CN112813178A - 一种用于检测微生物饲料添加剂中屎肠球菌的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测微生物饲料添加剂中屎肠球菌的荧光定量PCR试剂盒，包括含有上游引物、下游引物和探针，所述的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针的序列如SEQ ID NO.3所示。本发明使用设计的引物、探针对实样进行了检测，证明该引物和探针与其它细菌没有交叉，检测灵敏度非常高。
Description
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种检测试剂盒，具体来说是一种用于检测微生物饲料添加剂中屎肠球菌的荧光定量PCR试剂盒。
背景技术：
微生物饲料添加剂可参与调节胃肠道内微生态平衡、刺激免疫功能，从而促进动物生长，提高饲料转化率。因其无污染、无残留，且可作为抗生素的有效替代物而在畜牧业发展中具有良好的应用前景。屎肠球菌作为我国目前批准的添加菌种之一具有肠道黏附能力好，对高温、高盐、酸碱等具有良好的耐受性，对部分抗生素也具备很好的耐受性。因其对家畜家禽的生长、免疫及消化功能具有明显的改善作用而被广泛使用，是市售微生物饲料添加剂产品的重要组成部分。目前，我国还没有检测饲料中屎肠球菌的标准方法，市售产品质量参差不齐，因此本发明拟提供一种新的检测饲料添加剂中屎肠球菌的试剂盒，为保障市售微生物饲料添加剂的质量提供技术支撑。
发明内容：
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于检测微生物饲料添加剂中屎肠球菌的荧光定量PCR试剂盒，所述的这种用于检测微生物饲料添加剂中屎肠球菌的荧光定量PCR试剂盒要解决现有技术中没有合适的试剂盒用于检测饲料中屎肠球菌的技术问题。
本发明提供了一种用于检测微生物饲料添加剂中屎肠球菌的荧光定量PCR试剂盒，包括含有上游引物、下游引物和探针，所述的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，还含有阴性对照、阳性对照。
进一步的，还含有聚合酶链式反应试剂、Taq DNA聚合酶。
本发明选择屎肠球菌保守基因ddl(D-丙氨酸连接酶基因)作为目的基因，屎肠球菌保守基因ddl的序列为：
ttgaagattactttactatatggcggacgcagcgcagagcatgaagtgtccattctttccgcattttcagttttaaatgccatttattataattattaccaagttcaactcgtatttattacaaaagaaggacaatgggtcaaaggtccattactaacagaaaaacctgccagcaaagatgtcttgcatctttcatgggacccaagtggacagacagaggaaggctttacaggaaaagtgatcaatccgggcgaaatcaaagaagaaggagccatcgtttttccagttttacatgggccaaacggggaagatggaacgatccaaggcttcttagagacattgaatatgccttatgtcggcgcaggcgtattgagtgccatggataaaatcatgaccaagtatattttacaagctgctggtgtgccgcaagttccttatgtaccagtacttaagaatcaatggaaagaaaatcctaaaaaagtatttgatcaatgtgaaggttctttgctttatccgatgtttgtcaaaccggcgaatatgggttctagtgtcggcattacaaaagcagaaaaccgagaagagctgcaaaatgctttagcaacagcctatcagtatgattctcgagcaatcgttgaacaaggaattgaagcgcgcgaaatcgaagttgctgtattaggaaatgaagacgttcggacgactttgcctggtgaagtcgtaaaagacgtagcattctatgattatgaagcaaaatatatcaataataaaatcgaaatgcagattccagccgaagtgccagaagaagtttatcaaaaagcgcaagagtacgcgaagttagcttacacgatgttaggtggaagcggattgagccggtgcgatttctttttgacaaataaaaatgaattattcctgaatgaattaaactctatgccaggatttacggagttcagtatgtacccactcttatgggaaaatatgggcttgaaatacggtgatttgattgaagaactgatccagttaggaatgaatcgataccatcagcgtcaatctttttttgaaaaaaatgaataa(SEQ ID NO.4)，
使用Primer express3.0软件设计引物和Taqman水解探针，引物和探针序列见表1。
表1屎肠球菌ddl基因引物探针
引物和探针序列在NCBI的GenBank中进行了Blast验证，证明所设计引物和探针具有良好的特异性。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明使用设计的引物探针对实样进行了检测，证明该引物和探针与其它细菌没有交叉；另一方面，本发明对反应参数进行了优化，验证了其ddl基因的检测灵敏度。
附图说明：
图1显示了屎肠球菌质粒的扩增曲线。
图2显示了屎肠球菌标准曲线。
图3显示了屎肠球菌灵敏度，从左至右质粒浓度依次为3.6×109、3.6×108、3.6×107、3.6×106、3.6×105、3.6×104、3.6×103、3.6×102、36、3.6copies/μL(直线即为3.6)。
