CN112831521B - 一种扩张型心肌病小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种扩张型心肌病小鼠模型的构建方法及其应用。所述扩张型心肌病模型小鼠可通过特异性敲除小鼠心肌细胞中Prmt5基因的方法构建得到。本发明构建的心肌细胞特异性Prmt5缺失的小鼠存在扩张型心肌病(DCM)的病理特征，包括心脏室壁变薄、心腔扩张、心肌发生纤维化、收缩功能受损、病理性标志基因表达上升，最终导致小鼠死亡。利用本发明所述方法构建的小鼠DCM模型可应用于开发或筛选扩张型心肌病药物的研究。

Description

一种扩张型心肌病小鼠模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及医学生物技术领域，具体涉及一种扩张型心肌病小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
扩张型心肌病(DCM)是一种以左心室扩张和收缩功能障碍为特征的复杂性心肌病。四分之一至二分之一的DCM病例被认为具有遗传基础，并被归类为家族性DCM，这与编码细胞骨架蛋白、肌动蛋白和线粒体蛋白的基因突变有关。除此之外，仍有相当大一部分的扩张型心肌病的致病原因不明，称之为特发性心肌病，其分子机制有待充分阐明。
蛋白精氨酸甲基化是哺乳动物细胞内广泛存在的一个重要的转录后修饰过程。蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)是蛋白精氨酸甲基转移酶家族的一个重要组分，可以催化靶蛋白精氨酸亚基对称二甲基化过程，属于II型精氨酸甲基化转移酶。随着研究深入，发现越来越多的蛋白靶标可以被PRMT5介导的对称二甲基化修饰所调控，包括组蛋白和非组蛋白。PRMT5具有转录调控、RNA加工、蛋白质功能和信号转导等多种功能。然而，PRMT5在扩张型心肌病中的功能还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何构建扩张型心肌病动物模型。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种构建扩张型心肌病小鼠模型的方法。所述方法包括降低或抑制小鼠心肌细胞中Prmt5基因的表达量或/和PRMT5蛋白质的活性，得到所述扩张型心肌病小鼠模型。
所述降低或抑制小鼠心肌细胞中Prmt5基因的表达量或/和PRMT5蛋白质的活性可为特异性敲除小鼠心肌细胞中Prmt5基因。
上文所述小鼠模型心肌细胞不表达Prmt5基因。
上述方法还可包括使小鼠心肌细胞Prmt5基因的表达沉默的过程。
上文所述小鼠心肌细胞Prmt5基因(野生型等位基因，Prmt5+)包括17个外显子，其所在基因组序列的是GenBank Accession No.NC_000080(Update Date 2020-09-22)的第54744639-54754927位核苷酸序列的互补序列，将第54754927位核苷酸记为Prmt5基因的第1位核苷酸，其中，第1-224位为第一外显子序列，第856-974位为第二外显子序列，第1280-1365位为第三外显子序列，第2034-2168位为第四外显子序列，第2584-2696位为第五外显子序列，第2825-2874位为第六外显子序列，第4017-4180位为第七外显子序列，第5317-5478位为第八外显子序列，第5892-5969位为第九外显子序列，第6065-6123位为第十外显子序列，第6208-6330位为第十一外显子序列，第6417-6592位为第十二外显子序列，第7528-7637位为第十三外显子序列，第7834-7927位为第十四外显子序列，第8066-8182位为第十五外显子序列，第8515-8579位为第十六外显子序列，第9524-10289位为第十七外显子序列。
所述小鼠心肌细胞Prmt5基因编码的PRMT5蛋白是氨基酸序列为GenBankAccession No.NP_038796(Update Date 2021-01-03)所示的蛋白质。
上文所述特异性敲除小鼠心肌细胞Prmt5基因可为敲除所述受体小鼠心肌细胞基因组中Prmt5基因中的第七外显子。
上文所述特异性敲除小鼠心肌细胞Prmt5基因可包括采用Cre/loxP系统特异性敲除所述受体小鼠心肌细胞的Prmt5基因。
所述特异性敲除基因可为指通过遗传手段使得动物发育的某一阶段或某一特定组织、器官、细胞中的特定基因不表达，而动物发育的其它阶段或其它组织、器官、细胞中的该基因表达正常。例如，心肌细胞特异性Prmt5基因敲除可为仅实现心肌细胞中的Prmt5基因及蛋白不表达，对其它细胞中Prmt5基因表达没有影响。
所述基因敲除(gene knockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
上文所述扩张型心肌病小鼠模型的构建方法可包括如下步骤：
将Prmt5fl/fl小鼠和α-MHC-Cre小鼠交配得到F1代小鼠。
所述Prmt5fl/fl小鼠是将C57BL/6J小鼠的Prmt5基因替换为Prmt5fl等位基因，Prmt5fl等位基因是将基因组序列GenBank Accession No.NC_000080(Update Date 2020-09-22)的第54744027-54754899位核苷酸序列的互补序列(将第54754899位核苷酸记为第1位核苷酸)替换为如下DNA分子得到的等位基因：缺失序列表中SEQ ID No.2的第3571位至第10474位核苷酸，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子，得到的Prmt5基因突变体。
所述α-MHC-Cre小鼠为心肌细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。
选择所述F1代小鼠中的双阳性杂合子小鼠，命名为α-MHC-Cre；Prmt5fl/+小鼠，所述α-MHC-Cre；Prmt5fl/+小鼠的一条染色体携带所述Prmt5基因，另一条染色体携带所述Prmt5fl等位基因，且所述α-MHC-Cre；Prmt5fl/+小鼠在心肌细胞特异性表达Cre重组酶。
所述α-MHC-Cre；Prmt5fl/+小鼠和所述Prmt5fl/fl小鼠交配得到F2代小鼠。
选择所述F2代小鼠中的双阳性纯合子小鼠，命名为α-MHC-Cre；Prmt5fl/fl小鼠。所述α-MHC-Cre；Prmt5fl/fl小鼠为所述基因敲除小鼠。所述α-MHC-Cre；Prmt5fl/fl小鼠的两条染色体均携带所述Prmt5fl等位基因，且所述α-MHC-Cre；Prmt5fl/fl小鼠在心肌细胞特异性表达Cre重组酶。
上文所述α-MHC-Cre小鼠可携带包括α-MHC基因启动子和Cre重组酶基因的目的片段。所述α-MHC基因启动子可启动所述Cre重组酶基因的表达。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述的扩张型心肌病小鼠模型在制备扩张型心肌病动物模型中的应用。
所述扩张型心肌病小鼠模型的心肌细胞可为不表达或抑制表达Prmt5基因及其编码蛋白。
上文所述的Prmt5基因和/或所述Prmt5基因编码的PRMT5蛋白在开发预防和/或治疗心肌病药物中的应用也属于本发明的保护范围。
上文所述的方法和/或上文所述的扩张型心肌病小鼠模型在筛选预防和/或治疗心肌病药物中的应用也属于本发明的保护范围。所述心肌病具体可为扩张型心肌病。
本发明通过敲除小鼠心肌细胞特异性Prmt5基因的方法构建得到的DCM小鼠模型存在扩张型心肌病(DCM)的病理特征，包括心脏室壁变薄、心腔扩张、心肌发生纤维化、收缩功能受损、病理性标志基因表达上升，最终导致小鼠死亡。利用本发明所述方法构建的小鼠DCM模型可应用于开发或筛选扩张型心肌病药物的研究。
附图说明
图1为扩张型心肌病人标本基因芯片PRMT5表达量分析。
图2为Prmt5基因组位点、打靶载体和突变位点的示意图。FLP代表FLP重组酶，可以介导FRT序列之间的重组；Cre代表Cre重组酶，可以介导loxP序列之间的重组。
图3为扩张型心肌病模型Prmt5-cKO小鼠杂交构建示意图。
图4为扩张型心肌病小鼠基因型鉴定图。
图5为扩张型心肌病小鼠模型Prmt5敲除效率验证。
图6为扩张型心肌病小鼠模型生存曲线分析。
图7为扩张型心肌病小鼠模型心脏形态照片及心脏重量/体重比值、心脏重量/胫骨长度比值。
图8为扩张型心肌病小鼠模型组织水平验证。
图9为扩张型心肌病小鼠模型纤维化标志基因、病理标志基因表达水平检测。
图10为扩张型心肌病小鼠模型心脏超声功能检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
采用GraphPad Prism 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准误表示，采用双尾t检验。
本发明实施例中的α-MHC-Cre转基因小鼠(α-MHC-Cre小鼠)在文献“王剑等，心脏组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立[J]军事医学科学院院刊，2015,29(1)：38-44”中公开。α-MHC-Cre转基因小鼠(α-MHC-Cre小鼠)构建方法具体如下。
将包括α-MHC基因启动子、Cre重组酶基因和人生长素基因polyA的α-MHC-Cre-hGH目的片段(序列如SEQ ID No.1所示)通过显微注射导入至昆明白小鼠受精卵胸原核中，将该受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中，从而获得子代鼠。利用PCR从中筛选出携带Cre重组酶基因的小鼠，通过与C57BL/6J回交获得α-MHC-Cre小鼠。α-MHC-Cre小鼠仅在心肌细胞特异性表达Cre重组酶。SEQ ID No.1中，α-MHC基因启动子为第1-5474位，Cre重组酶基因为第5526-6719位，人生长素基因polyA为第6778-8935位。
Cre重组酶是SEQ ID No.1的第5526-6719位核苷酸(CDS)编码的蛋白质。
实施例一、PRMT5表达改变与扩张型心肌病相关性研究
对美国国立生物技术信息中心基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)公开的人扩张型心肌病人(DCM)心脏基因芯片结果进行分析，对来自GEO数据库的101个DCM病人样本(其中GSE1145的15个样本和GSE5406的86个样本)和27个对照样本(其中GSE1145的11个样本和GSE5406的16个样本)的PRMT5表达量进行分析，均发现在人DCM患者心脏中PRMT5表达明显降低(图1)。
实施例二、心肌细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的制备
1.1 Prmt5条件基因打靶小鼠(Prmt5fl/fl小鼠)的构建
小鼠的PRMT5蛋白是氨基酸序列为GenBank Accession No.NP_038796(UpdateDate 2021-01-03)所示的蛋白质，小鼠Prmt5基因(野生型等位基因，Prmt5+)包括17个外显子，其所在基因组序列的是GenBank Accession No.NC_000080(Update Date 2020-09-22)的第54744639-54754927位核苷酸序列的互补序列，将第54754927位核苷酸记为Prmt5基因的第1位核苷酸，其中，第1-224位为第一外显子序列，第856-974位为第二外显子序列，第1280-1365位为第三外显子序列，第2034-2168位为第四外显子序列，第2584-2696位为第五外显子序列，第2825-2874位为第六外显子序列，第4017-4180位为第七外显子序列，第5317-5478位为第八外显子序列，第5892-5969位为第九外显子序列，第6065-6123位为第十外显子序列，第6208-6330位为第十一外显子序列，第6417-6592位为第十二外显子序列，第7528-7637位为第十三外显子序列，第7834-7927位为第十四外显子序列，第8066-8182位为第十五外显子序列，第8515-8579位为第十六外显子序列，第9524-10289位为第十七外显子序列。
