CN115894701A - 结合cd3的抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种结合CD3的抗体及其用途,以及能同时结合CD3与肿瘤相关抗原的双特异性抗体。本发明的双特异性抗体包含第一结合结构域、第二结合结构域和第三结合结构域,其中第一结合结构域与CD3结合、第二结合结构域和第三结合结构域与肿瘤相关抗原结合,第一结合结构域具有Fab分子的形式,第二结合结构域具有Fv分子或scFv分子的形式,第三结合结构域具有Fab分子的形式。本发明的双特异性抗体能够在结合肿瘤相关抗原表达细胞的同时,结合并激活CD3阳性的T细胞,进而促进T细胞对表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞特异性的杀伤。同时,本发明还提供了包含所述双特异性抗体的药物组合物以及制备和使用所述双特异性抗体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及CD3抗体,还涉及同时结合CD3和肿瘤相关抗原的双特异性抗体及其用途。
背景技术
T淋巴细胞(T lymphocyte)简称T细胞,是由来源于骨髓的淋巴干细胞,在胸腺中分化、发育成熟后,通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能。T细胞是一种高效的杀伤细胞,能迅速消灭病毒感染细胞和癌细胞。T细胞杀伤作用需要免疫突触的形成,而这一过程高度依赖于TCR识别抗原递呈细胞表面MHC分子与所递呈的抗原肽形成的复合物。激活的免疫突触将释放细胞毒素和细胞因子起到杀伤作用。在免疫突触形成过程中,受T细胞与靶细胞之间距离的限制,双特异性抗体定向T细胞就要模拟免疫突触的形成,一端通过靶向CD3来实现桥连T细胞TCR受体,另一端桥连靶细胞通过靶向靶细胞表面抗原来实现。
CD3(T细胞表面糖蛋白CD3,T细胞受体的信号转导共受体,其包含亚基γ、δ、ε和ζ)是表达于所有T淋巴细胞表面的一种分化抗原,主要介导T细胞活化信号的转导。在机体免疫系统的抗感染免疫中起着重要作用。CD3分子与T细胞抗原受体(T cell receptor)形成稳定的TCR-CD3复合体,其胞外区识别、结合主要组织相容性复合体II类分子,增强T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)与MHC分子结合的稳定性;胞内区增强白细胞CD3转导的活化信号,从而参与并调节免疫系统的活化。CD3阳性淋巴细胞群的数量指标是衡量机体细胞免疫情况的重要指标。
双特异性抗体将细胞毒性T细胞导向癌细胞的基本原理在1985年首次被描述。双特异性抗体介导的T细胞重定向杀伤肿瘤细胞被认为是最有希望的癌症治疗策略。2009年,全球首个双特异性抗体药物Removab获得欧盟药品管理局(EMA)批准上市,适应症为标准治疗无效或不可行的因EpCAM阳性肿瘤所致的恶性腹水。Catumaxomab(anti-CD3and anti-EpCAM)做为第一例被FDA批准的双抗,想要达到的应用目标是“一个三功能”的双特异性抗体,它除了桥连的肿瘤靶细胞和T细胞,也可以结合Fcγ受体阳性效应细胞,巨噬细胞等。作为第一个被FDA批准的T cell recruiter类双抗,catumaxomab具有里程碑式的意义。事实上,在对有腹水的卵巢癌和其它癌患者的治疗中,catumaxomab的确显示了良好的疗效。但在这一过程中,细胞因子风暴引起的发热、恶心、呕吐等副作用多有出现,同时,在第0,3,7和10天分别进行10,20,50,150μg四次注射后,70%的患者出现了人抗小鼠抗体/人抗大鼠抗体(HAMA/HARA)。这些副作用可能和以下因素相关:双抗对CD3较高的亲和力导致未结合肿瘤细胞时就低活化T细胞所引起的细胞因子风暴;双抗在结合肿瘤细胞后过度活化T细胞引起的细胞因子风暴;EpCAM在某些正常组织上也有相当量的表达引起的双抗对正常组织的潜在非特异性杀伤。
本发明旨在提供亲和力、稳定性和/或降低引起细胞因子释放综合征等方面均具有较好效果的抗体。
发明内容
本发明提供了一种与CD3结合的抗体或其抗原结合片段,本发明提供的抗CD3抗体或其抗原结合片段可作为独立的疗法或与其它疗法/或其他抗癌药剂联合,用于诸如癌症的治疗;还提供了同时结合CD3和肿瘤相关抗原的三价双特异性抗体,其在亲和力、稳定性和/或降低引起细胞因子释放综合征等方面均具有较好效果,并能够有效抑制肿瘤生长,可用于诸如癌症的治疗。
在一个方面,本发明提供了一种双特异性抗体,其包含第一结合结构域、第二结合结构域和第三结合结构域,其中所述第一结合结构域与CD3结合,所述第二结合结构域和所述第三结合结构域与肿瘤相关抗原结合,所述第一结合结构域具有Fab分子或Fv分子或scFv分子的形式,所述第二结合结构域具有Fab分子或Fv分子或scFv分子的形式,和所述第三结合结构域具有Fab分子的形式。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域具有Fab分子的形式,所述第二结合结构域具有Fv分子或scFv分子的形式,和所述第三结合结构域具有Fab分子的形式。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域具有Fab分子的形式,所述第二结合结构域具有Fv分子的形式,和所述第三结合结构域具有Fab分子的形式。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域具有Fab分子的形式,所述第二结合结构域具有scFv分子的形式,和所述第三结合结构域具有Fab分子的形式。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域具有Fv分子的形式,所述第二结合结构域具有Fab分子的形式,和所述第三结合结构域具有Fab分子的形式。
在一些实施方式中,本发明所述肿瘤相关抗原选自BCMA、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CDK4、CEA、Claudin 18.2、EGFR、ROR1、TGF-β和5T4;优选地,所述肿瘤相关抗原是Claudin 18.2、CD20或BCMA。
在一些实施方式中,本发明所述双特异性抗体,其具有四条多肽链,其中所述第一多肽链自N端到C端具有VH1-CH1-连接肽-VL2-连接肽-铰链区-第一Fc区,所述第二多肽链自N端到C端具有VL1-CL-连接肽-VH2;所述第三多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-铰链区-第二Fc区,所述第四多肽链自N端到C端具有VL2-CL。其中,所述VH1和VL1形成一结构域,所述VH2和VL2形成一结构域。
在一些实施方式中,本发明所述第一多肽链的VH1-CH1与所述第二多肽链的VL1-CL形成所述第一结合结构域,所述第一多肽链的VL2与所述第二多肽链的VH2形成所述第二结合结构域,所述第三多肽链的VH2-CH1与所述第四多肽链的VL2-CL形成所述第三结合结构域。
在一些实施方式中,本发明所述双特异性抗体,其具有四条多肽链,其中所述第一多肽链自N端到C端具有VH1-CH1-连接肽-VL2-连接肽-VH2-连接肽-铰链区-第一Fc区,所述第二多肽链自N端到C端具有VL1-CL;所述第三多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-铰链区-第二Fc区,所述第四多肽链自N端到C端具有VL2-CL。其中,所述VH1和VL1形成一结构域,所述VH2和VL2形成一结构域。
在一些实施方式中,本发明所述第一多肽链的VH1-CH1与所述第二多肽链的VL1-CL形成所述第一结合结构域,所述第一多肽链的VL2-连接肽-VH2形成所述第二结合结构域,所述第三多肽链的VH2-CH1与所述第四多肽链的VL2-CL形成所述第三结合结构域。
在一些实施方式中,本发明所述双特异性抗体,其具有四条多肽链,其中所述第一多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-连接肽-VL1-连接肽-铰链区-第一Fc区,所述第二多肽链自N端到C端具有VL2-CL-连接肽-VH1;所述第三多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-铰链区-第二Fc区,所述第四多肽链自N端到C端具有VL2-CL。其中,所述VH1和VL1形成一结构域,所述VH2和VL2形成一结构域。
在一些实施方式中,本发明所述第一多肽链的VH2-CH1与所述第二多肽链的VL2-CL形成所述第二结合结构域,所述第一多肽链的VL1与所述第二多肽链的VH1形成所述第一结合结构域,所述第三多肽链的VH2-CH1与所述第四多肽链的VL2-CL形成所述第三结合结构域。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为:
HCDR1:X1YAMN,其中,X1为T或K;
HCDR2:RIRSKYNNYATYYAX2SVKX3,其中,X2为D或A,X3为D或G;
HCDR3:HGX3X4GX5X6X7X8X9X10X11AY,其中,X3为N或A,X4为F或A,X5为N或A,X6为S或A,X7为Y或A,X8为V或A,X9为S或A,X10为W或A,X11为F或A;
LCDR1:X12SSTGAVTTX13NYX14N,其中,X12为R或G,X13为S或G,X14为A或P;
LCDR2:GTNKRAP;
LCDR3:AX15X16X17X18X19X20X21X22,其中,X15为L或A,X16为W或A,X17为Y或A,X18为S或A,X19为N或A,X20为L或A,X21为W或A,X22为V或A。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3或4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5-22中任一项所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23或24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQID NO:25所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:26-42中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3:
所述HCDR1、HCDR2、HCDR3为:
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3;或
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3;或
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5-22中任一项所示的HCDR3;
所述LCDR1、LCDR2、LCDR3为:
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的LCDR3;或
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26-42中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为:
HCDR1:X1YAMN,其中,X1为T或K(优选为K);
HCDR2:RIRSKYNNYATYYAX2SVKX3,其中,X2为D或A(优选为A),X3为D或G(优选为G);
HCDR3:HGX3X4GX5X6X7X8X9X10X11AY,其中,X3为N,X4为F,X5为N或A,X6为S或A,X7为Y或A,X8为V或A,X9为S或A,X10为W,X11为F或A(优选为F);
LCDR1:X12SSTGAVTTX13NYX14N,其中,X12为R或G,X13为S或G,X14为A或P;
