CN115873787A - 一种高效转染细胞株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞株筛选技术领域，公开了一种高效转染细胞株及其制备方法和应用。本发明的高效转染细胞株由荧光质粒转染和流式细胞仪分选循环交替进行筛选而得。本发明的制备方法所得的高效转染细胞株对质粒容忍性好，易于被转染，外源基因表达效率高。适用于高表达需求和病毒包装。

Description

一种高效转染细胞株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞株筛选技术领域，具体涉及一种高效转染细胞株及其制备方法和应用。

背景技术

转染指在一定条件下，将外源DNA导入真核细胞的过程。常规的转染方法有磷酸钙转染、脂质体转染及电转染等。磷酸钙转染法是指形成一种DNA-磷酸钙沉淀物，使其粘附于细胞表面，通过细胞的内吞作用而使DNA被细胞捕获。脂质体转染法是指阳离子脂质体表面带正电荷，能与DNA的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂复合体，被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合作用，DNA传递进入细胞。电转染法是通过电场作用于细胞之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入细胞核的技术。转染的应用领域包括研究基因功能、调控基因表达、突变分析、病毒包装和蛋白质生产等生物学试验，是细胞生物学研究中的常规工具。

HEK293细胞来源于人胚胎肾细胞(Human Embryonic Kidney，HEK)。在人胚胎肾细胞第19号染色体上整合入4.35kb的腺病毒基因组片段后，导致HEK293的出现。HEK293细胞已广泛应用于多个领域，成为生产蛋白质、疫苗、抗癌药物和重组腺病毒载体的强大载体和新平台。其优点包括：在使用最常见的转染试剂时HEK293细胞表现出了高于其他细胞的转染效率；HEK293细胞是用于制药生产的大规模悬浮培养的理想宿主细胞；HEK293细胞拥有人类所有的翻译后修饰，它们能够产生与人类自然合成的蛋白质最相似的蛋白质；HEK293细胞生长速度快，在摇瓶中细胞密度高，代谢高效灵活，是生物治疗生产的可行工具；同时HEK293细胞是一种敏感的人类胚胎细胞，具有与早期分化神经元相似的特征，在体外对环境因素敏感，常作为新药发现和毒性试验的模型。HEK293具有一些特性例如复杂的表型，不稳定的核型和肿瘤原性。在此基础上，人们又进行了许多改造，产生了许多衍生细胞系：293E细胞表达EBNA-1,EBNA-1能够促进游离DNA的核转移和增强子活性，从而促进蛋白质生产；293-6E细胞是一个新的293E细胞系，表达截断型的EBNA-1，可以在不含血清的条件下进行蛋白或病毒载体生产；293F细胞是一种在无血清培养基中生长迅速、蛋白表达量高的293细胞株，可根据细胞密度、培养基类型和转染试剂做DOE条件摸索出合适的转染条件；293F细胞经质粒pCMVSPORT6TAg的作用，获得293FT细胞，用于生产慢病毒载体，但需要配套的培养基和转染试剂；293S细胞适合在低钙离子浓度培养基中悬浮生长，同样需要特殊的培养基；293T细胞表达SV40T基因，许多真核表达载体含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T蛋白的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。

在实际的HEK 293转染实验中，高效的转染和表达效率跟转染试剂有关，也跟细胞本身的性质有关，而细胞本体却是错综复杂的，改造的方向可包括代谢、容忍性、增长率、免疫抵抗等。然而，目前通常使用的方法是测试更加配套的细胞培养基和转染试剂，该方法投入的研发成本较大，且研发出来后使用的成本也较高。虽然市面上的HEK293相关细胞的转染效率已经达到约80％，但是基于HEK 293的广泛应用，如何进一步有效地、低成本地提高转染和表达效率仍是行业内难点之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种高效转染细胞株及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种高效转染细胞株，由荧光质粒转染和流式细胞仪分选循环交替进行筛选而得。

优选的，所述荧光质粒携带表达红色或绿色荧光的表达框。

本发明高效转染细胞株通过多次交替瞬转的方式而得，对质粒容忍性好，易于被转染，外源基因表达效率高，细胞转染效率比野生细胞高约2倍。当使用正常的用量进行病毒包装时，细胞平均滴度可达2.365E+11GC/mL，当将质粒和转染试剂用量减半，细胞平均滴度几乎没有变化。

作为本发明所述的高效转染细胞株的优选实施方式，所述交替进行筛选至少5～6轮；优选的，所述交替进行筛选共5～6轮。

第二方面，本发明提供一种高效转染细胞株的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制转染混合物，所述转染混合物包括转染试剂和荧光质粒A；

(2)将所述转染混合物加入所述待转染细胞；

(3)重悬细胞，经流式细胞筛过滤；稀释细胞密度至10⁵～10⁷cells/mL，进行流式分选，将荧光强度最强的前5％～10％的细胞分选出来；

(4)继续培养至细胞的荧光丢失，得转染细胞A；

(5)重复步骤(1)和(2)将荧光质粒B转入所述转染细胞，重复步骤(3)和(4)，得转染细胞B；

(6)按照步骤(1)～(5)进行质粒转染和流式分选循环交替共进行5～6轮，即成。

作为本发明所述的高效转染细胞株的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述转染试剂为氯化钙和磷酸盐缓冲液。

优选的，所述转染试剂为行业内常用转染试剂，包括但不限于磷酸钙、PEI、脂质体等；

优选的，所述细胞为293T细胞，所述普板的细胞数为4×10⁶～5×10⁶cells。

作为本发明所述的高效转染细胞株的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)和(5)中，所述荧光质粒A和荧光质粒B分别携带表达红色或绿色荧光的表达框。

优选的，在步骤(1)中，所述转染混合物为氯化钙、pUC19、pRP[Exp]-CMV>EGFP、磷酸盐缓冲液；按体积质量比计，所述氯化钙：pUC19：pRP[Exp]-CMV>EGFP：磷酸盐缓冲液＝1～2mL：4～5μg：0.5～1.5μg：1～2mL。

进一步的，所述氯化钙：pUC19：pRP[Exp]-CMV>EGFP：磷酸盐缓冲液＝1.5mL：6μg：1μg：1.5mL。

优选的，在步骤(5)中，所述荧光质粒B为pRP[Exp]-CMV>mCherry。

作为本发明所述的高效转染细胞株的制备方法的优选实施方式，在步骤(4)中，所述继续培养的时间为10～15天。

第三方面，本发明将所述的制备方法、所述的高效转染细胞株在质粒转染和/或病毒包装中应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明基于最普通的转染试剂，通过多次交替瞬转的方式，筛选出对质粒容忍性好，易于被转染，外源基因表达效率高的细胞株，方法简单，成本低。利用发明的方法针对293T细胞进行筛选，成功筛选出了转染和表达效率均有效提高的Ultra-293T细胞株，适用于高表达需求和病毒包装。通过本发明的方法，也可有效地筛选其他细胞类型的高效转染细胞株。

附图说明

图1为不同分选轮次筛选的细胞转染后的荧光电镜图；

图2为不同分选轮次筛选的细胞转染后的流式细胞仪检测结果图；

图3为不同分选轮次筛选的细胞转染后的绿色荧光阳性细胞的荧光强度(复孔平均值)；

图4为不同启动子的质粒转染48h的荧光流式检测结果；

图4中，A为三种细胞转染质粒pRP[Exp]-CMV>EGFP后的检测结果统计；B为三种细胞转染质粒pRP[Exp]-EF1A>EGFP后的检测结果统计；C为三种细胞转染质粒pRP[Exp]-CAG>EGFP后的检测结果统计；

图5为AAV滴度检测统计图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：高效转染细胞株的筛选

筛选方法的具体步骤如下：

(1)在10cm皿中常规铺板293T细胞，细胞数约4.5×10⁶cells；

(2)第二天在转染前更换新鲜DMEM高糖培养基；

(3)配制转染混合物，按氯化钙、质粒、磷酸盐缓冲液的顺序进行添加配制(最后磷酸盐缓冲液的加入要边振荡边逐滴加入或加入后迅速吹打混匀)；

转染混合物：氯化钙1.5mL，pUC19 6μg+pRP[Exp]-CMV>EGFP 1μg，磷酸盐缓冲液1.5mL；

(4)混匀后静置10min，逐滴加入培养皿中；

(5)转染5h后更换新鲜DMEM高糖培养基；

(6)培养48h后去除上清，每个皿加入适量PBS润洗后去除上清，再加入4mL胰酶适度消化后，加入4mL完全DMEM高糖培养基终止消化，将细胞悬液进行900rpm离心5min，去上清；以1mLPBS重悬细胞，经流式细胞筛过滤；再加入适量PBS将细胞密度稀释至10⁶cells/mL，进行流式分选；

(7)通过流式分选将绿色荧光强度最强的前5％～10％的细胞分选出来；

(8)细胞继续培养10～15天左右，瞬转质粒随着细胞分裂，分选出的细胞的绿色荧光基本丢失；

(9)将获得的细胞进行第二个质粒pRP[Exp]-CMV>mCherry的转染，此时质粒携带表达红色荧光的表达框；

(10)通过流式分选将红色荧光强度最强的前5％～10％的细胞分选出来；

(11)细胞继续培养10～15天左右，分选出的细胞的红色荧光基本丢失；

(12)将获得的细胞进行第二轮绿红荧光载体交替转染，每轮均筛选出荧光强度5％～10％的细胞；

(13)按照步骤(4)～(12)转染及流式分选循环交替共进行5～6轮，最终获得转染能力明显增强的293T细胞株。

试验例1：分选轮次对转染效率的影响

(1)采用实施例1的筛选方法，按照步骤(4)～(12)转染及流式分选循环交替分别进行1轮、2轮、3轮、4轮、5轮、6轮，分别获得筛选的细胞株。

(2)第二天在转染前更换新鲜DMEM高糖培养基；

(3)按照表1配制转染混合物，按氯化钙、质粒、HBS的顺序进行添加配制；

表1转染混合物

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(4)混匀后静置10min，逐滴加入培养皿中；

(5)转染5h后更换新鲜DMEM高糖培养基；

(6)培养48h后流式细胞仪(白光10ms，绿光100ms)检测各组细胞的荧光表达情况。

各组荧光电镜图如图1和图2所示，流式细胞仪检测结果如表2和图3所示。绿色荧光阳性细胞的荧光强度(复孔平均值)如图4所示。

表2流式细胞仪检测结果

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以上结果可知，交替轮次6次所得到的细胞株转染后的荧光值强于其他组，转染效率最高。

实施例2：高效转染细胞株的筛选

筛选方法的具体步骤如下：

(1)在10cm皿中常规铺板293T细胞，细胞数约4.5×10⁶cells；

(2)第二天在转染前更换新鲜DMEM高糖培养基；

(3)配制转染混合物，按氯化钙、质粒、磷酸盐缓冲液的顺序进行添加配制(最后磷酸盐缓冲液的加入要边振荡边逐滴加入或加入后迅速吹打混匀)；

转染混合物：氯化钙1.5mL，pUC19 6μg+pRP[Exp]-CMV>EGFP 1μg，磷酸盐缓冲液1.5mL；

(4)混匀后静置10min，逐滴加入培养皿中；

(5)转染5h后更换新鲜DMEM高糖培养基；

(6)培养48h后去除上清，每个皿加入适量PBS润洗后去除上清，再加入4mL胰酶适度消化后，加入4mL完全DMEM高糖培养基终止消化，将细胞悬液进行900rpm离心5min，去上清；以1mL PBS重悬细胞，经流式细胞筛过滤；再加入适量PBS将细胞密度稀释至10⁶cells/mL，进行流式分选；

(7)通过流式分选将绿色荧光强度最强的前5％的细胞分选出来；

(8)细胞继续培养10天，瞬转质粒随着细胞分裂，分选出的细胞的绿色荧光基本丢失；

(9)将获得的细胞进行第二个质粒pRP[Exp]-CMV>mCherry的转染，此时质粒携带表达红色荧光的表达框；

(10)通过流式分选将红色荧光强度最强的前5％的细胞分选出来；

(11)细胞继续培养10天，分选出的细胞的红色荧光基本丢失；

(12)将获得的细胞进行第二轮绿红荧光载体交替转染，每轮均筛选出荧光强度5％的细胞；

(13)按照步骤(4)～(12)转染及流式分选循环交替共进行6轮，进一步地可通过流式分选去除少量残留的红绿荧光的细胞，最终获得转染能力明显增强的293T细胞株，记为Ultra-293 T细胞。

对比例1：转染细胞株的筛选

筛选方法的具体步骤如下：

(1)在10cm皿中常规铺板293T细胞，细胞数约4.5×10⁶cells；

(2)第二天在转染前更换新鲜DMEM高糖培养基；

(3)配制转染混合物，按氯化钙、质粒、磷酸盐缓冲液的顺序进行添加配制(最后磷酸盐缓冲液的加入要边振荡边逐滴加入或加入后迅速吹打混匀)；

转染混合物：氯化钙1.5mL，pUC19 7μg，磷酸盐缓冲液1.5mL；

(4)混匀后静置10min，逐滴加入培养皿中；

(5)转染5h后更换新鲜DMEM高糖培养基；

(6)细胞继续培养10～15天左右，瞬转质粒随着细胞分裂基本丢失；

(7)将获得的细胞进行第二轮次质粒pUC19的转染；

(8)细胞继续培养10～15天左右，瞬转质粒随着细胞分裂基本丢失；

(9)按照步骤(4)～(8)转染培养进行6轮，获得pUC-293T细胞。

试验例2：含有不同启动子的表达载体的转染效率

(1)按表3于6孔板中铺板细胞，使其第二天达到80％融合度。铺板细胞为实施例2制备的Ultra-293T细胞、对比例1制备的pUC-293T、293-P26细胞(未经处理的野生型293T)，pUC19作为阴性对照载体；

(2)第二天，使用3种不同的启动子介导绿色荧光表达的载体按表3制备转染混合物，进行转染，每个细胞组进行2个重复；

表3细胞和转染混合物

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(3)转染5h后更换新鲜DMEM高糖培养基；

(4)48h后流式检测各组细胞的荧光表达情况。

检测结果如图4所示，使用实施例2制备的Ultra-293T细胞转染后的荧光强度强于使用野生型293T转染的荧光强度，无论转染哪种启动子的荧光质粒，经Ultra-293T细胞的细胞转染效率高于对比例1制备的pUC-293T和293-P26细胞的约2倍。

试验例3：细胞的包装效率

(1)于10cm皿中铺板细胞，使其第二天达到80％融合度。铺板细胞为实施例2制备的Ultra-293T细胞、293-P16细胞(未经处理的野生型293T)；

(2)第二天，按表4进行转染，比较不同细胞的腺相关AAV2病毒包装效率比较，其中组1～4为正常用量包装，组5～8为物料减半包装，每个细胞组进行两个重复；

表4细胞和转染混合物

(3)48h后收毒，并使用相同的体积定容，最后使用qPCR检测病毒滴度；

当使用正常的用量进行病毒包装时，实施例2制备的Ultra-293T细胞平均滴度可达2.365E+11GC/mL，而使用野生型293T进行包装获得病毒滴度1.83E+11GC/mL；当将质粒和转染试剂用量减半，实施例2制备的Ultra-293T细胞平均滴度可达2.355E+11GC/mL，即产量几乎没有变化，但使用野生型293T进行包装获得的平均病毒滴度只有1.505E+11GC/mL，即相同的减半质粒用量下，实施例2制备的Ultra-293T细胞进行的AAV病毒包装可提高约1.5倍。平均滴度检测趋势如图5所示。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种高效转染细胞株，其特征在于，由荧光质粒转染和流式细胞仪分选循环交替进行筛选而得。

2.根据权利要求1所述的高效转染细胞株，其特征在于，所述交替进行筛选至少5～6轮。

3.一种权利要求1或2所述高效转染细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制转染混合物，所述转染混合物包括转染试剂和待转染质粒A；

(2)将所述转染混合物加入待转染细胞；

(3)重悬细胞，经流式细胞筛过滤；稀释细胞密度至10⁵～10⁷cells/mL，进行流式分选，将荧光强度最强的前5％～10％的细胞分选出来；

(4)继续培养至细胞的荧光丢失，得转染细胞A；

(5)重复步骤(1)和(2)将荧光质粒B转入所述转染细胞，重复步骤(3)和(4)，得转染细胞B；

(6)按照步骤(1)～(5)进行质粒转染和流式分选循环交替共进行5～6轮，即成。

4.根据权利要求2所述的高效转染细胞株的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述细胞为293T细胞。

5.根据权利要求2所述的高效转染细胞株的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述转染试剂为氯化钙和磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求2所述的高效转染细胞株的制备方法，其特征在于，在步骤(1)和(5)中，所述荧光质粒A和荧光质粒B分别携带不同的荧光表达框。

7.根据权利要求6所述的高效转染细胞株的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述转染混合物为氯化钙、pUC19、pRP[Exp]-CMV>EGFP、磷酸盐缓冲液；按体积质量比计，所述氯化钙：pUC19：pRP[Exp]-CMV>EGFP：磷酸盐缓冲液＝1～2mL：4～5μg：0.5～1.5μg：1～2mL。

8.根据权利要求6所述的高效转染细胞株的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述荧光质粒B为pRP[Exp]-CMV>mCherry。

9.根据权利要求2所述的高效转染细胞株的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述继续培养的时间为10～15天。

10.权利要求1或2所述的高效转染细胞株、权利要求3～9任一项所述的制备方法、在质粒转染和/或病毒包装中的应用。

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