CN118369426A - 通过工程化细胞进入发现受体-配体特异性的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本公开文本涉及用于解码配体‑受体相互作用、用于将核酸和蛋白质递送至靶细胞中以及用于进行单细胞多组学的系统、方法和组合物。公开了工程化慢病毒，所述工程化慢病毒展示在同源受体‑配体相互作用下将货物递送至靶细胞中的配体。还公开了组合物和方法，所述组合物和方法包括展示pMHC或抗原表位的慢病毒，以鉴定pMHC/T细胞受体和抗原/B细胞受体相互作用。
Description
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本申请要求2021年12月6日提交的美国临时专利申请序列号63/286,507以及2022年11月8日提交的美国临时专利申请序列号63/382,860的优先权权益。以上引用的申请的公开内容通过引用以其整体(包括任何附图)明确并入本文。
序列表的并入
将所附序列表中的材料通过引用特此并入本申请。所附序列表文本文件(名为078430-538001WO_Sequence Listing_ST26.xml)创建于2022年12月1日，并且为17KB。
技术领域
本技术总体上涉及细胞生物学领域。更特别地，本技术涉及用于发现和鉴定配体-受体特异性以及用于基因和蛋白质递送的方法和组合物。本技术还涉及解码T细胞受体与MHC肽、抗体和抗原之间、或B细胞受体与B细胞抗原(包括胞内/分泌表位/细胞表面抗原表位)之间以及其他配体-受体之间的相互作用。
背景技术
通过配体-受体相互作用，细胞相互通信。丰富的细胞间通信塑造了哺乳动物细胞的分子程序，以指导特定的行为和细胞命运决定。例如，T细胞表面上的TCR可以识别来自抗原呈递细胞(APC)表面的主要组织相容性复合体(MHC)-抗原复合物并且与其相互作用。TCR和抗体基因经历体细胞重组，以达到大且多样的组库(在人类中约1016个TCRα和β序列)，其由子细胞克隆遗传。T细胞受体和B细胞受体相互作用是高度特异性的并且驱动抗原特异性T细胞和B细胞扩增和分化。解析TCR-抗原相互作用(尤其是将抗原特异性与TCR序列和T细胞状态联系起来)对于理解抗原识别如何驱动T细胞命运决定至关重要。已经开发了多种方法来破译TCR的抗原特异性，所述方法包括：(1)使用人工APC(诸如T-扫描、SABR、T细胞胞啃作用和细胞因子捕获测定)筛选T细胞特异性MHC抗原的细胞报告物测定(Joglekar等人,2019；Kula等人,2019；Lee和Meyerson,2021；Li等人,2019)；(2)针对重组TCR筛选MHC-抗原的酵母展示平台(Birnbaum等人,2012)；(3)基于T细胞的测定，诸如抗原肽刺激后的细胞因子产生(ELISpot)(McCutcheon等人,1997)；(4)DNA条形码化的MHC-肽多聚体，用于通过单细胞测序捕获抗原特异性和TCR序列(TetTCR-seq；Zhang等人,2018)。尽管每种技术具有它们独特的优势，但快速筛选针对原代T细胞的免疫原性MHC-抗原并且同时以高通量方式捕获抗原全景(landscape)、配对的TCR组库、和T细胞表型的基因表达仍具有挑战性。许多现有方法需要在异源性细胞上重新表达受体或配体，并且因此不能直接应用于人临床样品。类似的挑战适用于研究B细胞受体-抗原相互作用，增加了解决抗体识别的已知胞内抗原表位的挑战。
尽管在表征抗原特异性T细胞和B细胞的细胞状态方面取得了巨大进展，但靶向这些抗原特异性细胞并且选择性地重新连接其细胞状态和行为而不干扰其他旁观者T细胞或B细胞仍然具有挑战性。最近使用pMHC呈递纳米颗粒的方法能够实现在抗原特异性T细胞中的mRNA递送，为瞬时调节特异性T细胞开辟了许多可能性(Su等人,2022)。使用pMHC假型病毒的另一项最新研究允许抗原特异性T细胞的基因修饰(Guo和Elledge,2022)。然而，除抗原特异性T细胞之外，仍然缺乏选择性操纵抗原特异性B细胞的技术。
因此，需要用于可靠且快速地系统鉴定配体-受体配对和用于解码受体特异性的方法和组合物。更特别地，需要这样的方法，所述方法可以可规模化地(1)展示许多不同类型的配体，(2)使配体与细胞上的受体匹配，(3)记录信息，(4)操纵表达与配体匹配的受体的细胞。还需要用于以单细胞分辨率探索配体-受体配对以及用于细胞特异性递送基因或蛋白质有效载荷的方法和组合物。
发明内容
在一方面，本公开文本提供了一种工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在所述慢病毒的表面上展示的异源性配体；包含经修饰的病毒包膜蛋白的促融物(fusogen)，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述配体的内源性受体；可操作地连接至慢病毒结构蛋白(例如，与其融合)的报告蛋白；和条形码化RNA。
本公开文本的工程化慢病毒的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述促融物包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白。在一些实施方案中，其中所述经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白包含在所述VSV-G多肽的位置H8、K47、Y209和R354中的任一个处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白包含K47Q取代和R354A取代。
在一些实施方案中，所述配体是或包含蛋白质或表位。
在一些实施方案中，所述配体是或包含MHC肽、抗体、抗原、分泌型蛋白、细胞表面蛋白或可以由细胞表达的其他形式的抗原。在一些实施方案中，所述抗原是或包含胞内抗原。
在一些实施方案中，所述配体可操作地连接至优化的跨膜结构域(例如，与其融合)。在一些实施方案中，所述优化的跨膜结构域是源自HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-A2、ICAM1、CD43、CD162、CD62L、CD49d或LFA-1的跨膜结构域。
在一些实施方案中，所述配体可操作地连接至优化的跨膜结构域和信号肽(例如，与其融合)。
在一些实施方案中，所述工程化慢病毒包含缺陷型整合酶蛋白。
在一些实施方案中，所述报告蛋白是GFP或mNeon。
在一些实施方案中，所述结构蛋白是核衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述结构蛋白是Gag蛋白。
在一些实施方案中，所述条形码化RNA被包封在病毒颗粒中。
在一些实施方案中，所述RNA编码配体(例如，蛋白配体)。
在一些实施方案中，所述RNA编码待递送至靶细胞(例如，宿主细胞)中的目的基因。
在一些实施方案中，所述RNA通过下一代测序技术读出。
在一些实施方案中，所述RNA包含捕获序列，例如，可以用于(例如，在10xGenomics单细胞测序工作流程中)从样品中或在样品内捕获分析物(例如，DNA、RNA、蛋白质)或与所述分析物杂交的序列。
在一方面，本公开文本进一步提供了一种用于鉴定配体-受体对的方法，所述方法包括提供至少一种包含以下的工程化慢病毒：在所述慢病毒的表面上展示的异源性配体；包含经修饰的病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述配体的内源性受体(例如，免疫受体)；与慢病毒结构蛋白融合的报告蛋白；和条形码化RNA；将所述慢病毒与细胞群体合并；并且基于所述报告基因的存在分选所述细胞群体，从而鉴定配体-受体对。
用于鉴定本公开文本的配体-受体对的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述方法包括提供工程化慢病毒群体，所述群体展示了不同的配体。
在一些实施方案中，所述方法包括将慢病毒与细胞合并，并且在约4℃下孵育所述病毒/细胞混合物。
在一些实施方案中，所述方法包括将慢病毒与细胞合并，并且在室温下孵育所述病毒/细胞混合物。
在一些实施方案中，所述方法包括将慢病毒与细胞合并，并且在约37℃下孵育所述病毒/细胞混合物。
在一些实施方案中，所述方法包括将所述病毒/细胞混合物孵育约30分钟、或约1小时或约2小时、或约0.5小时至约2.5小时的任何时间段。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：对病毒RNA进行单细胞测序以鉴定配体序列。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：对细胞的转录组进行单细胞测序以鉴定受体序列。
在一方面，本公开文本进一步提供了将目的分子(例如，目的核酸或蛋白)递送至使用者定义的靶细胞中的方法，所述方法包括提供工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在所述慢病毒的表面上展示的异源性配体；包含经修饰的病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含所述配体的内源性受体(例如，免疫受体)；与慢病毒结构蛋白融合的报告蛋白；和条形码化RNA；使所述慢病毒与包含所述靶细胞的细胞混合物接触；以及将所述核酸或蛋白质仅递送至所述靶细胞中，其中所述靶细胞表达对在所述慢病毒表面上的所述配体有特异性的受体(例如，免疫受体)。
用于递送本公开文本的目的分子的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述配体经修饰以便将货物递送至使用者定义的靶细胞中。
在一些实施方案中，所述目的核酸被包装在所述工程化慢病毒颗粒内部。
在一些实施方案中，所述目的蛋白质可操作地连接至所述慢病毒的gag蛋白(例如，与其融合)。
在一些实施方案中，所述目的蛋白质替代报告物。在一些实施方案中，所述靶细胞在体内。在一些实施方案中，所述靶细胞是离体的。在一些实施方案中，所述靶细胞在体外。在一些实施方案中，所述靶细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞或B细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞并且所述受体是T细胞受体。在一些实施方案中，所述免疫细胞是B细胞并且所述受体是B细胞受体。在一些实施方案中，所述人细胞是原代人血细胞(PBMC)。
在另一方面，本公开文本进一步提供了一种用于鉴定免疫原性抗原的方法，所述方法包括提供工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在所述慢病毒的表面上展示的异源性受体蛋白；包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述受体的天然抗原；与慢病毒结构蛋白融合的报告转基因；和条形码化RNA，其中所述RNA编码抗原信息；将所述慢病毒与所述细胞群体合并；以及基于所述报告物的存在分选所述细胞群体。
用于鉴定本公开文本的免疫原性抗原的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对病毒RNA进行测序以鉴定抗原序列。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括用于测序细胞的受体RNA的步骤。
在另一方面，本公开文本进一步提供了一种鉴定T细胞受体和配对的MHC-肽的方法，所述方法包括提供工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在病毒表面上展示的pMHC；包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述PMHC的T细胞受体；与慢病毒结构蛋白融合的报告转基因；和条形码化RNA；将所述慢病毒与所述细胞群体合并，以及基于所述报告物的存在分选所述细胞群体，从而鉴定所述T细胞受体。
用于鉴定本公开文本的T细胞受体和配对的MHC-肽的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述细胞群体包含人原代T细胞。
在一些实施方案中，所述PMHC由包含以下的RNA编码：串联的信号肽、PMHC、G4S接头、b2m基因、G4S接头和MH等位基因。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：对病毒RNA进行单细胞测序以鉴定MHC肽序列。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：测序所述细胞的受体序列以鉴定MHC肽和T细胞受体序列。
在又另一方面，本公开文本还提供了鉴定B细胞受体或抗体的方法，所述方法包括提供工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在慢病毒表面上展示的表位，其中所述表位可操作地连接至ICAM1跨膜结构域(例如，与其融合)；包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述胞内表位的B细胞受体；与慢病毒结构蛋白融合的报告转基因；和条形码化RNA；将所述慢病毒与B细胞群体合并，以及基于所述报告物的存在分选所述细胞群体，从而鉴定所述B细胞受体或抗体。
用于鉴定本公开文本的B细胞受体或抗体的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述抗原是细胞表面膜蛋白、胞内蛋白、分泌型蛋白或糖基化蛋白。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：对病毒RNA进行单细胞测序以鉴定所述抗原并且匹配B细胞受体序列。
本公开文本进一步提供了鉴定B细胞受体的抗原的方法的至少一个实施方案，所述方法包括提供工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在所述慢病毒的表面上展示的异源性配体；包含经修饰的病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述配体的内源性受体(例如，免疫受体)；与慢病毒结构蛋白融合的报告蛋白；和条形码化RNA；将所述慢病毒与B细胞群体合并，以及基于所述报告物的存在分选所述细胞群体，从而鉴定所述B细胞抗原。
本公开文本还提供了单细胞多组学(single cell multiomics)的方法的至少一个实施方案，所述方法包括提供工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在所述慢病毒的表面上展示的异源性配体；包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述配体的内源性受体；与慢病毒结构蛋白融合的报告转基因；和RNA，其中所述RNA包含抗原序列和用于单细胞测序的捕获标签；在单细胞水平上同时检索转录组和表型信息。
在一些实施方案中，所述单细胞测序是基于微滴的平台(droplet basedplatform)。
在一些实施方案中，所述细胞的表型包括通过CITE-seq得出的表面标志物。
在一些实施方案中，所述信息包括配体序列和受体序列。
在一些实施方案中，所述单细胞多组学使用全细胞作为输入。
在一些实施方案中，所述单细胞多组学使用全细胞作为输入并且包括逆转录步骤。
在又另一方面，本公开文本提供了用于在细胞混合物中选择性耗尽或富集靶细胞群体的方法，所述方法包括：提供(a)如本文所述的工程化慢病毒，和(b)细胞混合物，所述细胞混合物包含(i)表达对在所述工程化慢病毒的表面上展示的配体有特异性的受体的靶细胞群体，和(ii)不表达对在所述工程化慢病毒的表面上展示的所述配体有特异性的受体的非靶细胞群体；使所述工程化慢病毒与所述细胞群体接触，并且将所述核酸或蛋白质仅递送至所述靶细胞中；添加试剂，所述试剂特异性抑制所述靶细胞群体的生长或抑制所述非靶细胞群体的生长，从而选择性耗尽或富集所述靶细胞群体。在一些实施方案中，所述受体是免疫受体。在一些实施方案中，所述免疫受体是B细胞受体。在一些实施方案中，免疫受体是T细胞受体。
本公开文本的用于选择性耗尽或富集靶细胞群体的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述靶细胞表达单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)转基因，并且所添加的试剂包含或是更昔洛韦(GCV)。在一些实施方案中，所述靶细胞表达shRNA以减少细胞死亡受体FAS的表达以预防靶群体的细胞死亡。在一些实施方案中，所述靶细胞群体包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞包含T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞包含B细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是自身反应性免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞对与健康状况相关的抗原有特异性。在一些实施方案中，健康状况是增殖性障碍、炎性障碍、自身免疫性障碍或微生物感染。在一些实施方案中，增殖性障碍是癌症。在一些实施方案中，微生物感染是细菌感染、病毒感染或微真菌感染。
前述发明内容仅是说明性的并且不旨在以任何方式进行限制。除了本文描述的说明性实施方案和特征之外，根据附图、详细描述和权利要求，本公开文本的其他方面、实施方案、目的和特征也将变得完全清楚。
尽管本公开文本的各种特征可以在单个实施方案的上下文中描述，但所述特征也可以单独地或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独实施方案的上下文中描述本公开文本，但本公开文本也可以在单个实施方案中实现。
附图说明
图1A-图1G展示了病毒展示平台，以在病毒表面上展示配体蛋白和促融物，递送荧光蛋白，以及通过细胞进入记录配体-受体相互作用。图1A示出了示例性一体化平台的示意图。慢病毒在不同的组分中被工程化，包括：(1)在病毒表面上展示的使用者定义的配体蛋白；(2)具有完整融合能力和与天然受体的缺陷结合的经修饰的促融物；(3)与病毒结构蛋白融合的货物蛋白；和(4)用于追踪和基因递送的条形码病毒RNA。
图1B示出了实验设置的示意图和在病毒感染3天后GFP表达的流式细胞术分析。Raji和Jurkat细胞被三组在病毒RNA中编码GFP的慢病毒感染：(1)具有野生型VSV-G的病毒(左)；(2)具有受体结合突变的VSV-G的病毒(中)；(3)具有VSV-G突变体和抗CD19单链抗体可变片段(scFv)的病毒。
图1C示出了实验设置的示意图(顶部)。GFP蛋白与基质蛋白(MA-GFP)或核衣壳蛋白(NC-GFP)或病毒蛋白R(VPR-GFP)融合。将携带与不同病毒蛋白融合的GFP蛋白的展示scFv-CD19的病毒与Raji(CD19+)或Jurkat(CD19-)细胞一起孵育2小时，并且然后经受流式细胞术。条形图(底部)示出了在孵育具有不同GFP融合病毒蛋白的病毒后GFP+细胞的百分比。
图1D示出了如在图1C中的短暂病毒孵育后，GFP信号的示例性流式细胞术图。
图1E示出了实验设置的示意图和与或不与病毒一起孵育的原代人B细胞中GFP信号的流式细胞术分析。将幼稚的和激活的人原代B细胞与融合NC-GFP并且展示scFv-CD19的病毒一起孵育2小时并且然后经受流式细胞术分析。将B细胞对活CD20+细胞门控。
图1F是来自图1E的组的表面CD19表达的直方图分析。
图1G描绘了条形图，所述条形图示出了幼稚和激活的人B细胞中的scFv-CD19病毒结合和CD19表面表达。图1C和图1F中的P值通过未配对t检验计算。****P<0.0001，***P<0.001。
图1H-图1N展示了如何通过ENTER破译共刺激分子的配体-受体的特异性相互作用。
图1H描绘了在蛋白酶K处理之前和之后，在不同温度下，展示scFv-CD19的病毒在Raji B细胞上的病毒结合和融合的流式细胞术分析。
图1I是条形图，所述条形图示出了来自图1H的GFP+细胞的百分比。
图1J示出了实验设置的示意图。将表达CD40的Raji B细胞与展示野生型CD40配体(CD40L)或与其同源受体CD40结合减少的CD40L突变体(K142E，R202E)的GFP病毒一起孵育。
图1K示出了在与展示野生型CD40L或突变体CD40L的GFP病毒一起孵育后，Raji B细胞中GFP信号的流式细胞术分析。
图1L是示出了来自图1K的GFP+细胞的百分比的条形图。通过非配对t检验计算p值。***P<0.001。
图1M示出了免疫捕获测定的示意图。在该测定中，将磁珠与抗CD40L、抗VSV-G和IgG抗体缀合，并且然后与展示CD40L的病毒一起孵育。使免疫捕获的病毒经受病毒RNA分离和CD40L的qRT-PCR。
图1N描绘了条形图，所述条形图示出了通过如图1M中的不同抗体缀合珠进行的ENTER病毒富集的qRT-PCR结果。所有p值均通过非配对t检验计算。n.s.不显著p≥0.05；*p<0.05；***p<0.001。
图2A-图2F示出了ENTER如何解码MHC-肽(pMHC)与TCR之间的相互作用。