LCDR2:GTNKRAP;
LCDR3:AX15X16X17X18X19X20X21X22,其中,X15为L或A,X16为W,X17为Y或A,X18为S或A,X19为N或A,X20为L或A,X21为W,X22为V或A。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3或4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5、9、10、11、15、17、18、19或20中任一项所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23或24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、30、33、35、36、37、39、40、41或42中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的LCDR3;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、33、36或37中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、35、37、39或40中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、33、40、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、33、35、36、37、40、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26或30所示的LCDR3;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33、35、36、37或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、35、36、37、39、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、33、35、36、40、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:9、10或19中任一项所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ IDNO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(Ⅻ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:43-62中任一项所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63-81中任一项所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示的VL;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65、67、72、75或76所示的VL;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、74、76、78或79所示的VL;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、72、79、80或81所示的VL;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65、67、72、74、75、76、79、80或81所示的VL;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65或69所示的VL;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:72、74、75、76或81所示的VL;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、74、75、76、78、80或81所示的VL;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、72、74、75、79、80或81所示的VL;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:49、50或59中任一项所示的VH,和氨基酸序列如SEQID NO:63所示的VL;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的VL;或
(Ⅻ)氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述第二结合结构域和第三结合结构域与Claudin18.2结合,其分别包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:121所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ IDNO:122所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:123所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:124所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:125所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:126所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第二结合结构域和第三结合结构域与CD20结合,其分别包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:127所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:128所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:129所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:131所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:132所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第二结合结构域和第三结合结构域与Claudin18.2结合,其分别包含:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:133所示的VH,和氨基酸序列如SEQ IDNO:134所示的VL;或(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:166所示的VH,和氨基酸序列如SEQ IDNO:167所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述第二结合结构域和第三结合结构域与CD20结合,其分别包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:135所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述第一Fc区为knob-Fc,所述第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方式中,本发明所述第一Fc区与所述第二Fc区之间通过铰链区的二硫键和杵臼结构连接。
在一些实施方式中,本发明所述第一Fc区和/或第二Fc区为来自IgG的Fc区,优选为来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。
在一些实施方式中,本发明所述第CH1为来自IgG的CH1,优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1。
在一些实施方式中,本发明所述CL为来自λ或κ轻链的CL。
在一些实施方式中,本发明连接肽可以是包含G(甘氨酸)、S(丝氨酸)和A(丙氨酸)或由G和S组成的柔性多肽,其长度可为2-30个氨基酸残基;进一步优选地,连接肽包括但不限于(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n和AS(GGGGS)n等,n可为1-6的整数,如1、2、3、4、5、6。
在一些实施方式中,本发明所述双特异性抗体具有四条多肽链,所述四条多肽链分别为:
(1)具有如SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(2)具有如SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(3)具有如SEQ ID NO:148所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(4)具有如SEQ ID NO:150所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(5)具有如SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:155所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(6)具有如SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(7)具有如SEQ ID NO:164所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列的第四多肽链。
在又一个方面,本发明提供了一种多核苷酸分子,其核苷酸序列选自:
(1)编码本文任一项所述的双特异性抗体的核苷酸序列;和
(2)如(1)所述核苷酸序列的互补序列。
在又一个方面,本发明提供了一种表达载体,其包含本文所述的多核苷酸分子,优选地,所述表达载体为真核表达载体。
在又一个方面,本发明提供了一种宿主细胞,其包含本文所述的多核苷酸分子,或包含本文所述的表达载体,或表达本文任一项所述的双特异性抗体;优选地,所述宿主细胞是真核细胞,更优选哺乳动物细胞。
在又一个方面,本发明提供了一种制备本文任一项所述的双特异性抗体的方法,所述方法包括在适合于本文任一项所述的双特异性抗体表达的条件下培养本文所述的宿主细胞,使其表达所述本文任一项所述的双特异性抗体,并从所述宿主细胞回收所表达的本文任一项所述的双特异性抗体。
在又一个方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含本文任一项所述的双特异性抗体、多核苷酸分子、表达载体或宿主细胞,和药学上可接受的载体或赋形剂。
在又一个方面,本发明提供了本文任一项所述双特异性抗体、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
在又一个方面,本发明提供了本文任一项所述双特异性抗体、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物,其用于预防或治疗癌症。
在又一个方面,本发明提供了一种预防或治疗癌症的方法,其包括向有需要的受试者施用如本文任一项所述双特异性抗体、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物。