图4显示了屎肠球菌qPCR方法特异性。曲线的部分为屎肠球菌标准菌株ATCC19434和屎肠球菌实验室分离株，阴性部分为ATCC 29212粪肠球菌和耐久肠球菌、鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌、海氏肠球菌、鸟肠球菌等。
具体实施方式：
实施例1
1.荧光定量PCR(qPCR)的检测
(1)按照检测样品数n(n＝待检样品数+2)取qPCR反应液、热启动Taq酶和探针等混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用。
(2)将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中。
(3)荧光定量PCR反应体系：10μL Premix Ex TaqTM(2×)，2μL模板，上、下游引物及探针各1μL(10μmol/L)，5μL ddH2O，共20μL。
(4)荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s，按以下参数循环40次：95℃变性10s，62℃采集荧光20s，62℃时荧光检测，检测通道：FAM。
2.质控标准
(1)阴性对照的Ct值应等于none。
(2)阳性对照的Ct值应≤30，否则，此实验视为无效。(Ct值应以S型曲线拐点的循环数为准)
(3)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。
3.结果判定
(1)Ct值≥35或无数值的标本为阴性。
(2)FAM通道Ct值≤30的标本为阳性标本。
(3)30＜Ct值＜35的样本建议重做。重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。
4.标准曲线制作
取试剂盒中阳性质粒，用Easy Dilution分别进行10倍梯度稀释，一共稀释6个梯度，并对每个稀释度分别进行荧光定量PCR的检测，获得标准曲线图。
实验结果：质粒扩增曲线见图1，标准曲线见图2。其线性方程为y＝-3.266x+41.31，扩增效率为102.4％，在90％～110％之间，表明该方法扩增效率好；其R2为0.9999，在0.99和1之间，表明该方法可信度较高。
5.特异性实验
取表2中菌株DNA各2μL作为样品，同时设质粒作为阳性对照，空白质粒作为阴性对照，DEPC水作为空白对照组。对上述样品进行qPCR扩增。
表2供试菌株信息
结果表明：所有屎肠球菌扩增出曲线，而其它细菌均无S型扩增曲线出现，同时DEPC水空白对照、空白质粒阴性对照均成立，表明该方法特异性好。(如图4所示)
实施例2参数优化
探针浓度确定：10μL Premix Ex TaqTM(2×)，2μL模板DNA，上、下游引物各1μL(10μmol/L)，分别加入探针0.1、0.5、1、2μL(10μmol/L)双蒸水补足20μL。结果表明探针终浓度为0.5μM时，反应体系扩增良好。
引物浓度确定：10μL Premix Ex TaqTM(2×)，2μL模板DNA，探针1μL(10μmol/L)，分别加入上、下游引物各1μL(10μmol/L)，0.5、1、2、4μL(10μmol/L)，双蒸水补足20μL。结果表明引物终浓度为0.5μM时，反应体系扩增良好。
退火温度：95℃预变性30s；95℃变性10s，分别60℃、62℃、65℃延伸20s，40个循环。结果表明退火温度为62℃时，反应体系扩增良好。
灵敏度：取阳性质粒(3.6×1010copies/μL)，并将其进行10倍的梯度稀释。每个梯度DNA中各取2μL模板用荧光定量PCR方法进行检测。同时设阴性对照。结果表明，本方法灵敏度可达36copies/μL。(如图3所示)。
序列表
<110> 上海市动物疫病预防控制中心（上海市兽药饲料检测所、上海市畜牧技术推广中心）
<120> 一种用于检测微生物饲料添加剂中屎肠球菌的荧光定量PCR试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agaaaaacct gccagcaaag at 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 27
<212> DNA
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tcttgcatct ttcatgggac ccaagtg 27
<210> 4
<211> 1068
<212> DNA
<213> Enterococcus faecium
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Claims (3)
1.一种用于检测微生物饲料添加剂中屎肠球菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括含有上游引物、下游引物和探针，所述的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测微生物饲料添加剂中屎肠球菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：还含有阴性对照、阳性对照。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测微生物饲料添加剂中屎肠球菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：还含有聚合酶链式反应试剂、Taq DNA聚合酶。
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