从欧洲条件小鼠突变计划(EUCOMM Program)购买Prmt5基因中靶小鼠胚胎干细胞(以下简称中靶ES细胞)，该中靶ES细胞含有一条中靶等位基因，中靶等位基因是将小鼠基因组序列GenBank Accession No.NC_000080(Update Date 2020-09-22)的第54744027-54754899位核苷酸序列的互补序列(将第54754899位核苷酸记为第1位核苷酸)替换为序列表中SEQ ID No.2所示的片段。
利用细胞显微注射技术将中靶ES细胞注射到C57BL/6J小鼠囊胚中制备获得嵌合体小鼠，将得到的嵌合体小鼠进一步与C57BL/6J小鼠交配得到中靶等位基因杂合子小鼠。然后将其与ROSA26::FLPe knockin小鼠(南京大学高翔实验室赠送，可于Jackson实验室购买，https://www.jax.org/strain/003946，129S4/SvJaeSor-Gt(ROSA)26Sortm1(FLP1)Dym/J货号为003946)交配得到Prmt5fl/+小鼠，Prmt5fl/+小鼠去除了新霉素基因等元件。与C57BL/6J小鼠相比，Prmt5fl/+小鼠的一条染色体上的基因组序列GenBank Accession No.NC_000080(Update Date 2020-09-22)的第54744027-54754899位核苷酸序列的互补序列(将第54754899位核苷酸记为第1位核苷酸)替换为如下DNA分子得到的等位基因：缺失序列表中SEQ ID No.2的第3571位至第10474位核苷酸，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子，成为如图2中Prmt5fl等位基因；另一条染色体上仍为野生型等位基因，Prmt5+。
将得到的Prmt5fl/+小鼠进行自交获得纯合子小鼠Prmt5fl/fl小鼠。Prmt5fl/fl小鼠的两条染色体上的原Prmt5基因序列，均替换成为图2中Prmt5fl等位基因；Prmt5fl等位基因是将基因组序列GenBank Accession No.NC_000080(Update Date 2020-09-22)的第54744027-54754899位核苷酸序列的互补序列(将第54754899位核苷酸记为第1位核苷酸)替换为如下DNA分子得到的等位基因：缺失序列表中SEQ ID No.2的第3571位至第10474位核苷酸，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；最终保持所述Prmt5基因的其它核苷酸序列不变得到的Prmt5基因突变体。
1.2心肌细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的制备
将饲养于SPF动物房的Prmt5fl/fl小鼠与α-MHC-Cre小鼠交配得到F1代小鼠，通过PCR鉴定获得双阳性杂合子小鼠，命名为α-MHC-Cre；Prmt5fl/+小鼠。
将α-MHC-Cre；Prmt5fl/+小鼠与Prmt5fl/fl小鼠交配得到F2代小鼠，通过PCR鉴定获得双阳性纯合子小鼠(α-MHC-Cre；Prmt5fl/fl)，命名为心肌细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠(Prmt5-cKO)(图3)，即为扩张型心肌病小鼠模型。
Prmt5-cKO小鼠基因组整合有α-MHC-Cre-hGH目的片段(序列表中SEQ ID No.1)，在心肌细胞特异性表达Cre重组酶，两条染色体上的基因组序列GenBank AccessionNo.NC_000080(Update Date 2020-09-22)的第54744027-54754899位核苷酸序列的互补序列(将第54754899位核苷酸记为第1位核苷酸)替换为如下DNA分子得到的等位基因：缺失序列表中SEQ ID No.2的第3571位至第10474位核苷酸，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子，成为图2中的Prmt5fl等位基因，并且Prmt5-cKO小鼠心肌细胞内两条染色体上的Prmt5f1等位基因的第七外显子均被Cre/loxP系统敲除，即缺失164bp的第七外显子，成为如图2的敲除等位基因。
PCR鉴定获得双阳性纯合子小鼠中，PCR鉴定方法具体如下：
(一)小鼠基因组DNA的制备
1、剪15天小鼠尾巴尖约2mm放入Eppendorf管中。
2、每管加入鼠尾裂解缓冲液(0.5％SDS，0.1M NaCl，0.05M EDTA，0.01M Tris-ClpH8.0,蛋白酶K,200μg/ml)400μl。
3、55℃保温过夜。
4、每管加入200μl饱和的NaCl(6M)。
5、将Eppendorf管置于纸盒中剧烈晃动200次。
6、将Eppendorf管置于冰上，10min。
7、室温14,000rpm离心，10min。
8、将上清500μl转移至干净的Eppendorf管中，每管加入0.8ml乙醇，混匀。
9、14,000rpm离心，5min。弃上清。
10、将Eppendorf管口朝下，室温干燥。将DNA重悬于50～100μl TE中，37℃保温至DNA完全溶解。
(二)PCR鉴定小鼠的基因型
按如下体系，在96孔板中加入各组分：
Figure BDA0002928931560000051
将配置好的反应体系放入PCR仪中。反应程序如下：
94℃：5min
Figure BDA0002928931560000052
72℃：10min
4℃：10min
配置2％琼脂糖凝胶电泳，将扩增完之后的产物点入凝胶孔中。恒压140V，20min。
鉴定Cre重组酶基因采用的Cre引物为5′-ATGACAGACAGATCCCTCCTATCTCC-3′和5′-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3′。鉴定Prmt5基因采用的Prmt5引物为5′-ACACTGGGTTGCTCACAACTGCA-3′和5′-TGTAAACTCCTGATCCTCCTG-3′。
Prmt5-cKO小鼠的基因型鉴定结果见图4，图中有6个样本，上图为采用Cre引物扩增的产物电泳，如能特异性扩增出629bp片段，则为α-MHC-Cre阳性；下图为采用Prmt5引物扩增的产物电泳，如能特异性扩增出一条466bp片段，则为Prmt5fl/fl纯合子，如能特异性分别扩增出312bp片段、466bp片段，则为Prmt5fl/+杂合子，如能特异性扩增出一条312bp片段，则为Prmt5+/+野生型。样本1的基因型为Prmt5+/+，样本2的基因型为Prmt5fl/+，样本3的基因型为Prmt5fl/fl，样本4的基因型为α-MHC-Cre；Prmt5+/+，样本5的基因型为α-MHC-Cre；Prmt5fl/+，样本6的基因型为α-MHC-Cre；Prmt5fl/fl。因此样本6为所需要的扩张型心肌病模型Prmt5-cKO小鼠。
实施例三、心肌细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠Prmt5基因敲除效率检测
取实施例二制备的Prmt5-cKO小鼠和Prmt5fl/fl小鼠的心脏组织。
(一)蛋白水平检测
心脏组织蛋白提取：将放有心脏组织的离心管中加入500μL RIPA裂解液(预先加入蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂)，利用匀浆器将组织彻底匀浆碎，其间用PBS清洗转头。将匀浆后的组织放于冰上静置10min。
将离心管放入超声破碎仪进行超声破碎。超声程序：超声时间3min 30s，工作6s，间隔9s。
12000r/min，4℃离心机离心20min。
将所得上清液吸入另一干净的离心管中，利用BCA法测量蛋白浓度。利用所测标准品浓度得到标准曲线，计算出样品的蛋白浓度。
采用western blot检测PRMT5蛋白表达，以GAPDH蛋白为参照。
取出100μL蛋白样品(即上述所得的上清液)并加入6×蛋白上样缓冲液，然后沸水中煮5min。
将蛋白量定为30μg，计算含上样缓冲液的蛋白上样量。
配置SDS-PAGE凝胶。
将SDS-PAGE电泳槽中加入电泳缓冲液，在SDS-PAGE凝胶胶孔中加入蛋白样品。电泳程序：115V，30min；175V，1h。(在上样缓冲液将要跑出胶时，停止电泳)
将电泳槽中加入转膜缓冲液，蛋白利用湿转法转至PVDF膜。电泳程序为：100v，1.5h。
使用5％脱脂奶粉作为封闭液，160rpm摇床室温孵育1.5h。
PBST洗去牛奶，孵育已稀释好的兔来源PRMT5一抗(abcam，ab109451)和小鼠来源GAPDH(中杉金桥公司，TA-08)一抗4℃摇床过夜。
使用PBST洗膜3次，每次7min，室温孵育稀释的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG二抗1h。
利用PBST洗膜3次后，利用ImageQuant LAS 4000mini进行显影。
结果如图5A所示，Prmt5-cKO小鼠的心脏组织中PRMT5蛋白的表达量较对照小鼠明显下降。
(二)mRNA水平检测
1.组织总RNA的提取：取小鼠心脏组织约50mg放入1ml Trizol中，用匀浆器进行匀浆，于室温培养5分钟。加入0.2ml氯仿，盖紧瓶盖剧烈振荡15秒，放置2－3分钟。2－8℃，10000－12000g离心15分钟。将上层水相转移到一个新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10分钟，2－8℃，10000－12000g离心10分钟。弃上清，加入至少1ml 75％的乙醇洗涤，2－8℃，不大于7500g离心5分钟。弃上清，空气干燥5－10分钟，加入无RNase的水500μl，反复抽吸使RNA溶解。55－60℃保温10分钟，－70℃冰箱储存备用。
2.RNA的反转录：
将提取的RNA按如下体系进行反转录：
RNA 2μg
5×RT Mix(TOYOBO) 2μL
DEPC水 up to 10μL
反应条件：37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min。
将上述所得产物cDNA加水稀释到50μL，用于后续实时荧光定量PCR的模板。
3.Real-time PCR检测
按如下体系于96孔板中加入各组分：
Figure BDA0002928931560000071
将配制好的反应体系放入ABI 7500Fast实时荧光定量PCR仪中，执行标准反应程序。
GAPDH引物5′-TGCCCAGAACATCATCCCT-3′和5′-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG-3′
Prmt5引物5′-AGCCCATCAAAGCAGCCATT-3′和5′-CATTGGGTGGAGGGCGATTT-3′
图5中B为qPCR检测Prmt5基因的相对表达量，结果显示Prmt5-cKO小鼠的心脏组织中Prmt5的mRNA表达水平较Prmt5fl/fl小鼠明显下降。
实施例四、Prmt5-cKO模型小鼠的扩张型心肌病(DCM)表型鉴定
(一)生存时间观测