在一些实施方式中,本发明所述癌症与CLDN18或CD20相关;更优选地,所述癌症选自胃癌、食道癌、胃食管癌、胰腺癌、胆管癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌、肠癌和膀胱癌;或所述癌症选自急性B淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、滤泡淋巴瘤,非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓细胞白血病和Burkitt淋巴瘤。
在又一个方面,本发明提供了一种药物组合,其包含如本文任一项所述双特异性抗体、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物,以及一种或多种另外的治疗剂。
在又一个方面,本发明提供了一种试剂盒,其包括如本文任一项所述双特异性抗体、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物。
在又一个方面,本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段,其包含结合CD3的结合结构域,其中,所述结合CD3的结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为:
HCDR1:X1YAMN,其中,X1为T或K;
HCDR2:RIRSKYNNYATYYAX2SVKX3,其中,X2为D或A,X3为D或G;
HCDR3:HGX3X4GX5X6X7X8X9X10X11AY,其中,X3为N或A,X4为F或A,X5为N或A,X6为S或A,X7为Y或A,X8为V或A,X9为S或A,X10为W或A,X11为F或A;
LCDR1:X12SSTGAVTTX13NYX14N,其中,X12为R或G,X13为S或G,X14为A或P;
LCDR2:GTNKRAP;
LCDR3:AX15X16X17X18X19X20X21X22,其中,X15为L或A,X16为W或A,X17为Y或A,X18为S或A,X19为N或A,X20为L或A,X21为W或A,X22为V或A;
条件是,所述结合CD3的结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3不同时为:氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ IDNO:1或2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3或4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ IDNO:5-22中任一项所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23或24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:26-42中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3:
所述HCDR1、HCDR2、HCDR3为:
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3;或
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3;或
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5-22中任一项所示的HCDR3;
所述LCDR1、LCDR2、LCDR3为:
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的LCDR3;或
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26-42中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为:
HCDR1:X1YAMN,其中,X1为T或K(优选为K);
HCDR2:RIRSKYNNYATYYAX2SVKX3,其中,X2为D或A(优选为A),X3为D或G(优选为G);
HCDR3:HGX3X4GX5X6X7X8X9X10X11AY,其中,X3为N,X4为F,X5为N或A,X6为S或A,X7为Y或A,X8为V或A,X9为S或A,X10为W,X11为F或A(优选为F);
LCDR1:X12SSTGAVTTX13NYX14N,其中,X12为R或G,X13为S或G,X14为A或P;
LCDR2:GTNKRAP;
LCDR3:AX15X16X17X18X19X20X21X22,其中,X15为L或A,X16为W,X17为Y或A,X18为S或A,X19为N或A,X20为L或A,X21为W,X22为V或A;
条件是,所述结合CD3的结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3不同时为:氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ IDNO:1或2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3或4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ IDNO:5、9、10、11、15、17、18、19或20中任一项所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23或24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、30、33、35、36、37、39、40、41或42中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的LCDR3;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、33、36或37所示的LCDR3;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、35、37、39或40所示的LCDR3;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、33、40、41或42所示的LCDR3;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、33、35、36、37、40、41或42所示的LCDR3;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26或30所示的LCDR3;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33、35、36、37或42所示的LCDR3;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、35、36、37、39、41或42所示的LCDR3;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、33、35、36、40、41或42所示的LCDR3;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:9、10或19所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示的LCDR3;或
(Ⅻ)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ IDNO:43-62中任一项所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63-81中任一项所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示的VL;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65、67、72、75或76所示的VL;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、74、76、78或79所示的VL;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、72、79、80或81所示的VL;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65、67、72、74、75、76、79、80或81所示的VL;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65或69所示的VL;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:72、74、75、76或81所示的VL;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、74、75、76、78、80或81所示的VL;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、72、74、75、79、80或81所示的VL;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:49、50或59所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的VL;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示的VL;或
(Ⅻ)氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:82-101中任一项所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:102-120中任一项所示的轻链。
在一些实施方式中,本发明所述抗体包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:83所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:103所示的轻链;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:84所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:104、106、111、114或115所示的轻链;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:88所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:106、113、115、117或118所示的轻链;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:89所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:106、111、118、119或120所示的轻链;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:90所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:104、106、111、113、114、115、118、119或120所示的轻链;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:94所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:104或108所示的轻链;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:111、113、114、115或120所示的轻链;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:97所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:106、113、114、115、117、119或120所示的轻链;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:99所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:106、111、113、114、118、119或120所示的轻链;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:88、89或98所示的重链,和氨基酸序列如SEQ IDNO:102所示的轻链;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:98所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:114所示的轻链。
