KR20180125749A - Traf4 결합 모티프를 이용한 혈전증 또는 암 치료제 및 이의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TRAF4 결합 모티프를 이용하여 혈전증 및 암 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 상기 TRAF4 결합 모티프는 2개의 혈소판 수용체인 GPIb-IX-V 복합체 및 GPVI 펩타이드와 직접적인 상호작용을 통하여 혈소판 매개 혈전증을 유도하고, TGF-β 수용체와의 상호작용하여 암 시작 및 진행에 관여하는 것으로 확인됨에 따라, TRAF4의 수용체 결합 특이성, TRAF4 매개 신호과정 및 관련 질병의 추가 이해, 혈전증 및 암 치료를 위한 약물 개발에 새로운 타켓이 될 수 있다.

Description

TRAF4 결합 모티프를 이용한 혈전증 또는 암 치료제 스크리닝 방법{Screening method for thrombosis or cancer treatment using TRAF4 binding motif}

본 발명은 TRAF4 결합 모티프를 이용하여 혈전증 또는 암 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

글리코프로테인(GP) Ib-IX-V 복합체와 GPVI은 2개의 중요한 혈소판 수용체로 손상된 혈관 벽에 초기 혈소판 협착을 유도하여 혈전 형성을 시작하고 이렇게 형성된 혈전은 뇌졸중 또는 심근경색과 같은 혈전증과 관련된다.

GPVI (Glycoprotein VI)은 최초 콜라겐 수용체로 알려져 있으며, GP Ib-IX-V 복합체는 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor) 및 결합인자 XI(coagulation factor XI; FXI), 인자 XII, 트롬빈(thrombin), 및 P-셀렉틴을 포함한 다양한 리간드와 결합한다. 이와 같은 GP Ib-IX-V 복합체의 다양한 리간드의 존재는 상기 수용체 복합체가 다수의 신호 과정을 통하여 혈소판 기능을 결정하는 것을 의미한다.

GPIbα (the major ligand-binding subunit), GPIbβ, GPIX, 및 GPV로 구성되어진 GP Ib-IX-V 복합체는 혈소판에서 두 번째로 많은 수용체로 다른 혈소판 수용체 GPVI와 물리적 및 기능적으로 연결된다.

종양 괴사 인자(TNF) 수용체 관련 인자 4(TRAF4)는 포유류에서 확인된 7개의 TRAF1~TRAF7 인자 중 하나로 생쥐에서 배아 발생, 특히, 중추신경계 및 말초신경계발생의 조절 인자로 확인되었으며, 기관 발달, 신경관 및 골격 형성과도 관련있으며, 많은 유형의 암의 개시 및 진행과 관련있는 것으로 보고되어 짐에 따라, TRAF4가 암치료를 위한 새로운 표적으로 제안될 수 있다.

다른 TRAF 패밀리들과 달리 TRAF4는 핵이행신호(nuclear localization signal; NLS)를 포함하고, TNFR2, CD30 및 CD40와 같은 대표적인 TRAF 결합 수용체와 상호작용하지 않는다. 이는 TRAF4가 전형적인 TRAF 패밀리들에 의해 유도되는 세포내 신호전달에 관여하지 않는 것을 의미한다.

한편, 활성산소종(ROS)의 생성은 혈소판 수용체의 특징 중 하나로, 특히 GPIb-IX-V 복합체 및 GPVI에 의해 매개되는 신호작용은 동맥 손상 부위에서 혈전증을 유도한다.

최근 연구에 따르면, GPIb-IX-V 복합체와 GPVI 신호전달을 통한 혈전증 부위에서 혈소판에 의한 ROS 생성은 TRAF4와 GPIb-IX-V 복합체 및 GPVI 사이에서 직접적인 상호작용을 매개하는 것이 확인됨에 따라, 상기 상호작용의 분열은 지혈작용에 영향을 주지 않으면서 혈전증을 예방할 수 있는 항-혈전증 치료제 개발의 새로운 타겟이 될 수 있다.

한국공개특허 제2015-0121345호(2015.10.29 공개)

본 발명은 TRAF4 TRAF 도메인에 의해 매개되는 GPIbβ 또는 GPVI 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합에 있어서, 상기 TRAF4 TRAF 도메인의 결합 모티프를 확인하고, 이를 이용한 TRAF4와 혈소판 수용체 결합 억제제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 GPIbβ 및 GPVI로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혈소판 수용체 및 TRAF4 단백질을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 GPIbβ 또는 GPVI 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합 감소를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 GPIbβ 혈소판 수용체 펩타이드 및 TRAF4 단백질을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 GPIbβ 혈소판 수용체 펩타이드와 TRAF4 단백질의 복합체 형성 억제를 확인하는 단계를 포함하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 TGF-β 수용체 및 TRAF4 단백질을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 TGF-β 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합 감소를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, TRAF4 결합 모티프는 2개의 혈소판 수용체인 GPIb-IX-V 복합체 및 GPVI와 직접적인 상호작용을 통하여 혈소판 매개 혈전증을 유도하고, TGF-β 수용체와의 상호작용하여 암 시작 및 진행에 관여하는 것으로 확인됨에 따라, TRAF4의 수용체 결합 특이성, TRAF4 매개 신호과정 및 관련 질병의 추가 이해, 혈전증 및 암 치료를 위한 약물 개발에 새로운 타켓이 될 수 있다.

