CN111411173A - 新型冠状病毒环介导等温扩增快速检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

新型冠状病毒环介导等温扩增快速检测试剂盒及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111411173A
CN111411173A CN202010277017.7A CN202010277017A CN111411173A CN 111411173 A CN111411173 A CN 111411173A CN 202010277017 A CN202010277017 A CN 202010277017A CN 111411173 A CN111411173 A CN 111411173A
Authority
CN
China
Prior art keywords
loop
isothermal amplification
mediated isothermal
gene
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010277017.7A
Other languages
English (en)
Inventor
不公告发明人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Original Assignee
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ filed Critical Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority to CN202010277017.7A priority Critical patent/CN111411173A/zh
Publication of CN111411173A publication Critical patent/CN111411173A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于新型冠状病毒检测的逆转录实时荧光定量环介导等温扩增试剂盒及其使用方法。所述试剂盒，由新型冠状病毒核衣壳(N)基因环介导等温扩增引物组构成，试剂盒成分主要由新冠病毒N基因环介导等温扩增引物组溶液、环介导等温扩增反应预混液、AMV逆转录酶、新冠病毒N基因阳性质控品构成，可采用逆转录实时荧光检测方法，进行新冠病毒的快速检测。本方法在30分钟之内可以完成检测，特异性强，灵敏度高，为新型冠状病毒的防控及流行趋势调查分析提供了一种简便、快速的途径。

Description

新型冠状病毒环介导等温扩增快速检测试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及一套用于病毒快速检测的引物组、试剂盒及使用方法，尤其涉及一套用于检测新型冠状病毒（简称新冠病毒）环介导等温扩增引物组、试剂盒及其使用方法，属于新冠病毒检测领域。
背景技术
新冠病毒在分类学上属于冠状病毒科(Corona viridae)冠状病毒属(Corona virus)中的β类型冠状病毒，具有囊膜和刺突细胞学特征，基因组为线性单股正链的ＲNA病毒。该病毒基因组包含两个位于侧翼的非编码区(5'-UTＲ和3'-UTＲ)、由12个开放阅读框(orf1ab， Spike，orf3a，orf3b，E，M，orf6，orf7a，orf7b，orf8/orf8b，N和orf9b)组成的一个编码多蛋白开放阅读框、1个前导序列、9个转录调控序列组成。其基因组的排列顺序为5'-复制酶(orf1/ab)-结构蛋白［Spike(S) Envelope(E)-Membrane(M)-Nucleocapsid(N)］3'，其编码产物依次是复制酶(orf1/ab)、刺突糖蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳(N)及其它假想蛋白，但缺乏在β类型冠状病毒A系中所特有的血凝素脂酶(HE) 基因。
目前，新冠病毒的临床检测方法主要为实时荧光定量 RT-PCR 检测。然而，由于荧光定量RT-PCR反应对温度具有一定的依赖性，要求精密控温系统，检测时间长，实验成本高，不适于现场快速检测，面对新冠病毒的世界范围大规模流行，急需开发快速检测方法。环介导等温扩增（LAMP）法是2000年由日本Notomi博士发明的一种新的核酸扩增技术，更具有简便、快速、敏感性高和特异性强等优点。经过二十年的发展，该方法得到不断完善，尤其在结果判定方面，已有多种肉眼可视的方法及实时荧光检测法得到广泛应用，可从源头上控制住由电泳开盖造成的气溶胶污染，尤其适合于现场快速检测以及床旁检测。
目前，新冠病毒的临床检测方法主要为实时荧光定量 RT-PCR 检测。然而，由于荧光定量RT-PCR反应对温度具有一定的依赖性，要求精密控温系统，检测时间长，实验成本高，不适于现场快速检测，面对新冠病毒的世界范围大规模流行，急需开发快速检测方法。环介导等温扩增（LAMP）法是2000年由日本Notomi博士发明的一种新的核酸扩增技术，更具有简便、快速、敏感性高和特异性强等优点。经过二十年的发展，该方法得到不断完善，尤其在结果判定方面，已有多种肉眼可视的方法及实时荧光检测法得到广泛应用，可从源头上控制住由电泳开盖造成的气溶胶污染，尤其适合于现场快速检测以及床旁检测。
发明内容