在一些实施方式中,本发明所述抗体是单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体,所述抗原结合片段为Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dsFv、scFv或sdAb。
在一些实施方式中,本发明所述抗体是特异性结合CD3的单克隆抗体。
在一些实施方式中,本发明所述抗体或其抗原结合片段还包含一个或两个结合肿瘤相关抗原的结合结构域。
在一些实施方式中,本发明所述肿瘤相关抗原选自BCMA、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CDK4、CEA、Claudin 18.2、EGFR、ROR1、TGF-β和5T4;优选地,所述肿瘤相关抗原是Claudin 18.2、CD20或BCMA。
在一些实施方式中,本发明所述肿瘤相关抗原是Claudin 18.2或CD20。在一些实施方式中,本发明所述结合Claudin 18.2的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:121所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:122所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:123所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:124所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:125所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:126所示的LCDR3。在一些实施方式中,本发明所述结合CD20的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:127所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQID NO:128所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:129所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ IDNO:130所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:131所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ IDNO:132所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合Claudin 18.2的结合结构域包含:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:133所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:134所示的VL;或(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:166所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:167所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD20的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQID NO:135所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示的VL。
在一些实施方式中,本发明提供了一种抗体,其包含结合CD3的结合结构域和结合CD20的结合结构域,其中,所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;所述结合CD20的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:127所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:128所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:129所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:131所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:132所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明提供了一种抗体,其包含结合CD3的结合结构域和结合CD20的结合结构域,其中,所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的VL,所述结合CD20的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:135所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述抗体的Fc区为来自IgG的Fc,例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc,和/或所述抗体的CL为来自λ或κ轻链的CL;优选地,所述Fc区包含杵臼结构。
在一些实施方式中,本发明所述抗体具有四条多肽链,所述四条多肽链分别为:
(1)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列;或
(2)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列;或
(3)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:148所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列;或
(4)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:150所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列;或
(5)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:155所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列;或
(6)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列;或
(7)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:164所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列。
在又一个方面,本发明提供了一种多核苷酸分子,其核苷酸序列选自:
(1)编码本文任一项抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列;和
(2)如(1)所述核苷酸序列的互补序列。
在又一个方面,本发明提供了一种表达载体,其包含本文所述的多核苷酸分子,优选地,所述表达载体为真核表达载体。
在又一个方面,本发明提供了一种宿主细胞,其包含本文所述的多核苷酸分子,或包含本文所述的表达载体,或表达本文任一项抗体或其抗原结合片段;优选地,所述宿主细胞是真核细胞,更优选哺乳动物细胞。
在又一个方面,本发明提供了一种制备本文任一项抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括在适合于本文任一项抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养本文所述的宿主细胞,使其表达所述本文任一项抗体或其抗原结合片段,并从所述宿主细胞回收所表达的本文任一项抗体或其抗原结合片段。
在又一个方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体或宿主细胞,和药学上可接受的载体或赋形剂。
在又一个方面,本发明提供了本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
在又一个方面,本发明提供了本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物,其用于预防或治疗癌症。
在又一个方面,本发明提供了一种预防或治疗癌症的方法,其包括向有需要的受试者施用如本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物。
在一些实施方式中,本发明所述癌症与CLDN18或CD20相关;更优选地,所述癌症选自胃癌、食道癌、胃食管癌、胰腺癌、胆管癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌、肠癌和膀胱癌;或所述癌症选自急性B淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、滤泡淋巴瘤,非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓细胞白血病和Burkitt淋巴瘤。
在又一个方面,本发明提供了一种药物组合,其包含如本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物,以及一种或多种另外的治疗剂。
在又一个方面,本发明提供了一种试剂盒,其包括如本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞或药物组合物。
在又一个方面,本发明提供本发明任一实施方案所述的特异性结合CD3的单克隆抗体在制备用于降低细胞因子风暴或用于治疗或预防细胞因子释放综合征的分子或药物中的应用。在一些实施方案中,所述分子或药物为双特异性抗体或含双特异性抗体的药物。在一些实施方案中,所述双特异性抗体为本文任一实施方案所述的双特异性抗体。
附图说明
图1:组一的抗体与人CD3的结合检测结果。
图2:组二的抗体与人CD3的结合检测结果。
图3:组三的抗体与人CD3的结合检测结果。
图4:组四的抗体与人CD3的结合检测结果。
图5:组五的抗体与人CD3的结合检测结果。