图2A示出了展示pMHC的病毒的示意图和在孵育展示pMHC的病毒后在表达特异性TCR的Jurkat T细胞中的GFP信号的流式细胞术分析。将展示由HLA-A0201(A2)等位基因呈现的9聚体肽(NY-ESO-1157-165)或由HLA-A0101(A1)等位基因呈现的11聚体CMV肽(pp65363-373)的GFP融合病毒与表达识别同源抗原的特异性TCR(例如，NY-ESO-1157-165-TCR或CMV-pp65363-373-TCR)的T细胞一起孵育。SP：信号肽；肽：抗原肽；B2M：β-2-微球蛋白。
图2B示出了在孵育展示各种HLA-A2呈递肽的病毒后表达特异性TCR(例如，NY-ESO-1157-165-TCR、CMV pp65495-5033-TCR或Flum1(58-66)-TCR)的Jurkat T细胞中GFP信号的流式细胞术分析。展示HPV16 E782-91肽的病毒用作阴性对照。
图2C示出了在孵育2X 108个ENTER病毒颗粒(其展示ny-eso-1157-166抗原(左)或具有不同量的ny-eso-1157-166pMHC四聚体)后NY-ESO-1TCR-T细胞的流式细胞术图。
图2D示出了展示具有不同TCR亲和力的抗原变体的病毒的结合效率(GFP+％)的比较。将1G4wt-TCR T细胞与展示突变体ny-eso-1157-166抗原变体的野生型的ENTER一起孵育2小时。将CMV-pp65495-503-TCR T细胞用作阴性对照。使用p24蛋白水平将病毒滴度归一化。
图2E示出了实验设置的示意图(顶部)和TCR-T细胞混合实验的流式细胞术分析(底部)。将Flu-m158-66-TCR T细胞通过CellTrace Violet染料标记，并且然后以不同比率与CMV-pp65495-503-TCR T细胞混合。将混合的T细胞群体与展示HLA-A2:m1的GFP病毒一起孵育2h，并且然后经受流式细胞术。代表性流式细胞术图示出了两种T细胞群体的1:1000混合和对Violet+和Violet-群体门控的T细胞的GFP信号。
图2F描绘了条形图，所述条形图示出了在图2E和图2J中的ENTER的信噪比。
图2G示出了野生型HEK293T、HLA-KO HEK293T和HLA-A2重建的HLA-KO HEK293T细胞中HLA-A2和B2M表面表达的流式细胞术分析。
图2H示出了在展示HLA-A2-肽的GFP病毒的2小时孵育、随后PE-四聚体染色后，CMV-pp65495-503-TCR T细胞的流式细胞术图。展示M1(58-66)(流感抗原)的病毒和M1(58-66)四聚体是阴性对照。
图2I示出了直方图(左)和条形图(右)，其示出了四聚体强度和CMV-pp65495-503-TCR T细胞的CD3表面表达。
图2J示出了实验设计的示意图(顶部)和T细胞混合实验的流式细胞术分析(底部)。将Flu-m158-66-TCR T细胞通过CellTrace Violet染料标记，并且然后以不同比率与NY-ESO-1157-165-TCR T细胞混合。将混合的T细胞群体与展示HLA-A2:m1的GFP病毒一起孵育2h，并且然后经受流式细胞术。代表性流式细胞术图示出了两种T细胞群体的混合和对Violet+和Violet-群体门控的T细胞的GFP信号。
图2K描绘了条形图，所述条形图示出了来自图2J的ENTER的灵敏度(左)和特异性(右)。
图3A-图3F展示了ENTER的优化以在病毒表面上呈递胞内抗原并且解码BCR与抗原之间的相互作用。图3A示出了实验设计的示意图。在慢病毒的组装和出芽期间，某些宿主细胞表面蛋白可以掺入病毒表面中。将选自文献的宿主蛋白的TM结构域与源自胞内抗原HPV16 L2的B细胞表位融合。将这些展示HPV表位的GFP病毒与表达靶向该HPV表位的BCR的B细胞(中靶)或没有任何BCR表达的B细胞(脱靶)一起孵育。
图3B示出了与GFP病毒一起孵育的B细胞中GFP信号的流式细胞术分析，所述GFP病毒展示了与不同TM结构域融合的HPV表位。将无BCR表达的B细胞用作阴性对照。
图3C描绘了条形图，所述条形图示出了来自图3B的GFP+B细胞。
图3D示出了在孵育展示SARS-CoV-2刺突RBD抗原或HPV L2抗原的ENTER病毒(作为阴性对照)后在RBD-BCR+B细胞中GFP信号的流式细胞术分析(左)。条形图示出了在孵育中靶或脱靶ENTER病毒后GFP+细胞的频率(右)。
图3E示出了实验设置的示意图(顶部)和B细胞混合实验的流式细胞术分析(底部)。将RBD-BCR+B细胞通过cell trace violet染料标记并且然后以不同比率与HPV-BCR+B细胞混合。将混合的B细胞群体与展示与ICAM1 TM结构域融合的RBD抗原的GFP病毒一起孵育，并且然后经受流式细胞术。代表性流式细胞术图示出了两种B细胞群体的1:1000混合和对Violet+和Violet-群体门控的B细胞的GFP信号。
图3F描绘了条形图，所述条形图示出了来自图3E和图3I的ENTER的信噪比。
图3G-图3P示意性地总结了为通过ENTER解码B细胞的抗原特异性以及表征货物递送效率和特异性而进行的实验的结果。图3G描绘了与展示HER2的病毒或展示RBD的病毒一起孵育的HER2-BCR+B细胞中GFP+细胞的流式细胞术分析。
图3H描绘了条形图，所述条形图示出了如在图3G中的GFP+细胞的百分比。
图3I示出了实验设计的示意图(顶部)和B细胞混合实验的流式细胞术分析(底部)。将RBD-BCR+B细胞通过CellTrace Violet标记并且以不同比率与HPV-BCR+B细胞混合。将混合的B细胞群体与展示与ICAM1 TM结构域融合的RBD抗原的GFP病毒一起孵育，并且然后经受流式细胞术。代表性流式细胞术图示出了两种B细胞群体的混合和对Violet+和Violet-群体门控的B细胞的GFP信号。
图3J描绘了条形图，所述条形图示出了来自图3I的ENTER的灵敏度。
图3K描绘了条形图，所述条形图示出了来自图3I的ENTER的灵敏度。
图3L描绘了条形图，所述条形图示出了具有野生型VSV-G的病毒在具有不同抗原特异性的细胞类型中的递送效率。通过非配对t检验计算p值。n.s.不显著P>0.05。
图3M描绘了在T细胞混合实验中货物递送的流式细胞术分析。将表达mScarlet的NY-ESO-1TCR+T细胞与CMV-pp65 TCR T细胞混合，并且然后用展示pp65495-503抗原并且携带含有HSV-TK和GFP的转基因的ENTER病毒感染。
图3N描绘了在B细胞混合实验中货物递送的流式细胞术分析。将表达mScarlet的RBD BCR+B细胞与HER2 BCR+B细胞混合，并且然后用展示HER2抗原并且携带含HSV-TK和GFP的转基因的ENTER病毒感染。
图3O描绘了直方图，所述直方图示出了用不同FAS shRNA或对照shRNA转导的T细胞中FAS的表面表达。
图3P描绘了代表性流式图，所述代表性流式图示出了抗FAS诱导的细胞凋亡和细胞死亡后T细胞的膜联蛋白V和7-AAD门控。
图4A-图4M示意性地总结了为证明ENTER允许抗原特异性T细胞或抗原特异性B细胞的选择性耗尽或扩增而进行的实验的结果。图4A是抗原特异性T细胞中货物递送的示意图(左)。将CMV-pp65 TCR+T细胞或NY-ESO-1TCR+T细胞用展示pp65495-503并且携带GFP转基因作为货物的ENTER病毒单独感染。代表性直方图示出了在2天感染后CMV-pp65 TCR+T细胞与NY-ESO-1TCR+T细胞之间的GFP表达。
图4B是示出了如在图4A中的GFP+细胞的百分比的条形图。
图4C是在抗原特异性B细胞中货物递送的示意图(左)。将HER2 BCR+B细胞或RBDBCR+B细胞用展示HER2并且携带GFP转基因作为货物的ENTER病毒单独感染。代表性直方图示出了在2天感染后HER2 BCR+T细胞与RBD BCR+B细胞之间的GFP表达。
图4D是示出了如在图4C中的GFP+细胞的百分比的条形图。
图4E是在不同的抗原特异性T细胞的库中的自杀基因递送的示意图。将表达mScarlet的CMV-pp65 TCR+T细胞和NY-ESO-1TCR+T细胞混合在一起，并且然后感染展示pp65495-503并且携带单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)转基因的ENTER病毒。在感染2天后，添加更昔洛韦(GCV)药物以杀死表达HSV-TK的细胞并且监测细胞存活持续4天。
图4F是示出了在GCV处理后第4天的活T细胞的数量的条形图。
图4G示意性地总结了在GCV药物处理后CMV-pp65 TCR+T细胞的数量与NY-ESO-1TCR+T细胞(其用携带GFP基因的ENTER或携带HSV-TK基因的ENTER感染)的数量之间富集倍数的动力学分析的结果。
图4H是在不同的抗原特异性B细胞库中自杀基因递送的示意图。将表达mScarlet的HER2 BCR+B细胞和RBD BCR+B细胞混合在一起，并且然后感染展示pp65495-503并且携带HSV-TK转基因的ENTER病毒。在感染2天后，添加GCV药物以杀死表达HSV-TK的细胞并且监测细胞存活持续4天。
图4I是示出了在GCV处理后第4天的活B细胞的数量的条形图。
图4J示意性地总结了在GCV药物处理后HER2 BCR+B细胞的数量与RBD BCR+B细胞(其用携带GFP基因的ENTER或携带HSV-TK基因的ENTER感染)的数量之间富集倍数的动力学分析的结果。
图4K是在不同的抗原特异性T细胞的库中shRNA递送的示意图。将CMV-pp65TCR+T细胞和表达mScarlet的NY-ESO-1TCR+T细胞混合在一起，并且然后感染展示pp65495-503并且携带FAS shRNA或对照shRNA的ENTER病毒。添加抗FAS抗体以诱导细胞凋亡。
图4L是条形图，所述条形图示出了在脱靶NY-ESO-1TCR+T细胞(未感染组)和用对照shRNA或FAS shRNA转导的中靶CMV-pp65 TCR+T细胞中的FAS的表面表达。
图4M是条形图，所述条形图示出了通过如图4K中的活细胞的shCtrl组(对膜联蛋白V和7-AAD双重阴性的门控)归一化的CMV-pp65 TCR+T细胞/NY-ESO-1TCR+T细胞富集倍数。通过非配对t检验计算P值。****P<0.0001；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05；n.s.P≥0.05。
图4N-图4W示意性地总结了为优化ENTER以检测抗原特异性原代人T细胞进行的实验的结果。
图4N是在与展示ny-eso-1157-165抗原肽的GFP病毒(其病毒RNA是完整的或插入了测序捕获标签)一起孵育后，在表达TCR(NY-ESO-1TCR或CMV pp65-TCR)的T细胞中的GFP信号的流式细胞术分析。
图4O是示出了来自图4N的GFP+细胞的百分比的条形图。通过非配对t检验计算P值。n.s.P>0.05。
图4P是实验设计的示意图。将供体分离的T细胞与携带GFP或mNeon荧光蛋白的展示pp65495-503的病毒一起孵育，并且然后用pp65495-503四聚体和其他抗体染色，随后进行流式细胞术。我们首先对CD3+CD8+T细胞门控以使用四聚体作为阳性对照测量pp65特异性T细胞，并且然后监测pp65四聚体+T细胞中的GFP信号。
图4Q是如在图4P中的被CMV感染的来自供体的原代人T细胞中四聚体和GFP信号的流式细胞术分析。
图4R是示出了在来自图4Q的pp65四聚体+T细胞中GFP+和GFP-细胞的百分比的条形图。通过非配对t检验计算p值。*p<0.05。
图4S是代表性流式细胞术图，其示出了在用pp65495-503病毒或阴性对照病毒(ny-eso-1157-165)孵育后pp65四聚体+T细胞中的GFP+细胞。
图4T是实验设计的示意图。从CMV血清反应阳性HLA-A2+供体分离PBMC，并且用十二种不同的CMV抗原肽的库(10μg/mL)培养10天。将原代T细胞在肽诱导的扩增之前或之后与展示pp65抗原的mNeon病毒一起孵育2小时，并且然后用抗体染色，随后进行流式细胞术。
图4U是代表性流式细胞术图，其示出了在15天扩增后在pp65495-503肽富集的T细胞中，展示pp65495-503四聚体和pp65495-503的mNeon病毒的共染色。这些T细胞对活CD8+CD3+T细胞进行门控。
图4V是代表性流式细胞术图，其示出了在如图4T中的汇集的CMV肽诱导的扩增之前或之后来自4个不同CMV血清反应阳性供体的GFP+T细胞(通过12个汇集的HLA-A2:CMV-抗原mNeon病毒染色)的百分比。
图4W是MA图，其示出了与pp65495-503四聚体或展示pp65495-503的ENTER病毒一起孵育的CMV-pp65 TCR T细胞的批量RNA-seq分析。具有log2变化倍数和经调整的p值<0.01的基因以红色突出显示。
图5A-图5F示意性地展示了用于大规模并行测量抗原肽序列、TCR序列和转录组的ENTER-seq。图5A示出了ENTER-seq工作流程的示意图。将展示单独pMHC的汇集的病毒的文库与T细胞一起孵育2小时。分选GFP+T细胞用于基于微滴的单细胞基因组学剖析(例如，用于基因表达和V(D)J免疫剖析的10x Genomics 5'试剂盒)。
图5B示出了用于基于微滴的单细胞捕获的病毒RNA工程化策略。将10x Genomics捕获标签插入在B2M与HLA-A2之间的接头区中。在CMV启动子后插入10x Genomics PCR柄。CMV：CMV启动子；SP：信号肽序列；肽：抗原肽；B2M：β-2-微球蛋白；MHC I类：HLA-A0201等位基因；LTR：长末端重复序列；TSO：模板转换寡核苷酸序列。
图5C示出了ENTER-seq的T细胞混合实验的示意图。
图5D示出了与每个细胞条形码(点)相关的Pp65(495-503)-TCR T细胞UMI计数(x轴)和NY-ESO-1157-165-TCR UMI计数(y轴)的数量。将颜色指定为NY-ESO-1157-165-TCR+T细胞(浅蓝色)、Pp65(495-503)-TCR+T细胞(红色)和双重体(doublet)(绿色，具有NY-ESO-1157-165-TCR和Pp65(495-503)-TCR两者)。
图5E示出了去除双重体后TCR UMI计数的散点图，按pp65(495-503)-抗原UMI计数在总UMI计数中的富集比(左)和nyeso157-165-抗原UMI计数在总UMI计数中的富集比(右)着色。
图5F示出了去除双重体后与每个细胞条形码(点)相关的pp65(495-503)-抗原UMI计数(x轴)和nyeso157-165-抗原UMI计数(y轴)的数量。将颜色分配为NY-ESO-1157-165-TCR+T细胞(浅蓝色)和Pp65(495-503)-TCR+T细胞(红色)。
图5G-图5N示意性地总结了为通过ENTER-seq表征T细胞亚群而进行的实验的结果。图5G是UMAP图，其示出了经由在去除ENTER诱导的基因特征之前或之后通过聚类得到的CMV特异性T细胞(黄色)和旁邻T细胞(蓝色)。
图5H是示出了人CD8 T细胞亚群的10个聚类簇的UMAP图。
图5I描绘了UMAP图，其示出了来自CITE-seq的表面蛋白CD127的量以及对于幼稚T细胞的基因(CCR7、SELL和LEF1)的表达。
图5J描绘了UMAP图，其示出了细胞溶解分子的基因表达。
图5K描绘了UMAP图，其示出了对于MAIT细胞的标志物的基因表达。
图5L描绘了UMAP图，其示出了每个亚群/聚类簇的标志物基因的表达。
图5M是示出了供体来源的UMAP图。
图5N示出了按供体来源分开的来自CMV抗原特异性T细胞(ENTER+)和旁邻T细胞(ENTER-)中的10个聚类簇的T细胞亚群的分数。
图6A-图6I示意性地总结了离体扩增的CMV特异性原代T细胞的ENTER-seq的结果。图6A示出了CMV抗原肽诱导的T细胞扩增和ENTER-seq工作流程的示意图。
图6B是UMAP图，其示出了有(ENTER+，以黄色着色)或没有(ENTER-，以蓝色着色)展示CMV抗原的病毒的结合的细胞。
图6C描绘了UMAP图，其示出了CD45RA(幼稚标志物)和CD45RO(记忆标志物)的表面蛋白表达的CITE-seq。
图6D是示出了以不同颜色标记的人CD8+T细胞亚群的10个聚类簇的UMAP图。
图6E是条形图，其示出了在供体#1(以黑色标记)和供体#2(以灰色标记)中识别特异性CMV抗原表位的CMV抗原特异性T细胞的数量。
图6F描绘了UMAP图，其示出了对于鉴定自图6E的前3种CMV抗原表位，每个细胞的CMV抗原表位的量。
图6G是热图，其示出了不同CMV抗原特异性T细胞中与效应子功能或Treg特征相关的代表性基因的柱标度的表达。
图6H是UMAP图(左)，其示出了按每种克隆型的细胞数量着色的CMV抗原特异性T细胞的克隆扩增大小。小提琴图(右)示出了通过抗原表位着色的不同CMV抗原特异性T细胞中克隆大小的分布。
图6I是小提琴图，其示出了在按CDR3克隆分开并且着色的pp65495-503特异性TCR克隆体中细胞因子和转录因子的表达。简化模型(右)。
图6J-图6P总结了离体扩增的CMV特异性T细胞的TCR克隆型分析的结果。图6J描绘了UMAP图，其示出了CMV抗原特异性T细胞(ENTER+)和旁邻T细胞(ENTER-)的克隆扩增大小。
图6K：按供体着色的CMV抗原特异性T细胞的TCR克隆型。每个圆圈表示具有相同CDR3核苷酸序列的克隆型。圆圈的大小表示每种克隆型的细胞数量。
图6L描绘了散点图，其示出了克隆扩增大小与细胞毒性基因得分的相关性。
图6M描绘了散点图，其示出了克隆扩增大小与耗尽基因得分或激活基因得分的相关性。
图6N是pp65495-503特异性TCR克隆的总结表，其示出了具有相同CDR3氨基酸序列的趋同TCR克隆型。
图6O是US874-82特异性和UL100200-208特异性TCR克隆的总结表。
图6P描绘了按CDR3克隆分开并且按10个聚类簇着色的在pp65495-503特异性TCR克隆中T细胞亚群的分数。通过皮尔森相关性(Pearson correlation)计算图6L-图6M中的系数r和p值。
图7A-图7K示意性地总结了从CMV血清反应阳性患者血液中直接分离(例如，无体外扩增)的原代CMV特异性T细胞的ENTER-seq的结果。图7A描绘了来自患者血液的原代T细胞的分离和ENTER-seq工作流程的示意图。
图7B是UMAP图(左)，其示出了有(ENTER+，以黄色着色)或没有(ENTER-，以蓝色着色)展示CMV抗原的病毒的结合的细胞。UMAP图(右)示出了以不同颜色标记的人CD8+T细胞亚群的13个聚类簇。
图7C描绘了UMAP图，其示出了来自CITE-seq的CD45RA和CD45RO的表面蛋白表达和代表性基因的表达。
图7D是热图，其示出了在不同聚类簇中，与不同功能(例如，I型IFN、细胞毒性等)相关的基因的表达的标度化z得分。
图7E是示出了按抗原表位着色的CMV抗原特异性的UMAP图。
图7F是UMAP图(左)，其示出了按每种克隆型的细胞数量着色的CMV抗原特异性T细胞的克隆扩增大小。
图7G是小提琴图，其示出了在具有不同克隆大小的T细胞中每个细胞结合的pMHC的数量。通过曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)计算P值。n.s.p≥0.05；*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图7H是CITE-seq密度图，其示出了在肽诱导的扩增之前和之后，来自供体#1(按橙色着色)和供体#2(按蓝色着色)的pp65特异性T细胞中CD45RA和CD45RO的表面表达。
图7I描绘了流式细胞术图，其示出了在肽诱导的扩增之前和之后在来自供体#1和供体#2的pp65特异性T细胞中的CD45RA和CD45RO。
图7J是密度图，其示出了在pp65特异性T细胞的前3种TCR克隆中，在肽诱导的扩增之前和之后，I型IFN ISG基因得分和细胞毒性基因得分的分布(左)。密度图示出了pp65特异性T细胞的前3种TCR克隆中，在肽诱导的扩增之前和之后IL13和EOMES的表达(右)。
图7K是在离体扩增后CMV特异性T细胞的表型转变的建议模型。
图7L-图7T示意性地总结了直接从患者血液中分离的CMV特异性T细胞的克隆内表型多样性的结果。图7L描绘了UMAP图，其示出了与不同功能(I型IFN ISG、细胞毒性、趋化因子和转录因子)相关的关键基因的表达。
图7M描绘了UMAP图，其示出了在去除ENTER诱导的基因特征之前和之后直接分离自患者血液样品的原代T细胞的亚群聚类。
图7N描绘了UMAP嵌入密度图，其示出了不同CMV抗原表位的CMV抗原特异性T细胞的密度。
图7O是条形图，其示出了在肽诱导的扩增之前和之后，具有共有TCR的US874-82特异性T细胞的百分比。
图7P描绘了按供体分开并且按TCR CDR3序列着色的在扩增前分离自新鲜PBMC的US874-82特异性T细胞的数量。在扩增之前和之后共有TCR序列以黑色圈出。
图7Q是具有在扩增之前和之后的细胞数量和频率度量的US874-82特异性T细胞(鉴定自E)的前列TCR克隆的总结表。
图7R描绘了按CDR3克隆分开并且按13个聚类簇着色的在pp65495-503特异性TCR克隆中T细胞亚群的数量。
图7S是热图，其示出了在不同TCR克隆特异性的T细胞中，与不同功能相关的基因的表达。
图7T描绘了密度图，其示出了在了肽诱导的扩增之前和之后，不同TCR克隆特异性T细胞中IL13和IL4的表达。
具体实施方式