本发明的主要目的是提供一套用于新冠病毒快速检测的环介导等温扩增试剂盒。
所述新冠病毒环介导等温扩增引物组是针对SARS-CoV-2核衣壳(N)基因特异性序列所设计。其中，N基因引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，按一定的比例配制而成，其中内引物与外引物按2:1，4:1，8:1，16:1的比例配制，优选比例为8:1，环引物与内引物的比例为1:2，反应终浓度外引物、内引物、环引物分别为：0.2μM、1.6μM、0.8μM。
所述的环介导等温扩增反应预混液，可以是使扩增产物发出荧光信号的一种商品化试剂盒Isothermal Master Mix（英国，OptiGene公司）或者等效的其他试剂盒，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜碱、MgSO4和缓冲溶液组成。试剂盒中还同时引入新冠病毒N基因阳性质控品，是由涵盖引物组扩增的N基因区域人工合成片段构建的质粒经体外转录纯化后得到的RNA模板。
所述新冠病毒N基因环介导等温扩增反应体系的总体积为25μL，其中包括N基因环介导等温扩增引物组溶液6μL，环介导等温扩增反应预混液13.8μL，AMV逆转录酶0.2μL，待测试样或者阳性质控品5μL。经扩增温度在60-67℃范围内的优选结果，最适扩增温度为64℃。环介导等温扩增荧光检测系统的扩增程序为：
Figure 383921DEST_PATH_IMAGE001
64℃，30min，
Figure 813765DEST_PATH_IMAGE002
98℃-80℃，0.05℃/s，10 min。
所述新冠病毒N基因检测试剂盒，实时荧光检测法中每个反应荧光信号达最大值所对应的扩增时间（Peak time）与体外转录RNA模板初始拷贝数的对数值之间，在102拷贝/反应-107拷贝/反应范围内具有线性关系，R2>0.970，可根据该标准曲线进行待测样本模板拷贝数的测定；该方法待测样本模板RNA拷贝数的检出限为102拷贝/反应。
扩增结果的分析和判定方法包括：
1）环介导等温扩增荧光检测系统测得的扩增曲线出现平台时，其荧光值高于本底噪音信号5倍且溶解曲线为单一尖锐峰的判定为阳性结果，其荧光值高于本底噪音信号5倍但溶解曲线不是单一尖锐峰的判定为非特异性的交叉干扰信号；其荧光值低于或等于本底噪音信号5倍的判定为阴性结果；
2）当待测试样新冠病毒N基因环介导等温扩增反应管为阴性结果时，则未检测到新冠病毒；待测试样为阳性结果，则为新冠病毒感染；其特征在于，N基因的扩增曲线以30min时的读数为基准。
一种用于新冠病毒SARS-CoV-2诊断的环介导等温扩增试剂盒的使用方法，还包括荧光信号达到最大值所对应的扩增时间（Peak time）与模板初始拷贝数的量化关系分析。其方法为，分别配制浓度分别为107拷贝数/反应、106拷贝数/反应、105拷贝数/反应、104拷贝数/反应、103拷贝数/反应、102拷贝数/反应的N基因阳性质控品水溶液系列，用逆转录环介导等温扩增实时荧光检测系统分别测定阳性质控品水溶液系列，以反应Peak time为纵坐标，以体外转录RNA模板初始拷贝数对数值（Log(Copies/reaction)）为横坐标，建立关系曲线。利用该曲线，通过测定未知样品Peak time，即可测得待测样品内目标模板的初始拷贝数。
附图说明
图1新冠病毒N基因体外转录RNA阳性质控品纯度及完整性
图2优化反应条件—引物浓度
图3优化反应条件—扩增温度
图4逆转录环介导等温扩增实时荧光检测法新冠病毒N基因引物特异性实验结果。
图中，1的模板为新冠病毒N基因体外转录RNA，2的模板为MERS-CoV体外转录RNA，3的模板为SARS-CoV体外转录RNA，4的模板为甲型流感病毒A/上海普陀/1203/2013(H1N1pdm09) RNA，5的模板为甲型流感病毒A/杭州/1/2013(H7N9) RNA，6的模板为甲型流感病毒A/环境/江西/21/2011（H9N2）RNA，7的模板为B/北京海淀/1386/2013（Victoria）RNA，8的模板为乙型流感病毒B/重庆渝中/1361/2013（Yamagata）RNA（1-3模板为实验室自行构建，4-8模板由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所馈赠)。
图5逆转录环介导等温扩增实时荧光检测法新冠病毒N基因灵敏度实验结果。
图中，1为配制浓度108拷贝数/反应、2为配制浓度107拷贝数/反应、3为配制浓度106拷贝数/反应、4为配制浓度105拷贝数/反应、5为配制浓度104拷贝数/反应、6为配制浓度103拷贝数/反应、7为配制浓度102拷贝数/反应、8为配制浓度10拷贝数/反应的新冠病毒N基因阳性质控品水溶液系列。
图6荧光信号达最大值所对应的扩增时间（Peak time）与阳性质控品模板初始拷贝数对数值（Log(Copies/reaction)）间的关系曲线。
具体实施方法
本实施例所用仪器与试剂具体如下：
仪器：
GenieII（英国，OptiGene公司），日立U-3310紫外可见分光光度计。
试剂：
Isothermal Master Mix（英国，OptiGene公司），AMV逆转录酶（美国，Promega公司），Standard RNA Synthesis（美国，NEB公司），SalI内切酶（美国，NEB公司），所有引物及质粒均有通用生物公司合成。
1. 试验材料与方法
1.1 试验材料