도 1은 두 개의 혈소판 수용체와 TRAF4 간의 상호작용을 확인한 결과로, 도 1a는 TRAF 패밀리의 도메인 범위를 나타낸 것이며, 도 1b는 TRAF-결합 수용체 및 이미 확인된 TRAF-결합 모티프를 나타낸 것이며, 도 1c는 다양한 수용체와 상호작용에 관여하는 TRAF1, 2 및 3의 보존된 아미노산 잔기를 나타낸 것으로, 상기 TRAF1, 2 및 3의 주요 스폿은 TRAF-결합 모티프와의 결합에 사용된다. TRAF4의 아미노산 잔기는 적색으로 표시되었으며, 보존되지 않는다. 도 1d는 이미 보고된 NOD2와 두 개의 혈소판 수용체에 대해 추정된 TRAF4 결합 영역을 나타내며, 도 1e 및 1f는 TRAF4 용액에 GPIbβ(e) 및 GPVI(f) 펩타이드를 적정하여 확인한 ITC 결과이며, 도 1g 및 1h는 고정화된 TRAF4에 결합하는 GPIbβ(g) 및 GPVI(h) 펩타이드의 SPR 특성을 확인한 결과로, 각 펩타이드(6.25 μM-100 μM)를 TRAF4가 결합된 센서 칩에 적용하였으며, 데이터는 독립적으로 수행된 세 번의 실험에서 얻은 결과값의 평균으로 나타낸 결과이다.
도 2는 TRAF4/GPIbβ 복합체의 결정 구조를 확인한 결과로, 도 2a는 RTRAF4/GPIbβ 복합체의 6량체(비대칭 단위의 2 개의 삼량체)의 모식도로, 사슬 A, 사슬 B 및 사슬 C가 하나의 삼량체를 구성하고, 사슬 A, 사슬 B 및 사슬 C가 또 다른 삼량체를 구성하며, 적색 점의 원형으로 표시된 세 위치는 GPIbβ 펩타이드를 나타내고 검은색 점 원형으로 표시된 1 부분에서는 불명확한 펩티드 밀도가 확인된 위치를 나타낸다. 도 2b는 결정의 비대칭 단위에서 확인된 6량체 TRAF4/GPIbβ 복합체의 측면도를 나타낸 것으로, 가장 명확한 펩타이드 모델은 체인 A 위치에 검은 박스로 표시된 부분은 가장 명확한 펩타이드 모델을 나타낸다. 도 2c는 GPIbβ 펩타이드(적색 선)가 결합된 단량체 TRAF4(파랑색)의 표면도로, 사슬 A는 대표적인 단량체 분자로 사용되었다. 도 2d는 회색 그물망으로 나타낸 GPIbβ 펩타이드 주위의 1σ 수준 경계를 나타낸 밀도 지도이며 가상의 어닐링은 생략되었다.
도 3은 상세한 TRAF4-GPIbβ 상호작용 방식 및 TRAF4- 결합 모티프를 확인한 결과로, 도 3a는 TRAF4 TRAF 도메인에 결합된 GPIbβ 펩타이드 경계를 근접 확인한 결과로, 사슬 A에 결합된 GPIbβ 펩타이드를 확인하였으며, GPIbβ 펩티드 상호 작용에 관여하는 TRAF4 잔기를 표시하고, H-결합을 검은 색 점선으로 표시하였으며, GPIbβ 펩타이드의 아미노산 위치를 R(P_-1), L(P₀), R(P₁), A(P₂) 및 R(P₃)로 나타내었으며, * 및 **은 각각 주요 및 소수의 소수성 주머니를 의미한다. 도 3b 및 3c는 중첩을 통하여 수용체-결합된 TRAF4(녹색)와 아포 TRAF4 (황색)를 구조적으로 비교한 결과로, 도 3b의 적색 원은 GPIbβ 펩타이드와의 결합시 구조적으로 움직이는 아미노산 잔기를 나타내며, 검은색 원은 GPIbβ 펩타이드 (c)와의 결합시 무질서한 루프 (β6-β7 연결 루프 : 아미노산 421-432)를 나타낸다. 도 3d는 TRAF4/GPIbβ 펩타이드 복합체의 표면 정전기를 나타낸 것으로, 파란색 원은 GPIbβ 혈소판 수용체의 세포외 도메인을 나타내었으며, TRAF4에 의해 인식된 세포 내에 위치한 GPIbβ 혈소판 수용체의 C-말단 꼬리를 모식화하였으며, N-term 및 C-term은 각각 TRAF4의 N-말단 및 C-말단을 의미한다. 도 3e 및 3f는 중첩실험을 통하여 TRAF4 결합 수용체 펩타이드(회색 : 펩타이드 형태의 사슬 A, 청록색 : 사슬 A의 펩티드, 적색 : 사슬 C의 펩티드)를 구조적으로 비교한 결과로, 도 3e는 펩티드의 전반적인 주사슬 형태는 거의 동일한 것을 확인한 결과이며, 도 3f는 P_-1, P₀ 및 P₂ 위치에서 측쇄 구조 및 주쇄 구조의 구조적으로 보존된 것을 확인한 결과이다. 도 3g는 TRAF4 / GPIbβ 수용체 펩타이드 복합체와 다른 TRAF / 수용체 펩타이드 복합체를 구조적으로 비교한 결과로, TRAF6 / RANK 복합체 및 TRAF4 / GPIbβ 복합체는 중첩 된 TRAF2 / TNFR2 복합체를 포함하는 것을 확인한 결과이다. 도 3h는 TRAF4 / GPIbβ 수용체 펩티드 복합체의 결정학적 패킹을 확인한 결과로, 비대칭 단위로 형성된 2 개의 삼량체 분자는 청색으로 나타내었으며, 다른 회색 분자는 대칭 분자이다. 도 3i는 사슬 B의 5개의 C- 말단 잔기와 대칭 분자 사이의 상호 작용을 나타낸 것이며, 도 3j는 사슬 B(청색) 및 대칭 분자(회색)의 5개의 C- 말단 잔기 사이에 형성된 결합 인터페이스를 확대한 것으로, 사슬 B상의 P_-2, P_-1, P₀ 및 P₁ 위치와 대칭형 분자상의 상호작용 잔기를 나타낸 것이다. 도 3k는 정렬 및 구조적으로 확인된 모티프을 이용한 서열 비교를 통하여 확인된 추정 TRAF4-결합 모티프를 나타낸 결과로, 적색과 청색은 각각 완전하거나 부분적으로 보존된 잔기를 나타낸다. 도 3l은 고정된 TRAF4에 결합하는 것으로 추정되는 TRAF4-결합 모티프를 함유하는 펩타이드의 SPR 특징을 확인한 결과로, 100 μM의 펩타이드를 TRAF4 결합 센서 칩에 적용하고, 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균값으로 나타내었다.

본 발명은 GPIbβ 및 GPVI로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혈소판 수용체 및 TRAF4 단백질을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 GPIbβ 또는 GPVI 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합 감소를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

상기 GPIbβ 또는 GPVI 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합은 TRAF4 TRAF 도메인에 의해 매개되는 것일 수 있으며, 상기 TRAF4 TRAF 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프를 포함하는 것 일 수 있다.

보다 상세하게는 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPIbβ 혈소판 수용체 내 Arg-Leu-Arg-Ala 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPVI 혈소판 수용체 펩타이드 내 Arg-Leu-Arg-His와 결합하는 것 일 수 있다.