本公开文本总体上涉及用于鉴定包括MHC-肽/T细胞受体和抗原/B细胞受体(抗体)对在内的受体-配体配对以及用于解码例如，展示配体蛋白，递送有效载荷，以及记录受体特异性的系统、组合物和方法。本公开文本的一些实施方案涉及解码T细胞受体与MHC肽之间的相互作用、抗体与抗原之间的相互作用、或B细胞受体与B细胞抗原(包括胞内/分泌表位/细胞表面抗原表位)之间的相互作用、以及其他配体-受体(例如，CD40配体与CD40)。本公开文本还涉及用于将蛋白质或核酸递送至使用者定义的靶细胞中的组合物和方法。特别地，本公开文本的一些实施方案涉及模块化病毒展示和递送平台以解码配体-受体相互作用，在靶细胞中递送货物，以及使配体-受体相互作用与细胞状态关联。在一些实施方案中，可以在多个水平上将慢病毒工程化，所述多个水平包括(1)在病毒表面上展示使用者定义的配体蛋白；(2)工程化促融物以实现展示同源配体的病毒的受体特异性细胞进入；(3)携带荧光蛋白以追踪工程化病毒；(4)在配对的配体-受体识别后递送货物；以及(5)修饰病毒RNA以通过测序记录配体信息。该技术被称为“ENTER”，即“慢病毒介导的通过工程化配体-受体相互作用导致的细胞进入(lentiviral-mediated cell entry by engineeredligand-receptor interaction)”，可以将其系统地去孤化(deorphanize)相互作用对(包括TCR-pMHC、抗体-抗原、共刺激性配体-受体和B细胞抗原-BCR)。在一些实施方案中，ENTER可以允许以受体特异性方式进行基因递送，允许选择性操纵抗原特异性T细胞和B细胞中的细胞行为。在一些实施方案中，ENTER可以是ENTER与基于微滴的单细胞基因组学剖析(ENTER-seq)的组合以测量单独人原代T细胞中的抗原特异性、TCR组库、基因表达和表面蛋白全景。
I.通用技术
除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术人员熟知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。此类技术在诸如以下文献中得到充分解释：Sambrook,J.和Russell,D.W.(2012).Molecular Cloning:ALaboratoryManual(第4版).纽约冷泉港:Cold Spring Harbor Laboratory以及Sambrook,J.和Russel,D.W.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版).纽约冷泉港:Cold Spring Harbor Laboratory(在本文中统称为“Sambrook”)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology.纽约州纽约:Wiley(包括至2014年的增刊)；Bollag,D.M.等人(1996).Protein Methods.纽约州纽约:Wiley-Liss；Huang,L.等人(2005).Nonviral Vectors for Gene Therapy.San Diego:Academic Press；Kaplitt,M.G.等人(1995).Viral Vectors:Gene Therapy and Neuroscience Applications.加利福尼亚州圣地亚哥:Academic Press；Lefkovits,I.(1997).The Immunology MethodsManual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques.加利福尼亚州圣地亚哥:Academic Press；Doyle,A.等人(1998).Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology.纽约州纽约:Wiley；Mullis,K.B.,Ferré,F.和Gibbs,R.(1994).PCR:The Polymerase Chain Reaction.Boston:Birkhauser Publisher；Greenfield,E.A.(2014).Antibodies:A Laboratory Manual(第2版).纽约州纽约:ColdSpring Harbor Laboratory Press；Beaucage,S.L.等人(2000).Current Protocols inNucleic Acid Chemistry.纽约州纽约:Wiley,(包括至2014年的增刊)；以及Makrides,S.C.(2003).Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells.Amsterdam,NL:Elsevier Sciences B.V.，将所述文献的公开内容通过引用并入本文。
II.定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语、符号和其他科学术语或用辞都旨在具有本公开文本所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的这些定义不必被解释为代表与本领域通常所理解的意义有实质性差异。本文描述或提及的许多技术和程序是本领域技术人员很好理解的并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以采用。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“一种细胞”包括一种或多种细胞，包括其混合物。本文中使用“A和/或B”来包括所有的以下替代形式：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。
如本文所用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒是逆转录病毒中唯一能够感染非分裂细胞的；它们可以将显著量的遗传信息递送至宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV是慢病毒的全部例子。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的方式。
术语“细胞”、“细胞培养物”和“细胞系”不仅是指特定的受试细胞、细胞培养物或细胞系，而且还指这样的细胞、细胞培养物或细胞系的后代或潜在后代，而不考虑培养中的转移或传代次数。应当理解，并非所有后代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响(例如，甲基化或其他表观遗传修饰)而在后代中发生，使得后代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍被包括在如本文所用的术语的范围内，只要后代保留与原始细胞、细胞培养物或细胞系的功能相同的功能即可。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何物质。
如本文所用，术语“接头”(也称为“间隔子”或“间隔结构域”)是指任选地位于本发明的促融物中的两个氨基酸序列之间的氨基酸或氨基酸序列。
术语“生物样品”或“样品”是指分离自个体或受试者的任何固体或液体样品。例如，它可以是指分离自动物(例如，人)的任何固体(例如，组织样品)或液体样品(例如，血液)，诸如但不限于活检材料(例如，固体组织样品)或血液(例如，全血)。这种样品在分析之前可以是例如新鲜的、固定的(例如，福尔马林固定的、醇固定的或丙酮固定的)、石蜡包埋的或冷冻的。在一些实施方案中，生物样品获自肿瘤(例如，胰腺癌)。“测试生物样品”是已经作为分析、监测或观察的主题的生物样品。含有相同类型的生物样品(例如，相同类型的组织或细胞)的“参考生物样品”是测试生物样品的对照。
如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的物理或功能连接，其允许它们以它们预期的方式操作。例如，当在本文所述的核酸构建体(例如，慢病毒载体)或者核酸分子中的编码序列和启动子序列的上下文中使用时，术语“可操作地连接”意指编码序列和启动子序列在框内并且在适当的空间和距离内，以允许转录因子或RNA聚合酶的各自结合对转录的影响。应当理解，可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的(例如，通过接头彼此连接)。在多肽构建体的上下文中，“可操作地连接”是指在氨基酸序列(例如，不同的区段、部分、区域或结构域)之间的物理连接(例如，直接或间接地连接)，以提供构建体的所描述的活性。本文公开的多肽或核酸分子的可操作地连接的区段、部分、区域和结构域可以是连续的或非连续的(例如，通过接头彼此连接)。在一些实施方案中，本文所述多肽的可操作地连接的区段、部分、区域和结构域彼此框内融合。
本文公开的所有基因、基因名称和基因产物旨在对应于来自本文公开的组合物和方法适用的任何物种的同系物。因此，所述术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。应当理解，当公开来自特定物种的基因或基因产物时，本公开文本旨在仅是示例性的，并且不应被解释为限制，除非其出现的上下文清楚地指示。因此，例如，对于本文公开的基因或基因产物(其在一些实施方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列)旨在涵盖来自其他动物(包括但不限于其他哺乳动物、鱼、两栖动物、爬行动物和鸟)的同源和/或直系同源基因和基因产物。在一些实施方案中，基因、核酸序列、氨基酸序列、肽、多肽和蛋白质是人的。术语“基因”还旨在包括其变体。
如本文所述的细胞群体可以是任何哺乳动物细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是人、小鼠、大鼠或非人灵长类动物细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是体细胞群体或生殖细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体包含抗原特异性细胞(例如，与特异性抗原结合的细胞)。在一些实施方案中，抗原特异性细胞群体包含免疫细胞。在一些实施方案中，抗原特异性细胞群体包含B细胞和/或T细胞。在一些实施方案中，细胞群体包含同质的细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体包含异质的细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是分离自受试者的细胞群体。受试者可以是人受试者(例如，患有疾病的人受试者)、小鼠受试者、大鼠受试者或非人灵长类动物受试者。在一些实施方案中，细胞群体分离自受试者的血液或肿瘤中。
在提供值范围的情况下，应当理解，除非上下文另外明确规定，否则在该范围的上限值与下限值之间的每个中间值(至下限值的单位的十分之一)以及所陈述的范围内的任何其他陈述的或中间值都被涵盖在本公开文本内。这些更小范围的上限值和下限值可以独立地被包括在更小范围内，并且也被涵盖在本公开文本内，服从于在陈述的范围内任何确切排除的限值。在陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些被包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本公开文本中。
如本领域的普通技术人员将理解的，出于任何和所有目的，诸如就提供书面描述方面而言，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围以及子范围的组合。任何所列范围都可以容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围都可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员将理解的，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等言辞都包括所列举的数字并且涉及随后可以分解为如上所讨论的子范围的范围。此外，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独成员。因此，例如，具有1-3个制品的组是指具有1、2或3个制品的组。类似地，具有1-5个制品的组是指具有1、2、3、4或5个制品的组，等等。
某些范围在本文中通过前面带有术语“约”的数值呈现。本文中使用术语“约”是为了对其后的精确数字以及接近或近似所述术语后的数字的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在呈现它的上下文中提供具体列举的数字的基本等效形式的数字。如果根据上下文原本不清楚近似程度，则“约”意指在提供的值的正负10％以内，或四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下包括所提供的值。在一些实施方案中，术语“约”指示指定值±至多10％、至多±5％或至多±1％。
应理解，本文描述的本公开文本的方面和实施方案包括“包含方面和实施方案”、“由方面和实施方案组成”以及“基本上由方面和实施方案组成”。如本文所用，“包含(comprising)”与“包括(including)”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。如本文所用，“由……组成”排除在要求保护的组合物或方法中未指定的任何要素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由……组成”并不排除不会实质性地影响要求保护的组合物或方法的基本和新型特征的材料或步骤。术语“包含”在本文中的任何叙述，特别是在组合物的组分的描述中或在方法的步骤的描述中，被理解为涵盖基本上由所列举组分或步骤组成以及由所列举组分或步骤组成的那些组合物和方法。
呈现标题(例如，(a)、(b)、(i)等)只是为了便于阅读说明书和权利要求。说明书或权利要求中的标题的使用不要求步骤或要素按字母或数字顺序或它们呈现的顺序进行。
III.本公开文本的组合物
工程化慢病毒
本文提供了包含慢病毒的组合物，所述慢病毒被工程化，使得它可以a)在细胞表面上展示特异性配体，b)具有突变的促融物，所述促融物允许病毒仅融合并且进入具有天然与所述配体配对的受体的宿主细胞，c)将报告物递送至宿主细胞中，以及d)在病毒RNA上带标签以允许单细胞测序。
在一些实施方案中，慢病毒可以进一步经工程化以包含缺陷型整合酶，使得病毒RNA不能整合到宿主细胞的基因组中，从而避免整合诱导的宿主基因组诱变。
配体
在一些实施方案中，本公开文本的工程化慢病毒包含在病毒细胞表面上展示的一个或多个使用者定义的配体。在一些实施方案中，配体相对于在其表面上展示配体的慢病毒是异源的，例如，配体是来自异源来源，诸如来自另一种细胞或另一种病毒的。合适配体类型的非限制性例子包括细胞表面受体；粘附蛋白；表面结合的糖蛋白、碳水化合物、脂质、糖脂、脂蛋白和脂多糖；整合素；粘蛋白；以及凝集素。在一些实施方案中，配体可以是或包含蛋白质。在一些实施方案中，配体可以是或包含表位。本领域技术人员应当理解，术语“表位”是指与抗原结合多肽的特异性抗原结合位点(例如，抗体分子的可变区(称为互补位))相互作用的抗原决定簇。单一抗原可以具有多于一个表位。因此，不同的抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物学效应。术语“表位”还指抗原上B细胞应答的位点。它还指由抗体结合的抗原区域。表位可以被定义为结构性的或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有直接促成相互作用的亲和力的那些残基。表位可以是线性的或构象的，也就是由非线性氨基酸构成。在某些实施方案中，表位可以包括决定簇，即分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。在一些实施方案中，配体可以是或包含细胞表面蛋白或胞内蛋白或其部分。在一些实施方案中，配体可以是或包含MHC肽、抗体、胞内抗原、分泌型蛋白或其他形式的蛋白质或肽。
在一些实施方案中，如果配体不含有天然跨膜结构域，则添加信号肽和跨膜结构域以与配体融合。因此，在一些实施方案中，跨膜结构域可操作地连接至跨膜结构域。在一些实施方案中，TM结构域可以促进病毒携带(carry-over)的效率。在一些实施方案中，跨膜结构域是异源跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域是源自HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-A2、ICAM1、CD43、CD162、CD62L、CD49d或LFA-1的异源跨膜。在一些实施方案中，TM被替代为优化的TM(诸如例如来自ICAM1、PDGFR的TM)。
在一些实施方案中，配体可以经工程化以首先展示在适合于产生慢病毒的细胞系(例如，HEK 293T，用于产生慢病毒的常见细胞类型)的表面上。配体可以在病毒出芽期间被携带到病毒表面上以产生病毒颗粒。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化慢病毒包含缺陷型整合酶蛋白。
报告基因
在一些实施方案中，本文所述的慢病毒可以包含报告物(例如，报告蛋白)。在一些实施方案中，慢病毒包含编码报告物(例如，报告蛋白)的核酸。如本文所用，报告物通常是当在逆转录病毒和/或靶细胞中表达时可以检测到的蛋白质或基因。在一些实施方案中，细胞群体中靶细胞或靶细胞亚群中存在或不存在报告物允许分选细胞(例如，使用流式细胞术和/或荧光激活的细胞分选)的能力。
在一些实施方案中，报告物是荧光蛋白。荧光蛋白可以说绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)。示例性荧光蛋白可以是如美国专利号7,060,869中描述的。展示特异性配体的工程化慢病毒颗粒在同源受体-配体相互作用下将荧光蛋白递送至靶细胞中。
在一些实施方案中，报告物是mNeon(基本上比GFP更亮的单体绿色荧光蛋白)。
在一些实施方案中，受体可以可操作地连接至病毒结构基因(例如，与其融合)。在一些实施方案中，结构基因可以是核衣壳蛋白(NC)或Gag蛋白。本领域技术人员应当认识到，在不偏离本公开文本的教导的情况下，可以使用其他结构基因。
在一些实施方案中，条形码化RNA被包封在病毒颗粒(例如，由工程化慢病毒产生的那些)中。在一些实施方案中，RNA编码配体。在一些实施方案中，所述RNA编码待递送至靶细胞(例如，宿主细胞)中的目的基因。在一些实施方案中，RNA通过下一代测序技术读出。在一些实施方案中，RNA包含捕获序列。
促融物
如本文所用的术语“促融物”或“融合分子”通常是指当存在于病毒表面上时可以促进、催化或触发膜融合的任何分子。适合于本公开文本组合物和方法的促融物的非限制性例子包括源自病毒的促融物或在宿主细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))中内源性表达的促融物。在一些实施方案中，本公开文本的促融物是糖蛋白。在一些实施方案中，本公开文本的促融物是病毒糖蛋白。适合于本文公开的组合物和方法的示例性病毒促融物包括属于I、II和III类病毒促融物的那些，其由包膜病毒产生以促进病毒-宿主膜融合。在这方面的附加信息可以见于例如Vance T.D.R和Lee J.E.(Curr.Biol.七月6日,30(13),R750-R754,2020)，将其通过引用并入本文。在一些实施方案中，本公开文本的促融物属于I类病毒促融物(即，能够形成卷曲螺旋三聚体的那些)，其包括但不限于来自流感病毒、冠状病毒、HIV和埃博拉病毒。在一些实施方案中，本公开文本的促融物属于II类病毒促融物，即能够在融合期间从二聚体转变为三聚体的那些，从而产生主要由β折叠(其在融合后稳定成发夹三聚体)构成的细长胞外结构域。合适的II类病毒促融物包括但不限于来自登革热病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒和蜱传脑炎病毒的那些。在一些实施方案中，本公开文本的促融物属于III类病毒促融物，即能够组合来自前两类的元件的那些，从而呈现含有类似于I类的卷曲螺旋三聚化区和如在II类中的细长发夹三聚体两者的融合后构象。合适的III类病毒促融物包括但不限于来自水疱性口炎病毒(VSV)、单纯疱疹病毒1(HSV1)、狂犬病病毒的那些。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法的促融物是或包含水疱性口炎病毒G(VSV-G)蛋白。在一些实施方案中，本文中的本公开文本的组合物和方法的促融物是或包含来自麻疹病毒、辛德比斯病毒、狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)、鼠白血病病毒、狂犬病病毒、尼帕病毒、RD114逆转录病毒、长臂猿白血病病毒(GALV)、树鼩副粘病毒(TPMV)或人内源性逆转录病毒(HERV)(诸如ERVW-1(例如，合胞素-1))的病毒促融物。
