JP2011518566A

JP2011518566A - Ａｂｉ１／ｈｓｓｈ３ｂｐ１コンディショナルノックアウトマウス

Info

Publication number: JP2011518566A
Application number: JP2011506500A
Authority: JP
Inventors: レスザックコトゥーラ，
Original assignee: ニューヨークブラッドセンター，インコーポレイテッド
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2011-06-30
Also published as: WO2009132357A1; IL208904A0; CA2719267A1; AU2009240404A1; EP2268821A1; US8110719B2; AU2009240404A2; US20090271883A1

Abstract

Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の条件的破壊を有する、遺伝的に操作したコンディショナルノックアウトマウスが、その作成および使用方法と共に開示される。一実施形態において、本発明は、体細胞および生殖細胞が、条件的に破壊されたＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を含むコンディショナルノックアウトマウスを提供し、ここで該破壊は、該マウスが検出可能なレベルのＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質を産生できないことを引き起こす。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００８年４月２５日に出願された、米国仮特許出願第６１／０４８，１３０号（この全体の内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

発明の分野
本開示は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子に条件的欠失を有する、遺伝的に操作したコンディショナルノックアウトマウスおよび関連する方法に関連する。

腫瘍形成の共通のメカニズムの１つは、１つまたはそれ以上のいわゆる癌抑制遺伝子の不活性化である。癌抑制遺伝子（「腫瘍予防」または「抗腫瘍」遺伝子としても知られる）は、細胞の成長、分裂および増殖、細胞分化のような、多くの基本的な細胞過程の調節において、および細胞と他の細胞との、および細胞外環境とのコミュニケーションにおいて、重要な役割を果たしている。癌抑制遺伝子の不活性化は、通常特定の組織内の細胞増殖の調節において壊滅的な結果を有し、そして通常腫瘍の増殖を引き起こす。

腫瘍細胞の選択的増殖の利点は、多くの場合腫瘍抑制因子および癌遺伝子の対立する機能の機能的不均衡によって達成される。増殖因子受容体（表皮増殖因子受容体［ＥＧＦＲ］および血小板由来増殖因子受容体［ＰＤＧＦＲ］のような）、またはシグナル伝達分子（ＰＩ−３キナーゼ、ＲａｓまたはＭｙｃのような）のような癌遺伝子の機能の増加が、細胞の増殖可能性を促進する。これが腫瘍抑制因子の機能の低下と組み合わさり、そして不活性化変異によって安定化する場合、細胞は、問題の平衡を保つためのアポトーシスまたは老化のような保護的反応を無くし得る。染色体の転座のような遺伝的イベントを含む、さらなるゲノムの不安定性は、多くの場合変異の影響を安定化し、続いて抗アポトーシス、抗老化、そして増殖促進（ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）シグナルのさらなる増幅を引き起こす。

最近発見された、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＳ遺伝子ファミリーの染色体転座および癌抑制遺伝子の遺伝的変化は、前立腺腫瘍形成（ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）を引き起こす、新形成性形質転換の最もよくある原因である。公知の前立腺癌癌抑制遺伝子は、Ｐｔｅｎ、ｐ５３、Ｒｂ、Ｎｋｘ３．１、ＫＬＦ６、およびｐ２７を含む。しかし、原発性前立腺癌において、さらなる癌抑制遺伝子が不活性化されることが明らかである。ｍｕｌｔｉ−ｈｉｔ／ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ仮説によって、決定的な増殖／生存／アポトーシス経路を調節するいくつかの遺伝子が変化して、完全な浸透性前立腺癌を引き起こすに違いない。例えば、マウスにおいて、非浸潤性から高度に浸潤性の腫瘍への進行に関して、Ｐｔｅｎの喪失は、ｐ５３の喪失を伴わなければならない。同様の関係が、２番目のノックアウト遺伝子がＮｋｘ３．１またはｐ２７である、他のＰｔｅｎダブルノックアウトモデルにおいて見出された。

最近同定された前立腺癌癌抑制遺伝子は、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１であり、それは実験室の培養条件で、前立腺腫瘍細胞の増殖を阻害する。タンパク質である、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子産物の発現は、前立腺腫瘍を有する患者の何人かにおいて失われている。さらに、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１は、白血病の悪性過程に関与する、Ａｂｉ１キナーゼの機能を調節する。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の不活性化変異が、原発性腫瘍において見出された。

癌の新規治療の開発の成功は、標的臓器または組織の独特の解剖学的および生理学的特徴、および適当な間質−腫瘍相互作用、および適当な免疫学的反応を含む動物モデルを必要とする。遺伝的に操作したマウスは、これらの局面を提供する。標的遺伝子の、組織特異的発達的（Ｃｒｅリコンビナーゼ発現を促進する、発達的に調節される組織特異的プロモーターの使用によって）、または条件的（Ｃｒｅレトロウイルスベクターを促進するタモキシフェン応答性プロモーターの使用によって）破壊または過剰発現は、インサイツにおいてそれぞれ、ヒト腫瘍抑制因子の変異による不活性化または癌遺伝子の活性化によく似る。これは、遺伝子不活性化の初期の時点から、初期の病理組織学的変化による、および続いて腫瘍増殖およびもし起こるなら転移による、腫瘍形成の過程の評価を可能にする。異なるレベルの腫瘍抑制因子不活性化（１または２対立遺伝子ノックアウト、または低形質の産生、およびノックイン変異系統による）を評価する可能性は、細胞シグナル伝達経路および特異的前臨床モデルの産生の両方の理解を可能にする。

本開示は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の条件的破壊（ノックアウト）を有する、遺伝的に操作したマウスを含む。

そのゲノムがＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子において操作した条件的破壊に関してヘテロ接合性である、トランスジェニックノックアウトマウス、ここでヘテロ接合状態の当該操作した条件的破壊は、機能的なＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質の産生を阻害する。

１つの実施形態において、その体細胞および生殖細胞が、条件的に破壊されたＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を含むコンディショナルノックアウトマウスが提供され、ここでその破壊は、マウスが検出可能なレベルのＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質を産生できないことを引き起こす。

別の実施形態において、その条件的破壊は、そのマウスを、フリッパーゼ（ｆｌｉｐｐａｓｅ）またはＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと繁殖させることによって誘発される。別の実施形態において、そのコンディショナルノックアウトマウスは、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の少なくとも一部に隣接する、ネオマイシン遺伝子、ｆｒｔ部位およびｌｏｘＰ部位を含む、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１対立遺伝子を含む。

別の実施形態において、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の少なくとも一部は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子のエキソン１である。さらに別の実施形態において、その条件的破壊は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子のエキソン１において起こる。

そのコンディショナルノックアウトマウスの別の実施形態において、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子は、全てのマウスの組織において発現されない。さらに別の実施形態において、そのＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子は、マウスの前立腺組織のような、マウスの組織の一部のみにおいて発現されない。

そのコンディショナルノックアウトマウスの別の実施形態において、そのマウスは、細胞運動性の破壊、方向持続性の増加、遊走距離の減少、および遊走速度の減少からなる群より選択される、少なくとも１つの表現型を示す。

１つの実施形態において、開示されたコンディショナルノックアウトマウスから単離された細胞が提供される。別の実施形態において、その細胞は、マウスの前立腺組織由来である。

１つの実施形態において、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の一部を含む、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子コンディショナルノックアウト構築物が提供され、ここでＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子のエキソン１は、５’ｌｏｘＰ部位および３’選択マーカーカセットに隣接し、ここでその選択マーカーカセットは、ｆｒｔ部位および、３’ｆｒｔ部位の３’側および５’ｆｒｔ部位の３’側のｌｏｘＰ部位に隣接する。別の実施形態において、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子コンディショナルノックアウトは、配列番号第１４番の配列を有する。

１つの実施形態において、開示されたノックアウト遺伝子構築物を、マウス胚幹（ＥＳ）細胞の集団にトランスフェクトする工程；選択マーカーを発現するトランスフェクトしたＥＳ細胞を選択する工程；トランスフェクトしたＥＳ細胞を、そのマウスの祖先の胚に導入する工程；胚を満期まで発生させて、生殖系列にコンディショナルノックアウト構築物を有するキメラマウスを産生する工程；キメラマウスを繁殖させて、条件的に破壊可能なＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を有するヘテロ接合性マウスを産生する工程；およびヘテロ接合性マウスを、フリッパーゼまたはＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと繁殖させて、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子に破壊を有し、そして選択マーカーを含まないマウスを産生する工程を含む、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子において標的化条件的破壊を有するマウスを産生する方法が提供される。

