CN114058687A - 家鸽雌雄干粉化lamp快速检测试剂盒 - Google Patents

家鸽雌雄干粉化lamp快速检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了家鸽雌雄干粉化LAMP快速检测试剂盒，试剂盒由干粉化反应液、反应复溶液、玻璃态显色液、反应隔离液、样本裂解液和阳性质控样本，以上六种试剂均置于对应容器中，本试剂盒包含有对应雌性鸟类特有的W染色体八个区段设计的6条引物，通过加入反应液和显色液可对雌鸟特有的W染色体进行鉴定检测，从而达到区分鸟类雌雄的目的。本检测试剂盒具有特异性强、灵敏度高特点，适用于鸟类性别的区分。本检测试剂盒中反应试剂为冻干态，常温下性质稳定，便于运输及储存；此外本检测试剂盒阴阳性显色差异明显，无需借助大型仪器设备，可肉眼快速识别检测结果，且操作简单、快捷，适合肉鸽等大规模养殖场对雌雄性别进行现场快速检测，具有很大的市场应用价值。

Description

家鸽雌雄干粉化LAMP快速检测试剂盒
技术领域
本发明涉及家鸽雌雄鉴别技术领域，尤其适用于家鸽雌雄鉴别LAMP核酸检测引物及其试剂盒。
背景技术
对于一些雌雄差异较大的鸟类可以通过羽毛的颜色或个体大小来区分。但几乎一半以上的鸟类不能通过外部特征进行性别判定,特别是对于幼鸟,作为性别标记的成年鸟类羽色特征还未出现,这就给人工育雏、尤其是大规模畜禽养殖和珍稀动物的人工培育带来很大困难。尤其是在鸽子养殖生产作业中，准确且及早地鉴定其性别，将利于产业化饲养管理与种鸽选育，节约禽类饲养成本,提高养殖效率。翻肛鉴别法是目前在家禽生产中运用较广泛的方法,但是初生鸽体型小,难以在早期进行性别鉴定,生产上一般到5月龄左右才能用此方法鉴别,同时鉴别的结果正确率低,耗时耗力,对鸽子应激大。
随着生物技术的不断发展,研究出了一系列鸽子性别鉴定的分子生物学方法。其中主要有PCR技术、荧光定量PCR技术、LAMP技术，PCR方法主要利用和Z染色体和W染色体连锁的CHD等基因内含子的差异设计特异性引物，通过PCR扩增后产生的片段大小和数量来区分鸽子的性别，该技术成本低，检测技术成熟，准确性高，但操作费时费力，一般需要凝胶电泳进行结果判定，检测周期较长；荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光标记探针，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和对未知模板进行定量分析的方法区分雌雄，该检测技术无需凝胶电泳进行结果判读，但需要大型荧光定量PCR仪器，同时对样本质量要求较高，且操作程序较为复杂。
LAMP方法只需使用恒温加热仪器或者水浴锅，无需专业人员，操作简便，30-60分钟可以根据反应显色差异判断鸽子性别，适合肉鸽、信鸽等大规模养殖场对雌雄性别进行现场快速检测，具有很大的市场应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供特异性强、灵敏度高、仪器要求低、操作简便快速、成本低的用于区分鸽子性别的LAMP检测试剂盒,以满足肉鸽等大规模养殖场对雌雄性别进行现场快速检测的需要。
为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案:
1、用于区分鸽子性别的LAMP引物,包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LoopF和LoopB，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。
表1：引物序列表
Figure 479183DEST_PATH_IMAGE001
2、 用于区分鸽子性别的LAMP检测试剂盒含有以下试剂: 冻干态的反应缓冲液（内含内引物F3和B3，外引物FIP和BIP，环引物LoopF和LoopB，各引物对序列分别为序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6所列的碱基序列；其中内引物F3和B3为5pmol，外引物FIP和BIP为40pmol，环引物LoopF和LoopB为20pmol。）、反应复溶液、玻璃态显色液、反应隔离液、样本裂解液和阳性质控样本。
3、用于区分鸽子性别的LAMP检测试剂盒反应缓冲液为冻干态，冻干态的反应液体包含有Bst DNA聚合酶、dNTP、内引物F3和B3、外引物FIP和BIP、环引物LoopF和LoopB及冻干保护剂，冻干保护剂由甘露醇、海藻糖、聚乙二醇-20000组成，其中甘露醇为2.5％（质量分数），海藻糖为2％（质量分数）聚乙二醇-20000为2.5％（质量分数）。干粉状反应液冻干程序见下表所示；在常温下性质稳定，便于储存及运输，在加入反应复溶液及经过样本裂解液处理后的待检样本后，无需复杂变温仪器，在63℃下恒温加热反应30~45min即可得到反应终产物。
表2：冻干程序
Figure 396324DEST_PATH_IMAGE002
4、该检测试剂盒荧光可目视化检测试剂为Green-DNA Dye（SYBR-green1），荧光可视化试剂在反应过程中被制成玻璃态固定在反应管盖上，在反应中不会抑制核酸扩增反应，反应完成后通过翻转反应管使显色试剂溶解并显色。在整个核酸扩增反应过程中及显色反应过程中，均无需打开反应管，同时反应液上加入反应隔离液，能最大程度消除气溶胶的污染，避免假阳性结果产生，从而使检测显色区分明显，结果准确可靠。
本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术,并根据雌性个体特有的W染色体，设计两个特异性外引物F3和B3、两个特异性内物FIP和BIP和一个特异性环引物LF，由此发明了用于区分鸽子雌雄的LAMP试剂盒，应用本发明的LAMP试剂盒，在45分钟可以根据反应显色差异判断鸽子性别，特别适合肉鸽等大规模养殖场对雌雄性别进行现场快速检测。本
检测具有以下突出优点；
<1>特异性强
实验证明，应用本发明对鸽子性别进行检测鉴别，无假阳性及假阴性结果，与PCR检测结果一致。
<2>灵敏度高
本检测试剂盒理论可检测的阳性质控最低模板拷贝数为102，带羽管及羽根的一至二根0.2mm-0.5mm羽毛经样本裂解液处理样本后，稀释至100倍依然可以有明显的显色反应，且和阴性对照显色差异显著，肉眼可明显区分。
<3>检测快速
普通PCR整个过程在2-4小时左右才能得出结果,应用本发明的试剂盒建立的检测方法,无需变温仪器，操作简单快速，恒温63℃下可在45min获得LAMP反应结果,反应迅速,结果可靠。
<4>不造成污染
荧光可视化试剂在反应过程中被制成玻璃态固定在反应管盖上，在反应中不会抑制核酸扩增反应，反应完成后通过翻转反应管使显色试剂溶解并显色。在整个核酸扩增反应过程中及显色反应过程中，均无需打开反应管，同时反应液上加入反应隔离液，能最大程度消除开盖跑气溶胶从而污染实验室的危险，避免假阳性结果产生。
附图说明
图1是应用本发明建立的LAMP检测方法的特异性检测结果图；
图2是应用本发明建立的LAMP检测方法的敏感性检测结果图；
图3是应用本发明建立的LAMP检测方法的荧光可视化检测结果图：
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明,但不限定本发明的保护范围。
反应的引物设计和合成
根据GenBank中的鸽子性染色体W基因序列，利用LAMP法引物设计辅助软件PrimerExplorer V4 设计并筛选出一套LAMP引物，包括内引物F3和B3，外引物FIP和BIP，环引物LoopF和LoopB。引物序列见下所述；
正向外侧引物F3:
5-GCTGAAATAAAAGCACTGC-3 (见序列表SEQ.ID.NO.1）
反向外侧引物B3:
5-GAGTCACGAGGTTCAGAA-3 (见序列表SEQ.ID.NO.2)
正向内侧引物FIP
6-ACACACTTTGCACTCAGAAACATCCGTGGTTATGTGTCTC-3(见序列表SEQ.ID.NO.3)
反向内侧引物BIP
5-GGGGTTCAAGTCTCTCTTGAGACAATCCTAGTTTCAGACTTGG-3(见序列表SEQ.ID.NO.4)
环引物LoopB
5-AAGGGAGGTGTTAGCAAAC-3 (见序列表SEQ.ID.NO.5）
环引物LoopF
6-TCCTTTAGATGTAAACCGTTGA-3 (见序列表SEQ.ID.NO.6）
反应缓冲液干粉化制备
一种鸽子雌雄检测试剂盒，所述试剂盒包括上述LAMP引物外，还包括dNTP、Bst聚合酶、超纯水、样本裂解液、反应缓冲液、冻干保护液、Green-DNA Dye（SYBR-green1）、阳性质控样。其中引物组、dNTP、Bst聚合酶在冻干保护剂保护下按照程序制成干粉状态，冻干保护剂由甘露醇、海藻糖、聚乙二醇-20000组成，其中甘露醇为2.5％（质量分数），海藻糖为2％（质量分数）聚乙二醇-20000为2.5％（质量分数）。引物组、dNTP、Bst聚合酶按照单次反应所需量被分装到单个反应管并制备成干粉状。
样本裂解液制备
一种鸽子雌雄检测试剂盒，所述试剂盒中含有用于样本粗处理的样本裂解液，样本裂解液由0.9%的氯化钠水溶液组成，样本裂解液单独装在离心管中，使用时按照每个样本100μL用量对样本进行前处理。
阳性对照模板的准备
一种鸽子雌雄检测试剂盒，所述试剂盒中含有用于评估试剂盒质量的阳性指控样本，阳性质控样本为人工合成的基因，浓度为10μM。基因序列见基因序列表SEQ.ID.NO.7所述，阳性质控样本单独装于保存管中，可在检测前或检测中用于评估试剂盒的产品质量和阳性样的显色反应颜色变化参考。
阳性质控合成序列：SEQ.ID.NO.75’-TGGTTTCCCAGCGCTGAAATAAAAGCACTGCATATAACTAAGTCCGTGGTTATGTGTCTCGTTTGCTAACACCTCCCTTGCTGCAATATGTTTCTGAGTGCAAAGTGTGTGGCCTGATCAGTGTAAAGTGCACATAAAAGGGGGTTCAAGTCTCTCTTGAGAATGGGAAAATATCCTTTAGATGTAAACCGTTGACCAAGTCTGAAACTAGGATTGGATCCAGCCGCACCTAAACTCCTCTCTGAAGGAGTTTAGAAAGCAAGGGGGTCCTTTCTGAACCTCGTGACTCAATGGGAGGGTGTCCCTGAATTTTTTTAGGCATGGGAAATAAAACTCGGCATAGAAAAGGGGACGCCCTTAGCCGAGGTATTGC-3’
显色管盖的准备
一种鸽子雌雄检测试剂盒，所述试剂盒中含有用于颜色反应的显色液，在反应前该显色液为玻璃态固体并被黏附在管盖上，反应结束后通过反转反应管使显色试剂溶解并显色，显色试剂按照单次反应所需的量（2μL浓度为1000 X Green-DNA Dye ）被分装并被玻璃态固定在管盖上，显色试剂显色的玻璃态制备通过玻璃态混合物在将显色管盖置于50℃温箱中烘干约0.5-1h制备。其中玻璃态聚合物由5％（质量分数）海藻糖、4％（质量分数）牛血清蛋白、2％（体积分数）甘油组成。
反应体系的建立
一种鸽子雌雄检测试剂盒，所述试剂盒中单个LAMP反应体系包括以下：
1、冻干态反应缓冲液（干粉）
成分 含量
F3/B3 5pmol
FIP/BIP 40pmol
LoopF/LoopB 20pmol
Bst聚合酶 0.7U
DNTPs 0.2mM
2、复溶液：22.5μL混合液体
成分 含量
Tris-HCl 20mM
KCl 50mM
(NH4)2SO4 10nM
Tween-20 0.1％
3、样本：2.5μL样本经裂解处理后的上清液
成分 含量
DNA模板 10-20ng
检测试剂盒具体实施方法
一种鸽子雌雄检测试剂盒其具体使用方法为:
1. 样本处理
干净的剪刀、镊子剪取鸽子带羽管根部10mm-20mm的羽毛2-3根，加到1.5mL无菌离心管中，加入80 μL DNA提取液，于金属浴95℃加热10min，静置后上清即为核酸模板；
2. 反应缓冲液溶解配制及封闭
取出冻干检测试剂，每管加入22.5μL复溶液，保证冻干粉完全溶解；之后向每个反应管中加入30μL石蜡油，石蜡油和反应缓冲液分层并位于反应液上层。
3. 样本加入及扩增反应
向上述反应管中加入待测模板2.5μL，样时需穿过石蜡油加至反应管底部，盖上显色管盖，于金属浴63℃加热45min。
4. 显色判断
翻转反应管，轻微晃动反应液使显色试剂溶解，a)若待检样本反应管呈绿色，则可报告为检测对象阳性，即检测是雌性；b)若待检样本反应管呈橙色，则可报告为检测对象阴性，即检测是雌性；
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明较佳实施例，不能被认为用于本发明的实施范围，凡依本发明申请范围所做的均等变化与改进等，均应属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 北京宠耀基因科技服务有限公司
北京市畜牧总站
<120> 家鸽雌雄干粉化LAMP快速检测试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 540
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ncstnggctg aaataaaagc actgcgagtc acgaggttca gaaacacact ttgcactcag 60
aaacatccgt ggttatgtgt ctcggggttc aagtctctct tgagacaatc ctagtttcag 120
acttggaagg gaggtgttag caaactcctt tagatgtaaa ccgttgatgg tttcccagcg 180
ctgaaataaa agcactgcat ataactaagt ccgtggttat gtgtctcgtt tgctaacacc 240
tcccttgctg caatatgttt ctgagtgcaa agtgtgtggc ctgatcagtg taaagtgcac 300
ataaaagggg gttcaagtct ctcttgagaa tgggaaaata tcctttagat gtaaaccgtt 360
gaccaagtct gaaactagga ttggatccag ccgcacctaa actcctctct gaaggagttt 420
agaaagcaag ggggtccttt ctgaacctcg tgactcaatg ggagggtgtc cctgaatttt 480
tttaggcatg ggaaataaaa ctcggcatag aaaaggggac gcccttagcc gaggtattgc 540

Claims (6)

1.一种用于鉴定鸽子雌雄的LAMP检测试剂盒，其特征在于包含外引物和内引物和环引物，它们分别为序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6所列的碱基序列。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2.一种用于鉴定鸽子雌雄的LAMP检测试剂盒，其特征在于试剂盒包含如下6种试剂，反应复溶液、玻璃态显色液、反应隔离液、样本裂解液、阳性质控样本和冻干态的反应缓冲液（内含内引物F3和B3，外引物FIP和BIP，环引物LoopF和LoopB，各引物对序列分别为序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6所列的碱基序列；其中内引物F3和B3各为5pmol，外引物FIP和BIP各为40pmol，环引物LoopF和LoopB各为20pmol。
3.一种用于鉴定鸽子雌雄的LAMP检测试剂盒，其特征在于反应液为冻干形态。
4.一种用于鉴定鸽子雌雄的LAMP检测试剂盒，其特征在于冻干态的反应液体包含有Bst DNA聚合酶、dNTP、内引物F3和B3、外引物FIP和BIP、环引物LoopF和LoopB及冻干保护剂，冻干保护剂由甘露醇、海藻糖、聚乙二醇-20000组成，其中甘露醇为2.5％（质量分数），海藻糖为2％（质量分数）聚乙二醇-20000为2.5％（质量分数）。
5.一种用于鉴定鸽子雌雄的LAMP检测试剂盒，其特征在于干粉状反应液冻干程序见下表所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
6.一种用于鉴定鸽子雌雄的LAMP检测试剂盒，其特征在于包含玻璃态的Green-DNADye（SYBR-green1）显色管盖，玻璃形态的显色管盖由10％蔗糖和Green-DNA Dye制备，制备方法为将10％蔗糖和Green-DNA Dye混匀后，滴加管盖上50-60℃烘干30min。
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