CN115561462A - 基于细胞粘连作用的膜蛋白相互作用筛选平台 - Google Patents

基于细胞粘连作用的膜蛋白相互作用筛选平台 Download PDF

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Abstract

基于细胞粘连作用的膜蛋白相互作用筛选平台。本发明公开了一种制备细胞膜相互作用的蛋白筛选平台，属于细胞免疫领域。将细胞膜蛋白和待测膜蛋白编码基因分别在不同的细胞中表达，染色后再将表达不同膜蛋白的细胞与表达目标蛋白的细胞共孵育，进而筛选得到相互作用的膜蛋白，并测序确定其具体序列。本发明提供的筛选平台可对多种细胞膜蛋白以及基于膜蛋白的工程细胞进行筛选，且特异性强，大大提高了筛选互作蛋白的效率，并降低难度，为研究细胞膜蛋白作用机理提供了简便的工具并提高筛选通量。

Description

基于细胞粘连作用的膜蛋白相互作用筛选平台
技术领域
本发明涉及免疫学相关蛋白筛选领域，具体地说，涉及细胞膜表面蛋白相互作用进而对特异性结合蛋白筛选的筛选平台。
背景技术
蛋白质是细胞功能的主要执行者，膜蛋白占人类蛋白质组的30％以上。细胞间的通信通常是由膜蛋白的相互作用控制的，且大多数信号通路是由细胞表面受体的参与而启动的，因此膜蛋白之间的相互作用在细胞间的信息交流、细胞内的信号转导中扮演着不可替代的角色。准确找出某一目标蛋白的相互作用蛋白，不仅有助于更全面地了解该目标蛋白的功能，还能完善细胞内信号通路的蛋白组成，为今后可能的药物靶点设计奠定了基础。
研究蛋白之间相互作用的现有技术如下：
1、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)：免疫共沉淀技术是一种以抗体和抗原识别专一性为基础，用于研究蛋白质间相互作用的经典方法。其基本原理是利用抗体来识别与与蛋白发生了特异性结合的抗原，从细胞裂解液或者蛋白混合物中捕获与抗原相互作用的蛋白，通过洗脱，获得抗原-蛋白复合物，联合质谱或蛋白印迹等方法对该蛋白进一步分析，即可获得蛋白间相互作用的信息。免疫共沉淀技术的应用范围十分广泛，可用与测定两种蛋白质在体内是否存在相互作用，也可用与确定特定蛋白的新的互作蛋白。当免疫共沉淀技术与其他方法如质谱或免疫印迹等结合时，可分离得到在天然状态下结合的相互作用蛋白复合物。
2、pMHC多聚体标记技术：近年来，荧光分子标记的pMHC多聚体结合流式细胞仪已经成为免疫分析中最重要的检测工具之一，被广泛应用于抗原特异性T细胞的定性、定量分析和分离。pMHC是MHC分子的可溶性寡聚体形式，利用亲和素与生物素的强结合力，将多个连有生物素的pMHC与被荧光标记的亲和素结合形成多聚体，该多聚体与T细胞结合的能力比单体形式强，且与抗原特异性T细胞结合后形成的复合物的稳定性更高，从而可通过流式将与该抗原肽结合的T细胞筛选出来。除了荧光分子标记的pMHC多聚体外，现在还发展出了其他分子如：DNA-条形码、重金属离子等标记的pMHC多聚体。pMHC多聚体标记技术结合微流控和单细胞测序等技术，不仅可以达到高通量筛选具有抗原特异性的T细胞，也可同时获得该T细胞所携带的TCR信息。
3、酵母双杂交系统：以转录激活因子重构为基础的酵母双杂交系统是一种研究细胞内蛋白质之间相互作用的经典方法，但该方法的可检测范围仅限于细胞核内的蛋白质。为满足检测细胞膜蛋白之间相互作用的研究需要，基于断裂泛素重组的酵母双杂交系统应运而生。泛素作为降解信号分子，分为N端和C端，在其两端分别连接一个待测蛋白质，当两个蛋白质之间发生相互作用时，断裂的泛素分子可被重组。互补重构的完整泛素分子可被泛素专一性蛋白酶识别，导致与泛素C端相连的转录因子被切割下来并进入细胞核内激活报告基因的转录表达。通过报告基因的表达与否，可判断膜蛋白之间是否存在相互作用。基于断裂泛素重组的膜蛋白酵母双杂交系统不仅可以用来大规模检测膜蛋白质间的相互作用，也可以用来研究抗原抗体的相互作用。
4、荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)：荧光共振能量转移是两个荧光基团之间的一种能量转移现象，若一个荧光基团的激发光谱与另一个荧光基团的发射光谱重合时，当前一个荧光基团被激发，能量可通过偶极-偶极耦合作用以非辐射方式传递并激发后一个荧光基团。将具有该特性的两种荧光基团分别构建到待测蛋白上，通过荧光基团的激发情况即可得知两种蛋白是否存在相互作用。FRET方法灵敏度高，能直观地提供蛋白质间相互作用的定位和定量信息，为在活细胞中对蛋白间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。
5、邻近催化标记技术
(1)APEX:
APEX是一种经基因工程改造的过氧化物酶，可用作电子显微镜(TM)和活细胞蛋白质组学中的标记酶。将APEX与目标蛋白遗传融合后在细胞内稳定表达，固定该细胞后用二氨基联苯胺(DAB)和过氧化氢溶液将其覆盖，通过TM可观察到由APEX催化DAB聚合而形成的局部沉积。当用蛋白质组图谱进行分析时，在培养液中添加生物素-苯酚作为底物，用过氧化氢处理活细胞1分钟后，APEX会催化生物素-苯酚的氧化，从而产生生物素-苯氧基自由基，该自由基共价可结合到与APEX-目标蛋白发生相互作用的内源蛋白上，使用链霉亲和素珠将结合蛋白进行富集并通过质谱鉴定可得到与目标蛋白相互作用的蛋白质的信息。
(2)BioID
BioID的基本原理是将生物素连接酶和诱饵蛋白在目的细胞中融合表达，加入适量的生物素后，与诱饵蛋白相互作用或者靠的很近的蛋白将被生物素连接酶标记上生物素；之后用链霉亲和素纯化被生物素标记的蛋白，将产物做质谱鉴定，实验组结果和对照组作比较分析即可获得与诱饵蛋白发生相互作用的蛋白。实验流程包括4个主要步骤，构建生物素连接酶和诱饵蛋白的融合表达载体，融合蛋白在目的细胞中稳定表达，加入适量生物素，生物素化的蛋白经链霉亲和素和磁珠纯化，洗脱产物做质谱鉴定。BioID鉴定到的互作蛋白是细胞内与诱饵蛋白天然互作的，且弱结合蛋白和瞬时互作蛋白也能被检测到。
(3)PUP-IT
PUP-IT利用了细菌中的Pup连接酶PafA，通过将邻近蛋白标记上小分子蛋白Pup来实现对蛋白质相互作用的捕捉。细菌Pup蛋白缀合系统通过遗传融合pafA(一种编码Pup连接酶的基因)和诱饵蛋白，在有ATP的存在时，pafA催化pup C末端的Glu磷酸化，随后pup C末端的Glu会被偶联到靶蛋白的赖氨酸残基链上。目前PUP-IT已应用到T细胞表面受体CD28的研究中，并鉴定到了多个与CD28相互作用的蛋白，同时也发现了大量潜在的新的CD28相互作用蛋白。
6、胞啃：
胞啃作用是T淋巴细胞和抗原递呈细胞之间特有的一种膜转移现象。T细胞与抗原递呈细胞特异性识别后发生接触，接触过的细胞其接触区域的膜表面蛋白会由于胞啃作用而相互转移。通过标记T细胞和其识别的目标细胞的膜表面蛋白转移来实现对TCR-抗原精确配对的筛选。胞啃技术的适用范围广泛，可用于筛选任意HLA类型的TCR所识别的抗原，且对MHCI或MHCII所呈递的抗原和TCR之间的配对筛选都适用，从而可以用来鉴定除肿瘤外与其它免疫疗法相关的潜在抗原，如自身免疫疾病抗原。胞啃技术的灵敏度也很高，可同时筛选104-105种抗原表位。
7、T-Scan：
T-Scan是利用当T细胞表面TCR与其靶细胞识别后会将颗粒酶(granzymeB，GzB)运输到靶细胞内这一T细胞杀伤功能的生理过程，通过荧光报告基因的激活检测靶细胞内GzB的活性，从而筛选出携带有TCR特异性识别的抗原肽信息的靶细胞。在荧光蛋白中构建一段可被GzB特异性识别的裂解序列，将其表达在抗原递呈细胞中。当抗原递呈细胞与T细胞发生特异性识别后，T细胞释放GzB，GzB进入到抗原递呈细胞中后切割裂解序列，使荧光蛋白完整性得以恢复。通过流式分选得到表达荧光的抗原递呈细胞并进行测序，可获得与TCR发生特异性识别的抗原序列。T-Scan作为一种高通量、全基因组的技术平台，能系统性的筛选与TCR特异性识别的抗原。
8、信号传导和抗原呈递双功能受体(signaling and antigen-presentingbifunctional receptors，SABRs)：
SABR方法是利用改造过的pMHC复合体来启动激活信号。SABR由胞外的pMHC复合物与胞内的CD28-CD3ζ信号域融合而成，当SABR-抗原递呈细胞与配对的T细胞相互识别后，会激活抗原递呈细胞中下游的NFAT信号，从而诱导荧光蛋白的表达，通过流式分选出这些表达荧光的细胞，二代测序后即可获得其携带的抗原信息，从而得到TCR与抗原的精准配对信息。SABR技术适用于筛选任意HLA类型的TCR所识别的抗原。
上述技术仍存在以下问题：
1、免疫共沉淀：
①蛋白质间瞬时的相互作用会被遗漏；②假阳性高，主要是由于检测到的结合可能是第三者物质的作用而造成的，而不是蛋白间直接的相互作用；③一次只能检测某特定蛋白与另一种蛋白的相互作用；④操作过程复杂。
2、pMHC多聚体标记技术：
①可用的荧光染料数量有限，限制了单次实验的可检测范围；②pMHC四聚体制备复杂，价格昂贵。
3、酵母双杂交系统：
部分蛋白质表面存在对其他蛋白质具有低亲和力的区域，容易形成蛋白体复合物，引起报告基因表达，产生假阳性结果。
4、荧光共振能量转移：通量低，并且要求两个荧光基团的距离小于100埃。
5、邻近催化标记技术
(1)APEX2：实验中需要添加过氧化氢才能使反应发生，若当实验对象为活细胞时，会造成细胞损伤或氧化应激。
(2)BioID：①不能判断鉴定到的蛋白是直接还是间接与诱饵蛋白相互作用的；②没有伯胺的互作蛋白不能被生物素化，无法通过该方法检测到。
6、胞啃：该技术仅在TCR-抗原筛选中得到验证，能否适用于其他膜蛋白的相互作用需要进一步探究。
7、T-Scan：①被筛选的抗原必须能够被编码从而可以用报告蛋白进行改造，因此生理状态下存在的翻译后修饰会被忽略，②非肽类抗原无法适用。
8、信号传导和抗原呈递双功能受体：目前每次只能用来筛选单个TCR识别的抗原肽，且抗原库表达的抗原数量范围限制在106。
