CN115161341B - 一种胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型的构建方法与应用 - Google Patents

一种胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型的构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型的构建方法与应用。所述胃窦浸润性肠型胃癌模型小鼠可通过特异性敲除小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因的方法构建得到，包括如下步骤：降低或抑制小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因的表达量或/和PRMT5蛋白的活性。经由病理学分析证实，本发明构建的胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠品系(Prmt5基因敲除小鼠)在4月龄时均发生胃窦肿瘤，在8月龄时部分发生胃窦浸润性肠型胃癌，最终在一年内全部死亡。利用本发明所述方法构建的胃窦肿瘤小鼠模型、胃窦肠型腺瘤小鼠模型或胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型可应用于后期开发或筛选胃癌药物中的应用。

Description

一种胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型的构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型的构建方法与应用。
背景技术
胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，发生率排名第五，死亡率排名第四。腺癌是胃癌的主要类型，根据Laurén分型组织学上可分为高分化肠型和低分化弥漫型。前者多见于胃窦远端及老年患者(60％～80％)，而后者多见于胃体和年轻患者。胃癌是遗传因素和环境因素共同作用的结果。尽管大规模临床样本数据的收集和基因组测序技术的发展提供了多种与人类胃癌发生发展相关的基因和信号通路，但仅有少数遗传突变经由基因工程小鼠模型证实可以体内启动胃肿瘤发生。参与胃癌发生的遗传突变仍是目前的研究热点。
蛋白质精氨酸甲基化是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的蛋白质翻译后修饰，由蛋白质精氨酸甲基转移酶(Protein arginine methyltransferases，PRMTs)家族催化。PRMT5是一种主要的II型蛋白质精氨酸甲基转移酶，可以催化多种蛋白质底物中精氨酸残基的对称二甲基化。众所周知，PRMT5可以促进多种人类癌细胞的增殖、侵袭和迁移，在包括胃癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌等肿瘤的病理学进展中发挥着重要的调节作用。值得注意的是，支持PRMT5促癌功能的证据主要是从体外研究中推断出来的，PRMT5在小鼠体内和胃癌发生阶段的作用及机制仍未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种构建胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型的方法。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种构建胃窦肿瘤小鼠模型的方法。所述方法包括如下步骤：
1)降低或抑制小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因的表达量或/和PRMT5蛋白质的活性，得到胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠；
2)将所述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃组织进行病理学染色，选取胃窦形成肿瘤的胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠，为胃窦肿瘤小鼠模型。
上述病理学染色具体为H&E染色，若胃窦表现为复层上皮和腺腔融合，则胃窦形成肿瘤。
本发明还提供了一种构建胃窦肠型腺瘤小鼠模型的方法，包括如下步骤：
1)降低或抑制小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因的表达量或/和PRMT5蛋白质的活性，得到胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠；
2)将所述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠进行病理学染色和免疫组织化学(immunohistochemical，IHC)染色，选取胃窦形成肿瘤，且胃窦上皮细胞中出现肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin异位表达的胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠，为胃窦肠型腺瘤小鼠模型。
上述病理学染色与构建胃窦肿瘤小鼠模型的方法中相同；
上述免疫组织化学染色具体为IHC染色检测肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin的表达情况，若肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin在胃窦上皮出现异位阳性信号，则判断为胃窦肠型腺瘤。
本发明还提供了一种构建胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型的方法，包括如下步骤：
1)降低或抑制小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因的表达量或/和PRMT5蛋白质的活性，得到胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠；
2)将所述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠进行病理学染色和IHC染色，选取胃窦形成肿瘤、胃窦上皮细胞中出现肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin异位表达且胃窦粘膜下层出现E-cadherin阳性细胞的胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠，为胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型。
上述病理学染色与构建胃窦肿瘤小鼠模型的方法中相同；
上述免疫组织化学染色具体为IHC染色检测肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin的表达情况和E-cadherin的表达情况，若肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin在胃窦上皮出现异位阳性信号且胃窦粘膜下层出现E-cadherin阳性的上皮细胞，则判断为胃窦浸润性肠型胃癌。
上述方法中，所述降低或抑制小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因的表达量或/和PRMT5蛋白的活性可为特异性敲除小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因。
上文所述小鼠模型胃上皮细胞不表达Prmt5基因。
上述方法还可包括使小鼠胃上皮细胞Prmt5基因的表达沉默的过程。
上文所述小鼠Prmt5基因(野生型等位基因，Prmt5+)包括17个外显子，其所在基因组序列的是GenBank Accession No.NC_000080(Update Date 2020-09-22)的第54744639-54754927位核苷酸序列的互补序列，将第54754927位核苷酸记为Prmt5基因的第1位核苷酸，其中，第1-224位为第一外显子序列，第856-974位为第二外显子序列，第1280-1365位为第三外显子序列，第2034-2168位为第四外显子序列，第2584-2696位为第五外显子序列，第2825-2874位为第六外显子序列，第4017-4180位为第七外显子序列，第5317-5478位为第八外显子序列，第5892-5969位为第九外显子序列，第6065-6123位为第十外显子序列，第6208-6330位为第十一外显子序列，第6417-6592位为第十二外显子序列，第7528-7637位为第十三外显子序列，第7834-7927位为第十四外显子序列，第8066-8182位为第十五外显子序列，第8515-8579位为第十六外显子序列，第9524-10289位为第十七外显子序列。
上述小鼠胃上皮细胞Prmt5基因编码的PRMT5蛋白质是氨基酸序列为GenBankAccession No.NP_038796(Update Date 2021-01-03)所示的蛋白质。
上述特异性敲除小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因可为敲除所述受体小鼠胃上皮细胞基因组中Prmt5基因中的第七外显子；
上述特异性敲除小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因可包括采用Cre/loxP系统特异性敲除受体小鼠胃上皮细胞的Prmt5基因。
上述特异性敲除基因可为通过遗传手段使得动物发育的某一阶段或某一特定组织、器官、细胞中的特定基因不表达，而动物发育的其它阶段或其它组织、器官、细胞中的该基因表达正常。例如，胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除可为仅实现胃上皮细胞中的Prmt5基因及蛋白不表达，对其它细胞中Prmt5基因表达没有影响。
所述基因敲除(gene knockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
上述方法中，所述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的构建方法包括如下步骤：
1)将Prmt5条件基因打靶小鼠(Prmt5fl/fl小鼠)与胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶的SP-A-Cre转基因小鼠交配得到F1代小鼠；选择所述F1代小鼠中的双阳性杂合子小鼠，命名为SP-A-Cre；Prmt5fl/+小鼠；
2)将所述SP-A-Cre；Prmt5fl/+小鼠和所述Prmt5fl/fl小鼠交配得到F2代小鼠；选择所述F2代小鼠中的双阳性纯合子小鼠，命名为SP-A-Cre；Prmt5fl/fl小鼠，为胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠；
上述Prmt5fl/fl小鼠是将C57BL/6J小鼠的Prmt5基因替换为Prmt5fl等位基因的纯合子小鼠。