在一些实施方案中，工程化慢病毒可以包含经修饰的促融物，例如以促进病毒与细胞膜的融合。可以修饰促融物，使得其促进病毒与细胞膜的融合而不需要病毒表面糖蛋白。在一些实施方案中，促融物包含经修饰的水疱性口炎病毒G(VSV-G)病毒包膜蛋白。在一些实施方案中，VSV-G多肽是或包含SEQ ID NO:56的序列。在一些实施方案中，经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白包含一个或多个取代，例如，消除VSV-G与细胞受体的结合的取代。在一些实施方案中，VSV-G包膜蛋白可以包含在对应于VSV-G多肽的位置H8、K47、Y209和R354中的任一个的位置处的一个或多个氨基酸取代。为了确定本文提及的特定位置中的哪个氨基酸“对应于”本文未列出的另一个VSV-G氨基酸序列中的哪个氨基酸，知道如何比对氨基酸序列(例如，多个VSV-G多肽的序列)在技术人员的知识范围内。因此，如本文所用的术语“对应于……的位置”在本领域内是众所周知的。
本文公开的经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白还可以包含在VSV-G的其他位置处的保守修饰和取代(例如，消除VSV-G与细胞受体的结合的那些)。此类保守取代包括Dayhoff1978(同上)和Argos 1989(同上)所述的那些。例如，属于以下组之一的氨基酸表示保守变化：组I：Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；组II：Cys、Ser、Tyr、Thr；组III：Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；组IV：Lys、Arg、His；组V：Phe、Tyr、Trp、His；和组VI：Asp、Glu。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代独立地选自丙氨酸(A)取代、精氨酸(R)取代、天冬酰胺(N)取代、天冬氨酸(D)取代、亮氨酸(L)取代、赖氨酸(K)取代、苯丙氨酸(F)取代、赖氨酸取代、谷氨酰胺(Q)取代、谷氨酸(E)取代、丝氨酸(S)取代和苏氨酸(T)取代及其任何组合。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代包括丙氨酸取代。
在一些实施方案中，经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白包含对应于SEQ ID NO:56的序列的K47Q取代或R354A取代的氨基酸取代。在一些实施方案中，经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白包含K47Q和R354A取代。如上所述，能够使病毒颗粒与细胞膜融合的其他病毒促融物也可以适合地与ENTER一起使用。
单细胞测序
ENTER可以适应与使用全细胞作为输入并且含有逆转录步骤的任何单细胞方法偶联。例如，与公开的或商业的单细胞测序技术兼容，所述单细胞测序技术诸如与包括5'或3'方法的任何单细胞RNA-seq(10x Genomics或其他)、鉴定B细胞和T细胞中的免疫VDJ重组的scTCR/BCR-seq(10x Genomics)、用条形码抗体鉴定表面标志物的CITE-seq/ECCITE、用与单细胞转录组偶联的CRISPR扰动基因的单细胞CRISPR扰动-seq(CRISPR perturb-seq)。
IV.本公开文本的方法
用于鉴定配体-受体对的方法
本文提供了通过以下鉴定配体-受体对的方法：(i)提供至少一种如本文公开的工程化慢病毒，(ii)将慢病毒与细胞群体合并；以及(iii)基于报告基因的存在分选细胞群体，从而鉴定配体-受体对。在一些实施方案中，工程化慢病毒包含在慢病毒的表面上展示的配体，其中配体相对于慢病毒是异源的；包含经修饰的病毒包膜蛋白的促融物，其中促融物能够使慢病毒与宿主细胞融合(例如，能够促进、催化或触发慢病毒与宿主细胞的融合)，其中宿主细胞包含针对所述配体的内源性受体；可操作地连接至慢病毒结构蛋白(例如，与慢病毒结构蛋白融合)的报告蛋白；和条形码化RNA。
可以将慢病毒和细胞群体合并持续限定的时间段。在一些实施方案中，可以以秒、分钟、小时或天来测量时间段。在一些实施方案中，时间段是0-30秒、15-45秒、30-60秒、45-90秒、60-90秒或60-120秒。在一些实施方案中，将病毒和细胞群体合并并且接触0-30秒、15-45秒、30-60秒、45-90秒、60-90秒或60-120秒。在一些实施方案中，时间段是1-2分钟、1-5分钟、1-10分钟、2-10分钟、5-10分钟、5-20分钟、10-20分钟、25-30分钟、25-60分钟、30-45分钟、30-40分钟、40-60分钟、50-70分钟或60-120分钟。在一些实施方案中，将逆转录病毒和细胞群体合并并且接触1-2分钟、1-5分钟、1-10分钟、2-10分钟、5-10分钟、5-20分钟、10-20分钟、25-30分钟、25-60分钟、30-45分钟、30-40分钟、40-60分钟、50-70分钟或60-120分钟。在一些实施方案中，时间段是1-2小时、1-5小时、1-3小时、2-5小时、3-6小时、3-12小时、6-12小时、12-18小时、12-24小时、15-30小时、18-24小时、24-48小时、24-36小时或36-50小时。在一些实施方案中，将病毒和细胞群体合并并且接触1-2小时、1-5小时、1-3小时、2-5小时、3-6小时、3-12小时、6-12小时、12-18小时、12-24小时、15-30小时、18-24小时、24-48小时、24-36小时或36-50小时。在一些实施方案中，时间段是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或5-15天。在一些实施方案中，将病毒和细胞群体合并并且接触1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或5-15天。在一方面，所述方法将慢病毒与细胞合并持续2小时以鉴定配体-受体对。
在一些实施方案中，可以将慢病毒和细胞群体在4℃至42℃、4℃至8℃、4℃至10℃、8℃至15℃、10℃至20℃、18℃至23℃、20℃至30℃、25℃至35℃、30℃至40℃或37℃至42℃范围内的温度下合并。
在一些实施方案中，细胞群体和病毒可以在37℃下孵育约2小时以鉴定配体-受体对。然而，修饰在本公开文本的范围内。
用于鉴定T细胞受体和配对的pMHC的方法
此外，本文提供了用于鉴定T细胞受体和配对的pMHC的方法，所述方法包括(i)提供如本文公开的工程化慢病毒，(ii)将慢病毒与细胞群体合并；以及(iii)基于报告物的存在分选细胞群体，从而鉴定T细胞受体。在一些实施方案中，工程化慢病毒包含在病毒表面上展示的pMHC；包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的促融物，其中促融物能够使慢病毒与宿主细胞融合，其中宿主细胞包含针对所述pMHC的T细胞受体；可操作地连接至慢病毒结构蛋白(例如，与慢病毒结构蛋白融合)的报告转基因；和条形码化RNA。在一些实施方案中，所述方法提供展示不同MHC肽的病毒混合物。(例如，MHC肽库)。在一些实施方案中，T细胞可以是细胞系群体。在另一个实施方案中，细胞是人原代T细胞。
在一些实施方案中，所展示的pMHC可以被工程化为单链形式来使用(图2A)，即RNA可以编码串联的信号肽、抗原肽、G4S接头、b2m基因、G4S接头和MH等位基因。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括以下步骤：对病毒RNA和细胞的受体序列进行单细胞测序以鉴定MHC肽序列和TCR受体信息。
除了使用已知的pMHC库来鉴定新型TCR受体外，本文提供的方法可以用于鉴定与已知T细胞受体匹配的MHC肽。例如，当已知T细胞受体的α和β链在TCR阴性细胞系(诸如Jurkat-76)上表达时，具有pMHC候选物的病毒库可以与细胞混合，如在以下实施例中所描述的。
用于鉴定B细胞受体和配对的抗原的方法
本文还提供了用于鉴定B细胞受体或抗体的方法，所述方法包括提供如本文公开的工程化慢病毒，(ii)使慢病毒与B细胞群体合并；以及(iii)基于报告物的存在分选细胞群体，从而鉴定B细胞抗原。在一些实施方案中，工程化慢病毒包含在慢病毒表面上展示的表位，其中表位可操作地连接ICAM1跨膜结构域(例如，与ICAM1跨膜结构域融合)；包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的促融物，其中促融物能够使慢病毒与宿主细胞融合(例如，能够促进、催化或触发慢病毒与宿主细胞的融合)，其中宿主细胞包含针对胞内表位的B细胞受体；可操作地连接至慢病毒结构蛋白(例如，与慢病毒结构蛋白融合)的报告转基因；和条形码化RNA。在一些实施方案中，抗原是细胞表面膜蛋白、胞内蛋白、分泌型蛋白或可以在细胞表面上表达的其他形式(例如，糖基化分子)。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括以下步骤：对病毒RNA和细胞的受体序列进行单细胞测序以鉴定抗原和匹配B细胞受体(BCR，抗体)信息。在另外的方面，所述方法可以鉴定新型抗体/BCR和抗原对。
用于将目的分子递送至细胞中的方法
在一些实施方案中，本公开文本进一步提供了将目的分子(例如，目的核酸或蛋白)递送至使用者定义的靶细胞的方法，所述方法包括提供工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在慢病毒的表面上展示的异源性配体；包含经修饰的病毒包膜蛋白的促融物，其中促融物能够使慢病毒与宿主细胞融合(例如，能够促进、催化或触发慢病毒与宿主细胞的融合)，其中宿主细胞包含针对所述配体的内源性受体；可操作地连接至慢病毒结构蛋白的报告蛋白(例如，与其融合)；和条形码化RNA；使慢病毒与包含靶细胞的细胞混合物接触；以及将核酸或蛋白质仅递送至靶细胞，其中靶细胞表达对在慢病毒表面上的配体有特异性的受体。在一些实施方案中，所述配体经修饰以便将货物递送至使用者定义的靶细胞中。在一些实施方案中，目的核酸被包装在所述工程化慢病毒颗粒内部。在一些实施方案中，目的蛋白质可操作地连接慢病毒的gag蛋白(例如，与其融合)。在一些实施方案中，目的蛋白质替代报告物。在一些实施方案中，所述靶细胞在体内。在一些实施方案中，所述靶细胞是离体的。在一些实施方案中，所述靶细胞在体外。在一些实施方案中，所述靶细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞并且所述受体是T细胞受体。在一些实施方案中，所述免疫细胞是B细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是B细胞并且所述受体是B细胞受体。在一些实施方案中，所述人细胞是原代人血细胞(PBMC)。
用于将目的分子递送至细胞中的方法
如上文所概述，本公开文本的一方面涉及用于在细胞混合物中选择性耗尽或富集靶细胞群体的方法，所述方法包括：提供(a)根据权利要求1-17中任一项所述的工程化慢病毒，和(b)细胞混合物，所述细胞混合物包含(i)表达对在工程化慢病毒的表面上展示的配体有特异性的受体的靶细胞群体，和(ii)不表达所述受体的非靶细胞群体；将工程化慢病毒与细胞群体合并；并且将核酸或蛋白质仅递送至靶细胞；添加试剂，所述试剂特异性抑制靶细胞群体的生长或抑制非靶细胞群体的生长，从而选择性耗尽或富集靶细胞群体。在一些实施方案中，所述受体是免疫受体。在一些实施方案中，所述免疫受体是B细胞受体。在一些实施方案中，免疫受体是T细胞受体。
本公开文本的用于选择性耗尽或富集靶细胞群体的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述靶细胞表达单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)转基因，并且所添加的试剂包含或是更昔洛韦(GCV)。在一些实施方案中，所述靶细胞群体包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞表达shRNA以减少细胞死亡受体FAS的表达以预防靶群体的细胞死亡。在一些实施方案中，所述免疫细胞包含T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞包含B细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是自身反应性免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞对与健康状况相关的抗原有特异性。在一些实施方案中，健康状况是增殖性障碍、炎性障碍、自身免疫性障碍或微生物感染。在一些实施方案中，增殖性障碍是癌症。在一些实施方案中，微生物感染是细菌感染、病毒感染或微真菌感染。
V.系统
本文还提供了系统，所述系统可以被称为ENTER(慢病毒介导的通过工程化配体-受体相互作用的细胞进入)，已被证明是实现多种应用(例如，用于配体展示、货物递送和相互作用记录)的多功能平台。ENTER的示例性应用包括解码配体-受体相互作用，在单细胞水平将受体相互作用与细胞状态联系起来，以及以受体特异性方式递送货物。如本文中更详细描述的，将多个功能统一到一个平台的能力是主要优势。ENTER不是收集和掌握多种不同的单一目的技术，而是为使用者提供了一个解决许多重要问题的平台。首先，在本公开文本的一些实施方案中，将慢病毒工程化以使得能够展示异源性细胞表面蛋白、胞内和胞外表位，包括pMHC复合物、抗体、共刺激分子和B细胞抗原。与酵母或噬菌体展示平台相比，ENTER具有几个优势(参见例如，表1)。酵母/噬菌体展示平台中的糖基化模式与哺乳动物系统不同，这可能干扰配对的TCR的正确MHC呈递和识别。此外，酵母或噬菌体展示需要大量优化以实现MHC的正确折叠、稳定性和呈递。此外，ENTER内置在人细胞中，并且能进行人糖基化和蛋白质折叠模式，如通过申请人呈现多种HLA-肽组合的能力所证明的。另外，在酵母和噬菌体展示平台中筛选需要可溶性重组TCR，因此使并行测试不同TCR具有挑战性。相比之下，ENTER允许研究人员筛选原代T细胞样品，为检查人TCR组库的巨大多样性打开了大门(参见例如，表1)。对于解码pMHC-TCR相互作用，ENTER还具有优于溶细胞性T细胞报告物测定(诸如T-扫描)的优点，因为后者不能在单细胞水平上记录pMHC与TCR的配对。
其次，在一些实施方案中，可以将ENTER工程化以受体特异性方式递送货物。慢病毒经工程化，使得受体-配体相互作用驱动病毒融合和感染。所述系统经过进一步工程化，以便研究人员可以选择瞬时或稳定地递送货物，具有使用整合缺陷机制(integration-defective machinery)的灵活性。在一些实施方案中，ENTER可以在基因疗法或RNA医学中具有应用，因为与像AAV的现有模式相比，ENTER可以实现精细的细胞类型特异性。在一些实施方案中，基于诱导细胞死亡或保护免于细胞死亡的基因货物的特异性递送，ENTER可以选择性地耗尽或扩增抗原特异性T细胞(参见例如，图4)。ENTER能够使抗原特异性B细胞耗尽，这可以应用于根除致病性自身抗原特异性B细胞以潜在地治疗自身免疫性障碍。
表1.ENTER与其他平台的比较
n.d.：未完成
n.a.：不可行
在一些实施方案中，如本文所述的ENTER可以用于在单细胞水平上将配体-受体相互作用与分子蓝图联系起来。例如，ENTER-seq将解码配体-受体相互作用的能力与单细胞基因组学大规模并行地解析细胞-细胞通信和细胞状态的能力组合。用于pMHC的ENTER-seq在概念上类似于pMHC四聚体分子的DNA条形码化文库，但具有几个潜在的优点。此外，与商业DNA条形码pMHC四聚体相比，ENTER可以是更低成本的。与具有DNA条形码化的pMHC四聚体的内部生成(house generation)相比，ENTER可以在任何实验室中容易地实施(参见例如，表2)。与pMHC四聚体的DNA缀合在缀合反应期间可能遭受不均等的条形码寡核苷酸加载，而ENTER-seq文库利用慢病毒生物学，其确保每个病毒颗粒有2个拷贝的条形码化病毒RNA。每个病毒样颗粒的DNA条形码化的均匀分布使得ENTER-seq能够定量pMHC结合强度，其尚未在使用DNA条形码化的pMHC四聚体的研究中进行研究。本文所述的实验数据揭示了高度扩增的TCR克隆与较高的pMHC结合相关(参见例如，图7G)，可能是由扩增克隆中更高的TCR与pMHC的亲和力或更高的TCR表面密度导致的。
表2.ENTER pMHC病毒与pMHC四聚体的比较
最后，如本文更详细描述的。在每种试剂的摩尔基础上，ENTER比pMHC四聚体更灵敏(参见例如，图2C)。在一些实施方案中，优异的灵敏度可以由在ENTER上展示的大量pMHC产生。基于HIV的慢病毒颗粒展示了每个病毒颗粒14-100个包膜蛋白分子，而pMHC四聚体根据定义是4个连接的分子。总之，ENTER-seq允许研究人员记录配体-受体特异性并且读出该相互作用的生物学结果(诸如抗原依赖性T细胞命运，包括幼稚细胞激活、效应细胞扩增、记忆细胞形成或T细胞耗竭)。类似地，ENTER-seq可以用于理解在感染性疾病和自身免疫的背景下抗原特异性B细胞的分子程序。
原代CMV特异性T细胞的ENTER-seq分析证明了所述平台在单个实验中将数以万计的原代T细胞中抗原表位、TCR组库、基因表达程序和表面蛋白表型联系起来的能力。这种不同模式的大规模并行剖析揭开了供体特异性抗原特异性和病毒表位的免疫原性。在一些实施方案中，肽刺激前和肽刺激后的T细胞的ENTER-seq揭露了扩增后的转录改变和响应于相同抗原的克隆间表型多样性。Th2细胞因子表达的此类转录变化和克隆差异可能受针对相同pMHC抗原的不同TCR亲和力/亲合力/密度或来自抗原呈递细胞的不同引发环境的影响。在急性成淋巴细胞性白血病患者中单细胞剖析CD19-CAR T细胞的最新研究表明，与复发的患者相比，Th2表达的诱导与持久应答者中的临床功效呈正相关(Bai等人,2022)。然而，尚不清楚Th2细胞因子如何能够加强CD8 T细胞效应子功能以实现长期缓解以及这种益处是否可以推广到感染性疾病。显示Th2细胞因子表达的TCR克隆特异性诱导的本文所述实验数据可能告知了选择TCR以进行工程化TCR-T细胞用于过继性T细胞疗法。此外，如本文所述的ENTER-seq提供了对T细胞克隆性和特异性如何影响抗原特异性T细胞的分子表型和生理功能的全面理解的洞悉。
在一些实施方案中，如本文所述的ENTER可以用于分离以及富集肿瘤抗原反应性T细胞以输注回患者中。在一些实施方案中，如本文所述的ENTER可以进一步在发现背景中用于筛选免疫原性抗原或优秀TCR用于疫苗开发或癌症免疫疗法的合理设计。在一些实施方案中，如本文所述的ENTER还可以应用于筛选靶向病毒抗原的BCR，从而促进开发治疗性抗体以预防病毒感染。在一些实施方案中，如本文所述的ENTER使得能够抗原特异性递送货物(诸如基因和shRNA)，从而允许扰动和操纵抗原特异性T和B细胞。这种靶向递送策略可以应用于重振耗竭的抗肿瘤T细胞，而不触发免疫相关不良事件，或耗尽自身反应性T或B细胞以治疗自身免疫。在又另外的实施方案中，ENTER可以延伸至另外的受体-配体对，诸如G蛋白偶联受体、粘附分子或原钙粘蛋白。因此，ENTER可以用于解决免疫系统之外的细胞-细胞联系。
ENTER-seq可以将解码配体-受体相互作用的能力与单细胞基因组学大规模并行规模解析细胞类型和细胞状态的能力组合。用于pMHC的ENTER-seq在概念上类似于MHC四聚体分子的DNA条形码化文库，但具有几个潜在的优点。MHC四聚体文库需要单独的肽合成以及然后加载到MHC四聚体中，与可以通过大规模并行DNA合成制备的ENTER-seq文库相比，导致高成本、长前导时间和更低的通量。与MHC四聚体的DNA缀合在缀合反应期间可能遭受不均等的条形码寡核苷酸加载，而ENTER-seq文库利用慢病毒生物学，其确保每个病毒颗粒有2个拷贝的条形码化病毒RNA。最后，与MHC四聚体相比，ENTER-seq可能更灵敏。基于HIV的慢病毒颗粒展示了每个病毒颗粒14-100个Env蛋白分子，而MHC四聚体根据定义是四个连接的分子。
总之，ENTER-seq允许研究人员记录配体-受体特异性并且读出该相互作用的生物学结果(诸如抗原依赖性T细胞命运，诸如幼稚细胞激活、效应细胞扩增、记忆细胞形成或T细胞耗竭)。类似地，ENTER-seq可以用于理解自身免疫中产生自身抗体的B细胞的分子程序。
ENTER将配体-受体相互作用以单细胞分辨率与分子蓝图联系起来。ENTER具有优于溶细胞性T细胞报告物测定(诸如T扫描)的优点，因为后者不能在单细胞水平上记录肽-MHC与TCR的配对，这排除了汇集分析。
ENTER可以在免疫学及其他方面有转化应用。ENTER可以用于分离以及富集肿瘤抗原反应性T细胞以输注回患者中。ENTER的非整合性质促进过继性T细胞疗法。ENTER可以进一步在发现背景中用于筛选免疫原性抗原或优秀TCR用于疫苗开发或癌症免疫疗法的合理设计。
应了解，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征也可单独地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的所有组合确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种组合均单独地和明确地公开一样。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合也确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种这样的子组合均单独地和明确地在本文中公开一样。
本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本申请的精神和范围内。
尽管出于阐明和理解的目的，本公开文本已经通过说明和举例的方式被稍微详细地描述，但是将清楚的是，可以在所附权利要求的范围内实践某些改变和修改。
在整个说明书中，引用了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章、电子数据库条目等)。将本文引用的所有专利、专利申请和其他出版物的披露内容出于所有目的特此通过引用以其整体并入。
实施例
实施例1
本实施例描述了根据本公开文本的一些实施方案进行的用于说明示例性ENTER的实验的结果，其中ENTER被工程化为模块化病毒展示和递送平台以捕获和解码配体-受体相互作用，在靶细胞中递送货物以及将配体-受体相互作用与细胞状态联系起来。
慢病毒在多个水平上被工程化，所述多个水平包括(i)在病毒表面上展示的配体蛋白，(ii)通过展示的配体和经修饰的促融物进行靶向宿主受体的病毒进入，(iii)经由病毒衣壳的融合进行的荧光蛋白递送，以及(iv)用于单细胞测序的带标签的病毒RNA(参见例如，图1A)。
为了例如通过使用展示使用者定义的配体蛋白的病毒实现慢病毒与宿主细胞之间的特异性配体-受体相互作用，具有被破坏的天然受体结合同时保持完整融合能力的病毒包膜蛋白(称为促融物)被设计为与病毒表面上展示的使用者定义的配体蛋白协作。两个单独的模块(配体蛋白+促融物)的协作允许病毒展示的配体与宿主受体之间的相互作用，以进一步促进通过促融物与宿主细胞的病毒融合(参见例如，图1A)。水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)，将病毒包膜蛋白用于假型化慢病毒。VSV-G假型病毒具有广泛的向性，因为VSV-G可以识别在许多细胞类型中表达的低密度脂蛋白受体(LDLR)并且与其相互作用。
在这些实验中，将Jurkat T细胞和Raji B细胞用携带GFP转基因的VSV-G假型慢病毒感染。在这些Jurkat T细胞和Raji B细胞中观察到稳健的GFP表达，但转导效率不同，这潜在地是由于不同细胞类型上LDLR的表达不同(参见例如，图1B)。
将VSV-G突变体工程化，其拥有两个点突变(K47Q，R354A)以预防其识别宿主细胞上的LDLR并且与其相互作用(Nikolic等人,2018)。观察到在使用突变体VSV-G假型病毒的Raji(0.1％)和Jurkat(0.6％)细胞中最小的GFP表达(参见例如，图1B)，表明对宿主细胞上特定受体的病毒识别是病毒进入和整合的首个重要步骤。为了测试VSV-G突变体是否是用于与病毒表面上的使用者定义的配体协作以在表达配对受体的宿主细胞中进行病毒感染的良好促融物候选物，将已确立的含有抗CD19单链抗体可变片段(sc-Fv)的CD19-CAR(嵌合抗原受体)与VSV-G突变体、在病毒转移载体中的GFP转基因和慢病毒的包装组分在HEK293T细胞中共表达，并且收集来自上清液的病毒。如所预期的，此类病毒特异性地感染具有高表达水平的CD19的Raji B细胞，但不感染CD19阴性Jurkat T细胞(参见例如，图1B)。因此，申请人已经开发了病毒展示平台，所述病毒展示平台可以将病毒融合从依赖于天然VSV-G/LDLR相互作用的细胞进入重编程为依赖于使用者定义的配体与配对的宿主细胞受体之间的相互作用的细胞进入。
为了捕获配体-受体相互作用同时避免宿主基因组的病毒整合和整合诱导的诱变(Ranzani等人,2013)，申请人工程化了病毒整合酶突变体(D64V)，所述突变体不能整合宿主基因组(Certo等人,2011)，并且将GFP蛋白与病毒结构蛋白融合以追踪展示配体的病毒。使用携带GFP蛋白的展示配体的病毒代替病毒整合以表达GFP，测量到表达配对的受体的宿主细胞中的瞬时病毒进入。为了鉴定用作GFP的最佳融合配偶体的病毒蛋白，申请人测试了包括基质蛋白(MA)、核衣壳蛋白(NC)和称为病毒蛋白R(VPR)的HIV辅助蛋白的三种病毒蛋白(参见例如，图1C)。在病毒组装和合成期间，MA和NC由Gag前体蛋白加工而成，所述Gag前体蛋白可以被顺式组装成每个病毒颗粒3000个MA或NC拷贝(De Guzman等人,1998；Kutluay等人,2014)，VPR可以经由与Gag蛋白的相互作用反式掺入到病毒颗粒中，作为每个病毒颗粒500个VPR拷贝(Wu等人,1995)。观察到，当GFP与NC融合时，80％的被CD19-CAR结合的Raji细胞呈递病毒，这显著胜过MA-GFP和VPR-GFP(参见例如，图1C)。
为研究展示CD19-CAR的NC-GFP病毒是否可以识别并且结合来自人血的原代CD19+B细胞，将这些病毒与幼稚或激活的人原代B细胞一起孵育2小时，并且通过流式细胞术检测这些B细胞上的GFP信号。与Raji B细胞系类似，80％的激活的人原代B细胞被NC-GFP标记的展示CD19-CAR的病毒结合，而60％的幼稚B细胞是GFP+(参见例如，图1D)。幼稚B细胞与激活的B细胞之间CD19表达的差异可以解释CD19-CAR病毒结合的差异。确实，流式细胞术结果表明，激活的B细胞中CD19的表面表达显著高于幼稚B细胞的表面表达(参见例如，图1E-图1F)，这与病毒在激活的B细胞上的较高结合一致。该结果表明，展示配体的病毒与表达受体的细胞的结合与配体配对的受体的表达水平定量相关。此外，在CD19-CAR病毒孵育后CD19表面表达明显降低，表明CD19-CAR病毒与CD19特异性结合以通过CD19抗原掩蔽或诱导表面CD19的内化来预防靶向CD19的流式细胞术抗体的后续结合(图1E-图1F)。为了确定表面CD19的损失是否是由于病毒融合诱导的表面CD19的内化或与CD19的特异性病毒结合(其预防后续的CD19抗体染色)，进行了病毒结合和融合测定(参见例如，图1H)。结果表明，在蛋白酶K处理后仅有5％的GFP+细胞，表明非常少的细胞经历了病毒融合以预防蛋白酶K介导的表面结合的GFP标记的病毒的降解(参见例如，图1I)。因此，表面CD19的减少主要是由ENTER病毒的特异性CD19结合/掩蔽而不是内化引起的，进一步突出了展示配体的病毒对靶向受体具有高度特异性。
为了进一步确定展示配体的GFP融合病毒是否可以通过其他配体-受体相互作用与靶细胞特异性结合，将病毒工程化以展示野生型CD40配体(CD40L)或突变体CD40L。CD40L突变体含有两个点突变(K142E，R202E)，导致对CD40的结合亲和力降低(Pasqual等人,2018)。流式细胞术结果显示，与野生型CD40L相比，当与展示CD40L突变体的病毒一起孵育时，GFP+Raji细胞显著减少(图1J-图1L)。
为了证实病毒粒子表面上的配体蛋白和促融物的掺入，进行免疫捕获测定以通过抗体包被的磁珠拉下展示所希望的蛋白质的病毒(参见例如，图1M)。具体地，产生展示CD40L和促融物(VSV-G突变体)的病毒，并且然后将它们分别与抗CD40L珠、抗VSV-G珠和IgG珠一起孵育。在孵育并且广泛洗涤后，提取病毒RNA用于随后的qRT-PCR分析。与IgG阴性对照相比，发现在抗CD40L和抗VSV-G组中病毒RNA的显著富集，验证了配体蛋白和促融物在病毒粒子表面上的掺入(参见例如，图1N)。
总之，这些结果表明，申请人的病毒展示平台(例如，ENTER)可以在瞬时病毒结合测定中捕获高度特异性的配体-受体相互作用并且适用于多种类别的受体-配体相互作用。
因此，展示特异性配体的工程化慢病毒颗粒在同源受体-配体相互作用下(无基因组整合或转基因转录)将荧光蛋白递送至靶细胞中。
实施例2
本实施例描述了为说明具有展示MHC-肽(pMHC)的病毒的ENTER如何映射TCR特异性，特别是该病毒展示平台如何捕获pMHC与TCR之间的相互作用而进行的实验的结果。
申请人工程化病毒以展示与β2微球蛋白(B2M)和共价连接的肽融合的单链MHC(参见例如，图2A)。为了预防在产生展示HLA-肽的病毒时干扰来自HEK 293T细胞的内源性人白细胞抗原(HLA，人MHC基因座)，申请人通过以CRISPR-Cas9敲除所有潜在的HLA I类等位基因(HLA-A/B/C)制备了稳定的HLA敲除(KO)HEK 293细胞系。B2M的表面表达在HLA KO细胞中也被消除，表明所有内源性HLA等位基因已被成功缺失(参见例如，图2G)。与B2M和肽融合的HLA-A*0201(HLA-A2)的单链在HLA KO细胞中过表达，并且观察到HLA-A2和B2M的高水平表面表达(参见例如，图2G)。
申请人工程化融合GFP的报告物病毒以通过在HLA KO HEK 293T细胞中共表达pMHC的单链三聚体、突变体VSV-G和含有NC-GFP的病毒Gag蛋白在表面上展示pMHC。将病毒收集并且与表达靶向同源pMHC抗原的TCR的Jurkat T细胞一起孵育。使用这些模块组分，成功地生成了展示已确立的在HLA-A2(人中最普遍的HLA等位基因)上的作为9聚体肽(SLLMWITQC)的癌症-睾丸抗原NY-ESO-1的病毒，(等人,1998)(参见例如，图2A)。与1.26％的对已知巨细胞病毒(CMV)表位有特异性的T细胞相比，88.2％的表达同源NY-ESO-1TCR的T细胞被携带NY-ESO-1抗原的GFP病毒标记(Lee和Meyerson,2021)。类似地，展示在不同HLA等位基因HLA-A*01:01上的CMV抗原(作为11聚体(YSEHPTFTSQY)肽)的病毒特异性地进入CMV TCR-T细胞中而不是NY-ESO-1TCR-T细胞(参见例如，图2A)。申请人进一步工程化展示来自以下的不同9聚体抗原表位的病毒：癌症-睾丸抗原、CMV pp65抗原(ny-eso-1157-165)、CMV pp65抗原(pp65495-503)和流感基质蛋白抗原(m158-66)，所有这些都呈现在HLA-A2等位基因上(Gotch等人,1987；Wills等人,1996)。结果显示，在与展示同源HLA-A2-肽的GFP融合病毒一起孵育2小时后，超过87％的TCR匹配的T细胞是GFP+的，而这些T细胞中仅有1％被展示阴性对照抗原的GFP病毒标记(参见例如，图2B)。在不同的抗原肽长度和不同的HLA等位基因的情况下观察到展示pMHC的病毒高度特异性地进入TCR匹配的T细胞中，突出了ENTER平台呈递不同pMHC抗原的通用性。
为了进一步测试展示pMHC的病毒的特异性，首先将CMV pp65495-503抗原特异性TCRJurkat T细胞与展示pp65495-503的病毒一起孵育，并且然后用广泛使用的商业pp65495-503四聚体染色。对于阴性对照，将这些T细胞与展示流感m158-66的病毒和商业m158-66四聚体一起孵育(参见例如，图2H)。流式细胞术结果表明，超过90％的四聚体阳性细胞是GFP+的，表明pp65495-503四聚体染色与展示pp65495-503的GFP病毒的结合的一致性强。阴性对照流感m158-66四聚体和病毒不标记pp65495-503 TCR T细胞(参见例如，图2H)。另外，观察到在与展示pp65495-503的病毒共孵育后，pp65495-503四聚体强度和CD3表面表达显著降低(参见例如，图2I)，这类似于在展示CD19-CAR的病毒的结合后Raji B细胞上CD19的表面表达减少的观察结果。该结果表明，展示pMHC的病毒特异性结合并且掩蔽TCR-CD3复合物，预防pMHC四聚体和抗CD3抗体的后续结合。
在使用pMHC四聚体作为参考确定展示pMHC的病毒的特异性后，申请人在每种试剂的摩尔基础上比较了展示pMHC的病毒与pMHC四聚体之间的灵敏度(参见例如，实施例11中的一般方法)。结果表明，2X 108个ENTER病毒颗粒可以染色95.7％的TCR-T细胞，而2X 108个pMHC四聚体不能检测到任何TCR-T细胞(参见例如，图2C)。重要的是，2X 108个ENTER病毒的结合效率类似于8X 109个pMHC四聚体，表明ENTER病毒比pMHC四聚体更灵敏(约40倍)。
为了进一步确定TCR对pMHC的亲和力是否影响展示pMHC的病毒与表达TCR的T细胞的结合，生成了识别具有不同已知TCR亲和力的NY-ESO-1抗原变体(Kd范围在7-85μM)的TCR-T细胞系(1G4wt)(Zhang等人,2021)。先前实验中使用的NY-ESO-1TCR T细胞系(参见例如，图2A-图2C)非常类似于1G4wt TCR T细胞系，不同之处在于在其TCR上的几个突变，导致对ny-eso-1157-165抗原非常高的结合亲和力(Robbins等人,2008)。然后将ENTER工程化以展示不同的ny-eso-1157-165抗原肽变体，诸如野生型肽(SLLMWITQC)、L3A突变体(SLAMWITQC)和T7A突变体(SLLMWIAQC)。然后，在将病毒的滴度(通过病毒p24蛋白水平显示)归一化后，在将不同的TCR-T细胞与展示抗原变体的病毒一起孵育后，测量GFP+细胞的百分比。结果表明，当添加高滴度的病毒(40ng p24)时，ENTER灵敏地检测低至10.8uM的TCR亲和力。对于非常低的TCR亲和力(像84.9uM)，25％的中靶细胞在高滴度下仍可以被ENTER检测到(参见例如，图2D)，突出了ENTER可以识别的广泛范围的TCR亲和力。观察到TCR结合亲和力与ENTER识别效率呈正相关，表明ENTER可以被应用于通过测量展示pMHC的病毒的结合效率来推断相对TCR亲和力(参见例如，图2D)。
此外，为了确定pMHC病毒展示平台的特异性和灵敏性，申请人以不同比率混合中靶T细胞(识别m158-66抗原的TCR)和脱靶T细胞(识别ny-eso-1157-165抗原的TCR)，并且然后与呈递m158-66抗原的GFP病毒一起孵育(参见例如，图2E、图2J)。为了区分这两种不同的TCR T细胞系，用CellTrace Violet染料标记flu-M1 TCR T细胞。计算基于中靶GFP+细胞的频率相比于脱靶GFP+细胞的频率的信噪比。即使在中靶T细胞的频率低至1/1000时，信噪比也超过150倍，证明了ENTER病毒展示平台的高特异性和灵敏度(参见例如，图2F、图2J和图2K)。
总之，上述实验数据证明，ENTER以特异性且灵敏的方式捕获pMHC与TCR之间的相互作用。
实施例3
本实施例描述了为说明通过展示B细胞抗原的ENTER病毒对B细胞特异性的示例性解码而进行的实验的结果。
B细胞具有高度多样性的BCR，所述BCR可以特异性靶向来自入侵病毒的外来抗原和自身抗原。病毒抗原特异性B细胞可以产生抗体(分泌形式的BCR)，这有利于预防病毒感染。相比之下，自身抗原特异性B细胞可以产生攻击自身的有害自身抗体，促成自身免疫性障碍(Burbelo等人,2021；Tan,1989)。因此，重要的是解码B细胞特异性，这将有助于开发高度有效的抗病毒抗体，指导疫苗的合理设计，并且提供对自身反应性B细胞形成的更好理解(Ju等人,2020)。基于ENTER在解码T细胞特异性中的成功应用，本实施例描述了为探索捕获BCR与抗原之间的相互作用的可行性而进行的实验的结果。
与在细胞表面上的由MHC呈递的抗原肽的TCR识别不同，BCR可以识别不仅源自细胞表面蛋白而且还有源自胞内蛋白、胞外蛋白和分泌型蛋白的抗原表位。ENTER解码B细胞特异性的主要挑战是在病毒表面上展示不含有其天然跨膜(TM)结构域的B细胞抗原。为了在病毒表面上展示来自胞内蛋白的抗原表位，申请人寻求工程化TM结构域以用于B细胞抗原的最佳表面展示。为了选择用于病毒表面展示的TM结构域的候选物，申请人利用了HIV-1病毒在病毒出芽期间将宿主蛋白掺入病毒表面上的独特能力。新生HIV-1病毒可以在病毒组装和出芽过程中选择性地掺入某些宿主TM蛋白，同时排除其他丰富的宿主表面蛋白(Burnie和Guzzo,2019)。申请人使用病毒的质谱法、免疫捕获测定和流式病毒测定方法(flow virometry)优先列出了来自先前文献的掺入病毒表面的高度丰富的宿主TM蛋白的列表(Burnie等人,2020；Cantin等人,1996；Chertova等人,2006；Grover等人,2015；Jalaguier等人,2015)。该宿主TM蛋白列表包括MHC I类和II类分子(HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-A2)，粘附分子(ICAM1、CD43、CD162、CD62L)和整合素家族成员(CD49d、LFA-1)(参见例如，图3A)。
为了确定B细胞表位与这些不同TM结构域的病毒展示的特异性和效率，对病毒进行工程化以表达源自人乳头瘤病毒(HPV)次要衣壳抗原L2的B细胞抗原表位(HPV16 L2残基17-36)并且与优先列表中的TM结构域融合。接下来，生成表达BCR的B细胞系，其特异性靶向HPV16 L2 B细胞表位(Wang等人,2015)。在将融合TM结构域并且展示B细胞表位的病毒与表达HPV-BCR(中靶)或没有任何BCR(脱靶)的B细胞一起孵育后，定量GFP+B细胞的百分比以测量效率和特异性(参见例如，图3B)。除了来自宿主蛋白的TM结构域外，将病毒进一步工程化以使B细胞表位与来自促融物VSV-G(可以在出芽病毒中组装的病毒包膜蛋白)的TM结构域融合。结果揭示出了ICAM1 TM结构域作为最高候选物，因为超过90％的HPV抗原特异性BCR+B细胞是GFP+的(参见例如，图3B-图3C)。这与先前的报道一致，所述报道显示ICAM1通过与病毒基质蛋白的相互作用而选择性地获取在出芽病毒中(Jalaguier等人,2015)。
为了测试ICAM1 TM结构域是否可以应用于除来自HPV16的线性表位之外还呈递其他B细胞抗原，将病毒工程化以展示来自SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)(参见例如，图3D)。结果表明，88％的刺突-RBD BCR+B细胞被展示RBD的病毒标记，表明具有优化的TM结构域的ENTER可以应用于解码B细胞对线性表位(HPV16 L217-36抗原)和全抗原结构域(SARS-CoV-2刺突RBD)两者的特异性。
超越ENTER展示胞内和胞外B细胞抗原的能力之外，进行另外的实验以确定ENTER是否可以解码针对细胞表面B细胞抗原的B细胞特异性。将ENTER工程化以展示使用其天然TM结构域的HER2。HER2是一种表皮生长因子受体，其在乳腺癌细胞中过表达(Gutierrez和Schiff,2011)。实验数据表明，76％的抗HER2 BCR B细胞被展示HER2的病毒检测到(参见例如，图3G-图3H)，突出了ENTER展示来自胞内(HPV L2)、胞外(刺突RBD)和细胞表面蛋白(HER2)的任何B细胞抗原的普遍性。
另外，为了进一步检查ENTER对破译BCR与B细胞抗原之间的相互作用的特异性和灵敏度，将中靶B细胞(具有识别SARS-CoV-2刺突RBD抗原的BCR)和脱靶B细胞(具有识别HPVL2抗原的BCR)以不同的比率混合，并且然后与呈递刺突RBD抗原的病毒一起孵育(参见例如，图3E和图3I)。为了区分这些中靶和脱靶B细胞，中靶B细胞具有CellTrace Violet染料。基于中靶GFP+细胞的频率相比于脱靶GFP+细胞的频率计算信噪比。信噪比在100至200倍左右(参见例如，图3F)，表明TM结构域优化的病毒展示B细胞抗原表位的极大特异性和灵敏度(参见例如，图3J-图3K)。
综上所述，上述实验数据证明，ENTER是能够以高度特异性且灵敏的方式成功捕获BCR与抗原相互作用的平台。
实施例4
本实施例描述了为研究ENTER是否能够通过靶向货物递送来缺失或扩增抗原特异性T细胞或抗原特异性B细胞而进行的实验。
首先，为了测试货物递送的抗原特异性，使用GFP转基因作为货物以测量递送效率和特异性。在用野生型VSV-G假型化的慢病毒的感染后，观察到与TCR或BCR特异性无关的相当的转导效率(参见例如，图3L)。然后进行另外的实验来工程化展示pp65495-503pMHC配体和VSV-G突变体促融物、在病毒RNA上携带GFP转基因以及其他病毒组分(包括野生型整合酶)的病毒(参见例如，实施例11中的一般方法)。在用靶向pp65495-503的CMV-pp65 TCR+T细胞和靶向不相关抗原的NY-ESO-1TCR+T细胞感染pp65495-503 pMHC病毒后，观察到82％的中靶TCR-T细胞表达GFP，而仅0.22％的脱靶TCR-T细胞是GFP+的(参见例如，图4A-图4B)。类似地，进行另外的实验来工程化展示B细胞抗原HER2并且携带GFP转基因作为货物的病毒(参见例如，图4C)。实验数据示出了在HER2 BCR+B细胞中(但不在RBD BCR+B细胞中)GFP转基因的特异性递送(参见例如，图4D)。
接下来，为了检查ENTER介导的靶向基因递送是否可以在抗原特异性T或B细胞中发挥正确的功能，进行另外的实验来工程化展示pMHC的病毒以携带单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因(已确立的响应于药物更昔洛韦(GCV)的自杀基因)(Beltinger等人,1999)。将CMV-pp65 TCR+T细胞与表达mScarlet的NY-ESO-1TCR+T细胞以1:1比率混合，并且然后添加携带自杀基因的展示pp65495-503的病毒。感染后三天，添加GCV药物以杀死表达HSV-TK的细胞，并且监测细胞存活持续4天(参见例如，图4E)。观察到在病毒感染后，在混合T细胞的库中，中靶T细胞中的特异性货物递送(参见例如，图3M)。在GCV处理4天后，观察到中靶T细胞(CMV-pp65 TCR+)的特异性耗尽，而不影响脱靶T细胞，参见例如(参见例如，图4F)。为了确定靶向杀伤是否不是由病毒感染诱导的，生成具有GFP基因的病毒作为阴性对照。发现与GFP基因递送相比，HSV-TK基因递送导致约8倍的中靶T细胞显著耗尽(参见例如，图4G)，进一步验证了通过抗原特异性自杀基因递送实现了一种T细胞克隆的选择性耗尽。为了测试抗原特异性基因递送是否可以应用于B细胞，将HER2 BCR+B细胞与表达mScarlet的RBD BCR+B细胞混合，随后添加携带自杀基因的展示HER2的病毒(参见例如，图4H和图3N)。类似地，在GCV药物处理后，结果显示与对照GFP基因相比，具有自杀基因递送的中靶B细胞显著减少(参见例如，图4I-图4J)，表明ENTER能够通过抗原特异性自杀基因递送选择性耗尽B细胞库中的一种B细胞克隆。
