CN110540999A - 一种转基因油菜及其产品筛查阳性质粒分子pYCSC-1905及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因油菜及其产品筛查阳性质粒分子pYCSC‑1905的设计及其应用，涉及转基因安全领域中转基因油菜的安全监管和筛查检测技术。pYCSC‑1905的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。利用pYCSC‑1905作为阳性对照和质控样品，能对油菜及其产品进行转基因成分的普通PCR和实时荧光PCR筛查检测，对目前已知遗传信息的转基因油菜的覆盖率为100％；本发明解决了转基因油菜筛查检测中缺乏阳性对照或标准品的技术难题，避免了筛查检测中针对多个检测靶标设置多个阳性对照的问题，降低了制备多个阳性对照的人力成本和经济成本。

Description

一种转基因油菜及其产品筛查阳性质粒分子pYCSC-1905及其 应用

技术领域

本发明涉及转基因安全领域中转基因油菜的安全监管和筛查检测技术，尤其涉及一种阳性质粒分子pYCSC-1905的设计及其应用。

背景技术

近20多年来，全球转基因生物研发及商业化迅猛发展，1992年以来，全球批准了4133项转基因产品的监管审批，涉及26个转基因作物的476个转化体，种植面积累计超过23亿公顷，产生了巨大的经济效益。与此同时，转基因生物的安全性问题一直备受社会各界关注，为此，包括中国、欧盟、美国、日本和韩国等在内50多个国家和地区纷纷颁布实施转基因生物安全管理法律法规，以规范转基因生物的研发和产业化应用。

在转基因生物安全监管工作中，一方面要监管已批准进口或商业化转基因产品的种植及应用情况，另一方面要监管非授权转基因产品的非法种植或应用情况。非授权转基因产品是指未经批准而释放到市场上的转基因产品，包括在别的国家批准而在我国并未获批的转基因材料、田间非法种植的仅批准进口用作加工原料的转基因材料，以及尚处于试验阶段的转基因材料。转基因油菜是四大转基因作物之一，是食用油和饲料菜粕的重要来源，已在加拿大、美国、澳大利亚等国进行大规模商业化种植。为了满足食用油和菜粕供应，我国每年需从国外进口油菜籽，在2015年进口量超过500万吨，其中90％以上为转基因菜籽。我国也是油菜种植大国，转基因研究活跃，不断有品种进入田间试验阶段。由于转基因产品存在潜在的环境和食用安全风险，一旦发生非授权转基因油菜的非法扩散事件，将扰乱正常贸易秩序，在消费者中引发恐慌情绪，对国民经济、生活产生一系列的恶劣影响。国际上关于非授权转基因作物的报道屡见不鲜，我国急需建立针对非授权转基因油菜的检测监管技术体系。

对转基因油菜进行筛查检测是对非授权转基因油菜进行监管检测的第一步。经过十余年的转基因检测技术体系建设，我国已建立起完善的转基因油菜筛查检测技术标准体系，发布了一系列的标准，包括国家标准、农业部公告、进出口检验检疫标准等，另外欧盟也发布了相应的标准。但受原材料供应等方面的限制，筛查标准物质或标准样品的研制严重落后于检测方法的开发，导致在转基因油菜筛查检测过程中经常面临缺乏标准物质或标准样品的难题，影响了检测标准的实施。通过研制转基因油菜筛查检测的标准样品，将进一步完善我国的转基因检测、监测技术标准体系，有效发挥标准方法在转基因生物安全监管中的作用。通过研制、使用转基因油菜筛查阳性质粒分子和与之配套的检测方法，将大大提高我国对转基因油菜产品非法扩散的检测、监测水平，为我国的转基因生物安全监管提供有效的技术支撑。

结合上述考虑，以解决缺乏转基因油菜筛查检测用标准样品这一难题为切入点，分析转基因油菜中常用的筛查元件和标准方法中筛查元件的检测序列，确定进行转基因油菜筛查检测的靶标及靶标序列，与油菜内标基因聚合构建到常用载体pUC18载体骨架上，研制转基因油菜筛查检测用质粒分子。

经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何采用本发明的设计或相似设计构建转基因油菜筛查检测通用的阳性质粒分子和应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于以解决转基因检测工作中缺乏转基因油菜筛查检测用标准物质这一难题为切入点，调研转基因油菜的商业化现状和研发情况，确定转基因油菜的筛查检测靶标；调研针对筛查靶标发布的各种标准，确定各检测靶标的核苷酸序列；人工合成各筛查检测靶标和油菜内标基因的融合序列，构建到常用在pUC18中，为转基因油菜筛查检测提供阳性对照和质控样品。

本发明一个方面提供了一种转基因油菜及其产品筛查阳性质粒分子pYCSC-1905，其特征在于：碱基序列如下的SEQ ID NO.1所示

本发明另一个方面提供了一种转基因油菜及其产品筛查阳性质粒分子pYCSC-1905，其特征在于：其含有9个常用筛查靶标和2个油菜内标基因，依次为：(1)pCaMV35S启动子(P-CaMV35S)，如SEQ ID NO.2所示，

(2)pFMV35S启动子(P-FMV35S)，如SEQ ID NO.3所示，

(3)Bar基因，如SEQ ID NO.4所示，

(4)修饰的CP4-EPSPS基因(mCP4-EPSPS),如SEQ ID NO.5所示，

(5)HPT基因，如SEQ ID NO.6所示，

(6)NPTII基因，如SEQ ID NO.7所示，

(7)PAT基因，如SEQ ID NO.8所示，

(8)PinII终止子(T-PinII)，如SEQ ID NO.9所示，

(9)NOS终止子(T-NOS)，如SEQ ID NO.10所示，

(10)油菜内标基因HMG I/Y，如SEQ ID NO.11所示，

(11)油菜内标基因CruA，如SEQ ID NO.12所示,

在本发明的技术方案中，一种转基因油菜及其产品筛查阳性质粒分子pYCSC-1905为在pUC18载体上插入融合序列SEQ ID No.13，构成的质粒分子。

本发明另一个方面提供了本发明所述的质粒分子作为转基因油菜及其产品筛查的阳性对照和或质控样品。

本发明另一个方面提供了一种用于普通PCR筛查转基因油菜及其产品的试剂盒，其包括本发明所述的质粒分子以及转基因油菜筛查元件和油菜内标基因的检测引物。

在本发明的技术方案中，用于普通PCR筛查转基因油菜及其产品的试剂盒的引物对组合物如下：

Bar基因：

BarF 5′—GAAGGCACGCAACGCCTACGA—3′SEQ ID NO.14

BarR 5′—CCAGAAACCCACGTCATGCCA—3′SEQ ID NO.15；

HPTII基因：

HPTIIF226 5′—GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT—3′SEQ ID NO.16

HPTIIR697 5′—AGATGTTGGCGACCTCGTATT—3′SEQ ID NO.17

mCP4-EPSPS基因：

F 5′—GACTTGCGTGTTCGTTCTTC—3′SEQ ID NO.18

R 5′—AACACCGTTGAGCTTGAGAC—3′SEQ ID NO.19

PAT基因：

F 5′—GTCGACATGTCTCCGGAGAG—3′SEQ ID NO.20

R 5′—GCAACCAACCAAGGGTATC—3′SEQ ID NO.21

T-PINII终止子：

F 5′—GACTTGTCCATCTTCTGGATTGG—3′SEQ ID NO.22

R 5′—CACACAACTTTGATGCCCACAT—3′SEQ ID NO.23；

P-FMV35S启动子：

FMV35S-F1 5′—AAGACATCCACCGAAGACTTA—3′SEQ ID NO.24

FMV35S-R1 5′—AGGACAGCTCTTTTCCACGTT—3′SEQ ID NO.25；

P-CaMV35S启动子：

35S-F1 5′—GCTCCTACAAATGCCATCATTGC—3′SEQ ID NO.26，

35S-R1 5′—GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC—3′SEQ ID NO.27；

T-NOS终止子：

NOS-F1 5′—GAATCCTGTTGCCGGTCTTG—3′SEQ ID NO.28，

NOS-R1 5′—TTATCCTAGTTTGCGCGCTA—3′SEQ ID NO.29；

NPTII基因：

NPTIIF68 5′—ACTGGGCACAACAGACAATCG—3′SEQ ID NO.30，

NPTIIR356 5′—GCATCAGCCATGATGGATACTTT—3′SEQ ID NO.31；

油菜内标准基因CruA：

CruAF398 5′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.32

CruAR547 5′—CTGGTGGCTGGCTAAATCGA—3′，SEQ ID NO.33；

油菜内标准基因HMG I/Y：

hmg-F 5′—TCCTTCCGTTTCCTCGCC—3′SEQ ID NO.34；

hmg-R 5′—TTCCACGCCCTCTCCGCT—3′SEQ ID NO.35。

本发明另一个方面提供了一种用于实时荧光PCR筛查转基因油菜及其产品的试剂盒，其包括本发明所述的质粒分子以及转基因油菜筛查单元和油菜内标基因的检测引物对和探针；

P-CaMV35S启动子：

引物CAMV35S-QF 5′—CGACAGTGGTCCCAAAGA—3′SEQ ID NO.36，

CAMV35S35S-QR 5′—AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC—3′SEQ ID NO.37，

探针CAMV35S-QP 5′—TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC—3′SEQ ID NO.38；

P-FMV35S启动子：

引物FMV35S-QF 5′—AAGACATCCACCGAAGACTTA—3′SEQ ID NO.39，

FMV35S-QR 5′—AGGACAGCTCTTTTCCACGTT—3′SEQ ID NO.40，

探针FMV35S-QP 5′—TGGTCCCCACAAGCCAGCTGCTCGA—3′SEQ ID NO.41；

Bar基因：

引物BAR-F1 5′—ACAAGCACGGTCAACTTCC—3′SEQ ID NO.42，

BAR-R1 5′—GAGGTCGTCCGTCCACTC—3′SEQ ID NO.43，

探针BAR-P1 5′—TACCGAGCCGCAGGAACC—3′SEQ ID NO.44；

mCP4-EPSPS基因：

引物CP4-EPSPSF505 5′—GTACCTATGGCTTCCGCTCAAG—3′SEQ ID NO.45，

CP4-EPSPSR597 5′—AGTCATGATTGGCTCGATAACAGT—3′SEQ ID NO.46，

探针CP4-EPSPSFP530 5′—AGTCCGCTGTTCTGCTTGCTGGTCTCA—3′SEQ ID NO.47；

HPT基因；

引物QHPTF286 5′—CAGGGTGTCACGTTGCAAGA—3′SEQ ID NO.48，

QHPTR395 5′—CCGCTCGTCTGGCTAAGATC—3′SEQ ID NO.49，

探针QHPTFP308 5′—TGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTG—3′SEQ ID NO.50；

NPTII基因：

引物QNPTIIF63 5′—CTATGACTGGGCACAACAGACA—3′SEQ ID NO.51，

QNPTIIR163 5′—CGGACAGGTCGGTCTTGACA—3′SEQ ID NO.52，

探针QNPTIIFP90 5′—CTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCG-3’SEQ ID NO.53；

PAT基因；

引物PAT-F1 5′—GTCGACATGTCTCCGGAGAG—3′SEQ ID NO.54，

PAT-R1 5′—GCAACCAACCAAGGGTATC—3′SEQ ID NO.55，

探针PAT-P 5′—TGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA—3′SEQ ID NO.56；

T-PinII终止子；

引物T-PINLL-F 5′—GACTTGTCCATCTTCTGGATTGG—3′SEQ ID NO.57，

T-PINLL-R 5′—CACACAACTTTGATGCCCACAT—3′SEQ ID NO.58，

探针T-PINLL-P 5′—AGTGATTAGCATGTCACTATGTGTGCATCC—3′SEQ ID NO.59；

T-NOS终止子：

引物T-NOS-F2 5′—ATCGTTCAAACATTTGGCA—3′SEQ ID NO.60，

T-NOS-R2 5′—ATTGCGGGACTCTAATCATA—3′SEQ ID NO.61，

探针T-NOS-P 5′—CATCGCAAGACCGGCAACAGG—3′SEQ ID NO.62；

油菜内标准基因CruA：

引物qCruAF 5′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.63，

qCruAR 5′—CCGTCGTTGTAGAACCATTGG—3′SEQ ID NO.64，

探针qCruAP 5′—AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA—3′SEQ ID NO.65；

油菜内标准基因HMG I/Y：

引物qhmg-F 5′—GGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG—3′SEQ ID NO.66，

qhmg-R 5′—CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC—3′SEQ ID NO.67，

探针qhmg-P 5′—CGGAGCCACTCGGTGCCGCAACTT—3′SEQ ID NO.68。

本发明再一个方面提供了一种转基因油菜及其产品普通PCR筛查的方法，其包括以下步骤：1)提取样品总DNA，

2)利用转基因油菜筛查元件和油菜内标基因的检测引物对对阳性质粒分子和样品基因组DNA进行PCR扩增；

3)琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；在阳性质粒分子正常扩增且样品中油菜内标准基因正常扩增的情况下，如存在扩增产物则说明油菜样品中含有转基因成分。

本发明再一个方面提供了一种转基因油菜及其产品荧光实时PCR筛查的方法，其包括以下步骤：

1)提取样品总DNA，

2)利用转基因油菜筛查单元和油菜内标基因的检测引物对和探针对阳性质粒分子和样品基因组DNA进行PCR扩增；

3)实时荧光PCR产物根据是否有典型扩增曲线判断是否有扩增产物；在阳性质粒分子正常扩增且样品中油菜内标准基因正常扩增的情况下，如存在扩增产物则说明油菜样品中含有转基因成分。

本发明的目的是这样实现的：

一、阳性质粒分子pYCSC-1905的设计

阳性质粒分子pYCSC-1905是一个聚合9个常用筛查元件和2个油菜内标准基因的阳性质粒分子。

(一)设计

1.转基因油菜筛查阳性质粒分子pYCSC-1905含有9个筛查元件，分别是(1)P-CaMV35S，(2)P-FMV35S，(3)Bar，(4)mCP4-EPSPS,(5)HPT，(6)NPTII，(7)PAT，(8)T-PinII，(9)T-NOS。通过检测这9个元件可以100％全覆盖已知转化信息的转基因油菜品种，并有效监测实验室阶段的转基因油菜产品。

2.转基因油菜筛查阳性质粒分子pYCSC-1905含有2个油菜内标基因，分别是HMGI/Y基因和CruA基因。

3.转基因油菜筛查阳性质粒分子pYCSC-1905中9个筛查元件的靶标序列是根据针对这些元件发布的农业部标准(农业部公告)、国家标准(GB/T)、进出口检验检疫标准(SN/T)和欧盟标准综合确定的，质粒分子pYCSC-1905可与各个标准配套使用。

4.转基因油菜筛查阳性质粒分子pYCSC-1905可同时用作各元件的普通定性PCR检测和实时荧光PCR检测的质控对照。

(二)构建

将9个筛查元件的靶标序列和2个油菜内标准基因的靶标序列拼接到一起，进行人工合成，将人工合成的融合序列构建到载体pUC18上，构建出聚合9个筛查元件和2个油菜内标准基因的阳性质粒分子pYCSC-1905(图1)。

(三)特征

1.碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其DNA区含有9个外源基因元件，和2个油菜内标准基因；

2.位于第437位至4513位的碱基是9个筛查元件的融合序列，依次是(1)pCaMV35S，(2)pFMV35S，(3)Bar，(4)mCP4-EPSPS,(5)HPT，(6)NPTII，(7)PAT，(8)T-PinII，(9)T-NOS。

3.位于第4514位至4869位的碱基是2个油菜内标准基因HMG I/Y和CruA定性定量检测靶标的融合序列。

4.以上所述序列是转基因油菜筛查阳性质粒分子pYCSC-1905的特征序列，可以用作转基因油菜筛查检测时的阳性对照和质控样品。

二、阳性质粒分子pYCSC-1905的应用

利用pYCSC-1905作为阳性对照和质控样品，对油菜样品进行转基因成分的普通PCR和实时荧光PCR筛查检测：

合成油菜内标准基因HMG I/Y(CruA)和外源基因元件的引物组合(引物/探针组合)；提取样品总DNA，分别利用内标准基因和外源元件的引物组合(引物/探针组合)对阳性质粒分子和样品基因组DNA进行PCR扩增；普通PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；实时荧光PCR产物根据是否有典型扩增曲线判断是否有扩增产物；在阳性质粒分子正常扩增且样品中油菜内标准基因正常扩增的情况下，如存在扩增产物则说明油菜样品中含有转基因成分。

与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：

(1)提供了转基因油菜筛查检测通用的阳性质粒分子pYCSC-1905；

(2)pYCSC-1905聚合了转基因油菜筛查检测用的9个常用的筛查检测靶标和2个油菜的内标准基因序列；

(3)pYCSC-1905可用作授权商业化转基因油菜、非授权转基因油菜、实验阶段转基因油菜筛查检测的阳性对照和质控样品，对已知遗传信息的转基因油菜的覆盖率达100％；

(4)解决了转基因油菜筛查检测中缺乏阳性对照或标准品的技术难题，避免了筛查检测中针对多个检测靶标设置多个阳性对照的问题，降低了制备多个阳性对照的人力成本和经济成本；

(5)适用于对转基因油菜及其制品实施筛查检测、监测和安全监管。

附图说明

图1是阳性质粒分子pYCSC-1905结构图；

图2是采用定性PCR方法验证阳性质粒分子中9个外源元件和2个油菜内标准基因的检测靶标。靶标顺序：1.pCaMV35S，2.pFMV35S，3.Bar，4.mCP4-EPSPS,5.HPT，6.NPTII，7.PAT，8.T-NOS，9.T-PinII，10.CruA，11.HMG I/Y。

图3是采用实时荧光PCR方法验证阳性质粒分子中9个外源元件和2个油菜内标准基因的检测靶标。

图4利用质粒分子pYCSC-1905做阳性对照，对部分油菜品种进行普通PCR筛查检测。

图5利用质粒分子pYCSC-1905做阳性对照，对部分油菜品种进行实时荧光PCR筛查检测。

CruA检测，pYCSC-1905和11个油菜均呈阳性；HMG I/Y检测，pYCSC-1905和11个油菜均呈阳性；P-CaMV35S检测，pYCSC-1905和T45、OXY235、Topas 19/2呈阳性；P-FMV35S检测，pYCSC-1905和GT73呈阳性；Bar检测，pYCSC-1905和MS8、MS1、RF1、RF2、RF3呈阳性；mCP4-EPSPS检测，pYCSC-1905和GT73、MON88302呈阳性；HPT检测，pYCSC-1905和GT73呈阳性；NPTII检测，pYCSC-1905和MS1、RF1、RF2、Topas19/2呈阳性；PAT检测，pYCSC-1905和T45、Topas 19/2呈阳性；T-NOS检测，pYCSC-1905和MS8、MS1、RF1、RF2、RF3、OXY235呈阳性；T-pinII检测，pYCSC-1905和73496呈阳性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明详细说明：

一、阳性质粒分子pYCSC-1905的构建

(一)确定转基因油菜筛查检测靶标

通过分析查阅到的转基因油菜品系中常用的外源元件和标记基因的使用频率、以及常用遗传转化载体中含有的调控元件和标记基因，确定用9个外源元件/基因进行转基因油菜的筛查检测，分别是(1)P-CaMV35S启动子(2)P-FMV 35S启动子、(3)Bar基因、(4)PAT基因、(5)mCP4-EPSPS基因、(6)NPTⅡ基因、(7)NOS终止子、(8)PinII终止子、(9)HPT基因。对这9个外源元件/基因进行检测，可实现19个已知转基因油菜品种、拟推广品种MS11、LMO数据库中已知遗传转化信息品种的全覆盖，批准进口品种覆盖2-3次。通过将HPT基因作为检测参数，可对实验室阶段的研究材料实现覆盖。

(二)确定9个筛查元件的靶标序列

收集农业部发布的标准(农业部公告)、国家标准(GB/T)、进出口检验检疫标准(SN/T)和欧盟标准中针对这9个筛查元件的检测方法及引物/探针序列。分析每个引物/探针组合的扩增序列及在筛查元件上的结合位点，确定拟构建到质粒上的靶标序列。pCaMV35S启动子序列长250bp，见SEQ ID NO.2；pFMV35S启动子序列长393bp，见SEQ IDNO.3；Bar基因序列长433bp，见SEQ ID NO.4；mCP4-EPSPS基因序列长793bp，见SEQ IDNO.5；HPT基因序列长474bp，见SEQ ID NO.6；NPTII基因序列长669bp，见SEQ ID NO.7；PAT基因序列长499bp，见SEQ ID NO.8；T-PINII终止子序列长310bp，见SEQ ID NO.9；T-NOS终止子序列长256bp，见SEQ ID NO.10.

(三)确定2个油菜内标基因的靶标序列

在转基因油菜检测中应用最广泛的内标基因有两个，分别是HMG I/Y和CruA基因。查阅这两个基因的普通PCR方法和实施荧光PCR方法的检测方法及引物/探针序列。分析每个引物/探针组合的扩增序列及在筛查元件上的结合位点，确定拟构建到质粒上的靶标序列。油菜内标基因HMG I/Y序列长206bp，见SEQ ID NO.11；油菜内标基因CruA序列长150bp，见SEQ ID NO.12.

(四)构建质粒分子pYCSC-1905

将9个转基因油菜筛查检测靶标和2个油菜内标基因的核苷酸序列拼接到一起，形成一个融合序列(SEQ ID NO.13)。将拼接的融合序列委托上海生工合成，合成后插入到pUC18载体上，构建成质粒分子pYCSC-1905。

二、阳性质粒分子pYCSC-1905的验证

(一)测序验证

对质粒分子pYCSC-1905进行全分子测序，验证靶标序列的准确性。

(二)普通PCR方法验证

根据发布的标准，合成9个筛查元件和2个油菜内标基因的普通PCR引物。Bar基因：引物BarF 5′—GAAGGCACGCAACGCCTACGA—3′SEQ ID NO.14和BarR 5′—CCAGAAACCCACGTCATGCCA—3′SEQ ID NO.15,扩增产物262bp；HPTII基因：引物HPTIIF2265′—GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT—3′SEQ ID NO.16和HPTIIR6975′—AGATGTTGGCGACCTCGTATT—3′SEQ ID NO.17，扩增产物472bp；mCP4-EPSPS基因：引物F 5′—GACTTGCGTGTTCGTTCTTC—3′SEQ ID NO.18和R 5′—AACACCGTTGAGCTTGAGAC—3′SEQ IDNO.19，扩增产物204bp；PAT基因：引物F 5′—GTCGACATGTCTCCGGAGAG—3′SEQ ID NO.20和R5′—GCAACCAACCAAGGGTATC—3′SEQ ID NO.21，扩增产物191bp；T-PINII终止子：引物F5′—GACTTGTCCATCTTCTGGATTGG—3′SEQ ID NO.22和R 5′—CACACAACTTTGATGCCCACAT—3′SEQ ID NO.23，扩增产物105bp；P-FMV35S启动子：FMV35S-F15′—AAGACATCCACCGAAGACTTA—3′SEQ ID NO.24和FMV35S-R1 5′—AGGACAGCTCTTTTCCACGTT—3′SEQ ID NO.25，扩增产物210bp；P-CaMV35S启动子：引物35S-F1 5′—GCTCCTACAAATGCCATCATTGC—3′SEQ ID NO.26和35S-R1 5′—GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC—3′SEQ ID NO.27，扩增产物195bp；T-NOS终止子：引物组合NOS-F15′—GAATCCTGTTGCCGGTCTTG—3′SEQ ID NO.28和NOS-R1 5′—TTATCCTAGTTTGCGCGCTA—3′SEQ ID NO.29，扩增产物180bp；NPTII基因：引物组合NPTIIF685′—ACTGGGCACAACAGACAATCG—3′SEQ ID NO.30和NPTIIR356 5′—GCATCAGCCATGATGGATACTTT—3′SEQ ID NO.31，扩增产物289bp；油菜内标准基因CruA：CruAF398 5′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.32和CruAR547 5′—CTGGTGGCTGGCTAAATCGA—3′SEQ ID NO.33，扩增产物150bp；油菜内标准基因HMG I/Y：hmg-F 5′—TCCTTCCGTTTCCTCGCC—3′SEQ ID NO.34和hmg-R 5′—TTCCACGCCCTCTCCGCT—3′SEQID NO.35，扩增产物206bp。

利用合成的普通PCR引物，以构建的阳性质粒分子为模板，进行PCR扩增。PCR反应采用25ul反应体系，含1μL阳性质粒分子，1×PCR Buffer(含10mM Tris HCl pH8.3，KCl50mM)，200uM dNTPs，2.5mM MgCl2，250nM的正向引物和反向引物，DNATaq酶1u。反应程序为，94℃ 2分钟预变性，94℃ 15秒，60℃30秒，72℃ 30秒，35次循环，72℃保温2分钟。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。

(三)实时荧光PCR方法验证

根据发布的标准或发表的文献，合成9个筛查元件和2个油菜内标基因的实时荧光PCR引物/探针。P-CaMV35S启动子：引物CAMV35S-QF 5′—CGACAGTGGTCCCAAAGA—3′SEQ IDNO.36和CAMV35S35S-QR5′—AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC—3′SEQ ID NO.37，探针CAMV35S-QP5′—TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC—3′SEQ ID NO.38；P-FMV35S启动子：引物FMV35S-QF5′—AAGACATCCACCGAAGACTTA—3′SEQ ID NO.39和FMV35S-QR 5′—AGGACAGCTCTTTTCCACGTT—3′SEQ ID NO.40，探针FMV35S-QP5′—TGGTCCCCACAAGCCAGCTGCTCGA—3′SEQ ID NO.41；Bar基因：引物BAR-F1 5′—ACAAGCACGGTCAACTTCC—3′SEQ ID NO.42和BAR-R1 5′—GAGGTCGTCCGTCCACTC—3′SEQ IDNO.43，探针BAR-P15′—TACCGAGCCGCAGGAACC—3′SEQ ID NO.44；mCP4-EPSPS基因：引物CP4-EPSPSF5055′—GTACCTATGGCTTCCGCTCAAG—3′SEQ ID NO.45和CP4-EPSPSR597 5′—AGTCATGATTGGCTCGATAACAGT—3′SEQ ID NO.46，探针CP4-EPSPSFP530 5′—AGTCCGCTGTTCTGCTTGCTGGTCTCA—3′SEQ ID NO.47；HPT基因；引物QHPTF286 5′—CAGGGTGTCACGTTGCAAGA—3′SEQ ID NO.48和QHPTR395 5′—CCGCTCGTCTGGCTAAGATC—3′SEQ ID NO.49，探针QHPTFP308 5′—TGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTG—3′SEQ ID NO.50；NPTII基因：引物QNPTIIF63 5′—CTATGACTGGGCACAACAGACA—3′SEQ ID NO.51和QNPTIIR1635′—CGGACAGGTCGGTCTTGACA—3′SEQ ID NO.52，探针QNPTIIFP90 5′—CTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCG-3’SEQ ID NO.53；PAT基因；引物PAT-F1 5′—GTCGACATGTCTCCGGAGAG—3′SEQ ID NO.54和PAT-R1 5′—GCAACCAACCAAGGGTATC—3′SEQID NO.55，探针PAT-P 5′—TGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA—3′SEQ ID NO.56；T-PinII终止子；引物T-PINLL-F5′—GACTTGTCCATCTTCTGGATTGG—3′SEQ ID NO.57和T-PINLL-R 5′—CACACAACTTTGATGCCCACAT—3′SEQ ID NO.58，探针T-PINLL-P 5′—AGTGATTAGCATGTCACTATGTGTGCATCC—3′SEQ ID NO.59；T-NOS终止子：引物T-NOS-F2 5′—ATCGTTCAAACATTTGGCA—3′SEQ ID NO.60和T-NOS-R2 5′—ATTGCGGGACTCTAATCATA—3′SEQID NO.61，探针T-NOS-P 5′—CATCGCAAGACCGGCAACAGG—3′SEQ ID NO.62；油菜内标准基因CruA：qCruAF5′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.63和qCruAR 5′—CCGTCGTTGTAGAACCATTGG—3′SEQ ID NO.64，探针qCruAP 5′—AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA—3′SEQ ID NO.65；油菜内标准基因HMG I/Y：qhmg-F5′—GGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG—3′SEQ ID NO.66和qhmg-R 5′—CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC—3′SEQ ID NO.67，探针qhmg-P 5′—CGGAGCCACTCGGTGCCGCAACTT—3′SEQ ID NO.68。

利用合成的实时荧光PCR引物，以构建的阳性质粒分子为模板，进行实时荧光PCR扩增。实时荧光PCR分析在一台CFX96PCR仪上进行，PCR反应体系20μL，含1μL质粒模板,1×PCR buffer，1U Taq DNA聚合酶，4.5mM MgCl2,300μM dNTPs,200nM引物,和100nM探针。PCR反应程序：50℃ 2分钟和95℃ 10分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95℃ 15秒变性，60℃1分钟退火及延伸，收集荧光信号。

三、应用方法

(一)利用pYCSC-1905作为转基因油菜普通PCR筛查检测的阳性对照和质控样品

用转基因油菜GT73、Topas 19/2、T45、MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、OXY235、MON88302和73496作为测试样品，利用合成的普通PCR引物，以质粒分子pYCSC-1905为阳性对照，对提取的DNA样品进行转基因成分筛查检测。

PCR反应采用25ul反应体系，含1μL DNA模板，1×PCR Buffer(含10mM Tris HClpH8.3，KCl 50mM)，200uM dNTPs，2.5mM MgCl₂，250nM的正向引物和反向引物，1U DNA Taq酶。反应程序为，94℃2分钟预变性，94℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，35次循环，72℃保温2分钟。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。

(二)利用pYCSC-1905作为转基因油菜实时荧光PCR筛查检测的阳性对照和质控样品

利用合成的实时荧光PCR引物，以质粒分子pYCSC-1905为阳性对照，对提取的转基因油菜DNA样品进行转基因成分筛查检测。

实时荧光PCR分析在一台CFX96PCR仪上进行，PCR反应体系20μL，含1μL DNA模板,1×PCR buffer，1U Taq DNA聚合酶，4.5mM MgCl₂,300μM dNTPs,200nM正向和反向引物,100nM探针。PCR反应程序：50℃2分钟和95℃10分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95℃15秒变性，60℃1分钟退火及延伸，收集荧光信号。

四、实验结果

(一)pYCSC-1905的构建和测序分析

对质粒分子pYCSC-1905进行全分子测序，测序结果表明，合成DNA靶标序列与预期DNA序列(SEQ ID NO.1)完全一致，证明构建的质粒分子中含有预期的9个转基因油菜筛查检测靶标和2个油菜内标准基因。

(二)验证pYCSC-1905上各基因元件的检测靶标

用合成的9个筛查元件和2个油菜内标准基因的普通PCR引物，以质粒分子pYCSC-1905为模板进行PCR扩增。对PCR产物进行电泳检测，发现各基因元件均扩增出了预期大小的PCR产物(图2)，表明质粒分子pYCSC-1905上含有各基因元件的普通PCR检测靶标。质粒分子pYCSC-1905可以用作转基因油菜普通PCR筛查检测的阳性对照和质控样品。

用合成的9个筛查元件和2个油菜内标准基因的实时荧光PCR引物，以质粒分子pYCSC-1905为模板进行实时荧光PCR扩增。发现各基因元件均产生了典型扩增曲线(图3)，表明质粒分子pYCSC-1905上含有各基因元件的实时荧光PCR检测靶标。质粒分子pYCSC-1905可以用作转基因油菜实时荧光PCR筛查检测的阳性对照和质控样品。

(三)将pYCSC-1905用作转基因油菜普通PCR筛查检测的阳性对照和质控样品

以质粒分子pYCSC-1905作为阳性对照，用合成的2个油菜内标准基因引物和9个筛查元件的引物进行普通PCR扩增，对11个转基因油菜(GT73、Topas 19/2、T45、MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、OXY235、MON88302和73496)中的转基因成分进行筛查检测。检测PCR产物发现，2个油菜的内标准基因在质粒分子pYCSC-1905和相应油菜中都有良好的扩增；9个筛查元件在质粒分子pYCSC-1905和含有相应元件的转基因油菜中都有良好的扩增(图4)。结果表明质粒分子pYCSC-1905可以作为油菜内标准基因和9个筛查元件进行普通PCR扩增时的对照样品，通过对照样品的扩增可以判定样品DNA的提取质量以及PCR扩增体系是否正常。

4.4、将pYCSC-1905用作转基因油菜实时荧光PCR筛查检测的阳性对照和质控样品

以质粒分子pYCSC-1905作为阳性对照，用合成的2个油菜内标准基因引物和9个筛查元件的引物进行实时荧光PCR扩增，对11个转基因油菜(GT73、Topas 19/2、T45、MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、OXY235、MON88302和73496)中的转基因成分进行实时荧光PCR检测分析。2个油菜的内标准基因在质粒分子pYCSC-1905和所有油菜中都有良好的扩增；9个筛查元件在质粒分子pYCSC-1905和含有相应元件的转基因产品中都有良好的扩增(图5)。结果表明质粒分子pYCSC-1905可以作为油菜内标准基因和9个筛查元件进行实时荧光PCR扩增时的对照样品，通过对照样品的扩增可以判定样品DNA的提取质量以及PCR扩增体系是否正常。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

农业农村部科技发展中心

<120> 一种转基因油菜及其产品筛查阳性质粒分子pYCSC-1905及其应用

<130> CP11903XXX

<160> 68

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7119

<212> DNA

<213> 转基因油菜

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420

actctagagg atccccgtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc 480

gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc 540

gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc 600

actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa 660

ggaagttcat ttcatttgga gagaacaaag cctcaacaag gtcagggtac agagtctcca 720

aaccattagc caaaagctac aggagatcaa tgaagaatct tcaatcaaag taaactactg 780

ttccagcaca tgcatcatgg tcagtaagtt tcagaaaaag acatccaccg aagacttaaa 840

gttagtgggc atctttgaaa gtaatcttgt caacatcgag cagctggctt gtggggacca 900

gacaaaaaag gaatggtgca gaattgttag gcgcacctac caaaagcatc tttgccttta 960

ttgcaaagat aaagcagatt cctctagtac aagtggggaa caaaataacg tggaaaagag 1020

ctgtcctgac agcccactca ctaatgcgta tgacgaacgc agtgacgacc acaaaagaaa 1080

gctgccagaa acccacgtca tgccagttcc cgtgcttgaa gccggccgcc cgcagcatgc 1140

cgcggggggc atatccgagc gcctcgtgca tgcgcacgct cgggtcgttg ggcagcccga 1200

tgacagcgac cacgctcttg aagccctgtg cctccaggga cttcagcagg tgggtgtaga 1260

gcgtggagcc cagtcccgtc cgctggtggc ggggggagac gtacacggtc gactcggccg 1320

tccagtcgta ggcgttgcgt gccttccagg ggcccgcgta ggcgatgccg gcgacctcgc 1380

cgtccacctc ggcgacgagc cagggatagc gctcccgcag acggacgagg tcgtccgtcc 1440

actcctgcgg ttcctgcggc tcggtacgga agttgaccgt gcttgtctcg atgtagtggt 1500

tgacgatggt gcatgggtct tgttggtgtt tacgatttcg atagcacttt cattggtgac 1560

gcttctctca ctaagcgtcc aatgggtcgt gtgttgaacc cacttcgcga aatgggtgtg 1620

caggtgaagt ctgaagacgg tgatcgtctt ccagttacct tgcgtggacc aaagactcca 1680

acgccaatca cctacagggt acctatggct tccgctcaag tgaagtccgc tgttctgctt 1740

gctggtctca acaccccagg tatcaccact gttatcgagc caatcatgac tcgtgaccac 1800

actgaaaaga tgcttcaagg ttttggtgct aaccttaccg ttgagactga tgctgacggt 1860

gtgcgtacca tccgtcttga aggtcgtggt aagctcaccg gtcaagtgat tgatgttcca 1920

ggtgatccat cctctactgc tttcccattg gttgctgcct tgcttgttcc aggttccgac 1980

gtcaccatcc ttaacgtttt gatgaaccca acccgtactg gtctcatctt gactctgcag 2040

gaaatgggtg ccgacatcga agtgatcaac ccacgtcttg ctggtggaga agacgtggct 2100

gacttgcgtg ttcgttcttc tactttgaag ggtgttactg ttccagaaga ccgtgctcct 2160

tctatgatcg acgagtatcc aattctcgct gttgcagctg cattcgctga aggtgctacc 2220

gttatgaacg gtttggaaga actccgtgtt aaggaaagcg accgtctttc tgctgtcgca 2280

aacggtctca agctcaacgg tgttgggaag tgcttgacat tggggagttt agcgagagcc 2340

tgacctattg catctcccgc cgtgcacagg gtgtcacgtt gcaagacctg cctgaaaccg 2400

aactgcccgc tgttctacaa ccggtcgcgg aggctatgga tgcgatcgct gcggccgatc 2460

ttagccagac gagcgggttc ggcccattcg gaccgcaagg aatcggtcaa tacactacat 2520

ggcgtgattt catatgcgcg attgctgatc cccatgtgta tcactggcaa actgtgatgg 2580

acgacaccgt cagtgcgtcc gtcgcgcagg ctctcgatga gctgatgctt tgggccgagg 2640

actgccccga agtccggcac ctcgtgcacg cggatttcgg ctccaacaat gtcctgacgg 2700

acaatggccg cataacagcg gtcattgact ggagcgaggc gatgttcggg gattcccaat 2760

acgaggtcgc caacatcttg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc 2820

cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc 2880

cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg 2940

cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt 3000

gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc 3060

catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga 3120

ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga 3180

tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct 3240

caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc 3300

gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt 3360

ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg 3420

cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttgc caaaaaccaa catcatgcca tccaccatgc 3480

ttgtatccag ctgcgcgcaa tgtaccccgg gctgtgtatc ccaaagcctc atgcaaccta 3540

acagatggat cgtttggaag gcctataaca gcaaccacag acttaaaacc ttgcgcctcc 3600

atagacttaa gcaaatgtgt gtacaatgtg gatcctaggc ccaacctttg atgcctatgt 3660

gacacgtaaa cagtactctc aactgtccaa tcgtaagcgt tcctagcctt ccagggccca 3720

gcgtaagcaa taccagccac aacaccctca acctcagcaa ccaaccaagg gtatctatct 3780

tgcaacctct ctagatcatc aatccactct tgtggtgttt gtggctctgt cctaaagttc 3840

actgtagacg tctcaatgta atggttaacg atatcacaaa ccgcggccat atcagctgct 3900

gtagctggcc taatctcaac tggtctcctc tccggagaca tgtcgaccta gacttgtcca 3960

tcttctggat tggccaactt aattaatgta tgaaataaaa ggatgcacac atagtgacat 4020

gctaatcact ataatgtggg catcaaagtt gtgtgttatg tgtaattact agttatctga 4080

ataaaagaga aagagatcat ccatatttct tatcctaaat gaatgtcacg tgtctttata 4140

attctttgat gaaccagatg catttcatta accaaatcca tatacatata aatattaatc 4200

atatataatt aatatcaatt gggttagcaa aacaaatcta gtctaggtgt gttttgcgat 4260

cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 4320

attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 4380

acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 4440

atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg 4500

ttactagatc gggtccttcc gtttcctcgc cgaggcctag aggtcgtcct cctaaggcga 4560

aaggaccttc ctcggaggtg gagacgaaag ttgcggcacc gagtggctcc gggaggccac 4620

gtggacgacc gccgaagaag cagaagacgg aatccgaggc ggttaaagcc gatgttgaac 4680

ctgcggaggc tccggctggg gagcggagag ggcgtggaag gccagggctt ccgtgatatg 4740

caccagaaag tggagcacat aaggactggg gacaccatcg ctacacatcc cggtgtagcc 4800

caatggttct acaacgacgg aaaccaacca cttgtcatcg tttccgtcct cgatttagcc 4860

agccaccagg ggtaccgagc tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 4920

attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 4980

ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 5040

agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 5100

gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 5160

ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 5220

gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 5280

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 5340

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 5400

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 5460

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 5520

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 5580

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 5640

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 5700

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 5760

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 5820

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 5880

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 5940

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 6000

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 6060

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 6120

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 6180

gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 6240

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 6300

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 6360

ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 6420

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 6480

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 6540

tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 6600

tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 6660

cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 6720

tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 6780

gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 6840

tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 6900

ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 6960

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 7020

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 7080

taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 7119

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> pCaMV35S启动子

<400> 2

gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg 60

ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 120

ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 180

acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 240

tggagagaac 250

<210> 3

<211> 393

<212> DNA

<213> pFMV35S启动子

<400> 3

aaagcctcaa caaggtcagg gtacagagtc tccaaaccat tagccaaaag ctacaggaga 60

tcaatgaaga atcttcaatc aaagtaaact actgttccag cacatgcatc atggtcagta 120

agtttcagaa aaagacatcc accgaagact taaagttagt gggcatcttt gaaagtaatc 180

ttgtcaacat cgagcagctg gcttgtgggg accagacaaa aaaggaatgg tgcagaattg 240

ttaggcgcac ctaccaaaag catctttgcc tttattgcaa agataaagca gattcctcta 300

gtacaagtgg ggaacaaaat aacgtggaaa agagctgtcc tgacagccca ctcactaatg 360

cgtatgacga acgcagtgac gaccacaaaa gaa 393

<210> 4

<211> 433

<212> DNA

<213> Bar基因

<400> 4

agctgccaga aacccacgtc atgccagttc ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg 60

ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg 120

atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag 180

agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc 240

gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg 300

ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc 360

cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg 420

ttgacgatgg tgc 433

<210> 5

<211> 793

<212> DNA

<213> 修饰的CP4-EPSPS基因

<400> 5

atgggtcttg ttggtgttta cgatttcgat agcactttca ttggtgacgc ttctctcact 60

aagcgtccaa tgggtcgtgt gttgaaccca cttcgcgaaa tgggtgtgca ggtgaagtct 120

gaagacggtg atcgtcttcc agttaccttg cgtggaccaa agactccaac gccaatcacc 180

tacagggtac ctatggcttc cgctcaagtg aagtccgctg ttctgcttgc tggtctcaac 240

accccaggta tcaccactgt tatcgagcca atcatgactc gtgaccacac tgaaaagatg 300

cttcaaggtt ttggtgctaa ccttaccgtt gagactgatg ctgacggtgt gcgtaccatc 360

cgtcttgaag gtcgtggtaa gctcaccggt caagtgattg atgttccagg tgatccatcc 420

tctactgctt tcccattggt tgctgccttg cttgttccag gttccgacgt caccatcctt 480

aacgttttga tgaacccaac ccgtactggt ctcatcttga ctctgcagga aatgggtgcc 540

gacatcgaag tgatcaaccc acgtcttgct ggtggagaag acgtggctga cttgcgtgtt 600

cgttcttcta ctttgaaggg tgttactgtt ccagaagacc gtgctccttc tatgatcgac 660

gagtatccaa ttctcgctgt tgcagctgca ttcgctgaag gtgctaccgt tatgaacggt 720

ttggaagaac tccgtgttaa ggaaagcgac cgtctttctg ctgtcgcaaa cggtctcaag 780

ctcaacggtg ttg 793

<210> 6

<211> 474

<212> DNA

<213> HPT基因

<400> 6

ggaagtgctt gacattgggg agtttagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc 60

acagggtgtc acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tacaaccggt 120

cgcggaggct atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc 180

attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc 240

tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc 300

gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt 360

gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat 420

tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tctt 474

<210> 7

<211> 669

<212> DNA

<213> NPTII基因

<400> 7

ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 60

gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 120

caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 180

ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 240

gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 300

cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 360

atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 420

gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 480

ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 540

ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 600

atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 660

ctcgtgctt 669

<210> 8

<211> 499

<212> DNA

<213> PAT基因

<400> 8

gccaaaaacc aacatcatgc catccaccat gcttgtatcc agctgcgcgc aatgtacccc 60

gggctgtgta tcccaaagcc tcatgcaacc taacagatgg atcgtttgga aggcctataa 120

cagcaaccac agacttaaaa ccttgcgcct ccatagactt aagcaaatgt gtgtacaatg 180

tggatcctag gcccaacctt tgatgcctat gtgacacgta aacagtactc tcaactgtcc 240

aatcgtaagc gttcctagcc ttccagggcc cagcgtaagc aataccagcc acaacaccct 300

caacctcagc aaccaaccaa gggtatctat cttgcaacct ctctagatca tcaatccact 360

cttgtggtgt ttgtggctct gtcctaaagt tcactgtaga cgtctcaatg taatggttaa 420

cgatatcaca aaccgcggcc atatcagctg ctgtagctgg cctaatctca actggtctcc 480

tctccggaga catgtcgac 499

<210> 9

<211> 310

<212> DNA

<213> PinII终止子

<400> 9

ctagacttgt ccatcttctg gattggccaa cttaattaat gtatgaaata aaaggatgca 60

cacatagtga catgctaatc actataatgt gggcatcaaa gttgtgtgtt atgtgtaatt 120

actagttatc tgaataaaag agaaagagat catccatatt tcttatccta aatgaatgtc 180

acgtgtcttt ataattcttt gatgaaccag atgcatttca ttaaccaaat ccatatacat 240

ataaatatta atcatatata attaatatca attgggttag caaaacaaat ctagtctagg 300

tgtgttttgc 310

<210> 10

<211> 256

<212> DNA

<213> NOS终止子

<400> 10

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atcggg 256

<210> 11

<211> 206

<212> DNA

<213> 油菜内标基因HMG I/Y

<400> 11

tccttccgtt tcctcgccga ggcctagagg tcgtcctcct aaggcgaaag gaccttcctc 60

ggaggtggag acgaaagttg cggcaccgag tggctccggg aggccacgtg gacgaccgcc 120

gaagaagcag aagacggaat ccgaggcggt taaagccgat gttgaacctg cggaggctcc 180

ggctggggag cggagagggc gtggaa 206

<210> 12

<211> 150

<212> DNA

<213> 油菜内标基因CruA

<400> 12

ggccagggct tccgtgatat gcaccagaaa gtggagcaca taaggactgg ggacaccatc 60

gctacacatc ccggtgtagc ccaatggttc tacaacgacg gaaaccaacc acttgtcatc 120

gtttccgtcc tcgatttagc cagccaccag 150

<210> 13

<211> 4433

<212> DNA

<213> 转基因油菜

<400> 13

gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg 60

ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 120

ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 180

acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 240

tggagagaac aaagcctcaa caaggtcagg gtacagagtc tccaaaccat tagccaaaag 300

ctacaggaga tcaatgaaga atcttcaatc aaagtaaact actgttccag cacatgcatc 360

atggtcagta agtttcagaa aaagacatcc accgaagact taaagttagt gggcatcttt 420

gaaagtaatc ttgtcaacat cgagcagctg gcttgtgggg accagacaaa aaaggaatgg 480

tgcagaattg ttaggcgcac ctaccaaaag catctttgcc tttattgcaa agataaagca 540

gattcctcta gtacaagtgg ggaacaaaat aacgtggaaa agagctgtcc tgacagccca 600

ctcactaatg cgtatgacga acgcagtgac gaccacaaaa gaaagctgcc agaaacccac 660

gtcatgccag ttcccgtgct tgaagccggc cgcccgcagc atgccgcggg gggcatatcc 720

gagcgcctcg tgcatgcgca cgctcgggtc gttgggcagc ccgatgacag cgaccacgct 780

cttgaagccc tgtgcctcca gggacttcag caggtgggtg tagagcgtgg agcccagtcc 840

cgtccgctgg tggcgggggg agacgtacac ggtcgactcg gccgtccagt cgtaggcgtt 900

gcgtgccttc caggggcccg cgtaggcgat gccggcgacc tcgccgtcca cctcggcgac 960

gagccaggga tagcgctccc gcagacggac gaggtcgtcc gtccactcct gcggttcctg 1020

cggctcggta cggaagttga ccgtgcttgt ctcgatgtag tggttgacga tggtgcatgg 1080

gtcttgttgg tgtttacgat ttcgatagca ctttcattgg tgacgcttct ctcactaagc 1140

gtccaatggg tcgtgtgttg aacccacttc gcgaaatggg tgtgcaggtg aagtctgaag 1200

acggtgatcg tcttccagtt accttgcgtg gaccaaagac tccaacgcca atcacctaca 1260

gggtacctat ggcttccgct caagtgaagt ccgctgttct gcttgctggt ctcaacaccc 1320

caggtatcac cactgttatc gagccaatca tgactcgtga ccacactgaa aagatgcttc 1380

aaggttttgg tgctaacctt accgttgaga ctgatgctga cggtgtgcgt accatccgtc 1440

ttgaaggtcg tggtaagctc accggtcaag tgattgatgt tccaggtgat ccatcctcta 1500

ctgctttccc attggttgct gccttgcttg ttccaggttc cgacgtcacc atccttaacg 1560

ttttgatgaa cccaacccgt actggtctca tcttgactct gcaggaaatg ggtgccgaca 1620

tcgaagtgat caacccacgt cttgctggtg gagaagacgt ggctgacttg cgtgttcgtt 1680

cttctacttt gaagggtgtt actgttccag aagaccgtgc tccttctatg atcgacgagt 1740

atccaattct cgctgttgca gctgcattcg ctgaaggtgc taccgttatg aacggtttgg 1800

aagaactccg tgttaaggaa agcgaccgtc tttctgctgt cgcaaacggt ctcaagctca 1860

acggtgttgg gaagtgcttg acattgggga gtttagcgag agcctgacct attgcatctc 1920

ccgccgtgca cagggtgtca cgttgcaaga cctgcctgaa accgaactgc ccgctgttct 1980

acaaccggtc gcggaggcta tggatgcgat cgctgcggcc gatcttagcc agacgagcgg 2040

gttcggccca ttcggaccgc aaggaatcgg tcaatacact acatggcgtg atttcatatg 2100

cgcgattgct gatccccatg tgtatcactg gcaaactgtg atggacgaca ccgtcagtgc 2160

gtccgtcgcg caggctctcg atgagctgat gctttgggcc gaggactgcc ccgaagtccg 2220

gcacctcgtg cacgcggatt tcggctccaa caatgtcctg acggacaatg gccgcataac 2280

agcggtcatt gactggagcg aggcgatgtt cggggattcc caatacgagg tcgccaacat 2340

cttggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg 2400

tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa 2460

ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct 2520

gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg 2580

caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca 2640

atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat 2700

cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac 2760

gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc 2820

gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa 2880

aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag 2940

gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc 3000

ttcctcgtgc ttgccaaaaa ccaacatcat gccatccacc atgcttgtat ccagctgcgc 3060

gcaatgtacc ccgggctgtg tatcccaaag cctcatgcaa cctaacagat ggatcgtttg 3120

gaaggcctat aacagcaacc acagacttaa aaccttgcgc ctccatagac ttaagcaaat 3180

gtgtgtacaa tgtggatcct aggcccaacc tttgatgcct atgtgacacg taaacagtac 3240

tctcaactgt ccaatcgtaa gcgttcctag ccttccaggg cccagcgtaa gcaataccag 3300

ccacaacacc ctcaacctca gcaaccaacc aagggtatct atcttgcaac ctctctagat 3360

catcaatcca ctcttgtggt gtttgtggct ctgtcctaaa gttcactgta gacgtctcaa 3420

tgtaatggtt aacgatatca caaaccgcgg ccatatcagc tgctgtagct ggcctaatct 3480

caactggtct cctctccgga gacatgtcga cctagacttg tccatcttct ggattggcca 3540

acttaattaa tgtatgaaat aaaaggatgc acacatagtg acatgctaat cactataatg 3600

tgggcatcaa agttgtgtgt tatgtgtaat tactagttat ctgaataaaa gagaaagaga 3660

tcatccatat ttcttatcct aaatgaatgt cacgtgtctt tataattctt tgatgaacca 3720

gatgcatttc attaaccaaa tccatataca tataaatatt aatcatatat aattaatatc 3780

aattgggtta gcaaaacaaa tctagtctag gtgtgttttg cgatcgttca aacatttggc 3840

aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 3900

tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 3960

gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 4020

agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcgggtcc 4080

ttccgtttcc tcgccgaggc ctagaggtcg tcctcctaag gcgaaaggac cttcctcgga 4140

ggtggagacg aaagttgcgg caccgagtgg ctccgggagg ccacgtggac gaccgccgaa 4200

gaagcagaag acggaatccg aggcggttaa agccgatgtt gaacctgcgg aggctccggc 4260

tggggagcgg agagggcgtg gaaggccagg gcttccgtga tatgcaccag aaagtggagc 4320

acataaggac tggggacacc atcgctacac atcccggtgt agcccaatgg ttctacaacg 4380

acggaaacca accacttgtc atcgtttccg tcctcgattt agccagccac cag 4433

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaaggcacgc aacgcctacg a 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccagaaaccc acgtcatgcc a 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaagtgcttg acattgggga gt 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agatgttggc gacctcgtat t 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gacttgcgtg ttcgttcttc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aacaccgttg agcttgagac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gtcgacatgt ctccggagag 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gcaaccaacc aagggtatc 19

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gacttgtcca tcttctggat tgg 23

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cacacaactt tgatgcccac at 22

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aagacatcca ccgaagactt a 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

aggacagctc ttttccacgt t 21

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gctcctacaa atgccatcat tgc 23

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gatagtggga ttgtgcgtca tccc 24

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gaatcctgtt gccggtcttg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ttatcctagt ttgcgcgcta 20

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

actgggcaca acagacaatc g 21

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gcatcagcca tgatggatac ttt 23

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ggccagggct tccgtgat 18

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ctggtggctg gctaaatcga 20

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tccttccgtt tcctcgcc 18

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ttccacgccc tctccgct 18

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cgacagtggt cccaaaga 18

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

aagacgtggt tggaacgtct tc 22

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tggaccccca cccacgagga gcatc 25

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

aagacatcca ccgaagactt a 21

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

aggacagctc ttttccacgt t 21

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tggtccccac aagccagctg ctcga 25

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

acaagcacgg tcaacttcc 19

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gaggtcgtcc gtccactc 18

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

taccgagccg caggaacc 18

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

gtacctatgg cttccgctca ag 22

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

agtcatgatt ggctcgataa cagt 24

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

agtccgctgt tctgcttgct ggtctca 27

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

cagggtgtca cgttgcaaga 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

ccgctcgtct ggctaagatc 20

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tgcctgaaac cgaactgccc gctg 24

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ctatgactgg gcacaacaga ca 22

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

cggacaggtc ggtcttgaca 20

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

ctgctctgat gccgccgtgt tccg 24

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gtcgacatgt ctccggagag 20

<210> 55

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

gcaaccaacc aagggtatc 19

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

tggccgcggt ttgtgatatc gttaa 25

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gacttgtcca tcttctggat tgg 23

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

cacacaactt tgatgcccac at 22

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

agtgattagc atgtcactat gtgtgcatcc 30

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

atcgttcaaa catttggca 19

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

attgcgggac tctaatcata 20

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

catcgcaaga ccggcaacag g 21

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

ggccagggct tccgtgat 18

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

ccgtcgttgt agaaccattg g 21

<210> 65

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

agtccttatg tgctccactt tctggtgca 29

<210> 66

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

ggtcgtcctc ctaaggcgaa ag 22

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

cttcttcggc ggtcgtccac 20

<210> 68

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

cggagccact cggtgccgca actt 24

Claims (10)

1.一种转基因油菜及其产品筛查阳性质粒分子pYCSC-1905，其特征在于：

碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种转基因油菜及其产品筛查阳性质粒分子pYCSC-1905，其特征在于：其含有9个常用筛查靶标和2个油菜内标基因，依次为：(1)pCaMV35S启动子(P-CaMV35S)，如SEQ ID NO.2所示，(2)pFMV35S启动子(P-FMV35S)，如SEQ ID NO.3所示，(3)Bar基因，如SEQ ID NO.4所示，(4)修饰的CP4-EPSPS基因(mCP4-EPSPS),如SEQ ID NO.5所示，(5)HPT基因，如SEQ IDNO.6所示，(6)NPTII基因，如SEQ ID NO.7所示，(7)PAT基因，如SEQ ID NO.8所示，(8)PinII终止子(T-PinII)，如SEQ ID NO.9所示，(9)NOS终止子(T-NOS)，如SEQ ID NO.10所示，(10)油菜内标基因HMG I/Y，如SEQ ID NO.11所示，(11)油菜内标基因CruA，如SEQ ID NO.12所示。

3.一种转基因油菜及其产品筛查阳性质粒分子pYCSC-1905，其为在pUC18载体上插入融合序列SEQ ID No.13，构成的质粒分子。

4.一种用于普通PCR筛查转基因油菜及其产品的试剂盒，其包括本权利要求1-3任一项所述的质粒分子以及转基因油菜筛查元件和油菜内标基因的检测引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中转基因油菜筛查元件和油菜内标基因的检测引物如下：

Bar基因：

BarF 5′—GAAGGCACGCAACGCCTACGA—3′SEQ ID NO.14

BarR 5′—CCAGAAACCCACGTCATGCCA—3′SEQ ID NO.15；

HPTII基因：

HPTIIF226 5′—GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT—3′SEQ ID NO.16

HPTIIR697 5′—AGATGTTGGCGACCTCGTATT—3′SEQ ID NO.17

mCP4-EPSPS基因：

F 5′—GACTTGCGTGTTCGTTCTTC—3′SEQ ID NO.18

R 5′—AACACCGTTGAGCTTGAGAC—3′SEQ ID NO.19

PAT基因：

F 5′—GTCGACATGTCTCCGGAGAG—3′SEQ ID NO.20

R 5′—GCAACCAACCAAGGGTATC—3′SEQ ID NO.21

T-PINII终止子：

F 5′—GACTTGTCCATCTTCTGGATTGG—3′SEQ ID NO.22

R 5′—CACACAACTTTGATGCCCACAT—3′SEQ ID NO.23；

P-FMV35S启动子：

FMV35S-F1 5′—AAGACATCCACCGAAGACTTA—3′SEQ ID NO.24

FMV35S-R1 5′—AGGACAGCTCTTTTCCACGTT—3′SEQ ID NO.25；

P-CaMV35S启动子：

35S-F1 5′—GCTCCTACAAATGCCATCATTGC—3′SEQ ID NO.26，

35S-R1 5′—GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC—3′SEQ ID NO.27；

T-NOS终止子：

NOS-F1 5′—GAATCCTGTTGCCGGTCTTG—3′SEQ ID NO.28，

NOS-R1 5′—TTATCCTAGTTTGCGCGCTA—3′SEQ ID NO.29；

NPTII基因：

NPTIIF68 5′—ACTGGGCACAACAGACAATCG—3′SEQ ID NO.30，

NPTIIR356 5′—GCATCAGCCATGATGGATACTTT—3′SEQ ID NO.31；

油菜内标准基因CruA：

CruAF398 5′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.32

CruAR547 5′—CTGGTGGCTGGCTAAATCGA—3′，SEQ ID NO.33；

油菜内标准基因HMG I/Y：

hmg-F 5′—TCCTTCCGTTTCCTCGCC—3′SEQ ID NO.34；

hmg-R 5′—TTCCACGCCCTCTCCGCT—3′SEQ ID NO.35。

6.一种用于实时荧光PCR筛查转基因油菜及其产品的试剂盒，其包括权利要求1-3任一项所述的质粒分子以及转基因油菜筛查元件和油菜内标基因的检测引物对和探针；优选地，转基因油菜筛查元件和油菜内标基因的检测引物对和探针为，

P-CaMV35S启动子：

引物CAMV35S-QF 5′—CGACAGTGGTCCCAAAGA—3′SEQ ID NO.36，

CAMV35S35S-QR 5′—AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC—3′SEQ ID NO.37，

探针CAMV35S-QP 5′—TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC—3′SEQ ID NO.38；

P-FMV35S启动子：

引物FMV35S-QF 5′—AAGACATCCACCGAAGACTTA—3′SEQ ID NO.39，

FMV35S-QR 5′—AGGACAGCTCTTTTCCACGTT—3′SEQ ID NO.40，

探针FMV35S-QP 5′—TGGTCCCCACAAGCCAGCTGCTCGA—3′SEQ ID NO.41；

Bar基因：

引物BAR-F1 5′—ACAAGCACGGTCAACTTCC—3′SEQ ID NO.42，

BAR-R1 5′—GAGGTCGTCCGTCCACTC—3′SEQ ID NO.43，

探针BAR-P1 5′—TACCGAGCCGCAGGAACC—3′SEQ ID NO.44；

mCP4-EPSPS基因：

引物CP4-EPSPSF505 5′—GTACCTATGGCTTCCGCTCAAG—3′SEQ ID NO.45，

CP4-EPSPSR597 5′—AGTCATGATTGGCTCGATAACAGT—3′SEQ ID NO.46，

探针CP4-EPSPSFP530 5′—AGTCCGCTGTTCTGCTTGCTGGTCTCA—3′SEQ ID NO.47；

HPT基因；

引物QHPTF286 5′—CAGGGTGTCACGTTGCAAGA—3′SEQ ID NO.48，

QHPTR395 5′—CCGCTCGTCTGGCTAAGATC—3′SEQ ID NO.49，

探针QHPTFP308 5′—TGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTG—3′SEQ ID NO.50；

NPTII基因：

引物QNPTIIF63 5′—CTATGACTGGGCACAACAGACA—3′SEQ ID NO.51，

QNPTIIR163 5′—CGGACAGGTCGGTCTTGACA—3′SEQ ID NO.52，

探针QNPTIIFP90 5′—CTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCG-3’SEQ ID NO.53；

PAT基因；

引物PAT-F1 5′—GTCGACATGTCTCCGGAGAG—3′SEQ ID NO.54，

PAT-R1 5′—GCAACCAACCAAGGGTATC—3′SEQ ID NO.55，

探针PAT-P 5′—TGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA—3′SEQ ID NO.56；

T-PinII终止子；

引物T-PINLL-F 5′—GACTTGTCCATCTTCTGGATTGG—3′SEQ ID NO.57，

T-PINLL-R 5′—CACACAACTTTGATGCCCACAT—3′SEQ ID NO.58，

探针T-PINLL-P 5′—AGTGATTAGCATGTCACTATGTGTGCATCC—3′SEQ ID NO.59；

T-NOS终止子：

引物T-NOS-F2 5′—ATCGTTCAAACATTTGGCA—3′SEQ ID NO.60，

T-NOS-R2 5′—ATTGCGGGACTCTAATCATA—3′SEQ ID NO.61，

探针T-NOS-P 5′—CATCGCAAGACCGGCAACAGG—3′SEQ ID NO.62；

油菜内标准基因CruA：

引物qCruAF 5′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.63，

qCruAR 5′—CCGTCGTTGTAGAACCATTGG—3′SEQ ID NO.64，

探针qCruAP 5′—AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA—3′SEQ ID NO.65；

油菜内标准基因HMG I/Y：

引物qhmg-F 5′—GGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG—3′SEQ ID NO.66，

qhmg-R 5′—CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC—3′SEQ ID NO.67，

探针qhmg-P 5′—CGGAGCCACTCGGTGCCGCAACTT—3′SEQ ID NO.68。

7.一种转基因油菜及其产品普通PCR筛查的方法，其包括以下步骤：

1)提取样品总DNA，

2)利用权利要求5中所述的转基因油菜筛查元件和油菜内标基因的检测引物对对权利要求1-3任一项所述的阳性质粒分子，以及样品基因组DNA进行PCR扩增；

3)琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；在阳性质粒分子正常扩增且样品中油菜内标准基因正常扩增的情况下，如存在扩增产物则说明油菜样品中含有转基因成分。

8.一种转基因油菜及其产品荧光实时PCR筛查的方法，其包括以下步骤：

1)提取样品总DNA，

2)利用权利要求6中所述转基因油菜筛查单元和油菜内标基因的检测引物对和探针对权利要求1-3任一项所述的阳性质粒分子，以及样品基因组DNA进行PCR扩增；

3)实时荧光PCR产物根据是否有典型扩增曲线判断是否有扩增产物；在阳性质粒分子正常扩增且样品中油菜内标准基因正常扩增的情况下，如存在扩增产物则说明油菜样品中含有转基因成分。

9.权利要求1-3任一项所述的质粒分子作为转基因油菜及其产品筛查的阳性对照和或质控样品。

10.权利要求1-3任一项所述的质粒分子的制备方法，其是将在pUC18载体上插入融合序列SEQ ID No.13，构成的质粒分子；或者将SEQ ID No.2-12依次连接构成融合序列，再将该融合序列插入pUC18载体中。