CN117143866A - 引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用 - Google Patents

引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117143866A
CN117143866A CN202311224467.XA CN202311224467A CN117143866A CN 117143866 A CN117143866 A CN 117143866A CN 202311224467 A CN202311224467 A CN 202311224467A CN 117143866 A CN117143866 A CN 117143866A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotide sequence
probe
seq
primer
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311224467.XA
Other languages
English (en)
Inventor
牛旻
郭冠瑛
张娇蕊
李亚楠
李英英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Hongxin Testing Technology Co ltd
Muyuan Foods Co Ltd
Original Assignee
Henan Hongxin Testing Technology Co ltd
Muyuan Foods Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Hongxin Testing Technology Co ltd, Muyuan Foods Co Ltd filed Critical Henan Hongxin Testing Technology Co ltd
Priority to CN202311224467.XA priority Critical patent/CN117143866A/zh
Publication of CN117143866A publication Critical patent/CN117143866A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用。本发明提供了引物组，所述引物组具有：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明所采用的PEDV病毒荧光定量RT‑PCR方法相比于普通PCR检测方法，具有操作简便，特异性强，敏感度高，重复性好等优点，对PEDV病毒的临床检测具有重要的现实意义。

Description

引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产 品中的应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用。
背景技术
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种能导致猪只腹泻、脱水、呕吐等症状的肠道传染性疾病。该病首次在比利时国家一个猪场中传播，但在2010年前，市面普遍使用的经典毒株PEDV CV777疫苗能够对其产生有效的保护保护。但在2010年后，我国南部地区部分注射过疫苗的猪群仍旧暴发大规模的PED感染，PED开始在我国各地广为流行，给我国的养猪业造成巨大损失。
PEDV为单股正链RNA病毒，基因组全长28kb，包含S、M、N、E结构蛋白、ORF3非结构蛋白、非编码区。其中的S基因是主要的毒力基因，全长大约4149bp，和其他引发猪只腹泻的冠状病毒相似。
由于临床上，PED与猪传染性胃肠炎的临床症状非常相似，导致但从临床发病情况，很难区分这两种疾病。目前市面针对PEDV的诊断方法主要有：常规RT-PCR、荧光定量RT-PCR、ELISA、病毒分离鉴定等。但是普通RT-PCR方法检测灵敏性不高，临床需要跑电泳，耗时较长，并且核酸染料对检测人员及环境造成污染；ELISA检测方法，特异性及灵敏性均不高，且常有假阳性结果出现；病毒分离鉴定方法需要培养细胞，洁净度要求高，并且所需时间较长；荧光定量RT-PCR方法相较于其他方法，具有特异性高、灵敏性强的多方面优点。
为实现临床对猪流行性腹泻的防控，建立一种快速、灵敏、特异的荧光定量RT-PCR检测方法迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用。本发明所采用的PEDV病毒荧光定量RT-PCR方法相比于普通PCR检测方法，具有操作简便，特异性强，敏感度高，重复性好等优点，对PEDV病毒的临床检测具有重要的现实意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物组，所述引物组具有：
(1)、如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
本发明还提供了探针，所述探针具有：
(5)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
(6)、与(5)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(5)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(7)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(8)、与(5)、(6)或(7)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述探针的核苷酸序列的5’端连接荧光报告基团，3’端连接淬灭基团。
在本发明的一些实施方案中，上述探针中，所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。
本发明还提供了检测试剂，包括上述引物组和/或上述探针以及可接受的助剂。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂，还包括：Taq master mix、阳性标准质粒、阳性标准质粒的引物组和模板；
所述阳性标准质粒的引物组具有如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的序列。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中所述探针的浓度为10μM，所述引物组的浓度为10μM。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，上游引物的浓度为10μM，下游引物的浓度为10μM。
本发明还提供了检测试剂盒，包括上述检测试剂以及可接受的载体或装置。
本发明还提供了上述引物组、上述探针、上述检测试剂和/或上述检测试剂盒在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述检测包括如下步骤：获得所述样品的cDNA与上述检测试剂和/或上述检测试剂盒混合，扩增，根据Cq值和扩增曲线，获得所述样品是否为阳性。
本发明的一些实施方案中，上述应用中所述扩增的程序包括：95℃30s；40个循环：95℃5s，55℃退火30s。
本发明的一些实施方案中，上述应用中所述扩增的体系包括：
本发明提供了引物组，所述引物组具有：
(1)、如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
本发明的有益效果包括：
(1)、操作简单：本发明不需电泳、显色等过程，自动化程度高，一步实现扩增和检测。