上述Prmt5fl等位基因是将基因组序列GenBank Accession No.NC_000080(UpdateDate 2020-09-22)的第54744027-54754899位核苷酸序列的互补序列(将第54754899位核苷酸记为第1位核苷酸)替换为如下重组DNA分子得到的等位基因：缺失序列表中序列2的第3571位至第10474位核苷酸，保持序列2的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子。
上述SP-A-Cre转基因小鼠为胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。
上述SP-A-Cre转基因小鼠可携带包括SP-A基因启动子和Cre重组酶基因的目的片段。所述SP-A基因启动子可启动所述Cre重组酶基因的表达。
上述F1代小鼠中的双阳性杂合子小鼠SP-A-Cre；Prmt5fl/+为小鼠的一条染色体携带所述Prmt5基因，另一条染色体携带所述Prmt5fl等位基因，且所述SP-A-Cre；Prmt5fl/+小鼠在胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶；
上述F2代小鼠中的双阳性纯合子小鼠SP-A-Cre；Prmt5fl/fl为所述基因敲除小鼠。所述SP-A-Cre；Prmt5fl/fl小鼠的两条染色体均携带所述Prmt5fl等位基因，且所述SP-A-Cre；Prmt5fl/fl小鼠在胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶。
上述方法构建的胃窦肿瘤小鼠模型、胃窦肠型腺瘤小鼠模型或胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型也是本发明保护的范围。
上述Prmt5条件基因打靶小鼠(Prmt5fl/fl小鼠)和上述胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶的SP-A-Cre转基因小鼠(SP-A-Cre小鼠)在构建胃窦肿瘤小鼠模型、胃窦肠型腺瘤小鼠模型或胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型中的应用也是本发明保护的范围。
上述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠在构建胃窦肿瘤小鼠模型、胃窦肠型腺瘤小鼠模型或胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型中的应用也是本发明保护的范围。
上述胃窦肿瘤小鼠模型、胃窦肠型腺瘤小鼠模型或胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型的胃上皮细胞不表达或抑制表达Prmt5基因及其编码蛋白。
上述小鼠胃上皮细胞中的Prmt5基因和/或所述Prmt5基因编码的PRMT5蛋白在开发预防和/或治疗胃癌药物中的应用也属于本发明保护的范围。
上文所述的方法和/或上文所述的胃窦肿瘤小鼠模型、胃窦肠型腺瘤小鼠模型或胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型在筛选预防和/或治疗胃癌药物中的应用也属于本发明保护的范围。
上述胃癌药物可为胃窦肿瘤药物，进一步为进展期胃窦肿瘤药物，再进一步可为为胃窦肠型腺瘤药物，再进一步可以为胃窦浸润性肠型胃癌药物。
本发明通过敲除小鼠胃上皮细胞特异性Prmt5基因的方法构建得到的小鼠模型存在浸润性肠型胃癌的病理特征，包括胃窦肿瘤发生、肠上皮标志物异位表达、胃窦粘膜下层出现E-cadherin阳性的上皮细胞，最终导致小鼠死亡。
利用本发明的方法可以根据研究的需要构建不同的动物模型，例如，用于研究胃窦肿瘤或筛选胃窦肿瘤治疗药物的动物模型，用于研究肠型腺瘤或肠型胃癌中胃上皮肠化生机制或筛选治疗肠型腺瘤或肠型胃癌药物的动物模型，用于研究胃癌浸润或转移机制或筛选治疗胃窦浸润性肠型胃癌药物的动物模型。
附图说明
图1为人胃癌中PRMT5基因改变及RNA和蛋白质表达量、预后相关性分析。
图2为胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的杂交构建示意图和基因型鉴定图。Cre代表Cre重组酶，可以介导loxP序列之间的重组。
图3为胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的Prmt5敲除效率鉴定图。
图4为胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的体重和生存曲线分析。
图5为胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃上皮解剖学分析。
图6为胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃上皮H&E病理分析图。
图7为胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃窦肠型腺瘤鉴定图。
图8为胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃窦浸润性胃癌鉴定图。
图9为胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃窦上皮增殖水平检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
采用GraphPad Prism 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准误表示，采用双尾t检验。
本发明实施例中的小鼠如下：
SP-A-Cre转基因小鼠为胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。该小鼠在文献中的名称为SP-A-Cre transgenic mouse，记载在如下文献中：Meng F,Shi L,ChengX,Hou N,Wang Y,Teng Y,Meng A,Yang X.Surfactant protein A promoter directs theexpression of Cre recombinase in brain microvascular endothelial cells oftransgenic mice.Matrix Biol.2007Jan；26(1):54-7.doi:10.1016/j.matbio.2006.09.003.Epub 2006Sep16.PMID:17059883。SP-A-Cre转基因小鼠(SP-A-Cre小鼠)构建方法具体如下：
该小鼠为将包含SP-A基因启动子、Cre重组酶基因和人生长素基因polyA的SP-A-Cre-hGH目的片段(核苷酸序列如序列1所示)通过显微注射导入至昆明白小鼠受精卵胸原核中，将该受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中，从而获得子代鼠。利用PCR从中筛选出携带Cre重组酶基因的小鼠，通过与C57BL/6J回交获得SP-A-Cre转基因小鼠。SP-A-Cre转基因小鼠在胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶。序列1中，SP-A基因启动子为第1-1414位，Cre重组酶基因为第1466-2658位，人生长素基因polyA为第2718-4875位。
Cre重组酶是序列1的第1466-2658位核苷酸(CDS)编码的蛋白质。
Prmt5条件基因打靶小鼠(Prmt5fl/fl小鼠)在文献中的名称为Prmt5-floxed mice(Prmt5fl/fl)，记载在如下文献中：PLi Z,Xu J,Song Y,Xin C,Liu L,Hou N,Teng Y,ChengX,Wang T,Yu Z,Song J,Zhang Y,Wang J,Yang X.PRMT5 Prevents DilatedCardiomyopathy via Suppression of Protein O-GlcNAcylation.Circ Res.2021Oct15；129(9):857-871.doi:10.1161/CIRCRESAHA.121.319456.Epub 2021Sep 10.PMID:34503365.
小鼠的PRMT5蛋白是氨基酸序列为GenBank Accession No.NP_038796(UpdateDate 2021-01-03)所示的蛋白质。小鼠Prmt5基因(野生型等位基因，Prmt5+)包括17个外显子，其所在基因组序列的是GenBank Accession No.NC_000080(Update Date 2020-09-22)的第54744639-54754927位核苷酸序列的互补序列，将第54754927位核苷酸记为Prmt5基因的第1位核苷酸，其中，第1-224位为第一外显子序列，第856-974位为第二外显子序列，第1280-1365位为第三外显子序列，第2034-2168位为第四外显子序列，第2584-2696位为第五外显子序列，第2825-2874位为第六外显子序列，第4017-4180位为第七外显子序列，第5317-5478位为第八外显子序列，第5892-5969位为第九外显子序列，第6065-6123位为第十外显子序列，第6208-6330位为第十一外显子序列，第6417-6592位为第十二外显子序列，第7528-7637位为第十三外显子序列，第7834-7927位为第十四外显子序列，第8066-8182位为第十五外显子序列，第8515-8579位为第十六外显子序列，第9524-10289位为第十七外显子序列。
Prmt5fl等位基因是将基因组序列GenBank Accession No.NC_000080(UpdateDate 2020-09-22)的第54744027-54754899位核苷酸序列的互补序列(将第54754899位核苷酸记为第1位核苷酸)替换为如下DNA分子得到的等位基因：缺失序列表中序列2的第3571位至第10474位核苷酸，保持序列2的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子。
Prmt5fl/+小鼠的一条染色体替换为Prmt5fl等位基因；另一条染色体上仍为野生型等位基因，Prmt5+。上述Prmt5fl/+小鼠进行自交获得纯合子小鼠Prmt5fl/fl小鼠。Prmt5fl/fl小鼠的两条染色体上的Prmt5基因均替换为Prmt5fl等位基因。
Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2小鼠(Strain#:008875)和Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato报告小鼠(Strain#:007914)均购自Jackson实验室(网址：https://mice.jax.org/)。
下述实施例中涉及部分实验方法如下：
1、胃组织的石蜡包埋及切片
在处死前2小时测量小鼠体重，并向小鼠腹腔注射每克体重100μg BrdU(B5002，Sigma Aldrich)，检测细胞增殖情况。
将取材的小鼠胃组织于4％多聚甲醛(PFA)中固定过夜，然后经过标准程序进行系列组织脱水和石蜡包埋。
用轮转切片机从石蜡包埋后的组织块上切下5μm厚的组织切片，贴于载玻片。37℃过夜，用于后续染色。
人胃癌组织芯片购自西安百斯特生物技术有限公司(ST2084a，https://www.alenabio.com)。
2、H&E染色