图6:组六的抗体与人CD3的结合检测结果。
图7:组七的抗体与人CD3的结合检测结果。
图8:组八的抗体与人CD3的结合检测结果。
图9:组九的抗体与人CD3的结合检测结果。
图10:组九的抗体与人CD3的结合检测结果。
图11:组十一的抗体与人CD3的结合检测结果。
图12:组十二的抗体与人CD3的结合检测结果。
图13:双特异性抗体JS202-7的结构示意图。
图14:双特异性抗体JS202-7 CD3 Fv的结构示意图。
图15:双特异性抗体JS202-7 012Fv和JS202-7 CD3 130 012Fv的结构示意图。
图16:双特异性抗体JS203-7-JSCD3-CD20Fv和JS203-7-CD3 130-CD20Fv的结构示意图。
图17:双特异性抗体JS203-7-CD3-FV的结构示意图。
图18:双特异性抗体JS202-7 CD3-130-012scFv的结构示意图。
图19:双特异性抗体JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7与人CD3的结合检测结果。
图20:双特异性抗体JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7与食蟹猴CD3e的结合检测结果。
图21:双特异性抗体JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7与CHO Claudin18.2的结合检测结果。
图22:双特异性抗体JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7对T细胞下游信号通路的激活作用。
图23:双特异性抗体JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7对T细胞的激活作用。
图24:双特异性抗体JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7引起细胞因子释放综合征的研究结果。
图25:双特异性抗体JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7对小鼠MC38hClaudin18.2细胞皮下移植瘤生长的抑制。
图26:双特异性抗体JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv与CHO-hCD3细胞的结合检测结果。
图27:双特异性抗体JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv与Raji细胞的结合检测结果。
图28:双特异性抗体JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv在荧光素酶报告基因系统中的活性检测结果。
图29:双特异性抗体JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv对T淋巴细胞的激活活性检测结果。
图30:双特异性抗体JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv引起细胞因子释放综合征的研究结果。
具体实施方式
定义
除非另有说明,本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术,这些都在本领域的技术范围内。
为了可以更容易地理解本发明,某些科技术语具体定义如下。除非本文其它部分另有明确定义,否则本文所用的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。关于本领域的定义及术语,专业人员具体可参考Current Protocolsin MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准三字母和/或单字母代码。本文(包括权利要求书)所用单数形式包括其相应的复数形式,除非文中另有明确规定。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。
术语“抗原”系指能够被本发明的抗体所结合的分子或分子之一部分。抗原可有一个或多于一个表位。
术语“肿瘤相关抗原”指肿瘤细胞单独表达或主要表达或过表达的任何分子(例如蛋白、肽、脂质、碳水化合物等),以使所述抗原与肿瘤相关。肿瘤相关抗原可以是仅一种类型的肿瘤表达的抗原,以使所述肿瘤抗原仅与一种类型的肿瘤相关或者仅是一种类型的肿瘤所特有的。可选地,肿瘤抗原可以是多种类型肿瘤相关或者特有的肿瘤抗原。例如,肿瘤相关抗原可以被乳腺癌细胞和结肠癌细胞都表达,但不被正常的、非肿瘤或非癌细胞所表达。示例性的肿瘤相关抗原为肿瘤细胞表面抗原,这类抗原更利于为治疗性和诊断性抗体所识别。“肿瘤相关抗原”的非限定示例包含,例如BCMA、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CDK4、CEA、Claudin 18.2、EGFR、ROR1、TGF-β和5T4。
术语“CD3”指的是作为T细胞受体复合物的一部分,由三个不同的链CD3ε,CD3δ和CD3γ组成。CD3在T细胞上通过例如抗CD3抗体对其的固定作用而产生的集中,导致T细胞的活化,与T细胞受体介导的活化类似,但是不依赖于TCR克隆的特异性。绝大多数抗CD3抗体识别CD3ε链。该术语指来自任何脊椎动物(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人))和啮齿类动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然CD3,除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的CD3以及由细胞内加工产生的任何形式的CD3或其任何片段。该术语还包括天然存在的CD3的变体,例如,剪接变体或等位变体。在一个优选实施方式中,CD3是指来自人和食蟹猴CD3全长或其片段(诸如其缺乏信号肽的成熟片段)。在一个优选实施方式中,CD3是指来自小鼠/大鼠全长或其片段(诸如其缺乏信号肽的成熟片段)。
术语“CLDN-18.2”或“Claudin 18.2”,是Claudin 18的两个剪接变异体之一。该术语指来自任何脊椎动物(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人))和啮齿类动物(例如,小鼠和大鼠)的任何天然CLDN-18.2,除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的CLDN-18.2以及由细胞内加工产生的任何形式的CLDN-18.2或其任何片段。该术语还包括天然存在的CLDN-18.2的变体,例如,剪接变体或等位变体。在一个优选实施方式中,CLDN-18.2是指来自人和食蟹猴CLDN-18.2全长或其片段(诸如其缺乏信号肽的成熟片段)。CLDN 18.2蛋白在多种肿瘤组织中高度表达,比如胃癌(60-80%)、胰腺癌(50%)、食管癌(30-50%)和肺癌(40-60%)等,但是在正常组织中几乎没有表达。
术语“人CD20”或“CD20”是指人CD20(UniProtKB/Swiss-Prot No.P11836)和包括由细胞(包括肿瘤细胞)天然表达或在用CD20基因或cDNA转染的细胞上表达的CD20的任何变体、同种型和物种同源物。物种同源物包括恒河猴CD20(macaca mulatta;UniProtKB/Swiss-Prot No H9YXP1)和食蟹猴。
术语“百分比(%)氨基酸序列同一性”或简称“同一性”定义为在将氨基酸序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性,且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后,候选氨基酸序列中的氨基酸残基与参比氨基酸序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性,例如,使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数,包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。
术语“免疫应答”是指由例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝产生可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用,该作用导致从人体选择性损害、破坏或清除侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或者在自体免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。
术语“信号转导途径”或“信号转导活性”是指通常由蛋白质间相互作用诸如生长因子对受体的结合启动的生化因果关系,所述关系导致信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分。一般地,传递包括引起信号转导的系列反应中的一种或多种蛋白质上的一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特定磷酸化。倒数第二过程通常包括细胞核事件,从而导致基因表达的变化。
术语“活性”或“生物活性”,或术语“生物性质”或“生物特征”此处可互换使用,包括但不限于表位/抗原亲和力和特异性、在体内或体外中和或拮抗CLDN-18.2活性的能力、IC50、抗体的体内稳定性和抗体的免疫原性质。本领域公知的抗体的其它可鉴定的生物学性质或特征包括,例如,交叉反应性(即通常与靶定肽的非人同源物,或与其它蛋白质或组织的交叉反应性),和保持哺乳动物细胞中蛋白质高表达水平的能力。使用本领域公知的技术观察、测定或评估前面提及的性质或特征,所述技术包括但不局限于ELISA、FACS或BIACORE等离子体共振分析、不受限制的体外或体内中和测定、受体结合、细胞因子或生长因子的产生和/或分泌、信号转导和不同来源(包括人类、灵长类或任何其它来源)的组织切片的免疫组织化学。
术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此,其以最广义使用,具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体。已知基本的抗体结构单位包含四聚体。每个四聚体包括两个相同的多肽链对,每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分或片段可包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分或片段可限定主要负责效应子功能的恒定区。通常将人轻链归类为κ和λ轻链。此外,通常将人重链归类为μ、δ、γ、α或ε,并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接,其中重链还包括约10多个氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental Immunology第7章(Paul,W.主编,第2版。Raven Press,N.Y.(1989))。
术语“分离的抗体”是指结合化合物的纯化状态,且在这种情况下意指该分子基本不含其它生物分子,例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质例如细胞碎片和生长培养基。术语“分离(的)”并非意指完全不存在这类物质或不存在水、缓冲液或盐,除非它们以明显干扰本文所述结合化合物的实验或治疗应用的量存在。