본 발명은 GPIbβ 혈소판 수용체 및 TRAF4 단백질을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 GPIbβ 혈소판 수용체 와 TRAF4 단백질의 복합체 형성 억제를 확인하는 단계를 포함하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 GPIbβ 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질의 복합체는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPIbβ 혈소판 수용체의 P_-1 위치의 Arg(R) 및 P₃ 위치의 Arg(R)과 TRAF4의 E406 및 N355 곁사슬이 각각 수소결합을 형성하고, P₀ 위치의 Leu(L)이 TRAF4의 F408, Y436 및 F434 곁사슬과 P₂ 위치의 Ala(A)이 TRAF4의 W414 및 F434와 상호작용하여 복합체를 형성하는 것일 수 있다.

상기 혈전증은 급성 심근 경색증, 뇌졸증, 폐 혈전증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 TGF-β 수용체 및 TRAF4 단백질을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 TGF-β 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합 감소를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 암 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

상기 TGF-β 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합은 TRAF4 TRAF 도메인에 의해 매개되는 것일 수 있으며, 상기 TRAF4 TRAF 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프를 포함하는 것일 수 있다.

보다 상세하게는 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TGF-β 수용체 펩타이드 내 Arg-Leu-Thr-Ala와 결합하는 것일 수 있다.

상기 암은 대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> TRAF4와 혈소판 수용체의 결합 확인

1. 펩타이드 합성

하기와 같은 8개의 펩타이드를 합성하였다.

GPIbβ (RRLRARARARA; 서열번호 2), GPVI (KRLRHRGRAVQ); 서열번호 3), GPIbβ-5 (RLRAR), TGFBR1 (ARLTALRIKK; 서열번호 4), TGFBR2 (DRLSGRSCSE), TGFBR2’ (ARLTAQCVA), NOD2 (GPPQKSPATLGLEEL) 및 NOD2’ (ERLARKA).

2. 단백질 발현 및 정제

TRAF4 TRAF 도메인(아미노산 290-470)을 20℃에서 하룻밤 동안 E. coli BL21 (DE3)에 발현시켰다.

니켈 친화력 및 Superdex 200 gel filtration column 10/30 (GE healthcare)를 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피로 카복실 말단 His-tag가 포함된 단백질을 정제하였다.

구조 분석을 위하여 TRAF4를 9-10 mg/ml로 농축하였으며, QuikChangeTM kit (Stratagene)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 부위 특이적 돌연변이를 유도하였다.

시퀀싱을 수행하여 돌연변이 생성을 확인하고, 상기 과정과 동일한 방법으로 돌연변이 단백질을 발현시키고 정제하였다.

3. 등온적정형열량계 (Isothermal titration calorimetry; ITC)

NanoITC(TA Instruments)를 이용하여 등온적정형열량계(ITC) 실험을 수행하였다.

TRAF4 TRAF 도메인을 PBS 완충용액에 투석하고, GPIbβ 펩타이드(RRLRARARARA)가 포함된 8개의 동결건조된 펩타이드를 동일한 완충용액에 용해시켜 열의 희석값을 최소화하였다.

적정 전에 단백질 시료 및 펩타이드를 4℃에서 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다.

ITC에서 점진적 주입을 위해, 1 mM 농축된 펩타이드 용액 2μL를 TRAF4 TRAF 도메인이 함유된 샘플 세포 190 μL를 포함하는 샘플 세포에 ~20 μM 농도로 주입하였다. 모든 적정은 15℃에서 160초 간격으로 25번 주입되었다.

각 적정 피크하의 면적을 적분하고, 주입 횟수에 대해 플롯팅한 후, TA 기기의 소프트웨어를 이용하여 단일-사이트 독립 결합 모델에 적용하였다.

실험 결과들은 TRAF4 TRAF 도메인이 없는 완충액에 펩타이드를 주입하여 얻은 기준 값을 제외시켰다.

4. 표면 플라스몬 공명 (Surface plasmon resonance; SPR ) 분석

펩타이드와 TRAF4 사이의 물리적 상호작용을 확인하기 위해, 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 수행하였다.

6xHis-tag from Biacore T200 (GE Healthcare)를 이용하여 TRAF4를 NTA 센서 칩 위에 고정하였다. 먼저, 센서 칩 표면에 100 mM 니켈을 주입하여 코팅하였다. 그 후, PBS를 이용하여 100 μg/mL 농도로 희석된 TRAF4를 10 μL/min 유속으로 1분간 주입하여 NTA 칩 표면에 일렬로 고정화시켰다.

안정화 후 약 3000 RU (Response Unit)로 확인되었다.

펩타이드의 농도 범위가 6.25 μM에서 100 μM 되도록 PBS에 희석하여 준비하고, 30 μL/min 유속으로 1분간 유량채널에 주입하고 300초의 해리 시간 후 EDTA 및 구아니딘 HCl의 혼합물로 재생시켰다.

미가공 센서 그람(sensorgrams)은 기준 유동 채널 및 블랭크 주입으로부터 감산 반응을 수행하여 이중 소거하였다.

5. 결정화, 펩타이드 침지 및 데이터 수집

펩타이드 침지를 위한 TRAF4 TRAF의 결정화를 TRAF4의 구조 연구를 위해 사전에 확인된 조건을 이용하여 행잉 드롭 증기 확산법(hanging drop vapor-diffusion method)으로 20℃에서 수행하였다.

X-선 회절법 연구를 위한 최종 결정을 단백질 용액 (9-10 mg/mL protein in 20 mM Tris-HCl at pH 8.0 and 150 mM NaCl) 1 μL, 0.14 M 마그네슘 포름산염 디하이드레이트가 포함된 저장액 1 μL 및 저장액의 0.4 ml에 대한 13% 폴리에틸렌 글리콜 3350를 포함하는 혼합액을 평형화하여 플레이트상에서 성장시켰다.

결정은 0.1 × 0.2 × 0.2 mm의 최대 면적으로 3일간 성장시켰다.

성장시킨 결정을 100 μM GPIbβ 펩타이드가 포함된 완충용액에 24시간 동안 침지시키고 액체 질소로 냉각시켰다.

포항가속기연구소(Pohang Accelerator Laboratory; PAL)의 SB-II (5C) 빔라인으로 회절 데이터를 수집하고, HKL200026를 이용하여 데이터 가공 및 스케일링을 수행하였다.

6. in vitro 에서 TRAF4와 혈소판 수용체 간의 결합 확인

TRAF 패밀리의 중요한 기능은 다양한 신호전달이므로, 이들 단백질의 기능적, 구조적 및 생화학적 분석은 주요 초점이 되어왔다.

집중적인 연구를 통하여 TRAF7을 제외한 TRAF 패밀리는 도 1a와 같이 C-말단에 보존된 TRAF 도메인을 포함하고 있는 것이 밝혀졌으며, 상기 도메인은 상부 수용체와 하부 효과기와 상호작용을 매개한다.

TRAF 도메인의 구조적 유사성에도 불구하고 서로 다른 TRAF 단백질의 각 도메인은 상부 수용기와 특이적으로 상호작용한다.

일 예로, 도 1b와 같이 TRAF6의 TRAF 도메인은 consensus 결합 모티프인 PxExxZ (Z: acidic or aromatic residues)와 특이적으로 결합하고 TRAF1, 2, 3 및 5 는 Px(Q/E)E, Px(Q/E)xxD 및 Px(Q/E)xT를 포함한 다른 결합 모티프를 인식한다.

최근에 TRAF4 TRAF 도메인 구조가 결정되었으나, TRAF4가 제한된 상호작용 인터페이스를 이용하여 다양한 수용체를 수용하는 방법에 대해서는 전혀 확인되지 않았다.

흥미롭게도, 다른 TRAF 패밀리 구성원과의 서열 비교를 통하여 도 1c와 같이 TRAF4에는 수용체 상호작용 핫 스팟이 보존되지 않는 것이 확인되었다.

상기 결과는 TRAF4가 다른 수용체와 결합하기 위해 새로운 상호작용 방식을 사용하는 것을 의미함에 따라, TRAF4 상호작용 수용체 및 TRAF4에 의해 매개되는 신호전달 사건을 확인한 연구들을 기초로, NOD2 및 두 개의 혈소판 수용체 GPIbβ와 GPVI를 후보 수용체를 확인하였다.

그 결과, 도 1d와 같이 NOD2에 추정되는 TRAF4 상호작용 영역은 전형적인 TRAF 결합 모티프와 유사한 모티프(PxQxS)를 포함하며, TRAF4 결합 영역으로 맵핑된 두 개의 혈소판 수용체의 양성 전하를 띠는 영역에는 알려지지 않은 TRAF 결합 모티프가 포함되지 않는 것을 확인하였다.

이에 따라, TRAF4에 의한 수용체 인식의 분자 메커니즘과 이를 이용한 치료방법을 개발하기 위해 몇 개의 알려진 수용체를 가진 TRAF4의 구조연구를 수행하였다.

먼저, TRAF4와 NOD2 및 두 개의 혈소판 수용체와의 상호작용이 확인됨에 따라, 이전 연구를 기초로 수용체 펩타이드를 합성하고, TRAF4와 하기 수용체 펩타이드 사이의 상호작용을 표면 플라스몰 공명(SPR)을 이용하여 정량적으로 분석하였다: NOD2 및 두 혈소판 수용체, NOD2 (GPPQKSPATLGLEEL), GPIbβ (RRLRARARARA) 및 GPIV (KRLRHRGRAVQ)

사전 상호작용 연구로 in vitro에서 50 μM로 농도 고정된 3가지 펩타이드와 TRAF4의 상호작용을 확인하였다.

초기 스크리닝 결과, GPIbβ와 GPIV는 TRAF4와 상호작용하는 것이 확인된 반면, NOD2는 상호작용하지 않는 것을 확인하였다.

상기 사전 결합 데이터를 기초로 TRAF4와 혈소판 수용체 GPIbβ 및 GPIV 사이의 상호작용을 등온적정형열량계(ITC) 및 표면 플라스몬 공명(SPR)을 이용하여 자세히 분석하였다.

GPIbβ 및 GPIV 펩타이드(1 mM)를 각각 TRAF4 20 μM에 적정하고 증분식 ITC 실험을 위해 25번 주입하였다.

그 결과, 도 1e 및 1f와 같이 두 펩타이드 모두 이상적인 상호작용 값에 해당하는 방출열이 나타났으며, 상기 결과로부터 상호작용에서 뚜렷한 협력 없이 단일 유형의 결합 사이트가 존재하는 것이 확인되었다.

또한, 결합 펩타이드 없이 수행된 대조군 적정을 측정하고 각 실험 적정 곡선에서 감하였다.

그 결과, GPIbβ 및 GPIV의 결합계수는 각각 2.167 × 10⁴ M^-1 및 2.008 × 10⁴ M^{- 1} 로 확인되었으며, 해리상수는 각각 46 μM 및 49 μM로 확인되었다.

상기 결과로부터 GPIbβ 및 GPIV 펩타이드 모두 유사한 친화도를 나타내는 TRAF4와 상호작용하는 것을 확인할 수 있었다.

표면 플라스몬 공명(SPR) 실험을 위해, His-tag affinity system을 이용하여 6xHis가 태그된 TRAF4를 Ni-NTA 센서칩에 결합시켰다.

각 펩타이드를 1 μM에서 100 μM 범위 내 다른 농도로 TRAF4와 결합시켜 분석하였다.

그 결과, 도 1g 및 1h와 같이 GPIbβ 및 GPIV은 명확한 농도 의존적 상호작용을 나타내었다.

GPIV 데이터는 피팅되지 못하였으나, GPIbβ 펩타이드는 데이터 피팅을 수행한 결과, GPIbβ 펩타이드 상호작용의 K_D 값이 11.5 μM로 나타났다.

7. TRAF4 복합체 구조를 이용한 상호작용 확인

in vitro 상호작용 연구는 TRAF4와 알려진 TRAF 결합 모티프가 포함되지 않은 합성된 혈소판 수용체 펩타이드 사이의 상호작용을 확인했기 때문에 실제로 TRAF4가 복잡한 구조를 해결하여 상기 펩타이드를 어떻게 인식하는지 확인하였다.

각각 다른 시간 척도로 TRAF4 결정을 다양한 농도의 혈소판 수용체 펩타이드에 침지시켰다.