図１は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１コンディショナルノックアウト（ＣＫＯ）マウスの構築を示す。図１Ａは、ノックアウト構築物の１つの実施形態を示す。図１Ｂは、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１マウスを産生するためのクローニング戦略を示す。標的化ベクターを構築するために使用される約１１．８ｋｂの領域を、まずポジティブに同定されたＢＡＣクローンからサブクローニングした。その領域を、短いホモロジーアーム（ＳＡ）がエキソン１の３’まで１．９ｋｂ伸長するよう設計した。長いホモロジーアーム（ＬＡ）は、エキソン１の５’側で終わり、そして約９ｋｂの長さであった。単一のｌｏｘＰ部位を、エキソン１の５’に挿入し、そしてｌｏｘＰ隣接ネオマイシン遺伝子カセットを、エキソン１の３’に挿入した。ネオマイシン遺伝子カセットは、２つのｆｒｔ部位によって、１つのｌｏｘＰ部位が５’ｆｒｔ部位の３’に結合した。その標的領域は０．９ｋｂであり、エキソン１を含んでいた。ｌｏｘＰ部位の位置の確認のため、および続く遺伝子型解析のために使用したプライマーの位置を示す：ａ、ｍＡｂｉ１ｌｏｘＰ３５’（配列番号第３番）；ｂ、ＤＬ７５’（配列番号第７番）；ｃ、ｍＡｂｉ１Ｉｎｔｒ１５’（配列番号第１５番）；ｄ、ＬＡＮ１（配列番号第１番）；ｅ、Ｎｅｏｇｅｎｅ１３’（配列番号第１６番）；ｆ、Ｆｌａｎｋｎｅｏ１３’（配列番号第４番）；ｇ、Ａ２（配列番号第２番）；ｈ、ＷＴ１（配列番号第１７番）；およびｉ、ＳＧ１（配列番号第１８番）。「ｈ」および「ｉ」プライマーセット（矢印）は、野生型Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子配列にのみ特異的である。図１は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１コンディショナルノックアウト（ＣＫＯ）マウスの構築を示す。図１Ａは、ノックアウト構築物の１つの実施形態を示す。図１Ｂは、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１マウスを産生するためのクローニング戦略を示す。標的化ベクターを構築するために使用される約１１．８ｋｂの領域を、まずポジティブに同定されたＢＡＣクローンからサブクローニングした。その領域を、短いホモロジーアーム（ＳＡ）がエキソン１の３’まで１．９ｋｂ伸長するよう設計した。長いホモロジーアーム（ＬＡ）は、エキソン１の５’側で終わり、そして約９ｋｂの長さであった。単一のｌｏｘＰ部位を、エキソン１の５’に挿入し、そしてｌｏｘＰ隣接ネオマイシン遺伝子カセットを、エキソン１の３’に挿入した。ネオマイシン遺伝子カセットは、２つのｆｒｔ部位によって、１つのｌｏｘＰ部位が５’ｆｒｔ部位の３’に結合した。その標的領域は０．９ｋｂであり、エキソン１を含んでいた。ｌｏｘＰ部位の位置の確認のため、および続く遺伝子型解析のために使用したプライマーの位置を示す：ａ、ｍＡｂｉ１ｌｏｘＰ３５’（配列番号第３番）；ｂ、ＤＬ７５’（配列番号第７番）；ｃ、ｍＡｂｉ１Ｉｎｔｒ１５’（配列番号第１５番）；ｄ、ＬＡＮ１（配列番号第１番）；ｅ、Ｎｅｏｇｅｎｅ１３’（配列番号第１６番）；ｆ、Ｆｌａｎｋｎｅｏ１３’（配列番号第４番）；ｇ、Ａ２（配列番号第２番）；ｈ、ＷＴ１（配列番号第１７番）；およびｉ、ＳＧ１（配列番号第１８番）。「ｈ」および「ｉ」プライマーセット（矢印）は、野生型Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子配列にのみ特異的である。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図２は、本明細書中で開示された、代表的な遺伝子および対立遺伝子の配列を示す。図２Ａは、５’ｌｏｘＰ（下線）および３’ｌｏｘＰ（二重下線）部位の両方、およびエキソン１（太い下線、コーディング鎖）を有する、ネオマイシン遺伝子を除去した後のＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’（太いおよび下線、配列番号第７番）、および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（太字、下線およびイタリック体、配列番号第４番）を示す。小文字の塩基は、フリッパーゼによるネオマイシン遺伝子の除去後に残るネオマイシンカセットのＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、全ての組換え要素を有し、そしてネオマイシン遺伝子を含む、ＡＢＬ−１全長条件的対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。長いホモロジーアームを太字で示し、エキソン１を強調し、短いホモロジーアームに下線を引き、単一のｌｏｘＰ部位を二重下線で示し、そしてｎｅｏカセットに隣接するｌｏｘＰ／ＦＲＴ部位を太い下線で示す。図２Ｃは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えによってできた、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ対立遺伝子のＤＮＡ配列を示す。組換えの結果として、エキソン１は欠失され、そして１つのｌｏｘＰ部位（下線）のみを含む。前向き配列決定プライマーＤＬ７５’および逆向き配列決定プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を示す（太字および下線）。コーディング鎖のみを図２Ｃで示す。図３は、ネオマイシン遺伝子カセット（Ｎｅｏ^＋／ｆｒｔ^＋／ｌｏｘＰ^＋）に関してプライマーＬＡＮ１（５’−ＣＣＡＧＡＧＧＣＣＡＣＴＴＧＴＧＴＡＧＣ−３’；配列番号第１番）およびＡ２（５’−ＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＧＡＴＡＧ−３’；配列番号第２番）を用いた、野生型対立遺伝子（Ｗｔ）（上のパネル、下のバンド）またはネオマイシン遺伝子および３’ｆｒｔ部位を欠くｌｏｘＰ導入Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１対立遺伝子（Ｎｅｏ⁻／ｆｒｔ⁻／ｌｏｘＰ^＋）（上のパネル、上のバンド）に関して、プライマーｍＡｂｉ１ｌｏｘＰ３５’（５’−ＡＡＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＡＴＧＡＣＡＧＣ−３’；配列番号第３番）およびＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（５’−ＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧ−３’；配列番号第４番）を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、Ｆ１Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１へテロ接合株の遺伝子型解析を示す。図４は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１^{ｌｏｘＰ／＋}（図４Ａ）およびＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１^{ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ}（Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１［ｆｌ／ｆｌ］；図４Ｂ）マウスから単離された、初代マウス胚線維芽細胞における、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の破壊を示す。図４は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１^{ｌｏｘＰ／＋}（図４Ａ）およびＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１^{ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ}（Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１［ｆｌ／ｆｌ］；図４Ｂ）マウスから単離された、初代マウス胚線維芽細胞における、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の破壊を示す。図５は、組換えＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子に関してホモ接合性のＭＥＦ細胞を同定するための、ＰＣＲに基づく遺伝子型解析を示す。図５Ａは、ＭＥＦ細胞スクリーニングのための遺伝子型解析コントロールを示す。ｆｒｔｄｅｌｅｔｏｒ株から得られ、そして野生型対立遺伝子のみを発現するゲノムＤＮＡ（下のバンド）、および野生型を発現するヘテロ接合性Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｆｌ／＋）動物、およびＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子（上のバンド）を、ＰＣＲ遺伝子型解析にかけた。図５Ｂは、ＭＥＦ細胞のスクリーニングを示す。ＭＥＦ細胞ＤＮＡサンプル（＃１−３４）を、ヘテロ接合性Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｆｌ／＋）動物の繁殖から生じたマウス胚から単離した。上のバンド、ｌｏｘＰ導入Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１対立遺伝子（Ｆｌｏｘｅｄ）；下のバンド、野生型対立遺伝子（Ｗｔ）。プライマーｍＡｂｉ１ｌｏｘＰ３５’およびＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を用いて遺伝子型解析を行った。図６は、ＭＥＦ＃３細胞系統サブクローンにおける、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質発現のＣｒｅリコンビナーゼによる喪失を示す。親ＭＥＦ＃３Ａｂｉ１（ｆｌ／ｆｌ）およびエキソン１欠失Ａｂｉ１（−／−）ＭＥＦ細胞系統における、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１発現のウェスタンブロット分析を、下のパネルに示す。示した細胞系統の細胞溶解物を、抗体７Ｂ６（Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１に特異的）でブロッティングした。クローン＃３−１から＃３−１１は、一時的なＣｒｅリコンビナーゼ発現の後に得られた親ＭＥＦ＃３のサブクローンを示す。Ａｂｉ１（＋／＋）ＭＥＦＷｔは、野生型Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を発現するマウス胚細胞を示す。添加コントロールは、上のパネルにおいてウェスタンブロッティング分析に使用したのと同じサンプルの、タンパク質染色ゲルの一部を示す。図７は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）刺激後の、コントロールおよび欠損ＭＥＦ細胞におけるＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の局在化を示す。コントロール（＃３）およびＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１−ＫＯ（＃３−１１）細胞系統を、ガラスカバーガラス上で増殖させ、飢餓状態にし、そしてＰＤＧＦで処理し、そして抗体およびファロイジンで免疫染色した。抗Ａｂｉ１／２抗体（Ｗ８．３）または抗Ａｂｉ１（４Ｅ２）抗体を使用した。図８は、末梢（図８Ａ）および背側（図８Ｂ）ラフリングの定量を示す。ＭＥＦコントロール（ｆｌ／ｆｌ）およびＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯを、ガラスのカバーガラス上にまき、そして一晩血清−飢餓状態にした。細胞をＰＤＧＦで刺激し、固定およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４結合ファロイジンで染色してＦ−アクチンを検出した。ＰＤＧＦ処理に反応して、異なる細胞形態を有する細胞のパーセンテージを、示したＭＥＦ細胞系統において定量した。背面環状および末梢ＰＤＧＦ誘発ラフリングを、独立に評価した。以下のカテゴリーのＰＤＧＦ反応の形態を記録した：ラフリングあり、ラフリングなし、または不明瞭な細胞形態。少なくとも１００個の細胞を分析し、そしてそれぞれの状態に関して分類した。カラムは、少なくとも３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして示した、それぞれの形態を有する細胞のパーセンテージである。＃３コントロールは、親ＭＥＦ＃３細胞系統を示す；＃３−６ＫＯ、＃３−８ＫＯおよび＃３−１１ＫＯは、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１発現を欠くＭＥＦ＃３サブクローンを示す；＃８は、親ＭＥＦ細胞系統を示す；＃８−７、＃８−１１は、ＭＥＦ＃８サブクローンを示す。図９は、ＰＤＧＦ誘発Ｒａｃ活性化を示す。示した親Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｆｌ／ｆｌ）およびＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ（−／−）細胞系統を、アッセイにおいて分析した。図１０は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１を欠くマウス胚線維芽細胞の細胞運動性の評価を示す。無作為な細胞運動性のパラメーター、遊走距離（図１０Ａ）、速度（図１０Ｂ）、および方向維持性（図１０Ｃ）を、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（Ｈｓｓｈｂ３ｐ１）ヌル細胞系統（クローン＃３−６および＃３−１１）およびＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入細胞（コントロール＃３、（ｆｌ／ｆｌ））において評価した。図１０は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１を欠くマウス胚線維芽細胞の細胞運動性の評価を示す。無作為な細胞運動性のパラメーター、遊走距離（図１０Ａ）、速度（図１０Ｂ）、および方向維持性（図１０Ｃ）を、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（Ｈｓｓｈｂ３ｐ１）ヌル細胞系統（クローン＃３−６および＃３−１１）およびＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入細胞（コントロール＃３、（ｆｌ／ｆｌ））において評価した。図１０は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１を欠くマウス胚線維芽細胞の細胞運動性の評価を示す。無作為な細胞運動性のパラメーター、遊走距離（図１０Ａ）、速度（図１０Ｂ）、および方向維持性（図１０Ｃ）を、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（Ｈｓｓｈｂ３ｐ１）ヌル細胞系統（クローン＃３−６および＃３−１１）およびＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入細胞（コントロール＃３、（ｆｌ／ｆｌ））において評価した。図１１は、創傷治癒遊走アッセイからのデータを示す。創傷閉鎖の速度を、時間の単位あたりの細胞によって覆われない面積を測定することによって決定した。データは、コントロール＃３（ｆｌ／ｆｌ）ＭＥＦ細胞と比較した、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ細胞系統（＃３−６および＃３−１１）の、４つの独立したアッセイの平均±ＳＤを示す（図１１Ａ）。図１１Ｂは、生きた細胞の観察からの代表的な顕微鏡写真を示す。図１１は、創傷治癒遊走アッセイからのデータを示す。創傷閉鎖の速度を、時間の単位あたりの細胞によって覆われない面積を測定することによって決定した。データは、コントロール＃３（ｆｌ／ｆｌ）ＭＥＦ細胞と比較した、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ細胞系統（＃３−６および＃３−１１）の、４つの独立したアッセイの平均±ＳＤを示す（図１１Ａ）。図１１Ｂは、生きた細胞の観察からの代表的な顕微鏡写真を示す。図１２は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ細胞におけるＷａｖｅ複合体の評価を示す。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ細胞系統のＭＥＦ細胞溶解物のウェスタンブロット分析。ＷＡＶＥ２、Ｎａｐ１、およびＳｒａ−１タンパク質レベルを、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１発現を欠く２つのクローン（＃３−６および＃３−１１）および親系統ＭＥＦ＃３から得た全細胞溶解物において、特異的抗体によって評価した。図１３は、Ａｂｉ１−／−およびＡｂｉ１＋／＋ＭＥＦ細胞におけるミトコンドリアデヒドロゲナーゼの活性を示す（^＊＊ｐ＜０．０１）。図１４は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の前立腺特異的破壊を示す。プロバシンプロモーター駆動Ｃｒｅリコンビナーゼ発現系統［Ｂ６．Ｄ２−Ｔｇ（Ｐｂｓｎ−Ｃｒｅ）４Ｐｒｂ］と、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｌｏｘＰ導入（ｆｌ／ｆｌ）系統の繁殖から得られた動物（オスのみ）を、ｌｏｘＰ導入Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１対立遺伝子の発現およびＣｒｅリコンビナーゼの発現に関して遺伝子型解析した。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する動物由来の前立腺組織（前側前立腺および後側前立腺）は、Ｃｒｅの発現に関して陰性の動物（ｌｏｘＰ導入）と対照的に、エキソン１の欠失（欠失）を示した。初代ＭＥＦ（ＲＡＲＡ１、ＲＡＲＡ３、およびＲＡＲＡ７）、親ＭＥＦ＃８（Ａｂｉ１（ｆｌ／ｆｌ））およびそのサブクローン細胞系統＃８−７および＃８−１１および親ＭＥＦ＃３およびそのサブクローン系統＃３−６、＃３−８、および＃３−１１も遺伝子型解析した。図１５は、症例３９８（図１５Ａおよび１５Ｂ）および４００（図１５Ｃおよび１５Ｄ）由来の、正常（図１５Ａおよび１５Ｃ）および悪性（図１５Ｂおよび１５Ｄ）前立腺組織の、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１に対するｍＡｂ２Ｇ８抗体による染色を示す。染色は、示した正常組織（図１５および１５Ｃ）および１０ｐ遺伝子座が欠失しなかった症例４００の腫瘍組織（図１５Ｄ）の両方において強力である。症例３９８由来の悪性組織における染色の完全な欠如（図１５Ｂ）に注意すること、それはまた１０ｐにおけるＨｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子座に隣接する配列の欠失を示した。大きなパネルを、×１００の倍率で示す；挿入図は×４００の倍率である。図１６は、ウサギ網状赤血球溶解物を用いた、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｃＤＮＡのインビトロ翻訳による、前立腺腫瘍細胞系統における、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のタンパク質短縮化試験を示す。ＰＣＲ産物のインビトロ翻訳後の反応混合物を、７％ＴｒｉｃｉｎｅＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離した；そのゲルを、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１に対するポリクローナル抗体Ａｂ−２でブロッティングした。レーン１、外来性ＤＮＡを加えない反応混合物；レーン２、ＬＮＣａＰ由来のＨｓｓｈ３ｂｐ１ｃＤＮＡを含む反応混合物；レーン３、ＰＣ３由来のＨｓｓｈ３ｂｐ１ｃＤＮＡを含む反応混合物。明らかに、ウサギ網状赤血球溶解物は、Ａｂ−２抗体反応性のバンドを含む（レーン１）。矢印は、ＰＣＲ分析（示していない）によって確認された、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のアイソフォーム２および３を表す全長Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ポリペプチドを示す。アスタリスクは、短縮化ポリペプチドを示す。

本開示は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の条件的破壊を有する、遺伝的に操作したマウス、および少なくとも１つの組織においてＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の発現を欠くマウスを含む。「Ｈｓｓｈ３ｂｐ１」という用語は、スペクトリンＳＨ３−結合タンパク質１（ＳＳＨ３ＢＰ１）遺伝子のクローンを指す。Ａｂｉ１という用語は、形質転換またはシグナル伝達において、Ａｂｌ機能の制御因子として作用する、Ａｂｌ相互作用物質（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）１（Ａｂｉ−１）タンパク質を指す。Ａｂｉ−１およびＨｓｓｈ３ｂｐ１は、同じタンパク質であると決定された。従って、本明細書中でその遺伝子をＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子と呼ぶ。

本明細書中で使用する場合、「ｌｏｘＰ導入（ｆｌｏｘｅｄ）」という用語は、２つのｌｏｘＰ部位の間にＤＮＡ配列を挟むことを指す。

本明細書中で使用する場合、「コンディショナルノックアウト」または「ＣＫＯ」という語句は、マウスを説明するために使用する場合、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子のエキソン１に隣接して挿入された選択マーカーを含むノックアウト構築物を含むマウスを指し、そしてここでその選択マーカーはｆｒｔ部位に隣接する。さらに、エキソン１の５’および選択マーカー３’ｆｒｔ部位の３’にｌｏｘＰ部位が存在する。さらなるｌｏｘＰ部位は、選択マーカー５’ｆｒｔ部位に対して３’である。コンディショナルノックアウトマウスは、機能的なＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を保持する。本明細書中で使用される、「ノックアウト」または「ＫＯ」という用語は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子のエキソン１が破壊されたマウス、またはマウスの組織を指し、そしてこのマウス、またはその特定の組織は、機能的なＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を有さない。

ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼは、ほとんどのヒト組織において発現し、そして細胞増殖および死の制御に関連していた。ＢＣＲ−Ａｂｌのような、ｃ−Ａｂｌの変異形態は、慢性骨髄性白血病およびいくつかの形態の急性リンパ性白血病のような、しかしそれに限らない、いくつかの形態の癌に関連していた。

Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１は、Ａｂｌキナーゼの生理学的阻害剤である。メシル酸イマチニブ（Ｉｍａｎｔｉｎｉｂｍｅｓｙｌａｔｅ）、ｃ−Ａｂｌキナーゼの阻害剤は、慢性骨髄性白血病および他の型の癌の有効な治療薬である。しかし、ＣＭＬを有するある患者は、メシル酸イマチニブ（ｉｍａｎｔｉｎｉｂ）による治療に抵抗性である。従って、この酵素を標的とする新規治療が必要である。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１に基づく化合物は、前立腺癌の治療に使用される可能性を有する。他の型の癌は、おそらくｃ−ＡｂｌチロシンキナーゼまたはＡｒｇチロシンキナーゼ（Ａｒｇチロシンキナーゼは、チロシンキナーゼのＡｂｌファミリーの２番目のメンバーである）が関与する。チロシンキナーゼのＡｂｌファミリーは、アクチンおよび微小管に基づく細胞骨格を調節し、そして細胞骨格を通して、細胞増殖、分裂、エンドサイトーシスおよび分化のような、基本的な細胞過程を調節する。これらの過程の忠実度の欠損が、多くの場合腫瘍形成（ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）の基礎となる。ＡｒｇおよびＡｂｌチロシンキナーゼは、特にＳＨ３、ＳＨ２およびキナーゼドメインにおいて、高度に保存された配列を有する。従って、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１はおそらく、Ａｂｌチロシンキナーゼファミリーの複数のメンバーの阻害剤の供給源である。

その配列がＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質由来であるペプチドは、インビトロにおいてｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害する（米国特許仮出願第６０／７４１，２０８号、および続く米国特許本出願第１２／０９５，７２８号およびＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／４５５７０を参照のこと、これらの開示は、本明細書中でそれらの全体が援用される）。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ペプチドのいくつかは、ｃ−Ａｂｌキナーゼによってリン酸化された、特異的なホスホチロシン残基を含む。ホスホチロシンを含む、および非リン酸化ペプチドは両方とも、ｃ−Ａｂｌキナーゼに対して阻害活性を有するが、これらのペプチドによるキナーゼ阻害のメカニズムは異なる。ホスホペプチドによるｃ−Ａｂｌキナーゼ阻害のメカニズムは、ペプチドの長さに依存して、ｃ−ＡｂｌＳＨ２ドメインへの結合、またはＡｂｌＳＨ２およびＳＨ３ドメイン両方への結合を含む。ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性におけるＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の決定的な役割は、調節性キナーゼを含む領域が欠損している細胞における、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の発現時の細胞増殖の阻害によって支持される。

本明細書中で記載された、コンディショナルノックアウトマウス、およびできた細胞系統は、癌の形成、進行およびふるまいにおけるＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の役割を研究するために有用である。さらに、ＣＫＯおよびＫＯマウス、およびできた細胞系統は、制限しない例、前立腺癌において、癌治療のための薬剤、または治療様式のスクリーニングにおいて有用である。

遺伝的に操作したＣＫＯマウスの作成は、ノックアウト構築物のような、特定のＤＮＡ配列を、マウスＤＮＡへ挿入することを含む。その挿入された配列は、通常マウスにおいて存在しない、２つのＤＮＡ特異的酵素、ｆｒｔリコンビナーゼ（フリッパーゼとしても知られる）およびＣｒｅリコンビナーゼによって認識される。Ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位と呼ばれ、そしてフリッパーゼ認識部位は、ｆｒｔ部位と呼ばれる。これらの酵素はそれぞれ、その認識部位に隣接するＤＮＡ配列を切断および除去し得る。このことは、その関心のある遺伝子の機能的ＤＮＡ配列が除去される場合、遺伝子機能の破壊を引き起こし得る。それに加えて、選択マーカー遺伝子をマウスに挿入し、その導入は、Ｃｒｅ組換えまたはフリッパーゼ認識部位を含む胚マウス細胞（幹細胞）の選択を可能にする。そのできたマウスがコンディショナルノックアウトマウスである。

ノックアウト構築物は、ＤＮＡ構築物のような核酸配列であり、それは、細胞に導入された場合、細胞において内因性ＤＮＡによってコードされたポリペプチドまたはタンパク質の発現の抑圧（部分的または完全）を引き起こす。典型的なノックアウト構築物が、本明細書中で提供される。この構築物は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のエキソン１、選択マーカーカセットの５’にｌｏｘＰ部位を、および選択マーカーカセットの３’にｌｏｘＰ部位を含む。その選択マーカーカセットは、選択マーカーの５’および３’にｆｒｔ部位を、そして５’ｆｒｔ部位および選択マーカー遺伝子の間に内部ｌｏｘＰ部位を含む。適当な選択マーカーは、ネオマイシン、ピューロマイシン、およびハイグロマイシンを含むがこれに限らない。適当なベクターは、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ、ｐＢＲ３２２、およびｐＧＥＭ７を含むがこれに限らない。ノックアウト構築物の調製の詳細が、本明細書中で提供される。

胚幹（ＥＳ）細胞は、典型的には、導入遺伝子の生殖系列伝達を生じるように、発達中の胚の生殖系列に組み込まれ、そしてその一部となる能力に関して選択される。従って、そのようにし得るあらゆるＥＳ細胞系統が、本明細書中で使用するために適当である。例えば、本明細書中で記載された、１２９ＳｖＥｖＥＳ細胞系統を使用し得る。あるいは、使用し得る適当な細胞系統は、１２９ＪＥＳ細胞系統、Ｄ３ＥＳまたはＪｌＥＳ細胞系統を含むがこれに限らない。当業者に周知の方法を使用して、その細胞を培養し、そしてＤＮＡ挿入のために調製する。

ノックアウト構築物のＥＳ細胞への導入を、例えばエレクトロポレーション、微量注入、およびリン酸カルシウム処理を含む、当該分野において周知の様々な方法を用いて達成し得る。ＤＮＡ配列の導入のために、ノックアウト構築物ＤＮＡを、選択した挿入方法に適当な条件下で、ＥＳ細胞に加える。もし細胞をエレクトロポレーションするなら、ＥＳ細胞および構築物ＤＮＡを、エレクトロポレーションの機械（エレクトロポレータ）を用いて、そして製造会社の使用ガイドラインに従って、電気パルスに曝露する。エレクトロポレーション後、その細胞を適当なインキュベーション条件下で回復させる。次いでその細胞を、ノックアウト構築物の存在に関してスクリーニングする。

導入遺伝子を含む細胞（相同的組換え体）に関するスクリーニングを、様々な方法を用いて行い得る。例えば、本明細書中で記載したように、細胞を必要に応じて処理して、それらの中のＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、特異的プローブを用いたスクリーニングのために利用可能にし得る。

適当なＥＳ細胞が同定されたら、それらを標準的な方法を用いて胚へ導入する。それらを、例えば微量注入を用いて導入し得る。例えば妊娠したメスの子宮の灌流によって、ＥＳ細胞の組み込みが起こるために適当な発生段階にある胚を得る。例えば、発生３−４日のマウス胚を得て、そしてマイクロピペットを用いてＥＳ細胞を注射し得る。ＥＳ細胞を胚へ導入した後、その胚を、偽妊娠メスマウスの子宮へ導入する。偽妊娠の段階を、着床が成功するチャンスを増強するように選択する。マウスにおいて、偽妊娠２−３日のメスが適当である。