术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体,即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的,针对单一抗原表位。相比之下,常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征,且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
术语“多特异性抗体”是指包含两个或更多个抗原结合结构域,能够结合两个或更多个不同的表位(例如,两个、三个、四个或更多个不同的表位),表位可以在相同或不同的抗原上的抗体。多特异性抗体的示例包括结合两个不同抗原或两个不同表位的“双特异性抗体”。
术语“全长抗体”,是指在天然存在时包含四条肽链的免疫球蛋白分子:两条重(H)链(全长时约50-70kDa)和两条轻(L)链(全长时约25kDa)通过二硫键互相连接。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可被进一步细分为具有高可变性的互补决定区(CDR)和其间隔以更保守的称为框架区(FR)的区域。每一个VH或VL区由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
术语“重链恒定区”或“CH”此处可互换使用,是指包含至少三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)的区域。非限制性示例人重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性示例人重链恒定区还包括ε和μ。各重恒定区对应于抗体同种型。例如,包含γ恒定区的抗体是IgG抗体,包含δ恒定区的抗体是IgD抗体,并且包含α恒定区的抗体是IgA抗体。此外,包含μ恒定区的抗体是IgM抗体,并且包含ε恒定区的抗体是IgE抗体。某些同种型可以进一步再分成亚类。例如,IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)抗体;IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)抗体;并且IgM抗体包括但不限于IgM1和IgM2。
术语“CH1结构域”或“CH1”或“重链恒定区1”此处可互换使用,包括免疫球蛋白重链的第一(大多数胺基末端)恒定区结构域,其例如从Kabat编号系统中的大约位置114-223(EU位置118-215)延伸。CH1结构域与VH结构域和免疫球蛋白重链分子的铰链区的胺基末端相邻,并且不构成免疫球蛋白重链的Fc区的一部分,例如人IgG1 CH1结构域、IgG2 CH1结构域、IgG3 CH1结构域和IgG4 CH1结构域;及其天然存在变体。
术语“CH2结构域”或“CH2”或“重链恒定区2”此处可互换使用,包括重链免疫球蛋白分子的这样的部分,其例如从Kabat编号系统中的大约位置244-360(EU位置231-340)延伸。CH2结构域是独特的,因为它不与另一个结构域紧密配对。而是将两个N连接的支链糖类链插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。
术语“CH3结构域”或“CH3”或“重链恒定区3”此处可互换使用,包括重链免疫球蛋白分子的这样的部分,其从CH2结构域的末端例如从Kabat编号系统的大约位置361-476(EU位置341-445)延伸约110个残基。CH3结构域通常形成抗体的C末端部分。然而,在一些免疫球蛋白中,附加的结构域可以从CH3结构域延伸以形成分子的C末端部分(例如,IgM的μ链和IgE的e链中的CH4结构域)。
术语“轻链恒定区”或“CL”此处可互换使用,是指包含轻链恒定结构域(CL)的区域。非限制性示例轻链恒定区包括λ和κ。
术语抗体(“亲代抗体”)的“抗原结合片段”包括抗体的片段或衍生物,通常包括亲代抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)的至少一个片段,其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab,Fab',F(ab')2,Fv和dsFv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子,例如scFv;由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody、sdAb)和多特异性抗体。当抗原的结合活性在摩尔浓度基础上表示时,结合片段或衍生物通常保持其抗原结合活性的至少10%。优选结合片段或衍生物保持亲代抗体的抗原结合亲和力的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更高。还预期抗体的抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。术语“结合化合物”是指抗体及其结合片段两者。在本申请中,术语“Fab”或“Fab分子”通常是指含有重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的片段,并且还含有轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)。术语“Fab'”通常是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab的片段。术语“F(ab')2”通常是指Fab'的二聚体,包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fv”或“Fv分子”通常是指含有完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段;在某些情形中,该片段可以由一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密非共价结合的二聚体组成。术语“dsFv”通常是指二硫键稳定的Fv片段,其单个轻链可变区与单个重链可变区之间的键是二硫键。术语“sdAb片段”通常是指由VH结构域组成的抗体片段。
术语“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段,其中这些结构域存在于单条多肽链中。Fv多肽一般还包含VH和VL结构域之间的多肽接头,其使scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。
术语“Fc”或“Fc区”或“Fc片段”或“Fc结构域”此处可互换使用,在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”包含两个或三个恒定结构域,即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如,在天然抗体中,免疫球蛋白Fc结构域包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域);或者包含源自IgM和IgE类抗体的两条重链的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。本文中的Fc区也可包含铰链区。
术语“铰链区”是指抗体中位于CH1与CH2之间,富含脯氨酸,易伸展弯曲的多肽链。
术语“结构域抗体”是只含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些情况下,两个或更多个VH区与肽接头共价连接形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的2个VH区可靶向相同或不同的抗原。
术语“价”是指多肽中潜在的抗原结合位点的数目。每个抗原结合位点特异性地结合抗原分子上的一个抗原分子或特异性位点。当多肽包含多于一个抗原结合位点时,每个抗原结合位点可特异性地结合相同或不同的分子(例如,可结合不同的配体或不同的抗原,或结合相同抗原上的不同表位)。术语“二价”表示抗体包含两个抗原结合位点。术语“三价”表示抗体包含三个抗原结合位点。
术语“结合结构域”或“抗原结合结构域”或“抗原结合位点”系指抗体中这样的部分,其包含特异地与抗原之部分或全部结合,并与抗原之部分或全部成互补的区域。当抗原很大时,抗体可能只能结合到抗原的一个特定的部分,该部分被称为表位。结合结构域可包含重链和轻链可变结构域(VH和VL),其各自包括四个保守框架区(FR)和三个CDR。CDR在序列上变化并确定对特定抗原的特异性。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合部位的小抗体片段,所述片段包含在同一多肽链(VH-VL或VL-VH)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用短得不允许在同一链的两个结构域之间配对的接头,迫使该结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位。
术语“嵌合抗体”是具有第一抗体的可变结构域和第二抗体的恒定结构域的抗体,其中第一抗体和第二抗体来自不同物种。通常,可变结构域获自啮齿动物等的抗体(“亲代抗体”),而恒定结构域序列获自人抗体,使得与亲代啮齿动物抗体相比,所得嵌合抗体在人受试者中诱导不良免疫应答的可能性较低。
术语“人源化抗体”是指含有来自人和非人(例如小鼠、大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言,人源化抗体包含基本所有的至少一个、通常两个可变结构域,其中所有或基本所有的超变环相当于非人免疫球蛋白的超变环,而所有或基本所有的构架(FR)区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体任选可包含至少一部分的人免疫球蛋白恒定区(Fc)。
术语“全人抗体”是指只包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如在小鼠中、在小鼠细胞中或在来源于小鼠细胞的杂交瘤中产生,则全人抗体可含有鼠糖链。同样,“小鼠抗体”是指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。或者,如果在大鼠中、在大鼠细胞中或在来源于大鼠细胞的杂交瘤中产生,则全人抗体可含有大鼠糖链。同样,“大鼠抗体”是指仅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
“同种型”抗体是指由重链恒定区基因提供的抗体种类(例如,IgM、IgE、IgG诸如IgGl、IgG2或IgG4)。同种型还包括这些种类之一的修饰形式,其中修饰已被产生来改变Fc功能,例如以增强或减弱效应子功能或对Fc受体的结合。
术语“表位”是指抗体所结合的抗原区域。表位可以由连续的氨基酸形成或者通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。特异性结合可以例如通过测定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量,所述对照分子通常是具有不具有结合活性的类似结构的分子。例如,特异性结合可以通过与类似于靶的对照分子竞争来确定。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由平衡解离常数(KD)代表,平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别是kdis和kon)的比值。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。
术语“不结合”蛋白或细胞是指,不与蛋白或细胞结合,或者不以高亲和力与其结合,即结合蛋白或细胞的KD为1.0×10-6M或更高,更优选1.0×10-5M或更高,更优选1.0×10-4M或更高、1.0×10-3M或更高,更优选1.0×10-2M或更高。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言,是指对于抗原的KD为1.0×10-6M或更低,优选5.0×10-8M或更低,更优选1.0×10-8M或更低、5.0×10-9M或更低,更优选1.0×10-9M或更低。对于其他抗体亚型,“高亲和性”结合可能会变化。例如,IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10-6M或更低,优选10-7M或更低,更优选10-8M或更低。
术语“抗体依赖的细胞毒性”、“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的免疫防御,其中免疫系统效应细胞主动地将细胞膜表面抗原与抗体,例如Claudin18.2抗体,结合的靶细胞例如癌细胞裂解。
术语“补体依赖的细胞毒性”或“CDC”是指IgG和IgM抗体的效应功能,当与表面抗原结合时引发典型的补体途径,包括形成膜攻击复合体以及靶细胞裂解。本发明的抗体,与Claudin 18.2结合时,引发对癌细胞的CDC。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确地限制,否则术语包括具有与参照核酸相似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢的含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸(参见,属于Kariko等人的美国专利No.8,278,036,其公开了尿苷被假尿苷替代的mRNA分子,合成所述mRNA分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白的方法)。除非另有所指,否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如,简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地,简并密码子取代可通过生成其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“构建体”是指任何重组多核苷酸分子(诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子),衍生自任何来源,能够与基因组整合或自主复制,构成如下多核苷酸分子,其中已经以功能操作的方式连接(即,可操作地连接)一或多个多核苷酸分子。重组构建体通常会包含可操作地连接至转录起始调节序列的本发明的多核苷酸,这些序列会导引多核苷酸在宿主细胞中的转录。可使用异源及非异源(即,内源)启动子两者导引本发明的核酸的表达。
术语“载体”是指任何重组多核苷酸构建体,该构建体可用于转化的目的(即将异源DNA引入到宿主细胞中)。一种类型的载体为“质粒”,是指环状双链DNA环,可将额外DNA区段连接至该环中。另一类型的载体为病毒载体,其中可将额外DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在被引入到的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。在引入到宿主细胞中后,其他载体(例如,非游离型哺乳动物载体)整合至宿主细胞的基因组中,且因此与宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够导引被操作性连接的基因的表达。本文将此类载体称为“表达载体”。
术语“表达载体”是指能够在转化、转染或转导至宿主细胞中时复制及表达目的基因的核酸分子。表达载体包含一或多个表型选择标记及复制起点,以确保维护载体及以在需要的情况下于宿主内提供扩增。
用于细胞或受体的“活化”、“刺激”和“处理”可具有相同含义,例如细胞或受体用配体活化、刺激或处理,除非上下文另外或明确规定。“配体”包括天然和合成配体,例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和来源于抗体的结合化合物。“配体”还包括小分子,例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可指通过内部机制以及外部或环境因素调节的细胞活化。“应答/反应”,例如细胞、组织、器官或生物体的应答,包括生化或生理行为(例如生物区室内的浓度、密度、粘附或迁移、基因表达速率或分化状态)的改变,其中改变与活化、刺激或处理有关,或者与例如遗传编程等内部机制有关。
如本文中所用,术语任何疾病或病症的“治疗”或“医治”在一个实施方式中是指改善疾病或病症(即,减缓或阻止或减少疾病的进展或其临床症状的至少一个)。在另一个实施方式中,“治疗”或“医治”是指缓解或改善至少一个身体参数,包括可能不能被患者辨别出的那些物理参数。在另一个实施方式中,“治疗”或“医治”是指在身体上(例如,可辨别的症状的稳定)、生理上(例如,身体参数的稳定)或在这两方面调节疾病或病症。除非在本文中明确描述,否则用于评估疾病的治疗和/或预防的方法在本领域中通常是已知的。
“受试者”或“对象”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物,例如哺乳动物和非哺乳动物,诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。如本文中所用,术语“cyno”或“食蟹猴”是指食蟹猴。
“联合”一种或多种其它治疗剂的施用包括同时(共同)施用和任意次序的连续施用。
“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指本发明的CLDN-18.2抗体或其抗原结合片段当单独或与其它治疗药物组合给予细胞、组织或受试者时,有效预防或改善一种或多种疾病或病况的症状或该疾病或病况的发展的量。治疗有效剂量还指足以导致症状改善的抗体或其抗原结合片段的量,例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病况或者提高这类病况的治疗、治愈、预防或改善的速度的量。当对个体施用单独给予的活性成分时,治疗有效剂量仅是指该成分。当组合施用时,治疗有效剂量是指引起治疗效果的活性成分的综合量,不论是组合、依次给予还是同时给予。治疗剂的有效量将导致诊断标准或参数提高至少10%;通常至少20%;优选至少约30%;更优选至少40%,最优选至少50%。
“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症可以是实体瘤和血液肿瘤,包括但不限于癌,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌,肺癌(包括小细胞肺癌,非小细胞肺癌,肺的腺癌,和肺的鳞癌),腹膜癌,肝细胞癌,胃的癌或胃癌(包括胃肠癌),胰腺癌,成胶质细胞瘤,宫颈癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝瘤(hepatoma),乳腺癌,结肠癌,结肠直肠癌,子宫内膜癌或子宫癌,唾液腺癌,肾癌或肾的癌,肝癌,前列腺癌,外阴癌,甲状腺癌,肝的癌,及各种类型的头和颈癌,以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL),小淋巴细胞性(SL)NHL,中级/滤泡性NHL,中级弥漫性NHL,高级成免疫细胞性NHL,高级成淋巴细胞性NHL,高级小无核裂细胞性NHL,贮积病(bulky disease)NHL,套细胞淋巴瘤,AIDS相关淋巴瘤,和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),急性成淋巴细胞性白血病(ALL),毛细胞性白血病,慢性成髓细胞性白血病,和移植后淋巴增殖性病症(PTLD),以及与瘢痣病(phakomatoses),水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。
“细胞因子风暴(cytokine storm)”是指机体体液中多种细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等迅速大量产生的现象,是引起急性呼吸窘迫综合征和多脏器衰竭的重要原因。细胞因子释放综合征(CRS)指淋巴细胞在应用单克隆抗体、细胞因子等治疗或感染后出现活化、溶解,并释放出大量细胞因子所导致的一组临床综合征。
抗体
术语“抗CD3抗体”、“抗CD3”、“CD3抗体”、“与CD3结合”或“结合CD3”是指能够以足够的亲合力结合CD3蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向CD3的诊断剂和/或治疗剂。
术语“抗CLDN-18.2抗体”、“抗CLDN-18.2”、“CLDN-18.2抗体”、“与CLDN-18.2结合”或“结合CLDN-18.2”是指能够以足够的亲合力结合CLDN-18.2蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向CLDN-18.2的诊断剂和/或治疗剂。
术语“抗CD20抗体”、“抗CD20”、“CD20抗体”、“与CD20结合”或“结合CD20”是指能够以足够的亲合力结合CD20蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向CD20的诊断剂和/或治疗剂。
本发明所述人源化的抗CD3抗体是以抗体JSCD3为起始进行突变得到,具有许多独特的性能和优势,其中抗体JSCD3参见专利申请CN202110468621.2和PCT/CN2021/113033。这些新的特性使这一新的人源化抗体更适合于抗体药物的开发。具体而言,本发明优化的抗体序列,抗体蛋白的表达量高,热稳定性好,与人和食蟹猴CD3抗原都有较好的亲和力,且能有效激活T细胞下游信号通路;在用于双特异性抗体制备时,显示出更强的肿瘤杀伤活性,并且能够降低引起细胞因子释放综合征的风险。本发明的公开的这一人源化序列比其他公司的人源化序列有更多的优势和特点,用于制备抗肿瘤新药显示出更好的杀肿瘤活性,而且理化稳定性也大幅度提高,更适合于抗肿瘤药物的筛选和开发,这一创造性的成就构成了本发明的有益的效果和极高的医疗应用价值。
在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗体,其包含第一结合结构域、第二结合结构域和第三结合结构域,其中所述第一结合结构域与CD3结合,所述第二结合结构域和所述第三结合结构域各自与肿瘤相关抗原结合,所述第一结合结构域具有Fab分子或Fv分子或scFv分子的形式,所述第二结合结构域具有Fab分子或Fv分子或scFv分子的形式,和所述第三结合结构域具有Fab分子的形式。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域具有Fab分子的形式,所述第二结合结构域具有Fv分子或scFv分子的形式,和所述第三结合结构域具有Fab分子的形式。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域具有Fab分子的形式,所述第二结合结构域具有Fv分子的形式,和所述第三结合结构域具有Fab分子的形式。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域具有Fab分子的形式,所述第二结合结构域具有scFv分子的形式,和所述第三结合结构域具有Fab分子的形式。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域具有Fv分子的形式,所述第二结合结构域具有Fab分子的形式,和所述第三结合结构域具有Fab分子的形式。
在一些实施方式中,本发明所述的肿瘤相关抗原选自BCMA、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CDK4、CEA、Claudin 18.2、EGFR、ROR1、TGF-β和5T4;优选地,所述肿瘤相关抗原是Claudin 18.2、CD20或BCMA。