100 μM GPIbβ 펩타이드에 24시간 동안 침지된 결정은 2.5 Å 회절되었으며, 분자 치환작용에 의한 구조 풀림 후 펩타이드 밀도를 정확하게 확인하였다.

그 결과, 도 2a와 같이 TRAF4 결정은 천연구조를 생성하는 결정과 유사한 완충 조건에서 얻어졌지만 복합 구조 연구를 위해 펩타이드 침지된 결정은 동일한 공간 그룹에서 약간 큰 세포 크기를 나타냈으며, 6 분자(두 개의 삼량체)를 포함하는 것으로 확인되었다: 비대칭 단위(asymmetric unit, ASU)에서 체인 A, B, 및 C로 이루어진 하나의 삼량체와 체인 A', B' 및 C'로 이루어진 다른 하나의 삼량체가 확인되었다.

구조는 R_work = 21.1% 및 R_free = 26.4%로 정제되었으며, 결정학 및 정제 통계치는 표 1과 같이 확인되었다.

	TRAF4/GPIbβ
Data collection
Space group	P21
Cell dimensions
a, b, c (Å) α, β, γ (°)	56.7, 88.6, 120.7 90.0, 93.6, 90.0
Resolution (Å)	50.0 - 2.5
R sym (%)	7.7 (26.9)†
Mean I/s (I)	21.7 (3.4)†
Completeness (%)	95.0 (95.9)†
Redundancy	3.1 (3.1)†
Refinement
Resolution (Å)	33.0 - 2.5
Molecules/au* No. reflections	6 (proteins) and 3(peptides) 28,763
R work / R free (%)	21.1 / 26.4
No. atoms
Protein	7,805
Water	29
Average B-factors (Å2)
Chain A	49.1
Chain B	60.4
Chain C	55.1
Chain D	52.6
Chain E	56.1
Chain F	55.0
Chain G	58.7
Chain I	60.7
Chain K	84.8
Water	52.7
R.M.S. deviations
Bond lengths (Å)	0.010
Bond angles (°)	1.390
Ramachandran plot (%) Most favored regions Additional allowed regions	96.1 3.9

^†Statistics for the highest-resolution shell are shown in parentheses

또한, 도 2a 및 2b와 같이 6 사슬 중 사슬 A, A' 및 C'은 다른 TRAF 패밀리 구성원의 전형적인 수용체 상호작용 지역에 GPIbβ 펩타이드를 포함하고 있었으며, 도 2c와 같이 깊은 홈이 수용체 결합 주머니로 확인되었으며, 수용체 펩타이드는 주머니에 결합되었다.

도 2d와 같이 각 펩타이드의 전자 밀도의 길이 및 간격은 차이가 있었으나, 체인 A내 GPIbβ 펩타이드는 가장 명확하게 모형화되었다.

또한, 펩타이드로 추측되는 추적할 수 없는 작은 전자 밀도가 사슬 C에서 확인되었다.

GPIbβ 수용체 펩타이드에 대해 아미노산 서열 RRLRARARAR을 설계, 합성 및 사용하였으나, 오직 RLRAR 부분만이 상호작용의 중심 부분이며, 낮은 전자 밀도를 갖기 때문에 도 2d와 같이 모델링되었다.

기존의 TRAF 패밀리와 다양한 복합체의 구조 연구를 통하여, TRAF-결합 모티프에서 가장 보호된 아미노산은 P₀ 또는 TRAF-결합 모티프의 제로 위치인 것으로 확인되었으며, 레이블링 전략에 따라, 도 3a와 같이 GPIbβ 수용체 펩타이드에서 RLRAR 모티프는 R (P_-1), L (P₀), R (P₁), A (P₂) 및 R (P₃)로 명명되었다.

또한, 본 발명의 복합체 구조를 통하여 GPIbβ 수용체 내 R (P_-1), L (P₀), A (P₂) 및 R (P₃) 곁사슬이 TRAF4 상호작용에 관련된 것이 확인되었다.

P_-1 위치의 R 및 P₃ 위치의 다른 R은 TRAF4의 E406 및 N355 곁사슬과 각각 수소결합을 형성한다.

또한, 도 3a를 참고하면, 중심이 되는 안정한 소수성 상호작용은 GPIbβ P₀ 의 L과 TRAF4의 F408, Y436 및 F434에 의해 형성되며, 두 번째로 중요한 소수성 주머니는 GPIbβ P₂의 A와 TRAF4의 W414 및 F434의 상호작용에 의해 형성되는 것이 확인되었다.

본 발명의 복합체 구조에서 TRAF4와 GPIbβ 수용체 펩타이드 사이의 상호작용을 확인하기 위해, 상기 복합체 구조에서 상호작용이 파괴된 6개의 돌연변이(N355R, S357E, Y366R, F434R 및 Y436R)를 발생시키고, ITC 및 SPR 분석을 수행하여 GPIbβ 수용체 펩타이드와 TRAF4 및 이들의 돌연변이 사이의 상호작용을 확인하였다.

그 결과, 표 2와 같이 N355R, Y366R 및 Y436R 세 개의 돌연변이에서는 상호작용의 파괴가 확인된 반면, S357E 및 F434R 돌연변이에서는 상호작용 친화성의 감소가 확인되었다.

상기 결과로부터 GPIbβ 수용체 펩타이드는 TRAF4의 N355, S357, Y366, F434 및 Y436에 의해 형성된 얕은 결합 주머니와 상호작용하는 것이 확인되었다.

Mutations	Peptides	SPR	ITC	Interaction
Wildtype	GPIbβ (RRLRARARAR) GPVI (KRLRHRGRAVQ)	KD = 11.2 μM N.D.	KD = 46.1 μM KD = 49.8 μM	Interact Interact
F434R	GPIbβ (RRLRARARAR) GPVI (KRLRHRGRAVQ)	KD = 27.2 μM KD = 16.6 μM	KD = 82.6 μM KD = 108.2 μM	Reduced
S357E	GPIbβ (RRLRARARAR) GPVI (KRLRHRGRAVQ)	KD = 90.6 μM N.D.	KD = 95.8 μM N.D.	Reduced
Y366R	GPIbβ (RRLRARARAR) GPVI (KRLRHRGRAVQ)	N.R. N.R	N.R N.R	Disrupt
Y436R	GPIbβ (RRLRARARAR) GPVI (KRLRHRGRAVQ)	N.R. N.R	N.R N.R	Disrupt
E406R	GPIbβ (RRLRARARAR) GPVI (KRLRHRGRAVQ)	N.R. N.R	N.R N.R	Disrupt
N355R	GPIbβ (RRLRARARAR) GPVI (KRLRHRGRAVQ)	N.R. N.R	N.R. N.R	Disrupt
Wildtype	NOD2 (GPPQKSPATLGLEEL) NOD2' (ERLARKA)	N.R. N.R.	N.R. N.R.	Not interact Not interact
Wildtype	TGFBR1 (ARLTALRIKK)	N.D.	KD = 115.3 μM	interact
Wildtype	TGFBR2 (DRLSGRSCSE) TGFBR2' (ARLTAQCVA)	N.D. N.D.	N.D. N.D.	Interact (low affinity) Interact (Low affinity)

N.R. and N.D. indicate no-response and not determined, respectively.

