KR20120108013A - 형질전환 비-인간 동물 및 그것의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로 형질전환 유전자(transgene) 구조체들, 형질전환 유전자 구조체들을 포함하는 형질전환 비-인간 동물들, 형질전환 유전자 구조체들을 포함하는 상기 형질전환 비-인간 동물들을 만드는 방법들 및 이용하는 방법들에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예는, GPCR 수용체에 대한 리간드 결합 후 경로 조절에 반응하는 생물발광 형질전환 유전자 리포터 시스템을 가지는 형질전환 모델을 이용해서, 전체 동물(whole animal)들, 조직편들에서, 혹은 천연 세포들에서 비-침습적으로 GPCR 리간드를 분석하는 방법들에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일반적으로 전이유전자(transgene) 작제물들, 전이유전자 작제물들을 포함하는 형질전환 비-인간 동물들, 전이유전자 작제물들을 포함하는 상기 형질전환 비-인간 동물들을 만드는 방법들 및 이용하는 방법들에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시형태는, GPCR 수용체에 대한 리간드 결합 후 경로 조절에 반응하는 생물발광 형질전환 유전자 리포터 시스템을 가지는 형질전환 모델을 이용해서, 전체 동물(whole animal)들, 조직편들에서, 혹은 천연 세포들에서 비-침습적으로 GPCR 리간드를 분석하는 방법들에 관한 것이다.
약물 개발에서는, 5개 화합물 중에서 단지 하나만 식품의약청(Food and Drug Administration, FDA)으로 진행될 정도로 실패율(attrition rate)이 높다(DiMasi, JA, et al, J Health Econ 22,151-185, 2003). 더욱이, 어마어마하게 늘어난 투자에도 불구하고, 신약 소개율은 지난 30년 동안 상대적으로 변함없는 상태로 남아 있고, 매년 신약 클래스에서 단지 두 세가지 진보만이 최종적으로 시장으로 나오고 있다(Lindsay MA, Nature Rev Drug Discovery, 2, 831-838, 2003).
약물 개발의 초기 단계들에 적용된 분자 및 기능 영상은 생물학적 활성에 대한 증거를 제공할 수 있으며, 추정 약물이 그것이 의도한 표적에 대해 효과를 가진다는 점을 확인시킬 수 있다. 따라서 분자 영상 기술에 대한 투자로 약물 개발이 촉진될 것이라는 데에 상당한 기대감이 있다 (Rudin M, Progress in Drug Res vol 62). 보다 많은 기존의 판독에 대해 분자 영상 기술들이 갖는 이점은 그것들이 생체 내 생물학적 공정들에 대해서 충분한 공간 및 시간 해상도를 가지면서 온전한 생물체 내에서 수행 가능하다는 것이다. 더욱이, 그것은 동일한 생물 모델에 대해 반복적, 비침습적, 균일하고 비교적 자동화된 연구를 다양한 시점에서 가능하게 하며, 이에 따라 종단적 연구(longitudinal studies)에 대한 통계학적 역량을 제고하고, 소요되는 동물들의 수를 줄임으로써, 약물 개발 비용을 줄일 수 있게 된다.
분자 영상 (
Molecular
Imaging
)
분자 영상이란 살아 있는 생물체 내 세포 및 아세포 수준에서의 특정 분자 공정들을 평가함에 있어서 영상 기술들을 개발하고 통합하려는 다양한 원칙들(세포 및 분자 생물학, 화학, 의학, 약학, 약리학, 물리학, 생물정보학 및 공학)로부터 접근하는 것의 집합체를 의미한다. (Massoud T.F., Genes Dev. 17:545-580, 2003)
유전공학의 출현으로 응용 과학, 예컨대 약물 발굴 파이프라인에 중대한 변화들이 생겨났다. 같은 방식으로, 동물 영상 절차를 개발하고 이용하는 것에 의해 새로운 전임상(pre-clinical) 연구 수단들을 제공하고 있다(Maggie A. and Ciana P., Nat.Rev.Drug Discov. 4, 249-255, 2005). 전통적으로 동물 모델들은 생리 현상들을 실시간으로 정량화하는 것이 어렵기 때문에 번거로웠다. 이러한 어려움을 극복하기 위해서 수년에 걸쳐서 새로운 영상 방법들, 예를 들면 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging, MRI) 및 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography, PET)들이 개발되어 왔다. 좀더 최근에는 반딧불이의 발광 효소인, 루시페라아제의 생체 내 발현에 기반한 생물발광 영상이 비침습적 검출을 위해서 사용되었다.
분자 영상: 생물발광(
Bioluminescence
)
생체 내 생물발광 영상(bioluminescent imaging, BLI)은 세포나 조직으로부터의 광 방출을 검출하는 것에 기반하는 섬세한 도구이다. 리포터 유전자 기술을 활용함으로써 생체 내 영상 방법들을 통한 살아 있는 동물 내에서의 특정 세포 및 생물 공정들을 분석하는 것이 가능해진다. 생물체에 의한 가시광의 효소적 생산인, 생물발광(bioluminescence)은 많은 비-포유동물 종에서 자연적으로 발생하는 현상이다 (Contag, C.H., et al, Mol. Microbiol. 18:593-603, 1995). 루시페라아제는 기질의 산화반응을 촉매해서 광의 광자(photon)들을 방출시키는 효소이다(Greer L.F., III, Luminescence 17:43-74, 2002). 북미 반딧불이로부터의 생물발광이 가장 널리 연구되고 있다. 상기 반딧불이 루시페라아제 유전자 (luc) 발현은 기질인 D-루시페린을 비-반응성 옥시루시페린으로 전환시켜서, 562 nm에서 녹색광을 방출시키는 루시페라아제 효소를 생산한다. 포유동물 조직들은 자연적으로 생물발광을 방출하지 않기 때문에, 생체 내 BLI가 상당히 매력적인데, 배경 신호가 거의 없이 이미지들이 생성될 수 있기 때문이다.
BLI는 상기 광 리포터(light reporter)를 구조적으로 구동시키는 선별된 유전자 프로모터의 조절 하에서 상기 생물발광 리포터 유전자로 이루어진 발현 카세트를 가진 세포나 조직에 대한 유전 공학을 필요로 한다(도 3). 광 생산을 유도하기 위해서 루시페린 등의 기질들을 뇌실 내(intracerebroventricular, icv), 정맥 내(iv), 복강 내(ip) 또는 피하(sq) 주사로 투여한다.
루시페라아제에 의해 방출된 광은 수 밀리미터 내지 센티미터 깊이의 조직을 투과할 수 있다; 하지만 광자 세기는 각각의 조직 깊이 센티미터마다 10 배 감소한다 (Contag, C.H., et al, Mol. Microbiol. 18:593-603, 1995). 민감한 광-검출 장비들을 사용해서 생체 내 생물발광을 검출해야 한다. 검출기들은 단위 면적 당 방출된 광자들의 수를 측정한다. 400 및 1000nm 사이의 파장에서의 낮은 수준의 광은, 실리콘 웨이퍼를 때리는 광 광자들을 전자들로 변환시키는 전하결합소자 카메라로 검출될 수 있다 (Spibey CP et al electrophoresis 22:829-836, 2001). 이 소프트웨어는 전자 신호들을 이차원 이미지로 변환할 수 있다. 또한 이 소프트웨어는 방출된 광의 세기를 정량화할 수도 있고(검출기들에 부딪히는 방출된 광자들의 수), 이 수치 값들을 의사색채(pseudocolor) 그래픽 또는 흑백 이미지로 변환시킬 수도 있다(도 2a 및 2b). 실제 데이터는 광자들로 측정되지만, 상기 의사색채 그래픽으로 인해 신속하게 시각적으로 해석할 수 있다. 보다 미세한 차이들에 대해서는 관심 영역 내에서 정량적 측정들이 필요할 수도 있다. 냉각시킨 전하결합소자(CCD) 카메라들을 사용함으로써 열적 노이즈를 줄이고, 차광(light-tight) 박스로 인해 루시페라아제가 생산한 광으로 하여금 최적상태로 시각화되고 정량될 수 있다 (Contag C.H. and Bachmann, M.H., Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:235-260, 2002).
상기 방출 신호의 해부 부위에 대한 자가기록(autograph)이나 방사선사진(radiograph) 같은 다른 유형의 이미지 위에 상기 루시페라아제 이미지가 겹쳐지게 하는 것이 유용하다(도 2b). 본 소프트웨어는 시각화 및 해석을 위해 이미지들을 겹쳐놓는다.
분자 영상 기술들과 동물 공학을 조합함으로써, 살아 있는 동물들 내에서의 특정한 분자 공정들에 대해 역학 연구를 수행하는 것이 가능해졌다. 이러한 접근은 전-임상 프로토콜에 잠재적으로 영향을 미쳐서, 의학의 모든 측면들을 광범위하게 변화시킬 수 있었다 (Maggie A. Trends Pharmacolo. Sci 25, 337-342, 2004)
G-단백질 결합 수용체들(G-
protein
coupled
receptors
,
GPCRs
) - 약물 표적들로서
GPCR
들
GPCR들은 그들이 공유하는 위상 구조(topological structure)에 기초해서 100개가 넘는 아집단(subfamily)으로 분류되는 세포 표면 수용체들 중 큰 대집단을 구성한다; 또한 GPCR들은 7개의 막관통(7TM) 수용체를 가리킨다. GPCR들은 제약 산업에서 가장 빈번하게 언급되는 약물 표적이다. 거래되는 전체 처방 약물들 중에서 대략 30%가 GPCR들을 표적화하고 있는데, 이로 인해 이 단백질 집단을 약학적으로 가장 성공적인 표적 클래스로 만든다(Jacoby, E; Chem. Med. Chem., 1: 761-782, 2006).
GPCR들과 그들의 세포외 리간드들 간의 상호작용은 치료제들에 대해 매력적인 방해 지점인 것으로 입증되었다. 이러한 이유 때문에 제약 산업은 생화학적 약물 발굴 분석법들을 개발해서, 이들 리간드-GPCR 상호작용들을 조사하였다. 활성화된 GPCR과 이종삼량체(heterotrimeric) G-단백질의 상호작용은, 여러가지 하방 효과기(downstream effector)들과의 상호작용을 가능하게 하는 구아노신 삼인산(GTP)에 의한 구아노신 이인산(GDP)의 교환을 촉매한다(Cabrera-Vera T.M., Endocr. Rev. 24:765-781, 2003). 하방 신호전달은 관심있는 GPCR이 선호하는 G-알파 아이소형에 따라 달라진다. 상기 G-알파q/11 집단의 단백질들은 포스포리파아제 C(PLC)를 자극하는 한편, G-알파i/0 및 G-알파s 집단의 대표예들은 대부분 아데닐레이트 사이클라아제(AC) 활성을 조절한다. 만약 관심있는 GPCR이 PLC를 경유해서 신호를 전달한다면, GPCR 활성화를 측정하는 데 가장 널리 적용된 리포터 기반 기술은 칼슘(Ca+2) 방출 검사이며, 그렇지 않으면 Ca+2-감수성 형광단(fluorophore)들을 사용하는 형광 포맷이나(Sullivan E, Methods Mol. Biol. 114:125-133, 1999) 에쿼린(aequorin)을 사용하는 발광 포맷 및 화학발광 기질에서 측정된다(Dupriez V.J., Receptors Channels 8: 319-330, 2002). 만약 관심있는 GPCR이 AC를 경유해서 신호를 전달한다면, 다양한 검출 기술들을 사용해서 세포질 환식 아데노신 일인산(cAMP) 함량이 결정될 수도 있다(Gabriel D. Assay Drug Dev.Technol. 1:291-303, 2003).
GPCR 리포터 기반 분석법들은 현존 약물 발굴 프로그램들에서 강력하게 이용되어 왔다. 일반적으로, GPCR 리포터들이 세포 기반 시스템들 속으로 도입되어서, 대형 약학 라이브러리들에 대한 시험관 내 고속 대량 스크리닝(HTS)을 지원해서 특정 GPCR를 활성화하거나 조절하는 리간드들이나 화합물들을 식별해 왔다. 이차 및 후속 세포 기반 분석법들은 특정 GPCR에 대한 HTS에서 식별된 임의의 “활성물질 (hits)”을 확인하고 정제시킨다; 하지만 역시, 이들 분석법들은 재조합 DNA 방법들에 의존해서 클로닝된 GPCR을 형질전환된 세포 유형 속으로 도입시킨다. 형질전환된 세포 유형들이 뛰어난 증식 능력을 가져서 대형 스크리닝 프로그램들을 지원하지만, 그들은 종종 비정상적인 유전적 및 기능적 특징들을 보여주며, 결과적으로 이 패러다임을 사용하면서 HTS로부터 추정되는 “활성물질 (hits)”에 대한 상당한 실패와 만나게 된다.
수년 동안, GPCR들의 기능 활성을 측정하기 위해서 생물발광-기반 리포터 유전자 분석법들이 사용되어 왔다(Hill, S.J. Curr.Opin.Pharmacol.1: 526-532, 2001). 이 분석 포맷은 매우 민감한데, 생물발광 판독의 낮은 신호 배경과, GPCR 활성화와 축적되는 리포터 유전자 발현 사이의 신호 증폭 단계들 때문이다.
상기 리포터 유전자의 프로모터 내 cAMP 반응 요소(cAMP response element, CRE)는 G 단백질 의존성 신호전달에 대해 특이적인 모니터링을 가능하게 한다. 리간드가 상기 GPCR에 결합할때, 그것은 상기 GPCR 내의 구조 변화를 야기시켜서, 연결된 G-단백질이 활성화될 수 있게 한다. 효소 아데닐레이트 사이클라아제는 G-단백질들에 의해 제어될 수 있는 세포성 단백질이다. 아데닐레이트 사이클라아제 활성은 그것이 상기 활성화된 G 단백질의 서브유닛에 결합할 때 활성화되거나 또는 억제된다. 신호 전달은 G 단백질의 종류에 따라 달라진다. 아데닐레이트 사이클라아제는 세포 내 cAMP 생산을 증가시키거나 감소시키는 작용을 한다. 상기 생산된 cAMP는 세포성 대사에서 이차 전달자이고, 단백질 키나아제 A(PKA)에 대한 다른자리성 활성인자(allosteric activator)이다. cAMP가 없을 때, 상기 PKA 복합체는 불활성상태이다. cAMP가 PKA의 조절성 서브유닛들에 결합할 때, 그들의 구조가 변하게 되어, 상기 조절성 서브유닛들을 분리시키고, 단백질 키나아제 A를 활성화시켜서, 추가적인 생물학적 효과들을 가능하게 한다. 이후 PKA는 전사인자 CREB를 인산화 및 활성화시킨다. CREB는 cAMP 반응 요소(CRE)라고 불리는 특정 DNA 서열들에 결합하고, 그 결과 전사를 증가시키거나 감소시키고, 이에 따라, 특정 유전자들, 예컨대 상기 루시페라아제 리포터 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시킨다.
CreLuc 전이유전자는 직접적으로는 상기 cAMP 세포 내 신호전달 경로를 통해서, 또는 간접적으로는 PLC를 경유하는 신호전달을 통해서, 3개의 주요 GPCR들 모두의 활성화를 검정하도록 설계된다. 어떠한 세포 유형이라도 그들의 세포 표면에 많은 다른 종류의 GPCR들을 포함하기 때문에, (따라서 어떠한 세포라도 세포 내에서 동시에 발생하는 G-알파q/11, G-알파i/0 및 G-알파s 경유 GPCR 신호전달을 가질 것임) 기존의 상식에 의하면 CreLuc 등의 전이유전자가 임의의 하나의 특이적인 GPCR 리간드를 구별해낼 만큼 충분히 특이적일 것 같지 않다고 제안할 것이다. 하지만, 우리가 여기서 언급하는 것은 상기 CreLuc 형질전환 유전자가 GPCR 리간드들을 구별해낼 수 있다는 것이다. 우리는 세포들, 조직편들, 또는 전체 동물(whole animal) 속 루시페라아제 리포터에 대한 생물발광 신호가 포스콜린(forskolin)에 의해 증가될 것이고, Gs, Gq 또는 Gi 수용체들에 대한 리간드들에 의해 조절될 것으로 예상한다. 표 1에서는 GPCR 리간드에 결합 시 GPCR 활성화/억제가 CreLuc 리포터 시스템에 대해 가질 것으로 예상되는 효과를 보여주고 있다. 또한, 세포들, 조직편들 및 전체 동물(whole animal) 내에서 사용될 때, 우리의 신규한 CreLuc 리포터 시스템이 다른 클래스의 GPCR 리간드들을 구별해낼 수 있고, 그러한 리포터 시스템이 신규한 GPCR 리간드들을 식별하는 데에 적용 가능하다는 데이터를 보여준다.
GPCR
바이오영상 리포터 형질전환 모델
현재의 약물 발굴 패러다임에서 잠재적 약물 후보물질들의 상당한 실패(attrition)는 세포 기반 리포터 분석들로부터 생체 내 모델들로의 위상 전이에서 생긴다. 특정 인간 질환 중 전부나 일부를 요약해서 보여주는 수많은 생체 내 모델들이 입수 가능하다. 이 모델들에서의 선도 화합물 활성을 설명하는 것은 새로운 화학적 GPCR 약물의 개발에 있어서 매우 획기적인 일이다. 동물 질환 모델들은 일반적으로 매우 많은 동물들과 시간을 요구함으로써, 그들의 표현형의 개발과 후보 화합물이 질환 결과를 바꾸는데 미치는 영향에 대한 정확한 분석이 가능해진다. 시험관 내 테스트를 진행한 후에, 복잡한 시스템에서 약물 후보물질을 시험하는 다음 수준은 질환 단계들에 대한 생체 내 시험 또는 생체 내 모델들로서, 기계론적인 기반으로 이루어진다. 유도된 질환 결과들을 바꾸는 것에 대한 실패들은 낮게 이해되지만, 약물 개발 파이프라인에서의 후보 화합물들의 실패율이 커지는 결과를 가져온다.
GPCR 리간드 결합 및 활성화 리포터 분석을 포함하는 형질전환 모델은 GPCR들에 대한 현재의 약물 발굴 패러다임에서 중대한 개선이 될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 일 실시형태에서는 GPCR 리간드 약물 발굴을 상당히 촉진시킬 전체 동물(whole animal), 조직, 또는 세포 내 분자 영상과 조합되는 루시페라아제 리포터에 기초한 cAMP 리포터 분석법(CreLuc)을 포함하여 전이유전자를 설명하고 있다(Bhaumik, S. and Gambhir, S.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:377-382 2002; Hasan M.T., et al., Genesis 29:116-122, 2001). 여기서 설명된 것처럼, 본 발명의 형질전환 비-인간 동물의 실시형태들은 다음과 같은 비-제한적인 이점들을 제공한다:
1. 조직 또는 세포 기반 분석들은 형질전환 생체 내 모델 분석에서와 동일한 리포터 시스템을 가져서, 복잡하고 온전한 상태의 생물 시스템들 내의 미지의 것들의 수를 줄인다.
2. 비-침습적 영상으로 인해서, 동일한 동물 내에서의 시간에 따른 분석에서 리간드 또는 화합물 활성에 대한 정량 분석이 가능해진다.
3. 비-침습적 영상으로 인해서, 연구당 동물의 수를 줄이고, 각각의 동물이 스스로 대조군이 됨으로써 통계학적 역량을 더욱 크게 부여할 수 있으며, 여기서 상기 대조군은 0 시간에서 분석된 동물이 된다.
4. 상기 형질전환 동물은 세포 및 조직의 원재료로서, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 수행된 평행 분석법(parallel assay)들을 지원한다.
5. 상기 형질전환 동물 분석법은 리간드: 수용체 상호작용에 대한 프로파일을 더욱 현실적으로 만들, 원래의 세포 유형에서의 리간드 활성 분석을 지원할 것이다.
6. 상기 형질전환 동물로 인해서 GPCR 리간드들에 대한 약력학(pharmacodynamics) 및 약동학(pharmacokinetics)을 동시에 평가하는 것이 가능해진다.
7. 상기 형질전환 동물로 인해서 기관에서든지 전체 동물(whole animal) 수준에서든지 조직 및 세포-유형 특이성을 동시에 식별하는 것이 가능해진다.
8. 상기 형질전환 동물로 인해서 다른 유전자 변형된 모델들과 교배해서, 신규한 신호전달 경로와 특정 리간드들에 대한 그들의 반응을 밝혀내는 것이 가능해진다.
다양한 리포터들로 조작된 다수의 형질전환 동물들이 분자 공정, 예컨대 약물 대사(Zhang W., et al. Drug Metab. Dispos. 31:1054-1064, 2003), 유전독성(genotoxicity)(Gossen J.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7971-7975, 1989) 및 독성 화합물들의 효과(Sacco M.G. et al., Nat. Biotechnol.15:1392-1397, 1997)의 연구에 이용되고 있다. 그들의 설계 목표를 달성하기 위해서, 분자 영상 연구에 적합한 GPCR 리포터 동물은, 큰 생물발광 검출 창(window of bioluminescent detection)을 지원하기 위한 고 수준의 리포터 발현뿐만 아니라, 연구 중인 리간드 또는 화합물의 생체 분포에 대한 광범위하고 예리한 생체 내 분석들을 지원하기 위한 모든 세포 유형 속 발현을 가능하게 하는 구조로 된 여러가지 요소들을 포함해야 한다.
유전자 발현과 연관된 기작들은 복잡하고 다양하므로 결코 연구자들이 형질전환 동물들에서 발현 중인 모든 현상들에서 작용 가능한 유전자들을 완전히 예상하게 구축할 수 있게 하지 않을 것이다(Pinkert, C. A. (ed.) 1994. Transgenic animal technology: A laboratory handbook. Academic Press, Inc., San Diedo, Calif.; Monastersky G. M. and Robl, J. M. (ed.) (1995) Strategies in Transgenic Animal Science. ASM Press. Washington D.C). 광범위한 시행착오를 통해서만, GPCR 리포터들의 바이오영상에 필요한 것과 같은 모델 디자인 목표를 전달하도록, 전이유전자 구조들의 독특한 조합들이 얻어질 수 있다.
재조합 세포 분석들에 대한 형질전환
GPCR
리포터의 유용성
스크리닝 기술이 개별 GPCR들의 거동들을 이해하는 지점으로 발전함에 따라서, 분명한 것은 온-오프 스위치이기 보다는, 이 수용체들이 정보의 마이크로프로세서 기능을 더욱 많이 한다는 것이다. 이것은 기능적인 선택 현상을 도입하였으며, 그에 따라 특정 리간드들이 단지 주어진 수용체에 의해 매개된 신호전달 기작 부분들만 개시하고, 이로써 약물 발굴을 위한 새로운 지평을 열어주었다. 신규한 GPCR 리간드 관계들을 발견하고, 이러한 복잡한 시스템들에 대한 약물의 효과를 정량해서 의화학을 가이드하는 것에 대한 요구는 임의의 약리학적 리포터 분석에 대해 더 많이 요구하고 있다. 이러한 개념은 환원주의 재조합 세포 기반 스크리닝 시스템들로부터 전체-시스템 분석으로 회귀하게 한다. 본연의 세포 환경에서 특정 GPCR 또는 GPCR 세트와 리간드의 활성을 프로파일함으로써 약학적으로 중요한 수용체들의 주요 군에 대응해서 신약을 동정하는 것의 성공율을 개선시킬 것으로 예상된다(Kenakin TP, Nat. Rev. Drug Discov. 8,617-625, 2009). 생물발광 GPCR 리포터 전이유전자를 갖는 동물 모델이 매우 바람직한 분자 영상 전략으로서, 본연의 생물학적으로 복잡한 시스템에서의 GPCR 리간드 활성을 인간 질환들과 싸우기 위한 약물 발굴을 개선하는 목표로서 정의한다.
CRE/CREB의 활성화는 많은 다양한 생물 공정들과 연관이 있기 때문에, CRE/CREB 리포터 발현 시스템을 이용한 CRE 활성화 연구에 상당한 관심이 있었다. 환식 아데노신 일인산(Cyclic adenosine monophosphate; cAMP)는 수용체 활성화 및 후속 단백질 키나아제 활성화에 이어지는 세포 내 신호 변환에서 이차 전달자로서, 많은 생물 공정들의 조절에 연관되고 있다. cAMP에 의해 활성화된 키나아제로 인산화된, CREB (cAMP 반응 요소 결합 단백질)가 다수 유전자들의 프로모터 부위에서 상기 cAMP 반응 요소(CRE)에 결합하고, 전사를 촉진한다(Shaywitz and Greenberg, Annul. Rev. Biochem., 68:821-861, 1999). 베타-갈락토시다아제 발현을 구동시키는 최소 단순 포진 바이러스(HSV) 프로모터와 함께 6개의 나란한(tandem) CRE를 운반하는 형질전환 마우스를 사용해서, 만성 항우울 치료에 반응하여 뇌 조직편들에서의 CRE-매개 유전자 발현을 연구하였다(Thome J., et al., J. Neurosci. 20:4030-4036, 2000). 유사하게, 티미딘 키나아제 프로모터와 상기 루시페라아제 유전자에 융합된 래트(rat) 소마토스타틴 유전자 프로모터 CRE의 4개 사본을 운반하는 형질전환 마우스를 사용해서, 조직학상 뇌 조직편들 또는 균질물들에서 CRE 활성화를 연구하였다(Boer et al, PloS One, May 9; 2(5):e431, 2007). 하지만, 지금까지의 연구들은 다수의 형질전환 세포주들을 스크리닝해서 적합한 동물 모델을 찾는 것에 대한 필요에 의해 제한되었다. 더욱이, 적정한 세포주를 동정한 후에, 상대적으로 낮은 리포터 발현 수준들은, 상기 리포터 유전자를 측정하기 위해서 상기 형질전환 동물을 안락사시킬 것을 요구하고, 이에 따라 다수의 동물을 하나의 실험 패러다임에 사용될 것을 요구하고 있다.
본 발명의 일 실시형태는 인슐레이터 요소들(insulator elements), 반응 요소들(response elements), 프로모터 요소들(promoter elements), 리포터 유전자들(reporter genes), 및 기능 요소들(functional elements)을 포함하는, 전이유전자를 개발하는 것이다. 상기 전이유전자는 비-인간 동물 속으로 빠르게 도입될 수 있는데, 그것의 높은 통합(integration)율과 높은 수준의 리포터 유전자 발현 때문이며, 이에 따라 형질전환 동물들이 생체 내(즉, 살아 있는 동물 내), 원 위치(in situ)(예, 뇌 조직편들, 온전한 전체 기관) 또는 시험관 내(예, 상기 형질전환 동물에서 배양한 일차 세포들, 조직 균질물들)에서의 조절 요소 활성화 연구용 모델들처럼 쉽게 개발될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태는 생체 내에서 세포 내 cAMP 수준 조절을 통한 GPCR 리간드 활성 정량용 모델들처럼 형질전환 비-인간 동물들에 사용되는 CRE Luc 리포터 시스템을 포함하는, 전이유전자이다. 비-제한적인 예시로서, 우리는 일반적인 cAMP 조절자들을 이용해서, 분리된 일차 세포들 및 전체 동물(whole animal) 내에서 생물발광을 통한 루시페라아제 리포터 변화를 설명하였다. 또 다른 실시형태에서, 상기 리포터의 활성화를 분석하였으며, 생체 외 루시페라아제 분석을 이용하여 조직 추출물들에서 확인하였다. 상기 CRE Luc 전이유전자의 반응을 복수의 마우스 세포주들에서 기록하였고, 단일 또는 복수의 조직 활성화 프로파일을 보여준다. 더욱이, 비-제한적인 예시로서, 본 발명자들은 특이적인 GPCR 리간드들이 전체 동물(whole animal)들, 조직편들 및 일차 세포들에서 상기 CRE Luc 전이유전자를 활성화시킨다는 것을 설명하였다.
일반적으로, 본 발명은 전이유전자 작제물들, 전이유전자 작제물들을 포함하는 형질전환 비-인간 동물들, 전이유전자 작제물들을 포함하는 상기 형질전환 비-인간 동물들을 만드는 방법들과 이용하는 방법들을 제공한다. 본 발명의 일 실시형태는 CRE Luc 리포터 시스템을 포함하는 전이유전자 작제물을 제공한다. 본 발명의 일 실시형태는 상기 CRE Luc 리포터 시스템을 포함하는 전이유전자 작제물을 비-인간 동물 내로 도입하는 것이다.
cAMP 조절이 GPCR들에 대한 주된 활성화 경로이므로, 본 발명은 전체 동물(whole animal)들, 조직편들, 또는 세포들에서, 리포터 유전자 활성화를 통해 리간드 또는 화합물에 의한 GPCR 활성화를 정량하기 위한 플랫폼으로서 작용하는데, 여기서 상기 리포터 유전자는 측정 가능한 생물발광 신호, 예컨대, 루시페라아제에 의한 루시페린 대사를 제공한다. 본 발명은 신약 발굴 물질들, 예컨대 전체 동물(whole animal)들에 대한 세포 기반 분석들로부터의 리간드들 또는 화합물들의 전이를 개선하기 위한 도구들을 공급한다. 본 발명의 일 실시형태는 새로운 GPCR 리간드들에 대한 실패율을 감소시키면서 생물유용성 데이터를 동시에 공급할, 원래의 세포들(native cells) 내 동일한 리포터 시스템을 이용한다.
본 발명의 일 실시형태는 제1 인슐레이터 요소, 반응 요소, 프로모터, 생물발광 리포터, 기능 요소 및 제2 인슐레이터 요소를 포함하는 전이유전자를 포함하는 게놈을 가지는 형질전환 비-인간 동물이다.
본 발명의 일 실시형태는 형질전환 비-인간 동물이며, 여기서 상기 제1 인슐레이터 요소는 매트릭스 부착 영역(MAR), DNase I-과민 부위(HS4) 및 역위 말단 반복부(ITR)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 추가적인 실시형태는 형질전환 비-인간 동물이며, 여기서 상기 제2 인슐레이터 요소는 매트릭스 부착 영역 (MAR), HS4 및 ITR로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 추가적인 실시형태는 형질전환 비-인간 동물이며, 여기서 상기 제1 인슐레이터 요소는 상기 제2 인슐레이터 요소와 동일하다.
본 발명의 일 실시형태는 형질전환 비-인간 동물을 포함하며, 여기서 상기 반응 요소는 cAMP 반응 요소(CRE), 활성자 단백질 1 (ASP1), 당질코르티코이드 반응 요소(GRE), 열 충격 반응 요소(HSE), 혈청 반응 요소(SRE), 티로이드 반응 요소(TRE) 및 에스트로겐 반응 요소(ERE)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 추가적인 실시형태는 형질전환 비-인간 동물이며, 여기서 상기 반응 요소는 나란하게(in tandem) 2 내지 24회 반복된다. 본 발명의 추가적인 실시형태는 형질전환 비-인간 동물이며, 여기서 상기 반응 요소는 나란하게(in tandem) 6회 반복된다. 본 발명의 추가적인 실시형태는 형질전환 비-인간 동물이며, 여기서 상기 반응 요소는 CRE이며, 또한 여기서 상기 CRE 반응 요소는 단일 요소이거나 2 내지 24회 반복되는 것일 수도 있다.
본 발명의 일 실시형태는 형질전환 비-인간 동물이며, 여기서 상기 프로모터는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 최소(HSV TK min) 프로모터이다.
본 발명의 일 실시형태는 형질전환 비-인간 동물이며, 여기서 상기 생물발광 리포터는 루시페라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 베타-갈락토시다아제, 분비된 알칼리성 포스파타아제(SEAP), 인간 성장 호르몬(HGH) 및 녹색 형광 단백질(GFP)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 일 실시형태는 형질전환 비-인간이며, 여기서 상기 기능 요소는 인간 성장 호르몬(hGH) 유전자이다.
본 발명의 일 실시형태는 형질전환 비-인간이며, 여기서 상기 전이유전자는 서열번호 18을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태는 형질전환 비-인간이며, 여기서 상기 전이유전자는 서열번호 19를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태는 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리된 세포 또는 청구항 1항의 형질전환 비-인간 동물로부터 단리된 조직편이다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 리간드를 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물에서의 생물발광의 양을 측정하는 단계; (b) 테스트제를 상기 형질전환 비-인간 동물에 투여하는 단계; (c) 상기 테스트제 투여 후 한번 이상의 시점에 상기 형질전환 비-인간 동물의 생물발광의 양을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 (a) 단계에서 측정된 생물발광의 양을 상기 (c) 단계에서 측정된 생물발광의 양과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 (c) 단계에 대해 비교된 상기 (a) 단계에서 측정된 생물발광의 양의 차이가 상기 테스트제를 GPCR 리간드로서 식별시켜 준다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 리간드를 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물로부터의 조직편을 준비하는 단계; (b) 상기 조직편에서의 생물발광의 양을 측정하는 단계; (c) 테스트제를 상기 조직편에 투여하는 단계; (d) 상기 테스트제 투여 후 한번 이상의 시점에 상기 조직편의 생물발광의 양을 측정하는 단계; 및 (e) 상기 (b) 단계에서 측정된 생물발광의 양을 상기 (d) 단계에서 측정된 생물발광의 양과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 (d) 단계에 대해 비교된 상기 (b) 단계에서의 생물발광의 양의 차이가 상기 테스트제를 GPCR 리간드로서 식별시켜 준다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 리간드를 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리한 세포를 준비하는 단계; (b) 상기 세포에서의 생물발광의 양을 측정하는 단계; (c) 테스트제를 상기 세포에 투여하는 단계; (d) 상기 테스트제 투여 후 한번 이상의 시점에 상기 세포에서의 생물발광의 양을 측정하는 단계; 및 (e) 상기 (b) 단계에서 측정된 생물발광의 양을 상기 (d) 단계에서 측정된 생물발광의 양과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 (d) 단계에 대해 비교된 상기 (b) 단계에서의 생물발광의 양의 차이가 상기 테스트제를 GPCR 리간드로서 식별시켜 준다.
본 발명의 일 실시형태는 비-인간 동물 내에서 GPCR 기능을 모니터링하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 비-인간 동물을 형질전환 변형해서 제1 인슐레이터 요소, 반응 요소, 프로모터, 생물발광 리포터, 기능 요소 및 제2 인슐레이터 요소를 포함하는 전이유전자를 발현하는 단계; (b) 상기 비-인간 동물로부터 생물발광을 모니터링하는 단계; 및 (c) 상기 생물발광을 GPCR 기능과 상호연관시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태는 비-인간 동물 내에서 GPCR 기능을 모니터링하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 비-인간 동물을 형질전환 변형해서 제1 인슐레이터 요소, 반응 요소, 프로모터, 생물발광 리포터, 기능 요소 및 제2 인슐레이터 요소를 포함하는 전이유전자를 발현하는 단계; (b) 상기 비-인간 동물로부터 루시페라아제를 모니터링하는 단계; 및 (c) 상기 생물발광을 GPCR 기능과 상호연관시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태는 비-인간 동물 내에서 GPCR 기능을 모니터링하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 비-인간 동물을 형질전환 변형해서 제1 인슐레이터 요소, 반응 요소, 프로모터, 생물발광 리포터, 기능 요소 및 제2 인슐레이터 요소를 포함하는 전이유전자를 발현하는 단계; (b) 상기 비-인간 동물을 조작해서 질환 상태의 양상을 모방하는 단계; (c) 상기 비-인간 동물로부터 생물발광을 모니터링하는 단계; 및 (d) 상기 생물발광을 GPCR 기능과 상호연관시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태는 비-인간 동물 내에서 GPCR 기능을 모니터링하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 비-인간 동물을 형질전환 변형해서 제1 인슐레이터 요소, 반응 요소, 프로모터, 생물발광 리포터, 기능 요소 및 제2 인슐레이터 요소를 포함하는 전이유전자를 발현하는 단계; (b) 상기 비-인간 동물을 조작해서 질환 상태의 양상을 모방하는 단계; (c) 상기 비-인간 동물로부터의 루시페라아제를 모니터링하는 단계; 및 (d) 상기 생물발광을 GPCR 기능과 상호연관시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태는 GPCR 기능 모니터링에 이용하기 위해서 비-인간 형질전환 동물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 비-인간 동물을 형질전환 변형해서 제1 인슐레이터 요소, 반응 요소, 프로모터, 생물발광 리포터, 기능 요소 및 제2 인슐레이터 요소를 포함하는 전이유전자를 발현하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 형질전환 비-인간 동물에서의 생물발광의 양을 측정하는 단계; (c) GPCR 리간드를 상기 형질전환 비-인간 동물에 투여하는 단계; (d) 상기 GPCR 리간드 투여 후 한번 이상의 시점에 상기 형질전환 비-인간 동물의 생물발광의 양을 측정하는 단계; 및 (e) 상기 (b) 단계에서 측정된 생물발광의 양을 상기 (d) 단계에서 측정된 생물발광의 양과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 (d) 단계에 대해 비교된 상기 (b) 단계에서의 생물발광의 양의 차이가 상기 형질전환 비-인간 동물을 GPCR 기능 모니터링에 사용하기 위한 것으로서 식별시켜 준다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)를 조절하는 화합물을 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리한 세포를 준비하는 단계; (b) 상기 세포에서의 생물발광의 양을 측정하는 단계; (c) 테스트제를 상기 세포에 투여하는 단계; (d) 상기 테스트제 투여 후 한번 이상의 시점에 상기 세포에서의 생물발광의 양을 측정하는 단계; 및 (e) 상기 (b) 단계에서 측정된 생물발광의 양을 상기 (d) 단계에서 측정된 생물발광의 양과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 (d) 단계에 대해 비교된 상기 (b) 단계에서의 생물발광의 양의 차이가 상기 테스트제를 GPCR 리간드로서 식별시켜 준다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)를 조절하는 화합물을 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리한 세포를 하나 이상의 수용용기(receptacle) 속으로 공급하는 단계; (b) 대조군을 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; (c) 테스트제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; 및 (d) 상기 수용용기에서의 루시페라아제의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 테스트제를 포함하는 상기 수용용기(들)에서의 루시페라아제의 양에 비교된 대조군을 포함하는 상기 수용용기(들)에서 측정한 루시페라아제의 양의 차이가 상기 화합물을 GPCR을 조절하는 것으로 의미한다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)를 조절하는 화합물을 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리한 세포를 하나 이상의 수용용기(receptacle) 속으로 공급하는 단계; (b) 일반적인 cAMP 조절자를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; (c) 테스트제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; 및 (d) 상기 수용용기에서의 루시페라아제의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 일반적인 cAMP 조절자와 상기 테스트제를 포함하는 상기 수용용기(들)에서의 루시페라아제의 양에 비교된 상기 일반적인 cAMP 조절자만을 포함하는 상기 수용용기(들)에서 측정한 루시페라아제의 양의 차이가 상기 화합물을 GPCR을 조절하는 것으로 표시한다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)를 조절하는 화합물을 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리한 조직편들을 하나 이상의 수용용기(receptacle) 속으로 공급하는 단계; (b) 대조군을 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; (c) 테스트제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; 및 (d) 상기 수용용기에서의 루시페라아제의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 테스트제를 포함하는 상기 수용용기(들)에서의 루시페라아제의 양에 대해 비교된 대조군을 포함하는 상기 수용용기(들)에서 측정한 루시페라아제의 양의 차이가 상기 화합물을 GPCR을 조절하는 것으로 표시한다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)를 조절하는 화합물을 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리한 조직편들을 하나 이상의 수용용기(receptacle) 속으로 공급하는 단계; (b) 일반적인 cAMP 조절자를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; (c) 테스트제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; 및 (d) 상기 수용용기에서의 루시페라아제의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 일반적인 cAMP 조절자와 상기 테스트제를 포함하는 상기 수용용기(들)에서의 루시페라아제의 양에 대해 비교된 상기 일반적인 cAMP 조절자만을 포함하는 상기 수용용기(들)에서 측정한 루시페라아제의 양의 차이가 상기 화합물을 GPCR을 조절하는 것으로 표시한다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)를 조절하는 화합물을 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리한 세포를 하나 이상의 수용용기(receptacle) 속으로 공급하는 단계; (b) 세포 자극제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; (c) 테스트제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; 및 (e) 상기 수용용기에서 루시페라아제의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 테스트제와 세포 자극제를 포함하는 상기 수용용기(들)에서의 루시페라아제의 양에 대해 비교된 세포 자극제를 포함하는 상기 수용용기(들)에서 측정한 루시페라아제의 양의 차이가 상기 화합물을 GPCR을 조절하는 것으로 표시한다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)를 조절하는 화합물을 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리한 세포를 하나 이상의 수용용기(receptacle) 속으로 공급하는 단계; (b) 세포 자극제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; (c) 일반적인 cAMP 조절자를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; (d) 테스트제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; 및 (e) 상기 수용용기에서 루시페라아제의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포 자극제와 일반적인 cAMP 조절자와 상기 테스트제를 포함하는 상기 수용용기(들)에서의 루시페라아제의 양에 대해 비교된 일반적인 cAMP 조절자와 세포 자극제를 포함하는 상기 수용용기(들)에서 측정한 루시페라아제의 양의 차이가 상기 화합물을 GPCR을 조절하는 것으로 표시한다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)를 조절하는 화합물을 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리한 조직편들을 하나 이상의 수용용기(receptacle) 속으로 공급하는 단계; (b) 세포 자극제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; (c) 테스트제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; 및 (d) 상기 수용용기에서 루시페라아제의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 테스트제와 세포 자극제를 포함하는 상기 수용용기(들)에서의 루시페라아제의 양에 대해 비교된 세포 자극제를 포함하는 상기 수용용기(들)에서 측정한 루시페라아제의 양의 차이가 상기 화합물을 GPCR을 조절하는 것으로 표시한다.
본 발명의 일 실시형태는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)를 조절하는 화합물을 식별하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 여기서 개시한 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리한 조직편들을 하나 이상의 수용용기(receptacle) 속으로 공급하는 단계; (b) 세포 자극제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; (c) 일반적인 cAMP 조절자를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; (d) 테스트제를 하나 이상의 수용용기에 투여하는 단계; 및 (e) 상기 수용용기에서 루시페라아제의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포 자극제와 일반적인 cAMP 조절자와 상기 테스트제를 포함하는 상기 수용용기(들)에서의 루시페라아제의 양에 대해 비교된 상기 세포 자극제와 일반적인 cAMP 조절자를 포함하는 상기 수용용기(들)에서 측정한 루시페라아제의 양의 차이가 상기 화합물을 GPCR을 조절하는 것으로 표시한다.
도 1은 CreLuc 바이오영상 마우스 모델을 보여준다. 본 도면은 cAMP 경로를 통해서 직접적으로든지 PLC 경로를 통해서 간접적으로든지 세 종류의 GPCR(Gi, Gs, 및 Gq) 전부에 의한 상기 CreLuc 리포터 전이유전자의 세포 내 활성화를 설명하고 있다(패널 A). 포스콜린 유도에 반응하여 루시페라아제 리포터의 생물발광 변화가 상기 세 종류의 GPCR에 대해 도시되어 있다(패널 B). 포스콜린은 Gs 및 Gq 신호전달을 증대시킬 것이며, 이에 따라 CreLuc 생물발광이 증가할 것이고, 반면에 Gi 유도는 상기 리포터 유래 신호를 감소시킬 것이다. Gαs는 AC 직접 자극에 의해서 cAMP 의존성 경로를 활성화시키고, Gαs는 cAMP의 생산을 억제하고, Gαq는 PLC를 자극해서 두 가지 이차 전달자 IP3 및 DAG가 형성되게 한다. 약어: α, G 단백질의 α-서브유닛; β, G 단백질의 β-서브유닛; γ, G 단백질의 γ-서브유닛; AC, 아데닐레이트 사이클라아제; PLC, 포스포리파아제 C; PKA, 단백질 키나아제 A; PKC, 단백질 키나아제 C; DAG, 디아실글리세롤; IP3, 이노시톨 삼인산; Ca+2, 칼슘; CaMK, 칼슘/칼모듈린 단백질 키나아제; cAMP, 환식 아데노신 일인산 CRE, cAMP 반응 요소; CREB, cAMP 반응성 요소 결합 단백질,
도 2a는 생체 내 실시간 생물발광 영상을 보여주고, 본 시스템을 사용하는 이점을 설명하고 있다. 컴퓨터 분석기 시스템을 보유한 IVIS100 (Xenogen) 바이오영상 장비로 인해서, 생체 내 발현된, 생물발광 리포터 유전자, 예컨대 루시페라아제에 의해 방출된 광을 이용한 생체 내 실시간 영상이 가능해진다. 본 소프트웨어는 비침습적이고 종단적으로 신호의 정량화를 지원한다. 생체 내 실시간 영상은 기존의 생체 내 화합물 테스팅에 비해 많은 이점을 가지고 있다. 기존의 동물 연구들에서는 복수의 처치 시점들에서 개별적으로 마우스를 필요로 하는 반면, 바이오영상 모델을 이용하는 연구들에서는 동일한 동물들로 하여금 복수의 처치 시점들에서 샘플링될 수 있도록 하고 복수의 처치에 재사용될 수 있게 한다. 본 도면에서 볼 수 있는 것처럼, 기존의 방식을 사용하면 0 시간, 2 시간, 4 시간 및 8 시간의 시 구간에서 24 마리 동물이 필요할 것이지만(시점 당 n=6), 바이오영상 기술을 사용하면 단지 6 마리 동물만 소요될 것이다. 이로 인해 여러가지 이점을 낳게 되는데, 더 많은 화합물을 효능 시험되게 하면서 더 적은 테스트 동물이 소요됨으로 인한, 더 높은 처리량(higher throughput); 같은 동물로부터 시간 및 공간 데이터가 수집 가능함에 따른, 더 많은 데이터 양 및 품질; 및 각각의 화합물에 내린 결정의 질을 개선시키는, 통계 오류 감소가 해당된다.
도 2b는 CreLuc 형질전환 마우스에서의 화합물 유도에 대한 전형적인 시각적 이미지를 보여주고 있다. 기저 수준에 비해서(좌측 패널) 이소프로테레놀 투여(우측 패널)에 의해서 CRE Luc 리포터의 척수 발현을 증가시킨다. 본 생물발광 검출이 흑백으로 된 의사색채 표시로서 동물에 대한 백색광 이미지에서 시각적으로 표현되고 있다.
도 3은 발현을 촉진하기 위한 복수의 DNA 요소를 포함하는 전이유전자 구조에 대한 개략도이다. 본 개략적인 전이유전자 구조는 하기 요소들을 포함하고 있다: 본 도면에서 매트릭스 부착 영역(MAR)로서 보여지며, 위치 독립적 발현을 생성하는 인슐레이터 요소; 6회 반복되는 CRE-cAMP로 표현되는(6X CRE) 반응 요소; 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 최소 프로모터(HSV TK 최소)로 보여지는 프로모터 요소; 포유동물 발현에 최적화된 루시페라아제 유전자(LUC2)로 표시되는 리포터 요소; 및 폴리 A 꼬리를 갖는 인간 성장 호르몬 유전자(hGH 폴리 A)로 표시되며, 전이유전자 발현을 촉진하는 기능 요소.
도 4: CreLuc 전이유전자 벡터에 대한 시험관 내 평가. 30, 100 또는 199ng DNA인 하이브리드 또는 합성(synthetic; synth) 벡터를 리포펙타민 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat #11668-019)을 이용해서 CHO 세포들 내로(레닐라 루시페라아제의 양성 대조군 벡터와 함께) 형질감염시켰다. 2일 후에, 상기 세포들을 3μM 포스콜린(Sigma, St Louis, MO, cat #F6886)으로 4시간 동안 자극시키고 나서, Dual Glo 루시페라아제 분석 시스템(Promega, Madison, WI, cat# E2920)을 이용해서 루시페라아제 활성을 측정하였다. 결과들에 의하면 양쪽 벡터들에서 루시페라아제 신호가 용량 의존적으로 증가하는 양상을 보여주고 있다. 보다 높은 수준의 유도가 하이브리드 벡터에서 달성되었다.
도 5a는 보통 마우스에서 cAMP 수준에 대한 PDE 억제자의 영향을 보여준다(Cheng JB, JPET, 280, 621-626으로부터 재생됨). Balb/c 마우스에게 x축에 나열된 비히클 또는 약물을 투약하고, 20분 후에 혈액을 채취하고 cAMP 방사성 면역 검정에 의해서 cAMP를 분석하였다. CP-80,633과 롤리프람 모두가 10mg/kg에서 원형질 cAMP 수준을 매우 증대시켰다.
도 5b는 원형질에서 cAMP의 생체 내 자극을 보여주고 있다. FVB/Tac 암컷들에 비히클(1% DMSO) 또는 약물(i.p.)을 투약하고 나서, 30분 후에 혈액 시료를 수거하고 ELISA(Assay Designs, Ann Arbor, MI, cat#900-163)로 cAMP를 분석했다. 사용된 약물은 다음과 같다: 5mg/kg 포스콜린(F) (Sigma F6886), 5mg/kg 수용성 포스콜린(H20F) (Calbiochem 344273), 10mg/kg 롤리프람(R) (Sigma R6520) 또는 포스콜린과 롤리프람의 조합형태(F/R). t-테스트에서 정해진 바와 같이 롤리프람과 조합된 수용성 포스콜린을 처치한 것에서 통계적으로 중요한 증가, 14배가 관찰되었다. 포스콜린은 아데닐레이트 사이클라아제를 활성화시킴으로써 cAMP 수준을 증가시키는 반면, PDE4의 억제제들, 예컨대 롤리프람은 cAMP의 가수분해를 방지함으로써 원형질 cAMP를 증가시킨다. 롤리프람과 수용성 포스콜린의 조합형태는 생체 내에서 cAMP 수준을 14배 증가시킨다. 이 조합형태를 사용해서 바이오영상에 의한 파운더 스크리닝의 큰 유도 창을 제공하였으며, 대표적인 연구가 도 6에 나타나 있다.
도 6은 CreLuc 리포터 마우스 모델에서 초기 파운더 유도 및 세포주 선별 결과를 보여주고 있다. 복수의 형질전환 주들을 생체 내에서 포스콜린과 롤리프람으로 루시페라아제 유도하기 위해서 스크리닝하고 나서, 조직을 분리하고 루시페라아제 효소를 분석하였다. 형질전환 마우스를 투약 전에 바이오영상화하고 나서(기저 발현 수준), 동일한 마우스에 10mg/kg 롤리프람과 5mg/kg 수용성 포스콜린을 투약(i.p.)하고 투약 후 4시간째에 바이오영상화하였다(유도 발현). A(아세포주 #90): 포스콜린/롤리프람 투여에 의해 폐와 기타 조직에서 CreLuc 리포터 전이유전자의 기저 발현을 증가시켰다; B (아세포주 #219): 기저 발현의 유도가 주로 내장(gut)에서 일어난다; C (아세포주 #44): 검출 불가능 기저 발현 및 리포터가 뇌에서와 기타 조직에서 유도된다; D (아세포주 #28): 검출 불가능 기저 발현이 흉선과 간에서 증가된다; E (아세포주 #187): 검출 불가능 기저 발현이 뇌와 척수에서 유도된다. 무작위 삽입된 전이유전자에서 예상되듯이, 기저 발현, 조직 분포, 및 유도에 대한 반응에서 세포주들 간에 다양성이 있었다. 20개 세포주가 하나 이상의 조직에서 5X를 초과하는 유도를 가지는 것으로 식별되었다. 조직 프로파일 다양성에 의하면 단일 조직(즉, 폐, 간, 뇌)은 배경 조직 반응이 없는 영상을 가능하게 하는 반면, 복수 조직은 광범위한 화합물 반응 프로파일이 형성될 수 있도록 하는 것을 설명할 수 있다.
도 7은 생체 내 또는 생체 외 CreLuc 스크리닝 분석의 일반적인 도시이다.
도 8a는 CreLuc 마우스(세포주 187)로부터의 전체 뇌 슬라이스들에서 발광에 대한 이소프로테레놀(ISO) 및 AMN082(AMN)의 효과를 보여주고 있다.
도 8b는 CreLuc 마우스(세포주 44)로부터의 전체 뇌 조직편들에서 발광에 대한 시간별 포스콜린의 효과를 보여주고 있다. 시간은 X축에 분으로 표시되어 있다. 50uM 포스콜린 또는 비히클(DMSO)을 아래쪽 패널에서 화살표로 표시한 시간 = 2880에 첨가하였다.
도 9는 CreLuc 마우스 유래 일차 신경 세포의 분리 및 화합물 처리를 나타내는 개략도이다.