对Prmt5-cKO小鼠21只和Prmt5fl/fl小鼠20只进行持续观测，记录小鼠死亡时间，利用Graphpad Prism软件绘制生存曲线发现Prmt5-cKO小鼠相比于Prmt5fl/fl小鼠存活时间显著缩短(图6)，Prmt5-cKO小鼠在58周龄时全部死亡，而其同窝对照Prmt5fl/fl小鼠在观测期内全部存活。
(二)心脏形态及重量检测
对七月龄Prmt5-cKO和Prmt5fl/fl小鼠断颈处死，取出心脏。观察心脏大体形态，剪去周围大血管，用电子天平称取心脏重量，测量胫骨长度，计算心脏重量与胫骨长度。
图7中A结果显示从大体形态方面进行观察发现Prmt5-cKO小鼠的心脏较Prmt5fl/fl小鼠显著增大，标尺长度5mm。图7中B结果显示Prmt5-cKO小鼠的心脏重量与体重比值(HW/BW)较Prmt5fl/fl小鼠显著增大；图7中C结果显示Prmt5-cKO小鼠的心脏重量与胫骨长度比值(HW/TL)较Prmt5fl/fl小鼠显著增大。
(三)组织学分析
3.1心脏组织的石蜡包埋及切片
将实施例3中取出的心脏组织于4％PFA固定过夜后，放入包埋机中进行系列组织脱水。程序如下：
70％乙醇，30min；80％乙醇，30min；90％乙醇，30min；95％乙醇，30min；无水乙醇，30min；无水乙醇，30min；二甲苯，15min；二甲苯，15min。
将脱水后的组织放入石蜡中透蜡2h，其间换蜡2次，放于60℃恒温培养箱中。
将组织放到预热的包埋框中，用镊子摆好位置，凝固热蜡。
将石蜡包埋后的组织固定于石蜡切片机上开始切片。切片厚度为5μm，用毛笔将切片放于42℃水面展开，贴于载玻片。37℃过夜，用于后续染色。
3.2 H&E染色
将步骤(一)制备的石蜡组织切片放在60℃恒温培养箱烤片2h。
将石蜡组织切片进行脱蜡系列乙醇复水：二甲苯，10min；二甲苯，20min；二甲苯，20min；无水乙醇，15min；无水乙醇，15min；95％乙醇，5min；90％乙醇，5min；80％乙醇，5min；70％乙醇，5min。
将组织切片用蒸馏水洗5min。
将组织切片置于Harris苏木素内染色5min，然后自来水冲5min，盐酸乙醇分化至蓝色褪去，再用自来水冲5min进行蓝化，显微镜下观察核染色情况。
将组织切片放入95％乙醇与伊红混合染液染色1min，后经95％乙醇、100％乙醇、100％乙醇各一分钟进行组织脱水，二甲苯透明2次各2min，中性树胶封片。
3.3Masson染色
将步骤(一)制备的石蜡组织切片进行烤片脱蜡复水(如上述步骤(二))。
将组织切片放在Bouin’s固定液中室温过夜。
将切片置于蒸馏水中，以充分漂洗去除切片上固定液的颜色。
将组织切片置于苏木素中染色5min。
用自来水冲洗5min，再用蒸馏水浸泡8min。
将组织切片进行Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin染色3min。
蒸馏水浸泡10min(换水一次)，然后将组织切片置于磷钨酸溶液中染色5min。
再将切片放于Aniline Blue溶液中染色8min。
将切片置于蒸馏水中约5s，看到蓝色褪去立即拿出。
将组织切片迅速放于95％乙醇中进行组织系列脱水，用中性树脂封片。脱水步骤：95％乙醇，1min；无水乙醇，1min；无水乙醇，1min；二甲苯，2min；二甲苯，2min。
组织学分析结果如图8所示，图8中A和B通过H&E染色表明Prmt5-cKO小鼠的心脏(图8中B)较Prmt5fl/fl小鼠心脏(图8中A)心腔明显增大，标尺长度1mm；图8中C和D通过Masson染色表明Prmt5-cKO小鼠的心脏(图8中D)较Prmt5fl/fl小鼠心脏(图8中C)发生明显的纤维化，标尺长度100μm。
(四)分子水平检测分析
利用qPCR对Prmt5-cKO和Prmt5fl/fl小鼠进行病理及纤维化标志基因表达分析，以GAPDH为内参基因。图9中A表明Prmt5-cKO小鼠的心脏较Prmt5fl/fl小鼠心脏病理标志基因心房利钠肽(Anp)、脑钠肽(Bnp)、骨骼肌肌动蛋白α1(Acta1)表达均显著上调，图9中B表明Prmt5-cKO小鼠的心脏较Prmt5fl/fl小鼠心脏纤维化标志基因I型胶原蛋白α1(Col1a1)、III型胶原蛋白α1(Col3a1)表达均显著上调。引物序列为GAPDH：5′-TGCCCAGAACATCATCCCT-3′和5′-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG-3′；Anp：5′-GCCGGTAGAAGATGAGGTCA-3′和5′-GGGCTCCAATCCTGTCAATC-3′；Bnp：5′-GCTCTTGAAGGACCAAGGCCTCAC-3′和5′-GATCCGATCCGGTCTATCTTGTGC-3′；Acta1：5’-GGCTCCCAGCACCATGAAGA-3’和5’-CAGCACGATTGTCGATTGTC G-3’；Col1a1：5′-AGCGAAGAACTCATACAGCCG-3′和5′-TTGGAGCAGCCATCGAC TAG-3′；Col3a1：5′-GCCTCCCAGAACATTACATACC-3′和5′-GGGTAGTCTCATTGCCTTGC-3′
(五)心脏收缩功能分析
使用Vevo 770超声仪(Visualsonics)为不同月龄小鼠进行心脏进行M型超声检测，记录以下参数：舒张末期左心室前壁厚度(LVAW；d)，mm；舒张末期左心室后壁厚度(LVPW；d)，mm；舒张末期左心室内径(LVID；d)，mm；舒张末期左心室容积(LVVol；d)，μL；收缩末期左心室前壁厚度(LVAW；s)，mm；收缩末期左心室后壁厚度(LVPW；s)，mm；收缩末期左心室内径(LVID；s)，mm；收缩末期左心室容积(LVVol；s)，μL；左心室质量(LVM)，mg；左室射血分数(EF)，％；左室收缩指数(FS)，％。结果如图10和表1所示，超声检测结果显示五月及七月龄Prmt5-cKO小鼠收缩末期左心室后壁及前壁厚度均显著减少(图10中B和C)，舒张及收缩末期左心室容积均显著增大(图10中D和E)；左室射血分数及收缩指数均显著受损(图10中F和G)。这些指标均指示心肌细胞特异性敲除Prmt5引起了扩张型心肌病。
表1 Prmt5-cKO和Prmt5fl/fl小鼠M型超声结果(平均值±标准误)
Figure BDA0002928931560000091
注：*p<0.05，**p<0.01
上述实施例证明心肌细胞特异性敲除Prmt5引起心脏产生扩张型心肌病的病理特征。通过对心肌细胞特异性Prmt5敲除小鼠进行表型分析，发现敲除Prmt5会引起心脏室壁变薄、心腔扩张、心肌发生纤维化、收缩功能受损、病理性标志基因表达上升，最终导致小鼠死亡，这些表现与扩张型心肌病表现一致。
综上所述，这些数据表明，心肌细胞特异性Prmt5缺失会导致DCM，导致小鼠死亡；使用心肌细胞特异性Prmt5敲除小鼠成功构建了小鼠DCM模型。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种扩张型心肌病小鼠模型的构建方法及其应用
<130> GNCSQ210508
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8935
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
ggtacctcca ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcctgcaag gtcacacaag 60
ggtctccacc caccaggtgc cctagtctca atttcagttt ccatgccttg ttctcacaat 120
gctggcctcc ccagagctaa tttggacttt gtttttattt caaaagggcc tgaatgagga 180
gtagatcttg tgctacccag ctctaagggt gcccgtgaag ccctcagacc tggagccttt 240
gcaacagccc tttaggtgga agcagaataa agcaattttc cttaaagcca aaatcctgcc 300
tctagactct tcttctctga cctcggtccc tgggctctag ggtggggagg tggggcttgg 360
aagaagaagg tggggaagtg gcaaaagccg atccctaggg ccctgtgaag ttcggagcct 420
tccctgtaca gcactggctc atagatcctc ctccagccaa acatagcaag aagtgatacc 480
tcctttgtga cttccccagg cccagtacct gtcaggttga aacaggattt agagaagcct 540
ctgaactcac ctgaactctg aagctcatcc accaagcaag cacctaggtg ccactgctag 600
ttagtatcct acgctgataa tatgcagagc tgggccacag aagtcctggg gtgtaggaac 660
tgaccagtga cttttcagtc ggcaaaggta tgaccccctc agcagatgta gtaatgtccc 720
cttagatccc atcccaggca ggtctctaag aggacatggg atgagagatg tagtcatgtg 780
gcattccaaa cacagctatc cacagtgtcc cttgcccctt ccacttagcc aggaggacag 840
taaccttagc ctatctttct tcctccccat cctcccagga cacaccccct ggtctgcagt 900
attcatttct tccttcacgt cccctctgtg acttccattt gcaaggcttt tgacctctgc 960
agctgctgga agatagagtt tggccctagg tgtggcaagc catctcaaga gaaagcagac 1020
aacaggggga ccagattttg gaaggatcag gaactaaatc actggcgggc ctgggggtag 1080
aaaaaagagt gagtgagtcc gctccagcta agccaagcta gtccccgaga tactctgcca 1140
cagctgggct gctcggggta gctttaggaa tgtgggtctg aaagacaatg ggattggaag 1200
acatctcttt gagtctcccc tcaaccccac ctacagacac actcgtgtgt ggccagactc 1260
ctgttcaaca gccctctgtg ttctgaccac tgagctaggc aaccagagca tgggccctgt 1320
gctgaggatg aagagttggt taccaatagc aaaaacagca ggggagggag aacagagaac 1380
gaaataagga aggaagaagg aaaggccagt caatcagatg cagtcagaag agatgggaag 1440
ccaacacaca gcttgagcag aggaaacaga aaagggagag attctgggca taaggaggcc 1500
acagaaagaa gagcccaggc cccccaagtc tcctctttat accctcatcc cgtctcccaa 1560
ttaagcccac tcttcttcct agatcagacc tgagctgcag cgaagagacc cgtagggagg 1620