上述石蜡组织切片进行烤片、脱蜡和系列乙醇复水后，使用标准技术进行H&E染色。
3、免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)染色
对于IHC和IF染色，在上述石蜡组织切片进行脱蜡和系列乙醇复水后，使用柠檬酸盐溶液(pH 6.0)热处理以修复抗原。
待切片冷却至室温后，3％H2O2 20min中和内源性过氧化物酶活性。
若利用BrdU检测细胞增殖情况，需将组织切片用稀释的盐酸溶液处理20min，其他靶分子不需要此过程。
用山羊血清37℃封闭1小时以减少非特异性抗体结合，然后将切片与下列稀释后一抗4℃孵育过夜:PRMT5(1:100，Abcam，ab109451)，H4R3me2s(1:500，Abcam，ab5823)，E-cadherin(1:300，BD Biosciences，610181)，CDX1(1:200，Sigma Aldrich，HPA055196)，CDX2(1:200，Sigma Aldrich，SAB4301787)，Villin(1:200，Santa Cruz，sc-7672)，RFP(1:500，Rockland，600-401-379；RFP抗体可用于识别tdTomato)，BrdU(1:300，Abcam，ab6326)。PBS清洗后二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)室温孵育1h。
IHC染色采用DAB(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9019)显色和苏木素染核后封片。
IF染色采用Tyramide信号扩增(TSA)法显色。对于多重免疫荧光染色，在完成第一个分子显色后，洗脱，重新完成封闭、一抗二抗孵育和显色过程。待完成最后一个分子的染色后，DAPI染核封片，共聚焦显微镜观察和拍照(Zeiss公司，LSM880)。
4、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)
使用Trizol试剂(Invitrogen，15596026)提取小鼠胃上皮组织的总RNA。
使用逆转录试剂盒(TOYOBO，FSQ-201)将2μg总RNA逆转录为cDNAs。将cDNAs用作RT-qPCR的模板，使用SYBR-Green Master PCR Mix(TOYOBO，QPK-201)和特异性引物进行基因表达分析，以Hprt作为内参。引物序列为Hprt：5’-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-3’和5’-CACAGGACTAGAACACCTGC-3’；Prmt5：5’-AGCCCATCAAAGCAGCCATT-3’和5’-CATTGGGTGGAGGGCGATTT-3’
5、蛋白质印迹分析(Western blot)
使用含磷酸酶抑制剂PPI(Roche，04906837001)和蛋白酶抑制剂PI(Roche，04693159001)的RIPA裂解缓冲液(Applygen，C1053)裂解小鼠胃上皮组织。
使用Pierce BCA蛋白分析试剂(Thermo Fisher，23225)测量蛋白浓度。
根据标准程序，使用稀释浓度为1:1000的兔来源PRMT5一抗(Abcam，ab109451)4℃过夜孵育进行小鼠胃组织中蛋白质表达量分析，β-actin(Abcam，ab8227)用作内参。
6、人类胃癌公共数据库及生存分析
人类癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库公开的人胃癌数据通过癌症基因组学生物门户网站(http://cbioportal.org/pancanatlas)进行可视化，包括DNA改变和mRNA表达。使用Kaplan-Meier Plotter胃癌数据库网页资源(https://kmplot.com/)对公开的人胃癌患者进行生存期分析。
7、统计学分析
采用不成对双尾学生t检验评估两组之间的差异。生存曲线采用Kaplan-MeierPlotter绘制，并通过对数秩检验进行比较。采用单因素方差分析检测人胃癌组织芯片中PRMT5的相对蛋白水平。使用GraphPad Prism 8进行统计分析和数据可视化。数据表示为平均值±标准误。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001对所有结果进行统计学差异判定。
实施例一、PRMT5与人胃癌临床相关性研究
对TCGA数据库公开的434例人原发性胃癌标本的PRMT5基因改变进行分析，结果如图1A所示，在37.1％(161/434)的人原发性胃癌样本中发现PRMT5基因的改变，包括缺失、获得性突变、扩增、截断突变和错义突变(双拷贝缺失，n＝5；单拷贝缺失，n＝104；功能获得性突变，n＝51；扩增，n＝1；截断突变，n＝1；错义突变，n＝3)。其中25.1％(109/434)的人胃癌样本中存在PRMT5的DNA缺失(双拷贝缺失和单拷贝缺失)，其发生率高于获得性突变11.8％(51/434)和扩增0.2％(1/434)，表明PRMT5缺失在人类胃癌样本中很常见，可能与胃癌的形成和发展有关。
分析TCGA数据库中PRMT5基因缺失的104例样本和拷贝数为二倍体的255例样本中PRMT5的mRNA表达水平，结果显示人胃癌标本中PRMT5的基因缺失与其mRNA低表达密切相关(图1B，缺失，n＝104；二倍体，n＝255；***P<0.001，学生t检验)。
通过免疫荧光染色检测人胃癌组织芯片(包含94例患者的肠型胃癌组织和正常癌旁组织)中PRMT5的蛋白水平。结果如图1C所示，40.4％(38/94)的胃癌样本中PRMT5表达低于癌旁组织，17％(16/94)的胃癌样本中PRMT5表达高于癌旁组织。统计学分析表明，PRMT5低表达与胃癌密切相关(n＝94对，**P<0.01，单因素方差分析)。比例尺：200μm。
对Kaplan-Meier Plotter数据库的胃癌患者进行生存曲线分析，发现PRMT5mRNA低表达与胃癌患者生存期短、预后不良有关(图1D，低表达，n＝288；高表达，n＝343，***P<0.001，Log-rank检验)，提示PRMT5可能在胃癌中发挥抑癌基因的作用。
实施例二、胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的构建与鉴定
杂交构建胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的策略如图2A所示。将饲养于SPF动物房的Prmt5fl/fl小鼠与SP-A-Cre小鼠交配得到F1代小鼠，通过PCR鉴定从F1代小鼠中选取双阳性杂合子小鼠，命名为SP-A-Cre；Prmt5fl/+小鼠。
将SP-A-Cre；Prmt5fl/+小鼠与Prmt5fl/fl小鼠交配得到F2代小鼠，通过PCR鉴定从F2代小鼠中选取双阳性纯合子小鼠(SP-A-Cre；Prmt5fl/fl)，命名为胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠。
胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的基因组整合有SP-A-Cre-hGH目的片段(序列表中序列1)，在胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶。该小鼠胃上皮细胞内两条染色体上的基因组序列GenBank Accession No.NC_000080(Update Date 2020-09-22)的第54744027-54754899位核苷酸序列的互补序列(将第54754899位核苷酸记为Prmt5基因的第1位核苷酸)均替换为等位基因Prmt5fl，并且该小鼠胃上皮细胞内两条染色体上的Prmt5fl等位基因的第七外显子均被Cre/loxP系统敲除，即缺失164bp的第七外显子，成为敲除等位基因。
图2A为利用Cre/loxP系统实现胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的杂交构建配策略示意图；SP-A-Cre转基因小鼠利用SP-A蛋白的启动子从胚胎期16.5天开始指导小鼠腺胃上皮细胞中Cre重组酶的表达。Prmt5fl/fl小鼠中Prmt5基因的第七外显子被两个LoxP元件锚定，在Cre重组酶作用的情况下可以实现Prmt5基因七外显子的敲除，从而破坏Prmt5的表达。
上述PCR鉴定获得双阳性杂合子小鼠和双阳性纯合子小鼠的方法如下：
取子代小鼠鼠尾2-3mm，标准程序提取鼠尾基因组DNA。以鼠尾基因组DNA作为模板，使用基因特异性引物进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)鉴定小鼠基因型。以野生型小鼠C57BL/6J小鼠鼠尾基因组DNA为对照。鉴定SP-A-Cre重组酶基因的引物序列为5’-GCATCGACCGGTAATGCAGGC-3’和5’-TTTTCTGAATGGCAGTGCATCTT-3’。鉴定Prmt5基因的引物序列为5’-ACACTGGGTTGCTCACAACTGCA-3’和5’-TGTAAACTCCTGATCCTCCTG-3’。
小鼠的基因型鉴定结果见图2B，图中5个泳道代表5个样本，上图为采用SP-A-Cre引物扩增的产物电泳，如能特异性扩增出481bp片段，则为SP-A-Cre阳性；下图为采用Prmt5引物扩增的产物电泳，如能特异性扩增出一条466bp片段，则为Prmt5fl/fl纯合子，如能特异性分别扩增出312bp片段和466bp片段，则为Prmt5fl/+杂合子，如能特异性扩增出一条312bp片段，则为Prmt5+/+野生型。图中样本1的基因型为Prmt5+/+，样本2的基因型为Prmt5fl/fl，样本3的基因型为SP-A-Cre；Prmt5fl/fl，样本4的基因型为SP-A-Cre；Prmt5fl/+，样本5的基因型为SP-A-Cre；Prmt5fl/fl。因此样本3和5为所需要的胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠。
SP-A-Cre；Prmt5fl/fl子代小鼠(下面又称为Prmt5基因敲除小鼠)，即小鼠基因组的2条染色体中的Prmt5基因均替换为Prmt5fl等位基因，且不表达Prmt5蛋白；
SP-A-Cre；Prmt5fl/+子代小鼠(下面又称为对照小鼠)，即小鼠基因组的1条染色体中的Prmt5基因替换为Prmt5fl等位基因，不表达Prmt5蛋白，且另一条染色体中的Prmt5基因正常表达。
Prmt5+/+子代小鼠，即小鼠基因组的2条染色体中的Prmt5基因均正常表达。
实施例三、胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠中Prmt5基因敲除效率检测
取材2月龄F2代子代SP-A-Cre；Prmt5fl/fl和SP-A-Cre；Prmt5fl/+小鼠的胃上皮组织，并分别检测胃窦和胃体上皮中PRMT5的表达水平。
(一)mRNA水平检测
按照前述方法分别提取小鼠胃窦和胃体组织RNA，并进行RT-qPCR检测Prmt5基因的相对mRNA表达水平。结果显示Prmt5基因敲除小鼠的胃窦和胃体上皮中Prmt5的mRNA表达水平较对照小鼠明显下降(图3A)。n＝4，***P<0.001，学生t检验。
(二)Western blot检测
按照前述方法分贝提取小鼠胃窦和胃体组织蛋白质并进行Western blot检测PRMT5蛋白的相对表达量，发现Prmt5基因敲除小鼠的胃窦和胃体上皮中PRMT5的蛋白水平较对照小鼠显著下降(图3B，n＝4)。
(三)多重免疫荧光检测
按照前述方法固定小鼠胃组织、石蜡包埋切片后进行多重免疫荧光染色检测E-钙粘蛋白E-cadherin、PRMT5和H4R3me2s的表达。
结果如图3C(胃窦)和3D(胃体)所示，PRMT5在对照小鼠胃窦腺腔基部高表达，与已报道的活跃增殖细胞处于同区域；PRMT5在对照小鼠胃体大部分腺腔上皮细胞中也有表达，但是没有呈现区域特异性；在Prmt5基因敲除小鼠的胃窦和胃体上皮腺腔中PRMT5蛋白显著下降。已知H4R3对称二甲基化(H4R3me2s)是PRMT5依赖的，结果显示H4R3的对称二甲基化在Prmt5基因敲除小鼠的胃窦和胃体上皮腺腔中也显著降低。比例尺：50μm。
上述结果表明，与对照小鼠相比，胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃窦和胃体上皮腺腔中PRMT5成功敲除。
实施例四、胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃窦浸润性肠型胃癌表型鉴定
(一)生存时间统计
对F2代20只Prmt5基因敲除小鼠和20只对照小鼠进行为期一年的持续观测，结果显示所有小鼠均正常出生，两个月后所有Prmt5基因敲除小鼠都明显比同窝同性别的对照小鼠更虚弱、体重更轻(图4A)。等方差t检验；雄，n＝4，**P<0.01；雌，n＝4，***P<0.001。
统计小鼠生存时间，利用Graphpad Prism软件绘制生存曲线发现Prmt5基因敲除小鼠相比于对照小鼠存活时间显著缩短(图4B)，Prmt5基因敲除小鼠在在一年内全部死亡，而其同窝对照小鼠在观测期内全部存活(Log-rank检验，***P<0.001)。
(二)解剖学分析
对8月龄Prmt5基因敲除小鼠和对照小鼠断颈处死，取出胃后观察胃的大体形态，沿胃大弯剪开后洗去内容物，观察解剖学结构。
结果如图5所示，与对照小鼠相比，肉眼可见Prmt5基因敲除小鼠的胃窦粘膜上皮明显增厚，而胃体无显著变化。
(三)组织学分析
1.胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的进展性胃窦肿瘤鉴定
F2子代小鼠中8月龄(n＝10)对照小鼠以及2月龄(n＝5)、4月龄(n＝13)和8月龄(n＝10)Prmt5基因敲除小鼠的胃窦上皮组织按照前述方法进行H&E染色。
图6A结果显示对照小鼠的胃窦上皮到8月龄时仍由单层腺腔紧密排列而成。相比之下，Prmt5基因敲除小鼠表现出多阶段的胃窦肿瘤发生过程：2月龄Prmt5基因敲除小鼠100％(5/5)发生增生，表现为粘膜结构紊乱和单层上皮的延长；4月龄Prmt5基因敲除小鼠100％(13/13)具有复层上皮、腺腔融合的微腺瘤，即胃窦肿瘤发生；8月龄Prmt5基因敲除小鼠的胃窦肿瘤腺腔结构更加紊乱。上一行图中方框区域的放大图见下一行图。比例尺：100μm。
针对不同月龄Prmt5基因敲除小鼠和对照小鼠的胃体组织也进行H&E染色，结果显示Prmt5基因敲除小鼠到8月龄时仍未发生胃体肿瘤，腺腔结构与对照小鼠无显著差异(图6B)。比例尺：100μm。
上述结果表明4月龄及以上的胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠100％发生胃窦肿瘤。这指示胃上皮细胞特异性敲除Prmt5引起胃窦肿瘤发生。
2.胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的肠型腺瘤鉴定
肠上皮化生是公认的肠型胃癌和肠型腺瘤危险因素，目前公认的肠上皮化生标志物是CDX1、CDX2和Villin。
对F2子代小鼠中Prmt5基因敲除小鼠的胃窦上皮肿瘤和对照小鼠的胃窦上皮按照前述方法进行IHC染色，检测肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin的表达情况。
结果如图7所示，与对照小鼠相比，Prmt5基因敲除小鼠的胃窦肿瘤获得肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin的异位表达，证实胃上皮细胞特异性敲除Prmt5导致肠型腺瘤或肠型胃癌。比例尺，100μm。
3.胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的浸润性胃癌检测
对F2子代小鼠中8月龄Prmt5基因敲除小鼠(n＝10)和8月龄对照小鼠(n＝2)的胃窦上皮组织按照前述方法进行H&E染色和E-cadherin的IHC染色分析。
将F1代SP-A-Cre；Prmt5fl/+小鼠与Cre报告小鼠品系Rosa 26-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato(Rosa26tdTomato)交配两代，通过PCR鉴定从子代小鼠中选取SP-A-Cre；Prmt5fl/fl；Rosa26tdTomato基因型小鼠。对该小鼠胃窦上皮组织按照前述方法进行tdTomato的IHC染色分析以永久标记重组细胞及其子代。
结果如图8所示，20％(2/10)的Prmt5基因敲除小鼠发生浸润性胃癌，表现为胃窦粘膜下层出现E-cadherin阳性的上皮细胞，并且浸润区细胞为Prmt5敲除的tdTomato阳性细胞，表明Prmt5敲除促进了胃窦肿瘤的发生、进展和转移。
图8中有1个大图和6个小图，黑色虚线划定了粘膜层和粘膜下层的两个区域，右边上行3个小图为大图中左边实线框的放大图，右边下行3个小图为大图中右边实线框的放大图，比例尺，100μm。
这些结果均指示胃上皮细胞特异敲除Prmt5导致小鼠发生胃窦浸润性肠型胃癌。
4.胃上皮细胞特异性基因敲除Prmt5导致胃窦上皮增殖增加
增生作为肿瘤发生的起始步骤，与细胞增殖增加密切相关。
在Prmt5基因敲除小鼠和对照小鼠取材前2h根据体重向小鼠腹腔内注射10mg/mL的BrdU注射液。经过前述取材、石蜡包埋、切片、复水、抗原修复后，需先将组织切片用稀释的盐酸溶液处理20min后阻断内源性过氧化氢酶，再继续后续一二抗的孵育。BrdU的IHC染色检测检测细胞的增殖情况。
结果如图9所示，BrdU阳性细胞仍局限于8月龄对照小鼠子代小鼠胃窦腺体基部。相比之下，早在2月龄Prmt5基因敲除小鼠胃窦中就出现增殖细胞数目显著增加和临时增殖细胞区域明显扩展到整个腺腔。比例尺，100μm；
上述实施例证明胃上皮细胞特异性敲除Prmt5可以引起胃窦浸润性肠型胃癌的病理特征。
通过对胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠进行胃窦肿瘤鉴定、肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin异位表达鉴定以及浸润性胃癌标志物鉴定，构建不同的胃窦肿瘤小鼠模型：
若上述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃窦形成肿瘤，则该小鼠为胃窦肿瘤小鼠模型。
若上述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃窦形成肿瘤且胃窦上皮细胞中肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin出现异位表达，则该小鼠为胃窦肠型腺瘤小鼠模型。
若上述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃窦形成肿瘤，胃窦上皮细胞中肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin出现异位表达。且胃窦粘膜下层出现E-cadherin阳性的上皮细胞，则该小鼠为胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型。
上述各个小鼠模型可以根据需要用作研究或筛选治疗不同类型胃癌药物的动物模型。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型的构建方法与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4875
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
gcaacattta agctttccag ggtctttctt tgtgtgctca gcacttgccg ctcttccctc 60
tgcttgttag ttgcagccat ctgagtggct ggatagcggc atcctattag agtgttggtt 120
tgtatttccc tagttgatgg tgttgttgaa cccctttgga tgtgtcagtt tgtatatctc 180
ccttgcatgt ttgtgtgaat acggacatgc ctgtgaccct gcacacgtac ggaagccgga 240
ggacaacctt gaatgtcact cctcaccgcc caccttgttt cacgtggggt ctgcattgcc 300
actgagcacc gcaggctggg tgacaggaga ttcaggaggt tctccagggt ccatttcttg 360
tctggacaga ggacagctgg gacacaaggt gccttcttca tgtcctgggg ggacaatctc 420
aggccctcac acttgcatgg caaattgctt tactcactga accagctctt tgggcccgtt 480
ttcacacttt attttattct gaaaaatatt tttaattctt ttgttcctct ttttaccttt 540
atttgatttt gtttgttttt attttgtaaa cagatttttt tttgtgggtg tttttgctct 600
gttttcttcc tcttttctcc tcctctttgg ttcccccccc cccgctttat tattattatt 660
attgtttttt ttttcagtcc atttgttacc cacctcctgg tctaccctcc cacagttcct 720
cactcctctt gccctcctga tgtccctccc ctcgctgcca tcccccttcc cctgccaggc 780
ctccccattc cctggggcct cacgtctctc aagggataga catgtcttct ctcactgagg 840
ccagatcagg cagtcctttg ctttatatgt gtcgggtggg ggtgggggtg ggatccccat 900
gctttttaat ttaatcttgc ttctttatct ttttcttttc cctgatctcc ctttatttaa 960
tcttcttgtt attattccca gtatttttaa tccattttca acgttattat ctcctttctg 1020
cttctttcct atggccgttg gtaatagagt tatgacagag ctatagtttt ggttgttctg 1080
atgttttgct ttcttttctg aatggcagtg catcttcacc aggacctcgg aaaggctttc 1140
attttgtgct gctggccaca agtgttaatt tagaatagag ggtgaccttg acaagagaga 1200
gattcccttc ccacacactt gggagtttgc cttctgtggt tctgtgccac cctcaagggt 1260
tctaagtgct cttcttgtta agtgctctga aggaacctga gctgtgtaca cacgatggct 1320
gcttcctgtc cggccctcct ttgtgatagg ggctctgagg gtggggaaag ctgtcagctt 1380
acatatctat aaaggatgcc gtccacttgt ccacgtcgac ctgcagccca agctgtaccc 1440
cctcgaaact gacaggagaa ccaccatggg cccaaagaag aagagaaagg tttcgaattt 1500
actgaccgta caccaaaatt tgcctgcatt accggtcgat gcaacgagtg atgaggttcg 1560
caagaacctg atggacatgt tcagggatcg ccaggcgttt tctgagcata cctggaaaat 1620
gcttctgtcc gtttgccggt cgtgggcggc atggtgcaag ttgaataacc ggaaatggtt 1680
tcccgcagaa cctgaagatg ttcgcgatta tcttctatat cttcaggcgc gcggtctggc 1740
agtaaaaact atccagcaac atttgggcca gctaaacatg cttcatcgtc ggtccgggct 1800
gccacgacca agtgacagca atgctgtttc actggttatg cggcggatcc gaaaagaaaa 1860
cgttgatgcc ggtgaacgtg caaaacaggc tctagcgttc gaacgcactg atttcgacca 1920
ggttcgttca ctcatggaaa atagcgatcg ctgccaggat atacgtaatc tggcatttct 1980
ggggattgct tataacaccc tgttacgtat agccgaaatt gccaggatca gggttaaaga 2040
tatctcacgt actgacggtg ggagaatgtt aatccatatt ggcagaacga aaacgctggt 2100
tagcaccgca ggtgtagaga aggcacttag cctgggggta actaaactgg tcgagcgatg 2160
gatttccgtc tctggtgtag ctgatgatcc gaataactac ctgttttgcc gggtcagaaa 2220
aaatggtgtt gccgcgccat ctgccaccag ccagctatca actcgcgccc tggaagggat 2280
ttttgaagca actcatcgat tgatttacgg cgctaaggat gactctggtc agagatacct 2340
ggcctggtct ggacacagtg cccgtgtcgg agccgcgcga gatatggccc gcgctggagt 2400
ttcaataccg gagatcatgc aagctggtgg ctggaccaat gtaaatattg tcatgaacta 2460
tatccgtaac ctggatagtg aaacaggggc aatggtgcgc ctgctggaag atggcgatta 2520
gccattaacg cggcgtggta cctctagagt cgacccgggc ggcctcgaga gatctacggg 2580
tggcatccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg 2640
cccaccagcc ttgtcctaac cattaacgcg cgaccagctt gatatcgaat tcctgcagcc 2700
cgggggatcc actagtccga tcccaaggcc caactccccg aaccactcag ggtcctgtgg 2760
acagctcacc tagctgcaat ggctacaggt aagcgcccct aaaatccctt tgggcacaat 2820
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ggggcttctg aatgtgagta tcgccatgta agcccagtat ttggccaatc tcagaaagct 2940
cctggtccct ggagggatgg agagagaaaa acaaacagct cctggagcag ggagagtgct 3000
ggcctcttgc tctccggctc cctctgttgc cctctggttt ctccccaggc tcccggacgt 3060
ccctgctcct ggcttttggc ctgctctgcc tgccctggct tcaagagggc agtgccttcc 3120
caaccattcc cttatccagg ctttttgaca acgctatgct ccgcgcccat cgtctgcacc 3180
agctggcctt tgacacctac caggagtttg taagctcttg gggaatgggt gcgcatcagg 3240
ggtggcagga aggggtgact ttcccccgct gggaaataag aggaggagac taaggagctc 3300
agggtttttc ccgaagcgaa aatgcaggca gatgagcaca cgctgagtga ggttcccaga 3360
aaagtaacaa tgggagctgg tctccagcgt agaccttggt gggcggtcct tctcctagga 3420
agaagcctat atcccaaagg aacagaagta ttcattcctg cagaaccccc agacctccct 3480
ctgtttctca gagtctattc cgacaccctc caacagggag gaaacacaac agaaatccgt 3540
gagtggatgc cttctcccca ggcggggatg ggggagacct gtagtcagag cccccgggca 3600
gcacagccaa tgcccgtcct tcccctgcag aacctagagc tgctccgcat ctccctgctg 3660
ctcatccagt cgtggctgga gcccgtgcag ttcctcagga gtgtcttcgc caacagcctg 3720
gtgtacggcg cctctgacag caacgtctat gacctcctaa aggacctaga ggaaggcatc 3780
caaacgctga tgggggtgag ggtggcgcca ggggtcccca atcctggagc cccactgact 3840
ttgagagctg tgttagagaa acactgctgc cctcttttta gcagtcaggc cctgacccaa 3900
gagaactcac cttattcttc atttcccctc gtgaatcctc caggcctttc tctacaccct 3960
gaaggggagg gaggaaaatg aatgaatgag aaagggaggg aacagtaccc aagcgcttgg 4020
cctctccttc tcttccttca ctttgcagag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca 4080
gatcttcaag cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact 4140
caagaactac gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct 4200
gcgcatcgtg cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttctagctgc ccgggtggca 4260
tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac 4320
cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt ccttctataa 4380
tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag 4440
ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc 4500
aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt 4560
ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac 4620
catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac cttggcctcc 4680
caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc tgattttaaa 4740
ataactatac cagcaggagg acgtccagac acagcatagg ctacctggcc atgcccaacc 4800
ggtgggacat ttgagttgct tgcttggcac tgtcctctca tgcgttgggt ccactcagta 4860
gatgcctgtt gaatt 4875
<210> 2
<211> 17878
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
tgtcccgcct cctggggact cttcaccgct tcgtgattgg actctagtat caaggaatcc 60
cggcgtgggc cgcgcgaggg aaaagatggc ggcgatggca gtcggaggtg ctggtggcag 120
ccgcgtgtcc agcgggaggg acctgaattg cgtccccgaa atagctgaca cactgggtgc 180
tgtggccaag caggggtgag ggccggactt ccgccagagg aatgcgggat ccaaatttgg 240
gaaacaagga gggcagacta gtcccctgca gggggtgagg gcttgagaca ccattactcc 300
ttgagtgggg aagacttcgg ccctaagaac gagaggatga aactctgggg gcggggggag 360
ggggcgcgtg tggtcactga gttaaaaaat caggggagtt ctagggtaaa aattaaaagg 420
gacgcacagt cattccttct ctagggcctt gaagactggg attatccgag agtagagaag 480
tataaagagg caatcgagag aagagtttaa tctggcttgg ggaggcatgg gcagtgttgg 540
gtcaagtcta actttgacag tcctggaaag ccagtgaagt cagggaagaa agaagctact 600
tggcttggat ttccatttct cgtttatctt ttcatgattg tgttttggga agaaattggt 660
gcacagtgta gtgaaagtga tgtgccccaa tatgggctga actccgtagc ccgtgggggt 720
gactggtggc tttatggaac tgtgcaaaat caaaatatta aacctagttg gttggatctc 780
tgggccctca ctttacatga tgcttctggg tctgtcgcgg ttgtaggttt gatttcctct 840
gcatgcctgt cttccacccg cgtttcaaga gggagttcat tcaggaacct gctaagaatc 900
ggcctggccc ccagacacga tcagacctac tgctgtcagg aaggggtagg gaccatcccc 960
tgtgcccctt aattattaga ggcaggaata tcttctgctt tataggactt aattctcctc 1020
ctcctctgac ttggttatct attggttagc ccctatgaca tagagaactc ttttttttct 1080
ttcctttcta aaagttgtag tcccctattc ttcatcaggc tatccctata tcagagacaa 1140
aaagtcttgt ctttcatctc tactctttat tctctgctga gaactagaaa ttgatcaaga 1200
acatgccaac tcccattgag tctttgtctt ctcttgggtt ggggatgcag actggaatac 1260
gctaattgtg ggaaagcttt ctccatggat tcatccagac tcaaaagtgg agaagatccg 1320
aaggaactct gaagcggtaa ggcagtttaa tttcttcgtg ggatcccttt aaaggttagg 1380
cctggcctgg gtgttggggc acctatctgc aatctcaagc gttgtgaggt tattcccaca 1440
tcaggaagat aatgagggag gattgagatt ccatgccagg agaagaaaag gaaaaaatta 1500
gttctgtcac taaactaggt caggagagta agctggtaaa tcagagtcca tctaaaagtg 1560
tctggaacga taggtgatgg ttcacatctg taatctcagc agggtccatc tccagcccag 1620
caaatcactg agttccaggc tagttagggc tgtaatctaa gaccctgttc caaaagggtt 1680
tggttctagc tcagtatggc agcttatagc tgtaatacag acactcagga gagtgaacca 1740
gccgggcatg gtggtgcacg cctttaatct cagcacttgg gaggcagagg caggcggatt 1800
tctgagttca aggccagcct ggtccaaaac caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaggga 1860
gagtgagcga ggtcagattc aaagtcaaac tgagttatat agagaattcc agaacagcct 1920
gggctacagt gtcagagcca gtttctgctg ctccctaccc taaaacccta gctcttaatt 1980
gttttctctt gtcttgtgtt tcaggctatg ttacaggagt tgaattttgg ggcatatctg 2040
ggtcttccag ctttcctatt gccccttaat caggaagata acacgaatct ggccagagtt 2100
ctgaccaacc acatccacac tggccaccac tcttccatgg tatgactgag ggttctttcc 2160
tgctctgtat catgatagct gtcccttttg cctagttaca ctcccagtgc atttggcaga 2220
attgaaatgt cagtgttgtt cattcctgac tccgcctaag tgtggtgtgc agaatgtttc 2280
agagcagtat atgtggggct agagacgtcg ctcagtggta gatcacttgc ctaacatacg 2340
tgagcctctg ggaacaaagg atagagaaat aaattatttc tgtttaaaat aaaagacaag 2400
ctaggtattt acacaaggat acgtatgaca tattaaacac gtgtaatcac atttagaaaa 2460
gcatataaag agattaactt gtgaacttga gggaagcttt ctggacctga tgagtgtgaa 2520
acagggtttt aacagggtac ctgttcatat gcagttctgg atgagggtac ccttggtggc 2580
cccagaggac ctgagagatg atgtaattga gaatgccccg actacacaca cagaggagta 2640
cagtggagaa gagaaaacat ggatgtggta tgtctccttt tgctgctgta ctgcgtgggg 2700
tggggtgagg gctatgggga actggtgggg cgtgttcttg agttataggt catatgcccc 2760
taacaggctc tttctttgtt tctgattctg ggcaggtggc ataactttcg gactctgtgt 2820
gactatagca agagaattgc agtaggtaag tccacaaggg ttctgagata tgagcggcct 2880
cctagaaatg agaatcaaca ggctgggcgt ggtggcccac cacctttcat tccagaacat 2940
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gagttctagg atagccagga ctatgtcgac agaccctgtc tttaaaaaaa aaaaagaaag 3060
ccaagcagtg gtggcacacg cctttagtcc ctgcacttag gaggtagagg caggcaagtc 3120
tctacaagtc tgaggccagc ctggtctaca gattaagttc cagggcagtt aagcctacac 3180
agagagacct tatctcaaac aaaagtaaga atgggcagtt tagaacgttc caggacagtc 3240
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gatggctcag tgtttaaaag tgcttgttgc tctatttttg aggatcaaag ttgagatacc 3360
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cctcttctgg cctccatggg ggaactgcac acacatggca catatacaga acacacacat 3480
atgaataaaa atgaatgtaa atattaaagg cgcataacga taccacgata tcaacaagtt 3540
tgtacaaaaa agcaggctgg cgccggaacc gaagttccta ttccgaagtt cctattctct 3600
agaaagtata ggaacttcga accctttccc acaccaccct ccacacttgc cccaaacact 3660
gccaactatg taggaggaag gggttgggac taacagaaga acccgttgtg gggaagctgt 3720
tgggagggtc actttatgtt cttgcccaag gtcagttggg tggcctgctt ctgatgaggt 3780
ggtcccaagg tctggggtag aaggtgagag ggacaggcca ccaaggtcag cccccccccc 3840
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actcagtgaa gcctggggta ccctattgga gtccttcaag gaaacaaact tggcctcacc 3960
aggcctcagc cttggctcct cctgggaact ctactgccct tgggatcccc ttgtagttgt 4020
gggttacata ggaaggggga cgggattccc cttgactggc tagcctactc ttttcttcag 4080
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ctagctttta ttgggatccc ctagtttgtg ataggccttt tagctacatc tgccaatcca 4260
tctcattttc acacacacac acaccacttt ccttctggtc agtgggcaca tgtccagcct 4320
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ccccccaccc ccagtatctg caacctcaag ctagcttggg tgcgttggtt gtggataagt 4440
agctagactc cagcaaccag taacctctgc cctttctcct ccatgacaac caggtcccag 4500
gtcccgaaaa ccaaagaaga agaaccctaa caaagaggac aagcggcctc gcacagcctt 4560
cactgctgag cagctccaga ggctcaaggc tgagtttcag accaacaggt acctgacaga 4620
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gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc 4860
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tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag 5040
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gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 5400
tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgctttg cctggtttcc ggcaccagaa 5460
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tcggcgtttc atctgtggtg caacgggcgc tgggtcggtt acggccagga cagtcgtttg 5760
ccgtctgaat ttgacctgag cgcattttta cgcgccggag aaaaccgcct cgcggtgatg 5820
gtgctgcgct ggagtgacgg cagttatctg gaagatcagg atatgtggcg gatgagcggc 5880
attttccgtg acgtctcgtt gctgcataaa ccgactacac aaatcagcga tttccatgtt 5940
gccactcgct ttaatgatga tttcagccgc gctgtactgg aggctgaagt tcagatgtgc 6000
ggcgagttgc gtgactacct acgggtaaca gtttctttat ggcagggtga aacgcaggtc 6060
gccagcggca ccgcgccttt cggcggtgaa attatcgatg agcgtggtgg ttatgccgat 6120
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ccgttgctga ttcgaggcgt taaccgtcac gagcatcatc ctctgcatgg tcaggtcatg 6360
gatgagcaga cgatggtgca ggatatcctg ctgatgaagc agaacaactt taacgccgtg 6420
cgctgttcgc attatccgaa ccatccgctg tggtacacgc tgtgcgaccg ctacggcctg 6480
tatgtggtgg atgaagccaa tattgaaacc cacggcatgg tgccaatgaa tcgtctgacc 6540
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accttattta tcagccggaa aacctaccgg attgatggta gtggtcaaat ggcgattacc 7860
gttgatgttg aagtggcgag cgatacaccg catccggcgc ggattggcct gaactgccag 7920
ctggcgcagg tagcagagcg ggtaaactgg ctcggattag ggccgcaaga aaactatccc 7980
gaccgcctta ctgccgcctg ttttgaccgc tgggatctgc cattgtcaga catgtatacc 8040
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cagctgagcg ccggtcgcta ccattaccag ttggtctggt gtcaaaaata ataataaccg 8340
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gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 8460
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agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 8580
aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atccggaata acttcgtata gcatacatta 8640
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gctctagata agtaatgatc ataatcagcc atatcacatc tgtagaggtt ttacttgctt 10260
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ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca 10380
caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat 10440
cttatcatgt ctggatccgg gggtaccgcg tcgagaagtt cctattccga agttcctatt 10500
ctctagaaag tataggaact tcgtcgagat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt 10560
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tgattgctgg gcagcttgtc ctggtccccg tttccagccg aagtctttct tactctgtca 13380
cctctgattt caggctagag aactggcagt ttgaagaatg ggggagccag gtgacagttg 13440
tctcatcaga catgcgggaa tgggtggctc cggagaaagc tgacatcatt gtcagtgagc 13500
ttctgggttc ctttgccgac aacgagctgt cacctgagtg tctggatgga gcacagcact 13560
tcctgaaagg tttgtccagg ttggggggaa accatatggc tgcgaactgc tgcttgctag 13620
agtcaaaaaa tctacaagta gccgggcgtg gtggcgcacg cctttaaacc cagcactcgg 13680
gaggcagagg caggcggatt tctgagttcg aggccagcct ggtctacaaa atgagctcca 13740
ggacagccag agctataaag agaaaccctg tctcaaacaa acaaacaaac aaaaaaaaaa 13800
tctacaagtg agctggccag tggtagcgca cgcctttaat cccagcactt gggaggcaga 13860
agcaggtggg tttctgagtt caaggccagc ctggtctaca aagtgagttc caggacagct 13920
agggctgcac agagaaaccc tgcctcgaaa aacaaaccaa accaagccaa aacaagatct 13980
gcaagtgggt ggactagaga ttccctaggg tctgtgggct cggaaggtat ctgtggagca 14040
tttatctgaa atgaggctct gggtgtgatc gctaccttgg gcttaatgtt tgttgggaac 14100
tttatggggt gctgtgatcc ccactgggtt agagtgcagt cagaccttgc ctagtgatgc 14160
tcggcagcag cagcgggctg tgtgtgtgat gtggtcccac aggattgtgt cagcaggtac 14220
ctcgtagtcc tcttagtttg tgtaaggact attgttttca cagagctggg ctctaatagc 14280
ccagagtgtg ttctgttgct aaacagtgca tggctctatg ttggtggttt ttacctttaa 14340
cctatggctc taacttagta agagtgggat tcctgtgacc cagtagcctg tgctccggcc 14400
gtgtccatag caaccttggc ttgttccggt ctttgagcct tcagctgctg taaaaacgcc 14460
atttccctcc ttctgggaac tgatttgacc ctgtggctgt gcagatgatg gcgtgagcat 14520
ccctggagaa tacacctcct tcctggctcc catttcttcc tctaagctgt acaatgaggt 14580
ccgtgcctgt cgggaaaagg accgcgatcc tgaggtaaag agctgctttt ctaggagggg 14640
ctattcttta gtcttctcta ctgtcttcct ctgaagtcga tgaaggtgga agagaagctg 14700
ggggtgaaga aggtggttga aataaagcgg tgttcttgtt tgtttctttg gtgctggagc 14760
cccagcgttc tctgtctatc tcctgaagtt gttgttttct ccctggacag gcacagtttg 14820
agatgcctta tgtggttcgg ttgcacaact tccaccagct ctctgctcct aagccctgct 14880
ttaccttcag ccatcccaac cgaggtaggt tcacgcgtgg ctcttctgac cgagctcccc 14940
gcgtctgcag ctctggccct ccagtgctag agcttattca agtttgccga gtcgctcagg 15000
ggttttggcc ccttgtcatc catccaccat ctttcctgac agatcctatg attgacaaca 15060
accgctactg taccttggag tttcctgtgg aggtgaacac agtgcttcat ggcttcgcag 15120
gctactttga gactgtgctt taccgggaca tcactctgag tgagtgtctg ggacagtgta 15180
tgagcgcatt agcatgggtg actctggttc ggcctgcatg tctttggggg ctgtttcaca 15240
aagcttcctc tgttcctcca tggcttgtta gctgagtact agccgaggtt agctgagtac 15300
tagctgaggt tagctgagta ctagctgagg ttactgccag tcccaatcca gcacagtagc 15360
ttactgggga ggccagagtc caggagtaga ggtctttggt tcttcatttt tatgaccaca 15420
gaagagactc ttctcaacgt agggaagagg gaaaggggag ccctcaaggt ttcattactt 15480
tgtctccaca ggtatccgcc cagagactca ctctcctggg atgttctcat ggttccccat 15540
cttcttcccc attaaggtag gagtcacctc taagacggtg ggtcgaggga caacttgtgc 15600
cagtggtgtt cttctcctgt ccctcagcta gttggctgtg acccatgttc tgttctgtca 15660
cttgctctgc agtcctcttg gggataccca agtaagctac ctggactccc cacatctcca 15720
gcctctcttg tccagtcttt acctggaaga gggatgaatt ttacattatt tgagtttgcc 15780
tttctatcta agcccctcag caccttccca ctgccctcag gtgagagctg gcttggtggg 15840
ttggcttcca gttctctctg ctttgcctgt gaggttcctt gttcatgtct ccaccctgct 15900
aactgcccta ggtttcctgg aatgtctcta ccatcaggcc attttcctga cctccaagaa 15960
taggccagct tcctcttgag tgctttcatg gctcccttcc tgtacagtgt ttactgtgtc 16020
cttgtcactg tccgggggtt ccatattttg acaggatagc taacttttat gagagtcaat 16080
atatattttt ttaaaattta tttatttatt atatgtaagt acactgtagc tgtctttaga 16140
tgccccagaa gagggcatct gatttaatta cagatggttg tgagccacca tgtgattgct 16200
gggatttgaa ctcaggacct caggaagagc agtcagagct cttaaccact gagccatcac 16260
tccagccccc aaggggcaga atattttgtt gtatttatct tttgtttggt ttttgagaaa 16320
gggtttggaa ttatagctca agctggcttt gaaatcctga ttctcctgcc tcagcgtcct 16380
gggtgttggg ttataggttt gtccctacac ttggctgttt attgtctaat ctctgtctgt 16440
cccaccatca ttgccaagta caattcctca ttcaagccgc ctgtgtcttt cgtattacag 16500
cagcccatca cggtgcacga aggccagaac atctgtgtgc gtttctggcg atgcagcaat 16560
tccaagaaag tgtggtacga gtgggcggtg acggcccccg tctgttcttc tattcacaac 16620
cctaccggcc gctcctatac cattggcctc tagccctgca cacagtgtca aaaccttgga 16680
agcagctctg agttctcttc ctacagcaca gaaggtgtag aacatctgct ggttcagttc 16740
ctcagtgaga ccctcagccg ccagagagga gcggttccgg ctgctttcct acctaatgtc 16800
atggtggcca acgggtaggc attcccggac tgccaggcat ggtggtgcat actctttatc 16860
ccagcactcc agaggcagag gcagaggcag atggatctct ttaagttcaa ggctagcccg 16920
gtctacctag caagtttcag gccacctagg gctacatagt gagaccctgt ctccaaaaaa 16980
cgaaaaaaaa aaaaaaaaag aactagagga cacaagccag cagcagtctt cagagcctct 17040
ggcttgggca tgagaactca gcagctctgg atgaagcaac ctcagcagat gctcagccgc 17100
cagagctccc caggggtcag gagagaaagc gaaggctgtg gaagagcccg ggctgcgtgc 17160
atgaacactt gacctgcgct cttcttgccc tactctgttg ttgtttgggt ggtttgtgtc 17220
tgaaggaaac aaataaagtg aagttacggc ctctgctgct ttaccctgct tctttctgcc 17280
tgcctgtttc ctgcacctca ctcaaatccc gcatgttgag gtctgtgctc ttgtcttacc 17340
taagacccaa ggagacccaa gaagctggga atggtcagta gtcgagcagg aagtactcag 17400
tggtaacctg tgaggttctg agtcctgctc atgctgcgtt cgaccccatg tgtcaagccc 17460
ttcagccccg ccccgcccct aggacctctg gttatatgct ttttctgtat ggtccattaa 17520
gtccatttgt tgatttctct aggaaagaga cactgtgggg atatgactaa agctcgctag 17580
cttctccctt ccttagatgg atcgcaggcg tctccagtaa aaccacagag tgattagacc 17640
attcctccat tttgcagaag ggaaatttga agtctgtaca gtgaaatgtt actacctttc 17700
caaacatctc taacagccag taactttttg gaatagtgca gggagtgggc agctgaagtg 17760
tccaggagtt ttggaaaacc taagaaagtg agggttggca ccatcagttc tttttagaac 17820
aatactgcag aactcgtgtc agccaagaaa ttatctcagt taacatttgc aatagggg 17878

Claims (7)

1.一种构建胃窦肿瘤小鼠模型的方法，包括如下步骤：
1）特异性敲除小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因，得到胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠；
2）将所述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的胃组织进行病理学染色，选取胃窦形成肿瘤的胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠，为胃窦肿瘤小鼠模型。
2.一种构建胃窦肠型腺瘤小鼠模型的方法，包括如下步骤：
1）特异性敲除小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因，得到胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠；
2）将所述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠进行病理学染色和免疫组织化学染色，选取胃窦形成肿瘤，且胃窦上皮中出现肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin异位表达的胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠，为胃窦肠型腺瘤小鼠模型。
3.一种构建胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型的方法，包括如下步骤：
1）特异性敲除小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因，得到胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠；
2）将所述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠进行病理学染色和免疫组织化学染色，选取胃窦形成肿瘤、胃窦上皮细胞中出现肠上皮标志物CDX1、CDX2和Villin异位表达且胃窦粘膜下层出现E-cadherin阳性的上皮细胞的胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠，为胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述特异性敲除小鼠胃上皮细胞中Prmt5基因包括采用Cre/loxP系统特异性敲除所述受体小鼠胃上皮细胞的Prmt5基因。
5.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠的构建方法包括如下步骤：
1）将Prmt5条件基因打靶小鼠Prmt5fl/fl小鼠与胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶的SP-A-Cre转基因小鼠交配得到F1代小鼠；选择所述F1代小鼠中的双阳性杂合子小鼠，命名为SP-A-Cre;Prmt5fl/+小鼠；
Prmt5条件基因打靶小鼠Prmt5fl/fl小鼠是将C57BL/6J小鼠的Prmt5基因替换为Prmt5fl等位基因的纯合子小鼠；
所述Prmt5fl等位基因是将基因组序列GenBank Accession No. NC_000080的第54744027-54754899位核苷酸序列的互补序列替换为如下重组DNA分子得到的等位基因：缺失序列表中序列2的第3571位至第10474位核苷酸，保持序列2的其它核苷酸不变得到的重组DNA分子；
2）将所述SP-A-Cre;Prmt5fl/+小鼠和所述Prmt5fl/fl小鼠交配得到F2代小鼠；选择所述F2代小鼠中的双阳性纯合子小鼠，命名为SP-A-Cre;Prmt5fl/fl小鼠，为胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠；
所述双阳性杂合子SP-A-Cre;Prmt5fl/+小鼠为小鼠的一条染色体携带Prmt5基因，另一条染色体携带Prmt5fl等位基因，且所述SP-A-Cre;Prmt5fl/+小鼠在胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶；所述双阳性纯合子SP-A-Cre;Prmt5fl/fl小鼠为小鼠的两条染色体均携带Prmt5fl等位基因，且所述SP-A-Cre;Prmt5fl/fl小鼠在胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶。
6.权利要求5中所述Prmt5fl/fl小鼠和所述胃上皮细胞特异性表达Cre重组酶的SP-A-Cre转基因小鼠在构建胃窦肿瘤小鼠模型、胃窦肠型腺瘤小鼠模型或胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型中的应用；
或，权利要求1-5任一所述方法中所述胃上皮细胞特异性Prmt5基因敲除小鼠在构建胃窦肿瘤小鼠模型、胃窦肠型腺瘤小鼠模型或胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型中的应用；
所述胃窦肿瘤小鼠模型、胃窦肠型腺瘤小鼠模型或胃窦浸润性肠型胃癌小鼠模型的胃上皮细胞不表达或抑制表达Prmt5基因及其编码蛋白。
7.权利要求1-5任一所述方法构建的小鼠模型在筛选预防和/或治疗胃癌药物中的应用。
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