新冠病毒N基因人工合成片段，是参考Genbank上已发表的序列（MN908947.3）人工合成，片段连接到pGEM-T easy载体上，并转化至感受态细胞DH5α，以30%甘油的菌液的形式储存。
1.2 引物设计
运用DNAMAN软件对新冠病毒N基因进行比对，选择针对N基因特异性片段作为靶序列，运用在线软件PrimerExplorer V5（http://primerexplorer.jp/e/）设计N基因的环介导等温扩增引物组。N基因环介导等温扩增引物组，由一对外引物（SEQ No.1、SEQ No.2）、一对内引物（SEQ No.3、SEQ No.4）和一对环引物（SEQ No.5、SEQ No.6）组成，其引物序列为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
1.3 重组质粒的提取及验证
在3mL预先加入氨苄青霉素的LB培养基中接入100uL的甘油菌液，37℃，250rpm振荡培养8-10h，参照质粒小提试剂盒的说明提取质粒，进行酶切、PCR鉴定，其余菌液加入30%甘油后放入-80℃保存。
1.4 体外转录RNA阳性质控品的制备
经质粒测序结果可知，N基因人工合成片段为T7 promoter引导方向。质粒经酶切、纯化后，应用T7体外转录试剂盒Standard RNA Synthesis制备RNA混合物，纯化后用日立U-3310紫外可见分光光度计测定RNA浓度，计算拷贝数。
1.5优化反应条件
1.5.1 优化引物浓度
将一对内引物、一对外引物和一对环引物按一定的比例配制而成，其中内引物与外引物按2:1，4:1，8:1，16:1的比例配制，环引物与内引物的比例为1:2，选择最佳引物浓度比例。
1.5.2 优化扩增温度
设置扩增温度在60-67℃范围，选择最佳反应温度。
1.6 环介导等温扩增反应
通过优化引物浓度和设置扩增温度后，得到的反应条件为：环介导等温扩增反应体系的总体积为25μL，包括新冠病毒N基因引物混合液6μL（反应终浓度外引物、内引物、环引物分别为：0.2μM、1.6μM、0.8μM），环介导等温扩增反应预混液13.8μL，AMV逆转录酶0.2μL，反应样品5μL，阴性对照试验以DEPC水代替反应样品。加完样品后，将反应管置于环介导等温扩增荧光检测系统中。扩增程序为：
Figure 803193DEST_PATH_IMAGE001
64℃，30min，
Figure 265267DEST_PATH_IMAGE002
98℃-80℃，0.05℃/s，10min，系统实时监测反应管中的荧光信号，通过获得的等温扩增曲线和溶解曲线判断试验结果。
1.7 引物混合液的特异性试验
分别以新冠病毒N基因体外转录RNA，MERS-CoV体外转录RNA，SARS-CoV体外转录RNA，甲型流感病毒A/上海普陀/1203/2013(H1N1 pdm09)RNA，甲型流感病毒A/杭州/1/2013(H7N9)RNA，甲型流感病毒A/环境/江西/21/2011（H9N2）RNA，B/北京海淀/1386/2013（Victoria）RNA，乙型流感病毒B/重庆渝中/1361/2013（Yamagata）RNA为反应模板，用新冠病毒N基因环介导等温扩增引物混合液进行实时荧光系统检测，检验引物混合液的特异性。
1.8荧光信号达到最大值所对应的扩增时间（Peak time）与模板RNA初始拷贝数的量化关系分析
分别将测定浓度的体外转录RNA依次进行10倍梯度稀释，通过实时荧光检测系统对各浓度RNA质控品（终浓度梯度为108拷贝数/反应、107拷贝数/反应、106拷贝数/反应、105拷贝数/反应、104拷贝数/反应、103拷贝数/反应、102拷贝数/反应、10拷贝数/反应）进行检测。每个反应检测结果进行模板RNA初始拷贝数的对数值与实时荧光检测法中Peak time之间的线性分析。
2. 试验结果
2.1 体外转录RNA阳性质控品纯度及完整性鉴定
人工合成质粒内插入片段，N基因为大小372bp的DNA序列。体外转录过程中，另外加上T7 promoter序列及限制酶区域序列140bp左右，获得基因大小约为512bp。经体外转录纯化后得到的RNA片段，用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度及完整性，如图1（M为RNA Marker，第三道N为新冠病毒N基因体外转录RNA片段）所示，在400-600bp范围内，可见N基因单一的目的条带，大小在预期范围内。
2.2 优化引物浓度
如图2所示，将内引物与外引物按2:1，4:1，8:1，16:1的比例配制（复孔），环引物与内引物的比例为1:2，选择最佳引物浓度比例，外引物、内引物、环引物最佳比例为1:8:4，反应终浓度分别为：0.2μM、1.6μM、0.8μM，图中表注的曲线为最适反应条件曲线。
2.3 优化扩增温度
设置扩增温度在60-67℃范围，选择最佳反应温度，图3标注出的最适扩增温度为64℃。
2.4 实时荧光检测法引物特异性实验结果
分别以新冠病毒N基因体外转录RNA，MERS-CoV体外转录RNA，SARS-CoV体外转录RNA，甲型流感病毒A/上海普陀/1203/2013(H1N1 pdm09)RNA，甲型流感病毒A/杭州/1/2013(H7N9)RNA，甲型流感病毒A/环境/江西/21/2011（H9N2）RNA，B/北京海淀/1386/2013（Victoria）RNA，乙型流感病毒B/重庆渝中/1361/2013（Yamagata）RNA为反应模板，新冠病毒N基因的环介导等温扩增实时荧光检测的试验结果如图4所示，只有新冠病毒N基因阳性质控品体外扩增RNA模板出现扩增信号，说明此新冠病毒N基因的环介导等温扩增引物混合液的特异性良好。