(2)、特异性强：本发明能够特异性检测出猪流行性腹泻病毒，对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒等毒株的检测结果均为阴性，具有很好的特异性。
(3)、敏感性高：荧光检测技术是极其灵敏的检测技术，本发明用于猪流行性腹泻病毒的检测，其最低检测限为3.16×101copies/μL。
(4)、准确性高：本发明所使用的引物是针对猪流行性腹泻病毒S基因设计，能真实、准确地反应出猪流行性腹泻病毒含量。
(5)、本发明对产物可以实现定量：由于荧光信号的强弱和扩增产物量成线性对应关系，通过收集荧光信号可以实现产物的定量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明实施例提供的PEDV S基因PCR扩增产物电泳图：自左向右依次为M-DNAMarker2000、PEDV S基因的PCR产物(633bp)；
图2示本发明实施例提供的PEDV S TaqMan探针实时荧光定量PCR的标准曲线图；
图3示本发明实施例提供的PEDV S TaqMan探针实时荧光定量PCR的灵敏性试验结果图，图中曲线梯度1～梯度5分别表示PEDV S质粒浓度为3.16×104copies/μL、3.16×103copies/μL、3.16×102copies/μL、3.16×101copies/μL、3.16×100copies/μL；
图4示本发明实施例提供的PEDV S TaqMan探针实时荧光定量PCR的特异性试验结果图，同步对PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、TGEV病毒核酸进行扩增。
具体实施方式
本发明公开了引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供了一种用于猪流行性腹泻病毒的Taqman实时荧光定量RT-PCR检测方法，该方法所使用的特异性引物是针对猪流行性腹泻病毒S基因设计，能够特异性检测猪流行性腹泻病毒S基因，具体引物核苷酸的序列为：
上游引物F1：5'-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3'；(如SEQ ID NO:1所示)
下游引物R1：5'-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3'；(如SEQ ID NO:2所示)
探针：5'-F-ACCTGTTGTTGCCATTACCACGACTCCTG-Q-3'；(如SEQ ID NO:3所示)
其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
使用该方法进行猪流行性腹泻病毒的检测具体步骤如下：
(1)提取样品RNA，反转录为cDNA；
(2)用荧光定量PCR引物上游引物F1、下游引物R1和探针进行荧光定量PCR反应：荧光定量PCR反应体系为：2x Taqmastermix takara10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.4μL，模板2.0μL，ddH2O补至20μL。
荧光定量PCR反应程序：95℃30s；40个循环：95℃5s，55℃退火30s；
根据荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Cq值并根据扩增曲线结果，判断待测样品中是否含有猪流行性腹泻病毒。
同时，本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒S基因缺失株的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，试剂盒包含上述荧光定量PCR引物、探针、PCR反应所需试剂以及阳性标准品。
上游引物F1：5'-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3'；(如SEQ ID NO:1所示)
下游引物R1：5'-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3'；(如SEQ ID NO:2所示)
探针：5'-F-ACCTGTTGTTGCCATTACCACGACTCCTG-Q-3'；(如SEQ ID NO:3所示)
其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
同时该荧光定量PCR试剂盒还包括扩增阳性标准质粒的上游引物F2、下游引物R2，引物序列为：
上游引物F2：5'-TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG-3'(如SEQ ID NO:4所示)
下游引物R2：5'-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3'(如SEQ ID NO:5所示)
荧光定量PCR反应体系为：2x Taq mastermix(takara)10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.4μL，DNA模板2.0μL，ddH2O补至20μL。
荧光定量PCR反应程序：95℃30s；40个循环：95℃5s，55℃退火30s；
利用上述试剂盒检测猪流行性腹泻病毒S基因的具体方法为：
(1)对样品预处理后提取样品的RNA，反转录为cDNA。
(2)以样品DNA为模板，使用本荧光定量PCR试剂盒中引物、探针配置反应体系，并按照反应程序进行PCR扩增。
(3)根据荧光定量PCR扩增的Cq值及扩增曲线判定该样品中是否含有猪流行性腹泻病毒。
本发明涉及的序列包括：
上游引物F1：5'-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3'；(如SEQ ID NO:1所示)
下游引物R1：5'-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3'；(如SEQ ID NO:2所示)
探针：5'-F-ACCTGTTGTTGCCATTACCACGACTCCTG-Q-3'；(如SEQ ID NO:3所示)
阳性标准质粒的上游引物F2、下游引物R2，引物序列为：
上游引物F2：5'-TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG-3'(如SEQ ID NO:4所示)
下游引物R2：5'-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3'(如SEQ ID NO:5所示)
本发明实施例1～实施例6中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1标准阳性模板的制备
1、引物及探针设计
(1)PCR阳性标准品引物：
上游引物F2：5'-TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG-3'(如SEQ ID NO:4所示)
下游引物R2：5'-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3'(如SEQ ID NO:5所示)
(2)荧光定量PCR引物序列为：
上游引物F1：5'-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3'；(如SEQ ID NO:1所示)
下游引物R1：5'-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3'；(如SEQ ID NO:2所示)
探针：5'-F-ACCTGTTGTTGCCATTACCACGACTCCTG-Q-3'；(如SEQ ID NO:3所示)
其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
2、猪流行性腹泻病毒RNA的提取
按照洛阳爱森生物RNA提取试剂盒说明书进行。
(1)将试剂条放置于试剂条架上，小心揭去试剂条上的热封膜。
(2)在试剂条1#/7#孔分别加入200μL采集到的样品。
(3)在试剂条1#/7#孔分别加入14μL裂解液B、裂解液C混合液。
(4)按次序将试剂条和搅拌套分别插入仪器指定位置，固定好。
(5)检查核酸提取程序并运行该程序。
(6)程序运行结束后，从第6#/12#孔吸出洗脱液保存于新的1.5mL灭菌离心管中，即为模板DNA。提取的DNA模板未能及时进行下游试验，应-20℃以下保存。
3、PCR
(1)PCR产物的克隆及鉴定
以病毒RNA为模板，进行反转录，结束后用荧光定量PCR引物外侧的特异性上游引物F2、下游引物R2进行PCR扩增，反应体系：2x Taqmastermix(TaKaRa)10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.4μL，DNA模板2.0μL，ddH2O补至20μL。
荧光定量PCR反应程序：95℃30s；40个循环：95℃5s，55℃退火30s；
(2)PCR产物的胶回收
扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，扩增得到大小为633bp的目标片段。将PCR产物按照OMEGA公司Gel ExtractionKit的使用说明书切胶回收目标片段，保存于-20℃。
(3)PCR产物的克隆及鉴定
连接及转化按照pEASY-Blunt CloningKit(TransGenBiotech)说明书进行。
在微型离心管中依次加入溶液：
PCR产物 4μL
CloningVector 1μL
轻轻混合，25℃反应20min。反应结束后，将离心管置于冰上。
(4)连接产物转化
1)加连接产物于50μL感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴20min；
2)42℃热激30s，立即置于冰上2min；
3)加250μL平衡至室温的LB培养基，200rpm、37℃孵育1h；
4)取8μL 500mM IPTG、40μL 20mg/mL X-gal混合，均匀地涂于准备好的平板上，在37℃放置30min；
5)待IPTG、X-gal吸收后，取200μL菌液涂板，培养过夜(为得到较多克隆，4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜)，观察菌落生长情况。
(5)克隆产物的鉴定
挑选白色菌落至10μL无菌水中，涡旋混合。取1μL混合液用作PCR反应的模板，建立20μL反应体系，用M13F、M13R引物(M13F：5’-GGTAACGCCAGGGTTTTCC-3’(如SEQ ID NO:6所示)，M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’(如SEQ ID NO:7所示))进行鉴定。将鉴定正确的重组菌，扩大培养后提质粒，双酶切鉴定，同时将此质粒送测序公司测序，测序结果正确的阳性重组质粒命名，作为实时荧光定量PCR的标准品。根据核酸浓度和分子质量计算标准品核酸拷贝数。
实施例2反应条件的优化
采用梯度试验，以出现最高荧光值，最小Cq值及在溶解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，对荧光定量PCR的引物、探针、酶的浓度及延伸温度进行优化。得到的最佳荧光定量PCR反应体系：2x Taqmastermix(TaKaRa)10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.4μL，DNA模板2.0μL，ddH2O补至20μL。
荧光定量PCR反应程序：95℃30s；40个循环：95℃5s，55℃退火30s。
实施例3荧光定量RT-PCR反应标准曲线的建立
将标准品pEASY-Blunt-S利用DNase/RNase-Free去离子水进行10倍系列稀释(3.16×102～3.16×107copies/μL)，使用美国伯乐CFX96 Touch荧光定量PCR仪以优化后的体系及程序进行扩增，建立标准曲线，如图2所示。结果显示，扩增曲线与Cq值之间的线性关系紧密，相关系数R2达0.999，表明线性关系良好。
实施例4敏感性试验
将标准品pEASY-Blunt-S利用DNase/RNase-F去离子水进行10倍系列稀释，并分别以稀释后的质粒为模板进行荧光定量PCR(3.16×100～3.16×104copies/μL)扩增，结果如图3所示，本方法的最低检测限度为3.16×101copies/μL。表明本方法具有较高的敏感性。
实施例5特异性试验
以猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒cDNA或DNA为模板，用本荧光定量PCR方法进行扩增，试验结果如图4所示，仅PEDV出现良好的扩增曲线，表明本试验所建立的荧光定量PCR具有较高特异性。
实施例6猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒制备
一种PEDV病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包含下列引物及探针。
上游引物F1：5'-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3'；(如SEQ ID NO:1所示)
下游引物R1：5'-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3'；(如SEQ ID NO:2所示)
探针：5'-F-ACCTGTTGTTGCCATTACCACGACTCCTG-Q-3'；(如SEQ ID NO:3所示)
其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
同时该荧光定量PCR试剂盒还包括扩增阳性标准质粒的上游引物F2、下游引物R2，引物序列为：
上游引物F2：5'-TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG-3'(如SEQ ID NO:4所示)
下游引物R2：5'-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3'(如SEQ ID NO:5所示)
荧光定量PCR反应体系为：2x Taq mastermix takara10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.4μL，DNA模板2.0μL，ddH2O补至20μL。
荧光定量PCR反应程序：95℃30s；40个循环：95℃5s，55℃退火30s。
利用上述荧光定量PCR试剂盒检测猪新型冠状病毒的具体方法为：
(1)对样品预处理后提取样品的RNA，反转录为cDNA。
(2)以样品cDNA为模板，使用本荧光定量PCR试剂盒中引物、探针配置反应体系，并按照反应程序进行PCR扩增；
(3)根据荧光定量PCR扩增的Cq值及扩增曲线，判定该样品中是否含有PEDV病毒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.引物组，其特征在于，所述引物组具有：
(1)、如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
2.探针，其特征在于，所述探针具有：
(5)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
(6)、与(5)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(5)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(7)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(8)、与(5)、(6)或(7)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
3.如权利要求3所述的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列的5’端连接荧光报告基团，3’端连接淬灭基团。
4.检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组和/或如权利要求2或3所述的探针以及可接受的助剂。
5.如权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，还包括：Taq mastermix、阳性标准质粒、阳性标准质粒的引物组和模板；
所述阳性标准质粒的引物组具有如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的序列。
6.如权利要求4或5所述的检测试剂，其特征在于，所述探针的浓度为10μM，所述引物组的浓度为10μM。
7.检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4至6任一项所述的检测试剂以及可接受的载体或装置。
8.如权利要求1所述的引物组、如权利要求2或3所述的探针、如权利要求4至6任一项所述的检测试剂和/或如权利要求7所述的检测试剂盒在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测包括如下步骤：获得所述样品的cDNA与如权利要求4至6任一项所述的检测试剂和/或如权利要求7所述的检测试剂盒混合，扩增，根据Cq值和扩增曲线，获得所述样品是否为阳性。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述扩增的程序包括：95℃30s；40个循环：95℃5s，55℃退火30s。
CN202311224467.XA 2023-09-21 2023-09-21 引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用 Pending CN117143866A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311224467.XA CN117143866A (zh) 2023-09-21 2023-09-21 引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311224467.XA CN117143866A (zh) 2023-09-21 2023-09-21 引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117143866A true CN117143866A (zh) 2023-12-01

Family

ID=88900803

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311224467.XA Pending CN117143866A (zh) 2023-09-21 2023-09-21 引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117143866A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107475459B (zh) 同时鉴别美洲型prrsv经典毒株、变异毒株及新型病毒类nadc30毒株的检测方法
CN110760620A (zh) 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法
CN107190104B (zh) 五种猪腹泻病毒多重实时荧光定量pcr快速诊断试剂盒及应用
CN110951916A (zh) 一种基于实时荧光逆转录重组酶聚合酶核酸扩增技术检测SADS-CoV的引物和试剂盒
CN113462820A (zh) 实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重rt-pcr引物探针组、试剂盒及其检测方法
CN113774168A (zh) 2019新型冠状病毒及其德尔塔和拉姆达变异株分型核酸检测试剂盒及检测方法
CN112739833A (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
CN113774169A (zh) 2019新型冠状病毒德尔塔变异株核酸检测试剂、试剂盒及检测方法
CN111471797B (zh) 用于检测猫冠状病毒的rt-rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法
CN107699635B (zh) 猪流行性腹泻病毒荧光rpa检测方法
Zhao et al. A lateral flow dipstick combined with reverse transcription recombinase polymerase amplification for rapid and visual detection of the bovine respirovirus 3
CN116814859A (zh) 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法
CN112280899A (zh) 猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用
CN116656845A (zh) 诊断布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN107937615B (zh) 用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针
CN117143866A (zh) 引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测猪流行性腹泻的产品中的应用
CN114540546A (zh) 用于prrsv和csfv二重荧光定量pcr检测的引物探针组、试剂盒及检测方法
CN109576394B (zh) 一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物及应用
CN117187240A (zh) 引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用
CN113549709A (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
CN117050992A (zh) 引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测SADS-CoV新型冠状病毒的产品中的应用
CN115141826B (zh) Rpa引物对及其应用、可视化检测pcv4的试剂盒及其应用和检测pcv4方法
CN117344061B (zh) 一种同时检测五种人源病毒ebv、hbv、hcv、hiv、hpv的方法、试剂盒、引物和探针及其应用
CN116515840B (zh) 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法
CN116064961A (zh) 用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光rt-raa检测的产品和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination