度组成的样本混合液，所述样本混合液中每种标准阳性质粒的浓度为7.67E+13拷贝/L；所述120种引物对对应的标准阳性质粒为分别将序列241-360的DNA序列插入到载体质粒中得到的分别包括120种引物对的扩增产物的标准阳性质粒。

其中，所述标准品和阴性对照样都可以为多个也可以为一个，并且至少为一个。

本发明提供一种可并行检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量PCR方法，使用所述的引物组合物和/或所述的芯片，包括如下步骤：

(1)提取环境样品DNA；

(2)将步骤(1)提取的样品DNA使用权利要求3所述的芯片进行实时荧光定量PCR定量扩增；

(3)将步骤(2)获得定量扩增结果进行数据分析。

其中，所述步骤(2)中的实时荧光定量PCR的扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环，最后从72℃开始升温至97℃，升温速率为4摄氏度/s，以0.4℃为一个测量点进行熔解曲线测定。

其中，所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的扩增反应体系包括：1×SYBR Green IMaster Mix，0.5μM正向引物，0.5μM反向引物，20-50ngμL^-1DNA和无核酸酶灭菌水。

其中，所述步骤(3)中数据分析的方法为：根据最佳循环C_T截止值和定量限确定循环C_T截止值的筛选原则，进行筛选保留后进行丰度的计算，包括相对丰度、比较型绝对丰度和绝对丰度。

上所述的引物组合物、芯片或者方法在如下至少一中的应用也应在本发明的保护范围之内：

P1)在制备同时检测肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌的毒力基因的产品中的应用；

P2)在制备检测肺炎克雷伯氏菌的毒力基因的产品中的应用；

P3)在制备检测鲍曼不动杆菌的毒力基因的产品中的应用；

P4)在制备检测大肠杆菌的毒力基因的产品中的应用；

P5)在制备检测肠道沙门氏菌的毒力基因的产品中的应用。

本发明在高通量qPCR(HT-qPCR)技术的基础上，建立了针对四种人畜致病细菌的多种毒力基因的新型芯片，提供了一个强大的工具，从而为评估环境中人畜共患的病原体的健康风险提供了新的信息。本发明有益效果在于：

(1)本发明实现同条件下一次同步检测环境中的多种毒力基因，提高了环境中的毒力基因的检测效率；

(2)本发明通过调整引物和产物长度，优化反应条件，使得其灵敏度和特异性较高，提高了环境毒力基因检测的准确性；

(3)本发明实现在一次检测中进行5184个定量PCR反应，同时进行42个样品的检测，降低了检测成本；

(4)本发明应用于环境样品的毒力基因检测，能够检测分析不同环境中毒力基因的丰度和分布，填补了传统单基因qPCR的低通量扩增和宏基因组学的高成本的缺点，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为使用本发明的HT-qPCR检测毒力基因芯片应用于污水样品的丰度结果的热图。

图2为验证本发明的灵敏度进行混合阳性标准质粒的10倍梯度连续稀释试验的箱型分布图。

图3为本发明的引物进行qPCR试验的扩增效率直方分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

发明概述：

本发明提供一种可并行检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量PCR引物，针对肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、致病性大肠杆菌和伤寒沙门氏菌这四种典型的人畜致病菌的毒力基因进行引物设计，得到120对引物。

这些引物共针对96个典型毒力基因，所有这些基因的名称及其序列均可通过公共数据库得到，这120对引物序列及扩增的其片段长度和对应的毒力基因见具体实施例1中的表1。所述引物序列如SEQ ID NO:1-240所示，其中SEQ ID NO：1为上游引物，SEQ ID NO：2为对应的下游引物；SEQ ID NO：3为上游引物，SEQ ID NO：4为对应的下游引物；以此类推至SEQ ID NO:239为上游引物，SEQ ID NO:240为对应的下游引物。其对应的毒力基因的信息如表2所示。

另一方面，本发明还提供一种可并行检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量PCR芯片，其特征在于，所述芯片含有所述的毒力基因引物。

另外一方面，本发明还提供一种可并行检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量PCR方法，其特征在于，使用了所述的毒力基因引物和芯片，方法步骤为：

(1)提取环境样品DNA；使用

试剂盒进行DNA提取，使用NanoDrop ND-2000分光光度计的OD260/280检测DNA的质量，数值范围在1.6-2.0之间表示质量合格；使用Qubit 3.0测定DNA的浓度，浓度范围在20-60ng/μL之间表示浓度符合检测要求；

(2)高通量定量PCR扩增：使用所述的用于可并行检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量PCR引物和芯片；在每个孔中100nL的总体积下配制qPCR扩增反应体系，体系中包括1×SYBR Green I Master Mix，0.5μM正向引物，0.5μM反向引物，20-50ngμL^-1DNA和无核酸酶灭菌水；扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环，最后从72℃开始升温至97℃，升温速率为4摄氏度/s，以0.4℃为一个测量点进行熔解曲线测定。

在SmartChip实时PCR系统(Wafergen，美国)中进行检测；

(3)获得扩增结果并进行数据分析；根据最佳循环C_T截止值和定量限确定循环C_T截止值的筛选原则，进行筛选保留后进行丰度的计算，包括相对丰度、比较型绝对丰度和绝对丰度。

实施例1芯片的制备

1.引物-酶混合液的制备

根据表1所示的引物信息合成的序列为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:240的引物，并将引物与SYBR Green I Mix酶用PCR级无菌水进行混合，得到引物-酶混合液，具体方法为：将911μL SYBR Green I Mix酶：547μL PCR级无菌水先进行初步混合，将混合液按照每个孔加入10.9μL的加入量分别加入到384板中的120个孔中；分别向120个孔中加入2.7μL120种引物对的引物溶液，其中，每种引物对的引物溶液中两条引物的浓度均为5μM，溶剂为水。至此，得到120组引物-酶混合液。

2.样品-酶混合液的制备

2.1混对照样品的制备

1)分别合成表1中120对基因的目标片段，其对应的序列如序列表中的序列241-360所示；分别将120个引物对应的目标扩增片段克隆到质粒克隆载体pUC57-Ampicillin得到120个标准阳性质粒。将120个对应引物的标准阳性质粒等拷贝数浓度混合组成的标准质粒样品混合液作为标准品，所述标准质粒样品混合液中每种标准质粒样品的浓度为7.67E+13copies/L。

将无菌水作为阴性对照样。

将40个待检测样品的样品DNA、一个标准品和一个阴性对照样分别与SYBR GreenI Mix酶用PCR级无菌水进行混合制成样品-酶混合液，具体为：先将493μLSYBR Green IMix酶与295.9μL PCR级无菌水先进行初步混合，再按照每个孔15.2μL的加入量分别转移到384板的42个孔中，在每个空分别加入样品3.8μL，，完成42组样品-酶混合液的制备。

3.按照SmartChip多样品纳米分配器仪器说明中排列原则，将120组对引物-酶混合液和42组样品-酶混合液(包括40个待测样品、1个标准品和1个对照样品)分别加入到384孔板中，再根据多样品纳米分配器的操作守则将引物和样品均匀分配到一片SmartChip芯片上。

表1引物序列信息及其片段长度

/>

表2各个引物对应的毒力基因信息

/>

/>

/>

实施例2污水样品检测

1、污水样品描述

污水和污泥样品同时采集于福建省龙岩市污水厂沿线，共有10个采样点。其中污水样品包括污水厂上游河流Y1，污水厂进水(INF)，污水厂二次沉淀池出水(EFF0)，污水厂消毒后出水(EFF)，污水厂下游河流点1(SD1)，污水厂下游河流点2(SD2)，和污水厂下游河流点3(SD3)。污泥样品包括污水厂厌氧反应池(ANO)，污水厂好氧反应池(OXC)，及污泥沉淀(SLG)。每个样点采集4个重复，共40个样品。

2、样品DNA提取

选取500mL污水样品用0.22μm的滤膜过滤后剪成细条或取0.5g污泥样品用于DNA提取。使用MP FastDNA提取试剂盒提取DNA，分别用Nanodrop ND-2000分光光度计和Qubit测量仪对提取DNA的质量和浓度进行检测(表3)。如表3所示，所有DNA的OD 260/280基本处于1.6-2.0之间，浓度大于30ng/μL，满足后续的定量检测试验要求。