한편, GPIbβ 펩타이드의 결합에 따른 TRAF4의 구조 변화를 분석하기 위해, 종래에 확인된 TRAF4 자연상태의 구조(PDBid: 4K8U)와 본 발명에서 확인된 TRAF4/GPIbβ 복합체 구조를 중첩시켰다.

그 결과, 도 3b와 같이 TRAF4 및 TRAF4/GPIbβ 펩타이드 복합체의 전체 구조가 거의 동일한 것으로 확인되었으며, 평균 제곱근 편차가 0.8 Å인 것으로 확인되었다.

반면, 도 3b를 참고하면 GPIbβ 결합 상의 상호작용 인터페이스에서 W414 및 F434가 포함된 TRAF4 잔기의 곁사슬의 정확한 움직임이 확인되었다.

F408, Y436 및 F434에 의해 형성된 중심 주머니 및 W414와 F434에 의해 형성된 작은 주머니와 같은 두 개의 소수성 주머니는 수용체 상호작용 없이 사전에 형성된다. 일단 GPIbβ가 상호작용하면, W414 및 F434의 곁사슬이 이동하여 GPIbβ 펩타이드의 P₀ 위치의 L 및 P₂ 위치의 A를 수용하고 소수성 상호작용을 통하여 도 3b와 같은 두 개의 소수성 주머니가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 GPIbβ 결합은 수용체 수용을 위해 TRAF4의 구조적 변형을 유도하는 것이 확인되었다.

펩타이드 결합된 TRAF4 구조의 다른 특징은 도 3c와 같이 매우 무질서한 β6-β7 연결 루프가 존재하는 것이며, 상기 β6-β7 연결 루프는 TRAF4/펩타이드 복합체 구조 내 낮은 밀도로 존재하기 때문에 본 발명에서는 모델링되지 않았으나, 자연적인 TRAF4 구조에서는 명확하게 확인되며, 수용체와 결합을 통해 β6-β7 연결 루프의 유연성이 증가되는 것은 신호 전달에 중요할 수 있으므로 추가로 확인되어야 한다.

한편, 도 3d와 같이 TRAF4의 표면 정전기적 특징은 소수성 수용체 결합 홈과 마찬가지로 분산된 전하 잔기로 구성되어 있다. GPIbβ의 TRAF4 결합 부위는 막 관통영역의 오른쪽에 위치하며, TRAF4는 GPIbβ와 GPIV에 의해 매개된 혈소판 신호 전달 과정 동안 세포내 막 근처에 위치하는 것으로 확인되었다.

최근 보고된 바에 따르면, TRAF4는 악성 유선 종양 상피 세포(MECs)의 단단한 접합을 불안정하게 만들고, 세포 내 막에서 포스파티딜이노시톨(phosphoinositide; PIP) 결합을 통하여 종양 진행을 위한 세포 이동을 증가시키는 것으로 확인되었다.

상기 결과들은 본 발명에서 확인된 TRAF4가 신호 전달 과정에서 적절한 수용체와 세포막에 부착된다는 사실을 뒷 받침한다.

A, A' 및 C' 사슬 내 세 개의 펩타이드의 구조를 비교하기 위해, 비대칭 유닛 상의 6 분자들을 중첩시켰다.

그 결과, 도 3e와 같이 6 분자들의 구조는 거의 동일하였으며, 분자 사이의 R.M.S.D는 0.84 ~ 1.82 Å로 확인되었다. TRAF4 구조에서 A, A' 및 C'의 백본은 동일하였으며, R.M.S.D.는 0.2 Å 보다 작았다.

상기 결과로부터 수용체 펩타이드의 주요 사슬의 입체구조는 구조적으로 보존되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 주요 사슬 입체구조는 전체적으로 보존되는 반면, 곁사슬의 입체구조는 다양하다. 도 3f를 참고하면, 펩타이드에 존재하는 5 잔기들 중 P_-1, P₀, 및 P₂ 위치에 존재하는 세 잔기의 곁사슬 입체구조는 매우 잘 보존된 반면, P₁ 및 P₃ 위치에 존재하는 다른 두 잔기의 곁사슬 입체구조는 가변적이다.

TRAF4 내 보존되지 않은 아미노산 잔기들은 다양한 수용체와의 상호작용을 위해 중요하며, 이러한 TRAF4의 새로운 수용체 특이성에 따른 TRAF4와 이의 수용체 GPIbβ 구조내 새로운 결합 방식이 확인되었다.

도 3g를 참고하면, GPIbβ 수용체 펩타이드의 하부(P₁, P₂ 및 P₃)는 TRAF2와 수용체 펩타이드가 결합하는 부위와 유사한 위치에서 TRAF4와 결합하는 반면, 상부는 TRAF2가 결합하는 수용체 펩타이드 결합 부위로부터 38°떨어진 부위에서 결합하였다. 또한, TRAF6의 수용체 결합 부위와 비교한 결과, TRAF4의 GPIbβ 펩타이드 결합 부위와 TRAF6의 RANK 펩타이드는 포개지지 않았다.

상기 결과로부터 TRAF4와 관련된 수용체의 방식은 TRAF6와 완전히 다른 것을 확인할 수 있었다.

TRAF4의 표면에 존재하는 두 개의 소수성 주머니는 다른 TRAF 패밀리 구성들의 수용체 결합과 비교하여 완전히 다른 방식을 유도하는 결정적인 인자이다.

도 3h 및 3i를 참고하면, 펩타이드와 유사한 전자 밀도는 사슬 B 및 B'의 수용체 펩타이드 결합 부위에서 확인되며, 대칭적인 분자가 원인이 된다.