atcacactgg atgaaggaga tgtgtggaga agtccaggga acctaagagc cagagcctaa 1680
aagagcaaga gataaaggtg cttcaaaggt ggccaggctg tgcacacaga gggtcgagga 1740
ctggtggtag agcctcaaga taaggatgat gctcagaatg ggcggggggg gggattctgg 1800
gggggggaga gagaaggtga gaaggagcct ggaacagaga atctggaagc gctggaaacg 1860
ataccataaa gggaagaacc caggctacct ttagatgtaa atcatgaaag acagggagaa 1920
gggaagctgg agagagtaga aggaccccgg ggcaagacat ggaagcaagg acaagccagg 1980
ttgagcgctc cgtgaaatca gcctgctgaa ggcagagccc tggtatgagc accagaacag 2040
cagaggctag ggttaatgtc gagacaggga acagaaggta gacacaggaa cagacagaga 2100
cgggggagcc aggtaacaaa ggaatggtcc ttctcacctg tggccagagc gtccatctgt 2160
gtccacatac tctagaatgt tcatcagact gcagggctgg cttgggaggc agctggaaag 2220
agtatgtgag agccagggga gacaaggggg cctaggaaag gaagaagagg gcaaaccagg 2280
ccacacaaga gggcagagcc cagaactgag ttaactcctt ccttgttgca tcttccatag 2340
gaggcagtgg gaactctgtg accaccatcc cccatgagcc cccactaccc ataccaagtt 2400
tggcctgagt ggcattctag gttccctgag gacagagcct ggcctttgtc tcttggacct 2460
gacccaagct gacccaatgt tctcagtacc ttatcatgcc ctcaagagct tgagaaccag 2520
gcagtgacat attaggccat gggctaaccc tggagcttgc acacaggagc ctcaagtgac 2580
ctccagggac acagctgcag acaggtggcc tttatcccca aagagcaacc atttggcata 2640
ggtggctgca aatgggaatg caaggttgaa tcaggtccct tcaagaatac tgcatgcaag 2700
acctaagacc cctggagaga ggggtatgct cctgccccca cccaccataa ggggagtgaa 2760
ctatcctagg gggctggcga ccttggggag acaccacatt actgagagtg ctgagcccag 2820
aaaaactgac cgccctgtgt cctgcccacc tccacactct agagctatat tgagaggtga 2880
cagtagatag ggtgggagct ggtagcaggg agagtgttcc tgggtgtgag ggtgtagggg 2940
aaagccagag caggggagtc tggctttgtc tcctgaacac aatgtctact tagttataac 3000
aggcatgacc tgctaaagac ccaacatcta cgacctctga aaagacagca gccctggagg 3060
acaggggttg tctctgagcc ttgggtgctt gatggtgcca caaaggaggg catgagtgtg 3120
agtataaggc cccaggagcg ttagagaagg gcacttggga aggggtcagt ctgcagagcc 3180
cctatccatg gaatctggag cctggggcca actggtgtaa atctctgggc ctgccaggca 3240
ttcaaagcag cacctgcatc ctctggcagc ctggggaggc ggaagggagc aaccccccac 3300
ttataccctt tctccctcag ccccaggatt aacacctctg gccttccccc ttcccacctc 3360
ccatcaggag tggagggttg cagagggagg gtaaaaacct acatgtccaa acatcatggt 3420
gcacgatata tggatcagta tgtgtagagg caagaaagga aatctgcagg cttaactggg 3480
ttaatgtgta aagtctgtgt gcatgtgtgt gtgtctgact gaaaacgggc atggctgtgc 3540
agctgttcag ttctgtgcgt gaggttacca gactgcaggt ttgtgtgtaa attgcccaag 3600
gcaaagtggg tgaatccctt ccatggttta aagagattgg atgatggcct gcatctcaag 3660
gaccatggaa aatagaatgg acactctata tgtgtctcta agctaaggta gcaaggtctt 3720
tggaggacac ctgtctagag atgtgggcaa cagagactac agacagtatc tgtacagagt 3780
aaggagagag aggagggggt gtagaattct cttactatca aagggaaact gagtcgtgca 3840
cctgcaaagt ggatgctctc cctagacatc atgactttgt ctctggggag ccagcactgt 3900
ggaacttcag gtctgagaga gtaggaggct cccctcagcc tgaagctatg cagatagcca 3960
gggttgaaag ggggaaggga gagcctggga tgggagcttg tgtgttggag gcaggggaca 4020
gatattaagc ctggaagaga aggtgaccct tacccagttg ttcaactcac ccttcagatt 4080
aaaaataact gaggtaaggg cctgggtagg ggaggtggtg tgagacgctc ctgtctctcc 4140
tctatctgcc catcggccct ttggggagga ggaatgtgcc caaggactaa aaaaaggcca 4200
tggagccaga ggggcgaggg caacagacct ttcatgggca aaccttgggg ccctgctgtc 4260
ctcctgtcac ctccagagcc aagggatcaa aggaggagga gccaggacag gagggaagtg 4320
ggagggaggg tcccagcaga ggactccaaa tttaggcagc aggcatatgg gatgggatat 4380
aaaggggctg gagcactgag agctgtcaga gatttctcca acccaggtaa gagggagttt 4440
cgggtggggg ctcttcaccc acaccagacc tctccccacc tagaaggaaa ctgcctttcc 4500
tggaagtggg gttcaggccg gtcagagatc tgacagggtg gccttccacc agcctgggaa 4560
gttctcagtg gcaggaggtt tccacaagaa acactggatg ccccttccct tacgctgtct 4620
tctccatctt cctcctgggg atgctcctcc ccgtcttggt ttatcttggc tcttcgtctt 4680
cagcaagatt tgccctgtgc tgtccactcc atctttctct actgtctccg tgccttgcct 4740
tgccttcttg cgtgtccttc ctttccaccc atttctcact tcaccttttc tccccttctc 4800
atttgtattc atccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt 4860
tctcccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttcctgtg tcagagtgct 4920
gagaatcaca cctggggttc ccacccttat gtaaacaatc ttccagtgag ccacagcttc 4980
agtgctgctg ggtgctctct taccttcctc accccctggc ttgtcctgtt ccatcctggt 5040
caggatctct agattggtct cccagcctct gctactcctc ttcctgcctg ttcctctctc 5100
tgtccagctg cgccactgtg gtgcctcgtt ccagctgtgg tccacattct tcaggattct 5160
ctgaaaagtt aaccaggtga gaatgtttcc cctgtagaca gcagatcacg attctcccgg 5220
aagtcaggct tccagccctc tctttctctg cccagctgcc cggcactctt agcaaacctc 5280
aggcaccctt accccacata gacctctgac agagaagcag gcactttaca tggagtcctg 5340
gtgggagagc cataggctac ggtgtaaaag aggcagggaa gtggtggtgt aggaaagtca 5400
ggacttcaca tagaagccta gcccacacca gaaatgacag acagatccct cctatctccc 5460
ccataagagt ttgagtcgac ctgcagccca agctgtaccc cctcgaaact gacaggagaa 5520
ccaccatggg cccaaagaag aagagaaagg tttcgaattt actgaccgta caccaaaatt 5580
tgcctgcatt accggtcgat gcaacgagtg atgaggttcg caagaacctg atggacatgt 5640
tcagggatcg ccaggcgttt tctgagcata cctggaaaat gcttctgtcc gtttgccggt 5700
cgtgggcggc atggtgcaag ttgaataacc ggaaatggtt tcccgcagaa cctgaagatg 5760
ttcgcgatta tcttctatat cttcaggcgc gcggtctggc agtaaaaact atccagcaac 5820
atttgggcca gctaaacatg cttcatcgtc ggtccgggct gccacgacca agtgacagca 5880