表3DNA浓度和质量检测表

/>

3.将上述40种样品、与实施例1中的引物混合液和样品混合液，分别加入到384孔板中，再根据多样品纳米分配器的操作守则将引物和样品均匀分配到一片SmartChip芯片上。

4.高通量荧光定量和数据处理

用SmartChip实时PCR系统对芯片进行高通量定量检测，采用的HT-qPCR反应循环程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环。PCR程序完成后，软件将自动分析并导出数据进行处理。导出后的数据根据表4的最佳循环C_T截止值和定量限确定循环C_T截止值≤28的原则，进行筛选保留后进行丰度的计算，包括相对丰度、比较型绝对丰度和绝对丰度。相对丰度(RA)的计算方法为：

CG＝10^{(28-CT)/(10/3)}

其中，CG为基因丰度，CG_VFG为毒力基因的丰度，CG_16S为16S rDNA的丰度。

比较型绝对丰度(CAA)的计算方式为：

CA_VFG＝RA_VFG×AA_16S

其中，RA_VFG为毒力基因的相对丰度，AA_16S为16S rDNA的绝对丰度，AA_16S根据16SrDNA基因的标准曲线公式计算。

绝对丰度(AA)则根据每个基因的标准曲线公式计算对应的基因绝对丰度。

污水样品的毒力基因的丰度结果如图1热图所示。不同样品中检测到的毒力基因有不同的丰度分布。检测到的毒力基因的绝对丰度从5到6.57×10⁷拷贝数，而比较型绝对丰度显示出类似的趋势，丰度浓度从3.26×10²到7.81×10⁹拷贝数，相对丰度的分布范围从0.0015到15.5955。根据毒力基因的相对丰度结果，不同的细菌宿主拥有各种毒力基因，它们发挥着主导的毒力功能。那些负责粘附、毒素和分泌系统的毒力基因在大肠杆菌中占优势。肺炎克雷伯氏菌的毒力基因富集于三种功能类型，包括免疫规避/入侵、粘附和铁吸收。肠道沙门氏菌中毒力基因的相对丰度在粘附和免疫规避/入侵中达到峰值。当用绝对丰度的方法计算时，几乎所有四个目标细菌中的毒力基因在污泥脱水过程中显示出最高的丰度，其次是厌氧处理和好氧处理过程的活性污泥。例如，大肠杆菌中的aafA基因负责形成菌毛粘附素以帮助与硫酸肝素蛋白多糖结合，其拷贝数在7.2×10⁵至7.5×10⁸之间。这些结果表明，毒力基因芯片能够很好地区分不同环境中毒力基因的分布格局。

表4毒力基因芯片引物的最佳循环C_T截止值和定量限(LoQ)

/>

/>

实施例3

1.特异性验证

以细菌gDNA Miniprep试剂盒(Biomiga，中国)提取的肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌(来自中国疾病预防控制中心)四种细菌样品DNA为模板，分别以表1中的120组引物对为引物，通过传统的qPCR来验证引物特异性。qPCR程序设置为：95℃初始变性5分钟，35个循环的变性(95℃，30秒)，每个引物组在适当退火温度下退火30秒，以及延伸(72℃，60秒)，然后在72℃最后延伸5分钟，之后保持在4℃。体系为每个25μL的qPCR反应体系包含12.5μL

SYBR Premix Taq(Ex Taq)，每个引物1μL，9.5μL无菌水，以及1μL DNA模板。通过qPCR实验，表明qPCR产生的熔解曲线为单峰以保证没有非特异性扩增，具有引物特异性。所有引物靶向的基因片段克隆到质粒克隆载体pUC57-Ampicillin(GENEWIZ,Inc.)。

2.灵敏度验证

将实施例1中的有目标基因片段的质粒DNA进行等比例(每个10nM)混合成一个混合的阳性对照，通过10倍梯度稀释，按照本发明实施例2中方法进行检测，制定标准曲线，进行灵敏度的评估验证。

标准曲线的Ct值和扩增效率结果如图2、3所示，显示标准曲线的R²系数平均为0.983±0.012(±标准差)，qPCR扩增效率主要在0.91到0.95之间，平均为0.92，标准差为0.053，证明本发明引物具有较好的特异性和灵敏度。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.一种可并行检测多种毒力基因的荧光定量PCR引物组合物，其特征在于，所述组合物由下述120种引物对组成：