2.5荧光信号达到最大值所对应的扩增时间（Peak time）与阳性质控品体外扩增RNA模板基因初始拷贝数的量化分析结果
将测定浓度的新冠病毒N基因体外转录RNA阳性质控品依次进行10倍梯度稀释（反应终浓度梯度为108拷贝数/反应、107拷贝数/反应、106拷贝数/反应、105拷贝数/反应、104拷贝数/反应、103拷贝数/反应、102拷贝数/反应、10拷贝数/反应），通过实时荧光检测系统对上述各浓度RNA质控品分别进行检测，结果如图5所示。
图6为量化关系分析结果（横坐标显示每个反应内模板RNA初始拷贝数的对数值，纵坐标为各反应Peak time值），在102拷贝数-107拷贝数范围内新冠病毒N基因线性方程为y=-1.895x+21.67，R2=0.970，提示新冠病毒N基因荧光信号达到最大值的扩增时间随反应体系的模板含量增加而加快，线性关系较好。本检测方法可进行定量检测，检出限为102拷贝/反应。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一套用于检测新型冠状病毒（简称新冠病毒）的环介导等温扩增引物组，由新冠病毒核衣壳(N)基因环介导等温扩增引物组构成，其特征在于，可用于新冠病毒检测的环介导等温扩增反应；
所述新冠病毒N基因环介导等温扩增引物组，其特征在于，由一对外引物（SEQ No.1、SEQ No.2）、一对内引物（SEQ No.3、SEQ No.4）和一对环引物（SEQ No.5、SEQ No.6）组成，其引物序列为：
引物名称 引物序列（5’-3’） SEQ No.1 TTATACAGTTTCCTGTTTACCTT SEQ No.2 TACTGCCAGTTGAATCTGA SEQ No.3 ACACGAACGTCATGATACTCTAAAATTGCCAGGAACCTAAATTGG SEQ No.4 ACTAAAATGTCTGATAATGGACCCCGGGTCCACCAAACGTAAT SEQ No.5 CGAACAACGCACTACAAGACTAC SEQ No.6 AGCGAAATGCACCCCGC
。
2.一种如权利要求1 所述的新冠病毒N基因环介导等温扩增引物组，用于新冠病毒检测试剂盒，主要由新冠病毒N基因环介导等温扩增引物组溶液、环介导等温扩增反应预混液、AMV逆转录酶、新冠病毒N基因阳性质控品构成，其特征在于，可以采用逆转录实时荧光检测方法，进行新冠病毒的快速检测；
所述新冠病毒N基因环介导等温扩增引物组溶液，其特征在于，是由一对内引物、一对外引物和一对环引物按一定的比例配制而成，其中内引物与外引物按2:1，4:1，8:1，16:1的比例配制，优选比例为8:1，环引物与内引物的比例为1:2，反应终浓度外引物、内引物、环引物分别为：0.2μM、1.6μM、0.8μM；
所述环介导等温扩增反应预混液，其特征在于，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜碱、MgSO4和缓冲溶液等构成，包括可使扩增产物发出荧光信号的一种商品化试剂盒Isothermal MasterMix（英国，OptiGene公司）或者等效的其他试剂盒；
所述新冠病毒N基因阳性质控品，其特征在于，是由涵盖上述引物扩增的N基因区域人工合成片段构建的质粒经体外转录纯化后得到的RNA模板；
所述新冠病毒N基因环介导等温扩增试剂盒常规反应体系，包括环介导等温扩增引物组溶液6μL，环介导等温扩增反应预混液13.8μL，AMV逆转录酶0.2μL，待测试样或者阳性质控品5μL，共计25μL。
3.如权利要求2所述的新冠病毒N基因环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，可使用实时荧光检测法进行新冠病毒检测；使用环介导等温扩增荧光检测系统实现同步等温扩增并实时检测反应管中的荧光信号，获得等温扩增曲线和溶解曲线，进而判定检测结果；经扩增温度在60-67℃范围内的优选结果，最适扩增温度为64℃；新冠病毒N基因环介导等温扩增实时荧光检测系统的扩增程序为：
Figure RE-267078DEST_PATH_IMAGE001
64℃，30min，
Figure RE-4090DEST_PATH_IMAGE002
98℃-80℃，0.05℃/s，10 min。
4.如权利要求2所述的新冠病毒N基因检测试剂盒，其特征在于，实时荧光检测法中每个反应荧光信号达最大值所对应的扩增时间（Peak time）与体外转录RNA模板初始拷贝数的对数值之间，在102拷贝/反应-107拷贝/反应范围内具有线性关系，R2>0.970，可根据该标准曲线进行待测样本模板拷贝数的测定；该方法待测样本模板RNA拷贝数的检出限为102拷贝/反应。
5.如权利要求2所述的新冠病毒N基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于，扩增结果的分析和判定方法包括：
1）环介导等温扩增荧光检测系统测得的扩增曲线出现平台时，其荧光值高于本底噪音信号5倍且溶解曲线为单一尖锐峰的判定为阳性结果，其荧光值高于本底噪音信号5倍但溶解曲线不是单一尖锐峰的判定为非特异性的交叉干扰信号；其荧光值低于或等于本底噪音信号5倍的判定为阴性结果；
