JP2005278631A - Axlリガンド結合領域蛋白質、その製造方法及びそれを用いたスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 以下の(a)又は(b)の蛋白質であり、かつGas6との結合活性を有するAxlリガンド結合領域蛋白質。(a) 特定のアミノ酸配列からなる蛋白質(b) 特定のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質
【選択図】なし
Description
[1] 以下の(a)又は(b)の蛋白質であり、かつGas6との結合活性を有するAxlリガンド結合領域蛋白質、
(a) 配列番号2または4で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号2または4で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質
[2] 以下の(a)又は(b)のAxlのGas6との結合活性を有するリガンド結合領域蛋白質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号2または4で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号2または4で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質
[3] 以下の(c)又は(d)のDNAであり、AxlのGas6との結合活性を有するリガンド結合領域蛋白質をコードするDNA。
(c) 配列番号1または3で表される塩基配列を含むDNA
(d) 配列番号1または3の塩基配列を含むDNAと相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、蛋白質をコードするDNA
[4] [2]または[3]のDNAを含有する組換えベクター、
[5] [4]の組換えベクターを含む形質転換体、
[6] [5]の形質転換体を培養し、得られる培養物からAxlのリガンド結合領域蛋白質を採取することを特徴とするAxlのリガンド結合領域蛋白質の製造方法、
[7] [1]のAxlのリガンド結合領域蛋白質に対する抗体、
[8] [1]のAxlのリガンド結合領域蛋白質を用いたスクリーニング方法、ならびに
[9] [7]の抗体を用いたスクリーニング方法。
さらに、配列番号1または3の塩基配列の縮重変異体も、本発明のDNAに含められる。
AxlのGas6結合領域解析:
Gas6の結合領域であるGas6LGドメインの精製蛋白をNHS−Activatedビーズ(アマシャム)に共有結合させ、Gas6LGアフィニティビーズを作製した。Axl−Fc(シグマ)は250mMリン酸緩衝液、pH7.8中にてV8プロテアーゼを基質:酵素=1:50の割合で反応させることで、Axl―Fcを切断し、断片ペプチドとした(図1)。25mMトリス塩酸緩衝液、150mM食塩、1mg/mlBSA、1%NP40の結合バッファー中で断片ペプチドAxl−FcをGas6LGアフィニティビーズに混合し、免疫沈降法を利用した結合試験を行なった。十分にアフィニティビーズを洗浄することで、非特異的に結合している分子を洗い流した後、酸(グリシン塩酸 0.1M、PH2.7)にて溶出した。ポリアクリルアミド電気泳動をした後、抗Axl抗体(シグマ)を用いた免疫染色を行った。その結果、Gas6LGを共有結合させたアフィニティビーズにAxl―Fc切断フラグメントの結合が認められた。Gas6LGと結合するAxl断片ペプチドは120kDa、75kDa、50kDa、35kDaの4種類認められ(図2)、N末解析によりGas6LGと結合する全てのAxl断片ペプチドは、N末端が同一のアミノ酸配列Glu−Glu−Ser−Pro−Pheであることが明らかとなった。この配列は、Ig領域のN端に存在する。溶出された35kDaのAxl断片ペプチドは50mM リン酸緩衝液 PH7.5中、N-glycosidaseF処理により約25kDaになることから、Gas6と相互作用するAxl部分領域は、Ig領域であることが示唆された。
結合領域の蛋白作製:
(1)AxlのIg領域蛋白質をコードするDNAの調製および大腸菌発現ベクターpET15b−Igの構築
公知のヒトAxlのアミノ酸配列蛋白質をコードするDNAを配列表1で示すように設計した。このDNA断片の調製に際しては、配列表1にある1番グルタミン酸から190番トレオニンをコードすると共に、その部分をHis6との融合蛋白質として発現させ、発現された融合蛋白質から所望のIg領域蛋白質を単離、精製することができるよう、His6をコードするベクターに挿入可能な形に設計した。即ち、His6とAxlの間にエンテローキナーゼの認識部位であるAsp-Asp-Asp-Asp-Lysをコードする配列がさらにN末端側に挿入されるよう設計した。従って、His6と融合した形で発現したAxlは、制限プロテアーゼエンテローキナーゼによる切断によってHis6から切り離される。またC末端には終結コドンTAAをさらに付加した。その上にDNA断片をpET15bのNde1とXho1部位に連結すべく、該DNAのN末端側とC末端側をさらに延長して、その延長部にNde1とXho1認識部位を形成し、発現ベクターpET15b−Igを構築した(図3)。
この発現ベクターpET15b−Igを用いて、これを100μlの大腸菌BL21(DE3)株コンピテントセルと混合し、0℃で30分間、さらに42℃で2分間インキュベートすることで大腸菌へ移入した。バクトトリプトン(ディフコ)10g、イーストエキス(ディフコ)5g、食塩5g、100μg/mlアンピシリンおよび0.2%グルコースを含む培地1リットルに上記形質変換体を接種し、37℃で(A600=約0.5)まで増殖させる。それにIPTG(シグマ社)を最終濃度が1mMになるように添加する。続いて、約5時間培養後、菌体を集める。集めた菌体は5mM EDTAを含む25mMトリス緩衝液pH7.5に懸濁した後超音波にて破砕する。12,000回転の遠心を行った後、沈殿を集める。
Gas6の受容体結合ドメインであるGas6LGとIgとの結合能:
Gas6の受容体結合ドメインであるGas6LGとIgの結合能を、ビアコア2000を用いて測定した。ビアコアはリアルタイムでタンパク質の相互作用の解析が可能な装置である。タンパク質同士の結合、乖離に伴うセンサーチップの微量な質量変化を検出することで相互作用を観測することができる。相互作用を測定するタンパク質の一方、すなわち作製したIgをセンサーチップCM5に固定し、他方であるGas6LGを送液することで結合を測定した。結合バッファーの組成は0.01Mヘペス緩衝液、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005%Surfactant P20、pH7.4とした。Gas6LGの濃度は、3,4,7,10μMを用いた。作製したIgにGas6LGの結合が認められた(図4)。
結合領域の蛋白作製:
(1)AxlのIg1領域蛋白質をコードするDNAの調製および大腸菌発現ベクターpET15b−Ig1の構築
公知のヒトAxlのアミノ酸配列蛋白質をコードするDNAを配列表1で示すように設計した。このDNA断片の調製に際しては、配列表1にある1番グルタミン酸から106番をコードするロイシンと共に、その部分を発現させた。C末端には終結コドンTAAを付加した。その上にDNA断片をpET15b(Novagen)のNco1とXho1部位に連結すべく、該DNAのN末端側とC末端側をさらに延長して、その延長部にNco1とXho1認識部位を形成し、発現ベクターpET15b−Ig1を構築した(図5)。
この発現ベクターpET15b−Ig1を用いて、これを100μlの大腸菌BL21(DE3)株コンピテントセルと混合し、0℃で30分間、さらに42℃で2分間インキュベートすることで大腸菌へ移入した。バクトトリプトン(ディフコ)10g、イーストエキス(ディフコ)5g、食塩5g、100μg/mlアンピシリン及び0.2%グルコースを含む培地1リットルに上記形質変換体を接種し、37℃で(A600=約0.5)まで増殖させる。それにIPTG(シグマ社)を最終濃度が1mMになるように添加する。続いて、約5時間培養後、菌体を集める。集めた菌体は5mM EDTAを含む25mMトリス緩衝液pH7.5に懸濁した後超音波にて破砕する。12,000回転の遠心を行った後、沈殿を集める。
(1)Gas6の受容体結合ドメインであるGas6LGとIg1との結合能:
結合実験は結合、乖離により生じる質量変化を表面プラズモン共鳴シグナルの変化として測定するBiacoreを用いて行った。Ig1をCM5センサーチップに固定化し、Gas6LGの濃度は、150nM、200nM、300nM、400nMを用いた。相互作用を測定するタンパク質の一方、すなわち作製したIg1をセンサーチップCM5に固定し、他方であるGas6LGを送液することで結合を測定した。結合バッファーの組成は0.01Mヘペス緩衝液、0.15M NaCl、0.005%Surfactant P20、pH7.4とした。作製したIg1にGas6LGの結合が認められた(図6)。
Axl−Fc (sigma)をCM5センサーチップに固定化し、Gas6LG 50nMを送液することにより、Gas6LGとAxl−Fcの結合を測定した。この結合はIg1の投与により阻害された(図7)。Ig1を15nM−1.2μM加えた。
Claims (9)
- 以下の(a)又は(b)の蛋白質であり、かつGas6との結合活性を有するAxlリガンド結合領域蛋白質。
(a) 配列番号2または4で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号2または4で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質 - 以下の(a)又は(b)のAxlのGas6との結合活性を有するリガンド結合領域蛋白質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号2または4で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号2または4で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質 - 以下の(c)又は(d)のDNAであり、AxlのGas6との結合活性を有するリガンド結合領域蛋白質をコードするDNA。
(c) 配列番号1または3で表される塩基配列を含むDNA
(d) 配列番号1または3の塩基配列を含むDNAと相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、蛋白質をコードするDNA - 請求項2または3に記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項4に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からAxlのリガンド結合領域蛋白質を採取することを特徴とするAxlのリガンド結合領域蛋白質の製造方法。
- 請求項1に記載のAxlのリガンド結合領域蛋白質に対する抗体。
- 請求項1に記載のAxlのリガンド結合領域蛋白質を用いたスクリーニング方法。
- 請求項7に記載の抗体を用いたスクリーニング方法。
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JP2004279582A JP2005278631A (ja) | 2004-03-04 | 2004-09-27 | Axlリガンド結合領域蛋白質、その製造方法及びそれを用いたスクリーニング方法 |
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2004
- 2004-09-27 JP JP2004279582A patent/JP2005278631A/ja active Pending
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