ＥＳ細胞の着床した胚への組み込みの成功は、キメラと呼ばれる子孫を生じる。変異対立遺伝子の生殖系列伝達可能なキメラを、標準的な方法によって同定する。キメラを繁殖させ、そしてできた子孫を、望ましい変化（例えば修飾された組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１対立遺伝子）の存在に関してスクリーニングする。公知の方法（例えばサザン分析、ドットブロット分析、ＰＣＲ分析）を用いて、導入遺伝子を評価するために、例えば毛皮の色に基づいて、または子孫からＤＮＡ（例えば尾部ＤＮＡ）を得ることによってこれを行い得る。導入遺伝子発現をまた、ノーザン分析またはＰＣＲ分析のような公知の方法によって評価し得る（例えば置換構築物が発現しているかどうか決定するために）。子孫ＤＮＡ（例えば尾部ＤＮＡ）のサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ分析を行って、望ましい遺伝子型を同定し得る。

本開示は、破壊遺伝子がＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子であるＣＫＯを記載する。ＣＫＯマウスと、フリッパーゼまたはＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと繁殖させることによって、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の条件的破壊を得た。ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ、ＭＥ）は、フリッパーゼまたはＣｒｅリコンビナーゼを発現する、７０以上のマウスの系統を販売している。フリッパーゼまたはＣｒｅリコンビナーゼ発現マウス系統は、これらの酵素を全てのマウス組織において発現する、または前立腺組織のような特定の組織においてのみ、または星状細胞のような特定の細胞型においてのみ、それらの存在を引き起こすシグナルの下でその酵素を発現し得る。組織または細胞特異的シグナルに加えて、発生特異的シグナル（例えば内因性発生因子または食餌応答性遺伝子プロモーター）を使用して、フリッパーゼまたはＣｒｅリコンビナーゼ発現の時間を制御し得る。当該マウスの１つの実施形態において、フリッパーゼの作用は、ネオマイシン遺伝子を除去し、そしてＣｒｅリコンビナーゼの作用は、関心のある標的遺伝子の決定的な部分、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のエキソン１を除去する。当該マウスの別の実施形態において、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用は、ネオマイシン遺伝子およびＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のエキソン１の両方を除去する。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のエキソン１の除去は、開始コドンの欠如のために、その遺伝子の不活性化を引き起こし、そして従ってタンパク質が産生されない（図２Ｃ）。ノックアウトにおいて、好ましくは標的遺伝子の発現は、検出不可能またはわずかである。

Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ノックアウトマウスは、細胞運動性の崩壊、方向持続性の増加、遊走距離の減少および遊走速度の減少を含むがこれに限らない、１つまたはそれ以上の表現型を示す。

本明細書中で開示されたＣＫＯマウスは、少なくとも３つの要素を含む：（１）標的遺伝子の決定的な部分に隣接する、少なくとも２つの酵素特異的認識部位；（２）ネオマイシンのような、しかしそれに限らない選択マーカーをコードする遺伝子；および（３）特定のマウス系統と繁殖させた時に除去が容易であるために、選択マーカー遺伝子に隣接する、少なくとも２つの酵素特異的認識部位。制限しない例において、標的遺伝子のエキソン１が、決定的な部分として指摘された。１つの実施形態において、標的遺伝子の決定的な部分に隣接する酵素特異的認識部位は、ｌｏｘＰ部位である。別の実施形態において、選択マーカー遺伝子に隣接する酵素特異的認識部位は、ｆｒｔ部位である。別の実施形態において、両方の認識部位のセットは、同じものを含む。さらなる実施形態において、標的遺伝子の他のエキソンまたは部分を、決定的な部分として指定し得る。さらなる実施形態は、その作用を模倣する、フリッパーゼおよびＣｒｅリコンビナーゼ以外のＤＮＡ修飾酵素を含む。別の実施形態において、遺伝子活性化のあらゆる他の方法を使用して標的遺伝子を不活性化し得る。代替マウス系統由来の胚幹（ＥＳ）細胞も、遺伝子標的化のために使用し得る。

本明細書中で使用する場合、実質的に同じであるヌクレオチド配列は、少なくとも約９０％の同一性を共有し、そして実質的に同じであるアミノ酸配列は、典型的には９５％超のアミノ酸同一性を共有する。しかし、スプライスバリアントとして生じる、上記で記載したレベルより低い相同性を含むタンパク質（およびそのようなタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ）、または保存的アミノ酸置換（または縮重コドンの置換）によって修飾されたタンパク質は、本開示の範囲内であると企図されることが認識される。当業者によって容易に認識されるように、比較のために配列を整列させるために様々な方法が、例えばＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆによって、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９９２）において記載されたような、Ｂｌｏｓｕｍ６２スコアリングマトリックスが考案された。この目的のために便利に採用されるアルゴリズムが、広く入手可能である（例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）を参照のこと）。

実施例１
遺伝的に操作したＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１マウス
Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ヘテロ接合性ｌｏｘＰ導入マウス（Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１^{ｌｏｘＰ＋／ｗｔ}、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｆｌ／＋）とも呼ばれる）の胚を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に、受入番号ＸＸＸＸＸＸで寄託し、そしてマウス胚９０５０６７１ＶＦ−１から９０５０６７１ＶＦ−１０として同定した。これらのマウスは、遺伝子の条件的破壊のために必要な最小限の量の配列を有する（Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のエキソン１周辺のｌｏｘＰ部位、下で「エキソン１」）。これらのマウスは、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子座にネオマイシン遺伝子を有さない；ｎｅｏカセット由来の少量の配列が残っている（図２Ａを参照のこと）。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１^{ｌｏｘＰ＋／ｗｔ}を繁殖させて、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１^{ｌｏｘＰ＋／ｌｏｘＰ}（Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｆｌ／ｆｌ））マウスを得る。

マウスＡｂｉ−１（受入番号ＮＭ＿００７３８０およびＥＮＳＭＵＳＧ００００００５８８３５）、ヒト遺伝子ＡＢＩ−１（受入番号ＮＭ＿００５４７０）のマウスオルソログ（ｏｒｔｏｌｏｇｕｅ）のエキソン１に挿入された、ｆｒｔおよびｌｏｘＰ部位に隣接するＰＧＫ−Ｎｅｏカセットを有する、ＡＢＬ−１条件的標的化構築物（配列番号第１４番、ノックアウト構築物または標的化ベクターとも呼ばれる）を構築した。

ゲノムバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）クローンを単離し、そしてコンディショナルＫＯ構築物を産生した。標的化ベクターを構築するために使用する約１１．８ｋｂの領域を、まず相同的組換えに基づく技術を用いて、ポジティブに同定されたＢＡＣクローンからサブクローニングした。短いホモロジーアーム（ＳＡ）がエキソン１の３’に１．９ｋｂ伸長するようにその領域をデザインした。長いホモロジーアーム（ＬＡ）は、エキソン１の５’側で終わり、そして約９ｋｂの長さである。単一のｌｏｘＰ部位がエキソン１の５’に挿入され、そしてｌｏｘＰに隣接するＮｅｏカセットがエキソン１の３’に挿入される。標的領域は０．９ｋｂであり、そしてエキソン１を含む（図１、図２）。その標的化ベクターを、各修飾工程の後に制限分析によって、および特異的プライマーを用いた配列決定によって確認した。

コンディショナルＫＯ構築物を、１２９ＳｖＥｖ胚幹（ＥＳ）細胞にトランスフェクトし、そして約３００個の抗生物質耐性コロニーを選択した。インビトロにおける増殖後、細胞のアリコートを溶解し、ＤＮＡを抽出、精製、そして９６穴組織培養プレートに乾燥させた。相同的組換えクローンから単離されたＤＮＡの９６穴プレートを、短いホモロジーアームおよびＮｅｏカセット両方の中にあるＰＣＲプライマーを用いた、ＰＣＲに基づく戦略を用いてスクリーニングした。次いでポジティブクローンを配列決定して、全てのｌｏｘＰおよびｆｒｔ部位の適当な組み込みを確認し、そして次いで最後に培養ＥＳ細胞へ増殖させた。

２つのポジティブＥＳクローン、１−２Ｄ３および１−３Ｄ１を、Ｃ５７ＢＬ／６未分化胚芽細胞に微量注入し、それを偽妊娠メスの子宮へ移植した。次いで偽妊娠メスマウスが子孫を出産した。４週齢に達した時、毛皮の色の観察によって、子孫のキメラ現象を分析した。少なくとも９０％のアグーチキメラ現象の５匹のオスが得られた。少なくとも９０％のアグーチキメラ現象を有するオスマウスを、６週齢に達した時に、ヘテロ接合性子孫を産生するために、Ｃ５７ＢＬ／６野生型メスマウスの群れと交配した。Ｆ１へテロ接合性オスおよびメス子孫の両方が得られた。

最初の組換えＤＮＡ要素（すなわち、ネオマイシン遺伝子、ｌｏｘＰ、およびｆｒｔ部位（すなわちｎｅｏ＋／ｌｏｘＰ＋／ｆｒｔ＋））を有するヘテロ接合性マウスは、より繁殖性が低いことが見出された；これらのマウスの繁殖は、２−４匹（６−１２匹の子が通常）の範囲の、より少ない子を生じた。組換え遺伝子カセット中にネオマイシン遺伝子を有するホモ接合体マウスは得られなかった。ネオマイシン遺伝子の除去時に、ホモ接合体ｌｏｘＰ導入マウスが得られた。

Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１キメラマウスの繁殖の成功後、修飾した組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１対立遺伝子（ネオマイシン遺伝子、ｆｒｔおよびｌｏｘＰ配列を含む）の生殖系列伝達を達成し、そして続いてＦ１系統の産生を生じた。できた子孫を、ＰＣＲによって遺伝子型解析して、コンディショナルノックアウト（ＣＫＯ）対立遺伝子の存在を決定し、そしてｌｏｘＰおよびｆｒｔ部位の存在に関しても配列決定した。

ネオマイシン遺伝子、ｆｒｔ部位およびｌｏｘＰ部位を含む、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１対立遺伝子に関してヘテロ接合性のマウスを、「ｆｒｔｄｅｌｅｔｏｒ」系統１２９Ｓ４／ＳｖＪａｅＳｏｒＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（ＦＬＰ１）Ｄｙｍ／Ｊ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ストック番号００３９４６）と繁殖させた。フリッパーゼによる組換え遺伝子カセットからのネオマイシン遺伝子の欠失を、特異的プライマーによる遺伝子型解析によって確認した。ヘテロ接合性Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１動物（Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｌｏｘＰ^＋／ｗｔ）、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｆｌ／＋）または（ｆｌｏｘｅｄ／＋）とも呼ばれる）（図３を参照のこと）を続いて繁殖させて、ホモ接合性Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｆｌ／ｆｌ）マウスを得た。マウス胚線維芽（ＭＥＦ）細胞系統を、続いてこれらのマウスから得た。

実施例２
正常および変異Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を有する細胞系統
実施例１で記載されたヘテロ接合体マウスから、細胞系統を単離した。マウス胚線維芽細胞のためにＭＥＦと呼ばれるその細胞系統は、１コピーの野生型遺伝子および１コピーの遺伝的に組換えした、エキソン１に隣接するｌｏｘＰ配列を有するＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を有する（この細胞系統はネオマイシン遺伝子を含んでいた）。初代ＭＥＦの単離後、その細胞をＰＣＲによって遺伝子型解析した（図５）。いくつかのＭＥＦ細胞系統を、無作為に選択した。これらは、野生型Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１を発現する細胞系統、および望ましいホモ接合性ｌｏｘＰ導入Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を発現する系統を含んでいた（図５）。

ＭＥＦ細胞系統を、ＳＶ４０ラージＴ抗原のレトロウイルス形質導入によって不死化した。遺伝子型の確認後、ホモ接合性Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｆｌ／ｆｌ）ＭＥＦ細胞系統（親ＭＥＦ＃３および親ＭＥＦ＃８）を用いて、インビトロで同系の細胞系統を得た（すなわち、インビトロにおける遺伝子ノックアウト実験のために）。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｆｌ／ｆｌ）細胞系統を、ｌｏｘＰ導入対立遺伝子を除去するために、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミド、またはピューロマイシンを発現するコントロールＥＧＦＰ（増強型緑色蛍光タンパク質）プラスミドのいずれかで一時的にトランスフェクトした。両方のプラスミドは、ピューロマイシン抵抗性カセットを有していた。トランスフェクションのために、ＦｕＧｅｎｅ６試薬を、マニュアルに従って使用した（Ｒｏｃｈｅ）。トランスフェクション培地を、５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加した通常培地と２４時間後に交換した。細胞をピューロマイシンと６日間培養した（適当なピューロマイシン濃度を、殺傷曲線（ｋｉｌｌｉｎｇｃｕｒｖｅ）を行うことによって達成した）。次いで細胞系統を、上記で記載したような通常条件下で培養した。限界希釈サブクローニングによって、単一のクローンを得た。各Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１前駆細胞系統に関して、少なくとも１０個の個々のＡｂｉ１ＫＯ細胞クローンを確立した。Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞におけるＡｂｉ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子の有効な除去を、ＰＣＲによって、タンパク質発現レベルの評価によって、およびＲＮＡアレイ分析によって確認した。

クローン＃３およびクローン＃８を、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１欠失系統の産生のために使用した。エキソン１の欠失によるＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の破壊を、ピューロマイシンに対する抵抗性を与えるプラスミドを用いたＣｒｅリコンビナーゼによる一時的なトランスフェクションによって達成した。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１エキソン１のゲノム欠失を、プライマーＤＬ７５’（配列番号第７番）、Ｎｅｏｇｅｎｅ１３’（配列番号第１６番）、およびｍＡｂｉ１ｌｏｘＰ３５’（配列番号第３番）を含む、いくつかのＰＣＲプライマーセットによる遺伝子型解析によって（図４）、およびＰＣＲ産物を配列決定することによって確認した。ウェスタンブロット分析（図６）は、そのクローンにおけるＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質の欠如を示した。親ＭＥＦクローン３＃の１１個のサブクローンからの代表的なデータを図６に示す。

実施例３
Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子発現を欠く細胞の形態
Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１は、前駆（ｆｌ／ｆｌ）細胞においてＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）刺激末梢および背面ラフリングに局在するが、ノックアウトＭＥＦ細胞には存在しない。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１は、ラメリポディウムを生じるアクチン再構成、およびアクチンが豊富な末梢および背面ラフリングの形成に関与することが公知である。従って、単離したＭＥＦ細胞において、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１がこれらの構造に局在するかどうか、および機能的Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の発現を欠く細胞において、これらの構造におけるいかなる欠損が観察されるかを決定した。

ＰＤＧＦ処理時に、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｆｌ／ｆｌ）コントロール（＃３）およびＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１欠損（クローン＃３−１１）細胞はどちらも、末梢および背面ラフリングの形成を示すが、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ細胞系統において、背面ラフリングはより顕著でない。Ａｂｉ１は、背面ラフリングにおいて高度に濃縮されており、そしてＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１コントロール細胞において細胞末梢ラフリングの先端に局在しているが、それはＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ノックアウト細胞系統においては検出できない。Ａｂｉ２も両方の細胞系統に存在するが、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１コントロール細胞において、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１局在化と区別できない（図７）。従って、本発明者らはコントロール（ｆｌ／ｆｌ）ＭＥＦ細胞における環状および末梢ラフリングの形成におけるＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の関与、およびノックアウトＭＥＦ細胞におけるＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の欠如を確認した。

Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＭＥＦ細胞のＰＤＧＦ刺激は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１コントロールおよびＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１欠損細胞において、末梢および背面ラフリングの両方の形成を引き起こした。複数の細胞形態が観察され、そして定量し、以下のカテゴリーによって分類した：ラフリング有り、ラフリング無し、または不明瞭な細胞形態（図８）。著しいことに、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の欠如は、定量可能な方式では末梢ラフリング形成に影響を与えず、一方背面ラフリングは、全ての試験したＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ細胞系統において、そのそれぞれの親コントロールと比較して、有意に抑制された。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯクローン＃３−１１は、ＰＤＧＦ処理に反応して最も激しい表現型を示した。特に、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１＃３コントロール細胞系統は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１＃８コントロール細胞系統と比較して、ＰＤＧＦによってより大きい程度まで刺激された（図８）。

機能的Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を欠く細胞において、Ｒａｃ活性の変化は観察されなかった。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＭＥＦ細胞系統において、ＰＤＧＦ処理後に、Ｇ−ＬＩＳＡキット（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、製造会社の指示に従って、Ｒａｃ活性をアッセイした。ＰＤＧＦ処理は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１コントロールおよびＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１欠損細胞系統の両方において、強いＲａｃ活性化を誘発した（図９）。しかし、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ノックアウト細胞において、有意な影響は観察されなかった。この観察は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１はＲａｃの下流において作用するか、またはＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１機能は、別のタンパク質、例えばＡｂｉ２によって代償されることを示唆した。

Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１を欠く細胞は、細胞運動性の欠損を示す。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１は、Ｗａｖｅ２複合体の一部として、アクチン細胞骨格依存性細胞運動性の調節因子として関与していた。従って、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯＭＥＦ細胞系統を、一連の運動性アッセイにおいて試験した。無作為遊走分析に関して、細胞を６穴プレートに、通常の増殖培地中、１０^４細胞／ウェルの濃度でまき、そして温度およびＣＯ_２をコントロールした顕微鏡チャンバーに置いた（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、ＭｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇＩｎｃ．）。プレーティングの６時間後に経時的な記録（ｔｉｍｅｌａｐｓｅｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）を開始した。ＡｘｉｏＣａｍＭＲｍカメラ（Ｚｅｉｓｓ）およびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて、８時間にわたって１５分間隔で、１０×対物レンズで画像を収集した。遊走経路、距離、速度、および方向維持性を含む運動性パラメーターを、経時的な動画から得た。個々の細胞の遊走経路を追跡するために、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨＩｍａｇｅＪ、ソフトウェアバージョン１．４１ｎ）を用いて、細胞を各フレームに手で位置づけた；核を追跡のための地理的中心として使用した。遊走経路を、グラフとして表した。細胞遊走の速度を、遊走経路の全長および遊走時間の比として計算した。遊走距離を、８時間の間の正味の転位置として決定した。方向維持性を、８時間の間の方向距離および遊走経路の全長の比として計算した。これらのアッセイは、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１を欠く細胞の、無作為な細胞運動性（遊走速度および遊走距離）の減少を示したが、方向維持性の増加を示した（図１０）。

創傷治癒に対するＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の効果を決定するために、細胞を、通常の増殖培地中、６穴プレートに１×１０^６細胞／ウェルの濃度でまいた。６時間後、コンフルエントな１層の細胞を、細いピペットの先端でひっかき、そして上記で記載したような経時的なイメージングによって遊走を可視化した。単位時間あたりの、細胞によって覆われない面積を測定することによって、創傷閉鎖の速度を決定した。各アッセイを少なくとも４回繰り返した。このアッセイにおいて、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１を欠く細胞の、創傷閉鎖のわずかであるが統計学的に有意な障害（図１１）。

細胞運動性のアッセイは、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＫＯ細胞における細胞運動性の欠損を示し、そしてＷａｖｅ２依存性アクチン重合のダウンレギュレーションを示唆した。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１は、Ｒａｃ１活性によって調節される、Ｗａｖｅ２−Ａｒｐ２／３活性化複合体の重要な部分であると考えられる。Ｒａｃ１、Ｗａｖｅ複合体、およびＡｂｉ１の間の相互作用は、Ｎａｐ１およびＳｒａ−１によって媒介される。ＲＮＡサイレンシング実験のデータは、個々のサブユニットのダウンレギュレーション時、Ｗａｖｅ２複合体の全ての主な成分は、協調的にダウンレギュレートされることを示した。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の遺伝子破壊による（すなわち遺伝的）ノックアウトがどのようにＷＡＶＥ２複合体成分の安定性に影響を与えるかを研究した。ウェスタンブロット分析は、Ａｂｉ１（−／−）ヌル細胞において、Ｗａｖｅ２、Ｓｒａ−１、およびＮａｐ１発現レベルがより低いが、完全に抑制されてはいないことを示した（図１２）。

実施例４
Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ノックアウトマウスゲノムの配列決定
下記に示した供給源から全ゲノムＤＮＡを単離し、そして示したプライマー（ＰＣＲプライマー）を用いてＰＣＲ増幅にかけた。ＰＣＲ断片を１％アガロースゲルで分離した（図１４）。ＰＣＲ産物バンドの配列決定を、５’ｌｏｘＰ部位の上流に位置する、プライマーＤＬ７５’（前向き配列決定プライマー；配列番号第７番）、および３’ｌｏｘＰ部位の下流に位置する、プライマーＦｌａｎｋｎｅｏ１３’（逆向き配列決定プライマー；配列番号第４番）を用いて行った。ＭＥＦ細胞系統およびマウスの名前を示す。

初代ＭＥＦ細胞系統
「ＲＡＲＡ１」を、ヘテロ接合性Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｌｏｘＰ／＋）系統の繁殖から生じ、そしてｌｏｘＰ対立遺伝子に関してネガティブであると遺伝子型解析されたマウス胚から得る。配列決定データは、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子のＷＴ配列において、５’ｌｏｘＰ部位の欠如および３’ｌｏｘＰ部位の欠如を確認する。

「ＲＡＲＡ３」を、ヘテロ接合性Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｌｏｘＰ／＋）系統の繁殖から生じ、そしてｌｏｘＰ対立遺伝子に関してホモ接合性であると遺伝子型解析されたマウス胚から得る。配列決定は、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子において、５’ｌｏｘＰ部位および３’ｌｏｘＰ部位の存在を確認する。

「ＲＡＲＡ７」を、ヘテロ接合性Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｌｏｘＰ／＋）系統の繁殖から生じ、そしてｌｏｘＰ対立遺伝子および野生型対立遺伝子に関してヘテロ接合性であると遺伝子型解析されたマウス胚から得る。配列決定は、５’および３’ｌｏｘＰ部位両方の存在を確認する。また、ＷＴ配列をＤＬ７５’およびＦｌａｎｋｎｅｏ１３’プライマーで確認した。

示した場合、「上のバンド」という用語は、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｌｏｘＰ導入対立遺伝子からの配列データを指し、そして「下のバンド」という用語は、野生型Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子対立遺伝子からの配列データを指す。

初代ＭＥＦ細胞系統からの配列決定データは、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｌｏｘＰ導入遺伝子において、５’ｌｏｘＰおよび３’ｌｏｘＰ部位の存在、およびネオマイシン遺伝子の欠如を確認した。

不死化ＭＥＦ細胞系統
ＭＥＦ＃３（親＃３ＭＥＦＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｌｏｘＰ導入細胞系統）：配列決定は、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子において、５’および３’ｌｏｘＰ部位両方の存在を確認した。

ＭＥＦ＃３クローン＃３−６、＃３−８、および＃３−１１：配列決定は、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子において、エキソン１の欠失、および１つのみのｌｏｘＰ部位の存在を確認した。

ＭＥＦ＃８（親＃８ＭＥＦＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｌｏｘＰ導入細胞系統）：配列決定は、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子において、５’および３’ｌｏｘＰ部位両方の存在を確認した。

ＭＥＦ＃８クローン＃８−７、および＃８−１１：配列決定は、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子において、エキソン１の欠失、および１つのみのｌｏｘＰ部位の存在を確認した。

不死化ＭＥＦ細胞系統からの配列決定データは、親＃３および＃８細胞系統の組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｌｏｘＰ導入遺伝子対立遺伝子において、５’ｌｏｘＰおよび３’ｌｏｘＰ部位の存在およびネオマイシン遺伝子の欠如を確認した。一時的なＣｒｅリコンビナーゼトランスフェクション後にサブクローニングした細胞系統（親ＭＥＦ＃３由来の＃３−６、＃３−８、＃３−１１および親ＭＥＦ＃８由来の＃８−７および＃８−１１）において、エキソン１を含み、そして１つのｌｏｘＰ部位を含む、ｌｏｘＰ部位の間に位置するＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子配列が、組換え対立遺伝子から欠失している。これは、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質発現の破壊を引き起こした（＃３サブクローンからのタンパク質発現データに関して図６を参照のこと）。

ＰｂＣｒｅマウスと交配したＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｌｏｘＰ導入マウス由来、およびＣｒｅリコンビナーゼ発現に関して陽性である前立腺組織
マウス＃４１８前方および後方前立腺：配列決定は、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子において、５’および３’ｌｏｘＰ部位両方の存在を確認した。

ＰｂＣｒｅマウスと交配したコントロールＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｌｏｘＰ導入マウス由来、しかしＣｒｅリコンビナーゼ発現に関して陰性である前立腺組織
マウス＃４１９前方および後方前立腺：配列決定は、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子において、５’および３’ｌｏｘＰ部位両方の存在を確認した。

これらの組織に関して、「上のバンド」という用語は、ｌｏｘＰ導入対立遺伝子からの配列データを指し、そして「下のバンド」という用語は、エキソン１欠失対立遺伝子からの配列データを指す。

マウス前立腺組織からの配列決定データは、動物＃４１８および＃４１９の前方および後方前立腺組織において、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｌｏｘＰ導入遺伝子対立遺伝子における、５’ｌｏｘＰおよび３’ｌｏｘＰ部位の存在およびネオマイシン遺伝子の欠如を確認した。プロバシン駆動（すなわち前立腺特異的）Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウス（マウス＃４１８）から得られた前立腺組織において、ｌｏｘＰ部位の間に位置し、そしてエキソン１および１つのｌｏｘＰ部位を含む、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子配列のＣｒｅリコンビナーゼによる欠失が観察された。

実施例５
Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ノックアウトマウス
組換えｌｏｘＰ導入Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１対立遺伝子に関してホモ接合性であるマウスを、プロバシンプロモーター駆動Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｐｂ−Ｃｒｅ）を発現する系統：Ｂ６．Ｄ２−Ｔｇ（Ｐｂｓｎ−Ｃｒｅ）４Ｐｒｂ（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ；ｔｈｅＭｏｕｓｅＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙｏｆｔｈｅＭｏｕｓｅＭｏｄｅｌｓｏｆＨｕｍａｎＣａｎｃｅｒｓＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と繁殖させた。これらのトランスジェニックマウスにおいて、ラットプロバシン遺伝子（Ｐｂ）の前立腺特異的プロモーターが、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を制御し、従ってその酵素は、成熟前立腺組織においてのみ発現することが予測される。Ｐｂ−Ｃｒｅ系統を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊメスと繁殖させることによって、ヘミ接合性状態で維持する。Ｃｒｅは、小さい、しかし有意な卵母細胞による組換えを避けるために、オスマウスを通じて伝達しなければならない。繁殖ペアは、ヘミ接合性オスおよびメスＣ５７ＢＬ／６Ｎのつがいとして供給された。Ｐｂ−Ｃｒｅマウスの連続的な世代を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと繁殖させて、実験のために十分なＰｂ−Ｃｒｅマウスを産生した。尾部から得たＤＮＡを用いて、マウスを遺伝子型解析した。

Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１エキソン１の前立腺特異的欠失を、プライマーＤＬ７５’およびＦｌａｎｋｎｅｏ１３’による遺伝子型解析によって、前立腺組織において確認した（図１３）。この結果は、インビボにおいてｌｏｘＰ部位の機能性を確認し、そしてこれらのマウスがＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子機能の研究に適当であることを示す。

実施例６
Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１を欠く細胞の増殖
Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１を欠く細胞の増殖速度は、コントロールＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（ｆｌ／ｆｌ）ＭＥＦ細胞よりも速い。原発性前立腺腫瘍におけるＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の喪失、および続くＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１機能の破壊を引き起こす原発性腫瘍の変異の同定は、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質の喪失が、細胞増殖の調節不全を引き起こすことを示唆した。これを、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ＣＫＯマウスから単離したＭＥＦ細胞を用いて試験した。腫瘍抑制因子仮説と一致して、ＭＥＦＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１（−／−）細胞（クローン＃３−１１）において、親クローン＃３Ａｂｉ１（＋／＋）と比較して、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼの活性によって決定された増殖速度の増加が観察された（図１３）。プライマーＤＬ７５’およびＦｌａｎｋｎｅｏ１３’を、遺伝子型解析のために使用した。

実施例７
前立腺癌におけるＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の役割
特定の染色体領域の欠失が、ヒト前立腺腫瘍において報告された。第１０染色体に関して、１０ｐおよび１０ｑアームの両方が、しばしば欠失していると報告された。１０ｑの欠失は、多くの場合候補前立腺癌抑制遺伝子、ＰＴＥＮまたはＭＭＡＣ１にマッピングされた配列を含む、１０ｑ２３−２４領域を含む。第１０染色体の短腕、１０ｐにおけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）も、前立腺腫瘍において観察された。多型マーカーを用いて行われたいくつかの研究は、特に１０ｐ１１．２領域における高率のＬＯＨを示した。ＬＯＨの率は、使用したマーカーおよび調査した癌のステージに依存して、研究の間で変動する。１０ｐにおける遺伝的変化は、多くの場合１０ｑにおける変化と関連して存在する。１３ヶ所の高度の多型の遺伝子座におけるヒト前立腺腫瘍の１０ｐの広範囲な欠失マッピングを行った。この研究において、調査した３５個の腫瘍の５７％が、１０ｐ配列の喪失を示した。１０ｐにおける最も高い濃度の対立遺伝子喪失は、４−から７−ｃＭ領域にまたがり、そして遺伝子座Ｄ１０Ｓ２１１、Ｄ１０Ｓ８９、およびＤ１０Ｓ１１１を含んでおり、それらはヒト前立腺腫瘍において１０ｐの最少共通欠失領域を規定する。さらに、いくつかの腫瘍は、Ｄ１０Ｓ２１１またはＤ１０Ｓ８９−Ｄ１０Ｓ１１１においてのみ欠失していたので、この研究は、１つまたはそれ以上の欠失ドメインを１０ｐにマッピングし得ることを示唆した。これらの研究は、マーカーＤ１０Ｓ１１１を用いて、局在化（ステージＢ）前立腺癌における３．２％のＬＯＨ、および進行前立腺癌（ステージＣおよびＤ）における２７％のＬＯＨという観察によって確認された。合わせると、これらの対立形質解析（ａｌｌｅｌｏｔｙｐｉｎｇ）研究は、ヒト前立腺腫瘍において１つまたはそれ以上の癌抑制遺伝子が、１０ｐにマッピングされることを示唆する。この仮説を支持する機能的研究が、染色体１０ｐの一部を加えた前立腺細胞系統における研究によって提供された。１０ｐｔｅｒ−ｑ１１を含む染色体下断片の、ＰＣ３前立腺癌細胞系統への導入は、ヌードマウスにおいてハイブリッドクローン注入後の腫瘍形成能を抑制した。ＰＰＣ−１細胞系統、ＰＣ３の亜系統を用いた別のグループによって、同様の結果が得られ、ここで１０ｐ配列の導入後に軟寒天におけるコロニー形成の減少が観察された。

従って、対立形質解析および機能的研究の両方が、前立腺腫瘍形成に決定的な、１つまたはそれ以上の癌抑制遺伝子が、Ｄ１０Ｓ８９およびＤ１０Ｓ１１１遺伝子座を含む１０ｐにマッピングされることを示唆する。ヒト前立腺腫瘍における１０ｐの最少共通欠失領域は、候補ヒトスペクトリンＳＨ３ドメイン結合タンパク質１、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１をコードする遺伝子を含む。Ｈｓｓｈ３ｂｐ１は、スペクトリンおよびＡｂｌチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに結合し、培養細胞においてマクロ飲作用小胞に会合し、そしてマクロ飲作用の可能性のある調節因子である。独立に別のグループによってＥｐｓ８結合タンパク質として同定され、そしてＨｓｓｈ３ｂｐ１のアイソフォーム２と同一であるタンパク質、Ｅ３ｂ１は、最近ＲａｓからＲａｃへのシグナル伝達に結びつけられた。Ｈｓｓｈ３ｂｐ１は前立腺癌において観察される１０ｐ最少欠失領域内の遺伝子座Ｄ１０Ｓ８９およびＤ１０Ｓ１１１の近くにマッピングし、そして３つの配列全てが単一のＹＡＣ、９６１Ｃ７に局在する。さらに、Ｄ１０Ｓ８９またはＤ１０Ｓ１１１の欠失した前立腺腫瘍において、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質発現がダウンレギュレートされる。２つの前立腺腫瘍細胞系統が、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の異常な形態の発現を引き起こす、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の変異を含む。これらのデータは、前立腺癌腫瘍形成の間に不活性化される候補癌抑制遺伝子としてのＨｓｓｈ３ｂｐ１の役割と一致する。

ＤＮＡ分析
１０ｐ最少欠失領域の完全なコンティグを含む、１１個のＣＥＰＨＹＡＣ（９６５Ｄ１０、７４６Ｄ９、８１５Ｃ７、７４７Ｈ１０、８５７Ｃ９、９３４Ｅ１１、７９６Ｆ８、８９９Ｅ１０、８７５Ｂ４、７４６Ｇ７、および９６１Ｃ７）のそれぞれ由来のコロニーを取り、そして１０μｌのリチカーゼ溶液（１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４［１Ｍのストックから１：４ｖ／ｖ一塩基：二塩基］）および２．５ｍｇ／ｍｌリチカーゼ（Ｓｉｇｍａ）と、３７℃で５分間インキュベートした。各消化混合物の５マイクロリットルを、続く５５℃のアニーリング温度を用いた、それぞれ２００μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰ；１×ＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２）；それぞれ１μＭの前向きおよび逆向きプライマー；および０．６ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用した。これらのマーカーの連結順序は、ｐｔｅｒ−Ｄ１０Ｓ２１１−ＷＩ４９０６−１０Ｓ５５３−Ｄ１０Ｓ１７８９−Ｄ１０Ｓ５５０−ＷＩ４１３３−Ｄ１０Ｓ５８２−Ｄ１０Ｓ１６７３−Ｄ１０Ｓ５８６−Ｄ１０Ｓ１７４９−Ｄ１０Ｓ１７４７−Ｄ１０Ｓ５７２−Ｄ１０Ｓ８９−Ｄ１０Ｓ１１１−セントロメアと報告された。

プライマー配列および連結情報を、ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＤａｔａＢａｓｅＥ−ｍａｉｌ：（ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂｗｗ−ｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ／）、ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈａｔｔｈｅＷｈｉｔｅｈｅａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＥ−ｍａｉｌ：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）、およびＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって維持されるデータベースから得た。使用したＨｓｓｈ３ｂｐ１前向きプライマーは、ＰＲＯＭ３５’（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣ−３’、配列番号第８番）、および使用した逆向きプライマーは、ＰＲＯＭ５３’（５’−ＣＡＡＧＴＴＧＡＧＴＡＣＧＡＡＴＡＣＴＣＣＧＴＡＣ−３’、配列番号第９番）であった。反応産物を、２．５％アガロースゲルで電気泳動し、そして臭化エチジウム染色後に可視化した。

Ｈｓｓｈ３ｂｐ１エキソン６配列を、前向きプライマーＥｘ６１５’（５’−ＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＣＴＣＡＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧ−３’、配列番号第１０番）、および逆向きプライマーＥｘ６１３’（５’−ＴＣＣＡＴＡＧＧＡＧＴＴＴＧＴＣＧＣＣＡＧＴＣＡＧ−３’、配列番号第１１番）を用いて、前立腺細胞系統から単離されたゲノムＤＮＡから増幅し、そして配列決定した。そのプライマー配列を、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子全体を含むＣｏｎｔｉｇＮＴ００８７３０（Ｇｅｎ−Ｂａｎｋ）から得た（上記で示したアドレスのＮＣＢＩウェブサイトにおける遺伝子のＡｃｅＶｉｅｗも参照のこと）。

Ｈｓｓｈ３ｂｐ１発現の分析
１０ｐ遺伝子量（dosage）状態に関して以前に特徴付けた、凍結した１対の正常および腫瘍前立腺組織を利用した。標準的な技術を用いて、ｔｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＢａｓｉｃＲｅｓｅａｒｃｈｉｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＤｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓＡｎｔｉｂｏｄｙＦａｃｉｌｉｔｙにおいて、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の組換えＣ−末端部分、プラスミドＣ５に対して、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２Ｇ８を産生した。１対の凍結正常および前立腺全摘除術標本由来の悪性組織から切断し、そして氷冷アセトンで１０分間固定し、次いで４℃で短時間空気乾燥した、５ミクロンの切片において免疫組織化学を行った。そのスライドを、Ｖｅｎｔａｎａ３２０ＥＳＡｕｔｏｍａｔｉｃＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ＩＰＯＸＳｔａｉｎｉｎｇＳｔａｔｉｏｎを用いて、製造会社のプロトコールに従って、１：２０００希釈のｍＡｂ２Ｇ８で染色した。その抗体染色を病理学者が評価し、そして染色の程度を、０（無し）、１（低度）、２（中程度）、または３（強度）と評価した。

タンパク質短縮化テスト（ＰＴＴ）
前立腺細胞系統ＬＮＣＡＰ．ＦＧＣ−１０（ＣＲＬ−１０９９５）、ＬＮＣａＰ．ＦＧＣ（ＣＲＬ−１７４０）、およびＰＣ３（ＣＲＬ１４３５）をＡＴＣＣから得て、そしてＡＴＣＣの指示に従って増殖させた。培養細胞由来のＲＮＡを、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）を用いて調製した。Ｈｓｓｈ３ｂｐ１特異的プライマーＴ７−Ｍ（５’−ＧＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＧＣＧＡＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＴＧＣＡＧＡＧ−３’、５’プライマー、配列番号第１２番）、およびＰ３（５’−ＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＡＣ−３’、３’プライマー、配列番号第１３番）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ゲル精製ＰＣＲ産物（２００ｎｇ）のインビトロにおける翻訳を、Ｔ７−ｈ１プライマーおよびＴ７ＴＮＴシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質電気泳動およびウェスタンブロッティングを行った。その分析において、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１に対するポリクローナル抗体Ａｂ−２を用いた。

Ｈｓｓｈ３ｂｐ１は前立腺腫瘍における１０ｐ最少共通欠失領域にマッピングする
１１個のＣＥＰＨＹＡＣをそれぞれ、１０ｐ最少共通欠失領域内の１４遺伝子座のマッピングのために増幅した。これらの実験は、ＹＡＣをこの領域にまたがるコンティグに整列させた（ｏｒｄｅｒ）（表１）。Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子はＹＡＣ９６１Ｃ７のみに局在し、それはまたマーカーＤ１０Ｓ８９およびＤ１０Ｓ１１１に特異的な配列を含む。Ｄ１０Ｓ８９はまた、よりテロメア側のＹＡＣ、８７５Ｂ４にも局在するので、可能性のある配列順は：１０ｐｔｅｒ−Ｄ１０Ｓ８９−Ｈｓｓｈ３ｂｐ１／Ｄ１０Ｓ１１１−１０ｃｅｎであり、ここで「／」は実際の方向は不明であることを示す（表１）。１．６７Ｍｂである、ＹＡＣ９６１Ｃ７の比較的小さいサイズは、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子は、Ｄ１０Ｓ８９またはＤ１０Ｓ１１１が欠失した腫瘍において、同時に欠失し得る可能性を示唆した。

隣接する１０ｐ配列が欠失した前立腺腫瘍において、Ｈｓｓｐ３ｂｐ１の発現はダウンレギュレートされる
Ｈｓｓｐ３ｂｐ１に対するｍＡｂを用いた前立腺組織の免疫組織化学的分析を行って、前立腺腫瘍においてＨｓｓｐ３ｂｐ１タンパク質発現がＤ１０Ｓ８９またはＤ１０Ｓ１１１量と関連するかどうかを決定した。Ｄ１０Ｓ８９およびＤ１０Ｓ２１１の量に関して以前に特徴付けた、１７組の正常および悪性前立腺標本を、これらの研究のために利用した。１７個の腫瘍組織のうち、６個がＤ１０Ｓ８９またはＤ１０Ｓ１１１における欠失によって特徴付けられた（表２）。残りの１１個の腫瘍は、Ｄ１０Ｓ８９、Ｄ１０Ｓ１１１、または両方の遺伝子座において、正常な二倍体量を保持していた（表２）。上皮細胞質の免疫組織化学的染色を、４つのグループ：なし（０）、低度（１）、中程度（２）、または強度（３）に段階をつけた。Ｈｓｓｐ３ｂｐ１の中程度または強度の発現を、試験した８２％（１４／１７）の正常組織で検出した（表２）。対照的に、Ｈｓｓｐ３ｂｐ１の中程度または強度の発現を、試験した４１％（７／１７）の悪性組織においてのみ検出した。さらに、最少共通欠失領域内で、Ｄ１０Ｓ８９またはＤ１０Ｓ１１１における１０ｐ配列が欠失した４／６（６７％）の腫瘍が、これらの遺伝子座において正常な二倍体量を維持する５／１１（４６％）の腫瘍と比較して、Ｈｓｓｐ３ｂｐ１タンパク質を発現できなかった。正常および悪性におけるＨｓｓｈ３ｂｐ１染色の例を、図１６に示す。

合わせると、これらの実験結果は、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質発現の喪失は、ヒト前立腺腫瘍において、１０ｐの欠失に隣接する遺伝子座の欠失と明らかに関連していたことを示す。

前立腺腫瘍細胞系統は、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１に変異を含む
２つの前立腺腫瘍細胞系統、ＬＮＣａＰ（ＣＲＬ−１０９９５）およびＰＣ３（ＣＲＬ−１４３５）において、ＰＴＴを行った。そのＰＴＴテストは、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のＣ−末端に対する抗体を使用し、そしてＰＣ３細胞系統における２つのポリペプチドと比較して、ＬｎＣａＰ細胞系統における短縮ポリペプチドの存在を示した（図１６）。ＤＮＡ配列決定によって決定されたように、ＬＮＣａＰ細胞系統は、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｃＤＮＡのヌクレオチド６６０−８００（全部で１４１ヌクレオチド）の欠失を含むが、ＰＣ３細胞系統は含まない。これは、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のアミノ残基１９４から２４０までのインフレーム欠失を引き起こし、そしてＰＴＴにおけるより小さい産物の翻訳の観察と一致する。Ｈｓｓｈ３ｂｐ１配列の同一の欠失が、別の腫瘍細胞系統、ＣＲＬ−１７４０において観察された。これらの細胞系統由来のＨｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の配列決定は、前のイントロンの３’スプライスジャンクション近くに位置する遺伝子のエキソン６における、ヘテロ接合性の点突然変異の存在を明らかにした：配列

は、今や

であり、ここでイタリック体はイントロン配列、矢印はスプライス部位を、そして下線／太字は変異残基を示す。その変異は、Ｒ（ＣＧＧ）からＱ（ＣＡＧ）へのコドン１９４の変化を引き起こす。このミスセンス変異は、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｍＲＮＡのスプライシングにおいて、明らかにエキソン６のスキッピングを引き起こし、それは少なくとも２つの独立したメカニズム：ミスセンス誘発エキソンスキッピング、または３’スプライス部位付近のＨｓｓｈ３ｂｐ１ｍＲＮＡのコンフォメーション変化によって説明され得る。アイソフォーム特異的プライマーを用いた、ＰＣ３細胞におけるＨｓｓｈ３ｂｐ１ｃＤＮＡのＰＣＲ分析は、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のアイソフォーム２および３の発現を明らかにし、それは２つの狭く間隔の空いたポリペプチドの観察と一致する（図１６）。ＬｎＣＡＰ細胞からのポリペプチドの明らかな移動は、エキソン６によってコードされるアミノ酸配列を欠くＨｓｓｈ３ｂｐ１のアイソフォーム５の移動に対応する。

以前の対立形質解析および機能的研究は、前立腺腫瘍形成に重要な、１つまたはそれ以上の癌抑制遺伝子が、１０ｐ染色体領域にマッピングすることを示唆した。Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子は、前立腺腫瘍に関して以前本発明者らの研究室によって規定された、１０ｐ最少欠失領域内の、遺伝子座Ｄ１０Ｓ８９およびＳ１０Ｓ１１１に隣接してマッピングされた。さらに、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質の発現は、Ｄ１０Ｓ８９またはＤ１０Ｓ１１１のいずれかが欠失した前立腺腫瘍の大部分において、抑制された。これらの研究は、観察されたＨｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質発現の抑制は、１つのコピーの欠失および残るコピーの変異による、遺伝子の対立遺伝子不活性化により得ることを示唆する。このメカニズムは、もともと「プロトタイプ」癌抑制遺伝子、網膜芽細胞腫に関して提案された、「ツーヒット」モデルのものと一致する。従って、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１は、前立腺腫瘍形成に重要な、候補癌抑制遺伝子である。

前立腺癌における、１０ｐ最少共通欠失領域内の、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１配列とＤ１０Ｓ８９およびＤ１０Ｓ１１１の同時局在は、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の発現は、前立腺腫瘍において喪失し得ることを示唆する。これは、ここで示された免疫組織化学的研究によって支持され、それは、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質発現は、調査したＤ１０Ｓ８９またはＤ１０Ｓ１１１の欠失を有する前立腺腫瘍の大部分（５／６、８３％）において欠如している、または抑制されているが、正常組織の大部分およびこれらの遺伝子座においてインタクトである前立腺腫瘍において発現することを示す。

隣接する１０ｐ遺伝子座の欠失と組み合わせて、観察されたＨｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質の発現の抑制を説明し得る２つのメカニズムは、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１配列の欠失および／または変異を含む。しかし他のメカニズムも関与し得る。例えば、５個の腫瘍（症例３４４、２６０、３９２、３８６、および３８０）が、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質を発現しなかったが、それらはＤ１０Ｓ８９またはＤ１０Ｓ１１１の欠失を示さなかった。これらの例において、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１発現が他の手段、例えば小さい中間部欠損、両方のＨｓｓｈ３ｂｐ１対立遺伝子を含む変異、転写ダウンレギュレーション、またはタンパク質安定性の低下によって、ダウンレギュレートされた可能性がある。有意なことに、正常前立腺上皮標本の大部分（１４／１７、８２％）は、中程度または強度のＨｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質発現を示したので、これらの提案されたイベントは、明らかに前立腺腫瘍に特異的である。例外として、Ｄ１０Ｓ８９およびＤ１０Ｓ１１１の両方において１つの対立遺伝子が欠失した１つの腫瘍（症例４０４）は、高レベルのＨｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質を発現したことにも注意するべきである。この腫瘍においては、欠失がＨｓｓｈ３ｂｐ１の１つの対立遺伝子のみに影響を与え、残りの対立遺伝子の正常な発現を可能にした可能性がある。

２つの前立腺腫瘍ＬｎＣＡＰ細胞系統、ＣＲＬ−１０９９５およびＣＲＬ−１７４０は、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のエキソン６にミスセンス変異を含む。これらの細胞系統は、お互いの誘導体であり、それが遺伝子において同じ変異が観察される理由である。この変異は、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１ｍＲＮＡおよびタンパク質の異常な形態の発現を引き起こす、明らかなエキソン６のスキッピングを引き起こす。Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の１つの対立遺伝子においてエキソン６の変異が観察されるが、これらの細胞において短縮化ポリペプチドの発現のみが観察され、前の段落において言及したメカニズムによる正常対立遺伝子のダウンレギュレーションを示唆する。エキソンのスキッピングは、ＢＲＣＡ１および他のもののような遺伝子における、構成的におよび選択的にスプライシングされたエキソンの両方に存在する、エキソンスプライスエンハンサーに位置するナンセンスまたはミスセンス変異によることが示された。同定された変異はまた、前にあるイントロンの３’スプライスジャンクションから＋３の位置にあるので、エキソン６の適切なスプライシングに必要な、ＲＮＡ２次構造およびコンフォメーションにも影響を与え得る。エキソン６配列の存在は、原発性前立腺細胞、ＰＣ３細胞、ヒト脳、およびいくつかの培養細胞系統を含む、様々な組織から得られたＨｓｓｈ３ｂｐ１ｃＤＮＡにおいて常に観察される。脳におけるＨｓｓｈ３ｂｐ１の選択的スプライシングは、３’非翻訳領域の選択的スプライシングのさらなる可能性を有する、ｍＲＮＡコーディング領域の５つのアイソフォームを生じる。異なる細胞における、特定のＨｓｓｈ３ｂｐ１アイソフォームの発現は、機能的に有意であり得、そしてＰＣ３においてＬｎＣＡＰ細胞系統と異なる。

Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のアミノ残基１９４から２４０をコードするエキソン６配列の欠如は、ＬｎＣＡＰ細胞系統において、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１におけるＡｂｌチロシンキナーゼＳＨ３ドメイン結合部位（Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のアミノ残基１４４−２６０）の一部の喪失を引き起こす。そのような欠失は、Ａｂｌチロシンキナーゼの細胞内局在に影響を与え、そしてそのキナーゼ活性を変化させ、細胞の形質転換を引き起こし得る。この仮説は、ＡｂｌＳＨ３ドメインの変異は、Ａｂｌの形質転換能力の増加を引き起こすという事実と一致する。提案された腫瘍抑制因子機能と一致して、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１は、癌遺伝子であるＡｂｌチロシンキナーゼの機能の負の制御因子であり得る。

以前の研究は、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１をマクロ飲作用小胞のマーカーとして同定した。それに加えて、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１の過剰発現は、蛍光色素のエンドサイトーシスを減少させ、マクロ飲作用におけるＨｓｓｈ３ｂｐ１の負の調節性の役割の可能性を示唆した。マクロ飲作用は、腫瘍細胞系統において、増殖因子による刺激によってアップレギュレートされ、そしてＰＩ−３キナーゼはその過程の正の調節因子である。ＰＩ−３キナーゼの特異的阻害剤であるＬＹ２９４００２は、蛍光色素のＨｓｓｈ３ｂｐ１マクロピノソームへのエンドサイトーシスを阻害し、そしてその形態に劇的に影響を与える。これは、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１が、ＰＩ−３キナーゼの関与する伝達経路に関与することを示唆する。ＰＩ−３キナーゼ機能は、次は前立腺腫瘍形成に関与する癌抑制遺伝子であるＰＴＥＮ／ＭＭＡＣによって対抗される。従って、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１およびＰＴＥＮは、前立腺癌において影響される、同じシグナル伝達経路に位置し得る。従って、Ｈｓｓｈ３ｂｐ１のダウンレギュレーションは、ＰＴＥＮまたはＰＩ−３キナーゼの異常な調節の下流のイベントであり得る。Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質発現のダウンレギュレーションも、欠失および、おそらく変異メカニズムによって独立に起こり得る。

他に示さなければ、明細書および特許請求の範囲において使用される、成分の量、分子量、反応条件等のような性質を表す全ての数字は、全ての例において「約」という用語によって修飾されると理解される。よって、それと反対に示さなければ、明細書および付随する特許請求の範囲において述べた数字のパラメーターは、本発明によって得ようとする望ましい性質に依存して変動し得る近似値である。少なくとも、そして請求の範囲に対する同等物の主義の適用を制限する試みとしてではなく、各数字のパラメーターは、少なくとも報告された有意な数字として、そして通常の概数を作る技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広い範囲を述べる数字の範囲およびパラメーターは近似値であるにも関わらず、特定の実施例において述べた数値は、できるだけ正確に報告される。しかし、いかなる数値も、そのそれぞれの試験測定値において見出される標準偏差から必然的に生じるある誤差を本質的に含む。

本発明を説明する文脈において（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）使用される、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語、および同様の指示対象は、本明細書中で他に示さなければ、または明らかに文脈によって否定されなければ、単数および複数の両方を含むと解釈される。本明細書中における値の範囲の引用は、単にその範囲内に含まれる別々の値それぞれに個々に言及する、略式の方法となることが意図される。本明細書中で他に示されなければ、個々の値それぞれは、それが個々に本明細書中で引用されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書中で他に示されなければ、または他に文脈によって明らかに否定されなければ、本明細書中で記載された全ての方法を、あらゆる適当な順序で行い得る。本明細書中で提供される、あらゆるおよび全ての実施例、または例示の言語（例えば「〜のような」）の使用は、単に本発明をより明らかにするために意図され、そして他に請求される本発明の範囲に制限を加えない。明細書中の言語は、本発明の実施に必須の、あらゆる請求されない要素を示すと解釈されるべきではない。

本明細書中で開示された、本発明の代替要素または実施形態のグループ分けは、制限として解釈されない。それぞれのグループメンバーに個々に、または本明細書中で見出されるグループの他のメンバーまたは他の要素と組み合わせて、言及および請求し得る。簡便さおよび／または特許の理由で、グループの１つまたはそれ以上のメンバーを、グループに含み得る、またはグループから削除し得ることが予期される。あらゆるそのような含有または削除が起こる場合、その明細書は修飾されたようにそのグループを含むと考えられ、従って付随する特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュグループの書かれた説明を満たす。

本発明を実施するために、発明者らに公知の最もよい方法を含む、本発明のある実施形態を、本明細書中で記載する。もちろん、これらの記載された実施形態のバリエーションが、前述の説明を読んだ時に当業者に明らかとなる。発明者は、当業者が、そのようなバリエーションを適当なように採用することを期待し、そして発明者らは、本明細書中で明確に記載された以外に実施されることを意図する。よって、本発明は、適用可能な法律によって許される、ここに添付した特許請求の範囲において引用された内容の全ての修飾および同等物を含む。さらに、本明細書中で他に示されなければ、または他に文脈によって明らかに否定されなければ、その全ての可能なバリエーションにおける上記で記載した要素のあらゆる組み合わせが、本発明によって含まれる。

本明細書中で開示される特定の実施形態をさらに、〜から成る、または実質的に〜から成るという言語を用いて、特許請求の範囲において制限し得る。特許請求の範囲において使用する場合、出願または修正によって加えたかに関わらず、「〜から成る」という移行用語は、特許請求の範囲において特定されないあらゆる要素、工程、または成分を除外する。「実質的に〜から成る」という移行用語は、特定された物質または工程および、基本的および新規特徴に物質的に影響を与えないものに、請求の範囲を制限する。請求される本発明の実施形態は、本明細書中で本質的にまたは明白に記載および可能にされる。

さらに、この明細書を通して、特許および印刷された出版物に多くの言及がなされた。上記で引用された参考文献および印刷された出版物はそれぞれ、その全体として本明細書中で個々に参考文献に組み込まれる。

結びに、本明細書中で開示された本発明の実施形態は、本発明の原理の説明であることが理解される。採用し得る他の修飾が、本発明の範囲内である。従って、制限ではなく例として、本発明の代替の配置を、本明細書中の教示によって利用し得る。よって、本発明は、示された、および記載されたように正確には制限されない。

Claims

体細胞および生殖細胞が、条件的に破壊されたＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を含むコンディショナルノックアウトマウスであって、ここで該破壊は、該マウスが検出可能なレベルのＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１タンパク質を産生できないことを引き起こす、コンディショナルノックアウトマウス。
前記条件的破壊は、前記マウスを、フリッパーゼまたはＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと繁殖させることによって誘発される、請求項１に記載のコンディショナルノックアウトマウス。
前記Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の少なくとも一部に隣接する、ネオマイシン遺伝子、ｆｒｔ部位およびｌｏｘＰ部位を含む、組換えＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１対立遺伝子を含む、請求項１に記載のコンディショナルノックアウトマウス。
前記Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の前記少なくとも一部は、該Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子のエキソン１である、請求項３に記載のコンディショナルノックアウトマウス。
前記条件的破壊は、前記Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子のエキソン１において起こる、請求項１に記載のコンディショナルノックアウトマウス。
前記Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子は、全ての前記マウスの組織において発現されない、請求項１に記載のコンディショナルノックアウトマウス。
前記Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子は、前記マウスの組織の一部のみにおいて発現されない、請求項１に記載のコンディショナルノックアウトマウス。
前記Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子は、前記マウスの前立腺組織において発現されない、請求項１に記載のコンディショナルノックアウトマウス。
前記マウスは、細胞運動性の破壊、方向持続性の増加、遊走距離の減少、および遊走速度の減少からなる群より選択される、少なくとも１つの表現型を示す、請求項１に記載のコンディショナルノックアウトマウス。
請求項１に記載のマウスから単離された細胞。
前記細胞は、前記マウスの前立腺組織由来である、請求項１０に記載の細胞。
Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子の一部を含む、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子コンディショナルノックアウト構築物であって、ここで該Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子のエキソン１は、５’ｌｏｘＰ部位および３’選択マーカーカセットに隣接し、ここで該選択マーカーカセットは、ｆｒｔ部位および、３’ｆｒｔ部位の３’側および５’ｆｒｔ部位の３’側のｌｏｘＰ部位に隣接する選択マーカーを含む、Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子コンディショナルノックアウト構築物。
配列番号第１４番の配列を有する、請求項１２に記載のＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子コンディショナルノックアウト構築物。
Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子において標的化条件的破壊を有するマウスを産生する方法であって、該方法は、
請求項１２に記載のノックアウト遺伝子構築物を、マウス胚幹（ＥＳ）細胞の集団にトランスフェクトする工程；
選択マーカーを発現するトランスフェクトしたＥＳ細胞を選択する工程；
該トランスフェクトしたＥＳ細胞を、該マウスの祖先の胚に導入する工程；
該胚を満期まで発生させて、生殖系列にコンディショナルノックアウト構築物を有するキメラマウスを産生する工程；
該キメラマウスを繁殖させて、条件的に破壊可能なＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子を有するヘテロ接合性マウスを産生する工程；および
該ヘテロ接合性マウスを、フリッパーゼまたはＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと繁殖させて、該Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子に破壊を有し、そして該選択マーカーを含まないマウスを産生する工程、
を包含する、方法。