2）当待测试样新冠病毒N基因环介导等温扩增反应管为阴性结果时，则未检测到新冠病毒；待测试样为阳性结果，则为新冠病毒感染；其特征在于，N基因的扩增曲线以30min时的读数为基准。
CN202010277017.7A 2020-04-10 2020-04-10 新型冠状病毒环介导等温扩增快速检测试剂盒及使用方法 Pending CN111411173A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010277017.7A CN111411173A (zh) 2020-04-10 2020-04-10 新型冠状病毒环介导等温扩增快速检测试剂盒及使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010277017.7A CN111411173A (zh) 2020-04-10 2020-04-10 新型冠状病毒环介导等温扩增快速检测试剂盒及使用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111411173A true CN111411173A (zh) 2020-07-14

Family

ID=71489732

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010277017.7A Pending CN111411173A (zh) 2020-04-10 2020-04-10 新型冠状病毒环介导等温扩增快速检测试剂盒及使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111411173A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111763770A (zh) * 2020-07-16 2020-10-13 青岛国际旅行卫生保健中心(青岛海关口岸门诊部) 以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其检测方法
CN111778359A (zh) * 2020-07-23 2020-10-16 贵州中医药大学第二附属医院 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法
CN111793719A (zh) * 2020-07-27 2020-10-20 韩山师范学院 重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法
CN111850172A (zh) * 2020-08-04 2020-10-30 中山大学 用于检测SARS-CoV-2的LAMP引物组及试剂盒
EP4202063A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-28 Fundación Gaiker Method and kit for the detection of the sars-cov-2 virus based on a loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) and optical and/or electrochemical detection

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099430A (zh) * 2014-08-01 2014-10-15 中国检验检疫科学研究院 H7n9亚型禽流感病毒诊断环介导等温扩增试剂盒及使用方法
CN105238877A (zh) * 2015-09-17 2016-01-13 中国检验检疫科学研究院 H7亚型禽流感病毒环介导等温扩增试剂盒及使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099430A (zh) * 2014-08-01 2014-10-15 中国检验检疫科学研究院 H7n9亚型禽流感病毒诊断环介导等温扩增试剂盒及使用方法
CN105238877A (zh) * 2015-09-17 2016-01-13 中国检验检疫科学研究院 H7亚型禽流感病毒环介导等温扩增试剂盒及使用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LAMB LE等: "Rapid detection of novel coronavirus(COVID-19) by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification", 《MEDRXIV》 *
殷宏等: "建立新型冠状病毒实时荧光逆转录环介导等温扩增快速检测方法", 《中国国境卫生检疫杂志》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111763770A (zh) * 2020-07-16 2020-10-13 青岛国际旅行卫生保健中心(青岛海关口岸门诊部) 以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其检测方法
CN111778359A (zh) * 2020-07-23 2020-10-16 贵州中医药大学第二附属医院 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法