相对于细胞质和细胞核中蛋白质的相互作用，检测位于细胞膜上的蛋白质的相互作用面临着更大的挑战，主要的原因有：膜蛋白不易提取、相互作用时间短且作用力微弱、研究蛋白质之间相互作用的传统方法并不完全适用于膜蛋白、细胞膜上相互作用的蛋白其作用机制仍不清楚。
发明内容
为了鉴定和筛选细胞膜蛋白的潜在互作蛋白，我们开发了一种在活细胞中利用细胞粘连作用检测膜蛋白间相互作用的平台。我们希望构建一种操作简单、广谱、高效的平台，不仅可以对膜蛋白间的相互作用进行鉴定，而且可以高通量地筛选出膜蛋白间发生相互作用形成的细胞粘连体，从而进一步获得互作蛋白的信息。
实施本发明的原理如下：
细胞粘连是细胞由于膜表面蛋白间的相互作用而互相接近并发生连接的现象。将表达不同膜蛋白的细胞共培养一段时间后，可以相互作用的膜蛋白特异识别时，细胞间会发生粘连现象将两个细胞彼此拉近并“捆绑”，此时将细胞固定并通过流式细胞仪筛选出粘连的细胞，并对分选得到的细胞进行二代测序获得发生相互作用的膜蛋白的基因序列。
进一步的，所述筛选平台中包括至少两种相同或不同的细胞，用来表达不同的膜蛋白，其中一种用于表达已知的膜蛋白，而另外一种用于表达可能与已知膜蛋白相互作用的待测膜蛋白。所述细胞可以是真核细胞或原核细胞。真核细胞包括但不限于：哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、线虫细胞、植物细胞或真菌细胞。其中，哺乳动物细胞包括但不限于293T、K562、Jurkat、Raji、EL4等。
进一步的，为了使得不同的膜蛋白能够在细胞表面表达，本发明构建了表达载体，用来转染细胞，而且所述表达载体中包含编码蛋白的基因和引导膜定位和膜锚定的基因序列。而且，所述编码不同蛋白的核酸可操作性的连接在一起，能够在细胞膜表面表达。
其中，所述表达载体包括能够在真核细胞中进行表达的载体，包括病毒表达载体和真核表达载体，其中病毒表达载体包括但不限与逆转录病毒表达载体，慢病毒表达载体、腺病毒表达载体和腺相关病毒表达载体，具体如pRD114和pHIT60等。真核表达载体包括pCMV、pEGF等非病毒载体。
进一步的，本发明的筛选平台还包括待测膜蛋白的cDNA文库，为了筛选和已知目的抗原膜蛋白相互作用的不同的膜蛋白，本发明还公开了作为筛选待测膜蛋白的cDNA文库和抗原膜蛋白的cDNA文库，所述两种不同的cDNA文库容量较大，至少包含10000种不同的膜蛋白，便于从中查找和克隆待测膜蛋白和目的蛋白，所述文库序列可参考GenBank公开的基因组序列，包括但不限于人、小鼠、大鼠、鸡等动物。其中所述抗原膜蛋白可以衍生自一种或多种自体和非自体蛋白。非限制性实例包括寄生蛋白，病毒蛋白，细菌蛋白，寄生虫抗原，病毒抗原，细菌抗原，诱导自身免疫疾病的蛋白，自身抗原，肿瘤蛋白，肿瘤抗原，癌症蛋白，癌症抗原，外源抗原，内源性抗原，新抗原，毒素等等。
本发明第一方面公开一种细胞膜蛋白相互作用筛选平台：
通过基因工程手段将一段编码蛋白质的核酸序列表达在细胞A里，并在该细胞中表达该编码蛋白，该蛋白为任意可锚定在细胞膜上的蛋白；
将所述细胞A与另一携带膜蛋白的相同或不同的细胞B进行共孵育，发生接触；
将细胞固定以维持并稳定细胞之间相互作用的状态；
检测或分选出发生相互作用的细胞，所述发生相互作用的细胞会粘连聚团也即细胞粘连；
鉴定粘连的细胞所携带的膜蛋白信息，获得跨膜蛋白之间发生相互作用或表达水平的信息。
优选的，制备膜蛋白在细胞膜上表达的方法包括但不限于病毒载体感染、电转染、脂质体方法等使细胞表达跨膜蛋白的任一方法。其中，病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等病毒类载体。
优选的，上述膜蛋白包含跨膜序列的野生型跨膜蛋白或者经过基因工程改造的融合表达某一或几个跨膜序列的蛋白质或多肽。
优选的，所述跨膜系列包括所有具有膜定位功能的跨膜蛋白或多肽，可选自但不限于CD8跨膜序列、CD28跨膜序列、GPI锚定蛋白、A型激酶锚定蛋白以及所有可跨膜的蛋白序列或多肽。
优选的，上述膜蛋白，包括但不限于跨膜糖蛋白、G蛋白偶联受体、免疫球蛋白、病毒蛋白、抗原识别受体、抗体、抗原决定簇、细胞因子受体、低密度脂蛋白受体以及经改造的任何可跨膜的蛋白质或多肽。
优选的，所述跨膜糖蛋白，包括但不限于CD40、CD40L、表皮生长因子受体等；所述G蛋白偶联受体，包括但不限于CD185(CXCR5)、趋化因子受体家族等；所述的免疫球蛋白，包括但不限于CD80、CD86、PD-1、ICAM-1、CD19等；所述的抗原识别受体，包括但不限于T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体等。所述细胞因子受体，包括但不限于I型细胞因子受体和II型细胞因子受体。
上述筛选平台在构建过程中使用细胞可以是真核细胞或原核细胞。真核细胞包括但不限于：哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、线虫细胞、植物细胞或真菌细胞。其中，哺乳动物细胞包括但不限于293T、K562、Jurkat、Raji、EL4等。
鉴定上述细胞粘连使用可检测的示踪标记物括但不限于，蛋白类示踪标记物、生物素标记物、荧光染料标记物、磁珠标记、酶催化标记等所有可将细胞A与细胞B区分开的活细胞标记方法。
优选的，蛋白类示踪标记物，选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白以及所有可被标记物偶联抗体标记的蛋白或多肽等。
优选的，偶联抗体标记的蛋白包括但不限于NGFR、CD8、CD80、CD4、CAR等所有可被抗体或配体识别的蛋白或多肽。标记物偶联的抗体，可偶联荧光基团或荧光蛋白、生物素、磁珠等所有可与抗体偶联的标记物。
优选的，荧光染料标记包括但不限于活细胞示踪剂等多有可使细胞携带上荧光信号的染料，可选自CMFDA、Violet以及Far red以及其他活细胞示踪剂。
将粘连的细胞进行固定使用的固定液包括但不限于4％多聚甲醛固定液、70％乙醇固定液、戊二醛固定液、乙醇-福尔马林固定液、Carnoy固定液等所有可维持细胞结构的液体。
优选的，分选的方法包括但不限于流式细胞分选技术(FACS)、液滴微流控技术等所有可将发生粘连的细胞分选出来的方法。
优选的，检测步步骤包括：提取分选得到的粘连细胞中的多核苷酸；通过寡核苷酸条形码标记引物对其进行PCR扩增；扩增产物纯化后利用核苷酸测序技术进一步得到与已知蛋白相互作用的膜蛋白信息。
优选的，所述的寡核苷酸条形码可以通过直接或间接的方式缀合到粘连细胞筛选后所提取的多核苷酸中。
优选的，多核苷酸是选自基因组DNA、载体DNA、质粒DNA、mRNA、通过PCR扩增的DNA和通过逆转录产生的cDNA等。
优选的，所述的核苷酸测序技术包括但不限于桑格测序和二代测序(NGS)等任何可获得核苷酸序列信息的方法。
第二方面，本发明公开了一种对多种细胞膜表面蛋白进行双向筛选平台，优选的，可应用于包括但不限于鉴定T细胞受体(T cell receptor，TCR)与其靶抗原的配对以及TCR识别抗原的筛选、抗体及其识别抗原的鉴定和筛选、进行CAR的筛选及表达分析、细胞因子及其受体鉴定等所有膜锚定蛋白的互作蛋白鉴定、分析和筛选。
优选的，所表达的膜蛋白包括但不限于野生型膜蛋白、基因工程方法过表达的任何可定位到膜上的蛋白或跨膜蛋白库。
优选的，所述的抗原，按在细胞中加工的位置可分为内源性抗原和外源性抗原，可经由MHC分子递呈到抗原递呈细胞表面。
优选的，所述的抗原，按制备的方式可分为天然抗原、合成抗原和基因工程抗原。其中，合成抗原，是指具有抗原性质的人工合成多肽。
基因工程抗原，是指将编码免疫原性氨基酸序列的基因在质粒载体中真核或原核表达的抗原。优选的，包括但不限于以单链三聚体(SCT)形式在细胞中表达的一类抗原或一类抗原库。所述的SCT，是指由GS接头连接的抗原肽、β-微球蛋白和MHC结构域三部分组合而成，并在GS接头和MHC上构建二硫键修饰。
所述内源性抗原是指在抗原递呈细胞中新合成的抗原，包括但不限于病毒抗原和肿瘤抗原。以抗原肽-主要组织相容性复合体I类分子(MHCI)复合物形式递呈给CD8+T细胞。
外源性抗原，是指抗原递呈细胞从外部摄取，降解成短肽后以抗原肽-主要组织相容性复合体II类分子(MHCII)复合物形式递呈给CD4+T细胞，
其中，所述的MHC，包括MHCI、MHCII、MHCIII基因，分别编码MHCI、MHCII、MHCIII分子。其来源包括但不限于于人MHC(HLA复合体)、小鼠MHC(H-2复合体)、大鼠MHC(H-1复合体)等。
优选的，所述MHC包括HLA-A、B、C、E、F、G、H、J、K、L等位点的等位基因，编码HLA-A抗原、B抗原、C抗原、E抗原、F抗原、G抗原、H抗原、J抗原、K抗原、L抗原等I类抗原。
优选的，所述的MHCII分子，基因区包括HLA-DP、DQ、DR、DN、DO、DM。
所述TCR，包括但不限于人源和鼠源的内源性和外源性TCR。
优选的，所述内源性TCR，包括但不限于来源于原代T细胞、杀伤性T细胞、记忆T细胞等T细胞群体的TCR。
优选的，所述外源性TCR，包括TCRα链和β链。将编码至少一种TCR的多核苷酸序列连接至同一质粒载体上。
本发明第三方面公开了一种构建筛选平台的构建方法，所述筛选平台具体构建方法包括如下步骤：
(1)融合质粒的构建：将目标蛋白序列构建在质粒载体上；
(2)蛋白的稳定表达：通过转染将目的蛋白包装成病毒，通过感染的方式使之表达在特定的细胞上，得到稳定表达该膜蛋白的细胞系；
(3)活细胞示踪标记：利用活细胞示踪染料对细胞标记；
(4)共培养：将表达不同蛋白的细胞按照适当的比例进行混合，在一定条件下进行孵育，孵育后将细胞固定使发生相互作用的细胞保持在黏连状态；
(5)流式分析及分选：用细胞流式仪，分选同时带两种荧光的细胞；
(6)测序分析：通过聚合酶链式反应(PCR)技术对筛选到的细胞DNA进行扩增，再进行第二代测序，得到与已知膜蛋白发生特异性黏连的膜蛋白序列。
进一步的，所述方法中活细胞示踪标记包括细胞染色以及荧光蛋白标记，所述细胞染色为流式细胞荧光分选技术(FACS)常用的染色剂，包括CMFDA，Violet，DAPI等染色剂，也可以通过在细胞内表达各种荧光蛋白等进行细胞标记。
进一步的，在一些实施方案中，表达待测膜蛋白和已知膜蛋白的细胞产生有效的细胞粘连的细胞的比例为约1:5至约1：10000。在一些实施方案中，有效细胞黏连成所需的比例为约5:1、10:1、100:1、1000:1、或10000:1，或者上述比例中任意两个所定义的范围内的比例。在一些实施方案中，细胞黏连的细胞占总细胞的至少为5％。在一些实施方案中，细胞黏连形成的效率为约60％，或在前述值中的任何两个所定义的范围内的值。
本发明第四方面公开了一种利用上述方法获得的筛选平台筛选表达特定表面标记的细胞的方法，即通过将表达特定表面标记蛋白的细胞和表达待测蛋白的细胞，通过上述方法进行共孵育，进而筛选得到与表面标记互作的蛋白，所述细胞选自B细胞，CD4 T细胞，CD8T细胞，γ-δT细胞，NKT细胞，癌细胞以及人工构建的CART细胞和表达TCR的细胞，还包括表达CD19、CD20、PD1、PDL1、CD3、CD40、CD28、CD86以及表达特定抗原的细胞。
本发明利用细胞转染或细胞感染方式使细胞携带上某一个膜蛋白或某一群膜蛋白库，并将细胞培养后，利用流式细胞术或其他技术手段将发生细胞粘连的细胞团分选出来，并依赖高通量测序技术获得发生粘连的细胞团所携带的膜蛋白信息，从而用于筛选与某一靶蛋白发生相互作用的蛋白，大大提高了筛选效率且特异性强。
上述发明内容涉及名词解释如下：
膜蛋白：本发明使用的膜蛋白是指细胞膜上的蛋白组分，包括但不限于膜表面蛋白和跨膜蛋白。膜蛋白可以是细胞系自身表达的也可以是通过工程化过表达的。
靶细胞：本发明使用的靶细胞是指能够被表达某已知蛋白的细胞识别的任何细胞。靶细胞包括但不局限于永生化细胞系，也可以是原代细胞、肿瘤来源的细胞等，其中永生化细胞包括但不限于K562细胞、Raji细胞和按上文描述的工程化的细胞系。在鉴定TCR表位的实例中，靶细胞可以是表达抗原和能够呈递抗原的MHC分子的任何细胞。
共培养：本发明使用的“共培养”是指两种或两种以上的细胞，按照合适的比例在特定的缓冲液中37℃孵育一段时间使得细胞可以互相接触、识别并发生特异性相互作用。共培养包括将细胞在足以发生细胞粘连的条件下一起培养。细胞培养容器包括但不限于1.5ml EP管、96孔U底板。
合适的比例：本发明使用的合适的比例是指经过预实验鉴定，配对的细胞间发生双阳性比例最高时细胞的比例。
本发明的有益效果包括：
1、本发明公开了公开一种细胞膜蛋白相互作用筛选平台。能够快速高效的对在细胞膜上表达的蛋白进行互作蛋白的筛选，大大提高了筛选效率。
2、本发明公开了一种双向筛选互作蛋白的方法，利用本发明第一方面公开的筛选平台，能够简便快捷确定相互作用的两种蛋白，为探究细胞相互作用提高了高效工具。
附图说明
为了更清楚的说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见的下面描述中的附图，仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的技术方案以及相应的附图。
图1细胞粘连流程示意图。
图2细胞粘连方法验证CD40L和CD40蛋白间的相互作用。
图3细胞粘连方法验证CD28和CD80/86蛋白间的相互作用。
图4细胞粘连方法对TCR的特异性抗原进行鉴定。
图5细胞粘连方法对CAR的特异性抗原进行鉴定。
图6细胞粘连方法对病毒蛋白及其受体进行鉴定。
图7细胞粘连方法对呈递特定TCR靶抗原的细胞进行分离。
图8细胞粘连方法对表达靶蛋白的细胞进行特异性分离。
图9细胞粘连方法从SCT文库中筛选出TCR的特异性抗原。
具体实施方式
实施例1：细胞膜蛋白互作筛选系统制备方法
1、质粒构建
将编码CD40、CD40L、CD28、CD80、CD86、CD8等蛋白的基因和携带人或鼠的TCR恒定区的F5 TCR、1G4 TCR、Neo TCR的基因分别搭载在MSGV逆转录病毒载体上。将编码抗原肽-MHC单链三聚体(SCT)和eGFP的基因构建在pCCLc慢病毒载体上，其中SCT是由GS接头连接的抗原肽(NYESO、MART1)、β-微球蛋白和HLA-A2结构域三部分组合而成，并在GS接头和HLA-A2上构建二硫键修饰。
2、细胞系构建
通过使用PEI转染试剂在293T细胞中转染如上所述的逆转录病毒质粒及其包装质粒(pRD114和pHIT60)或如上所述的慢病毒质粒及其包装质粒(psPAX2和pMD2.G)。转染48小时后，通过0.45μm滤嘴过滤并收集病毒以用于感染。在收集的病毒上清液中加入10μg/mLpolybrene后，在2500rpm和37℃条件下离心90min以感染Jurkat、K562或293T细胞。感染48小时后，通过流式细胞仪来分选TCR+CD8+Jurkat细胞、eGFP+K562细胞、CD40+293T细胞、CD40L+293T细胞、CD28+Jurkat细胞、CD80+K562细胞和CD86+K562细胞，从而得到稳定表达特定蛋白的细胞系。
3、活细胞示踪染料标记
将TCR-Jurkat、CD28-Jurkat和CD40L-293T细胞以2M个/mL重悬于PBS溶液中，加入Violet活细胞示踪染料后在37℃孵育30min。SCT-K562、CD80/86-K562和CD40-293T细胞以2M个/mL重悬于PBS溶液后，加入CMFDA活细胞示踪染料在37℃孵育30min。孵育后的细胞用含2％FBS的PBS溶液洗两遍以洗净残留在溶液中的染料后用于共培养实验。
4、共培养和流式检测
将已标记活细胞示踪染料的细胞以Jurkat：K562＝5：1的细胞比例(总量0.25M个细胞)加在1.5mL EP管中(对于CD40L-CD40组，293T-CD40L：293T-CD40＝5：1)，混合均匀后在37℃共培养30min。共培养结束后用500ul固定液将细胞混合物固定。通过流式细胞仪对固定的细胞进行分析，Violet+CMFDA+细胞为因相互作用而发生细胞粘连的配对细胞。
5、文库构建
本专利所用的HLA-A2-SCT cDNA文库包括约12000种A2抗原表位，新抗原SCT cDNA文库包括约3000种新抗原表位。将编码以上抗原文库的DNA插入pCCLc慢病毒载体中，使其与eGFP共表达。用PEI转染试剂将携带编码以上抗原文库的质粒与其包装质粒在293T细胞中进行转染，转染48小时后收集病毒，感染K562细胞，48小时后检测eGFP+表达，达到80％以上即可用于后续共培养实验。
6、与A2/Neo library的共培养及细胞分选
在F5-Jurkat或1G4-Jurkat细胞与A2-SCT-K562文库细胞的共孵育实验和Neo-Jurkat细胞与Neo-SCT-K562文库细胞的共孵育实验中，将2M Jurkat细胞与2M K562细胞混合，37℃条件下共培养30min，固定后用流式细胞仪进行分选，分选得到Violet+CMFDA+细胞。
7、PCR扩增和测序
使用DNA提取试剂盒提取分选得到的细胞的基因组DNA并且用作模板。加入引物TruSeq-Univ-SCTfixed-F，引物TruSeq-Read2-SCTfixed-R和引物index(引物index是一段DNA短片段，可用来对DNA序列进行标记)进行PCR扩增，不同样本分别用不同的index引物标记到DNA序列尾部，引物序列如表1所示：
表1引物序列
Figure BDA0003143664350000161
Figure BDA0003143664350000171
用PCR纯化试剂盒对第一步PCR产物进行纯化，纯化后的产物作为模板，再用引物TruSeq-Univ-SCTfixed-F和相应的引物index进行第二次PCR。通过琼脂糖凝胶电泳跑胶后将目的片段进行切割并回收，收集样本并进行二代测序。
实施例2：细胞粘连筛选方法验证CD40L和CD40蛋白间的相互作用
首先建立稳定表达CD40和CD40L蛋白的细胞系。将编码CD40和CD40L蛋白构建在MSGV逆转录病毒载体上，用PEI转染试剂在293T上转染48小时并收集病毒。分别感染293T细胞48小时后通过流式细胞仪分选得到高表达CD40和CD40L的细胞。
然后将CD40L-293T细胞用Violet活细胞示踪染料，CD40-293T细胞用CMFDA活细胞示踪染料进行标记后，以5：1的细胞比例在37℃条件下共培养30min，用固定液将其固定。最后通过共聚焦显微镜和流式细胞仪观察分析Violet和CMFDA双阳性细胞群的形成。
CD40L-293T细胞(Violet+)和CD40-293T细胞(CMFDA+)以上述条件共培养后，在共聚焦显微镜下可观察到粘连的细胞对，叠加荧光后可发现粘连的两个细胞分别表达Violet和CMFDA，而不表达CD40L的细胞与CD40-293T细胞共培养后，细胞总体呈现独立分散的状态(图2a)，证明了共聚焦显微镜下观察到的粘连的细胞对是由于CD40L与CD40的相互识别而导致的。通过流式细胞仪对固定的细胞共培养物进一步分析，配对组中表达双荧光的细胞占总细胞量的8.19％(图2b)，在CD40-293T细胞(CMFDA+)群中，有近60％的细胞同时有Violet荧光表达(图2c)，通过以上结果证明细胞粘连可以鉴定CD40-CD40L蛋白之间的相互作用。
实施例3：细胞粘连方法验证CD28和CD80/86蛋白间的相互作用
将编码CD28、CD80、CD86蛋白构建在pCCLc慢病毒载体上，用PEI转染试剂在293T上转染48小时并收集病毒。CD28感染Jurkat细胞，CD80和CD86分别感染K562细胞，48小时后通过流式细胞仪分选得到高表达CD28、CD80及CD86的细胞。CD28-Jurkat细胞用Violet活细胞示踪染料，CD80-K562和CD86-K562细胞用CMFDA活细胞示踪染料进行标记后，以Jurkat：K562＝1：5的细胞比例在37℃条件下共培养30min，用固定液将其固定。通过流式细胞仪分析Violet和CMFDA双阳性细胞群的形成。
CD28-Jurkat细胞(Violet+)分别和CD80-K562、CD86-K562细胞(CMFDA+)按以上述条件共培养后，通过流式细胞仪对固定的细胞共培养物进一步分析，配对组中表达双荧光的细胞约占总细胞量的15％(图3a)，在CD28-Jurkat(Violet+)群中，有近70％的细胞同时有CMFDA荧光表达(图3b)，通过以上结果证明细胞粘连可以鉴定CD28-CD80和CD28-CD86蛋白之间的相互作用。
实施例4：细胞粘连方法用于鉴定TCR的特异性抗原
将编码F5 TCR、1G4 TCR和huCD8的基因构建在MSGV逆转录病毒载体上，用PEI转染试剂在293T上转染48小时并收集病毒。F5 TCR+huCD8和1G4TCR+huCD8分别组合感染Jurkat细胞48小时后通过流式细胞仪分选得到同时高表达TCR和CD8的细胞。将编码NYESO-SCT和MART1-SCT的基因构建在pCCLc慢病毒载体上，用PEI转染试剂在293T上转染48小时并收集病毒。分别感染K562细胞48小时后通过流式细胞仪分选得到同时高表达GFP的细胞。过表达TCR的Jurkat细胞用Violet活细胞示踪染料，过表达SCT的K562细胞用CMFDA活细胞示踪染料进行标记后，以5：1的细胞比例在37℃条件下共培养30min，用固定液将其固定。通过流式细胞仪观察分析Violet和CMFDA双阳性细胞群的形成。
过表达TCR和SCT的细胞以上述条件共培养后，通过流式细胞仪对固定的细胞共培养物进一步分析，配对组中表达双荧光的细胞占总细胞量的8％-9％(图4a，c)，在SCT细胞(CMFDA+)群中，有近40％的细胞同时有Violet荧光表达(图4b，d)，通过以上结果证明细胞粘连可以用于鉴定TCR及其靶抗原之间的相互作用。
实施例5：细胞粘连方法用于鉴定CAR的特异性抗原
将编码CD19 CAR或EGFR CAR并融合NGFR的基因构建在MSGV逆转录病毒载体上，用PEI转染试剂在293T上转染48小时并收集病毒。CAR感染Jurkat细胞，48小时后通过流式细胞仪分选得到高表达NGFR的细胞。CAR-Jurkat细胞用Violet活细胞示踪染料，Raji细胞(自身高表达CD19)用CMFDA活细胞示踪染料进行标记后，以Jurkat：Raji＝1：20的细胞比例在37℃条件下共培养30min，用固定液将其固定。通过流式细胞仪分析Violet和CMFDA双阳性细胞群的形成。
CAR-Jurkat细胞(Violet+)和Raji细胞(CMFDA+)按以上述条件共培养后，通过流式细胞仪对固定的细胞共培养物进一步分析，配对组中表达双荧光的细胞约占总细胞量的6.3％(图5a)，在CD19 CAR细胞群中，有近60％的细胞同时有CMFDA荧光表达(图5b)，通过以上结果证明细胞粘连可以用来鉴定CD19 CAR及其靶抗原CD19之间的相互作用。
实施例6：细胞粘连方法对病毒蛋白及其受体进行鉴定。
将编码新冠病毒spike蛋白和其受体ACE2的基因构建在pcDNA载体上，用PEI转染试剂在293T上瞬转24小时。293T及spike-293T细胞用CMFDA活细胞示踪染料，ACE2-293T细胞用Violet活细胞示踪染料进行标记后，以1：5的细胞比例在37℃条件下共培养30min，用固定液将其固定。通过流式细胞仪分析Violet和CMFDA双阳性细胞群的形成。
通过流式细胞仪对固定的细胞共培养物进一步分析，配对组中表达双荧光的细胞约占总细胞量的3.5％(图6a)，在表达ACE2的细胞群中，有近18.5％的细胞同时有CMFDA荧光表达(图6b)，通过以上结果证明细胞粘连可以用来鉴定病毒蛋白及其受体之间的相互作用。
实施例7：细胞粘连方法分离TCR的特异性靶细胞
为了确定细胞黏连的灵敏度，将过表达MART1的K562细胞以1：3000，1：5000，1：10000的比例分别稀释到K562中，过表达MART1的K562细胞先用CMFDA活细胞示踪染料进行标记后再与K562混合，混合后的细胞一起标记Far red活细胞示踪染料，将混合的细胞(Farred+，2M)与F5-Jurkat细胞(Violet+，2M)(F5 TCR与MART1可特异性识别)按照1：1的比例混合均匀，37℃共培养30min后用固定液固定。经流式细胞仪分析在K562-MART1细胞中，发生粘连的细胞在其中的比例可达到40％左右(参见图7)；而在K562细胞中，发生粘连现象的细胞比例不足5％。证明SCT-K562细胞被稀释后也能被与之特异性识别的TCR发生特异性粘连，粘连方法的灵敏度很高。
实施例8：细胞粘连方法对表达靶蛋白的细胞进行特异性分离
为了确定细胞黏连的灵敏度，将过表达CD80或CD86的K562细胞以1：1000，1：5000，1：10000的比例分别稀释到K562中，过表达CD80或CD86的K562细胞先用CMFDA活细胞示踪染料进行标记后再与K562混合，混合后的细胞一起标记Far red活细胞示踪染料，将混合的细胞(Far red+，2M)与CD28-Jurkat细胞(Violet+，2M)按照1：1的比例混合均匀，37℃共培养30min后用固定液固定。经流式细胞仪分析，在K562-CD80或K562-CD86细胞中，发生粘连的细胞在其中的比例可达到60％左右(参见图8)；而在K562细胞中，发生粘连现象的细胞比例不足3％。证明CD80或CD86-K562细胞被稀释后也能被与之特异性识别的CD28-Jurkat发生特异性粘连，粘连方法的灵敏度很高。
实施例9：细胞粘连方法从SCT文库中筛选TCR的靶细胞
为了进一步检测粘连方法能否运用到配体文库筛选，构建了A2限制性SCT cDNA文库，该文库包含来自免疫表位数据库(IEDB)的12055种公共抗原肽序列，肽的长度为8-12个氨基酸，其中包括可与F5 TCR特异性识别的MART1抗原肽。将该文库转导在K562细胞上，并将构建的A2 library-K562细胞(CMFDA+)按照1：1(2M：2M)的比例，与F5-Jurkat细胞(Violet+)37℃共培养30min。通过流式细胞仪来分选同时CMFDA+和Violet+的细胞(参见图9)。对分选出的细胞提取DNA，以该DNA作为模板，进行扩增和用index引物标记后，分析二代测序结果，检测筛选出的肽段是否是与F5 TCR配对的SCT。从图9中可以看出，本筛选平台对特异性识别的抗原肽具有较高的筛选能力。
实施例10：利用细胞粘连方法评估双特异性抗体的效价
用不同的荧光示踪剂分别对细胞膜上表达某特定蛋白(如CD3)的细胞和表达另一蛋白(如CD19)的细胞进行标记后，将两种细胞以一定的比例在分别定量加入了不同种双特异性抗体的体系中进行共培养，用固定液固定后FACS检测表达双荧光的粘连细胞群的比例。经筛选，能够筛选得到粘连的不同细胞，所述发光细胞通过双特异性抗体粘连在一起，通过细胞粘连比例的高低即可对双特异性抗体的效价进行评估。
实施例11：利用细胞粘连方法从膜蛋白文库中筛选相互作用的蛋白
用不同的荧光示踪剂分别标记转导了膜蛋白cDNA文库的细胞，按一定细胞比例将不同标记的两种细胞进行共培养后用固定液固定，通过流式分选将每一对黏连的双荧光细胞单独地分到96孔板中，分别提取DNA并PCR后，进行测序，获取互作蛋白双方的序列信息。大大缩短了筛选互作蛋白的时间，提高了工作效率和揭示了不同互作蛋白的作用机理。
应当理解的是，上述实施例仅是用来验证本发明的可行性，而不应作为对本发明的限制，根据本发明说明书中记载的内容，本领域技术人员可以在不付出创造性劳动的前提下，对实施例中细胞表面标记类型进行常规替换并用来实施本发明的技术方案。

Claims (10)

1.一种筛选和鉴定细胞膜表面的蛋白质之间相互作用的平台，其特征在于：利用表达在细胞膜表面的蛋白质之间发生相互作用时产生的细胞粘连体来鉴定相互作用的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的筛选平台，其特征在于：该平台包含两种不同的活细胞，一种为表达目的蛋白的细胞，另一种为表达待测蛋白的细胞。
3.根据前述任一权利要求所述的筛选平台，其特征在于：所述目的蛋白和/或所述待测蛋白是任一可锚定在细胞膜上的天然蛋白或人工改造蛋白以及蛋白体，并通过任意方式使其荷载于细胞中并定位于细胞表面。
4.根据前述任一权利要求所述的筛选平台，其特征在于：所述筛选平台中作为表达宿主的细胞包括但不限于Jurkat、K562、293T或其他真核表达细胞系。
5.根据前述任一权利要求所述的筛选平台，其特征在于：所述两种细胞需要分别带有至少一种不同的筛选标签。
6.前述任一权利要求所述筛选平台中细胞所携带的筛选标签，其特征在于，包括但不限于：荧光蛋白、活细胞示踪剂、生物素标记物。
7.前述任一权利要求所述筛选平台的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将目标蛋白序列构建在质粒载体上；
(2)蛋白表达：通过转染将目的蛋白编码基因包装成病毒，通过感染的方式使之表达在特定的细胞上，得到稳定表达所述蛋白的细胞系；或者直接使用脂质体包封技术或者直接电转或化转方式将编码目的蛋白的基因转入特定细胞系；
(3)荧光标记：利用活细胞示踪染料标记、抗体标记和/或融合表达荧光蛋白使细胞带有特定荧光。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)获得的质粒载体中包含编码蛋白的基因和引导膜定位的信号肽序列。
9.一种利用权利要求1-6任一所述筛选平台或权利要求7-8任一所述构建方法获得的表达不同蛋白的细胞筛选鉴定与已知目的膜蛋白互作的膜蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤，
(1)共培养：将表达不同蛋白的细胞按照适当的比例进行混合，在一定条件下进行孵育，孵育后将细胞固定使发生相互作用的细胞保持在黏连状态；
(2)流式分析及分选：用细胞流式仪，分析同时带两种荧光的细胞，可通过分选将其收集；
(3)测序分析：通过聚合酶链式反应(PCR)技术对筛选到的细胞DNA进行扩增，再进行第二代测序，得到与已知膜蛋白发生特异性黏连的膜蛋白序列。
10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)将表达待测膜蛋白的细胞与其他细胞按照特定比例混合，所述比例为1:1-1:10000。
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