또한, 사슬 B (465-PRKIL-469)의 C-말단으로부터 5개의 잔기는 대칭적인 분자 내 다른 사슬 B의 전형적인 펩타이드 수용체 결합 부위에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

흥미롭게도 결정학적인 포장에 의해 형성된 상호작용 방식은 TRAF4와 GPIbβ 수용체 펩티드 사이의 상호작용 방식과 유사한 것을 확인할 수 있었다.

도 3j를 참고하면, 사슬 B의 I468는 TRAF4와 GPIbβ 수용체 펩타이드의 상호 작용에 중요한 소수성 주머니의 형성에 관여하는 대칭적인 분자인 F408, F434 및 Y436에 의해 형성된 소수성 주머니에 둘러싸여 있다.

TRAF4에서 E406과 수소 결합을 형성하기 위해 P_-1 위치의 R을 사용하는 TRAF4-GPIbβ 수용체 펩타이드 상호 작용과 달리, TRAF와 대칭분자간의 상호작용은 P_-2 위치의 R을 사용하여 TRAF4의 E406과 수소 결합을 형성한다.

또한, P_-2 위치의 하전된 잔기와 P₀ 위치의 Ile은 TRAF4-결합 모티프의 대안이 될 수 있다.

본 발명의 복합체 구조에서 P_-2 위치의 GPIbβ 수용체 펩타이드의 R은 포함되어 있지 않지만, 두 개의 혈소판 수용체로부터의 두 펩타이드는 P_-2 위치에 R을 포함하며, P_-2 위치에 R을 포함하지 않는 펩타이드 보다 높은 친화력을 가졌다.

상기 결과로부터 P_-2 위치의 양성 전하를 갖는 잔기는 적절한 친화력과 특이성에 중요할 수 있다.

다양한 신호작용 과정에서 TRAF 패밀리의 생물학적 중요성 때문에, 구조 연구에서 TRAF-결합 수용체의 TRAF-결합 컨센서스 모티프는 확인되어 졌으나, 아직까지 TRAF4-결합 모티브에 대해서는 확인되어지지 않았다.

이에 따라, 현재까지의 TRAF4-GPIbβ 수용체 복합체 구조 및 구조-기반 서열 정렬에 기초하여, TRAF4-결합 컨센서스 모티프를 확인하였다.

< 실시예 2> TRAF4와 TGF -β 수용체의 결합 확인

이전 연구를 통하여 NOD2와 TGF-β 수용체가 TRAF4 결합 수용체로 확인되어 짐에 따라, 아미노산 서열 분석을 수행한 결과, 도 3k와 같이 C 말단 부위에서 GPIbβ 수용체 펩티드 유사 서열이 확인되었다.

이에 따라, NOD2, TGF-β 수용체 1 (TGFBR1) 및 추정되는 TRAF4-결합 모티프를 포함하는 TGF-β 수용체 2 (TGFBR2)를 펩타이드로 제작한 후 SPR를 수행하여 TRAF4와 결합하는지 확인하였다.

그 결과, 도 3i와 같이 TGF-β 수용체 1 (ARLTALRIKK)은 높은 반응 단위로 TRAF4와 결합하는 것으로 확인된 반면, NOD2 (ERLARKA)은 TRAF4와 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 두 개의 TGF-β 수용체 2 펩타이드 (TGFBR2: DRLSGRSCSE 및 TGFBR2': ARLTAQCVA)는 TRAF4와 낮은 반응 단위로 상호작용하는 것이 확인되었다.

상기 결과들은 이전에 세포 기반의 상호작용 연구에서 확인된 결과와 일치하였으며, 상기 결과로부터 활성화된 TGF-β 수용체와 관련된 TRAF4는 TGF-β 수용체 2 보다 TGF-β 수용체 1과 높은 친화력을 갖는 것이 확인되었다.

한편, 사전에 수행된 상호작용 연구에 기초하여, SPR 및 ITC를 수행하여 TRAF4와 TGF-β 수용체 1 (ARLTALRIKK)간의 상호작용을 적량적으로 분석하였다.

SPR를 위해, His-tag affinity system을 사용하여 정제된 6xHis-태그된 TRAF4와 Ni-NTA 센서 칩을 결합시켰다.

각 펩타이드들을 6.25 내지 100 μM 범위의 다양한 농도로 TRAF4가 고정된 센서 칩에 처리하여 결합을 확인한 결과, 농도의존적으로 상호작용하는 것이 확인되었다. TGF-β 수용체 1 펩타이드(ARLTALRIKK)를 TRAF4에 적정하여 방출된 열은 이상적인 상호작용 값과 일치하였으며, 상기 결과로부터 상호작용에 있어서, 특징적인 협력없이 단일 유형의 결합부위가 존재하는 것이 확인되었다.

또한, 측정된 해리 상수는 115.3 μM이었으며, 상기 값을 통하여 TRAF4와 GPIbβ 수용체 펩타이드 (RRLRARARARA)간의 상호작용보다 낮은 친화성을 갖는 것으로 확인되었다.

상기 결과들로부터 P_-1 및 P₀ 위치에서 Arg-Leu 모티프가 TRAF4 상호 작용에 중요하며, P₂ 위치의 Ala 잔기가 친화력에 영향을 미치는 것이 확인되었다.

도 3k를 참고하면, P₂ 위치의 Ala 잔기를 His (GPVI peptide) 및 Gly (TGF-β 수용체 2 펩타이드)로 대체할 경우, TRAF4와의 결합 친화력이 감소되고, Arg (NOD2 펩타이드)로 대체될 경우 상호작용이 파괴되었다.

상기 결과로부터 Arg-Leu-Xaa-Ala(서열번호 1)의 P_-1에서 P₂ 대한 TRAF4 결합 모티프가 확인되었으며, 상기 Xaa는 임의의 아미노산일 수 있으며, Ala는 작고 전하를 띄지 않은 잔기로 대체될 수 있다.