CN111778359B (zh) * 2020-07-23 2023-06-20 贵州中医药大学第二附属医院 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法
CN111793719A (zh) * 2020-07-27 2020-10-20 韩山师范学院 重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法
CN111850172A (zh) * 2020-08-04 2020-10-30 中山大学 用于检测SARS-CoV-2的LAMP引物组及试剂盒
CN111850172B (zh) * 2020-08-04 2023-05-26 深圳市梓健生物科技有限公司 用于检测SARS-CoV-2的LAMP引物组及试剂盒
EP4202063A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-28 Fundación Gaiker Method and kit for the detection of the sars-cov-2 virus based on a loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) and optical and/or electrochemical detection

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111411173A (zh) 新型冠状病毒环介导等温扩增快速检测试剂盒及使用方法
WO2016188144A1 (zh) 一种具有增强鉴别能力的str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN110951916A (zh) 一种基于实时荧光逆转录重组酶聚合酶核酸扩增技术检测SADS-CoV的引物和试剂盒
CN110777220B (zh) 一种引物组、探针、rpa试纸条试剂盒、鉴别方法
CN113774169A (zh) 2019新型冠状病毒德尔塔变异株核酸检测试剂、试剂盒及检测方法
CN113774168A (zh) 2019新型冠状病毒及其德尔塔和拉姆达变异株分型核酸检测试剂盒及检测方法
CN112481417B (zh) 新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒
CN112239794B (zh) 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
CN111154903A (zh) 一种用于布鲁氏菌rpa扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用
CN112662821A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒m基因的荧光探针引物组合、试剂盒及应用
CN113817872A (zh) 2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸检测试剂、试剂盒及检测方法
CN114107567A (zh) 一种病毒核酸突变检测方法及应用
CN112126716A (zh) 一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测用引物对及其应用
CN117867166A (zh) 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大别山病毒的引物组及其应用
CN111471802A (zh) 一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、试剂盒及其应用
CN106282410B (zh) 一种寨卡病毒特异性检测靶序列、质粒标准分子及其检测试剂盒
CN111926090A (zh) 用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及试剂盒
CN116574844B (zh) 一组检测牛病毒性腹泻病毒的rpa引物对、试剂盒和检测方法
CN116200546B (zh) PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法
CN115141826B (zh) Rpa引物对及其应用、可视化检测pcv4的试剂盒及其应用和检测pcv4方法
CN116515840B (zh) 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法
CN114292963B (zh) 鸭坦布苏病毒核酸CRISPR-Cas13a检测系统及RPA引物对和crRNA
CN114107569B (zh) 一种快速鉴别牛痘病毒的引物、探针及试剂盒
CN117660701B (zh) 一种检测丽水穿山甲病毒的lamp引物组、试剂盒及方法
CN117143866A (zh) 引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200714

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication