CN117187240A - 引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。本发明提供了引物组，所述引物组具有：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明所采用的ASFV 177病毒荧光定量PCR方法相比于普通PCR检测方法，具有操作简便，特异性强，敏感度高，重复性好等优点，对ASFV 177病毒的临床检测具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种猪的急性、高度接触性传染病。一旦出现发病，病程短发病快，表现为皮肤发绀、高热、严重出血等症状，病死率接近100％。
2018年8月，非洲猪瘟病毒首次传入我国，随后快速蔓延，给我国养猪业带来巨大损失。ASFV是囊膜双链DNA病毒，通过虫媒传播，基因组170～193kbp，编码多种结构蛋白和非结构蛋白。由于病毒结构的多样、强抵抗力及复杂免疫逃避机制，使得临床对非洲猪瘟的防控非常困难，目前国内也还未研发出安全、有效的商品化疫苗及药物。临床只能通过快速检测鉴别及快速剔除阳性猪只进行有效的防控。
目前临床上对非洲猪瘟的检测方法有：常规PCR、荧光定量PCR、ELISA等，各类检测方法检测效果对比中，荧光定量PCR相比其他检测方法，灵敏度高、特异性强、检测周期短等优点，目前是临床上对非洲猪瘟最普及的检测方法。
2022年，首个ASFV I177L商品化缺失疫苗在越南首次批准上市。但依照目前研究表明，该弱毒疫苗在生物安全方面还存在水平传播的风险，随着感染代次的增加，病毒还能保持较高病毒滴度，市面该疫苗的批注使用引起的传播风险可能会给生猪养殖产业的生物安全带来较大的威胁，对临床非洲猪瘟病毒的防控带来一定的挑战。
目前，ASFV I177L基因缺失株是在野生型毒株基础上缺失了I177L基因，为防控ASFV I177L基因缺失疫苗在我国的传播，建立一种快速、有效鉴别该基因缺失毒株的检测方法迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。本发明所采用的ASFV 177病毒荧光定量PCR方法相比于普通PCR检测方法，具有操作简便，特异性强，敏感度高，重复性好等优点，对ASFV 177病毒的临床检测具有重要的现实意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物组，所述引物组具有：
(1)、如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
本发明还提供了探针，所述探针具有：
(5)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
(6)、与(5)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(5)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(7)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(8)、与(5)、(6)或(7)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述探针的核苷酸序列的5’端连接荧光报告基团，3’端连接淬灭基团。
在本发明的一些实施方案中，上述探针中，所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。
本发明还提供了检测试剂，包括上述引物组和/或上述探针以及可接受的助剂。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂，还包括：Taq master mix、阳性标准质粒、阳性标准质粒的引物组和模板；
所述阳性标准质粒的引物组具有如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的序列。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中所述探针的浓度为10μM，所述引物组的浓度为10μM。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，上游引物的浓度为10μM，下游引物的浓度为10μM。
本发明还提供了检测试剂盒，包括上述检测试剂以及可接受的载体或装置。
本发明还提供了上述引物组、上述探针、上述检测试剂和/或上述检测试剂盒在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述非洲猪瘟病毒为非洲猪瘟病毒I177L基因缺失病毒。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述检测包括如下步骤：获得所述样品的cDNA与上述检测试剂和/或上述检测试剂盒混合，扩增，根据Cq值和扩增曲线，获得所述样品是否为阳性。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述扩增的程序包括：95℃30s；40个循环：95℃5s，60℃退火30s。
本发明的一些实施方案中，上述应用中所述扩增的体系包括：
本发明提供了引物组，所述引物组具有：
(1)、如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
本发明的有益效果包括：
(1)、操作简单：本发明不需电泳、显色等过程，自动化程度高，一步实现扩增和检测。
(2)、特异性强：本发明能够特异性检测出非洲猪瘟病毒I177L基因缺失病毒，对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒等毒株的检测结果均为阴性，具有很好的特异性。
(3)、敏感性高：荧光检测技术是极其灵敏的检测技术，本发明用于非洲猪瘟病毒I177L基因缺失病毒的检测，其最低检测限为3.43×101copies/μL。
(4)、准确性高：本发明所使用的引物是针对非洲猪瘟病毒I177L基因设计，能真实、准确地反应出非洲猪瘟病毒I177L基因缺失病毒含量。
(5)、本发明对产物可以实现定量：由于荧光信号的强弱和扩增产物量成线性对应关系，通过收集荧光信号可以实现产物的定量。
(6)、本发明具有操作简单，灵敏度高，特异性强，准确快速等特点，有利于在临床实践中推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明实施例提供的ASFV 177基因PCR扩增产物电泳图：自左向右依次为M-DNAMarker2000、ASFV 177基因的PCR产物(811bp)；
图2示本发明实施例提供的ASFV 177TaqMan探针实时荧光定量PCR的标准曲线图；
图3示本发明实施例提供的ASFV 177TaqMan探针实时荧光定量PCR的灵敏性试验结果图，图中曲线分别表示ASFV 177质粒浓度为3.43×104copies/μL、3.43×103copies/μL、3.43×102copies/μL、3.43×101copies/μL、3.43×100copies/μL；
图4示本发明实施例提供的ASFV 177TaqMan探针实时荧光定量PCR的特异性试验结果图，同步对PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV病毒核酸进行扩增。
具体实施方式
本发明公开了引物组、探针、检测试剂盒及其在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供了一种用于非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株的Taqman实时荧光定量PCR检测方法，该方法所使用的特异性引物是针对非洲猪瘟病毒I177L基因设计，能够特异性检测非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株，具体引物核苷酸的序列为：
上游引物F1：5'-GCGAAGGGGGATCCGTATAA-3'；(如SEQ ID NO:1所示)
下游引物R1：5'-TGCCAAGCTTCAGCCACTAA-3'；(如SEQ ID NO:2所示)
探针：5'-F-ATCCTAGCTTGCGTAATGGCTATTAAGT-Q-3'；(如SEQ ID NO:3所示)
其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
使用该方法进行非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株的检测具体步骤如下：
(1)提取样品DNA；
(2)用荧光定量PCR引物上游引物F1、下游引物R1和探针进行荧光定量PCR反应：荧光定量PCR反应体系为：2x Taqmastermix takara10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.4μL，DNA模板2.0μL，ddH2O补至20μL。
荧光定量PCR反应程序：95℃30s；40个循环：95℃5s，60℃退火30s；
根据荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Cq值并根据扩增曲线结果，判断待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒I177L基因缺失病毒。
同时，本发明还提供了一种检测非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株的荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒包含上述荧光定量PCR引物、探针、PCR反应所需试剂以及阳性标准品。
荧光定量PCR引物序列为：
上游引物F1：5'-GCGAAGGGGGATCCGTATAA-3'；(如SEQ ID NO:1所示)
下游引物R1：5'-TGCCAAGCTTCAGCCACTAA-3'；(如SEQ ID NO:2所示)
探针：5'-F-ATCCTAGCTTGCGTAATGGCTATTAAGT-Q-3'；(如SEQ ID NO:3所示)
其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。该引物及探针的浓度均为10uM。
同时该荧光定量PCR试剂盒还包括扩增阳性标准质粒的上游引物F2、下游引物R2，引物序列为：
上游引物F2：5'-TATCAGGTGTCTGTACTCTG-3'(如SEQ ID NO:4所示)
下游引物R2：5'-CAGTGATATTCCACTCTGATA-3'(如SEQ ID NO:5所示)
荧光定量PCR反应体系为：2x taq master mix takara10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.4μL，DNA模板2.0μL，ddH2O补至20μL。
荧光定量PCR反应程序：95℃30s；40个循环：95℃5s，60℃退火30s；
利用上述试剂盒检测非洲猪瘟病毒I177L基因缺失病毒的具体方法为：
(1)对样品预处理后提取样品的DNA。
(2)以样品DNA为模板，使用本荧光定量PCR试剂盒中引物、探针配置反应体系，并按照反应程序进行PCR扩增。
(3)根据荧光定量PCR扩增的Cq值及扩增曲线判定该样品中是否含有非洲猪瘟病毒I177L基因缺失病毒。
本发明涉及的序列包括：
上游引物F1：5'-GCGAAGGGGGATCCGTATAA-3'；(如SEQ ID NO:1所示)
下游引物R1：5'-TGCCAAGCTTCAGCCACTAA-3'；(如SEQ ID NO:2所示)
探针：5'-F-ATCCTAGCTTGCGTAATGGCTATTAAGT-Q-3'；(如SEQ ID NO:3所示)
阳性标准质粒的上游引物F2、下游引物R2，引物序列为：
上游引物F2：5'-TATCAGGTGTCTGTACTCTG-3'(如SEQ ID NO:4所示)
下游引物R2：5'-CAGTGATATTCCACTCTGATA-3'(如SEQ ID NO:5所示)
本发明实施例1～实施例6中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1标准阳性模板的制备
1、引物及探针设计
PCR阳性标准品引物：
上游引物F2：5'-TATCAGGTGTCTGTACTCTG-3'(如SEQ ID NO:4所示)
下游引物R2：5'-CAGTGATATTCCACTCTGATA-3'(如SEQ ID NO:5所示)
荧光定量PCR引物序列为：
上游引物F1：5'-GCGAAGGGGGATCCGTATAA-3'；(如SEQ ID NO:1所示)
下游引物R1：5'-TGCCAAGCTTCAGCCACTAA-3'；(如SEQ ID NO:2所示)
探针：5'-F-ATCCTAGCTTGCGTAATGGCTATTAAGT-Q-3'；(如SEQ ID NO:3所示)
其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。该引物及探针的浓度均为10uM。
2、ASFV 177病毒DNA的提取
按照洛阳爱森生物RNA提取试剂盒说明书进行。
(1)将试剂条放置于试剂条架上，小心揭去试剂条上的热封膜。
(2)在试剂条1#/7#孔分别加入200μL采集到的样品。
(3)在试剂条1#/7#孔分别加入14μL裂解液B、裂解液C混合液。
(4)按次序将试剂条和搅拌套分别插入仪器指定位置，固定好。
(5)检查核酸提取程序并运行该程序。
(6)程序运行结束后，从第6#/12#孔吸出洗脱液保存于新的1.5ml灭菌离心管中，即为模板DNA。提取的DNA模板未能及时进行下游试验，应-20℃以下保存。
3、PCR
(1)PCR产物的克隆及鉴定
以病毒DNA为模板，用荧光定量PCR引物外侧的特异性上游引物F2、下游引物R2进行PCR扩增，反应体系：2x Taq mastermix(TaKaRa)10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.4μL，DNA模板2.0μL，ddH2O补至20μL。
荧光定量PCR反应程序：95℃30s；40个循环：95℃5s，60℃退火30s；
(2)PCR产物的胶回收
扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，扩增得到大小为811bp的目标片段。将PCR产物按照OMEGA公司Gel ExtractionKit的使用说明书切胶回收目标片段，保存于-20℃。
(3)PCR产物的克隆及鉴定
连接及转化按照pEASY-Blunt Cloning Kit(TransGen Biotech)说明书进行。
在微型离心管中依次加入溶液：
PCR产物 4μL
pEASY-Blunt Cloning Vector 1μL
轻轻混合，25℃反应20min。反应结束后，将离心管置于冰上。
(4)连接产物转化
1)加连接产物于50μL感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴20min；
2)42℃热激30s，立即置于冰上2min；
3)加250μL平衡至室温的LB培养基，200rpm、37℃孵育1h；
4)取8μL 500mM IPTG、40μL 20mg/ml X-gal混合，均匀地涂于准备好的平板上，在37℃放置30min；
5)待IPTG、X-gal吸收后，取200μL菌液涂板，培养过夜(为得到较多克隆，4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜)，观察菌落生长情况。
(5)克隆产物的鉴定
挑选白色菌落至10μL无菌水中，涡旋混合。取1μL混合液用作PCR反应的模板，建立20μL反应体系，用M13F、M13R引物(M13F：5’-GGTA ACGCCAGGGTTTTCC-3’(如SEQ ID NO:6所示)，M13R：5’-CAGGA AACAGCTATGACC-3’(如SEQ ID NO:7所示))进行鉴定。将鉴定正确的重组菌，扩大培养后提质粒，双酶切鉴定，同时将此质粒送测序公司测序，测序结果正确的阳性重组质粒命名，作为实时荧光定量PCR的标准品。根据核酸浓度和分子质量计算标准品核酸拷贝数。
实施例2反应条件的优化
采用梯度试验，以出现最高荧光值，最小Cq值及在溶解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，对荧光定量PCR的引物、探针、酶的浓度及延伸温度进行优化。得到的最佳荧光定量PCR反应体系：2x Taqmastermix(TaKaRa)10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.4μL，DNA模板2.0μL，ddH2O补至20μL。
荧光定量PCR反应程序：95℃30s；40个循环：95℃5s，60℃退火30s。
实施例3荧光定量PCR反应标准曲线的建立
将标准品pEASY-Blunt-S利用DNase/RNase-Free去离子水进行10倍系列稀释(3.43×102～3.43×107copies/μL)，使用美国伯乐CFX96 Touch荧光定量PCR仪以优化后的体系及程序进行扩增，建立标准曲线，如图2所示。结果显示，扩增曲线与Cq值之间的线性关系紧密，相关系数R2达0.996，表明线性关系良好。
实施例4敏感性试验
将标准品pEASY-Blunt-S利用DNase/RNase-F去离子水进行10倍系列稀释，并分别以稀释后的质粒为模板进行荧光定量PCR(3.43×100～3.43×104copies/μL)扩增，结果如图3所示，本方法的最低检测限度为3.43×101copies/μL。表明本方法具有较高的敏感性。
实施例5特异性试验
以猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒cDNA或DNA为模板，用本荧光定量PCR方法进行扩增，试验结果如图4所示，仅ASFV出现良好的扩增曲线，表明本试验所建立的荧光定量PCR具有较高特异性。
实施例6ASFV 177病毒荧光定量PCR检测试剂盒制备
一种ASFV 177病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包含下列引物及探针。
荧光定量PCR引物序列为：
上游引物F1：5'-GCGAAGGGGGATCCGTATAA-3'；(如SEQ ID NO:1所示)
下游引物R1：5'-TGCCAAGCTTCAGCCACTAA-3'；(如SEQ ID NO:2所示)
探针：5'-F-ATCCTAGCTTGCGTAATGGCTATTAAGT-Q-3'；(如SEQ ID NO:3所示)
其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。该引物及探针的浓度均为10μM。
同时该荧光定量PCR试剂盒还包括扩增阳性标准质粒的上游引物F2、下游引物R2，引物序列为：
上游引物F2：5'-TATCAGGTGTCTGTACTCTG-3'(如SEQ ID NO:4所示)
下游引物R2：5'-CAGTGATATTCCACTCTGATA-3'(如SEQ ID NO:5所示)
荧光定量PCR反应体系为：2x taq mastermix takara10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.4μL，DNA模板2.0μL，ddH2O补至20μL。
荧光定量PCR反应程序：95℃30s；40个循环：95℃5s，60℃退火30s。
利用上述荧光定量PCR试剂盒检测猪新型冠状病毒的具体方法为：
(1)对样品预处理后提取样品的DNA。
(2)以样品DNA为模板，使用本荧光定量PCR试剂盒中引物、探针配置反应体系，并按照反应程序进行PCR扩增；
(3)根据荧光定量PCR扩增的Cq值及扩增曲线，判定该样品中是否含有ASFV 177病毒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.引物组，其特征在于，所述引物组具有：
(1)、如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
2.探针，其特征在于，所述探针具有：
(5)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
(6)、与(5)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(5)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(7)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(8)、与(5)、(6)或(7)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
3.如权利要求3所述的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列的5’端连接荧光报告基团，3’端连接淬灭基团。
4.检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组和/或如权利要求2或3所述的探针以及可接受的助剂。
5.如权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，还包括：Taq mastermix、阳性标准质粒、阳性标准质粒的引物组和模板；
所述阳性标准质粒的引物组具有如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的序列。
6.如权利要求4或5所述的检测试剂，其特征在于，所述探针的浓度为10μM，所述引物组的浓度为10μM。
7.检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4至6任一项所述的检测试剂以及可接受的载体或装置。
8.如权利要求1所述的引物组、如权利要求2或3所述的探针、如权利要求4至6任一项所述的检测试剂和/或如权利要求7所述的检测试剂盒在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测包括如下步骤：获得所述样品的cDNA与如权利要求4至6任一项所述的检测试剂和/或如权利要求7所述的检测试剂盒混合，扩增，根据Cq值和扩增曲线，获得所述样品是否为阳性。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述扩增的程序包括：95℃30s；40个循环：95℃5s，60℃退火30s。
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