도 10은 β-아드레날린성 수용체(ADβR) 활성화 및 D1 도파민 수용체(DRD1) 활성화를 통한 Gs 조절을 보여준다. 뉴런을 세포주 187 E18 배아의 피질(cortices)에서 분리했다. 3일째에 배양물에서, 테스트 화합물에 포스콜린 5μM(F), 롤리프람 10μM(R), 포스콜린과 롤리프람 조합 형태(F/R), 이소프로테레놀 10μM, 이소프로테레놀과 롤리프람 조합형태(I/R); SKF82958 10μM, 및 SKF82958과 롤리프람 조합형태(S/R)가 첨가되었다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 11은 일차 대뇌피질 뉴런에서 루시페라아제 발현에 대한 프로키네티신 2(PROK2) 펩타이드의 효과를 보여준다. 일차 대뇌피질 뉴런을 세포주 187 유래 E18에서 채취하였다(뇌 및 척수에서 루시페라아제 유도 가능). 분석은 3일째에 배양물에서 4시간 또는 8시간 동안 진행되었다. 상기 PROK2 펩타이드를 수성 용액으로서 1nM 및 100nM 가한다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 12는 다양한 CreLuc 세포주 유래 일차 대뇌피질 뉴런에서 루시페라아제 발현에 대한 프로키네티신 2(PROK2) 펩타이드의 효과를 보여준다. 일차 대뇌피질 뉴런을 4개의 상이한 CreLuc 세포주 유래 E18로부터 채취하였다. 분석은 3일째에 배양물에서 1nM 또는 100nM PROK2 펩타이드로 2 시점, 4시간 및 24시간에, 3번 진행되었다. 브라이트 글로를 사용해서 분석하였고 탑카운트에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 13a는 일차 대뇌피질 뉴런에서 루시페라아제 발현에 대한 mGluR7 효능제, AMN082의 효과를 보여준다. 대뇌피질 뉴런을 E18 배아(세포주 187)로부터 채취하였다. 분석은 3일째에 배양물에서 진행되었다. 포스콜린을 10μM 사용하였다. 상기 효능제 AMN082를 포스콜린 1nM, 10nM, 100nM 및 1μM과 조합형태로 사용하였다. 분석은 4시간, 및 8시간에 브라이트 글로(Promega)로 탑카운트에서 판독되었다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 13b는 일차 대뇌피질 뉴런에서의 Gi 활성 조절 능력에 대해서 미지의 화합물을 스크리닝한 결과를 보여준다. 대뇌피질 뉴런을 E18 배아(세포주 187)에서 채취하였다. 분석은 3일째에 배양물에서 진행되었다. 포스콜린을 10μM 사용하였다. AMN082 또는 미지의 화합물 A, B 또는 C를 다양한 농도의 포스콜린과 조합하여 테스트하였으며, EC50 값을 산출하였다. 분석은 브라이트 글로(Promega)를 사용해서 4시간에 탑카운트에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 14는 일차 대뇌피질 뉴런에서의 루시페라아제 발현에 대한 mGluR7 효능제, AMN082의 효과를 보여준다. 일차 대뇌피질 뉴런을 세포주 187 유래 E18 배아에서 분리하였다. 분석은 7일째에 배양물에서 6 시간 동안, 3번 진행되었다. AMN082에 대한 농도 곡선은 50μM 포스콜린과 10μM 롤리프람과 조합해서 수행되었다. 분석은 브라이트 글로 기질(Promega)을 사용해서 탑카운트 발광측정기에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 15a는 CB1 효능제인 CP 55,940에 의한 다양한 CreLuc 세포주로부터의 일차 피질 뉴런에서의 루시페라아제 발현의 Gi 조절을 보여준다. 일차 피질 뉴런을 E18에서 4개의 다른 CreLuc 세포주로부터 채취하였다. 분석은 3일째에 배양물에서 실시되었다. 10μM 의 상기 CB1 효능제, 5μM 의 포스콜린 및 10μM 의 롤리프람을 사용하였다. 4시간 및 24시간의 두 시점에서 실시하였다. 브라이트 글로 루시페라아제 검정 기질을 첨가하고, 탑카운트 발광측정기에서 검정을 판독하였다. 나타낸 데이터는 3회 반복 실시한 값의 평균치이다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 15b는 CB1 효능제인 CP 55,940에 의한 CreLuc 마우스로부터의 일차 피질 뉴런에서의 루시페라아제의 Gi 조절을 보여준다. 피질 뉴런을 E18 배아(세포주 187)로부터 분리하였다. 분석은 3일째에 배양물에서 실시하였다. 10μM의 포스콜린(F) 및 롤리프람(R)을 사용하였다. 효능제를 10μM, 1 μM 및 100nM의 농도로 첨가하였다. 검정을 8시간의 시점에 브라이트 글로(Promega)를 갖는 탑카운트에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 16은 포스콜린과 롤리프람, 및 Gs 효능제 DRD1 및 ADβR에 의해서 CreLuc 선조 뉴런에서 유도된 루시페라아제 발현을 보여준다. 선조 뉴런들을 E14 배아(세포주 187)로부터 분리하였다. 분석은 4일째에 배양물에서 실시하였다. 5μM 의 포스콜린(F) 및 10μM의 롤리프람(R)을 사용하였다. Gs 효능제 이소프로테레놀(iso), 도파민(dopa) 및 SKF82958(chloro)을 10μM, 3μM 및 1μM로 사용하였다. 5시간째에 탑카운트 발광측정기 및 브라이트 글로 루시페라아제 시약(Promega)으로 검정을 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 17은 CreLuc 마우스로부터 분리된 전체 비장세포 프렙(prep)에서의 루시페라아제 발현에 있어서 Gs 효능제뿐만 아니라 포스콜린(F) 및 롤리프람(R)과 같은 일반 cAMP 유도제의 효과를 보여준다. 세포주 64 비장세포를 항-CD3 항체(CD)로 24시간 동안 자극하였고, 나머지 절반은 처리하지 않았다(무자극). 24 시간째에, 화합물들을 추가 4시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 포스콜린과 롤리프람 공동 처치(F/R)는 5uM 포스콜린과 10um 롤리프람이었다. 사용된 Gs 효능제는 다음과 같다: EP2 효능제로서 EX00000173A(173A), DP1 효능제로서 BW245C, 및 ADβR 효능제로서 이소프로테레놀. 모든 Gs 효능제를 10uM 사용하였다. 분석은 3회 반복하여 실시하였다. 4시간 후에, 100ul의 브라이트 글로를 첨가하고 검정을 탑카운트 발광측정기에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 18은 CreLuc 마우스의 5개의 다른 아세포주(subline)로부터 분리된 T 세포에서 롤리프람 및 포스콜린에 의한 일반 cAMP 활성화 효과를 보여준다. 세포들을 항 CD3 항체(1ug/ml)로 자극하였다. 18시간 후에, 10μM 롤리프람 및 5μM 포스콜린을 추가 4시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 브라이트 글로를 첨가하고 검정을 탑카운트에서 판독하였다. 데이터를 발광(cps) (상단 패널) 및 배지 단독 대조군에 대한 증가 배수로서(하단 패널) 나타냈다.
도 19는 CreLuc 마우스(세포주 64)로부터 분리된 항 CD3 자극된 CD4+ T 세포에서의 루시페라아제 수준에 대한 Gs 효능제들의 효과를 보여준다. 웰 당 1.5x105의 세포를 96 웰 백색 불투명 플레이트에 도말한 후, 항 CD3 항체(1ug/ml)로 자극하였다. 24시간 후, 추가 4시간 동안 화합물들을 첨가하였다. Gs 효능제들 BW245C, EX00000173A(1734A) 및 이소프로테레놀(iso) 모두 10μM 사용하였다. 5uM의 포스콜린(F) 및 10uM의 롤리프람(R)을 사용하였다. 브라이트 글로를 첨가하고 검정을 탑카운트에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 20은 CreLuc 마우스의 2개의 다른 아세포주로부터 분리된 B 세포에서의 롤리프람 및 포스콜린에 의한 일반 cAMP 활성화의 효과를 보여준다. 세포를 96 웰 백색 불투명 플레이트에 웰 당 2.0x105로 도말한 후, 10ng/ml의 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극하였다. 18시간 후, 10μM 롤리프람 및 5μM 포스콜린을 추가 4시간 동안 상기 플레이트에 첨가하였다. 브라이트 글로를 첨가하고 검정을 탑카운트에서 판독하였다. 데이터를 발광(cps), 및 배지 단독 대조군에 대한 증가 배수로서 나타냈다.
도 21은 CreLuc 마우스로부터 분리된 LPS로 자극한 B220+ B 세포에서의 루시페라아제 수준에 대한 Gs 효능제들의 효과를 보여준다. 세포를 96 웰 백색 불투명 플레이트에 웰 당 2.0x105로 도말한 후, 10ng/ml의 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극하였다. 24시간 후, 추가 4시간 동안 화합물들을 첨가하였다. Gs 효능제들 BW245C, EX00000173A (1734A) 및 이소프로테레놀(iso) 모두 10μM 사용하였다. 5uM의 포스콜린(F) 및 10uM의 롤리프람(R)을 사용하였다. 브라이트 글로(Promega, Madison, WI, cat#E2610)를 첨가하고 검정을 탑카운트에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 22는 일반 cAMP 활성화제인 포스콜린(F) 및 롤리프람(R), 및 DP 수용체에 대한 효능제인 BW245C에 의한 분리된 미세아교세포(세포주 64)에서의 루시페라아제 발현의 유도를 보여준다. 일차 미세아교세포를 P2 마우스의 피질로부터 분리하고, 폴리-D-라이신-코팅 플레이트 상의 96 웰 포맷에 도말하였다. 세포를 처리하지 않고 두거나 100ng/ml LPS로 2시간 동안 자극하였다. 그런 다음 브라이트 글로 검정을 실시하기 전에 화합물들을 추가 4시간 동안 첨가하였다. 사용된 상기 화합물들은 5μM 포스콜린, 10μM 롤리프람 또는 이들 둘의 조합, 또는 DP1 수용체에 대한 Gs 효능제로서 10 μM BW245C를 사용하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 23은 CreLuc 마우스(세포주 187)의 뇌와 척수에서의 루시페라아제 발현의 유도에 대한, 척수강 내 주입된 포스콜린(F) 및 롤리프람(R)의 효과를 보여준다. 그룹 당 N=3-4 마리 마우스, 3개월령의 수컷 마우스들. A 그룹: DMSO 대조군, B 그룹: 1ug 포스콜린/10ug 롤리프람, C 그룹: 10ug 포스콜린/10ug 롤리프람, D 그룹: 40ug 포스콜린/10ug 롤리프람. 상기 동물들에 척수강 내 주입을 통해 요추 부위에 마우스 당 5μl 부피로 투약하였다. 투약 후 4시간째에 상기 동물들을 영상화하였다. 척수 및 뇌 둘 모두에 대한 데이터는 cm2당 초당 광자 개수인 평균 피크 발광으로서 나타냈다.
도 24는 CreLuc 마우스의 뇌 및 척수에서의 루시페라아제 발현에 대한 EP2 효능제, EX00000173A의 효과를 보여준다. 마우스들(세포주 187)에 비히클(5% DMSO, 0.05% tween 80, PBS) 혹은 10mg/kg EX00000173A 중 하나를 i.p. 주입하였다. 투여 후 4시간째에 동물들을 바이오영상화하였다. 나타난 데이터는 cm2당 초당 광자 개수로서 5마리 마우스의 평균을 데이터로 나타냈다.
도 25는 CreLuc 마우스에서의 루시페라아제 발현에 대한 EP2 효능제, EX00000173A의 효과를 보여준다. 마우스에 비히클 대조군과 다양한 용량의 EP2 효능제 EX0000173A 중 어느 하나를 투약하였다. 마우스에 척수강 내 주입(마우스 당 5μl)으로 투약하고 4시간 후 IVIS 바이오이미저로 바이오영상화하였다. 데이터를 평균 피크 발광인 cm2당 초당 광자 개수로서 상기 5마리 마우스의 평균으로 나타냈다.
도 26은 CRE-Luc 마우스에서 아드레날린 수용체 베타3(Adrb3) 효능제, CL316,243(1mg/kg, ip)에 의해 다양한 조직에서의 루시페라아제의 유도를 나타낸다. 상기 루시페라아제 검정은 조직 균질액 내에서 실행하였다.
도 27a는 CRE-Luc 마우스의 세포주 11(n=2) 및 115(n=3)에서 상기 Adrb3 효능제 CL316,243(1mg/kg, ip)에 의한 루시페라아제의 유도를 나타낸다. 처치 전과 4-5시간 후에 BLI를 취하였다. 조직 균질액 내에서의 루시페라아제 활성은 아래 그림들에서 보여진다.
도 27b는 CRE-Luc 마우스의 세포주 31(n=2) 및 175(n=3)에서 상기 Adrb3 효능제 CL316,243(1mg/kg, ip)에 의한 루시페라아제의 유도를 나타낸다. 처치 전과 4-5시간 후에 BLI를 취하였다. 조직 균질액 내에서의 루시페라아제 활성은 아래 그림들에서 보여진다.
도 28은 CRE-Luc 마우스의 3개의 독립적 세포주에서 글루카곤-유사 펩타이드 1 수용체(glucagon-like peptide 1 receptor; GLP-1R) 효능제인 AVE0010에 의한 루시페라아제 리포터의 유도를 보여준다. 기저 이미지는 1일째에 획득하였다. 2일째에는, AVE0010(0.1mg/kg, 피하 투여)로 마우스를 처리하고 4시간 후 영상화하였다. 기저에 비해 증가된 유도의 배수를 하단부에서 나타냈다.
도 29는 CRE-Luc 마우스의 3개의 독립적 세포주에서 상기 글루카곤-유사 펩타이드 1 수용체(glucagon-like peptide 1 receptor; GLP-1R) 효능제인 AVE0010에 의한 루시페라아제 리포터의 유도를 보여준다. 마우스에 4시간 동안 AVE0010(0.1mg/kg, 피하 투여)을 처리하였다. 8개의 다른 조직에서의 루시페라아제 활성들을 측정하였다.
도 30은 AVE0010에 의한 CRE-Luc의 유도에 있어서 베타-세포 독소 스트렙토조토신(streptozotocin; STZ)의 효과를 보여준다. 수컷 CRE-luc 마우스(세포주 11)를 AVE0010 0.1 mg/kg로 피하 투여하기 전(“미유도”; 상단 패널) 및 후에 (“AVE0010”으로 유도, 중간 패널) 영상화하였다. 모든 마우스가 AVE0010에 반응하였다(중간 패널). 그런 다음, 상기 동물에 비히클(대조군) 또는 STZ(200 mpk, ip)을 처리하였다. 4일 후에, 상기 동물들을 AVE0010 처리 후에 다시 영상화하였다(하단 패널).
도 31은 AVE0010에 의한 CRE-Luc의 유도가 베타-세포 특이적인 것과 유사함을 보여준다. 동물들을 도 30에 기재된 바와 같이 처리하였다. 혈중 글루코오스 수준을 금식시키지 않은 마우스의 꼬리 정맥을 절단하여 측정하였다. 글루코오스 수준을 베이어 혈당측정기(Bayer glucometer)로 판독하였다. 글루코오스 수준을 mg 글루코오스/ml으로 나타낸다. 유도 배수는 기저 신호에 대한 AVE10 투약의 루시페라아제 바이오영상 수준이다. 혈중 글루코오스 수준(BG)이 STZ(상단 좌측 패널)에 의해 증가하였다. 금식하지 않은 BG 수준은 AVE0010(0.1mg/kg, 피하 투여)에 의해 감소하였다. 도 30에 도시된 BLI 데이터를 정량화하였다.
도 32는 CreLuc 골수 생착을 NOD scid 감마(NSG) 마우스를 사용하여 보여준다. 골수 세포를 세포주 44 이형접합체 및 세포주 64 동형접합체로부터 채취하였다. 그런 다음 세포의 꼬리 정맥 주입을 통해서 마우스 당 백만 또는 5백만 개의 상기 세포들을 방사능 조사된 NSG 마우스에 생착시켰다. 세포주44: 마우스 1 및 2에 5백만 개의 세포를 주입하였으며, 마우스 3 및 4에 백만 개의 세포를 주입; 세포주 64: 마우스 1에 5백만 개의 세포를 주입, 마우스 2, 3 및 4에 마우스 당 백만 개의 세포를 주입. (CreLuc 세포주 당 4마리 NSG 마우스). 상기 동물들을 4주째에 바이오영상화하고(데이터는 나타내지 않음) 8주째에 다시 바이오영상화하였다(데이터 나타냄). 영상화하기 전에, 세포주 64 마우스에 5시간 동안 5mg/kg 포스콜린 및 10mg/kg 롤리프람을 유도하였다.
도 33은 마우스 배아 섬유아세포에서의 루시페라아제 발현에 대한 포스콜린, 롤리프람 및 이소프로테레놀의 효과를 보여준다. 마우스 배아 섬유아세포를 6개의 독립적 CreLuc 세포주로부터의 E12 배아로부터 배양하였고, 웰 당 20,000개 세포로 도말하였다. 테스트된 화합물들은 10μM 포스콜린(F), 5μM 롤리프람(R) 및 10μM 이소프로테레놀(iso)을 포함한다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 34는 CreLuc 마우스(세포주 187)의 루시페라아제 수준에 대한 자이모산(zymosan) 처리 효과를 보여준다. 통증 반응을 유도하기 위해서, 상기 처리한 그룹의 동물들에 자이모산(zymo)을 뒷발 모두에 피하 주입하였다. 그런 다음 상기 동물들을 4일 동안 매일 바이오영상화하였다(d1, d2, d3 및 d4로 표시함).
도 35는 심근세포에서의 루시페라아제 수준에 대한 포스콜린 및 롤리프람 및 이소프로테레놀의 효과를 보여준다. 심근세포를 P3 새끼(pup)들로부터(세포주 229) 분리하였다. 상기 세포들을 96 웰 플레이트에서 배양하였다. 테스트된 화합물들은 10μM 포스콜린(F), 5μM 롤리프람(R) 및 10μM 이소프로테레놀(iso)을 포함한다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 2a는 생체 내 실시간 생물발광 영상을 보여주고, 본 시스템을 사용하는 이점을 설명하고 있다. 컴퓨터 분석기 시스템을 보유한 IVIS100 (Xenogen) 바이오영상 장비로 인해서, 생체 내 발현된, 생물발광 리포터 유전자, 예컨대 루시페라아제에 의해 방출된 광을 이용한 생체 내 실시간 영상이 가능해진다. 본 소프트웨어는 비침습적이고 종단적으로 신호의 정량화를 지원한다. 생체 내 실시간 영상은 기존의 생체 내 화합물 테스팅에 비해 많은 이점을 가지고 있다. 기존의 동물 연구들에서는 복수의 처치 시점들에서 개별적으로 마우스를 필요로 하는 반면, 바이오영상 모델을 이용하는 연구들에서는 동일한 동물들로 하여금 복수의 처치 시점들에서 샘플링될 수 있도록 하고 복수의 처치에 재사용될 수 있게 한다. 본 도면에서 볼 수 있는 것처럼, 기존의 방식을 사용하면 0 시간, 2 시간, 4 시간 및 8 시간의 시 구간에서 24 마리 동물이 필요할 것이지만(시점 당 n=6), 바이오영상 기술을 사용하면 단지 6 마리 동물만 소요될 것이다. 이로 인해 여러가지 이점을 낳게 되는데, 더 많은 화합물을 효능 시험되게 하면서 더 적은 테스트 동물이 소요됨으로 인한, 더 높은 처리량(higher throughput); 같은 동물로부터 시간 및 공간 데이터가 수집 가능함에 따른, 더 많은 데이터 양 및 품질; 및 각각의 화합물에 내린 결정의 질을 개선시키는, 통계 오류 감소가 해당된다.
도 2b는 CreLuc 형질전환 마우스에서의 화합물 유도에 대한 전형적인 시각적 이미지를 보여주고 있다. 기저 수준에 비해서(좌측 패널) 이소프로테레놀 투여(우측 패널)에 의해서 CRE Luc 리포터의 척수 발현을 증가시킨다. 본 생물발광 검출이 흑백으로 된 의사색채 표시로서 동물에 대한 백색광 이미지에서 시각적으로 표현되고 있다.
도 3은 발현을 촉진하기 위한 복수의 DNA 요소를 포함하는 전이유전자 구조에 대한 개략도이다. 본 개략적인 전이유전자 구조는 하기 요소들을 포함하고 있다: 본 도면에서 매트릭스 부착 영역(MAR)로서 보여지며, 위치 독립적 발현을 생성하는 인슐레이터 요소; 6회 반복되는 CRE-cAMP로 표현되는(6X CRE) 반응 요소; 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 최소 프로모터(HSV TK 최소)로 보여지는 프로모터 요소; 포유동물 발현에 최적화된 루시페라아제 유전자(LUC2)로 표시되는 리포터 요소; 및 폴리 A 꼬리를 갖는 인간 성장 호르몬 유전자(hGH 폴리 A)로 표시되며, 전이유전자 발현을 촉진하는 기능 요소.
도 4: CreLuc 전이유전자 벡터에 대한 시험관 내 평가. 30, 100 또는 199ng DNA인 하이브리드 또는 합성(synthetic; synth) 벡터를 리포펙타민 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat #11668-019)을 이용해서 CHO 세포들 내로(레닐라 루시페라아제의 양성 대조군 벡터와 함께) 형질감염시켰다. 2일 후에, 상기 세포들을 3μM 포스콜린(Sigma, St Louis, MO, cat #F6886)으로 4시간 동안 자극시키고 나서, Dual Glo 루시페라아제 분석 시스템(Promega, Madison, WI, cat# E2920)을 이용해서 루시페라아제 활성을 측정하였다. 결과들에 의하면 양쪽 벡터들에서 루시페라아제 신호가 용량 의존적으로 증가하는 양상을 보여주고 있다. 보다 높은 수준의 유도가 하이브리드 벡터에서 달성되었다.
도 5a는 보통 마우스에서 cAMP 수준에 대한 PDE 억제자의 영향을 보여준다(Cheng JB, JPET, 280, 621-626으로부터 재생됨). Balb/c 마우스에게 x축에 나열된 비히클 또는 약물을 투약하고, 20분 후에 혈액을 채취하고 cAMP 방사성 면역 검정에 의해서 cAMP를 분석하였다. CP-80,633과 롤리프람 모두가 10mg/kg에서 원형질 cAMP 수준을 매우 증대시켰다.
도 5b는 원형질에서 cAMP의 생체 내 자극을 보여주고 있다. FVB/Tac 암컷들에 비히클(1% DMSO) 또는 약물(i.p.)을 투약하고 나서, 30분 후에 혈액 시료를 수거하고 ELISA(Assay Designs, Ann Arbor, MI, cat#900-163)로 cAMP를 분석했다. 사용된 약물은 다음과 같다: 5mg/kg 포스콜린(F) (Sigma F6886), 5mg/kg 수용성 포스콜린(H20F) (Calbiochem 344273), 10mg/kg 롤리프람(R) (Sigma R6520) 또는 포스콜린과 롤리프람의 조합형태(F/R). t-테스트에서 정해진 바와 같이 롤리프람과 조합된 수용성 포스콜린을 처치한 것에서 통계적으로 중요한 증가, 14배가 관찰되었다. 포스콜린은 아데닐레이트 사이클라아제를 활성화시킴으로써 cAMP 수준을 증가시키는 반면, PDE4의 억제제들, 예컨대 롤리프람은 cAMP의 가수분해를 방지함으로써 원형질 cAMP를 증가시킨다. 롤리프람과 수용성 포스콜린의 조합형태는 생체 내에서 cAMP 수준을 14배 증가시킨다. 이 조합형태를 사용해서 바이오영상에 의한 파운더 스크리닝의 큰 유도 창을 제공하였으며, 대표적인 연구가 도 6에 나타나 있다.
도 6은 CreLuc 리포터 마우스 모델에서 초기 파운더 유도 및 세포주 선별 결과를 보여주고 있다. 복수의 형질전환 주들을 생체 내에서 포스콜린과 롤리프람으로 루시페라아제 유도하기 위해서 스크리닝하고 나서, 조직을 분리하고 루시페라아제 효소를 분석하였다. 형질전환 마우스를 투약 전에 바이오영상화하고 나서(기저 발현 수준), 동일한 마우스에 10mg/kg 롤리프람과 5mg/kg 수용성 포스콜린을 투약(i.p.)하고 투약 후 4시간째에 바이오영상화하였다(유도 발현). A(아세포주 #90): 포스콜린/롤리프람 투여에 의해 폐와 기타 조직에서 CreLuc 리포터 전이유전자의 기저 발현을 증가시켰다; B (아세포주 #219): 기저 발현의 유도가 주로 내장(gut)에서 일어난다; C (아세포주 #44): 검출 불가능 기저 발현 및 리포터가 뇌에서와 기타 조직에서 유도된다; D (아세포주 #28): 검출 불가능 기저 발현이 흉선과 간에서 증가된다; E (아세포주 #187): 검출 불가능 기저 발현이 뇌와 척수에서 유도된다. 무작위 삽입된 전이유전자에서 예상되듯이, 기저 발현, 조직 분포, 및 유도에 대한 반응에서 세포주들 간에 다양성이 있었다. 20개 세포주가 하나 이상의 조직에서 5X를 초과하는 유도를 가지는 것으로 식별되었다. 조직 프로파일 다양성에 의하면 단일 조직(즉, 폐, 간, 뇌)은 배경 조직 반응이 없는 영상을 가능하게 하는 반면, 복수 조직은 광범위한 화합물 반응 프로파일이 형성될 수 있도록 하는 것을 설명할 수 있다.
도 7은 생체 내 또는 생체 외 CreLuc 스크리닝 분석의 일반적인 도시이다.
도 8a는 CreLuc 마우스(세포주 187)로부터의 전체 뇌 슬라이스들에서 발광에 대한 이소프로테레놀(ISO) 및 AMN082(AMN)의 효과를 보여주고 있다.
도 8b는 CreLuc 마우스(세포주 44)로부터의 전체 뇌 조직편들에서 발광에 대한 시간별 포스콜린의 효과를 보여주고 있다. 시간은 X축에 분으로 표시되어 있다. 50uM 포스콜린 또는 비히클(DMSO)을 아래쪽 패널에서 화살표로 표시한 시간 = 2880에 첨가하였다.
도 9는 CreLuc 마우스 유래 일차 신경 세포의 분리 및 화합물 처리를 나타내는 개략도이다.
도 10은 β-아드레날린성 수용체(ADβR) 활성화 및 D1 도파민 수용체(DRD1) 활성화를 통한 Gs 조절을 보여준다. 뉴런을 세포주 187 E18 배아의 피질(cortices)에서 분리했다. 3일째에 배양물에서, 테스트 화합물에 포스콜린 5μM(F), 롤리프람 10μM(R), 포스콜린과 롤리프람 조합 형태(F/R), 이소프로테레놀 10μM, 이소프로테레놀과 롤리프람 조합형태(I/R); SKF82958 10μM, 및 SKF82958과 롤리프람 조합형태(S/R)가 첨가되었다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 11은 일차 대뇌피질 뉴런에서 루시페라아제 발현에 대한 프로키네티신 2(PROK2) 펩타이드의 효과를 보여준다. 일차 대뇌피질 뉴런을 세포주 187 유래 E18에서 채취하였다(뇌 및 척수에서 루시페라아제 유도 가능). 분석은 3일째에 배양물에서 4시간 또는 8시간 동안 진행되었다. 상기 PROK2 펩타이드를 수성 용액으로서 1nM 및 100nM 가한다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 12는 다양한 CreLuc 세포주 유래 일차 대뇌피질 뉴런에서 루시페라아제 발현에 대한 프로키네티신 2(PROK2) 펩타이드의 효과를 보여준다. 일차 대뇌피질 뉴런을 4개의 상이한 CreLuc 세포주 유래 E18로부터 채취하였다. 분석은 3일째에 배양물에서 1nM 또는 100nM PROK2 펩타이드로 2 시점, 4시간 및 24시간에, 3번 진행되었다. 브라이트 글로를 사용해서 분석하였고 탑카운트에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 13a는 일차 대뇌피질 뉴런에서 루시페라아제 발현에 대한 mGluR7 효능제, AMN082의 효과를 보여준다. 대뇌피질 뉴런을 E18 배아(세포주 187)로부터 채취하였다. 분석은 3일째에 배양물에서 진행되었다. 포스콜린을 10μM 사용하였다. 상기 효능제 AMN082를 포스콜린 1nM, 10nM, 100nM 및 1μM과 조합형태로 사용하였다. 분석은 4시간, 및 8시간에 브라이트 글로(Promega)로 탑카운트에서 판독되었다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 13b는 일차 대뇌피질 뉴런에서의 Gi 활성 조절 능력에 대해서 미지의 화합물을 스크리닝한 결과를 보여준다. 대뇌피질 뉴런을 E18 배아(세포주 187)에서 채취하였다. 분석은 3일째에 배양물에서 진행되었다. 포스콜린을 10μM 사용하였다. AMN082 또는 미지의 화합물 A, B 또는 C를 다양한 농도의 포스콜린과 조합하여 테스트하였으며, EC50 값을 산출하였다. 분석은 브라이트 글로(Promega)를 사용해서 4시간에 탑카운트에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 14는 일차 대뇌피질 뉴런에서의 루시페라아제 발현에 대한 mGluR7 효능제, AMN082의 효과를 보여준다. 일차 대뇌피질 뉴런을 세포주 187 유래 E18 배아에서 분리하였다. 분석은 7일째에 배양물에서 6 시간 동안, 3번 진행되었다. AMN082에 대한 농도 곡선은 50μM 포스콜린과 10μM 롤리프람과 조합해서 수행되었다. 분석은 브라이트 글로 기질(Promega)을 사용해서 탑카운트 발광측정기에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 15a는 CB1 효능제인 CP 55,940에 의한 다양한 CreLuc 세포주로부터의 일차 피질 뉴런에서의 루시페라아제 발현의 Gi 조절을 보여준다. 일차 피질 뉴런을 E18에서 4개의 다른 CreLuc 세포주로부터 채취하였다. 분석은 3일째에 배양물에서 실시되었다. 10μM 의 상기 CB1 효능제, 5μM 의 포스콜린 및 10μM 의 롤리프람을 사용하였다. 4시간 및 24시간의 두 시점에서 실시하였다. 브라이트 글로 루시페라아제 검정 기질을 첨가하고, 탑카운트 발광측정기에서 검정을 판독하였다. 나타낸 데이터는 3회 반복 실시한 값의 평균치이다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 15b는 CB1 효능제인 CP 55,940에 의한 CreLuc 마우스로부터의 일차 피질 뉴런에서의 루시페라아제의 Gi 조절을 보여준다. 피질 뉴런을 E18 배아(세포주 187)로부터 분리하였다. 분석은 3일째에 배양물에서 실시하였다. 10μM의 포스콜린(F) 및 롤리프람(R)을 사용하였다. 효능제를 10μM, 1 μM 및 100nM의 농도로 첨가하였다. 검정을 8시간의 시점에 브라이트 글로(Promega)를 갖는 탑카운트에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 16은 포스콜린과 롤리프람, 및 Gs 효능제 DRD1 및 ADβR에 의해서 CreLuc 선조 뉴런에서 유도된 루시페라아제 발현을 보여준다. 선조 뉴런들을 E14 배아(세포주 187)로부터 분리하였다. 분석은 4일째에 배양물에서 실시하였다. 5μM 의 포스콜린(F) 및 10μM의 롤리프람(R)을 사용하였다. Gs 효능제 이소프로테레놀(iso), 도파민(dopa) 및 SKF82958(chloro)을 10μM, 3μM 및 1μM로 사용하였다. 5시간째에 탑카운트 발광측정기 및 브라이트 글로 루시페라아제 시약(Promega)으로 검정을 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 17은 CreLuc 마우스로부터 분리된 전체 비장세포 프렙(prep)에서의 루시페라아제 발현에 있어서 Gs 효능제뿐만 아니라 포스콜린(F) 및 롤리프람(R)과 같은 일반 cAMP 유도제의 효과를 보여준다. 세포주 64 비장세포를 항-CD3 항체(CD)로 24시간 동안 자극하였고, 나머지 절반은 처리하지 않았다(무자극). 24 시간째에, 화합물들을 추가 4시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 포스콜린과 롤리프람 공동 처치(F/R)는 5uM 포스콜린과 10um 롤리프람이었다. 사용된 Gs 효능제는 다음과 같다: EP2 효능제로서 EX00000173A(173A), DP1 효능제로서 BW245C, 및 ADβR 효능제로서 이소프로테레놀. 모든 Gs 효능제를 10uM 사용하였다. 분석은 3회 반복하여 실시하였다. 4시간 후에, 100ul의 브라이트 글로를 첨가하고 검정을 탑카운트 발광측정기에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 18은 CreLuc 마우스의 5개의 다른 아세포주(subline)로부터 분리된 T 세포에서 롤리프람 및 포스콜린에 의한 일반 cAMP 활성화 효과를 보여준다. 세포들을 항 CD3 항체(1ug/ml)로 자극하였다. 18시간 후에, 10μM 롤리프람 및 5μM 포스콜린을 추가 4시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 브라이트 글로를 첨가하고 검정을 탑카운트에서 판독하였다. 데이터를 발광(cps) (상단 패널) 및 배지 단독 대조군에 대한 증가 배수로서(하단 패널) 나타냈다.
도 19는 CreLuc 마우스(세포주 64)로부터 분리된 항 CD3 자극된 CD4+ T 세포에서의 루시페라아제 수준에 대한 Gs 효능제들의 효과를 보여준다. 웰 당 1.5x105의 세포를 96 웰 백색 불투명 플레이트에 도말한 후, 항 CD3 항체(1ug/ml)로 자극하였다. 24시간 후, 추가 4시간 동안 화합물들을 첨가하였다. Gs 효능제들 BW245C, EX00000173A(1734A) 및 이소프로테레놀(iso) 모두 10μM 사용하였다. 5uM의 포스콜린(F) 및 10uM의 롤리프람(R)을 사용하였다. 브라이트 글로를 첨가하고 검정을 탑카운트에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 20은 CreLuc 마우스의 2개의 다른 아세포주로부터 분리된 B 세포에서의 롤리프람 및 포스콜린에 의한 일반 cAMP 활성화의 효과를 보여준다. 세포를 96 웰 백색 불투명 플레이트에 웰 당 2.0x105로 도말한 후, 10ng/ml의 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극하였다. 18시간 후, 10μM 롤리프람 및 5μM 포스콜린을 추가 4시간 동안 상기 플레이트에 첨가하였다. 브라이트 글로를 첨가하고 검정을 탑카운트에서 판독하였다. 데이터를 발광(cps), 및 배지 단독 대조군에 대한 증가 배수로서 나타냈다.
도 21은 CreLuc 마우스로부터 분리된 LPS로 자극한 B220+ B 세포에서의 루시페라아제 수준에 대한 Gs 효능제들의 효과를 보여준다. 세포를 96 웰 백색 불투명 플레이트에 웰 당 2.0x105로 도말한 후, 10ng/ml의 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극하였다. 24시간 후, 추가 4시간 동안 화합물들을 첨가하였다. Gs 효능제들 BW245C, EX00000173A (1734A) 및 이소프로테레놀(iso) 모두 10μM 사용하였다. 5uM의 포스콜린(F) 및 10uM의 롤리프람(R)을 사용하였다. 브라이트 글로(Promega, Madison, WI, cat#E2610)를 첨가하고 검정을 탑카운트에서 판독하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 22는 일반 cAMP 활성화제인 포스콜린(F) 및 롤리프람(R), 및 DP 수용체에 대한 효능제인 BW245C에 의한 분리된 미세아교세포(세포주 64)에서의 루시페라아제 발현의 유도를 보여준다. 일차 미세아교세포를 P2 마우스의 피질로부터 분리하고, 폴리-D-라이신-코팅 플레이트 상의 96 웰 포맷에 도말하였다. 세포를 처리하지 않고 두거나 100ng/ml LPS로 2시간 동안 자극하였다. 그런 다음 브라이트 글로 검정을 실시하기 전에 화합물들을 추가 4시간 동안 첨가하였다. 사용된 상기 화합물들은 5μM 포스콜린, 10μM 롤리프람 또는 이들 둘의 조합, 또는 DP1 수용체에 대한 Gs 효능제로서 10 μM BW245C를 사용하였다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 23은 CreLuc 마우스(세포주 187)의 뇌와 척수에서의 루시페라아제 발현의 유도에 대한, 척수강 내 주입된 포스콜린(F) 및 롤리프람(R)의 효과를 보여준다. 그룹 당 N=3-4 마리 마우스, 3개월령의 수컷 마우스들. A 그룹: DMSO 대조군, B 그룹: 1ug 포스콜린/10ug 롤리프람, C 그룹: 10ug 포스콜린/10ug 롤리프람, D 그룹: 40ug 포스콜린/10ug 롤리프람. 상기 동물들에 척수강 내 주입을 통해 요추 부위에 마우스 당 5μl 부피로 투약하였다. 투약 후 4시간째에 상기 동물들을 영상화하였다. 척수 및 뇌 둘 모두에 대한 데이터는 cm2당 초당 광자 개수인 평균 피크 발광으로서 나타냈다.
도 24는 CreLuc 마우스의 뇌 및 척수에서의 루시페라아제 발현에 대한 EP2 효능제, EX00000173A의 효과를 보여준다. 마우스들(세포주 187)에 비히클(5% DMSO, 0.05% tween 80, PBS) 혹은 10mg/kg EX00000173A 중 하나를 i.p. 주입하였다. 투여 후 4시간째에 동물들을 바이오영상화하였다. 나타난 데이터는 cm2당 초당 광자 개수로서 5마리 마우스의 평균을 데이터로 나타냈다.
도 25는 CreLuc 마우스에서의 루시페라아제 발현에 대한 EP2 효능제, EX00000173A의 효과를 보여준다. 마우스에 비히클 대조군과 다양한 용량의 EP2 효능제 EX0000173A 중 어느 하나를 투약하였다. 마우스에 척수강 내 주입(마우스 당 5μl)으로 투약하고 4시간 후 IVIS 바이오이미저로 바이오영상화하였다. 데이터를 평균 피크 발광인 cm2당 초당 광자 개수로서 상기 5마리 마우스의 평균으로 나타냈다.
도 26은 CRE-Luc 마우스에서 아드레날린 수용체 베타3(Adrb3) 효능제, CL316,243(1mg/kg, ip)에 의해 다양한 조직에서의 루시페라아제의 유도를 나타낸다. 상기 루시페라아제 검정은 조직 균질액 내에서 실행하였다.
도 27a는 CRE-Luc 마우스의 세포주 11(n=2) 및 115(n=3)에서 상기 Adrb3 효능제 CL316,243(1mg/kg, ip)에 의한 루시페라아제의 유도를 나타낸다. 처치 전과 4-5시간 후에 BLI를 취하였다. 조직 균질액 내에서의 루시페라아제 활성은 아래 그림들에서 보여진다.
도 27b는 CRE-Luc 마우스의 세포주 31(n=2) 및 175(n=3)에서 상기 Adrb3 효능제 CL316,243(1mg/kg, ip)에 의한 루시페라아제의 유도를 나타낸다. 처치 전과 4-5시간 후에 BLI를 취하였다. 조직 균질액 내에서의 루시페라아제 활성은 아래 그림들에서 보여진다.
도 28은 CRE-Luc 마우스의 3개의 독립적 세포주에서 글루카곤-유사 펩타이드 1 수용체(glucagon-like peptide 1 receptor; GLP-1R) 효능제인 AVE0010에 의한 루시페라아제 리포터의 유도를 보여준다. 기저 이미지는 1일째에 획득하였다. 2일째에는, AVE0010(0.1mg/kg, 피하 투여)로 마우스를 처리하고 4시간 후 영상화하였다. 기저에 비해 증가된 유도의 배수를 하단부에서 나타냈다.
도 29는 CRE-Luc 마우스의 3개의 독립적 세포주에서 상기 글루카곤-유사 펩타이드 1 수용체(glucagon-like peptide 1 receptor; GLP-1R) 효능제인 AVE0010에 의한 루시페라아제 리포터의 유도를 보여준다. 마우스에 4시간 동안 AVE0010(0.1mg/kg, 피하 투여)을 처리하였다. 8개의 다른 조직에서의 루시페라아제 활성들을 측정하였다.
도 30은 AVE0010에 의한 CRE-Luc의 유도에 있어서 베타-세포 독소 스트렙토조토신(streptozotocin; STZ)의 효과를 보여준다. 수컷 CRE-luc 마우스(세포주 11)를 AVE0010 0.1 mg/kg로 피하 투여하기 전(“미유도”; 상단 패널) 및 후에 (“AVE0010”으로 유도, 중간 패널) 영상화하였다. 모든 마우스가 AVE0010에 반응하였다(중간 패널). 그런 다음, 상기 동물에 비히클(대조군) 또는 STZ(200 mpk, ip)을 처리하였다. 4일 후에, 상기 동물들을 AVE0010 처리 후에 다시 영상화하였다(하단 패널).
도 31은 AVE0010에 의한 CRE-Luc의 유도가 베타-세포 특이적인 것과 유사함을 보여준다. 동물들을 도 30에 기재된 바와 같이 처리하였다. 혈중 글루코오스 수준을 금식시키지 않은 마우스의 꼬리 정맥을 절단하여 측정하였다. 글루코오스 수준을 베이어 혈당측정기(Bayer glucometer)로 판독하였다. 글루코오스 수준을 mg 글루코오스/ml으로 나타낸다. 유도 배수는 기저 신호에 대한 AVE10 투약의 루시페라아제 바이오영상 수준이다. 혈중 글루코오스 수준(BG)이 STZ(상단 좌측 패널)에 의해 증가하였다. 금식하지 않은 BG 수준은 AVE0010(0.1mg/kg, 피하 투여)에 의해 감소하였다. 도 30에 도시된 BLI 데이터를 정량화하였다.
도 32는 CreLuc 골수 생착을 NOD scid 감마(NSG) 마우스를 사용하여 보여준다. 골수 세포를 세포주 44 이형접합체 및 세포주 64 동형접합체로부터 채취하였다. 그런 다음 세포의 꼬리 정맥 주입을 통해서 마우스 당 백만 또는 5백만 개의 상기 세포들을 방사능 조사된 NSG 마우스에 생착시켰다. 세포주44: 마우스 1 및 2에 5백만 개의 세포를 주입하였으며, 마우스 3 및 4에 백만 개의 세포를 주입; 세포주 64: 마우스 1에 5백만 개의 세포를 주입, 마우스 2, 3 및 4에 마우스 당 백만 개의 세포를 주입. (CreLuc 세포주 당 4마리 NSG 마우스). 상기 동물들을 4주째에 바이오영상화하고(데이터는 나타내지 않음) 8주째에 다시 바이오영상화하였다(데이터 나타냄). 영상화하기 전에, 세포주 64 마우스에 5시간 동안 5mg/kg 포스콜린 및 10mg/kg 롤리프람을 유도하였다.
도 33은 마우스 배아 섬유아세포에서의 루시페라아제 발현에 대한 포스콜린, 롤리프람 및 이소프로테레놀의 효과를 보여준다. 마우스 배아 섬유아세포를 6개의 독립적 CreLuc 세포주로부터의 E12 배아로부터 배양하였고, 웰 당 20,000개 세포로 도말하였다. 테스트된 화합물들은 10μM 포스콜린(F), 5μM 롤리프람(R) 및 10μM 이소프로테레놀(iso)을 포함한다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
도 34는 CreLuc 마우스(세포주 187)의 루시페라아제 수준에 대한 자이모산(zymosan) 처리 효과를 보여준다. 통증 반응을 유도하기 위해서, 상기 처리한 그룹의 동물들에 자이모산(zymo)을 뒷발 모두에 피하 주입하였다. 그런 다음 상기 동물들을 4일 동안 매일 바이오영상화하였다(d1, d2, d3 및 d4로 표시함).
도 35는 심근세포에서의 루시페라아제 수준에 대한 포스콜린 및 롤리프람 및 이소프로테레놀의 효과를 보여준다. 심근세포를 P3 새끼(pup)들로부터(세포주 229) 분리하였다. 상기 세포들을 96 웰 플레이트에서 배양하였다. 테스트된 화합물들은 10μM 포스콜린(F), 5μM 롤리프람(R) 및 10μM 이소프로테레놀(iso)을 포함한다. 데이터는 초당 개수(cps)로 보여진다.
달리 정의하지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
여기에 인용된 각각의 공개문헌, 특허출원, 특허등록, 및 기타 참조문헌은 본 개시문헌과 불합치하지 않는 범위까지 그 전문이 참조문헌으로서 인용된다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 본문에서 명시적으로 달리 표시하지 않는 한 단수 형태인 “일(a)”, “하나(an)”, 및 “상기(the)”는 복수 참조를 포함함을 주지해야 한다.
또한, 본 발명에 따르면, 당해 분야의 기술 범주 이내에서 채용된 기존의 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술들이 있을 수 있다. 그러한 기술들은 문헌 내에서 완전하게 설명되어 있다. 예를 들면, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (herein “Sambrook et al., 1989”); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J.Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)를 참고한다.
“테스트제(test agent)”는 하나의 화합물 또는 화학적 화합물들, 예컨대, 유기 화학 물질들, 무기 화학 물질들, 생물학적 화합물들 또는 생물학적 재료들, 예컨대, 항체들 및 항원 인식 단편들 및 작제물들, 핵산들, 예컨대, RNAi, 기타 등등을 포함하도록 널리 해석된다. 테스트제는 단일 제제 또는 함께 적용된 복수 제제를 포괄한다.
여기에서 사용된 것처럼, “형질전환 동물”이란 비-인간 동물, 비-제한적인 예시로서 포유동물인데, 상기 동물의 하나 이상의 세포들이 여기서 정의한 바와 같은 유전자 변형을 포함하고 있다. 추가적인 비-제한적인 예시들에는 래트 또는 마우스 같은 설치류가 포함된다. 형질전환 동물들의 다른 예시들에는 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭, 양서류 등등이 포함된다. 형질전환 동물을 선택하는 것은 상기 리포터에서 생성된 광이 조직을 가로지르고 검출이 발생할 수 있는 표면에 도달할 수 있는 능력에 의해서만 제한된다.
여기에서 사용된 것처럼, “유전자 변형”이란 상기 비-인간 동물의 유전자 서열들에서의 하나 이상의 변경이다. 비-제한적인 예시로는 전이유전자가 상기 형질전환 동물의 게놈 속으로 삽입되는 것이다.
여기에서 사용된 것처럼, “전이유전자”란 프로모터, 리포터 유전자, 폴리 아데닐화 신호 및 발현 촉진용 기타 요소들(인슐레이터류, 인트론류)을 포함하고 있는 외인성 DNA를 의미한다. 이 외인성 DNA는 형질전환 동물이 발생하는 1-세포 배아의 게놈 속으로 통합되고, 상기 전이유전자는 성숙한 동물의 게놈 안에 남아있게 된다. 상기 통합된 전이유전자 DNA는 알(egg)이나 마우스의 게놈 내의 단일 또는 복수 공간에서 생길 수 있으며, 상기 전이유전자의 나란한 형태의 단일 내지 복수(수백 개) 사본들이 각각의 게놈 위치에 통합될 수 있다.
용어 “일반적인 cAMP 조절자”란 cAMP 수준을 증대시키거나 유지시킬 수 있는, 화학적 화합물들, 예컨대 유기 화학 물질들, 무기 화학 물질들, 생물학적 화합물들 또는 생물학적 재료들, 예컨대 항체들 및 항원 인식 단편들 및 작제물들, 핵산들, 예컨대, RNAi, 기타 등등을 의미한다. 비-제한적인 예시들로는 포스콜린(forskolin) 및 롤리프람(rolipram)이 있다. 일반적인 cAMP 조절자는 단일 cAMP 조절자 또는 함께 적용된 복수의 cAMP 조절자를 포괄한다.
용어 “세포 자극제”란 상기 세포를 활성화시킬 수 있거나 상기 세포로 하여금 더욱 활성화된 상태에 있게 할 수 있는, 화학적 화합물들, 예컨대 유기 화학 물질들, 무기 화학 물질들, 생물학적 화합물들 또는 생물학적 재료들, 예컨대 항체들 및 항원 인식 단편들 및 작제물들, 핵산들, 예컨대, RNAi, 기타 등등을 의미한다. 비-제한적인 예시들로는 리포폴리사카라이드와 항 CD3이 포함된다.
본 발명의 일 실시형태는 대조군을 사용한다. 대조군이란 기술을 가진 자들에게 잘 이해된 기술분야의 용어이다. 활용된 분석 파라미터들이나, 검사 중에 있는 실험상 질문에 따라서 적절한 대조군이 달라질 수도 있다. 일반적으로, 대조군은 대조군이 테스트제나 화합물들을 용해시키는데 사용한 것과 동일한 완충용액이나 용매인 비히클 대조군(vehicle control)이다. 비-제한적인 예시는, 만약 화합물 용해를 위해서 인산 완충 염수가 사용되는 경우에는 상기 비히클 대조군은 인산 완충 염수가 될 것이다. 유사하게, DMSO가 테스트제를 용해시키기 위해 사용되는 경우에는, 상기 대조군은 DMSO이다. 종종, 한 가지를 넘는 대조군이 실험 또는 분석마다 사용되어야 하는데, 한 가지를 넘는 희석제가 테스트되는 화합물들에 사용되기 때문이다.
여기에서 사용된 것처럼, “루시페라아제”란 루시페라아제 효소 활성뿐만 아니라 루시페라아제 단백질의 실질적인 양을 의미한다.
본 발명에 따르면 형질전환 비-인간 동물들을 형성하기 위해서 당해 분야에서 기술을 가진 자들에게 알려진 종래 기술들이 채택될 수도 있다. 예를 들면, Pinkert, C. A. (ed.) 1994. Transgenic animal technology: A laboratory handbook. Academic Press, Inc., San Diedo, Calif.; Monastersky G. M. and Robl, J. M. (ed.) (1995) Strategies in transgenic animal science. ASM Press. Washington D.C.. and Nagy A, Gertsenstein, M, Vintersten, K, Behringer R 2003. Manipulating the Mouse Embryo; A laboratory Manual 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
전이유전자 요소들
본 발명의 일 실시형태는 전이유전자에 관한 것이다. 상기 전이유전자는 인슐레이터 요소, 반응 요소, 프로모터 요소, 리포터 요소, 및 기능 요소를 포함할 수도 있다.
반응 요소는 회귀성(palindromic) DNA 서열로, 세포 내에서 호르몬, 효소, 또는 기타 주요한 신호전달 단백질 등의 세포 신호에 반응한다. 반응 요소의 비-제한적인 예시들로는 표 2에 나열된 CRE (cAMP 반응 요소), 에스트로겐 반응 요소 및 기타류가 있다. 반응 요소는 단일 DNA 서열 또는 나란한 반복체(tandem repeats) 형태로 상기 전이유전자 속에 통합될 수도 있다. 예를 들면, 4회 또는 6회 반복된 CRE 반응 요소가 전이유전자 작제에 사용되었으며, 시험관 내에서 평가되었다(Deutsch P.J., et al., J. Biol. Chem., 263;18466-18472, 1988; Oetjen E JBC 269;27036-27044, 1994). 또한, Cre 반응 요소가 생체 내에서 비교되었으며, 다량체 증가는 cAMP 경로 활성자들에 대한 전사 반응 증가와 상호관련지어졌다 (Montoliu, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92;4244, 1995; Boer et al, PloS One, May 9; 2(5):e431, 2007). 본 발명의 일 실시형태는 단일 서열로서든지 복수의 나란한 반복체(tandem repeats) 형태로서든지 어떠한 알려진 반응 요소라도 활용할 수도 있는데, 예를 들면, CRE의 나란한 6개 반복체(tandem repeats) (6X CRE)이다.
DNA 프로모터 요소는 특정 유전자의 전사를 촉진하는 DNA 영역이다. 일반적으로 프로모터는 그것이 조절하는 유전자 가까이에서 같은 가닥 및 상류(센스 가닥의 5’ 영역 방향)에 위치한다. 프로모터는 RNA 중합효소 및 RNA 중합효소를 채용하는 소위 전사 인자 단백질에 대한 결합 부위를 제공하는 특이적인 DNA 서열과 반응 요소를 함유하고 있다. DNA 프로모터는 시간과 공간 안에서 특정 유전자 발현의 조절에 기여하는 그 크기와 내부 하위구조에 있어서 매우 가변적이다. 프로모터 요소의 비-제한적인 예시에서는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 최소 프로모터(HSV TK min)를 설계해서 모든 세포 유형에서 리포터 유전자가 발현될 수 있게 한다. 중심부 발현 요소들만 시험관 내에서든지 생체 내에서든지 흔한 발현을 부여하도록 보유된다(Park, J., et al., DNA Cell Bio., 12:1147-1149, 1994). 본 발명의 일 실시형태는 임의의 알려진 프로모터 요소를 활용할 수도 있다. 비-제한적 예시로서, 임의의 알려진 프로모터 요소를 사용해서 상기 CRE 시스-활성 반응 요소와 조합될 때 상기 프로모터 요소가 상기 리포터의 유전자를 발현시켜서 cAMP 경로 조절에 반응하게 할 수도 있다.
CRE 등의 반응 요소 및 상기 프로모터 요소 HSV TK 최소 프로모터는 크기가 작기 때문에, 리포터 요소의 전사를 조절하는 이 요소들을 함유하는 전이유전자 프로모터는 위치 효과에 대해 매우 민감하고 특히 낮은 리간드 농도에서 생체 내 리간드에 대한 발현 반응을 낮게 유발할 것이다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태는 상기 전이유전자에 부가될 부가 요소들에 포함해서, 높은 발현 수준과, 전체 세포 구조부들에서 기능성 전이유전자의 광범위한 분포를 가능하게 하는 것이다. 이 요소들에는 인슐레이터 요소와 기능 요소가 포함된다(Sun F.L and Elgin S.C, Cell 99:459-462, 1999).
본 발명의 일 실시형태는 상기 전이유전자 내에서 기능성 요소 또는 기능성 인핸서 요소를 이용한다. 기능 요소에 대한 비-제한적 예시로는 인간 성장 호르몬(hGH) 유전자가 있다. 상기 CreLuc 전이유전자에 사용되는 hGH 서열은 상기 인슐레이터 요소에 기여하고 상호작용해서 바이오영상 모델 설계 목표를 달성하게 하는 여러가지 설계 요소를 가지고 있다. 상기 hGH 서열은 상기 hGH 게놈 구조 전부를 포함하고 있어서, 여러가지 중요한 요소들을 제공하지만, 전사되거나 단백질로 번역되지 않는다. 상기 hGH 서열이 기능성 전이유전자의 생산을 개선시키는데 미치는 중대한 영향이 1990년 이후 여러가지 형질전환 모델들에서 언급되었다(Erickson LA, Nature 346: 74-76, 1990). 그 중요성에 대한 비교 분석은 없지만, 상기 hGH 구조는 여러가지 중요하고 의미있는 DNA 요소를 포함하고 있다:
a. 인트론 절단(Intron splicing): 처음에는 전사된 mRNA가 인트론 및 엑손 서열을 포함하고 있는데, 이것들이 나중에 핵으로부터 나와서 가공되어서 인트론 서열을 제거하게 되고, 결과적으로 엑손 서열만 포함하는 성숙 mRNA를 만들게 된다. 이러한 수송 및 트리밍 과정이 상기 성숙 mRNA 가닥을 최종 단백질 생산을 위한 추가적인 번역 기계에 연결시킨다. 전이유전자 cDNA 구조 속 인트론을 포함시키는 것은 상기 전이유전자 cDNA의 발현수준을 개선하는 것으로 보여져 왔다(Palmiter, R.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:478-482, 1988).
b. 완전 3’UTR를 포함하는 게놈 구조: 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 전이유전자 속 hGH 서열은 무손상 3’UTR을 포함하는데, 이것은 고도의 mRNA 안정성과 이에 따른 더 높은 수준의 전이유전자 발현을 부여한다.
c. 폴리 A (PA+) 구조를 포함하는 게놈 구조: 상기 hGH 서열은 상기 천연 3’ UTR에 내포된 그것의 본래의 PA+ 구조를 가지고 있다. 일반적으로 PA+ 신호는 바이러스 서열(SV40, RSV 등)에서 유래하고 연관되지 않은 3’UTR 말단에 부가되는 최소한의 구조이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 천연 PA+ 신호를 가지는 온전한 3’UTR 구조는 전체 hGH 유전자의 훨씬 넓은 게놈 맥락에서 보존된다.
인슐레이터 요소는 위치 독립적 발현을 생성하는 DNA 서열이다(Giraldo et al., Transgenic Research 12: 751-755, 2003). 인슐레이터 서열은 1980년대에 글로불린 좌위에서 설명되었고(Sun F.L. and Elgin, S.C., Cell 99;459-462, 1999) 선택된 조직에서 정확하고 반응성 형질전환 발현을 달성할 기회를 증대시켜서 바이오영상을 위한 모델 설계 목표를 지원하는 것으로 보고되었다(Pinkert, C. A. (ed.) 1994. Transgenic animal technology: A laboratory handbook. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Monastersky G. M. and Robl, J. M. (ed.) (1995) Strategies in transgenic animal science. ASM Press. Washington D.C). 인슐레이터는 DNA 요소로, 유전자 발현을 허용하는 개방된 염색질(chromatin) 도메인을 형성하고, 원거리의 사일렌서/인핸서 서열의 영향과 아세틸화 및 메틸화 현상들에 대해 장벽을 구성한다. 이것은 바이오영상에서 검출가능 수준으로 발현된 리포터 유전자를 가지는, 독립적인 형질전환 파운더(founder) 세포주의 개수를 상당히 증가시킨다. 인슐레이터 요소는 일시 형질감염 분석(transient transfection assay)에서 루시페라아제 발현 클론 개수를 40에서 70%로 증가시켜서, ERE-luci 전이유전자에서 루시페라아제 발현의 유도 능력을 개선시키는 것으로 알려져 왔다. (Ottobrini L., Mol Cell Endo 246, 69-75). 하지만, 인슐레이터를 전이유전자 리포터 발현에 적용하는 것을 전면 검토한 결과 실무 측면에서, 여전히 인슐레이터를 활용하는 것이 곤란하다는 결론에 도달하고 있다. 그것들의 작용 기작이 부분적으로만 알려져 있으며 그들의 효과가 완전하게 예상 가능하지 않다. 비-제한적인 인슐레이터 요소 예시가 표 3에 포함되어 있다.
상기 Cre-Luc 전이유전자에 대한 일 실시형태에서, 인슐레이터 요소의 함유는 바이오영상에 의해 검출된 바와 같이 기능성 리포터를 가진 세포주들을 형성시킬 빈도를 상당히 증가시켰다. CreLuc 형질전환 마우스 세포주에서 인슐레이터 요소가 루시페라아제 발현에 기여하는 것을 분석하기 위해서는, 하기 “실시예” 중 VI 부분을 참고한다.
본 발명의 일 실시형태는 리포터 요소 또는 유전자를 포함하는 전이유전자에 관한 것이다. 리포터 유전자에는 검출 가능한 유전자 산물을 발현시키는 임의의 유전자를 포함하는데, RNA 또는 단백질일 수도 있다. 많은 리포터 유전자가 당해 분야에 알려져 있는데, 베타-갈락토시다아제 및 알칼리성 포스파타아제를 포함하지만, 이들에만 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시형태에서, 상기 전이유전자는 생물발광 리포터 유전자를 포함한다. 많은 생물발광 리포터 유전자가 당해 분야에 알려져 있는데, 루시페라아제를 포함하지만, 이에만 제한되는 것은 아니다. 많은 루시페라아제의 원료가 있는데, 비-제한적인 예시로는 반딧불이 루시페라아제와 박테리아 루시페라아제가 있다. 본 발명의 일 실시형태는 임의의 공지된 생물발광 리포터, 예컨대, 루시페라아제를 활용할 수도 있다. 또 다른 비-제한적인 리포터 요소 예시가 표 5에 보여진다.
본 발명의 또 다른 실시형태들은 적합한 기질이 공급될 때, 상기 루시페라아제 효소의 변형된 형태들, 타 종들로부터의 루시페라아제 효소, 또는 동물 조직을 관통할 수 있는 광을 생산할 수 있는 기타 단백질, 또는 동물 조직을 관통할 수 있는 광을 방출할 수 있는 임의의 효소를 포함할 수 있다. 본 발명의 리포터 단백질은 신호의 감소가 방출 중인 광의 파장과, 상기 방출 중인 세포를 둘러싼 조직 특성에 따라 달라진다는 사실에 의해서만 제한된다. 일반적으로, 청녹색 광(400 590nm)은 심하게 약해지는 반면, 적색 내지 근적외 광(590 800nm)은 훨씬 덜 약화되는 실정이다. 대부분의 루시페라아제 종류는 청색 내지 황록색 파장에서 방출 피크를 가지는데, 상기 방출 스펙트럼이 넓어서, 조직 속으로 매우 깊게 관통하는 적색 파장에서(>600 nm) 상당한 방출이 있다. 마우스 등의 소형 설치류의 경우에, 이로 인해 동물 전체에 대해 전체적으로 신호 검출이 가능해진다.
생체 내 광 검출 한계는 생물발광 리포터 종류, 상기 동물의 주변 생리학 및 소스 깊이에 따라서 달라진다. 일반적으로, 동물 속 생물발광 세포들은 1 3cm 깊이에서 민감한 CCD 카메라로 관측 가능한데, 세포의 수와 위치에 따라 달라진다. 광자들이 조직을 통해 나아가면서 그들이 분산됨으로 인해 동물 표면 위에서 검출된 이미지의 공간 해상도를 제한한다. 일반적으로, 상기 표면 상의 점 크기 또는 해상도는 상기 표면 아래 소스의 깊이와 대략 동일하다. 물리학 기반 분산 모델을 이용해서, 밀리미터 수준에 이르는 공간 해상도 개선이 이루어질 수 있다. 냉각된 과학 등급 CCD 어레이를 사용해서, 이미지를 얻은 후에 CCD 픽셀 판독과 연관된 판독 노이즈에 의해서 신호 검출 한계를 결정하는데, 그것은 픽셀 당 소수의 광자의 순서에 따른다(Honigman et al., Mol. Ther. 4:239-249, 2001). 모발, 피부, 또는 어쩌면 동물 위의 오염물질들의 인광(phosphorescence)으로 인한 부수적인 배경 광이 있을 수도 있다. 일반적으로, 배경 광은 낮은 수준으로 나타나며, 깊은 저-수준 생물발광 소스 이미지에 대한 저하 효과(deleterious effect)만 가진다. 하지만, 배경 광은 적절한 광학 필터를 이용해서 제거될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태는 CCD 카메라, 예컨대 IVIS (Xenogen Corporation, 860 Atlantic Avenue, Alameda, Calif. 94501, USA)를 활용한다. 상기 IVIS.RTM. 영상 시스템에는 민감성 CCD 카메라, 입사광을 최소화하기 위한 어두운 영상 챔버, 및 결과를 정량하고 분석하기 위한 특화된 소프트웨어가 포함된다. IVIS는 제노겐 코포레이션(Xenogen Corporation)의 등록상표이다. 하지만, 어떠한 생물발광 영상 시스템이라도 본 발명에 적용할 수 있다.
실시간 생체 내 영상으로 인해 상기 생물발광 리포터 유전자를 비침습적으로 정량할 수 있으며, 즉, 동물을 안락사시킬 필요가 없으며, 또한 종단적 정량이 가능하다, 즉, 상기 측정이 지속된 시 구간 동안 연속하거나 반복될 수 있다. 실시간 생체 내 영상은 효능 때문에 더 많은 테스트 화합물이 시험되게끔 하는 기존 프로토콜보다 더 적은 테스트 동물과(예컨대, 동일한 동물이 특정된 시 구간에 걸쳐서 사용 가능하기 때문), 더 적은 시간을(예컨대, 더 적은 동물이 다루어질 필요가 있기 때문) 필요로 한다. 실시간 생체 내 영상은 많은 이유로 더 높은 데이터 내용과 더 높은 데이터 품질을 제공한다. 예를 들면, 동일한 동물로부터 시간 및 공간 데이터를 수집할 수 있고, 시간 소모적인 조직학적 평가를 필요로 하지 않고 데이터를 수집할 수 있다. 더 높은 데이터 품질은 통계 오류를 줄이고 테스트 화합물 평가 및 의사결정의 품질을 개선한다.
본 발명의 일 실시형태는 고속대량 스크리닝(HTS) 방법에 있어서의 용도이다. HTS는 질환 병리학의 생물 기작 또는 양상을 모형화하도록 설계된 분석들에서 수천 개의 개별 화학적 화합물들을 자동화된, 동시에 테스트하는 방법이다. 하나를 초과하는 화합물, 예컨대, 복수의 화합물이 동시에, 예컨대, 하나의 배취(batch)에서 테스트될 수 있다. 일 실시형태에서, 용어 HTS 스크리닝 방법은 하나의 화합물 또는 복수의 화합물이 판독 선택에 영향을 미칠 수 있는 능력을 테스트하는 분석방법을 의미한다.
액체 취급 시스템, 형광 판독기나 섬광 계수기 등 분석 장비 및 세포배양 및 시료 조작을 위한 로봇 공학기술이 당해 분야에 주지되어 있다. 기계 시스템, 예컨대, 로봇 팔 또는 “체리-피킹(cherry-picking)” 장치가 본 기술 전문가들에 의해 이용 가능하다. 상업적인 플레이트 판독기(plate reader)가 기존의 96-웰 또는 384-웰 플레이트를 분석하기 위해 이용 가능하다. 단일 시료, 복수 시료 또는 플레이트 시료 판독기를 이용해서 미리 정해진 웰을 분석하고 미가공 데이터(raw data) 보고서를 생성할 수 있다. 상기 미가공 데이터는 다양한 방식으로 전환되고 제시될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태는 세포, 조직편 및 기타 재료, 예컨대 배양 배지를 수용할 수 있는 수용용기 어레이를 포함한다. 수용용기 어레이는 본 발명의 범위 이내에서 세포나 조직편을 고정하기에 적합한 적어도 하나 또는 그 이상의 수용용기 유래의 임의의 개수의 수용용기일 수 있다. 예시에는 플라스크, 배양 접시, 튜브, 예컨대 1.5 ml 튜브, 12 웰 플레이트, 96 웰 플레이트, 384 웰 플레이트 및 대략 4000개 수용용기로 된 소형화된 미세적정 플레이트가 포함되지만, 이들에만 한정되는 것은 아니다(미국특허출원 20050255580). 수용용기 어레이는 보호용 커버링이 추가되는 것을 변경해서, 오염물 유입이나 내용물 증발로부터 보호될 수도 있다.
상기 수용용기의 또 다른 특성은 상기 수용용기가 분석을 가능하게 할 수도 있다는 것으며, 비-제한적인 예시로는 분광 분석, 섬광 계수 및 형광 측정가 있다. 하지만, 시료가 추가 분석을 위해서 변형 가능한 적절한 용기에 전달될 수 있는 경우에는, 이것은 본 발명의 범위 내에서 사용 가능한 수용용기에 대한 한계가 아니다. 비-제한적인 예시로는 상기 방법을 변형해서 그 방법이 이차 어레이를 제공하는 것을 더욱 포함하는 것으로, 여기서 세포를 용해하는 단계는 세포 파편(cell debris)으로부터 상청액을 분리시키는 것을 추가로 포함하고, 다음 단계는 상기 분리된 상청액 시료를 담지하는 상기 이차 수용용기 어레이 중에서 적어도 하나의 수용용기에 DNA 조각들을 삽입할 수 있는 검출 가능 화합물을 부가하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 추가적인 양상들과 세부사항들은 하기 실시예들로부터 분명해질 것이며, 그것들은 이해를 돕기 위한 것이며, 어떠한 식으로든지 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
동물이 연관된 모든 실험 작업은 연방 가이드라인에 따라서 수행되었으며, 프로토콜은 사전 검토되고 사노피-아벤티스 사이트 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)에서 승인되었다.
실시예
I. 멀티사이트 게이트웨이 프로 플러스
클로닝
시스템(
MultiSite
Gateway
Pro
Plus
Cloning
System
)용 벡터 골격(도 3)
목적 벡터인 pDest2XMARS를, 멀티사이트 게이트웨이 프로 플러스 클로닝 시스템(MultiSite Gateway Pro Plus Cloning System; Invitrogen Carlsbad, CA, cat #12537-100)에 사용하도록 특별히 설계하고 클로닝하였다. 벡터 내로 삽입된 모든 요소들을 PCR(polymerase chain reaction; 중합효소 연쇄 반응) 클로닝하거나, 합성에 의해 생성하였다. 모든 PCR 클로닝 단계에 있어서, PCR 수퍼믹스 하이 피델리티(PCR SuperMIx Hi Fidelity; Invitrogen, Carlsbad, CA, cat # 10790-020) 및 단편 특이적 프라이머를 사용하여 지정된 벡터로부터 단편들을 증폭시켰다. 그런 다음, PCR 산물을 TOPO 클로닝을 통해 pCR2.1 벡터 내로 서브클로닝(subcloned)하였다. TOPO 클로닝은, Taq와 Pfu 중합효소들 중 어느 하나에 의해 증폭된 DNA 단편이 DNA 리가아제에 대한 요구 없이도 특정 벡터 내로 클로닝되는 분자 생물학 기술이다.
우선, 인슐레이터 요소(insulator element)들을 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 벡터 pCpG-LacZ(InvivoGen San Diego, CA, cat #pcpg-lacz)로부터 클로닝하고, 서열을 확인한 후 pNEB193(New England Biolabs Ipswich, MA, cat#N3051S)의 제한 부위 내로 서브클로닝하였다. 상기 인슐레이터 요소들은 삽입 부위 의존 위치 효과(integration site dependant position effects)로 인해 전이유전자의 발현의 가변성을 감소시키기 위해 사용되었다.
상기 단편들을 클로닝하기 위해 사용된 PCR 프라이머는 다음과 같다:
a. 인간 IFN-β MAR 프라이머 서열(프라이머는 서브클로닝을 위한 EcoRV 부위를 갖는다)
서열번호 1, IFN 전방향 프라이머:
5’-GGGGGATATCAGTCAATATGTTCACCCCA-3’
서열번호 2, IFN 역방향 프라이머:
5’-GGGGGATATCCTACTGTTTTAATTAAGC-3’
b. 인간 β-글로빈 MAR 프라이머 서열
서열번호 3, β-글로빈 전방향 프라이머:
5’-AAGGATCCTTAATTAAAATTATCTCTAAGGC-3’
서열번호 4, β-글로빈 역방향 프라이머:
5’-GGATCCCTGCAGGAATTCCTTTTAAT-3’
β-글로빈 PCR 단편을 pCR2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#K2030-01)을 사용하여 TOPO 클로닝하였다. 서열을 확인한 후, 상기 단편을 BamHI로 절단한 다음 pNEB193(βgloMAR-pNEB193)의 BamH1 부위 내로 서브클로닝하였다. 또한, IFN-β PCR 단편을 pCR2.1로 TOPO 클로닝하고, 서열결정한 후, EcoRV로 절단하고 βgloMAR-pNEB193(2XMARS-pNEB193)의 HincII 부위 내로 서브클로닝하였다.
최종 게이트웨이 목적 벡터에 있어서, XbaI 말단 및 내부 EcoRV 부위를 포함하는 링커를 2XMARs-pNEB193의 XbaI 부위 내로 서브클로닝하였다. 그런 다음, 블런트 말단 게이트웨이 전환 카세트(blunt ended Gateway conversion cassette)인 RfA를 2XMARs-pNEB193(2XMARSpDest)의 EcoRV 부위 내로 삽입하였다. 최종 벡터인 2XMARSpDest는 전이유전자를 생성하기 위해 사용되는 최종 목적 벡터이었다.
서열번호 5
II
. 전이유전자 성분
A.
CRE
:
두 개의 다른 6개의 CRE 요소들을 전이유전자의 생성에 사용하였다. 첫 번째 요소는 미국 캘리포니아 멘로 파크(Menlo Park)에서 입수한 DNA2.0에서 합성에 의해 생성되는 합성 CRE 요소(“합성”으로 표기함)이다. 합성 서열은 4-단편 게이트웨이 클로닝을 위한 attL1 및 attR5 부위를 갖는다.
다른 벡터로부터 6개의 CRE를 완전하게 PCR 클로닝하기 위한 많은 시도가 있었지만, 이는 CRE의 중앙에서의 헤어핀 구조 때문에 가능하지 않았다. 그런 다음, 이러한 단편을 합성에 의해 클로닝하였다. 사용된 두 번째 6X CRE 요소는 클론텍(Clontech) 벡터(Mountainview, CA, cat#PT3336-5)로부터 CRE 요소를 PCR 클로닝하여 생성된 하이브리드 형태이다. 클론텍은 벡터 내에 2개의 CRE가 있다고 주장하였지만 서열 분석으로는 실제 3개가 존재하는 것으로 나타났다. 두 개의 다른 PCR 반응이 단편을 클로닝하는데 사용되었다. EcoR1 부위뿐만 아니라 게이트웨이 클로닝을 위한 Att 부위를, 상기 두 개의 단편이 서로 “부착”될 수 있도록 프라이머 내로 도입시킨 후, 인비트로겐 게이트웨이(Invitrogen Gateway) pDONR P1-P5r 벡터(Carlsbad, CA, cat #12537-100) 내로 재조합하였다.
1. 합성 CRE 요소
서열번호 6:
2. 하이브리드 CRE: 표준 클로닝인 PCR은 3개의 CRE를 포함하는 클론텍 pCreLuc 벡터로부터 CRE 요소를 증폭시키고, PCR 프라이머는 한 말단에서 EcoR1 제한 부위를 가지며(CRE3X-B, CRE3X-C), 다른 말단에서 게이트웨이 클로닝을 위한 att 부위로서, attB1과 attB5r 중 어느 하나를 갖는다(CRE3X-A, CRE3X-D). 그런 다음, 상기 두 개의 단편들을 결합시켜 6개의 CRE를 갖는 하나의 단편을 생성하였다. 상기 단편들을 게이트웨이 pDONR P1-P5r 벡터 내로 재조합하였다.
서열번호 7: CRE 전방향 프라이머 A
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGCACCAGACAGTGA-3’
서열번호 8: CRE 역방향 프라이머 B
5’-GGGAATTCGTTCTCCCATTGACGTCA-3’
서열번호 9: CRE 전방향 프라이머 C
5’-GGGAATTCGCACCAGACAGTGACGTC-3’
서열번호 10: CRE 역방향 프라이머 D
5’-GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGTTCTCCCATTGACGTCA-3’
서열번호 11: 하이브리드 CRE 서열:
GCTTAGCACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGCCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAGAACGAATTCGCACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGCCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAGAACA
B. 인간 성장 호르몬
폴리
A 꼬리:
인간 성장 호르몬 폴리 A 꼬리를 벡터 pOGH(Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano,CA, Cat # 40-2205)로부터 PCR 클로닝하였다. 프라이머 서열은, 게이트웨이 pDONR P3-P2 벡터 내로의 재조합을 위해 전방향 프라이머 상에 attB3 부위를 가지며 역방향 프라이머 상에 attB2 부위를 갖는다.
서열번호 12: hGH 전방향 프라이머:
5’-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGATCCCAAGGCCCAACTCC-3’
서열번호 13: hGH 역방향 프라이머
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACAACAGGCATCTACT-3’
C.
HSV
TK
최소 프로모터(
Minimal
Promoter
):
HSV TK 최소 프로모터를 소위 “661 CreLuc”로 명명되는 인 하우스 벡터(in house vector)로부터 PCR 클로닝하였다. 프라이머 서열은, 게이트웨이 pDONR P5-P4 벡터 내로의 재조합을 위해 전방향 프라이머 상에 attB5 부위를 가지며 역방향 프라이머 상에 attB4 부위를 갖는다.
서열번호 14: TK 전방향 프라이머
5’-GGGGACAACTTTGTATACAAAAGTTGTGGAACACGCAGATGCAGT-3’
서열번호 15: TK 역방향 프라이머
5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGTGGATCTGCGGCACGCT-3’
D. 루시페라아제
cDNA
:
루시페라아제 cDNA를 벡터 pGL4.10(Promega Madison, WI Cat #E6651)로부터 PCR 클로닝하였다. Luc 프라이머 서열은, 게이트웨이 pDONR P4r-P3r 벡터 내로의 재조합을 위해 전방향 프라이머 상에 attB4r 부위를 가지며 역방향 프라이머 상에 attB3r 부위를 갖는다.
서열번호 16: luci 전방향 프라이머
5’GGGGACAACTTTTCTATACAAAGTTGATGGAAGATGCCAAAAACA3’
서열번호 17: luci 역방향 프라이머
5’GGGGACAACTTTATTATACAAAGTTGTTTACACGGCGATCTTGCC3’
III
. 최종 벡터의
작제
pDONR 벡터 내의 전이유전자의 4개 성분인 CRE(합성 형태와 하이브리드 형태 중 하나), HSVTK 최소 프로모터, 루시페라아제 cDNA, 및 hGH 폴리 A 꼬리를 표준 인비트로겐 프로토콜에 따라 pDest2XMARs 목적 벡터로 재조합하였다. 그런 다음, 두 전이유전자를 서열결정하고 CHOK1 내로 형질감염(transfection)시켜 기능을 시험하였다. 전이유전자 둘 모두는 도 5에 도시된 바와 같이 시험관 내에서 기능적이었다. 도 5는 포스콜린(forskolin) 유도에 의한 CreLuc 벡터의 시험관 내 분석을 나타낸다.
IV
. 형질전환 마우스 생산
A. 전이유전자 제조:
전이유전자 작제물의 특성을 아가로스 겔 상에 분취량을 이동시켜 확인하고 확정하였다. 어떠한 분해의 기미도 관찰되지 않았다. 최종적으로, 진단용 XhoI 및 PvuII 및 PstI 제한 효소를 사용하는 제한 분석은 예상된 제한 프로파일을 산출하였다. 그런 다음, 상기 전이유전자 플라스미드를 Acc65I 및 PmeI로 절단하고 상기 전이유전자를 포함하는 단편들을 아가로스 겔 상에서 분해물을 이동시켜 벡터 골격으로부터 분리하였다. 그런 다음, 상기 전이유전자 단편들을 겔에서 절단해 내서 퀴아퀵 겔 추출 키트(Qiaquick gel extraction kit; Qiagen, Valencia, CA cat#28706)로 정제하고 수정된 난모세포 내로 주입하기 전에 희석하였다. 상기 분리된 전이유전자의 순도 및 농도를 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.
서열 번호: 18: CreLuc 합성 전이유전자(Acc65I/PmeI 분해, 5550bp)
서열번호 19: CreLuc 하이브리드 전이유전자 서열 (Acc65I/PmeI 분해, 5562bp)
B.
파운더
(
Founder
) 생산:
상기 전이유전자들을 FVB/Taconic 단일-세포 배아의 전핵 내로 각자 미세주입하였다. 형질전환(Tg) 동물을 생산하는 일반적인 전략은 잘 기술되어 있으며 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
PCR 유전자형 분석(genotyping) 전략을 사용하여, 형질전환 양성 파운더 마우스를 출생 후 즉시 꼬리 생검 및 유전자형을 위한 PCR을 통해 확인하였다. 상기 선택된 프라이머 쌍이 전이유전자 서열 내의 짧은 DNA 서열의 증폭을 가능하게 하여, 특정 405-bp PCR 산물을 산출하였다. PCR 반응 혼합물은 MgCl2 (Qiagen, Valencia, CA cat #201205), 0.2mM dNTP, 0.4μM 프라이머, 0.5 유닛의 Taq 중합효소가 구비된 1X 퀴아젠(Qiagen) PCR 완충용액이다. 사이클 조건은 다음과 같다: 94°C에서 1 사이클; 5분, 94°C에서 35 사이클; 45초/ 57°C; 45초/72°C; 1분, 72°C 1사이클; 5분.
유전자형 분석 프라이머는 다음과 같다:
서열번호 20: Luc2-전방향 프라이머:
5’-GAAGATGCCAAAAACATTAAGAAG-3’
서열번호 21: Luc2-역방향 프라이머:
5’-GATCTTTTGCAGCCCTTTCT -3’
합성 CreLuc 전이유전자의 경우, (181개 중에서) 39개의 전이유전자 양성 파운더가 생산되었으며, 하이브리드 CreLuc 전이유전자의 경우, (244개 중에서) 73개의 형질전환 유전자 양성 파운더가 생성되었다. 형질전환 마우스 세포주들은 CreLuc로 약기하였다.
V.
파운더
발현 분석:
도 5a는 일반 마우스에서 원형질 cAMP 수준에 대한 다양한 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase; PDE) 억제자들의 효과를 비교한 것이다(Cheng et al, JPET, 280(2):621-626, 1997로부터 재현됨). 4마리 동물 그룹에서 화합물 또는 비히클(VEH)을 마우스에 경구 투약하였다. 20분 후에, 혈액을 수집하여 cAMP측정을 위해 처리하였다. 이러한 공지된 실험에 근거하여, cAMP 수준을 증가시키는 CreLuc 파운더의 능력 및 유용성에 대한 CreLuc 파운더 스크리닝에서 포스콜린과 함께 일반적인 유도제로서 롤리프람(rolipram)이 선택되었다. 상기 두 화합물들이 함께 투약되었을 때의 추가 효과는 상기 동물들에서 루시페라아제 수준을 시험하였을 때 더 큰 유도 창(window of induction)을 제공한다.
도 5b는 포스콜린(F), 롤리프람(R) 또는 포스콜린 및 롤리프람의 조합(F/R)의 다양한 처리 이후의 야생형 마우스에서의 원형질 수준에 대한 cAMP 검정을 나타낸 것이다. 2개월령의 FVB/Tac 암컷에 다음 중 어느 하나에 따라 복막내 투약하였다: A 그룹: 비히클 대조군, 인산염 완충 염수(phosphate buffered saline; PBS) 중의 1% 디메틸 술폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO), B 그룹: 5mg/kg 포스콜린(Sigma, St Louis MO, cat#F6886), 및 C 그룹: 10mg/kg 롤리프람(Sigma St Louis, MO, cat# R6520), D 그룹: 5mg/kg 포스콜린과 조합된 10mg/kg 롤리프람, E 그룹: 5mg/kg 수용성 포스콜린(Calbiochem Gibbstown, NJ cat#344273), 및 F 그룹: 5mg/kg 수용성 포스콜린과 조합된 10mg/kg 롤리프람. G 그룹은 처리하지 않았다. 비히클 단독에 비해, 롤리프람 및/또는 포스콜린은 순환하는 cAMP 수준 증가에 있어서 통계학적으로 유의성을 나타냈다. 포스콜린 단독으로는 비히클 대조군에 비해 순환하는 cAMP를 유의하게 증가시키지 못한다. 수용성 포스콜린(H2OF) 및 롤리프람의 조합에서 cAMP 플라즈마 수준이 가장 크게 증가하였으며, 따라서 이러한 처리가 생체내에서 전이유전자의 발현을 위한 CreLuc 파운더를 스크리닝하기에 최적일 수 있음을 나타냈다.
10mg/kg 롤리프람(Sigma St Louis, MO, cat# R6520) 및 5mg/kg 수용성 포스콜린(Calbiochem Gibbstown, NJ cat#344273)의 조합을 마우스에 복막 내 투약하여 전이유전자 발현에 대해 모든 파운더들(표 5 내지 표 8에 나타낸 파운더들 및 도 6에 도시된 대표 파운더들)을 시험하였다. 4시간 후, Xenogen IVIS Lumina 시스템을 사용하여 마우스를 바이오영상화하였다. 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 250mg/kg 루시페린을 피하 주사하였다. 루시페린을 주사하고 8분 후, 마우스를 영상화하였다. 39개의 전이유전자 양성 합성 CreLuc 전이유전자 중에서, 34개, 즉 87%가 양성 발현하였다. 하이브리드 전이유전자에 있어서, 시험된 마우스에서 71마리 중 55마리, 즉 마우스의 78%가 양성 발현하였다. 임의의 조직의 루시페라아제 수준이 상기 시스템에서의 배경 수준 이상일 때 발현이 양성이 되는 것으로 간주되었다.
CreLuc 마우스의 다양한 독립 세포주의 바이오영상화에 의해 검정된 다양한 포스콜린 롤리프람 반응 프로파일을 도 6에 도시하였다. 유도되지 않은 상태에서, 본 발명자들은 세포주 90 및 219에서 도시된 바와 같이 검출가능한 기저 바이오영상화 신호를 관찰하거나, 세포주 44, 28 및 187에 도시된 바와 같이 어떠한 기저 활성도 관찰하지 못했다. 포스콜린 롤리프람 유도 후에 단일 또는 복수 조직에서 CreLuc 리포터 유도의 바이오영상화 패턴이 나타났으며 이는 각 독립적인 CreLuc 세포주에서 특유의 것이다. 다수의 CreLuc 세포주는 치료학적 관련 영역에서 검출가능한 루시페라아제 바이오영상을 나타내는 하나 이상의 조직을 갖는다.
기저 및 포스콜린 롤리프람 유도 둘 모두에 의한 파운더들에서의 CreLuc 발현의 바이오영상화 스크리닝 이후에 하나 이상의 조직(뇌에서 2x)에서 5회의 바이오영상화 유도의 필터 창을 충족하는 CreLuc 세포주를 조직 추출물 중의 유도된 루시페라아제 효소의 수준을 검정하여 좀더 자세히 분석하였다.
조직 발현 분석에 있어서, 동물들을 기준선 신호를 위해 처리하지 않은 채로 유지하거나 4시간 동안 유도하였다. 유도를 위해, 5mg/kg 포스콜린(Calbiochem, Gibbstown, NJ cat#344273) 및 10mg/kg 롤리프람(Sigma St Louis, MO, cat# R6520)의 조합을 둘베코 PBS(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#14040) 중의 1% DMSO(Sigma, St Louis, MO, cat#D2650)와 함께 동물에 복막 내 투약하였다. 4시간 후에, 상기 동물들을 CO2로 희생시키고 다양한 기관들을 제거하여 드라이 아이스 상에 냉동시켰다. 루시페라아제 검정에서, 루시페라아제 검정 시스템(Luciferase Assay System; Promega, Madison, WI, cat#E1500)을 사용하였다. 조직을 1ml의 세포 배양 용해 완충액(Promega, Madison, WI, cat#E1531) 중에서 균질화하고 얼음 상에서 5분간 인큐베이션한 후, 원심분리기에서 5분 동안 회전시켰다. 20μl의 상청액을 제조업자의 지시에 따라 검정에 사용하였다. 샘플의 단백질 농도를 DC 단백질 검정 키트(BioRad, Hercules, CA, cat#500-0111)로 측정하였다. 데이터는 표 5 내지 표 8에 나타냈으며 유도 배수(fold induction)(유도된 RLU/ug 단백질을 기저 RLU/ug 단백질로 나눈 것)로 나타냈다. RLU 유도는 유도된 조직 샘플의 RLU/ug 단백질이다.
각 세포주에서의 이러한 세부적인 수준의 CreLuc 발현은 표적 조직 내에서 가장 높은 발현 수준을 갖는 최적 세포주의 선별 및 특유의 단일 또는 다중 발현 패턴을 갖는 세포주의 선별을 가능하게 한다. 효소 검정은 또한 CreLuc 발현이 특정 조직에 확실하게 관련되어 있음을 확실하게 하였다. 일반적으로, 전이유전자에서 설계된 바와 같이, 본 발명자들은 상기 세포주들의 대부분에 걸쳐서 거의 모든 조직에서 루시페라아제의 발현을 관찰하였다. GPCR 리간드를 이용한 추가 참고 화합물 반응 프로파일링을 위해 핵심적인 약제학적 관련 표적 조직(뇌, 췌장, 폐, 비장)으로부터 상위 3 내지 5개의 세포주를 선별하였다.
VI
. 발현 수준에 대한
인슐레이터
요소의 효과 분석
표 9에서, 인슐레이터 요소들의 첨가로 인한 영향을 225개의 독립 형질전환 세포주들을 포함하여 11개의 상이한 전이유전자들에서 교차 비교하였다. 기능성 형질전환 세포주들의 생산은 전형적으로 10 내지 30%이었다(본 발명자들의 연구실로부터 입수된 사실에 근거한 데이터). 표 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 11개의 전이유전자들 중 10개의 전이유전자 및 190개의 세포주들이 hGH 미니유전자 또는 기능성 인핸서(enhancer)를 포함하기 때문에 이러한 범위(기능성 세포주의 평균 수가 37 또는 32.7%임) 중 최고치에서 발현 수준을 수득하였다. 중대하게, 인슐레이터 요소들의 포함이 이러한 발현 빈도를 두 배 이상으로 증가시켰으며, 112개 세포주에서 78%가 기능성 리포터(reporter)를 발현하였다. 상기 전이유전자들의 비교 및 상이점 둘 모두에 있어서 샘플 크기는 게놈에서의 전이유전자의 무작위 통합에 의해 일반적인 생물학적 변화를 극복하기에 충분히 크다.
형질전환 바이오영상화(bioimaging) 리포터 세포주를 생산하는 것은 낮은 빈도 및 높은 실패율의 과정이다. 다수의 독립 파운더 세포주들(50-100)은 리포터에 대한 요구되는 검출 수준을 갖는 세포주를 수득하고 약물 후보 스크리닝에 적합한 표적 조직의 광범위한 선별에서 리포터가 발현되게 하는 것이 필요하다. 전형적으로 5% 이하의 세포주들이 약물 스크리닝 적용에 적합하며, 따라서 상기 리포터를 포함하는 상기 전이유전자가 생산된 각 형질전환 세포주에서의 발현을 최대화 하기 위해 많은 요소들을 가지고 있어야 한다. 다른 발현 인핸서(hGH 미니유전자)에 결합된 인슐레이터 요소가, 전이유전자를 발현하는 대부분의 형질전환 세포주를 산출하는 것이 입증되었으며 약물 개발(특히, 수용체 결합에 대한 리간드에 따른 신호의 감소를 검출하기 위한 다양한 GPCR 신호전달 경로)에 적용될 수 있는 발현 패턴을 갖는 형질전환 세포주를 발견하기 위한 핵심이다.
재료의 기탁:
마우스 배아 섬유아세포의 제조: 12일령의 배아를 임신한 암컷으로부터 제거하였다. 상기 배아를 인산염 완충 염수(PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#14040)를 포함하는 10cm 디쉬 내에서 자궁 외부로 절개하였다. 그런 다음 상기 배아를 PBS를 포함하는 새로운 디쉬로 옮겼다. 상기 배아를 겸자로 풀어 헤친 후 심장 및 간을 제거하였다. 그런 다음 상기 조직 조각을 2 내지 3ml의 차가운 0.25% 트립신(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#25200) 내에서 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음 날, 대부분의 트립신을 흡입하여 제거하고 조직 펠렛을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 2 내지 3ml의 배지, 즉 DMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#11965), 5% 열 불활성화 FBS(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#16140), 1% 펜 스트렙(pen strep)(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat# 15140)을 첨가하고, 남아있는 조직 덩어리를 피펫팅(pipetting)하여 파쇄하였다. 그런 다음 상기 세포 현탁액을 하나의 T75 조직 배양 플라스크 상에 도말하였다. 세포를 3회 계대배양한 후 바이알 당 백만 내지 이백만개 세포로 1ml 바이알 내에 넣어, 냉동 배지, 즉 15% 열 불활성화 FBS(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#16140), 5% DMSO(Sigma, St Louis, MO, cat#D2650), DMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#11965)에서 냉동시켰다.
하기 재료들을 American Type Culture Collection(10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, USA (ATCC))에 기탁하였다:
기탁은 특허 절차 및 그에 따른 규정(부다페스트 조약)에 있어서 미생물의 기탁의 국제 규정에서 부다페스트 조약의 조항 하에서 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁의 생존 가능한 배양물의 유지를 보장한다. 기탁은 부다페스트 조약의 법규에 따라 ATCC에 의해 이용 가능할 것이고, 사노피-아벤티스 US Inc.와 ATCC 사이의 협정에 귀속될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 등록 시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원이 대중에 공개 시, 이들 중 빠른 날로부터 기탁된 배양물의 자손의 영구적이고 비제한적인 이용 가능성이 보장되며 여기에 권리를 부여할 특허 및 상표의 미국 특허상표국장에 의해 결정되는 것에 따라 자손의 이용 가능성을 보장한다.
본 출원의 양수인은, 적절한 조건 하에서 배양되었을 때 기탁된 물질의 배양물이 죽거나 손실되거나 파괴되는 경우, 통지에 따라 물질을 즉시 동일한 새로운 물질로 교체할 것임을 동의하였다. 기탁된 물질의 이용 가능성은, 어떠한 정부의 특허법에 따른 권한 하에서 등록된 권리의 위반시 본 발명을 실시하기 위한 허가로서 해석되는 것은 아니다.
VII
. 생체 내 및 생체 외 스크리닝 검정
도 7은 생체 내와 생체 외 중 어느 하나의 CreLuc 스크리닝 검정의 흐름도에 의해 대표되는 본 발명의 실시형태를 보여준다. 생체 내 검정에서, 동물에 루시페린을 단독 투약한 후 기저 신호를 얻기 위해 IVIS 바이오이미저(bioimager) 상에 바이오영상화하였다. 그런 다음 상기 동물들에 화합물을 투약한 후 루시페라아제 신호에 대한 화합물의 효과를 시험하기 위해 세트 시점(set timepoint)에서 다시 바이오영상화하였다. 기저 신호에 대한 유도된 신호의 유도 배수로서 데이터를 분석할 수 있다. 생체 외 검정에서, 화합물과 비히클 중 어느 하나를 마우스에 투약한 후 세트 시점에서, 조직을 수확하여 냉동시켰다. 그런 다음, 상기 조직을 균질화할 수 있으며 프로메가 루시페라아제 검정 시스템(Promega Luciferase assay system; Promega cat #E1500)과 같은 루시페라아제 검정을 상기 조직 추출물에 실시하고 검정을 탑카운트(Topcount)와 같은 발광측정기 상에서 판독하였다. 비히클 대 화합물 그룹을 비교하여 데이터를 1μg의 단백질 당 상대적 광 유닛으로서 분석할 수 있다.
본 발명의 추가 양상 및 상세한 설명은 하기 실시예로부터 명백해질 것이며, 이는 설명하기 위해 의도된 것이지, 임의 방식으로 본 발명의 범주를 제한하려는 의미가 아니다.
A. 전체 뇌 슬라이스 실험
전체 뇌 슬라이스를 CreLuc 마우스의 형광에 대한 화합물 효과를 보여주기 위해 사용하였다(도 8a, 8b). 일반적으로, CreLuc 마우스로부터 뇌를 채취한 후 마이크로톰(microtome) 상에서 슬라이스 형태로 잘라내거나 또는 다양한 아구(subregion)로 절개한 후 마이크로톰 상에서 슬라이스할 수 있다. 그런 다음 상기 슬라이스들을 포스콜린 및 롤리프람, 또는 GPCR 특이적 화합물과 같은 다양한 화합물들과 함께 인큐베이션할 수 있다. 그런 다음 루시페라아제 수준을 IVIS 바이오이미저, 또는 캐러셀(carousel)이 구비된 광전자 증배관(photomultiplier)으로 측정하여 정량적 시간별(timecourse) 측정을 실시하였다.
CreLuc 마우스(세포주 187)의 해마 영역으로부터의 뇌 슬라이스를 1uM 이소프로테레놀(Sigma, cat#5627)과 함께 2일 동안 인큐베이션하였다. 이소프로테레놀(Isoproterenol; ISO)은 cAMP 경로(경로 도식에 대한 도 1 참조)를 활성화하는 Gs 효능제(agonist)이며 CreLuc 마우스 내에서 루시페라아제 발현 수준을 유도한다(도 8a, 하단 패널). 그러므로, Gi 효능제와 같은 GPCR 특이적 화합물을 스크리닝하는 것을 허용하는 루시페라아제 신호 창을 증가시키는데 이소프로테레놀을 사용하였다. AMN082(AMN, Tocris Bioscience, Cat. No. 2385)는 mGluR7 효능제이고 mGluR7은 Gi에 결합하는 수용체이다. 뇌 슬라이스를 1uM AMN082와 조합된 1uM ISO로 처리하였을 때, 루시페라아제 신호가 ISO 단독 처리에 비해 감소하였다.
화합물 활성 또한 활성 뇌 슬라이스에서 시간에 따라 정량화할 수 있으며, 루시페라아제 발현은 바이오이미저로 가시화할 수 있다. 도 8b에서, CreLuc 마우스(세포주 44)로부터의 뇌 슬라이스는 포스콜린에 반응하였다. 포스콜린은 cAMP의 일반적 활성화제이다. 뇌 슬라이스를 50uM 포스콜린으로 처리하면(화살표는 포스콜린이 슬라이스에 첨가된 시간을 표시한 것임) 비히클에 비해 시간 의존적 방식으로 유도를 야기하였다.
B. 시험관 내 세포 배양 실험
1. 일차 대뇌피질 뉴런
CreLuc 모델로부터 일차 신경 세포의 분리 및 화합물 처리에 대한 일반적인 작업흐름도를 도 9에 도시한다. 대뇌피질 또는 다른 뇌 아구를 배아, 일반적으로 17일 또는 18일령의 배아(E) 또는 E14 정도의 초기 배아로부터 제거한다. 그런 다음 각각의 뉴런을 분리하여 96 웰 검정 플레이트 상에 도말하였다. 검정을 3회 또는 4회 반복 실행하였다. 상기 검정을 표적 GPCR의 발현 수준에 따라 배양물에서 3일로부터 7일 또는 10일까지 실시하였다. 그런 다음 화합물들을 세트 시점에서 플레이트에 첨가하고, 브라이트 글로(Bright Glo; Promega, Cat # E2610)를 플레이트에 첨가한 후 검정을 탑카운트 또는 다른 발광측정기에서 실시하였다.
a) β 아드레날린 수용체(
AD
βR) 및
D1
도파민 수용체(
DRD1
)를 통한
Gs
조절
CreLuc 마우스로부터의 일차 세포 배양물을 Gs 결합 수용체를 조절할 수 있는 화합물들을 스크리닝하기 위해 사용할 수 있다. 뉴런을 세포주 187 E18 배아의 피질로부터 분리하였다. 세포주 187은 전체 조직 루시페라아제 검정에 의해 뇌 및 척수 둘 모두에서 유도성 수준의 루시페라아제를 가짐을 보였다(하기 기재 참조; 도 24). 상기 검정을 3일째에 배양물에서 3회 반복 실시하였다. 포스콜린을 5μM으로 사용하였고, 롤리프람은 10μM으로 사용하였으며 Gs 효능제인 ADβR-이소프로테레놀과 도파민-SKF82958(MFG, Cat # C130)은 10μM으로 사용하였다. 4시간의 시점에 브라이트 글로를 첨가하고 탑카운트에서 검정을 실시하였다. 포스콜린은 cAMP의 일반적 활성화제이다. 롤리프람은 cAMP를 활성화시키지 않지만, 대신, 롤리프람은 cAMP의 분해를 방지하여 cAMP 수준을 안정화시킨다. 포스콜린 및 롤리프람은 협력해서 작용하여 루시페라아제 발현을 증가시킨다. 100배 이상의 유도가 포스콜린 및 롤리프람의 조합에서 관찰되었다. DMSO 대조군에 비해 증가된 luci 수준이 ADβR 효능제 이소프로테레놀(11배)에서 보여졌다. D1 DR 효능제인 SKF82958은 루시페라아제 수준의 유의한 증가를 나타내지 못한 반면, 롤리프람 단독으로 투여했을 때에 비해 SKF82958을 롤리프람과 조합하여 투여하였을 때 2배의 유도가 관찰되었다. 그러므로, 세포주 187은 화합물이 Gs 결합 수용체를 조절할 수 있는지를 결정하기 위한 화합물을 스크리닝하기 위한 유용한 모델이다.
b)
프로키네티신
2 수용체(
Prokineticin
2
Receptor
;
PROK2R
)를 통한
Gq
조절
CreLuc 마우스로부터의 일차 세포 배양물을 Gs 결합 수용체를 조절할 수 있는 화합물을 스크리닝하기 위해 사용하였다. PROK2R은 Gq 결합형이므로, PROK2R에 대한 효능제인 프로키네티신 2(PROK2)를 CreLuc 마우스가 Gq 조절에 반응할 것인지 여부를 확인하기 위해 사용하였다. Gq는 cAMP를 우회하지만 CREB를 활성화하기 위한 PLC 경로를 사용한다(도 1의 경로 도식 참조). 일차 피질 뉴런을 E18에 세포주 187(뇌 및 척수에서 유도성 루시페라아제를 갖는 것으로 나타남: 하기 기재 및 도 24 참조)로부터 채취하였다. 검정을 4시간 또는 8시간 동안 배양물에서 3일째에 실시하였다. PROK2 펩타이드(Peprotech, Cat#100-46)를 수용액으로서 1nM 및 100nM의 양으로 첨가하였다. 브라이트 글로를 루시페라아제 신호를 위해 사용하고, 검정을 탑카운트 발광측정기에서 실시하였다. 두 시점 모두에서 배지 단독 대조군에 비해 루시페라아제 수준에서의 매우 유의한 증가가 PROK2 농도 둘 모두에서 관찰되었다. 그러므로, CreLuc 마우스는 Gq 결합 수용체를 조절하는 화합물들을 스크리닝하는데 사용할 수 있다.
다양한 CreLuc 세포주로부터의 일차 피질 뉴런에서 루시페라아제 발현에 대한 PROK2 펩타이드의 효과를 시험하였다. 일차 피질 뉴런을 E18에 4개의 다른 CreLuc 세포주로부터 채취하였다. 세포주들은 전체 뇌 추출물에서 유도성 루시페라아제 수준을 결정하는 초기 실험을 근거로 선별하였다(데이터는 나타내지 않음). 검정을 4시간 및 24시간의 두 시점에서 1nM과 100nM PROK2 펩타이드 중 하나를 갖는 배양물에서 3일째에 3회 반복하여 실시하였다. 브라이트 글로를 검정을 위해 사용하였으며 탑카운트에서 판독하였다. 통계적으로 루시페라아제 수준에서의 유의한 증가가 세포주 219 및 175에서의 두 농도 모두 및 두 시점 모두에서 관찰되었다. 모든 세포주들이 PROK2 리간드에 어느 정도까지 반응하였지만, 루시페라아제 발현 수준에서의 차이는 전이유전자 통합에서의 차이에서 기인할 수 있다.
c)
mGluR7
수용체를 통한
Gi
조절
CreLuc 마우스로부터의 일차 세포 배양물을 Gi 결합 수용체를 조절할 수 있는 화합물들을 스크리닝하기 위해 사용할 수 있다. 도 13a는 일차 피질 뉴런들에서 루시페라아제 발현에 대한 mGluR7 효능제 AMN082의 효과를 나타낸다. 피질 뉴런을 E18 배아(세포주 187)로부터 채취하였다. 검정을 배양물에서 3일째에 실시하였다. Gi 활성을 검출하기 위해 사용될 더 큰 신호 창을 부여하기 위해 10μM의 포스콜린을 사용하였다. 상기 mGluR7 효능제 AMN082를 포스콜린과 조합하여 1nM, 10nM, 100nM 및 1μM의 양으로 사용하였다. 검정을 4시간 및 8시간에서 브라이트 글로(Promega)와 함께 탑카운드에서 판독하였다. 포스콜린 단독에 비해, 루시페라아제 수준에서의 유의한 감소가 두 시점에서의 100nM 및 1μM AMN082에서 관찰되었다. CreLuc 마우스는 Gq 결합 수용체를 조절하는 화합물들을 스크리닝하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 어떠한 화합물이 Gi 조절 능력을 나타내는지를 결정하기 위해 내부 대조군으로서 AMN082를 사용하여 일차 피질 뉴런 배양물에서 “A”, “B” 및 “C”라고 표시된 “미지의” 화합물을 스크리닝하였다(도 13b). 화합물 A는 EC50 = 1.735e-07을 갖는 알려진 mGluR7 효능제 AMN082에 비해 EC50 = 1.529e-06 계산치를 갖는 활성 화합물로 간주된 반면 화합물 B는 비-특이적 화합물로 간주될 수 있으며 화합물 C는 불활성이다.
CreLuc 마우스로부터의 일차 세포 배양물을 사용하여 Gi 결합 수용체를 조절하는 능력에 대한 화합물의 스크리닝을 상기 설명한 바와 같이 포스콜린과 같은 cAMP 자극제의 존재 하에서 실시할 수 있다. 그러나, 신호 창을 좀더 넓게 증가시키기 위해, 롤리프람(cAMP의 분해를 방지함)을 포스콜린과 조합하여 사용하였다. 일차 피질 뉴런을 유도성 뇌 및 척수 발현을 갖는 것으로 이미 측정된 세포주 187로부터의 E18 배아에서 분리하였다. 7일에 배양물에서 6시간 동안 검정을 3회 반복하여 실시하였다. AMN082에 있어서, 10μM에서 1nM까지의 용량 곡선은 50μM 포스콜린 및 10μM 롤리프람과 조합하여 진행되었다. 검정을 브라이트 글로 기질(Promega)을 갖는 탑카운트 발광측정기에서 판독하였다. 루시페라아제 수준에서 p<0.0005의 통계학적으로 유의한 감소(포스콜린 및 롤리프람 대조군에 비해 59-61%)가 1μM, 100nM 및 1nM에서 보여졌다.
CB1 효능제인 CP 55,940에 의한 다른 CreLuc 세포주로부터의 일차 피질 뉴런에서의 루시페라아제 발현의 Gi 조절을 포스콜린 및 롤리프람의 존재 하에서 실행하였다(도 15). 일차 피질 뉴런을 E18에서 세포주 69, 187, 175 및 219로부터 채취하였다. 사용된 모든 세포주들은 전체 뇌 조직 추출물에서 유도성 루시페라아제 발현 수준을 갖는 것으로 이미 측정된 것이다(데이터는 나타내지 않음). 3일째에 배양액에서 검정을 실시하였다. 10μM의 상기 CB1 효능제, 5μM의 포스콜린 및 10μM의 롤리프람을 사용하였다. 4시간 및 24시간의 두 시점에서 실시하였다. 그런 다음, 브라이트 글로 루시페라아제 검정 기질을 첨가하고 탑카운트 발광측정기에서 검정을 판독하였다. 검정은 3회 반복하여 실시하였다. 나타낸 데이터는 3회 반복 실시한 값의 평균치이다. 데이터는 초당 개수(counts per second; cps)로 나타낸다. 루시페라아제에서의 감소된 신호가 CB1 효능제의 첨가 시점 둘 모두에서 4개 세포주 모두에서 관찰되었다. 반응 수준에서의 약간의 차이는 전이유전자 통합에 의한 것일 수 있으나, 모든 세포주들이 Gi 조절에 반응하였으며 Gi 활성에 대한 화합물의 스크리닝으로 수정할 수 있을 것이다.
CB1 효능제인 CP 55,940에 의한 CreLuc 마우스로부터 일차 피질 뉴런에서의 루시페라아제의 Gi 조절은 용량-의존적 방식이었다(도 15b). 피질 뉴런을 E18 배아로부터 분리하였다. 검정을 배양물에서 3일째에 실시하였다. 10μM의 포스콜린 및 롤리프람을 사용하였다. 효능제를 10μM, 1 μM 및 100nM의 농도로 첨가하였다. 검정을 8시간의 시점에 브라이트 글로(Promega)를 갖는 탑카운트에서 판독하였다. 루시페라아제 수준의 유의한 감소(포스콜린 및 롤리프람 단독에 비해 포스콜린 및 롤리프람과 조합된 효능제)가 3개 농도 모두에서 관찰되었다.
2. 일차 선조(
striatal
) 뉴런
CreLuc 마우스로부터 유래된 모든 세포 배양물을 GPCR을 조절하는 능력에 대한 화합물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있다. 루시페라아제 발현이 포스콜린 및 롤리프람, 및 DRD1 및 ADβR에 대한 Gs 효능제에 의해 CreLuc 선조 뉴런에서 유도되었다(도 16). 선조 뉴런들을 E14 배아(세포주 187)로부터 분리하였다. 4일째에 배양물에서 검정을 실시하였다. 5μM의 포스콜린 및 10μM의 롤리프람을 사용하였다. Gs 효능제들(이소프로테레놀은 ADRβ의 효능제고, 도파민 및 SKF82958은 D1DR의 효능제임)을 10μM, 3μM 및 1μM으로 사용하였다. 5시간째에 탑카운트 발광측정기 및 브라이트 글로 루시페라아제 시약(Promega)으로 검정을 판독하였다. 28배의 매우 유의한 증가가 포스콜린 및 롤리프람 조합을 처리한 세포에서 관찰되었다. 10μM 도파민에서도, 2.7 배의 유의한 증가가 관찰되었으며, 3개 농도의 이소프로테레놀 모두에서도 관찰되었다. 그러므로, 형질전환 유전자는 피질 뉴런뿐만 아니라 선조 뉴런에서도 기능성을 나타낸다(도 10 참조).
3. 전체
비장세포
(
Splenocytes
)
CreLuc 마우스(세포주 64)로부터 분리된 전체 비장세포 프렙(prep)을 루시페라아제 발현에 있어서 Gs 효능제뿐만 아니라 포스콜린 및 롤리프람과 같은 일반 cAMP 유도제의 효과를 확인하기 위해 사용하였다(도 16). 비장을 1X HBSS(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#14025) 내에서 동물로부터 채취하였다. 그런 다음 5ml의 D-PBS(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#14190) 내에서 5ml 주사기의 끝을 사용하여 비장 캡슐을 기계적으로 파괴하여 세포를 분리하였다. 그런 다음, 상기 세포 현탁액을 70um 여과기를 통해 50ml 원뿔형 튜브로 통과시켰다. 그런 다음, 상기 세포를 800rpm에서 회전시킨 후, 재현탁시키고 5ml의 1X Pharm Lyse 용액(BD BioSciences, cat#555899) 중에서 실온에서 6분간 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 RPMI 1640(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#11875), 10% FCS(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#16000), 1% pen/strep(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#15070) 및 0.1% β-머캅토에탄올(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat#21985)로 구성된 28ml의 배지를 첨가하여 세척하였다. 세포를 2x106/ml로 희석하고, 100ul의 세포를 96 웰 백색 불투명 플레이트(96 well white opaque plate)의 웰마다 도말하였다. 세포의 절반을 항-CD3 항체(BD Pharmingen, cat#553058)로 24시간 동안 자극하였고, 나머지 절반은 처리하지 않았다. 24 시간째에, 화합물들을 추가 4시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 일반적인 유도제는 롤리프람(Sigma R6520) 및 포스콜린(Sigma F6886)을 포함한다. 사용된 Gs 효능제는 다음과 같다: EX00000173A(173A; 인 하우스 합성)은 Gs 결합된 프로스타글란딘(prostaglandin) E2(EP2) 수용체의 효능제이다; BW245C(Sigma B9305)는 Gs 결합된 프로스타글란딘 D2 수용체 1(DP1)의 효능제이고 이소프로테레놀(Sigma I5627)은 Gs 결합된 β-아드레날린 수용체(ADβR)의 효능제이다. 검정은 3회 반복하여 실시하였다. 4시간 후에, 100μl의 브라이트 글로(Promega, Madison, WI, cat#E2610)를 첨가하고 검정을 탑카운트 발광측정기에서 판독하였다. DMSO에 비해 14배의 증가가 롤리프람 및 포스콜린의 존재하에서 CD3 자극된 세포에서 관찰되었다. DMSO 단독 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가(t-테스트에 의함) 역시 Gs 효능제 3개 모두에서 관찰되었다. 이 실험은 전이유전자가 전체 비장세포 개체군에서 기능성이 있음을 나타낸다. 상기 실험에서 사용된 제제는 세포의 혼합된 개체군인 전체 비장세포 제제였다. 하기 기술된 실험들은 T 세포 및 B 세포와 같은 하위개체군에서의 루시페라아제 발현 수준을 확인하기 위한 것이다.
4. 분리된 T 세포
CreLuc 마우스의 5개의 다른 아세포주(subline)로부터 분리된 T 세포에서 롤리프람 및 포스콜린에 의한 일반 cAMP 활성화 효과를 연구하였다(도 18). 전체 비장세포 개체군을 상기 기재한 바와 같이 기계적으로 파괴하여 준비하였다. 그런 다음 CD4+ 세포를 양성 선별 컬럼(Positive Selection Column; Miltenyi Biotec cat#130-049-201)이 구비된 MACS 자성 분리(MACS Magnetic Separation)를 사용하여 분리하였다. 그런 다음 웰 당 1.5x105의 세포를 96 웰 백색 불투명 플레이트에 도말한 후 항 CD3 항체(BD Pharmingen cat#553058)로 자극하였다. 18 시간 후에, 10μM 롤리프람(Sigma R6520) 및 5μM 포스콜린(Sigma F6886)을 추가 4시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 브라이트 글로(Promega, Madison, WI, cat#E2610)를 첨가하고 검정을 탑카운트에서 판독하였다. 데이터를 발광(초당 개수) 및 배지 단독 대조군에 대한 증가 배수로서 나타냈다. 루시페라아제의 발현에서의 증가가, CreLuc 마우스에서 일반 조절제에 의해 cAMP 경로가 활성화됨을 입증하는 가장 높은 수준의 유도를 나타내는 세포주 64와 함께, 처리된 모든 세포주들에서 관찰되었다.
CreLuc 마우스(세포주 64)로부터 분리된 항 CD3 자극된 CD4+ T 세포에서의 루시페라아제 수준에 대한 다른 Gs 효능제의 효과를 연구하였다(도 19). 전체 비장세포 개체군을 기계적 파괴에 의해 준비하였다. 그런 다음 CD4+ 세포를 양성 선별(Positive Selection; Miltenyi Biotec cat#130-049-201)이 구비된 MACS 자성 분리(MACS Magnetic Separation)를 사용하여 분리하였다. 그런 다음 웰 당 1.5x105의 세포를 96 웰 백색 불투명 플레이트에 도말한 후 항 CD3 항체(BD Pharmingen cat#553058)로 자극하였다. 24 시간 후, 추가 4시간 동안 화합물들을 첨가하였다. DP(BW245C), EP2(EX00000173A) 및 ADβR(이소프로테레놀)에 대한 Gs 효능제들은 모두 10μM로 사용되었다. 5μM의 포스콜린 및 10μM의 롤리프람을 사용하였다. 브라이트 글로(Promega, Madison, WI, cat#E2610)를 첨가하고 검정을 탑카운트에서 판독하였다. 25배의 증가가 포스콜린 및 롤리프람으로 처리한 세포들에서 관찰되었다. 세 개의 Gs 효능제 모두에서 매우 유의한 증가가 관찰되었고, 즉, BW245C에서는 3배, 173A에서는 2배, 및 이소프로테레놀에서는 5배로 관찰되었다. 상기 전이유전자가 cAMP 경로의 일반적 조절제뿐만 아니라 특이적 Gs 효능제에도 반응하였다.
5. 분리된 B 세포
CreLuc 마우스의 2개의 다른 아세포주로부터 분리된 B 세포에서의 롤리프람 및 포스콜린에 의한 일반 cAMP 활성화의 효과를 시험하였다(도 20). 전체 비장세포 개체군을 상기 기술한 바와 같이 기계적으로 파괴하여 준비하였다. 그런 다음 B220+ 세포를 양성 선별 컬럼(Miltenyi Biotec, cat# 130-049-501)이 구비된 MACS 자성 분리를 사용하여 분리하였다. 그런 다음, 상기 세포를 96 웰 백색 불투명 플레이트의 웰 당 2.0x105로 도말한 후 10ng/ml의 리포폴리사카라이드(LPS; Sigma L-2630)로 자극하였다. 18시간 후, 10μM 롤리프람(Sigma R6520) 및 5μM 포스콜린(Sigma F6886)을 추가 4시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 브라이트 글로(Promega, Madison, WI, cat#E2610)를 첨가하고 검정을 탑카운트에서 판독하였다. 데이터를 발광(초당 개수), 및 배지 단독 대조군에 대한 증가 배수로서 나타냈다. 루시페라아제 발현에서의 증가가 세포주 64에서는 관찰되었지만 세포주 229에서는 관찰되지 않았다.
6. 미세아교세포(
Microglia
)
일반 cAMP 활성화제인 포스콜린 및 롤리프람 및 DP 수용체에 대한 효능제인 BW245C에 의한 CreLuc 마우스로부터 분리된 미세아교세포에서의 루시페라아제 발현의 유도를 시험하였다(도 22). 일차 미세아교세포를 DMEM(GIBCO Cat# 11995), 10% FBS(GIBCO Cat# 16140) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 100X(GIBCO Cat# 15140)으로 구성된 배지 내에서 P2 마우스(세포주 64)의 피질로부터 분리하였다. 상기 세포들을 폴리-D-라이신-코팅 플레이트 상의 96 웰 포맷에 도말하였다. 세포를 처리하지 않고 두거나 100ng/ml LPS로 2시간 동안 자극하였다. 그런 다음 브라이트 글로 검정을 실시하기 전에 화합물들을 추가 4시간 동안 첨가하였다. 사용된 상기 화합물들은 5μM 포스콜린, 10μM 롤리프람 또는 이들 둘의 조합, 또는 DP1 수용체에 대한 Gs 효능제로서 10μM BW245C를 사용하였다. 비자극 조건에서, 미세아교세포는 일반 cAMP 조절제 및 DP 수용체에 대한 특이적 Gs 효능제에 비반응성을 나타냈다. 그러나, 미세아교세포를 LPS로 자극하였을 때, 세포는 포스콜린 및 BW245C에 반응성을 나타냈다.
7. 마우스 배아 섬유아세포
마우스 배아 섬유아세포에서의 루시페라아제 발현에 대한 포스콜린, 롤리프람 및 이소프로테레놀의 효과를 조사하였다(도 33). 마우스 배아 섬유아세포를 6개의 독립적 CreLuc 세포주로부터의 E12 배아로부터 배양하였다. 세포들을 웰 당 20,000개 세포로 도말하였다. 시험된 화합물들은 10μM 포스콜린, 5μM 롤리프람 및 10μM 이소프로테레놀(ADβR 효능제)을 포함한다. 포스콜린 및 롤리프람의 조합에 대한 반응에서 유의한 증가가 모든 세포주에서 관찰되었다. 이소프로테레놀에 대한 반응에서도 세포주들 중 3개에서 유의한 증가가 관찰되었다.
7. 심근세포(
Cardiomyocytes
)
심근세포에서의 루시페라아제 수준에 대한 포스콜린 및 롤리프람 및 이소프로테레놀의 효과를 연구하였다(도 35). 심근세포를 세포주 229로부터의 P3 새끼(pup)들로부터 분리하였다. 상기 세포들을 96 웰 플레이트에서 배양하였다. 시험된 화합물들은 10μM 포스콜린, 5μM 롤리프람 및 10μM 이소프로테레놀(ADβR 효능제)을 포함한다. 루시페라아제 수준의 유의한 증가가 롤리프람 및 포스콜린의 조합(25배)에서 관찰되었으며 효능제인 이소프로테레놀(2배)에서도 유의한 증가가 관찰되었다.
B. 생체 내 및 생체 외 실험
1. 일반
cAMP
조절제의 효과
루시페라아제 발현의 유도에 대한 포스콜린 및 롤리프람의 척수강 내 주입의 효과를 세포주 187 CreLuc 마우스의 뇌 및 척수에서 연구하였다(도 23). 선별된 마우스의 세포주는 뇌 및 척수 둘 모두에서 전이유전자의 발현을 나타냄을 이미 측정한 것이다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 검정을 위해 선별된 마우스의 세포주(세포주187)는 뇌 및 척수 둘 모두에서 루시페라아제의 유도성 수준을 갖는다. 3개월령의 수컷 마우스들을 그룹 당 N=3-4마리의 4개의 처리 그룹으로 분류하였다. A 그룹: DMSO 대조군, B 그룹: 1μg 포스콜린/10μg 롤리프람, C 그룹: 10μg 포스콜린/10μg 롤리프람, D 그룹: 40μg 포스콜린/10μg 롤리프람. 상기 동물들에 척수강 내 주입을 통해 요추 부위에 마우스 당 5μ 부피로 투여하였다. 투약 후 4시간 후에 상기 동물들을 영상화하였다. 척수 및 뇌 둘 모두에 대한 데이터는 cm2당 초당 광자 개수인 평균 피크 발광으로서 나타낸다. 척수에서 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었으며, 뇌에서의 루시페라아제 신호의 유의한 증가는 가장 높은 농도의 포스콜린에서만 관찰되었다. cAMP의 일반 조절제를 척수 내로 주입하였을 때, 뇌에서 관찰되는 반응이 보다 적으면서도 척수에서의 전이유전자의 발현이 국부적으로 증가하였다.
2.
Gs
효능제의 효과
CreLuc 마우스의 뇌 및 척수에서의 루시페라아제 발현에 대한 EP2 효능제 EX00000173A의 효과를 연구하였다(도 24). 세포주 187로부터, 5개월령의 5마리의 수컷 마우스들에 비히클(5% DMSO, 0.05% tween 80, PBS) 또는 10 mg/kg EX00000173A(하우스 합성) 중 하나를 i.p. 주입하였다. 투약 후 4시간째에 동물들을 바이오영상화하였다. 뇌 및 척수 둘 모두에 대하여 cm2당 초당 광자 개수로서 5마리 마우스의 평균을 데이터로 나타낸다. 통계학적으로 유의한 증가가 효능제 처리된 뇌 및 척수 둘 모두에서 나타낸다. 따라서, 복막내 투여된 Gs 효능제는 전이유전자를 활성화시켰다.
또한, CreLuc 마우스에서의 루시페라아제 발현에 대한 EP2 효능제 EX00000173A의 효과는 용량-반응성이었다(도 25). 세포주 187이 뇌 및 척수 둘 모두에서 높은 유도성 발현을 나타내기 때문에 이 세포주를 선별하였다. 검정을 5마리로 이루어진 6주령 마우스의 5개 그룹으로 구성한다. 마우스에 비히클 대조군(D-PBS; 둘베코 인산염 완충 염수, Invitrogen, cat#14040) 또는 1.5nmol, 5nmol, 15nmol 및 50nmol의 다양한 용량의 EP2 효능제 EX0000173A(인 하우스 합성) 중 어느 하나를 투약하였다. 마우스에 척수강내 주입(마우스 당 5μl)으로 투약하고 4시간 후 IVIS 바이오이미저로 바이오영상화하였다. 뇌 및 척수 둘 모두에 대한 데이터를 평균 피크 발광인 cm2당 초당 광자 개수로서 상기 5마리 마우스의 평균으로 나타낸다. 효능제 처리에서 통계학적으로 유의한(t-테스트) 증가가 척수에서의 3가지 농도에서 관찰되었으나 뇌에서는 관찰되지 않았다. 뇌에서의 증가(유의성 없음)는 척수강 내 주입으로 예상되는 바와 같이 가장 높은 농도에서만 관찰되었다.
도 26은 CRE-Luc 마우스에서 아드레날린 수용체 베타3(Adrb3) 효능제 CL316,243(1 mg/kg, ip)에 의해 다른 조직에서의 루시페라아제의 유도를 나타낸다. 상기 루시페라아제 검정은 조직 균질액 내에서 실행하였다. 스크리닝된 12개의 독립적 형질전환 세포주 중에서, 7개의 세포주가 지방 조직 및 폐에서 10배 이상의 유도를 나타냈다. 4개의 세포주는 바이이영상화를 통해 가시적인 유도를 나타냈다(도 27a 및 27b 참조).
3.
Gs
효능제
AVE0010
의 특이적 효과
CRE-Luc 마우스의 3개의 독립적 세포주에서 연구된 글루카곤-유사 펩타이드 1 수용체(glucagon-like peptide 1 receptor; GLP-1R) 효능제인 AVE0010에 의한 루시페라아제 리포터의 유도에 의해 예시된 바와 같이 전이유전자 활성화는 조직 특이적 수용체 활성화와 공동-국소화(co-localizing)된다(도 28). GLP-1R은 Gs 결합형이다. 기저 이미지는 1일째에 획득하였다. 2일째에는, AVE0010(0.1mg/kg, 피하 투여)로 마우스를 처리하고 4 시간 후 영상화하였다. 기저에 비해 증가된 유도의 배수를 하단부에서 나타냈다. 예상된 바와 같이 GLP-1R 수용체가 췌장 조직에서 주로 발현되기 때문에, 췌장에서 관찰된 형질전환 유전자 활성화의 강력한 유도가 나타났다. 8개의 다른 조직에서의 루시페라아제 활성들을 세포주 11, 16 및 90(도 29)에 4시간 동안 AVE0010(0.1mg/kg, 피하 투여)을 처리한 후에 측정하였다. 조직 균질액에서의 루시페라아제 활성은 루시페라아제의 췌장-특이적 유도를 확인하였다. GLP-1R이 다른 조직 유형에서 발견될지라도 AVE0010의 활성은 췌장에 국한된다.
AVE0010에 의한 Cre-Luc의 유도는 베타-세포 매개일 것으로 예상된다. AVE0010에 의한 CRE-Luc의 유도에 있어서 베타-세포 독소 스트렙토조토신(streptozotocin; STZ)의 효과를 조사하였다(도 30). 수컷 CRE-luc 마우스(세포주 11)를 AVE0010(0.1mg/kg, 피하 투여) 처리 전 및 후에 영상화하였다. 데이터는 모든 마우스가 AVE0010에 반응함을 나타낸다(도 30의 중간 패널 참조). 그런 다음, 상기 동물에 비히클 또는 STZ(200mpk, ip)을 처리하였다. 4일 후에, 상기 동물들을 AVE0010 처리 후에 다시 영상화하였다. 비히클 그룹에 비해, STZ 그룹이 감소된 루시페라아제 유도를 갖는다.
AVE0010에 의한 CRE-Luc의 유도는 베타-세포 특이적인 것으로 예상된다(도 31). 동물들을 도 30에 기재된 바와 같이 처리하였다. 혈중 글루코오스 수준을 금식시키지 않은 마우스의 꼬리 정맥을 절단하여 측정하였다. 글루코오스 수준을 베이어 혈당측정기(Bayer glucometer)로 판독하였다. 글루코오스 수준을 1ml 당 글루코오스의 양(mg)으로 나타냈다. 유도 배수는 기저 신호에 대한 AVE10 투약의 루시페라아제 바이오영상화 수준이다. 혈중 글루코오스 수준(BG)이 STZ(상위 왼쪽 패널)에 의해 증가하였다. 금식하지 않은 BG 수준은 AVE0010(0.1mg/kg, 피하 투여)에 의해 감소하였다. 도 30에 도시된 BLI 데이터는 정량화되었다.
4. 골수 생착(
Bone
Marrow
Engraftments
)
CreLuc 골수 생착을 NOD scid 감마(NSG) 마우스를 사용하여 실시하였다(도 32). NSD 마우스들은 기능성 천연 킬러 세포인 성숙 T 및 B 세포가 부족하여 면역저하된 마우스이며, 조혈 세포의 융합을 허용하는 사이토킨 신호전달이 결핍되어 있다. 골수 세포를 세포주 44 이형접합체(높은 기저 루시페라아제 수준을 가짐; 데이터는 나타내지 않음) 및 세포주 64 동형접합체(유도성 루시페라아제 수준을 가짐)로부터 채취하였다. 그런 다음 백만 또는 5백만 개의 상기 세포들을 꼬리 정맥 주입을 통해 방사능조사된 NSG 마우스에 생착시켰다. 세포주 44는, 마우스 1 및 2에 5백만 개의 세포로 주입되었으며, 마우스 3 및 4에 백만 개의 세포로 주입되었다. 세포주 64는, 마우스 1에 5백만 개의 세포로 주입되고 마우스 2, 3 및 4에 마우스 당 백만 개의 세포로 주입되었다(CreLuc 세포주 당 4마리 NSG 마우스). 상기 동물들을 4주째에 바이오영상화하고(데이터는 나타내지 않음) 8주째에 다시 바이오영상화하였다. 영상화하기 전에, 세포주 64 마우스에 5시간 동안 5mg/kg 포스콜린 및 10mg/kg 롤리프람을 이용하여 유도하였다. 바이오영상화 사진은 8주째 시점에서 보여진 것이다. 세포주 44 골수 세포가 생착된 상기 NSG 마우스에서의 루시페라아제 수준은 CreLuc 세포주 44(데이터는 나타내지 않음)에서 보여진 이미지와 유사하며, 이의 발현은 관절, 척수, 머리 및 흉골에서 관찰된다. 유도성 루시페라아제 발현이 세포주 64 골수 세포를 생착한 NSG 마우스의 비장에서 관찰되었다.
4. 동물 모델
CreLuc 마우스를 질환의 동물 모델 및 질환 상태의 양상을 연구하기 위해 사용할 수 있다. 게다가, CreLuc 마우스는 CreLuc 마우스에서 유도되는 질환 및 질환 양상을 조절할 수 있는 화합물들을 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, CreLuc 세포주 187의 루시페라아제 수준에 대한 자이모산(zymosan) 처리 효과를 연구하였다(도 34). 처리 그룹의 CreLuc 마우스(세포주 187)에 통증 반응을 유도하기 위해 자이모산을 뒷발 모두에 피하 주입하였다. 그런 다음 상기 동물들을 4일 동안 바이오영상화하였다. 루시페라아제 발현의 통계학적으로 유의한 증가가 모든 시점에서 자이모산에 대한 반응으로서 상기 동물들의 발에서 관찰되었다. 자이모산은 염증 반응을 강하게 활성화시키는 효모 세포벽 성분이다. 그러므로, 상기 CreLuc 마우스는 동일한 동물에서 시간에 따른 염증 반응을 모니터링할 수 있는 도구이다. 또한, 상기 자이모산 처리 동물들을 자이모산에 의해 유도되는 염증을 되돌리거나 약화시키기 위한 테스트 화합물들의 능력을 평가하기 위한 스크리닝 도구로서 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> SANOFI
<120> TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMAL AND USES THEREOF
<130> US2009/167 WO PCT
<150> US 61/288,480
<151> 2009-12-21
<150> US 61/298,973
<151> 2010-01-28
<150> US 61/318,919
<151> 2010-03-30
<150> FR 1057663
<151> 2010-09-23
<160> 21
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IFN forward primer
<400> 1
gggggatatc agtcaatatg ttcacccca 29
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IFN reverse primer
<400> 2
gggggatatc ctactgtttt aattaagc 28
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> beta-globin forward primer
<400> 3
aaggatcctt aattaaaatt atctctaagg c 31
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> beta-globin reverse primer
<400> 4
ggatccctgc aggaattcct tttaat 26
<210> 5
<211> 5689
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> vector used for transgene
<400> 5
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccgggggc 420
gcgccgggat ccttaattaa aattatctct aaggcatgtg aactggctgt cttggttttc 480
atctgtactt catctgctac ctctgtgacc tgaaacatat ttataattcc attaagctgt 540
gcatatgata gatttatcat atgtattttc cttaaaggat ttttgtaaga actaattgaa 600
ttgatacctg taaagtcttt atcacactac ccaataaata ataaatctct ttgttcagct 660
ctctgtttct ataaatatgt accagtttta ttgtttttag tggtagtgat tttattctct 720
ttctatatat atacacacac atgtgtgcat tcataaatat atacaatttt tatgaataaa 780
aaattattag caatcaatat tgaaaaccac tgatttttgt ttatgtgagc aaacagcaga 840
ttaaaaggaa ttcctgcagg atccttaatt aagttctaga tcacaagttt gtacaaaaaa 900
gctgaacgag aaacgtaaaa tgatataaat atcaatatat taaattagat tttgcataaa 960
aaacagacta cataatactg taaaacacaa catatccagt cactatggcg gccgcattag 1020
gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtataa tgtgtggatt ttgagttagg 1080
atccgtcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata 1140
ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt cagtcagttg 1200
ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta aagaccgtaa 1260
agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc ctgatgaatg 1320
ctcatccgga attccgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc 1380
acccttgtta caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat 1440
accacgacga tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg 1500
aaaacctggc ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc 1560
cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac ttcttcgccc 1620
ccgttttcac catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga 1680
ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac 1740
aacagtactg cgatgagtgg cagggcgggg cgtaaacgcg tggatccggc ttactaaaag 1800
ccagataaca gtatgcgtat ttgcgcgctg atttttgcgg tataagaata tatactgata 1860
tgtatacccg aagtatgtca aaaagaggta tgctatgaag cagcgtatta cagtgacagt 1920
tgacagcgac agctatcagt tgctcaaggc atatatgatg tcaatatctc cggtctggta 1980
agcacaacca tgcagaatga agcccgtcgt ctgcgtgccg aacgctggaa agcggaaaat 2040
caggaaggga tggctgaggt cgcccggttt attgaaatga acggctcttt tgctgacgag 2100
aacaggggct ggtgaaatgc agtttaaggt ttacacctat aaaagagaga gccgttatcg 2160
tctgtttgtg gatgtacaga gtgatattat tgacacgccc gggcgacgga tggtgatccc 2220
cctggccagt gcacgtctgc tgtcagataa agtctcccgt gaactttacc cggtggtgca 2280
tatcggggat gaaagctggc gcatgatgac caccgatatg gccagtgtgc cggtctccgt 2340
tatcggggaa gaagtggctg atctcagcca ccgcgaaaat gacatcaaaa acgccattaa 2400
cctgatgttc tggggaatat aaatgtcagg ctcccttata cacagccagt ctgcaggtcg 2460
accatagtga ctggatatgt tgtgttttac agtattatgt agtctgtttt ttatgcaaaa 2520
tctaatttaa tatattgata tttatatcat tttacgtttc tcgttcagct ttcttgtaca 2580
aagtggtgat ctagactaga gtcatcagtc aatatgttca ccccaaaaaa gctgtttgtt 2640
aacttgtcaa cctcattcta aaatgtatat agaagcccaa aagacaataa caaaaatatt 2700
cttgtagaac aaaatgggaa agaatgttcc actaaatatc aagatttaga gcaaagcatg 2760
agatgtgtgg ggatagacag tgaggctgat aaaatagagt agagctcaga aacagaccca 2820
ttgatatatg taagtgacct atgaaaaaaa tatggcattt tacaatggga aaatgatgat 2880
ctttttcttt tttagaaaaa cagggaaata tatttatatg taaaaaataa aagggaaccc 2940
atatgtcata ccatacacac aaaaaaattc cagtgaatta taagtctaaa tggagaaggc 3000
aaaactttaa atcttttaga aaataatata gaagcatgcc atcaagactt cagtgtagag 3060
aaaaatttct tatgactcaa agtcctaacc acaaagaaaa gattgttaat tagattgcat 3120
gaatattaag acttattttt aaaattaaaa aaccattaag aaaagtcagg ccatagaatg 3180
acagaaaata tttgcaacac cccagtaaag agaattgtaa tatgcagatt ataaaaagaa 3240
gtcttacaaa tcagtaaaaa ataaaactag acaaaaattt gaacagatga aagagaaact 3300
ctaaataatc attacacatg agaaactcaa tctcagaaat cagagaacta tcattgcata 3360
tacactaaat tagagaaata ttaaaaggct aagtaacatc tgtggcttaa ttaaaacagt 3420
aggatgactg tttaaacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 3480
cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 3540
tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 3600
cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 3660
gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 3720
tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 3780
acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 3840
aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 3900
cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 3960
gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 4020
tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 4080
tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 4140
cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 4200
gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 4260
ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 4320
ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 4380
ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 4440
agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 4500
aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 4560
atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 4620
tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 4680
tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 4740
tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 4800
gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 4860
tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 4920
ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 4980
gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 5040
aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 5100
ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 5160
tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 5220
ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 5280
aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 5340
ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 5400
ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 5460
agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 5520
tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 5580
ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt 5640
atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 5689
<210> 6
<211> 394
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic CRE element
<400> 6
aaataatgat tttattttga ctgatagtga cctgttcgtt gcaacaaatt gatgagcaat 60
gcttttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctt actgtcgaca attgcgtcat 120
actgtgacgt ctttcagaca ccccattgac gtcaatggga ttgacgtcaa tggggtgtct 180
gaaagacgtc acagtatgac ccgggctcga gcctccttgg ctgacgtcag agagagaggc 240
cggcccctta cgtcagaggc gagaattcga caactttgta tacaaaagtt gaacgagaaa 300
cgtaaaatga tataaatatc aatatattaa attagatttt gcataaaaaa cagactacat 360
aatactgtaa aacacaacat atccagtcac tatg 394
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CRE forward primer A
<400> 7
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt agcaccagac agtga 45
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CRE reverse primer B
<400> 8
gggaattcgt tctcccattg acgtca 26
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CRE forward primer C
<400> 9
gggaattcgc accagacagt gacgtc 26
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CRE reverse primer D
<400> 10
ggggacaact tttgtataca aagttgtgtt ctcccattga cgtca 45
<210> 11
<211> 186
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Hybrid CRE sequence
<400> 11
gcttagcacc agacagtgac gtcagctgcc agatcccatg gccgtcatac tgtgacgtct 60
ttcagacacc ccattgacgt caatgggaga acgaattcgc accagacagt gacgtcagct 120
gccagatccc atggccgtca tactgtgacg tctttcagac accccattga cgtcaatggg 180
agaaca 186
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> hGH forward primer
<400> 12
ggggacaact ttgtataata aagttggatc ccaaggccca actcc 45
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> hGH reverse primer
<400> 13
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta caacaggcat ctact 45
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TK forward primer
<400> 14
ggggacaact ttgtatacaa aagttgtgga acacgcagat gcagt 45
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TK reverse primer
<400> 15
ggggacaact ttgtatagaa aagttgggtg gatctgcggc acgct 45
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> luci forward primer
<400> 16
ggggacaact tttctataca aagttgatgg aagatgccaa aaaca 45
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> luci reverse primer
<400> 17
ggggacaact ttattataca aagttgttta cacggcgatc ttgcc 45
<210> 18
<211> 5550
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CreLuc synthetic transgene (Acc65I/PmeI digest)
<400> 18
gtacccgggg gcgcgccggg atccttaatt aaaattatct ctaaggcatg tgaactggct 60
gtcttggttt tcatctgtac ttcatctgct acctctgtga cctgaaacat atttataatt 120
ccattaagct gtgcatatga tagatttatc atatgtattt tccttaaagg atttttgtaa 180
gaactaattg aattgatacc tgtaaagtct ttatcacact acccaataaa taataaatct 240
ctttgttcag ctctctgttt ctataaatat gtaccagttt tattgttttt agtggtagtg 300
attttattct ctttctatat atatacacac acatgtgtgc attcataaat atatacaatt 360
tttatgaata aaaaattatt agcaatcaat attgaaaacc actgattttt gtttatgtga 420
gcaaacagca gattaaaagg aattcctgca ggatccttaa ttaagttcta gatccaagtt 480
tgtacaaaaa agcaggctta ctgtcgacaa ttgcgtcata ctgtgacgtc tttcagacac 540
cccattgacg tcaatgggat tgacgtcaat ggggtgtctg aaagacgtca cagtatgacc 600
cgggctcgag cctccttggc tgacgtcaga gagagaggcc ggccccttac gtcagaggcg 660
agaattcgac aactttgtat acaaaagttg tggaacacgc agatgcagtc ggggcggcgc 720
ggtcccaggt ccacttcgca tattaaggtg acgcgtgtgg cctcgaacac cgagcgaccc 780
tgcagcgacc cgcttaacag cgtcaacagc gtgccgcaga tccacccaac ttttctatac 840
aaagttgcta tggaagatgc caaaaacatt aagaagggcc cagcgccatt ctacccactc 900
gaagacggga ccgccggcga gcagctgcac aaagccatga agcgctacgc cctggtgccc 960
ggcaccatcg cctttaccga cgcacatatc gaggtggaca ttacctacgc cgagtacttc 1020
gagatgagcg ttcggctggc agaagctatg aagcgctatg ggctgaatac aaaccatcgg 1080
atcgtggtgt gcagcgagaa tagcttgcag ttcttcatgc ccgtgttggg tgccctgttc 1140
atcggtgtgg ctgtggcccc agctaacgac atctacaacg agcgcgagct gctgaacagc 1200
atgggcatca gccagcccac cgtcgtattc gtgagcaaga aagggctgca aaagatcctc 1260
aacgtgcaaa agaagctacc gatcatacaa aagatcatca tcatggatag caagaccgac 1320
taccagggct tccaaagcat gtacaccttc gtgacttccc atttgccacc cggcttcaac 1380
gagtacgact tcgtgcccga gagcttcgac cgggacaaaa ccatcgccct gatcatgaac 1440
agtagtggca gtaccggatt gcccaagggc gtagccctac cgcaccgcac cgcttgtgtc 1500
cgattcagtc atgcccgcga ccccatcttc ggcaaccaga tcatccccga caccgctatc 1560
ctcagcgtgg tgccatttca ccacggcttc ggcatgttca ccacgctggg ctacttgatc 1620
tgcggctttc gggtcgtgct catgtaccgc ttcgaggagg agctattctt gcgcagcttg 1680
caagactata agattcaatc tgccctgctg gtgcccacac tatttagctt cttcgctaag 1740
agcactctca tcgacaagta cgacctaagc aacttgcacg agatcgccag cggcggggcg 1800
ccgctcagca aggaggtagg tgaggccgtg gccaaacgct tccacctacc aggcatccgc 1860
cagggctacg gcctgacaga aacaaccagc gccattctga tcacccccga aggggacgac 1920
aagcctggcg cagtaggcaa ggtggtgccc ttcttcgagg ctaaggtggt ggacttggac 1980
accggtaaga cactgggtgt gaaccagcgc ggcgagctgt gcgtccgtgg ccccatgatc 2040
atgagcggct acgttaacaa ccccgaggct acaaacgctc tcatcgacaa ggacggctgg 2100
ctgcacagcg gcgacatcgc ctactgggac gaggacgagc acttcttcat cgtggaccgg 2160
ctgaagagcc tgatcaaata caagggctac caggtagccc cagccgaact ggagagcatc 2220
ctgctgcaac accccaacat cttcgacgcc ggggtcgccg gcctgcccga cgacgatgcc 2280
ggcgagctgc ccgccgcagt cgtcgtgctg gaacacggta aaaccatgac cgagaaggag 2340
atcgtggact atgtggccag ccaggttaca accgccaaga agctgcgcgg tggtgttgtg 2400
ttcgtggacg aggtgcctaa aggactgacc ggcaagttgg acgcccgcaa gatccgcgag 2460
attctcatta aggccaagaa gggcggcaag atcgccgtgt aaacaacttt gtataataaa 2520
gttgctgatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac agctcaccta 2580
gctgcaatgg ctacaggtaa gcgcccctaa aatccctttg ggcacaatgt gtcctgaggg 2640
gagaggcagc gacctgtaga tgggacgggg gcactaaccc tcaggtttgg ggcttctgaa 2700
tgtgagtatc gccatgtaag cccagtattt ggccaatctc agaaagctcc tggtccctgg 2760
agggatggag agagaaaaac aaacagctcc tggagcaggg agagtgctgg cctcttgctc 2820
tccggctccc tctgttgccc tctggtttct ccccaggctc ccggacgtcc ctgctcctgg 2880
cttttggcct gctctgcctg ccctggcttc aagagggcag tgccttccca accattccct 2940
tatccaggct ttttgacaac gctatgctcc gcgcccatcg tctgcaccag ctggcctttg 3000
acacctacca ggagtttgta agctcttggg gaatgggtgc gcatcagggg tggcaggaag 3060
gggtgacttt cccccgctgg gaaataagag gaggagacta aggagctcag ggtttttccc 3120
gaagcgaaaa tgcaggcaga tgagcacacg ctgagtgagg ttcccagaaa agtaacaatg 3180
ggagctggtc tccagcgtag accttggtgg gcggtccttc tcctaggaag aagcctatat 3240
cccaaaggaa cagaagtatt cattcctgca gaacccccag acctccctct gtttctcaga 3300
gtctattccg acaccctcca acagggagga aacacaacag aaatccgtga gtggatgcct 3360
tctccccagg cggggatggg ggagacctgt agtcagagcc cccgggcagc acagccaatg 3420
cccgtccttc ccctgcagaa cctagagctg ctccgcatct ccctgctgct catccagtcg 3480
tggctggagc ccgtgcagtt cctcaggagt gtcttcgcca acagcctggt gtacggcgcc 3540
tctgacagca acgtctatga cctcctaaag gacctagagg aaggcatcca aacgctgatg 3600
ggggtgaggg tggcgccagg ggtccccaat cctggagccc cactgacttt gagagctgtg 3660
ttagagaaac actgctgccc tctttttagc agtcaggccc tgacccaaga gaactcacct 3720
tattcttcat ttcccctcgt gaatcctcca ggcctttctc tacaccctga aggggaggga 3780
ggaaaatgaa tgaatgagaa agggagggaa cagtacccaa gcgcttggcc tctccttctc 3840
ttccttcact ttgcagaggc tggaagatgg cagcccccgg actgggcaga tcttcaagca 3900
gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac gcactactca agaactacgg 3960
gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag acattcctgc gcatcgtgca 4020
gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt ctagctgccc gggtggcatc cctgtgaccc 4080
ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct 4140
aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggcgtcc ttctataata ttatggggtg 4200
gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt 4260
ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc 4320
ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat 4380
gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca tattggccag 4440
gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca aattgctggg 4500
attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg attttaaaat aactatacca 4560
gcaggaggac gtccagacac agcataggct acctggccat gcccaaccgg tgggacattt 4620
gagttgtttg cttggcactg tcctctcatg cgttgggtcc actcagtaga tgcctgttgt 4680
acccagcttt cttgtacaaa gtgggatcta gactagagtc atcagtcaat atgttcaccc 4740
caaaaaagct gtttgttaac ttgtcaacct cattctaaaa tgtatataga agcccaaaag 4800
acaataacaa aaatattctt gtagaacaaa atgggaaaga atgttccact aaatatcaag 4860
atttagagca aagcatgaga tgtgtgggga tagacagtga ggctgataaa atagagtaga 4920
gctcagaaac agacccattg atatatgtaa gtgacctatg aaaaaaatat ggcattttac 4980
aatgggaaaa tgatgatctt tttctttttt agaaaaacag ggaaatatat ttatatgtaa 5040
aaaataaaag ggaacccata tgtcatacca tacacacaaa aaaattccag tgaattataa 5100
gtctaaatgg agaaggcaaa actttaaatc ttttagaaaa taatatagaa gcatgccatc 5160
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tgttaattag attgcatgaa tattaagact tatttttaaa attaaaaaac cattaagaaa 5280
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gcagattata aaaagaagtc ttacaaatca gtaaaaaata aaactagaca aaaatttgaa 5400
cagatgaaag agaaactcta aataatcatt acacatgaga aactcaatct cagaaatcag 5460
agaactatca ttgcatatac actaaattag agaaatatta aaaggctaag taacatctgt 5520
ggcttaatta aaacagtagg atgactgttt 5550
<210> 19
<211> 5562
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CreLuc hybrid transgene sequence (Acc65I/PmeI digest)
<400> 19
gtacccgggg gcgcgccggg atccttaatt aaaattatct ctaaggcatg tgaactggct 60
gtcttggttt tcatctgtac ttcatctgct acctctgtga cctgaaacat atttataatt 120
ccattaagct gtgcatatga tagatttatc atatgtattt tccttaaagg atttttgtaa 180
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ctttgttcag ctctctgttt ctataaatat gtaccagttt tattgttttt agtggtagtg 300
attttattct ctttctatat atatacacac acatgtgtgc attcataaat atatacaatt 360
tttatgaata aaaaattatt agcaatcaat attgaaaacc actgattttt gtttatgtga 420
gcaaacagca gattaaaagg aattcctgca ggatccttaa ttaagttcta gatccaagtt 480
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catactgtga cgtctttcag acaccccatt gacgtcaatg ggagaacgaa ttcgcaccag 600
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attgacgtca atgggagaac acaactttgt atacaaaagt tgtggaacac gcagatgcag 720
tcggggcggc gcggtcccag gtccacttcg catattaagg tgacgcgtgt ggcctcgaac 780
accgagcgac cctgcagcga cccgcttaac agcgtcaaca gcgtgccgca gatccaccca 840
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gccgagtact tcgagatgag cgttcggctg gcagaagcta tgaagcgcta tgggctgaat 1080
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ctgctgaaca gcatgggcat cagccagccc accgtcgtat tcgtgagcaa gaaagggctg 1260
caaaagatcc tcaacgtgca aaagaagcta ccgatcatac aaaagatcat catcatggat 1320
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accgcttgtg tccgattcag tcatgcccgc gaccccatct tcggcaacca gatcatcccc 1560
gacaccgcta tcctcagcgt ggtgccattt caccacggct tcggcatgtt caccacgctg 1620
ggctacttga tctgcggctt tcgggtcgtg ctcatgtacc gcttcgagga ggagctattc 1680
ttgcgcagct tgcaagacta taagattcaa tctgccctgc tggtgcccac actatttagc 1740
ttcttcgcta agagcactct catcgacaag tacgacctaa gcaacttgca cgagatcgcc 1800
agcggcgggg cgccgctcag caaggaggta ggtgaggccg tggccaaacg cttccaccta 1860
ccaggcatcc gccagggcta cggcctgaca gaaacaacca gcgccattct gatcaccccc 1920
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atcgtggacc ggctgaagag cctgatcaaa tacaagggct accaggtagc cccagccgaa 2220
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gagaactcac cttattcttc atttcccctc gtgaatcctc caggcctttc tctacaccct 3780
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cctctccttc tcttccttca ctttgcagag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca 3900
gatcttcaag cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact 3960
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gcgcatcgtg cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttctagctgc ccgggtggca 4080
tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac 4140
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gatgcctgtt gtacccagct ttcttgtaca aagtgggatc tagactagag tcatcagtca 4740
atatgttcac cccaaaaaag ctgtttgtta acttgtcaac ctcattctaa aatgtatata 4800
gaagcccaaa agacaataac aaaaatattc ttgtagaaca aaatgggaaa gaatgttcca 4860
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gaattgtaat atgcagatta taaaaagaag tcttacaaat cagtaaaaaa taaaactaga 5400
caaaaatttg aacagatgaa agagaaactc taaataatca ttacacatga gaaactcaat 5460
ctcagaaatc agagaactat cattgcatat acactaaatt agagaaatat taaaaggcta 5520
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Luc2-reverse primer
<400> 21
gatcttttgc agccctttct 20
Claims (20)
- 제1 인슐레이터 요소, 반응 요소, 프로모터, 생물발광 리포터, 기능 요소 및 제2 인슐레이터 요소를 포함하는 전이유전자(transgene)를 포함하는 게놈을 갖는, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제1 인슐레이터 요소가 매트릭스 부착 영역(Matrix Attachment Region, MAR), DNase I-과민 부위(HS4) 및 역위 말단 반복부(Inverted Terminal Repeat, ITR)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제2 인슐레이터 요소가 매트릭스 부착 영역(MAR), HS4 및 ITR로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제1 인슐레이터 요소가 상기 제2 인슐레이터 요소와 동일한, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 반응 요소는 cAMP 반응 요소(CRE), 활성자 단백질 1(ASP1), 당질코르티코이드 반응 요소(GRE), 열 충격 반응 요소(HSE), 혈청 반응 요소(SRE), 티로이드 반응 요소(TRE) 및 에스트로겐 반응 요소(ERE)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 반응 요소가 나란하게 2 내지 24회 반복되는, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 반응 요소가 나란하게 6회 반복되는, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 7 항에 있어서, 상기 반응 요소가 CRE인, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 프로모터가 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 최소 (HSV TK min) 프로모터인, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 생물발광 리포터가 루시페라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 베타-갈락토시다아제, 분비된 알칼리성 포스파타아제(SEAP), 인간 성장 호르몬(HGH) 및 녹색 형광 단백질(GFP)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 기능 요소가 인간 성장 호르몬(hGH) 유전자인, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 전이유전자가 서열번호 18을 포함하는, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 11 항에 있어서, 상기 전이유전자가 서열번호 19를 포함하는, 형질전환 비-인간 동물.
- 제 1 항의 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리된 세포.
- 제 1 항의 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리된 조직편.
- G 단백질 결합 수용체(GPCR) 리간드를 식별하는 방법으로서,
(a) 제 1 항의 상기 형질전환 비-인간 동물에서의 생물발광의 양을 측정하는 단계;
(b) 테스트제를 상기 형질전환 비-인간 동물에 투여하는 단계;
(c) 상기 테스트제 투여 후 한번 이상의 시점에 상기 형질전환 비-인간 동물의 생물발광의 양을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 (a) 단계에서 측정된 생물발광의 양을 상기 (c) 단계에서 측정된 생물발광의 양과 비교하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 (c) 단계에 대해 비교된 상기 (a) 단계에서의 생물발광의 양의 차이가 상기 테스트제를 GPCR 리간드로서 식별시켜 주는,
G 단백질 결합 수용체(GPCR) 리간드를 식별하는 방법. - G 단백질 결합 수용체(GPCR) 리간드를 식별하는 방법으로서,
(a) 제 1 항의 상기 형질전환 비-인간 동물로부터의 조직편을 준비하는 단계;
(b) 상기 조직편에서의 생물발광의 양을 측정하는 단계;
(c) 테스트제를 상기 조직편에 투여하는 단계;
(d) 상기 테스트제 투여 후 한번 이상의 시점에 상기 조직편의 생물발광의 양을 측정하는 단계; 및
(e) 상기 (b) 단계에서 측정된 생물발광의 양을 상기 (d) 단계에서 측정된 생물발광의 양과 비교하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 (d) 단계에 대해 비교된 상기 (b) 단계에서의 생물발광의 양의 차이가 상기 테스트제를 GPCR 리간드로서 식별시켜 주는,
G 단백질 결합 수용체(GPCR) 리간드를 식별하는 방법. - G 단백질 결합 수용체(GPCR) 리간드를 식별하는 방법으로서,
(a) 제 1 항의 상기 형질전환 비-인간 동물로부터 단리한 세포를 준비하는 단계;
(b) 상기 세포에서의 생물발광의 양을 측정하는 단계;
(c) 테스트제를 상기 세포에 투여하는 단계;
(d) 상기 테스트제 투여 후 한번 이상의 시점에 상기 세포에서 생물발광의 양을 측정하는 단계; 및
(e) 상기 (b) 단계에서 측정된 생물발광의 양을 상기 (d) 단계에서 측정된 생물발광의 양과 비교하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 (d) 단계에 대해 비교된 상기 (b) 단계에서의 생물발광의 양의 차이가 상기 테스트제를 GPCR 리간드로서 식별시켜 주는,
G 단백질 결합 수용체(GPCR) 리간드를 식별하는 방법. - 비-인간 동물 내에서 GPCR 기능을 모니터링하는 방법으로서,
(a) 비-인간 동물을 형질전환 변형해서 제1 인슐레이터 요소, 반응 요소, 프로모터, 생물발광 리포터, 기능 요소 및 제2 인슐레이터 요소를 포함하는 전이유전자를 발현하는 단계;
(b) 상기 비-인간 동물로부터 생물발광을 모니터링하는 단계; 및
(c) 상기 생물발광을 GPCR 기능과 상호연관시키는 단계를 포함하는,
비-인간 동물 내에서 GPCR 기능을 모니터링하는 방법. - GPCR 기능을 모니터링하는데 이용하기 위한 비-인간 형질전환 동물을 제조하는 방법으로서,
(a) 비-인간 동물을 형질전환 변형해서 제1 인슐레이터 요소, 반응 요소, 프로모터, 생물발광 리포터, 기능 요소 및 제2 인슐레이터 요소를 포함하는 전이유전자를 발현하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 상기 형질전환 비-인간 동물에서 생물발광의 양을 측정하는 단계;
(c) GPCR 리간드를 상기 형질전환 비-인간 동물에 투여하는 단계;
(d) 상기 GPCR 리간드 투여 후 한번 이상의 시점에 상기 형질전환 비-인간 동물의 생물발광의 양을 측정하는 단계; 및
(e) 상기 (b) 단계에서 측정된 생물발광의 양을 상기 (d) 단계에서 측정된 생물발광의 양과 비교하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 (d) 단계에 대해 비교된 상기 (b) 단계에서의 생물발광의 양의 차이가 상기 형질전환 비-인간 동물을 GPCR 기능 모니터링에 사용하기 위한 것으로서 식별시켜 주는,
GPCR 기능을 모니터링하는데 이용하기 위한 비-인간 형질전환 동물을 제조하는 방법.
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| WO2004042363A2 (en) * | 2002-11-04 | 2004-05-21 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | In vivo imaging of e2f-regulated bioluminescent proteins |
| EA008439B1 (ru) * | 2003-02-14 | 2007-06-29 | Байоджен Айдек Ма Инк. | Экспрессионная кассета и вектор для временной или постоянной экспрессии экзогенных молекул |
| US20050283854A1 (en) * | 2003-05-23 | 2005-12-22 | Anton Krumm | Recombinant vectors for use in position-independent transgene expression within chromatin |
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