atgctgtttc actggttatg cggcggatcc gaaaagaaaa cgttgatgcc ggtgaacgtg 5940
caaaacaggc tctagcgttc gaacgcactg atttcgacca ggttcgttca ctcatggaaa 6000
atagcgatcg ctgccaggat atacgtaatc tggcatttct ggggattgct tataacaccc 6060
tgttacgtat agccgaaatt gccaggatca gggttaaaga tatctcacgt actgacggtg 6120
ggagaatgtt aatccatatt ggcagaacga aaacgctggt tagcaccgca ggtgtagaga 6180
aggcacttag cctgggggta actaaactgg tcgagcgatg gatttccgtc tctggtgtag 6240
ctgatgatcc gaataactac ctgttttgcc gggtcagaaa aaatggtgtt gccgcgccat 6300
ctgccaccag ccagctatca actcgcgccc tggaagggat ttttgaagca actcatcgat 6360
tgatttacgg cgctaaggat gactctggtc agagatacct ggcctggtct ggacacagtg 6420
cccgtgtcgg agccgcgcga gatatggccc gcgctggagt ttcaataccg gagatcatgc 6480
aagctggtgg ctggaccaat gtaaatattg tcatgaacta tatccgtaac ctggatagtg 6540
aaacaggggc aatggtgcgc ctgctggaag atggcgatta gccattaacg cggcgtggta 6600
cctctagagt cgacccgggc ggcctcgaga gatctacggg tggcatccct gtgacccctc 6660
cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaac 6720
cattaacgcg cgaccagctt gatatcgaat tcctgcagcc cgggggatcc actagtccga 6780
tcccaaggcc caactccccg aaccactcag ggtcctgtgg acagctcacc tagctgcaat 6840
ggctacaggt aagcgcccct aaaatccctt tgggcacaat gtgtcctgag gggagaggca 6900
gcgacctgta gatgggacgg gggcactaac cctcaggttt ggggcttctg aatgtgagta 6960
tcgccatgta agcccagtat ttggccaatc tcagaaagct cctggtccct ggagggatgg 7020
agagagaaaa acaaacagct cctggagcag ggagagtgct ggcctcttgc tctccggctc 7080
cctctgttgc cctctggttt ctccccaggc tcccggacgt ccctgctcct ggcttttggc 7140
ctgctctgcc tgccctggct tcaagagggc agtgccttcc caaccattcc cttatccagg 7200
ctttttgaca acgctatgct ccgcgcccat cgtctgcacc agctggcctt tgacacctac 7260
caggagtttg taagctcttg gggaatgggt gcgcatcagg ggtggcagga aggggtgact 7320
ttcccccgct gggaaataag aggaggagac taaggagctc agggtttttc ccgaagcgaa 7380
aatgcaggca gatgagcaca cgctgagtga ggttcccaga aaagtaacaa tgggagctgg 7440
tctccagcgt agaccttggt gggcggtcct tctcctagga agaagcctat atcccaaagg 7500
aacagaagta ttcattcctg cagaaccccc agacctccct ctgtttctca gagtctattc 7560
cgacaccctc caacagggag gaaacacaac agaaatccgt gagtggatgc cttctcccca 7620
ggcggggatg ggggagacct gtagtcagag cccccgggca gcacagccaa tgcccgtcct 7680
tcccctgcag aacctagagc tgctccgcat ctccctgctg ctcatccagt cgtggctgga 7740
gcccgtgcag ttcctcagga gtgtcttcgc caacagcctg gtgtacggcg cctctgacag 7800
caacgtctat gacctcctaa aggacctaga ggaaggcatc caaacgctga tgggggtgag 7860
ggtggcgcca ggggtcccca atcctggagc cccactgact ttgagagctg tgttagagaa 7920
acactgctgc cctcttttta gcagtcaggc cctgacccaa gagaactcac cttattcttc 7980
atttcccctc gtgaatcctc caggcctttc tctacaccct gaaggggagg gaggaaaatg 8040
aatgaatgag aaagggaggg aacagtaccc aagcgcttgg cctctccttc tcttccttca 8100
ctttgcagag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag cagacctaca 8160
gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac gggctgctct 8220
actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg cagtgccgct 8280
ctgtggaggg cagctgtggc ttctagctgc ccgggtggca tccctgtgac ccctccccag 8340
tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat 8400
taagttgcat cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg 8460
tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg 8520
aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc 8580
aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc 8640
tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct 8700
ccaactccta atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg 8760
cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc tgattttaaa ataactatac cagcaggagg 8820
acgtccagac acagcatagg ctacctggcc atgcccaacc ggtgggacat ttgagttgct 8880
tgcttggcac tgtcctctca tgcgttgggt ccactcagta gatgcctgtt gaatt 8935
<210> 2
<211> 17878
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
tgtcccgcct cctggggact cttcaccgct tcgtgattgg actctagtat caaggaatcc 60
cggcgtgggc cgcgcgaggg aaaagatggc ggcgatggca gtcggaggtg ctggtggcag 120
ccgcgtgtcc agcgggaggg acctgaattg cgtccccgaa atagctgaca cactgggtgc 180
tgtggccaag caggggtgag ggccggactt ccgccagagg aatgcgggat ccaaatttgg 240
gaaacaagga gggcagacta gtcccctgca gggggtgagg gcttgagaca ccattactcc 300
ttgagtgggg aagacttcgg ccctaagaac gagaggatga aactctgggg gcggggggag 360
ggggcgcgtg tggtcactga gttaaaaaat caggggagtt ctagggtaaa aattaaaagg 420
gacgcacagt cattccttct ctagggcctt gaagactggg attatccgag agtagagaag 480
tataaagagg caatcgagag aagagtttaa tctggcttgg ggaggcatgg gcagtgttgg 540
gtcaagtcta actttgacag tcctggaaag ccagtgaagt cagggaagaa agaagctact 600
tggcttggat ttccatttct cgtttatctt ttcatgattg tgttttggga agaaattggt 660
gcacagtgta gtgaaagtga tgtgccccaa tatgggctga actccgtagc ccgtgggggt 720
gactggtggc tttatggaac tgtgcaaaat caaaatatta aacctagttg gttggatctc 780
tgggccctca ctttacatga tgcttctggg tctgtcgcgg ttgtaggttt gatttcctct 840
gcatgcctgt cttccacccg cgtttcaaga gggagttcat tcaggaacct gctaagaatc 900
ggcctggccc ccagacacga tcagacctac tgctgtcagg aaggggtagg gaccatcccc 960
tgtgcccctt aattattaga ggcaggaata tcttctgctt tataggactt aattctcctc 1020
ctcctctgac ttggttatct attggttagc ccctatgaca tagagaactc ttttttttct 1080
ttcctttcta aaagttgtag tcccctattc ttcatcaggc tatccctata tcagagacaa 1140
aaagtcttgt ctttcatctc tactctttat tctctgctga gaactagaaa ttgatcaaga 1200
acatgccaac tcccattgag tctttgtctt ctcttgggtt ggggatgcag actggaatac 1260
gctaattgtg ggaaagcttt ctccatggat tcatccagac tcaaaagtgg agaagatccg 1320
aaggaactct gaagcggtaa ggcagtttaa tttcttcgtg ggatcccttt aaaggttagg 1380
cctggcctgg gtgttggggc acctatctgc aatctcaagc gttgtgaggt tattcccaca 1440
tcaggaagat aatgagggag gattgagatt ccatgccagg agaagaaaag gaaaaaatta 1500
gttctgtcac taaactaggt caggagagta agctggtaaa tcagagtcca tctaaaagtg 1560
tctggaacga taggtgatgg ttcacatctg taatctcagc agggtccatc tccagcccag 1620
caaatcactg agttccaggc tagttagggc tgtaatctaa gaccctgttc caaaagggtt 1680
tggttctagc tcagtatggc agcttatagc tgtaatacag acactcagga gagtgaacca 1740
gccgggcatg gtggtgcacg cctttaatct cagcacttgg gaggcagagg caggcggatt 1800
tctgagttca aggccagcct ggtccaaaac caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaggga 1860
gagtgagcga ggtcagattc aaagtcaaac tgagttatat agagaattcc agaacagcct 1920
gggctacagt gtcagagcca gtttctgctg ctccctaccc taaaacccta gctcttaatt 1980
gttttctctt gtcttgtgtt tcaggctatg ttacaggagt tgaattttgg ggcatatctg 2040
ggtcttccag ctttcctatt gccccttaat caggaagata acacgaatct ggccagagtt 2100
ctgaccaacc acatccacac tggccaccac tcttccatgg tatgactgag ggttctttcc 2160
tgctctgtat catgatagct gtcccttttg cctagttaca ctcccagtgc atttggcaga 2220
attgaaatgt cagtgttgtt cattcctgac tccgcctaag tgtggtgtgc agaatgtttc 2280
agagcagtat atgtggggct agagacgtcg ctcagtggta gatcacttgc ctaacatacg 2340
tgagcctctg ggaacaaagg atagagaaat aaattatttc tgtttaaaat aaaagacaag 2400
ctaggtattt acacaaggat acgtatgaca tattaaacac gtgtaatcac atttagaaaa 2460
gcatataaag agattaactt gtgaacttga gggaagcttt ctggacctga tgagtgtgaa 2520
acagggtttt aacagggtac ctgttcatat gcagttctgg atgagggtac ccttggtggc 2580
cccagaggac ctgagagatg atgtaattga gaatgccccg actacacaca cagaggagta 2640
cagtggagaa gagaaaacat ggatgtggta tgtctccttt tgctgctgta ctgcgtgggg 2700
tggggtgagg gctatgggga actggtgggg cgtgttcttg agttataggt catatgcccc 2760
taacaggctc tttctttgtt tctgattctg ggcaggtggc ataactttcg gactctgtgt 2820
gactatagca agagaattgc agtaggtaag tccacaaggg ttctgagata tgagcggcct 2880
cctagaaatg agaatcaaca ggctgggcgt ggtggcccac cacctttcat tccagaacat 2940
gggaactgga gacaggtaga tctctgtgag tgtaattaaa gctagccttg tttatatagt 3000
gagttctagg atagccagga ctatgtcgac agaccctgtc tttaaaaaaa aaaaagaaag 3060
ccaagcagtg gtggcacacg cctttagtcc ctgcacttag gaggtagagg caggcaagtc 3120
tctacaagtc tgaggccagc ctggtctaca gattaagttc cagggcagtt aagcctacac 3180
agagagacct tatctcaaac aaaagtaaga atgggcagtt tagaacgttc caggacagtc 3240
agggttacac agaaagacca tggctttaaa aagaaaaatt aacagtttcg ggcctggaga 3300
gatggctcag tgtttaaaag tgcttgttgc tctatttttg aggatcaaag ttgagatacc 3360
aggacccaca ctgggttgct cacaactgca tgttaactct agctccagga gatctggtgc 3420
cctcttctgg cctccatggg ggaactgcac acacatggca catatacaga acacacacat 3480
atgaataaaa atgaatgtaa atattaaagg cgcataacga taccacgata tcaacaagtt 3540
tgtacaaaaa agcaggctgg cgccggaacc gaagttccta ttccgaagtt cctattctct 3600
agaaagtata ggaacttcga accctttccc acaccaccct ccacacttgc cccaaacact 3660
gccaactatg taggaggaag gggttgggac taacagaaga acccgttgtg gggaagctgt 3720
tgggagggtc actttatgtt cttgcccaag gtcagttggg tggcctgctt ctgatgaggt 3780
ggtcccaagg tctggggtag aaggtgagag ggacaggcca ccaaggtcag cccccccccc 3840
ctatcccata ggagccaggt ccctctcctg gacaggaaga ctgaagggga gatgccagag 3900
actcagtgaa gcctggggta ccctattgga gtccttcaag gaaacaaact tggcctcacc 3960
aggcctcagc cttggctcct cctgggaact ctactgccct tgggatcccc ttgtagttgt 4020
gggttacata ggaaggggga cgggattccc cttgactggc tagcctactc ttttcttcag 4080
tcttctccat ctcctctcac ctgtctctcg accctttccc taggatagac ttggaaaaag 4140
ataaggggag aaaacaaatg caaacgaggc cagaaagatt ttggctgggc attccttccg 4200
ctagctttta ttgggatccc ctagtttgtg ataggccttt tagctacatc tgccaatcca 4260
tctcattttc acacacacac acaccacttt ccttctggtc agtgggcaca tgtccagcct 4320
caagtttata tcaccacccc caatgcccaa cacttgtatg gccttgggcg ggtcatcccc 4380
ccccccaccc ccagtatctg caacctcaag ctagcttggg tgcgttggtt gtggataagt 4440
agctagactc cagcaaccag taacctctgc cctttctcct ccatgacaac caggtcccag 4500
gtcccgaaaa ccaaagaaga agaaccctaa caaagaggac aagcggcctc gcacagcctt 4560
cactgctgag cagctccaga ggctcaaggc tgagtttcag accaacaggt acctgacaga 4620
gcagcggcgc cagagtctgg cacaggagct cggtacccgg aagatctgga ctctagagaa 4680
ttccgcccct ctccctcccc cccccctaac gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc 4740
cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg 4800
gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc 4860
aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga 4920
agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg 4980
tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag 5040
tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc 5100
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cggtgcacat gctttacatg tgtttagtcg aggttaaaaa acgtctaggc cccccgaacc 5220
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cccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 5340
gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 5400
tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgctttg cctggtttcc ggcaccagaa 5460
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tgcgatgtcg gtttccgcga ggtgcggatt gaaaatggtc tgctgctgct gaacggcaag 6300
ccgttgctga ttcgaggcgt taaccgtcac gagcatcatc ctctgcatgg tcaggtcatg 6360
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cgctgttcgc attatccgaa ccatccgctg tggtacacgc tgtgcgaccg ctacggcctg 6480
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cgtaatcacc cgagtgtgat catctggtcg ctggggaatg aatcaggcca cggcgctaat 6660
cacgacgcgc tgtatcgctg gatcaaatct gtcgatcctt cccgcccggt gcagtatgaa 6720
ggcggcggag ccgacaccac ggccaccgat attatttgcc cgatgtacgc gcgcgtggat 6780
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gataacgagc tcctgcactg gatggtggcg ctggatggta agccgctggc aagcggtgaa 7260
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ccggagagcg ccgggcaact ctggctcaca gtacgcgtag tgcaaccgaa cgcgaccgca 7380
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gtgacgctcc ccgccgcgtc ccacgccatc ccgcatctga ccaccagcga aatggatttt 7500
tgcatcgagc tgggtaataa gcgttggcaa tttaaccgcc agtcaggctt tctttcacag 7560
atgtggattg gcgataaaaa acaactgctg acgccgctgc gcgatcagtt cacccgtgca 7620
ccgctggata acgacattgg cgtaagtgaa gcgacccgca ttgaccctaa cgcctgggtc 7680
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gatacacttg ctgatgcggt gctgattacg accgctcacg cgtggcagca tcaggggaaa 7800
accttattta tcagccggaa aacctaccgg attgatggta gtggtcaaat ggcgattacc 7860
gttgatgttg aagtggcgag cgatacaccg catccggcgc ggattggcct gaactgccag 7920
ctggcgcagg tagcagagcg ggtaaactgg ctcggattag ggccgcaaga aaactatccc 7980
gaccgcctta ctgccgcctg ttttgaccgc tgggatctgc cattgtcaga catgtatacc 8040
ccgtacgtct tcccgagcga aaacggtctg cgctgcggga cgcgcgaatt gaattatggc 8100
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ccagggccct ggcacccgtg cagaccctgg cccaccccac ctgggcgctc agtgcccaag 8760
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cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 9600
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 9660
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caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat 10440
cttatcatgt ctggatccgg gggtaccgcg tcgagaagtt cctattccga agttcctatt 10500
ctctagaaag tataggaact tcgtcgagat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt 10560
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catatgcctg cagttccacc tcttaggagg tggaggcagg aggatcagga gtttacagaa 10740
agctcagtgc tacattgggt tacctgagac ccactctaaa aatagaacca gccctggcca 10800
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tgatctgtgt tatctgaagg gccagcccat aagctcccac aaccaggact ggaggtggct 11760
gttagcccaa atgacctctc agctctttgt ctggccaaga ccacactgat ccttaagcta 11820
gtccttgtag cctatctcta aacccatgta cctggagctg agttttgata catttaagct 11880
ttctcgtgca ccagggattg tattacacca gggaacttcc caccaaactg tactgtgttt 11940
aaacatgctg gcaataaact gcctggcatc acactctcaa gtttggtcca gcctaggtca 12000
ggatgcactg agttctcatt gtcacattgc catggattat ttcctgctcc tgtgatgcct 12060
acagggaccc caccccctcc tccaccccca ccctcaccca cacttgtgga cctttgtgtt 12120
agcatatgag gactttataa atttatgaaa gccctgcctt ttttggtact gggacagatg 12180
ctgggcagct gttggtatgg gttttatttt atgttggggc ttttggttat aaagtataat 12240
gtctgagaat ggtggtttgt gggcttgctc tcatgctctg acttttcaca cagttggaag 12300
tgcagtttat catcacggga accaaccacc actcagagaa ggagttctgt tcctacctcc 12360
agtacttgga atacttaagc caaaatcgcc ctccacccaa tgcctatgag ctctttgcca 12420
aaggctatga agactatctg cagtccccac tccaggtagg tgtggagagc actactggtg 12480
acagagggga ccacagagat gactaagagc tcagagccca ggcttctcgt cccggggact 12540
tgtatttggt tcctagcact cacatggtgg ctcccagctg taactccagc tccagaggac 12600
caggtgctct cagtgccttc tccccaggca ctgcctgtgc atgtggtgca cagacttaca 12660
cgcaggcaga atacccacgc acatacatgt ttttaattga aaagtcaata gtaattgtaa 12720
taatacccag acataggacc aagaaatatc tcttaagagt agatggtcca ggtgggtcct 12780
accgaaattc aggaagcaat gggaaatttt tgatgtcttg gccatttgcc aaatactggc 12840
caacttgttc ttctgtctcc tctgtcagcc tctgatggac aatctggaat ctcagacata 12900
tgaagtgttt gaaaaggacc ccatcaaata ctctcaatat cagcaggtat ggtgttggct 12960
tccgcggggc aaagcacagg gccaggataa ggtcagtaaa gaagggctca cagctgtgag 13020
gttttctgtc tttcccctca ggctatttat aaatgtttgc tagaccgagt accagaagaa 13080
gaaaaggaga ccaatgtcca gtgagtactg tccttttgtt cccaggggct ggtgcgcctg 13140
cccgtccctc tgctcagtct gcttgacttt gcccttttcc ttagggtact tatggtgctg 13200
ggtgcaggcc ggggtcctct tgtgaatgcg tctcttcggg cagccaaaca ggccgagcgg 13260
cggatcaggc tgtatgctgt ggagaagaac cccaatgctg tggtgacgtg agtagcaact 13320
tgattgctgg gcagcttgtc ctggtccccg tttccagccg aagtctttct tactctgtca 13380
cctctgattt caggctagag aactggcagt ttgaagaatg ggggagccag gtgacagttg 13440
tctcatcaga catgcgggaa tgggtggctc cggagaaagc tgacatcatt gtcagtgagc 13500
ttctgggttc ctttgccgac aacgagctgt cacctgagtg tctggatgga gcacagcact 13560
tcctgaaagg tttgtccagg ttggggggaa accatatggc tgcgaactgc tgcttgctag 13620
agtcaaaaaa tctacaagta gccgggcgtg gtggcgcacg cctttaaacc cagcactcgg 13680
gaggcagagg caggcggatt tctgagttcg aggccagcct ggtctacaaa atgagctcca 13740
ggacagccag agctataaag agaaaccctg tctcaaacaa acaaacaaac aaaaaaaaaa 13800
tctacaagtg agctggccag tggtagcgca cgcctttaat cccagcactt gggaggcaga 13860
agcaggtggg tttctgagtt caaggccagc ctggtctaca aagtgagttc caggacagct 13920
agggctgcac agagaaaccc tgcctcgaaa aacaaaccaa accaagccaa aacaagatct 13980