본 발명에 따른 구조 및 생화학적 연구를 통하여, TRAF4는 2개의 혈소판 수용체인 GPIb-IX-V 복합체 및 GPVI와 직접적인 상호작용을 통하여 혈소판 매개 혈전증에 관여하는 분자적 기작이 확인되었으며, TGF-β 수용체와의 상호작용하여 암 시작 및 진행에 관여하는 것으로 확인됨에 따라, TRAF4의 수용체 결합 특이성, TRAF4 매개 신호과정 및 관련 질병의 추가 이해, 혈전증 및 암 치료를 위한 약물 개발에 중요하고 새로운 타켓이 될 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Screening method for thrombosis or cancer treatment using TRAF4 binding motif <130> ADP-2017-0134 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> TRAF4 binding motif <400> 1 Arg Leu Xaa Ala 1 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> GPIb-beta <400> 2 Arg Arg Leu Arg Ala Arg Ala Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> GPVI <400> 3 Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala Val Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> TGF-beta receptor 1 <400> 4 Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 206 <212> PRT <213> Human GPIb <400> 5 Met Gly Ser Gly Pro Arg Gly Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Pro Pro Ser Arg Pro Ala Ala Gly Cys Pro Ala Pro Cys Ser Cys 20 25 30 Ala Gly Thr Leu Val Asp Cys Gly Arg Arg Gly Leu Thr Trp Ala Ser 35 40 45 Leu Pro Thr Ala Phe Pro Val Asp Thr Thr Glu Leu Val Leu Thr Gly 50 55 60 Asn Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Gly Leu Leu Asp Ala Leu Pro Ala 65 70 75 80 Leu Arg Thr Ala His Leu Gly Ala Asn Pro Trp Arg Cys Asp Cys Arg 85 90 95 Leu Val Pro Leu Arg Ala Trp Leu Ala Gly Arg Pro Glu Arg Ala Pro 100 105 110 Tyr Arg Asp Leu Arg Cys Val Ala Pro Pro Ala Leu Arg Gly Arg Leu 115 120 125 Leu Pro Tyr Leu Ala Glu Asp Glu Leu Arg Ala Ala Cys Ala Pro Gly 130 135 140 Pro Leu Cys Trp Gly Ala Leu Ala Ala Gln Leu Ala Leu Leu Gly Leu 145 150 155 160 Gly Leu Leu His Ala Leu Leu Leu Val Leu Leu Leu Cys Arg Leu Arg 165 170 175 Arg Leu Arg Ala Arg Ala Arg Ala Arg Ala Ala Ala Arg Leu Ser Leu 180 185 190 Thr Asp Pro Leu Val Ala Glu Arg Ala Gly Thr Asp Glu Ser 195 200 205 <210> 6 <211> 339 <212> PRT <213> Human GPVI <400> 6 Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala 20 25 30 Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys 35 40 45 Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser 50 55 60 Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg 65 70 75 80 Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp 85 90 95 Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala 130 135 140 Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp 145 150 155 160 Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly 165 170 175 Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser 180 185 190 Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Ser Val Thr 195 200 205 Pro Ser Arg Leu Pro Thr Glu Pro Pro Ser Pro Val Ala Glu Phe Ser 210 215 220 Glu Ala Thr Ala Glu Leu Thr Val Ser Phe Thr Asn Glu Val Phe Thr 225 230 235 240 Thr Glu Thr Ser Arg Ser Ile Thr Ala Ser Pro Lys Glu Ser Asp Ser 245 250 255 Pro Ala Gly Pro Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg 260 265 270 Ile Cys Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala 275 280 285 Glu Asp Trp His Ser Arg Arg Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala 290 295 300 Val Gln Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Leu Thr Arg Lys 305 310 315 320 Ser Asn Gly Gly Gln Asp Gly Gly Arg Gln Asp Val His Ser Arg Gly 325 330 335 Leu Cys Ser <210> 7 <211> 503 <212> PRT <213> Human TGF-beta receptor <400> 7 Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr 20 25 30 Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys 35 40 45 Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys 50 55 60 Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg 65 70 75 80 Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr 85 90 95 Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro 100 105 110 Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala 115 120 125 Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met 130 135 140 Val Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn 145 150 155 160 Glu Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr 165 170 175 Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln 195 200 205 Glu Ser Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp 210 215 220 Arg Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg 225 230 235 240 Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His 245 250 255 Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr 260 265 270 Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu 275 280 285 Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys 290 295 300 Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile 305 310 315 320 Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser 325 330 335 Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu 340 345 350 Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala 355 360 365 Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu 370 375 380 Asp Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp 385 390 395 400 Ile Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser 405 410 415 Ile Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val 420 425 430 Pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln 435 440 445 Lys Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu 450 455 460 Arg Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala 465 470 475 480 Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser 485 490 495 Gln Gln Glu Gly Ile Lys Met 500

Claims (12)

1. GPIbβ 및 GPVI로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혈소판 수용체 및 TRAF4 단백질을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
   상기 후보물질이 처리된 세포에서 GPIbβ 또는 GPVI 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합 감소를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 GPIbβ 또는 GPVI 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합은 TRAF4 TRAF 도메인에 의해 매개되는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 TRAF4 TRAF 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPIbβ 혈소판 수용체 내 Arg-Leu-Arg-Ala 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPVI 혈소판 수용체 내 Arg-Leu-Arg-His와 결합하는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법.
5. GPIbβ 혈소판 수용체 펩타이드 및 TRAF4 단백질을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
   상기 후보물질이 처리된 세포에서 GPIbβ 혈소판 수용체 펩타이드와 TRAF4 단백질의 복합체 형성 억제를 확인하는 단계를 포함하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 GPIbβ 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질의 복합체는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPIbβ 혈소판 수용체의 P_-1 위치의 Arg(R) 및 P₃ 위치의 Arg(R)이 TRAF4의 E406 및 N355 곁사슬과 각각 수소결합을 형성하고, P₀ 위치의 Leu(L)이 TRAF4의 F408, Y436 및 F434 곁사슬과 P₂ 위치의 Ala(A)이 TRAF4의 W414 및 F434와 상호작용하여 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 혈전증은 급성 심근 경색증, 뇌졸증, 폐 혈전증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법.
8. TGF-β 수용체 및 TRAF4 단백질을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
   상기 후보물질이 처리된 세포에서 TGF-β 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합 감소를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 암 치료제 스크리닝 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 TGF-β 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합은 TRAF4 TRAF 도메인에 의해 매개되는 것을 특징으로 하는 암 치료제 스크리닝 방법.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 TRAF4 TRAF 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료제 스크리닝 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TGF-β 수용체 내 Arg-Leu-Thr-Ala와 결합하는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료제 스크리닝 방법.
12. 청구항 8에 있어서, 상기 암은 대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료제 스크리닝 방법.

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