相反，还进行另外的实验以检查ENTER是否能够实现抗原特异性T细胞的选择性存活和保留。这些实验的目的是在抗原特异性T细胞中递送针对细胞死亡受体FAS的短发夹RNA(shRNA)以预防FAS诱导的细胞程序性死亡(Yonehara等人,1989)。在筛选靶向FAS的多种shRNA后，选择具有最佳敲低效率的shFAS#2，这通过与对照shRNA(shCtrl)组相比FAS的表面表达的明显降低反映出(参见例如，图3O)。进一步产生的是展示pp65495-503携带shFAS#2或shCtrl的，并且用这些病毒感染混合的中靶(CMV-pp65 TCR+)和脱靶(NY-ESO-1TCR+)T细胞库(参见例如，图4K)。结果显示，与shCtrl组或脱靶未感染T细胞相比，感染shFAS#2的中靶T细胞中FAS蛋白表面表达显著降低，表明了靶向的shRNA递送(参见例如，图4L)。接下来，将这些细胞用抗FAS抗体处理以触发由膜联蛋白V和7-AAD染色所揭示的FAS介导的细胞死亡(参见例如，图4K和图3P)。在将中靶群体相对于脱靶群体归一化后，与shCtrl组相比，在FAS敲低后在活细胞中，在中靶T细胞上观察到显著增加(参见例如，图4M)。总之，本文所述的数据表明，ENTER允许靶向货物递送以操纵具有配体-受体特异性的复杂细胞群体。
实施例5
本实施例描述了实验的结果，其中将病毒展示平台ENTER与基于微滴的单细胞RNA-seq组合以开发ENTER-seq(在单细胞分辨率下捕获配体-受体相互作用和分子蓝图的技术)。因此，ENTER-seq在单细胞分辨率下捕获MHC-肽抗原特异性、TCR组库和基因表达谱。在一些实施方案中，ENTER-seq的工作流程包括(1)生成汇集的展示pMHC的GFP病毒，(2)与人T细胞一起孵育这些病毒，(3)分选病毒标记的GFP+细胞用于基于微滴的单细胞分析(例如，10x Genomics的5'单细胞RNA-seq/V(D)J-seq)，(4)包括基因表达、V(D)J TCR组库和抗原-肽序列的三个单细胞文库的生成和测序(参见例如，图5A)。
将单链PMHC信息储存在包装到慢病毒颗粒中的病毒单链RNA(ssRNA)中。病毒ssRNA是大约4.6kb，使得难以在微滴中逆转录(RT)为全长cDNA。为了在每个微滴中的RT步骤期间高效捕获病毒RNA上的pMHC信息，将捕获标签插入在B2M与MHC之间的接头区域中，并且另一个PCR柄紧挨着CMV启动子(参见例如，图5B)。该捕获标签允许通过与缀合在珠上的模板转换寡核苷酸(Template Switch Oligo)(TSO)序列杂交而被可商购的5’GEM珠捕获。PCR柄允许在cDNA扩增步骤期间方便地扩增靶肽序列而不掺加另外的引物(参见例如，图5B)。进一步的巢式PCR和索引PCR允许抗原肽序列的靶向富集，以生成用于深度测序的最终抗原文库。捕获标签和PCR柄的插入不影响pMHC在病毒上的展示以及与表达TCR的T细胞的特异性相互作用(参见例如，图4N-图4O)。
为了评估ENTER-seq的抗原特异性和TCR组库的单细胞剖析，用汇集的展示pMHC的病毒对混合的表达TCR的T细胞进行ENTER-seq。为了模拟真实生活的T细胞群体，将10％的具有识别ny-eso-1157-165抗原的TCR的T细胞与90％的具有识别CMV pp65495-503抗原的TCR的T细胞混合，并且然后与汇集的展示ny-eso-1157-165抗原或pp65495-503抗原的病毒一起孵育(参见例如，图5C)。过滤出双重体后对独特TCR序列的分析证实了T细胞的混合比率为9.4％(ny-eso-1157-165-TCR+)比90.6％(CMV pp65495-503-TCR+)，这类似于输入混合比率(10％比90％)(参见例如，图5D)。在过滤TCR和抗原肽的独特分子标识符(UMI)计数(方法)后，进一步回收具有可靠抗原肽信息和TCR序列的总计4198个T细胞。计算总肽中来自优势抗原肽的UMI的比率。观察到抗原肽与其配对TCR的高度一致性(参见例如，图5E)。在单细胞水平下将TCR序列与抗原肽匹配后，结果显示99.8％的pp65495-503+细胞和97.4％的ny-eso-1157-165+细胞分别与其对应的TCR序列匹配(参见例如，图5F)。
因此，上述实验数据表明，ENTER-seq可以在单细胞分辨率下灵敏且稳健地捕获TCR组库与同源HLA抗原肽的相互作用。
实施例6
本实施例描述了为说明优化的ENTER-seq检测稀有抗原特异性原代人T细胞而进行的实验的结果。特别地，ENTER-seq可以应用于直接分离自人血液的稀有抗原特异性原代T细胞。
首先使用展示呈现在HLA-A2等位基因上的CMV-pp65抗原表位的GFP病毒和来自具有CMV感染史的HLA-A2+患者的原代T细胞来验证ENTER-seq系统的灵敏度。将原代T细胞与展示pp65495-503抗原的病毒一起孵育，并且然后用广泛使用的CMV pp65495-503四聚体(其用作阳性对照)染色。四聚体染色分析表明，1％的T细胞是pp65495-503抗原特异性的(参见例如，图4Q)。83％的pp65495-503四聚体阳性T细胞被GFP病毒标记。为了进一步增加通过流式细胞术检测的灵敏度，将GFP替代为mNeon(基本上比GFP更亮的单体绿色荧光蛋白)(参见例如，图4P-图4Q)。确实，通过展示pp65495-503表位的mNeon病毒(而不是阴性对照病毒)，回收了98％的pp65495-503四聚体阳性T细胞，指示比GFP病毒显著更高的效率(参见例如，图4Q-图4S)。
实施例7
本实施例描述了为说明肽富集的CMV特异性T细胞的ENTER-seq可以揭露供体特异性免疫原性CMV表位和抗原特异性分子表型而进行的实验的结果。
抗病毒T细胞对控制病毒复制和传播是必不可少的。体外扩增的CMV特异性T细胞的过继转移已显示出控制接受移植的患者的CMV感染的巨大功效。然而，CMV肽诱导的抗原特异性扩增如何在体外影响CMV特异性T细胞的分子表型、克隆扩增和潜在功能是在很大程度上未探索的。
在这些实验中，使用ENTER-seq来表征经由CMV抗原肽刺激扩增的CMV特异性T细胞的转录程序、抗原特异性和TCR克隆性。为了富集并且扩增CMV特异性T细胞，首先将来自CMV血清反应阳性供体的人外周单个核细胞(PBMC)与12种CMV抗原肽的库一起培养10天(Lehmann等人,2020；Lübke等人,2020；Solache等人,1999)(参见例如，图4T)。将肽加工并且由自体抗原呈递细胞呈递，然后其刺激CMV抗原特异性T细胞用于后续的扩增。为了测试本公开文本的ENTER病毒对肽富集的T细胞的特异性，使用肽pp65495-503扩增T细胞，并且然后与呈递pp65495-503抗原的mNeon病毒一起孵育，随后用pp65495-503四聚体染色。流式细胞术分析表明，约99％的四聚体+T细胞被病毒标记(参见例如，图4U)，证明了ENTER检测肽富集的抗原特异性T细胞的高特异性和灵敏度。
制备展示这12种CMV抗原表位的ENTER病毒的库，并且与来自4个不同CMV血清反应阳性HLA-A2阳性供体的扩增T细胞一起孵育(参见例如，图S4G)。在4个供体中的2个(在供体#1中19.4％和在供体#2中8.78％)中观察到CMV抗原特异性T细胞的急剧扩增(参见例如，图4V)。接下来，对来自这两个供体的扩增T细胞进行ENTER-seq，并且用独特主题标签(hashtag)抗体标记每个供体样品。为进一步探询抗原特异性T细胞的表型，通过用靶向细胞表面蛋白CD45RA、CD45RO和IL7R的DNA条形码化抗体对细胞染色，将ENTER-seq与CITE-seq组合(参见例如，图6A)。
在分选GFP+(CMV抗原特异性T细胞)和GFP-(旁邻T细胞)CD8+T细胞、随后基于微滴的单细胞捕获后，生成文库以在单独细胞中剖析基因表达程序、CMV抗原肽、TCR组库和表面蛋白(包括CITE-seq蛋白和主题标签蛋白)。结果表明，与展示CMV抗原的病毒(ENTER+)结合的细胞在表型上不同于不结合病毒的细胞(ENTER-)(参见例如，图6B)。为了测试这种表型差异是否由ENTER病毒的结合诱导的，将CMV pp65TCR-T细胞的RNA-seq数据与展示pp65495-503的ENTER病毒或pp65495-503四聚体的孵育进行比较。总之，28个基因被鉴定为在ENTER组与四聚体组之间差异化表达(2倍变化并且调整的P值<0.01)(参见例如，图4W)。值得注意的是，所有28个基因在ENTER病毒处理的细胞中都被显著上调，并且主要与TCR激活(CD69)和由TCR信号传导诱导的转录因子(FOS、NR4A1、NR4A3、EGR1等)相关(参见例如，图4W)。该结果表明，与四聚体结合相比，展示pMHC的病毒的结合可以微弱地诱导静息/幼稚CMV pp65 TCR-T细胞的TCR激活。为了进一步确定该ENTER诱导的基因上调是否导致CMV特异性T细胞与旁邻T细胞之间的表型差异，在具有或不具有ENTER诱导的基因特征的情况下进行莱顿聚类(Leiden clustering)(参见例如，实施例11中的一般方法)。在去除这28个基因后，在CMV特异性T细胞与旁邻T细胞之间发现了明显的分离，表明表型差异不是由ENTER病毒的结合引起的(参见例如，图5G)。
在整合表面蛋白全景和基因表达后，观察到肽富集的CMV特异性T细胞(ENTER+)主要是效应记忆T(TEM)细胞(CD45RO+CD45RA-)，而ENTER-细胞是幼稚和中枢记忆T(TCM)细胞的混合物(参见例如，图6C和图5H-图5I)。与ENTER-细胞相比，ENTER+细胞是基于诸如IFNG、TNF的效应分子和包括颗粒酶和穿孔素的细胞毒性分子的高表达的潜在保护性T细胞(参见例如，图5J)。单细胞RNA-seq数据将所有T细胞集类为10个聚类簇，包括：(1)幼稚T细胞：CD45RA+CCR7+；(2)TCM：CD45RA-CCR7+；(3)：终末分化的效应T细胞(TEMRA)：CD45RA+CCR7-；(4)粘膜相关的不变T细胞(MAIT)：CD45RA-CD161+CXCR6+；(5)增殖性T细胞：CD45RA+KI67+；(6)IL4+TEM：CD45RO+IL4+；(7)KLRC2+TEM；CD45RO+KLRC2+；(8)CST7+TEM(CD45RO+CST7+；(9)：HSP+TEM：CD45RO+热休克蛋白(例如，HSPA1A)+；(10)：增殖性TEM：CD45RO+KI67+(参见例如，图6D和图5H-图5L)。供体之间的亚群频率的比较表明，两个供体之间的ENTER-旁邻T细胞相对相似，而两个供体之间的ENTER+CMV抗原特异性T细胞在表型上不同，表明两个供体可能对CMV抗原具有不同的免疫应答(参见例如，图5M-图5N)。
为了确定是否存在对CMV抗原的供体特异性免疫应答，测量每个供体中识别特异性CMV抗原表位的T细胞的数量。pp65495-503特异性T细胞是两个供体中最优势的抗原特异性T细胞，表明pp65495-503是最常见且最具免疫原性的CMV抗原(参见例如，图6E)。这与显示在许多供体中高频率的CMV pp65495-503特异性T细胞的先前报道一致(Elkington等人,2003；Gillespie等人,2000；Wills等人,1996)。还观察到，与供体#1相比，供体#2中US874-82特异性T细胞和UL100200-208特异性T细胞的频率更高，指示供体特异性病毒表位免疫原性。有趣的是，在将前3种抗原表位投影到基因表达UMAP图时，观察到3个不同的聚类簇，表明不同的表位可能驱动独特的基因CD8+T细胞命运和表达程序(参见例如，图6F)。确实，pp65495-503特异性T细胞具有高表达的对效应T细胞所必需的效应细胞因子(例如，IFNG、FASLG、PRF1等)和转录因子(例如，ZEB2)(参见例如，图6G)。令人惊讶的是，UL100200-208特异性T细胞具有高表达的FOXP3、IL2RA(CD25)和CTLA4，这是调节性T(Treg)细胞的特征(Billerbeck等人,2007；Churlaud等人,2015；Fontenot等人,2003；Wing等人,2008)，表明UL100200-208特异性T细胞与CD8+Treg细胞相似(参见例如，图6G)(Vieyra-Lobato等人,2018)。因此，ENTER-seq不仅揭露了供体特异性病毒表位，而且还揭示了在识别来自相同病毒的不同抗原表位后抗原特异性T细胞的不同分子蓝图。
实施例8
相同抗原特异性之下的克隆间表型多样性
本实施例描述了为说明相同抗原特异性之下的克隆间表型多样性而进行的实验的结果。为研究CMV抗原特异性T细胞的克隆扩增，进行在单细胞水平上TCR组库、抗原特异性和基因表达的综合分析。
在这些实验中，通过CDR3核苷酸序列的同一性来定义TCR克隆型(Yassai等人,2009)。与旁邻T细胞(ENTER-，每种TCR克隆最多174个细胞)相比，肽富集的CMV特异性T细胞(ENTER+)展现了高克隆扩增(每种TCR克隆最多3856个细胞)(参见例如，图6J)。使用优势TCR克隆型作为参考，计算并且观察到低的假阴性率(FNR<3％)和假阳性率(FPR<1％)，这突出了ENTER-seq对原代T细胞的高灵敏度和特异性(参见例如，实施例11中的一般方法)。接下来，进行另外的实验以检查两个供体之间是否存在CMV抗原特异性TCR克隆的任何重叠。这些实验的结果表明，两个供体具有独特的扩增TCR克隆而没有任何重叠(参见例如，图6K)，与先前的研究一致，所述先前的研究表明，由于TCR组库的高度多样性，抗原特异性TCR克隆型通常对每个个体都是私有的(Dupic等人,2021；Robins等人,2009)。因此，共有的TCR特异性不能仅从TCR序列预测，而需要pMHC结合数据。抗原特异性和TCR克隆扩增的进一步综合分析显示，不同的CMV抗原表位特异性T细胞展现出不同的TCR克隆扩增行为(参见例如，图6H)。pp65495-503特异性T细胞的克隆扩增大小显著大于UL100200-208特异性T细胞的克隆扩增大小(参见例如，图6H)。高度扩增的TCR克隆与细胞毒性基因的高表达相关，例如，pp65495-503特异性T细胞与UL100200-208特异性T细胞相比。确实，在所有克隆型中，与细胞毒性相关的基因表达与TCR克隆扩增显著相关(皮尔森相关系数r＝0.48，p＝0.0，图6L)。相比之下，克隆扩增与其他基因特征之间的相关性相对弱(对于T细胞耗竭基因，r＝0.13；对于T细胞激活基因，r＝0.09)(参见例如，图6M)。
因为多个TCR核苷酸序列可以编码靶向相同抗原表位的相同CDR3氨基酸序列，然后基于对于各CMV抗原表位而言相同CDR3氨基酸序列合并克隆型(参见例如，图6N-图6O)。对于最具免疫原性的CMV表位pp65495-503，鉴定三种优势CDR3克隆型。其中，两个TCRβ链序列(CASSFQGYTEAFF；SEQ ID NO:54和CASSYQTGASYGYTF；SEQ ID NO:55)与IEDB数据库中公开的pp65495-503特异性TCR相同，进一步验证了本文公开的ENTER平台的特异性(参见例如，图6O)。在将CDR3克隆型与pp65495-503特异性T细胞中的基因表达谱组合时，发现不同的克隆型展现出不同的基因表达表型，包括不同的细胞因子谱、细胞溶解酶和转录因子表达，这指示了靶向相同抗原表位的克隆间表型多样性(参见例如，图6I和图6P)。因此，ENTER-seq可以在功能上表征TCR结合特异性和TCR相关细胞状态两者。
实施例9
本实施例描述了实验的结果，证明来自患者的原代CMV特异性T细胞的ENTER-seq揭示了与细胞毒性和I型IFN应答相关的基因中的克隆内多样性。
为了解码CMV血清反应阳性患者的抗病毒T细胞记忆，将ENTER病毒工程化以展示先前鉴定的前3种CMV抗原表位，并且对直接分离自患者血液不经体外扩增的原代T细胞进行ENTER-seq(参见例如，图7A)。CITE-seq和基因表达谱的综合分析表明，患者中的CMV特异性T细胞(ENTER+)主要是终末分化的效应记忆T细胞(TEMRA，CD45RO-CD45RA+CCR7-)(参见例如，图7B-图7C)。该观察结果与先前的研究一致，所述先前的研究显示CMV血清反应阳性患者中TEMRA CMV特异性T细胞的积累(Appay等人,2002；Derhovanessian等人,2011)。
在亚群聚类后，在CMV特异性T细胞中观察到TEMRA群体的异质性，所述CMV特异性T细胞具有与细胞毒性功能、趋化因子、共刺激性/共抑制性分子和I型IFN应答相关的不同基因表达模式(参见例如，图7D和图7L)。例如，在CMV特异性T细胞中，TEMRA#1聚类簇含有高表达的细胞毒性基因(像IFNG、TNF和PRF1，但没有GZMK)，而TEMRA#4聚类簇是IFNG-TNF-PRF1+GZMK+的(参见例如，图7C和图7L)。值得注意的是，CMV特异性T细胞中的TEMRA#2聚类簇含有低表达的所有细胞毒性基因，但有高表达的I型IFN刺激基因(ISG)(诸如ISG15、ISG20、IFIT1和OASL等)(参见例如，图7C和图7L)。ISG基因的这种上调反映了在小的CMV特异性T细胞亚群中I型IFN应答的特异性诱导，这可能是由患者中响应于CMV病毒的I型IFN的局部产生或由其他病原体的I型IFN的旁邻产生刺激的。为了测试ENTER病毒结合是否影响T细胞状态(例如，I型IFN应答)，比较具有或不具有ENTER诱导的基因的莱顿聚类，并且观察到高度一致的聚类簇。该结果表明，ENTER病毒的结合对分离自患者血液的原代T细胞的T细胞状态具有最小的影响(参见例如，图7M)。
随后，整合患者中CMV特异性T细胞的抗原特异性、TCR组库和基因表达。如所预期的那样，发现CMV特异性T细胞主要是与大范围的克隆扩增相关的pp65495-503特异性T细胞，证实了pp65495-503是高度免疫原性的CMV表位(参见例如，图7E-图7F)。进一步观察到被US874-82 pMHC ENTER病毒标记的罕见T细胞群体(43个细胞)(参见例如，图7N)。TCR测序揭示了至多60％的US874-82特异性细胞在静息时与肽扩增的US874-82特异性T细胞共享TCR，证实了它们的克隆同一性(参见例如，图7O)。有趣的是，通过沿扩增追踪每个供体中的优势TCR克隆，发现供体#2含有最多扩增的TCR克隆，而供体#1中的TCR克隆很少扩增(参见例如，图7P-图7Q)。这些实验数据证明了ENTER-seq在存在高度优势表位的情况下从未经扩增的新鲜PBMC中检测多种抗原特异性的能力。
还对每个细胞结合的pMHC的数量进行定量以测量展示pMHC的ENTER病毒的结合强度。通过整合患者中CMV pp65特异性T细胞的pMHC结合强度和TCR克隆扩增，结果显示在高度扩增的T细胞克隆(克隆大小>50)中pMHC的结合显著高于低扩增的T细胞(参见例如，图7G)。因为ENTER pMHC结合与TCR亲和力正相关(参见例如，图2F)，本文所述的实验数据表明，高TCR亲和力与更大的T细胞克隆扩增相关并且可能驱动所述更大的T细胞克隆扩增。
在pp65495-503特异性T细胞中，发现3种优势TCR克隆具有与肽富集的pp65特异性T细胞相同的TCR序列。类似于体外肽扩增的T细胞，这些pp65特异性TCR克隆展现出表型差异，但它们靶向相同的抗原表位(参见例如，图7R)。引人注目地，在相同TCR克隆中观察到表型异质性(参见例如，图7R-图7S)。例如，TCR克隆#2由以下构成：I型IFN ISG+TEMRA、应激IFNGhiFASLGlo TEMRA和IFNGloFASLGhi TEMRA(参见例如，图7R-图7S)。该数据揭示了相同TCR克隆之下的克隆内表型多样性，表明T细胞状态受TCR结合特异性和局部微环境两者的影响。
实施例10
本实施例描述了为证明在离体抗原肽诱导的扩增后CMV特异性T细胞的表型转变和克隆差异而进行的实验的结果。
为了理解抗原特异性扩增如何影响抗病毒T细胞的分子表型，进行在肽诱导扩增之前和之后的CMV特异性T细胞的ENTER-seq的比较。通过组合抗原特异性、CITE-seq和转录程序，观察到在抗原特异性扩增后发生pp65特异性T细胞的表型转变(参见例如，图7H)。直接分离自患者血液的pp65特异性T细胞主要是TEMRA T细胞、终末分化的效应记忆细胞。在抗原诱导的扩增后，这些T细胞失去CD45RA表达并且获得CD45RO表达，表明这些TEMRA T细胞可以进一步分化为效应记忆T细胞(TEM，CD45RA-CD45RO+)(参见例如，图7H)。通过流式细胞术在两个供体中验证了该观察结果(参见例如，图7I)。
进行另外的实验以检查扩增后的表型变化是由整个抗病毒组库的细胞状态转变驱动的还是由特定T细胞克隆的选择性扩增偏置的。在这些实验中，将TCR序列用作“天然”条形码，以追踪每种优势T细胞克隆在扩增之前和之后的细胞状态。计算IFN-I ISG基因得分和细胞毒性基因得分以反映I型IFN刺激中的细胞状态和单独T细胞的细胞毒性功能(参见例如，实施例11中的一般方法)。发现在患者中的每种T细胞克隆中，IFN-I ISG和细胞毒性得分在静息时是高度异质的(参见例如，图7J)。在离体扩增后，IFN-I ISG和细胞毒性得分在T细胞克隆中变得显著集中：在所有三个克隆中都发现了I型IFN ISG基因表达的丧失和细胞毒性基因的上调(参见例如，图7J)。该结果表明，肽诱导的扩增可以进一步增强T细胞的效应子功能，而在患者中观察到的I型IFN应答在离体扩增后不能维持。
相反，抗原激活也可以引起克隆间表型多样性。在三种pp65495-503特异性T细胞克隆中，所有三种都具有低表达的T辅助2(Th2)细胞因子基因IL13，但在静息时记忆T细胞转录因子EOMES的表达谱不是如此(参见例如，图7J)。在抗原激活和扩增后，克隆1现在产生表达IL13、EOMES或两者的细胞；克隆3产生以相互排斥的方式表达IL13或EOMES的细胞；克隆2增加EOMES的表达频率但从不增加IL13的表达频率(参见例如，图7J)。一致地，在扩增后，pp65495-503特异性T细胞克隆在仅两种Th2细胞因子(IL4和IL13)的表达中展现出另外的克隆多样性(参见例如，图7T)。因此，各TCR可以不同地识别相同抗原以驱动不同的转录程序和细胞状态。
总之，ENTER-seq能够实现在患者中病毒感染后，T细胞特异性、静息细胞状态和抗原诱发的细胞命运潜能的系统化剖解。在细胞毒性和I型IFN应答方面从TEMRA T细胞到TEMT细胞的抗CMV T细胞转变，伴随着肽诱导的抗原特异性扩增后特定T细胞克隆中Th2细胞因子基因的上调(参见例如，图7K)。
实施例11
实施例1-10的一般材料和方法
质粒克隆和构建。
引物订购自IDT DNA technologies，并且由twist bioscience和IDT合成基因片段。表3示出了本研究中使用的载体设计列表。通常通过Gibson assembly(New EnglandBiolabs)制备所有构建体。简言之，将pMD2.G(addgene#12259)用EcoRI消化以去除野生型VSV-g基因片段。将其用突变VSV-g组装(通过PCR引物引入K37Q和R354Q以生成VSV-g双突变体。将psPax2(addgene#12260)用BsiWI和SphI消化以在MA后融合eGFP。为了生成具有NC-eGFP/NC-mNeon融合的包装载体，用SphI和BspEI顺序地消化psPAX2-D64V-NC-MS2(addgene#122944)。然后将gag的一部分和eGFP或mNeon与骨架组装在一起。GFP-VPR获自Addgene(#83374)。
为了生成HPV16_L2抗原特异性BCR，由载体JWW-1(addgene#66748)分开扩增轻链和重链并且通过2A肽连接。然后将其插入CMV启动子(PB-CMV)后的piggybac载体中，之后添加PDGFR跨膜(TM)结构域和2A-mCherry以在细胞表面上表达该抗体。以相同方式由源曲妥珠单抗载体(addgene#61883)克隆抗Her2 BCR。为了生成抗SAR2-RBD BCR，对编码RBD抗体的轻链和重链的DNA片段(蛋白质数据库(Protein Data Bank)，根据登录号7BWJ(Ju等人,2020))进行密码子优化并且合成(Twist Bio)。之后，将信号肽添加至每条链，并且将重链进一步延伸至具有人IgG1 Fc和PDGFR TM序列的全长。然后将BCR插入由具有潮霉素抗性的SFFV启动子驱动的慢病毒载体中。
合成NY-ESO-1TCR的单链形式(Roth等人,Nature 2018；克隆1G4，野生型(1G4wt)及其具有高亲和力的突变形式(a95:LY)，由2A肽连接的串联α和β链(Robbins等人,2008))并且插入到具有潮霉素抗性的慢病毒载体中。TCR5(其与来自CMV病毒的p5肽结合)由α(addgene#164999)和β链(addgene#165000)扩增并且将其制成如上文NY-ESO-1TCR那样的单链形式。
为了在病毒表面上展示抗原和HLA肽复合物，首先生成克隆慢病毒载体，其具有强CMV启动子、多克隆位点和WPRE元件以增强表达。通过以下方式生成CD19-CAR载体：将具有CD8茎接头和TM的scFv CD19(由Mackall lab友好提供)插入慢病毒质粒中，随后插入2A-嘌呤霉素和2A-eGFP。替代scFv CD19和TM以生成包括HPV-L2抗原、CD40L(addgene#125795)和CD40L突变体(addgene#125796)的其他抗原候选物。对于TM结构域筛选，在HPV-L2抗原病毒载体中，将TM与10种备选物交换(表4)。合成SAR2刺突RBD结构域的DNA片段并且插入慢病毒表达载体，随后是类似于以上描述的CD8茎接头和TM结构域。对于Her2展示，由WT HER2(addgene#16257)扩增包括其天然TM和另外的55-aa胞质尾的截短Her2(a1-a700)片段，并且插入上述载体中。
为了展示pMHC复合物，构建单链载体，其具有串联的信号肽、抗原肽、G4S接头、β2微球蛋白(B2M)、第二个G4S接头和HLA等位基因。合成编码β2微球蛋白的人生长激素信号肽的DNA，并且连同HLA等位基因一起插入慢病毒载体中。在此，由addgene载体#119052扩增HLA等位基因A0201，并且由addgene#165009扩增等位基因A0101。引入两个半胱氨酸突变以通过在HLA等位基因的Y84C与位于肽后的G4S接头中的G2C之间的二硫键来稳定肽结合。为了使其适应10x Genomics测序平台，将10xTSO序列(表6)进一步插入在B2M与HLA之间的接头中编码氨基酸SHIRN，并且10xPCR柄在CMV启动子后的5'UTR中(表6)。通过用2个esp3I位点替代抗原肽来构建克隆载体，其中可以适当地插入各种HLA肽(表5)。
生成各种载体用于递送目的。首先将pMD载体中的VSV-G以与VSV-g突变体相同的方法替代为不同的包膜蛋白，诸如RBD、HER2、pp65-HLA-A2。接下来，构建货物递送载体，其中货物(诸如HSV-TK-2A-egfp(来自addgene#33308的HSV-TK)，并且eGFP仅由慢病毒载体中的Ef1a启动子驱动。对于shRNA递送，将不同的shRNA置于含有eGFP和嘌呤霉素作为荧光和选择标志物的慢病毒载体中的人U6启动子下。将mScarlet转基因插入具有嘌呤霉素抗性的慢病毒载体中的EF1短启动子后，以用红色荧光蛋白标记细胞。
转染和慢病毒产生
为生成用于细胞系感染和产生的常规慢病毒，每6孔，将HEK 293T用病毒表达载体(2ug)、pMD2.G(VSV-G野生型)(1ug)和具有脂质体3000的psPax2(2ug)转染。次日更换一次培养基，并且分别在48小时和72小时两次收集病毒上清液。根据制造商的方案，将病毒用4xLenti-X浓缩，并且在-80℃下以20x浓缩储存。为了制备特异性受体靶向和整合病毒，使用VSV-G突变体代替。为了产生可以用荧光检测而不整合的展示抗原的病毒，将psPAX2-D64V(整合酶上的D64V突变)载体的VSV-G突变体和荧光蛋白融合形式(NC-eGFP或NC-mNeon)与表达抗原的载体根据上述比率混合以转染HEK 293T细胞。对于展示pMHC的病毒，使用HLA-KO HEK 293T细胞进行转染。将病毒收集，浓缩至40x，并且在-80℃下储存。为了生成用于货物递送的慢病毒，每6孔，将HEK 293T用货物表达载体(1.6μg)、pMD2.G VSV-g mut(0.8μg)、psPax2(1.6μg)和具有脂质体3000的包膜质粒(1μg)转染。如上所述收集病毒，浓缩至40x，并且在使用前储存在-80℃。根据制造商的方案通过Lenti-X GoStix Plus试剂盒(Takarabio)确定慢病毒滴度。
细胞培养和细胞系产生
在补充有10％ FBS(Invitrogen)和1X pen/strep的RPMI中培养Raji、Ramos和Jurkat相关细胞系。将HEK 293T相关细胞维持在补充有10％ FBS和1X pen/strep的DMEM中。通过靶向HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因的Cas9 RNP的电穿孔生成HLA-KO HEK 293T细胞，并且基于HLA-A/B/C的表面表达进一步分选HLA-KO细胞。获得Ramos细胞。获得JurkatTCR阴性-76细胞和表达CMV pp65 TCR和flu-m1 TCR的Jurkat。为了生成包括表达BCR和TCR的细胞的稳定细胞系，将Ramos或Jurkat细胞用病毒感染，并且在4-5天后通过分选或使用药物进行选择。将NYESO-TCR Jurkat和RBD-BCR Ramos细胞用红色mScarlet病毒感染，并且用嘌呤霉素选择以生成mScarlet红色荧光标记的细胞系。
慢病毒感染和病毒孵育测定
对于图1B，将30uL浓缩的慢病毒添加到12孔板中的250K个Raji或Jurkat细胞中。3天后，通过流式细胞术测量GFP信号。对于1B之后的图，收集200K个靶细胞到管中并且在离心后去除上清液。将细胞沉淀物重悬在30uL浓缩的融合GFP的慢病毒中并且在37℃下孵育。在孵育2h后，将细胞用流式细胞术抗体在4℃下染色10min(如果需要)，通过RPMI培养基洗涤两次，并且最后经受流式细胞术。为了定量图2D中的展示具有不同TCR亲和力的pMHC抗原变体的ENTER病毒的结合，将病毒滴度归一化并且随着展示抗原变体的ENTER病毒的逐步调整(4ng、20ng、40ng p24水平)孵育100K个NY-ESO-1TCR T细胞(1G4野生型或a95:LY突变体)或脱靶CMV-pp65 TCR+T细胞。在2小时孵育后，将细胞洗涤并且经受流式细胞术以定量GFP+细胞。为了比较图2C中在每种试剂的每摩尔基础上的展示pMHC的ENTER病毒和pMHC四聚体的灵敏度，将100K个NY-ESO-1TCR+T细胞与2X 108个展示NY-ESO-1157-165抗原的ENTER病毒(20ng p24)或一系列NY-ESO-1157-165pMHC四聚体(2X 108至8X 109)一起孵育2小时。每种试剂的摩尔数的计算在以下示出。由于104个病毒颗粒含有1pg p24蛋白，因此具有20ng p24的病毒＝20*1000*104＝2X 108个病毒颗粒。对于pMHC四聚体，分子量为500KD左右(PE-链霉亲和素：约300KD，pMHC四聚体：约200KD(50KD单体*4))。因此，1μg pMHC四聚体＝1μg*106*(6.02x 1023)/500/1000＝1.2X 1012个四聚体。
病毒结合和融合测定
将20μL展示CD19-scFv的GFP病毒与200K个Raji B细胞在4℃或37℃下一起孵育2小时。将细胞洗涤两次并且在37℃下经受0.5mg/mL蛋白酶K处理15min，这将消化细胞表面结合病毒。在蛋白酶K处理之前和之后，使细胞经受流式细胞术以鉴定GFP阳性细胞的百分比。
免疫捕获测定
将10μL蛋白G Dynabead在1mL封闭缓冲液(含0.1％ BSA的PBS)中在室温下孵育20min。将2μg抗CD40L抗体(目录号157009，Biolegend)或抗VSV-G抗体(克隆8G5F11，Millipore sigma)或IgG抗体添加到具有100μL封闭缓冲液的珠中并且在4℃下旋转30min。将缀合抗体的珠洗涤三次并且去除上清液。将30μL展示CD40L的病毒添加到具有30μL封闭缓冲液的珠中并且在室温下旋转1小时。制备5μL来自同一批次的展示CD40L的病毒作为输入样品。将珠洗涤三次并且去除上清液。将100μL Trizol添加到珠或输入样品中，并且通过Zymo Quick-RNA Miniprep试剂盒经受RNA提取。使用Stratagene Brilliant II SYBRGreen QRT-PCR主混液(Agilent)进行RT-qPCR。
慢病毒靶向货物递送
如上所述，将细胞与病毒在含有6μg/ml聚凝胺的培养基中一起孵育。在3天后用流式细胞术(Attune NxT)评估递送效率和特异性。在需要时，首先将细胞用PeCy7抗人IgG(对于B细胞，克隆G18-145，BD bioscience)或APC抗人CD3(对于T细胞，克隆HIT3a，Biolegend)染色，之后进行流式细胞术分析。对于HSV-TK细胞杀伤测定，将两个细胞群体(其中一个由mScarlet标记(脱靶)并且一个是非荧光的(中靶))以1:1比率混合并且与病毒一起孵育。在3天后，添加更昔洛韦(GCV，Invivogen)至终浓度为0.1μg/ml，将其计为第0天。细胞培养基和药物每3天更新一次。在2天后，每天取300μL细胞培养物，用IgG或CD3染色，之后通过流式细胞术分析。计算活的中靶细胞与脱靶细胞的比率，并且按天数作图(相对于第0天归一化)。可替代地，还在仅TK与eGFP递送之间比较在处理的第4天靶向或NT群体的活细胞的原始计数。
对于关于FAS shRNA递送的细胞凋亡测定，将Jurkat T细胞感染不同的shRNA，用PE-FAS/CD95(Biolegend)染色以比较shRNA敲低的效果。将CMV-Jurkat(中靶)和mScarlet+NY-ESO-Jurkat(脱靶)的混合物与shRNA病毒一起孵育。在5天后，以0.25μg/ml添加抗FAS抗体(克隆CH11，Millipore Sigma)以诱导细胞凋亡。在14小时后收集细胞，并且根据制造商的方案用APC抗膜联蛋白V(Biolegend)和7-AAD染色。然后将样品用流式细胞术(BD LSRII)进行分析，并且首先对7-AAD-低和膜联蛋白V-低群体进行门控。然后在FAS shRNA与对照shRNA之间比较转导的中靶细胞与脱靶细胞的比率以生成经归一化的条形图。
慢病毒与混合细胞群体的孵育
对于T细胞混合实验，根据制造商的方案，通过CellTrace Violet染料(#C34571，Thermo Fisher)标记表达Flu-TCR的Jurkat T细胞。将Violet标记的Flu-m1 TCR+T细胞与NY-ESO-1-TCR+T细胞以不同比率(包括1:1、1:10、1:100、1:1000)混合。将混合的T细胞与40μL浓缩的展示HLA-A2-Flu抗原的GFP病毒一起在37℃下一起孵育2小时。将T细胞用CD3-APC(克隆HIT3a，BioLegend)抗体染色，洗涤两次，并且经受流式细胞术。对于B细胞混合实验，将表达HPV-BCR的Ramos B细胞用CellTrace Violet染料标记，并且与表达HPV-L2 BCR的Ramos B细胞以不同比率(包括1:1、1:10、1:100、1:1000)混合。将混合的细胞与40uL浓缩的展示RBD-抗原的GFP病毒在37℃下一起孵育2小时。将B细胞用IgG-PE-Cy7抗体(克隆G18-145，BD Biosciences)染色，洗涤两次，并且经受流式细胞术。指标计算如下：
灵敏度＝GFP+中靶细胞占总中靶细胞的百分比
特异性＝1-(GFP+脱靶细胞占总脱靶细胞的百分比)
信噪比＝(GFP+中靶细胞占总中靶细胞的百分比)/(GFP+脱靶细胞占总脱靶细胞的百分比)。
人原代免疫细胞的分离和激活
来自健康供体的血沉棕黄层获自具有同意书的Stanford Blood Center。使用Lymphoprep(目录号07811，STEMCELL Technologies)密度梯度离心来分离外周血单个核细胞(PBMC)，并且将其冷冻保存并且储存在-80℃。根据制造商的方案，使用EasySep人B细胞富集试剂盒(目录号19844，STEMCELL Technologies)通过阴性选择从解冻的PBMC中纯化B细胞。将分离的B细胞在补充有10％ FBS和55mMβ-巯基乙醇的IMDM培养基中以1X 106个细胞/mL进行培养，并且通过CellXVivo人B细胞扩增剂(1:250稀释，R&D system)和50ng/mLIL2(目录号200-02-10ug，PeproTech)激活两天。来自具有CMV感染(CMV血清反应阳性)的HLA-A2+供体的LRS室获自具有同意书的Stanford Blood Center。如上所述分离并且储存PBMC。根据制造商的方案，使用EasySep人CD8+T细胞富集试剂盒(目录号19053，STEMCELLTechnologies)通过阴性选择从解冻的PBMC中纯化CD8+T细胞。
抗原特异性T细胞的肽富集
通过Elimbio在冻干粉末中合成编码CMV表位(与HLA-A2等位基因相容，表S3)的短9聚体肽。将肽以10mg/mL溶解在DMSO中。从如上所述的供体血液中分离PBMC。将PBMC在T细胞培养基(补充有10％ FBS、1X penstrep、100mM HEPES、55mMβ-巯基乙醇的RPMI培养基)中培养。将单独的肽(10ug/mL)或汇集的肽(每种肽1ug/mL)添加到PBMC中用于在T细胞培养基中培养10天。每两天添加一次50ng/mL IL-2。在肽富集后，将PBMC与病毒和/或PE-四聚体一起孵育，并且然后通过流式细胞术分析。
流式细胞术
对于图1D，将B细胞与病毒一起孵育2小时，并且然后在4℃下用细胞染色缓冲液(BioLegend)中的人TruStain FcXTM(Fc块，BioLegend)、CD19-APC(克隆HIB19)和CD20-V450(克隆L27)抗体染色10分钟。对于图2，将Jurkat T细胞与病毒一起孵育2小时，并且然后用CD3-APC(克隆HIT3a)和PE标记的负载肽的四聚体(NIH四聚体核心)在4℃下染色30min。对于图5，将细胞与病毒一起孵育2小时，并且然后用人Fc块、CD3-APC、CD8-BV711(克隆SK1)、四聚体-PE(如果需要)和活力染料在4℃下染色30min。在染色后，将细胞通过细胞过滤缓冲液洗涤两次，并且通过流式细胞术(Attune，Thermo Fisher)分析。如果没有指定，则所有抗体均来自BioLegend。四聚体来自NIH四聚体核心。
RNA-seq实验和分析
将CMV pp65-TCR+T细胞与30uL展示pp65495-503的ENTER病毒或1μg pp65495-503四聚体一起孵育2小时。将细胞洗涤两次并且经受RNA提取。使用具有柱上DNA酶消化的Quick-RNA Miniprep试剂盒(Zymo Research)提取RNA。遵循制造商的说明书，对每个样品使用Stranded mRNA Library Prep试剂盒(目录号20020594，Illumina)，将至少100ng的RNA用于制备RNA-seq文库。在Illumina Nextseq上对文库进行测序以生成2X 150个成对末端读段(paired-end reads)。使用STAR以默认参数(--outFilterMultimapNmax1--alignEndsType EndToEnd--outSAMattributes NH HI NM MD)将RNA-seq读段映射到人基因组(hg19)。通过具有默认参数(--stranded＝reverse–additional-attr＝gene_name)的HTseq计数在基因水平上进行比对读段的定量。使用具有大小因子归一化的DESeq2，将原始计数用于鉴定差异表达的基因(DEG)，并且如果Benjamini&Hochberg调整的p值<0.01并且基因表达差异超过2倍变化，则鉴定DEG。
混合的表达TCR的Jurkat T细胞的ENTER-seq工作流程
所有引物均是合成和从IDT订购的(表6)。将表达不同TCR的Jurkat细胞混合在一起并且如上所述对病毒混合物进行染色。之后在BD Aria II上分选GFP+细胞。定制商业10xGenomics 5’RNA试剂盒以同时读出每个单细胞的HLA肽、TCR和转录组。分选后立即将细胞在4℃下用PBS+0.4％ BSA洗涤一次，与掺加有定制TCRαRT引物(hs_TRAc_RT和NYESO_TRAc_RT的混合物)的RT(逆转录)混合物以0.1μM混合，并且加载到10xchromium。将cDNA根据制造商的方案扩增并且清除以生成转录组。
在cDNA清除期间，将含有HLA肽的较短片段和TCR信息的上清液进一步与SPRISelect珠混合至0.9x，并且清除。通过2轮巢式PCR和最后一轮索引PCR生成编码HLA肽的文库。首先，用0.5uM 10x_5pRNA_Fw和HLA_nested_fw通过8个PCR循环(98c持续45min，然后8x的在98℃下20s、在59℃下20s以及在72℃下30s)富集HLA肽cDNA。在清除后，在如上所述具有0.5um巢式引物和Illumina衔接子P7_Tru_HLA_fw和P5_adapter引物的第二轮PCR中使用5ul洗脱物。最后，取5ul洗脱物用基于Illumina Truseq的索引引物生成最终文库。以上引物以与双索引兼容的方式设计，因此在此可以使用定制索引引物或10x双索引引物。
为了读出Jurkat细胞系中的TCR信息，生成文库，所述文库涵盖TCRα的VDJ部分以推断细胞的TCR身份。首先，用0.5μM 10x_5pRNA_Fw和0.5uM靶向两种不同TCR的nyeso_TRAc_rev和hs_TRAc_rev的混合物通过巢式PCR(具体地，98c持续45min，然后8x的在98℃下20s、在59℃下20s以及在72℃下30s)富集TCR DNA。接下来，取5ul洗脱液用于运行具有Illumina衔接子(P7_TRAc_nyeso_Rev和P7_TRAc_hs_Rev的混合物)和P5_adapter的第二轮巢式PCR持续8个循环，随后进行类似于HLA文库的最终索引PCR。混合的表达TCR的Jurkat T 细胞的ENTER-seq分析
使用Illumina的Novaseq和Miseq平台对文库进行测序。使用10X的CellRanger分析转录组fastq文件以提供单细胞条形码。用定制python脚本将TCR库的fastq文件映射到TCRα链。计算每个细胞条形码化的每种类型TCR的UMI计数。为了排除双重体，设定对于每个gem条形码，优势TCR的UMI计数是那些非优势TCR种类的至少10倍。接下来，使用CellRanger计数处理HLA肽读段，其中肽序列作为特征参考。用python中的matplotlib包生成下游分析和绘图。
在CMV抗原肽诱导的离体扩增之前或之后原代T细胞的ENTER-seq工作流程
收集肽刺激的供体PBMC，并且用12种展示CMV抗原表位(包括IE181-89、IE1316-324、US150A152-161、US874-82、UL100200-208、UL46100-108、pp65417-425、pp65325-333、pp65188-196、pp65120-128、pp65495-503和pp6514-22)的病毒的混合物染色。CMV抗原的肽序列列出于表5中。在2小时后，还将细胞用条形码化抗体CD45RA、CD45RO和IL7R(Biolegend totalseq-C，目录号304163、目录号304259、目录号351356)、活死染料、CD3-APC和CD8-BV711在冰上染色20min。还将来自每个供体的样品用独特主题标签条形码化抗体(Biolegend totalseq-C，目录号394661，目录号394663)染色。在两次洗涤后，根据制造商的方案使用5’RNA和VDJ试剂盒分选CD8+CD3+GFP+细胞以在10x Genomics平台上运行。在此，根据制造商的方案，每个样品获得以下文库：10x基因表达文库、VDJ文库和特征条形码化CITE-seq文库。另外，以与上述相同的方式生成HLA肽文库。将最终文库在Illumina Miseq、Nextseq 550或Novaseq 6000上测序。对于不经肽刺激/扩增的直接分离自患者血液样品的原代T细胞的ENTER-seq，首先遵循使用者的方案使用EasySep人CD8+T细胞分离试剂盒(目录号17953，STEMCELLTechnologies)从冷冻保存的患者PBMC样品中纯化总CD8+T细胞。接下来，前3种ENTER pMHC病毒(pp65495-503、US874-82和UL100200-208)的混合物在37℃下制备2小时。抗体染色、流式细胞术分选和10x Genomics文库生成的后续步骤与上述离体扩增的T细胞相同。
来自CMV血清反应阳性供体的原代细胞的ENTER-seq分析
将scRNA-seq读段与GRCh38基因组比对，并且使用CellRanger计数(10xGenomics)进行定量。使用CellRanger计数处理CITE-seq读段，其中抗体寡核苷酸条形码作为特征参考。使用CellRanger vdj(10x Genomics)将TCR-seq读段映射到VDJ兼容参考(refdata-CellRanger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0)。使用CellRanger计数处理HLA肽读段，其中肽序列作为特征参考。
使用SCANPY(Wolf等人,2018)进行单细胞RNA-seq和CITE-seq的后续分析。从分析中排除检测少于200个基因或大于10％线粒体RNA读段的细胞。使用标记供体来源的条形码化主题标签抗体进行CITE-seq分析来去除双重体细胞。对于细胞聚类，将原始UMI计数首先通过总计数归一化以校正文库大小，并且然后进行对数归一化。使用具有默认参数的scanpy.pp.highly_variable_genes()调用可变基因。在主组分分析(PCA)之前去除可变TCR基因以预防来自可变TCR转录物的聚类偏倚。接下来，回归掉(regress out)每个细胞的总计数和线粒体基因的百分比的影响，并且然后将数据缩放至单位方差。基于可变基因(无TCR基因)，将缩放的数据用作PCA分析的输入。用前40个主组分使用莱顿图聚类方法鉴定聚类簇。为了确定ENTER病毒诱导的基因表达是否可以影响T细胞状态和聚类，进行在去除28个ENTER病毒诱导的基因(其从批量RNA-seq数据中鉴定)之前和之后的莱顿图聚类。使用具有默认参数的scanpy.tl.umap()和scanpy.pl.umap()生成UMAP图。使用scanpy.tl.heatmap()与原始值或z得分缩放的基因表达生成热图绘图。
使用包括CD3E、CD4、CD8A、CD45RA、CD45RO、CCR7、GZMB和KLRB1的已知标志物的表达来注释初始聚类簇。所有CD8+T细胞均是CD3E+CD8A+CD4-的。幼稚T细胞是CD45RA+CCR7+的。中枢记忆T细胞(TCM)是CD45RA-CCR7+的。效应记忆T(TEM)细胞是CD45RO+CCR7-的。再表达CD45RA的终末效应细胞(TEMRA)是CD45RA+CCR7-CD45RO-的，MAIT细胞是KLRB1+CXCR6+TRAV1-2+的。使用scanpy.tl.score_genes()计算基因得分，其中ctrl_size＝500并且use_raw＝True。由已确立的细胞毒性分子策定出细胞毒性基因的基因集。T细胞耗竭基因、T细胞激活基因和I型IFN应答基因选自先前的文献(Yost等人,2019)。
使用Scirpy(Sturm等人,2020)进行TCR相关分析。将通过CellRanger vdj生成的重叠群(contig)注释文件用作TCR分析的输入。使用scirpy.tl.chain_qc()分析TCR质量。基于CDR3核苷酸序列相似性使用具有默认参数的scirpy.pp.ir_dist()和scirpy.tl.define_clonotypes()来定义TCR克隆型。使用scirpy.Tl.clonotype_network()(其中min_cells＝3)在网络上可视化TCR克隆型。使用weblogo(Crooks等人,2004)生成CDR3氨基酸组合物。对于任何单独抗原具有超过5个原始计数的HLA肽的细胞被标记为抗原特异性T细胞。使用log(计数+1)转化来定量每个细胞的抗原肽计数。将pp65特异性T细胞分成克隆大小>50或>10或≥1的不同克隆扩增的细胞。在小提琴图中示出了不同克隆扩增的T细胞中每个细胞结合的抗原肽计数的分布。使用优势TCR克隆型作为条形码，使用kdeplot()函数生成2D密度图，以显示在抗原诱导的扩增之前和之后具有相同TCR序列的T细胞的细胞毒性基因得分和I型IFN基因得分。所有图(例如，小提琴图、散点图、密度图和条形图)均由Python matplotlib和seaborn生成。
使用TCR作为条形码，在与优势抗原特异性T细胞共享相同TCR序列的ENTER阴性群体中鉴定假阴性T细胞。类似地，假阳性抗原特异性T细胞(诸如pp65特异性T细胞)可以通过以下生成：在具有优势克隆的pp65特异性T细胞与其他CMV抗原特异性T细胞或ENTER阴性T细胞之间追踪TCR序列。进一步计算前3个抗原表位的假阴性率(FNR)和假阳性率(FPR)。对于pp65495-503特异性T细胞，FNR＝0.19％；FDR＝0.36％。对于US874-82特异性T细胞，FNR＝2.73％；FDR＝0.18％。对于UL100200-208特异性T细胞，FNR＝0％；FDR＝0.07％。
虽然已经参考具体实施方案(其中一些是优选实施方案)具体示出和描述了本公开文本，但是本领域技术人员应理解，在不脱离如本文公开的本公开文本的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式和细节上的各种改变。因此，不旨在限制于本文呈现的确切摘要和公开文本。
表3.在这些研究中构建的载体列表
表4.TM结构域序列的列表
表5.HLA肽序列的列表：
表6.DNA寡核苷酸序列
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Claims (67)
1.一种工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含：
在所述慢病毒的表面上展示的异源性配体；
包含经修饰的病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述配体的内源性受体；
可操作地连接至慢病毒结构蛋白的报告蛋白；和
条形码化RNA。
2.根据权利要求1所述的工程化慢病毒，其中所述促融物是或包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白包含在所述VSV-G多肽的位置H8、K47、Y209和R354中的任一个处的一个或多个氨基酸取代。
4.根据权利要求3所述的工程化慢病毒，其中所述经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白包含K47Q取代和R354A取代。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述配体是或包含蛋白质或表位。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述配体是或包含MHC肽、抗体、抗原、分泌型蛋白、细胞表面蛋白、或由细胞表达的其他形式的抗原。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述抗原是胞内抗原。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述配体可操作地连接至优化的跨膜结构域。
9.根据权利要求8所述的工程化慢病毒，其中所述优化的跨膜结构域是源自HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-A2、ICAM1、CD43、CD162、CD62L、CD49d或LFA-1的跨膜结构域。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述配体可操作地连接至优化的跨膜结构域和信号肽。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含缺陷型整合酶蛋白。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述报告蛋白是GFP或mNeon。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述结构蛋白是核衣壳蛋白。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述结构蛋白是Gag蛋白。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述条形码化RNA被包封在病毒颗粒中。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述RNA编码所述配体蛋白。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述RNA编码待递送至宿主细胞中的目的基因。
18.根据权利要求1-14中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述RNA通过下一代测序技术读出。
19.根据权利要求1-14中任一项所述的工程化慢病毒，其中所述RNA包含捕获序列。
20.一种用于鉴定配体-受体对的方法，所述方法包括：
提供至少一种根据权利要求1-19中任一项所述的工程化慢病毒；
将所述慢病毒与细胞群体合并；以及
基于所述报告基因的存在分选所述细胞群体，从而鉴定配体-受体对。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法包括提供工程化慢病毒库，所述库展示不同的配体。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法包括将所述慢病毒与细胞合并，并且在约4℃下孵育病毒/细胞混合物。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法包括将所述慢病毒与细胞合并，并且在室温下孵育病毒/细胞混合物。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法包括将所述慢病毒与细胞合并，并且在约37℃下孵育病毒/细胞混合物。
25.根据权利要求20-24所述的方法，其中所述方法包括将所述病毒/细胞混合物孵育约30分钟、或约1小时或约2小时、或约0.5小时至约2.5小时的任何时间段。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：对病毒RNA进行单细胞测序以鉴定所述配体序列。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：对细胞转录组进行单细胞测序以鉴定所述受体序列。
28.一种将目的核酸或目的蛋白质递送至使用者定义的靶细胞中的方法，所述方法包括：提供根据权利要求1-19中任一项所述的工程化慢病毒；
使所述慢病毒与包含所述靶细胞的细胞混合物接触，以及
将所述核酸或蛋白质仅递送至所述靶细胞中，其中所述靶细胞表达对所述慢病毒表面上的所述配体有特异性的受体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述配体经修饰以便将货物递送至所述使用者定义的靶细胞中。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述目的核酸被包装在所述工程化慢病毒颗粒内部。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述目的蛋白质可操作地连接至所述慢病毒的慢病毒结构蛋白。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述目的蛋白质可操作地连接至gag蛋白。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是体内、离体或体外的。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是哺乳动物细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
36.根据权利要求34至35中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是免疫细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞或B细胞。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述人细胞是原代人血细胞(PBMC)。
39.一种鉴定免疫原性抗原的方法，所述方法包括：
提供工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在所述慢病毒的表面上展示的异源性受体蛋白；包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述受体的天然抗原；可操作地连接至慢病毒结构蛋白的报告转基因；和条形码化RNA，其中所述RNA编码抗原信息；
将所述慢病毒与细胞群体合并；以及
基于所述报告物的存在分选所述细胞群体。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：对病毒RNA进行测序以鉴定抗原序列。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：对细胞的受体RNA进行测序。
42.一种鉴定T细胞受体和配对的pMHC的方法，所述方法包括：
提供工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在病毒表面上展示的pMHC；包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述PMHC的T细胞受体；可操作地连接至慢病毒结构蛋白的报告转基因；和条形码化RNA；
将所述慢病毒与所述细胞群体合并；以及
基于所述报告物的存在分选所述细胞群体，从而鉴定所述T细胞受体。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述细胞群体包含人原代T细胞。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述pMHC由包含以下的RNA编码：串联的信号肽、所述PMHC、G4S接头、b2m基因、G4S接头和MH等位基因。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：对病毒RNA进行单细胞测序以鉴定MHC肽序列。
46.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：对细胞的受体序列进行测序以鉴定所述MHC肽序列和T细胞受体序列。
47.一种鉴定B细胞受体或抗体的方法，所述方法包括：
提供工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在慢病毒表面上展示的表位，其中所述表位任选地与ICAM1跨膜结构域连接；包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述胞内表位的B细胞受体；可操作地连接至慢病毒结构蛋白的报告转基因；和条形码化RNA；
将所述慢病毒与B细胞群体合并；以及
基于所述报告物的存在分选所述细胞群体，从而鉴定所述B细胞受体或抗体。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述抗原是细胞表面膜蛋白、胞内蛋白、分泌型蛋白或糖基化蛋白。
49.根据权利要求47-48所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：对病毒RNA进行单细胞测序以鉴定所述抗原并且匹配B细胞受体序列。
50.一种鉴定针对B细胞受体的抗原的方法，所述方法包括：
提供根据权利要求1-19中任一项所述的工程化慢病毒；
将所述慢病毒与B细胞群体合并；以及
基于所述报告物的存在分选所述细胞群体，从而鉴定所述B细胞抗原。
51.一种单细胞多组学的方法，所述方法包括：
提供工程化慢病毒，所述工程化慢病毒包含在所述慢病毒的表面上展示的异源性配体；包含经修饰的VSV-G病毒包膜蛋白的促融物，其中所述促融物能够使所述慢病毒与宿主细胞融合，其中所述宿主细胞包含针对所述配体的内源性受体；可操作地连接至慢病毒结构蛋白的报告转基因；和RNA，其中所述RNA包含抗原序列和用于单细胞测序的捕获标签；以及
在单细胞水平上同时检索转录组和表型信息。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述单细胞测序是基于微滴的平台。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述细胞的表型包括通过CITE-seq得出的表面标志物。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述信息包括配体序列和受体序列。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述单细胞多组学使用全细胞作为输入。
56.根据权利要求51所述的方法，其中所述单细胞多组学使用全细胞作为输入并且包括逆转录步骤。
57.一种用于在细胞混合物中选择性耗尽或富集靶细胞群体的方法，所述方法包括：
提供(a)根据权利要求1-19中任一项所述的工程化慢病毒，和(b)包含以下的细胞混合物：
(i)靶细胞群体，所述靶细胞群体表达对在所述工程化慢病毒的表面上展示的所述配体有特异性的受体，和
(ii)不表达所述受体的非靶细胞群体；
使所述工程化慢病毒与所述细胞群体接触，并且将所述核酸或蛋白质仅递送至所述靶细胞中；
添加试剂，所述试剂特异性抑制所述靶细胞群体的生长或抑制所述非靶细胞群体的生长，从而选择性耗尽或富集所述靶细胞群体。
58.根据权利要求57所述的方法，所述靶细胞表达单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)转基因，并且所添加的试剂包含或是更昔洛韦(GCV)。
59.根据权利要求57至58中任一项所述的方法，其中所述靶细胞表达shRNA，以减少细胞死亡受体FAS的表达，以预防所述靶群体的细胞死亡。
60.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述靶细胞群体包含免疫细胞。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述免疫细胞包含T细胞。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述免疫细胞包含B细胞。
63.根据权利要求60至62中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是自身反应性免疫细胞。
64.根据权利要求60至63中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞对与健康状况相关的抗原有特异性。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述健康状况是增殖性障碍、炎性障碍、自身免疫性障碍、或微生物感染。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述增殖性障碍是癌症。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述微生物感染是细菌感染、病毒感染、或微真菌感染。
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