gcaagtgggt ggactagaga ttccctaggg tctgtgggct cggaaggtat ctgtggagca 14040
tttatctgaa atgaggctct gggtgtgatc gctaccttgg gcttaatgtt tgttgggaac 14100
tttatggggt gctgtgatcc ccactgggtt agagtgcagt cagaccttgc ctagtgatgc 14160
tcggcagcag cagcgggctg tgtgtgtgat gtggtcccac aggattgtgt cagcaggtac 14220
ctcgtagtcc tcttagtttg tgtaaggact attgttttca cagagctggg ctctaatagc 14280
ccagagtgtg ttctgttgct aaacagtgca tggctctatg ttggtggttt ttacctttaa 14340
cctatggctc taacttagta agagtgggat tcctgtgacc cagtagcctg tgctccggcc 14400
gtgtccatag caaccttggc ttgttccggt ctttgagcct tcagctgctg taaaaacgcc 14460
atttccctcc ttctgggaac tgatttgacc ctgtggctgt gcagatgatg gcgtgagcat 14520
ccctggagaa tacacctcct tcctggctcc catttcttcc tctaagctgt acaatgaggt 14580
ccgtgcctgt cgggaaaagg accgcgatcc tgaggtaaag agctgctttt ctaggagggg 14640
ctattcttta gtcttctcta ctgtcttcct ctgaagtcga tgaaggtgga agagaagctg 14700
ggggtgaaga aggtggttga aataaagcgg tgttcttgtt tgtttctttg gtgctggagc 14760
cccagcgttc tctgtctatc tcctgaagtt gttgttttct ccctggacag gcacagtttg 14820
agatgcctta tgtggttcgg ttgcacaact tccaccagct ctctgctcct aagccctgct 14880
ttaccttcag ccatcccaac cgaggtaggt tcacgcgtgg ctcttctgac cgagctcccc 14940
gcgtctgcag ctctggccct ccagtgctag agcttattca agtttgccga gtcgctcagg 15000
ggttttggcc ccttgtcatc catccaccat ctttcctgac agatcctatg attgacaaca 15060
accgctactg taccttggag tttcctgtgg aggtgaacac agtgcttcat ggcttcgcag 15120
gctactttga gactgtgctt taccgggaca tcactctgag tgagtgtctg ggacagtgta 15180
tgagcgcatt agcatgggtg actctggttc ggcctgcatg tctttggggg ctgtttcaca 15240
aagcttcctc tgttcctcca tggcttgtta gctgagtact agccgaggtt agctgagtac 15300
tagctgaggt tagctgagta ctagctgagg ttactgccag tcccaatcca gcacagtagc 15360
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cagtggtgtt cttctcctgt ccctcagcta gttggctgtg acccatgttc tgttctgtca 15660
cttgctctgc agtcctcttg gggataccca agtaagctac ctggactccc cacatctcca 15720
gcctctcttg tccagtcttt acctggaaga gggatgaatt ttacattatt tgagtttgcc 15780
tttctatcta agcccctcag caccttccca ctgccctcag gtgagagctg gcttggtggg 15840
ttggcttcca gttctctctg ctttgcctgt gaggttcctt gttcatgtct ccaccctgct 15900
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taggccagct tcctcttgag tgctttcatg gctcccttcc tgtacagtgt ttactgtgtc 16020
cttgtcactg tccgggggtt ccatattttg acaggatagc taacttttat gagagtcaat 16080
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tgccccagaa gagggcatct gatttaatta cagatggttg tgagccacca tgtgattgct 16200
gggatttgaa ctcaggacct caggaagagc agtcagagct cttaaccact gagccatcac 16260
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gggtgttggg ttataggttt gtccctacac ttggctgttt attgtctaat ctctgtctgt 16440
cccaccatca ttgccaagta caattcctca ttcaagccgc ctgtgtcttt cgtattacag 16500
cagcccatca cggtgcacga aggccagaac atctgtgtgc gtttctggcg atgcagcaat 16560
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cagagctccc caggggtcag gagagaaagc gaaggctgtg gaagagcccg ggctgcgtgc 17160
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tggtaacctg tgaggttctg agtcctgctc atgctgcgtt cgaccccatg tgtcaagccc 17460
ttcagccccg ccccgcccct aggacctctg gttatatgct ttttctgtat ggtccattaa 17520
gtccatttgt tgatttctct aggaaagaga cactgtgggg atatgactaa agctcgctag 17580
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attcctccat tttgcagaag ggaaatttga agtctgtaca gtgaaatgtt actacctttc 17700
caaacatctc taacagccag taactttttg gaatagtgca gggagtgggc agctgaagtg 17760
tccaggagtt ttggaaaacc taagaaagtg agggttggca ccatcagttc tttttagaac 17820
aatactgcag aactcgtgtc agccaagaaa ttatctcagt taacatttgc aatagggg 17878

Claims (7)

1.一种构建扩张型心肌病小鼠模型的方法，包括特异性敲除小鼠心肌细胞的Prmt5基因，得到所述扩张型心肌病小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述特异性敲除小鼠心肌细胞中Prmt5基因为特异性敲除受体小鼠心肌细胞基因组中Prmt5基因中的第七外显子。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于：所述特异性敲除小鼠心肌细胞中Prmt5基因包括采用Cre/loxP系统特异性敲除所述受体小鼠心肌细胞的Prmt5基因。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述扩张型心肌病小鼠模型的构建方法包括如下步骤：
将Prmt5 fl/fl小鼠和α-MHC-Cre小鼠交配得到F1代小鼠；
所述Prmt5 fl/fl小鼠是将C57BL/6J小鼠的Prmt5基因替换为Prmt5 fl等位基因的纯合子小鼠；所述Prmt5基因所在基因组序列是GenBank Accession No. NC_000080（Update Date2020-09-22）的第54744639-54754927位核苷酸序列的互补序列，将第54754927位核苷酸记为Prmt5基因的第1位核苷酸，所述Prmt5 fl等位基因是将基因组序列GenBank AccessionNo. NC_000080（Update Date 2020-09-22）的第54744027-54754899位核苷酸序列的互补序列（将第54754899位核苷酸记为第1位核苷酸）替换为如下DNA分子得到的等位基因：缺失序列表中SEQ ID No.2的第3571位至第10474位核苷酸，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；最后保持所述Prmt5基因的其它核苷酸序列不变得到的Prmt5基因突变体；
所述α-MHC-Cre小鼠为心肌细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠；
选择所述F1代小鼠中的双阳性杂合子小鼠，命名为α-MHC-Cre;Prmt5 fl/+小鼠，所述α-MHC-Cre；Prmt5 fl/+小鼠的一条染色体携带所述Prmt5基因，另一条染色体携带所述Prmt5 fl等位基因，且所述α-MHC-Cre；Prmt5 fl/+小鼠在心肌细胞特异性表达Cre重组酶；
所述α-MHC-Cre;Prmt5 fl/+小鼠和所述Prmt5 fl/fl小鼠交配得到F2代小鼠；
选择所述F2代小鼠中的双阳性纯合子小鼠，命名为α-MHC-Cre;Prmt5 fl/fl小鼠，所述α-MHC-Cre;Prmt5 fl/fl小鼠为扩张型心肌病小鼠模型，所述α-MHC-Cre；Prmt5 fl/fl小鼠的两条染色体均携带所述Prmt5 fl等位基因，且所述α-MHC-Cre；Prmt5 fl/fl小鼠在心肌细胞特异性表达Cre重组酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述α-MHC-Cre小鼠携带包括α-MHC基因启动子和Cre重组酶基因的目的片段，所述α-MHC基因启动子启动所述Cre重组酶基因的表达。
6.权利要求1-5中任一权利要求中所述的扩张型心肌病小鼠模型在制备扩张型心肌病动物模型中的应用，其特征在于：所述扩张型心肌病小鼠模型的心肌细胞不表达Prmt5基因及其编码蛋白。
7.权利要求1-5中任一权利要求中所述的扩张型心肌病小鼠模型在筛选治疗扩张型心肌病药物中的应用。
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