A29)由SEQ ID No.57和SEQ ID No.58所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A30)由SEQ ID No.59和SEQ ID No.60所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A31)由SEQ IDNo.61和SEQ ID No.62所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A32)由SEQ ID No.63和SEQID No.64所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A33)由SEQ ID No.65和SEQ ID No.66所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A34)由SEQ ID No.67和SEQ ID No.68所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A35)由SEQ ID No.69和SEQ ID No.70所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A36)由SEQ ID No.71和SEQ ID No.72所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A37)由SEQ ID No.73和SEQ ID No.74所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A38)由SEQID No.75和SEQ ID No.76所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A39)由SEQ ID No.77和SEQ ID No.78所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A40)由SEQ ID No.79和SEQ IDNo.80所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A41)由SEQ ID No.81和SEQ ID No.82所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A42)由SEQ ID No.83和SEQ ID No.84所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A43)由SEQ ID No.85和SEQ ID No.86所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A44)由SEQ ID No.87和SEQ ID No.88所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A45)由SEQ ID No.89和SEQ ID No.90所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A46)由SEQ IDNo.91和SEQ ID No.92所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A47)由SEQ ID No.93和SEQID No.94所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A48)由SEQ ID No.95和SEQ ID No.96所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A49)由SEQ ID No.97和SEQ ID No.98所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A50)由SEQ ID No.99和SEQ ID No.100所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A51)由SEQ ID No.101和SEQ ID No.102所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A52)由SEQ ID No.103和SEQ ID No.104所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A53)由SEQ ID No.105和SEQ ID No.106所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A54)由SEQ IDNo.107和SEQ ID No.108所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A55)由SEQ ID No.109和SEQ ID No.110所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A56)由SEQ ID No.111和SEQ IDNo.112所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A57)由SEQ ID No.113和SEQ ID No.114所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A58)由SEQ ID No.115和SEQ ID No.116所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A59)由SEQ ID No.117和SEQ ID No.118所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A60)由SEQ ID No.119和SEQ ID No.120所示的两条单链DNA分子组成的引物对；A51)由SEQ ID No.101和SEQ ID No.102所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

A107)由SEQ ID No.213和SEQ ID No.214所示的两条单链DNA分子组成的引物A108)由SEQ ID No.215和SEQ ID No.216所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

2.根据权利要求1所述的引物组合物，所述引物组检测毒力基因为肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌的毒力基因。

3.一种可并行检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量PCR芯片，其特征在于，所述芯片包括权利要求1所述的引物组合物。

4.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片还包括标准品和阴性对照样，所述标准品为由120种引物对对应的标准阳性质粒等拷贝数浓度组成的样本混合液，所述样本混合液中每种标准阳性质粒的浓度为7.67E+13拷贝/L；所述阴性对照样为无菌水。

5.一种可并行检测多种毒力基因的高通量实时荧光定量PCR方法，其特征在于，使用权利要求1所述的引物组合物和/或权利要求3所述的芯片。

6.根据入权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取环境样品DNA；

(3)将步骤(2)获得定量扩增结果进行数据分析。

7.根据入权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的实时荧光定量PCR的扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环，最后从72℃开始升温至97℃，升温速率为4摄氏度/s，以0.4℃为一个测量点进行熔解曲线测定。

8.根据入权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的扩增反应体系包括：1×SYBR Green I Master Mix，0.5μM正向引物，0.5μM反向引物，20-50ngμL^-1DNA和无核酸酶灭菌水。

9.根据入权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中数据分析的方法为：根据最佳循环C_T截止值和定量限确定循环C_T截止值的筛选原则，进行筛选保留后进行丰度的计算，包括相对丰度、比较型绝对丰度和绝对丰度。

10.权利要求1或2所述的引物组合物、权利要求3或4所述的芯片或者权利要求5-9任一所述的方法在如下至少一中的应用：

P2)在制备检测肺炎克雷伯氏菌的毒力基因的产品中的应用；

P3)在制备检测鲍曼不动杆菌的毒力基因的产品中的应用；

P4)在制备检测大肠杆菌的毒力基因的产品中的应用；

P5)在制备检测肠道沙门氏菌的毒力基因的产品中的应用。