在一些实施方式中,本发明所述双特异性抗体具有四条多肽链,其中所述第一多肽链自N端到C端具有VH1-CH1-连接肽-VL2-连接肽-铰链区-第一Fc区,所述第二多肽链自N端到C端具有VL1-CL-连接肽-VH2;所述第三多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-铰链区-第二Fc区,所述第四多肽链自N端到C端具有VL2-CL。其中,所述VH1和VL1形成一结构域,所述VH2和VL2形成一结构域。在一些实施方式中,本发明所述第一多肽链的VH1-CH1与所述第二多肽链的VL1-CL形成所述第一结合结构域,所述第一多肽链的VL2与所述第二多肽链的VH2形成所述第二结合结构域,所述第三多肽链的VH2-CH1与所述第四多肽链的VL2-CL形成所述第三结合结构域。
在一些实施方式中,本发明所述双特异性抗体具有四条多肽链,其中所述第一多肽链自N端到C端具有VH1-CH1-连接肽-VL2-连接肽-VH2-连接肽-铰链区-第一Fc区,所述第二多肽链自N端到C端具有VL1-CL;所述第三多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-铰链区-第二Fc区,所述第四多肽链自N端到C端具有VL2-CL。其中,所述VH1和VL1形成一结构域,所述VH2和VL2形成一结构域。在一些实施方式中,本发明所述第一多肽链的VH1-CH1与所述第二多肽链的VL1-CL形成所述第一结合结构域,所述第一多肽链的VL2-连接肽-VH2形成所述第二结合结构域,所述第三多肽链的VH2-CH1与所述第四多肽链的VL2-CL形成所述第三结合结构域。
在一些实施方式中,本发明所述双特异性抗体具有四条多肽链,其中所述第一多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-连接肽-VL1-连接肽-铰链区-第一Fc区,所述第二多肽链自N端到C端具有VL2-CL-连接肽-VH1;所述第三多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-铰链区-第二Fc区,所述第四多肽链自N端到C端具有VL2-CL。在一些实施方式中,本发明所述第一多肽链的VH2-CH1与所述第二多肽链的VL2-CL形成第二结合结构域,所述第一多肽链的VL1与所述第二多肽链的VH1形成第一结合结构域,所述第三多肽链的VH2-CH1与所述第四多肽链的VL2-CL形成第三结合结构域。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为:
HCDR1:X1YAMN(SEQ ID NO:168),其中,X1为T或K;
HCDR2:RIRSKYNNYATYYAX2SVKX3(SEQ ID NO:169),其中,X2为D或A,X3为D或G;
HCDR3:HGX3X4GX5X6X7X8X9X10X11AY(SEQ ID NO:170),其中,X3为N或A,X4为F或A,X5为N或A,X6为S或A,X7为Y或A,X8为V或A,X9为S或A,X10为W或A,X11为F或A;
LCDR1:X12SSTGAVTTX13NYX14N(SEQ ID NO:171),其中,X12为R或G,X13为S或G,X14为A或P;
LCDR2:GTNKRAP(SEQ ID NO:172);
LCDR3:AX15X16X17X18X19X20X21X22(SEQ ID NO:173),其中,X15为L或A,X16为W或A,X17为Y或A,X18为S或A,X19为N或A,X20为L或A,X21为W或A,X22为V或A。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3或4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5-22中任一项所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23或24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQID NO:25所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:26-42中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3;其中,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3为:
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3;或
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3;或
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5-22中任一项所示的HCDR3;
所述LCDR1、LCDR2、LCDR3为:
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的LCDR3;或
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26-42中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为:
HCDR1:X1YAMN,其中,X1为T或K(优选为K);
HCDR2:RIRSKYNNYATYYAX2SVKX3,其中,X2为D或A(优选为A),X3为D或G(优选为G);
HCDR3:HGX3X4GX5X6X7X8X9X10X11AY,其中,X3为N,X4为F,X5为N或A,X6为S或A,X7为Y或A,X8为V或A,X9为S或A,X10为W,X11为F或A(优选为F);
LCDR1:X12SSTGAVTTX13NYX14N,其中,X12为R或G(优选G),X13为S或G(优选G),X14为A或P(优选P);
LCDR2:GTNKRAP;
LCDR3:AX15X16X17X18X19X20X21X22,其中,X15为L或A(优选L),X16为W,X17为Y或A(优选Y),X18为S或A(优选S),X19为N或A(优选N),X20为L或A(优选L),X21为W,X22为V或A。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3或4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5、9、10、11、15、17、18、19或20所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23或24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、30、33、35、36、37、39、40、41或42所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的LCDR3;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、33、36或37中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、35、37、39或40中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、33、40、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、33、35、36、37、40、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26或30所示的LCDR3;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33、35、36、37或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、35、36、37、39、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、33、35、36、40、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:9、10或19中任一项所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ IDNO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(Ⅻ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:43-62中任一项所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63-81中任一项所示的VL。在一些实施方案中,本发明所述第一结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:43-45、49-51、55和57-60中任一项所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63-65、67、69、72、74-76和78-81中任一项所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述第一结合结构域包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示的VL;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65、67、72、75或76所示的VL;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、74、76、78或79所示的VL;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、72、79、80或81所示的VL;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65、67、72、74、75、76、79、80或81所示的VL;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65或69所示的VL;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:72、74、75、76或81所示的VL;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、74、75、76、78、80或81所示的VL;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、72、74、75、79、80或81所示的VL;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:49、50或59所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的VL;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的VL;或
(Ⅻ)氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述第二结合结构域和第三结合结构域与Claudin18.2结合,其分别包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:121所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ IDNO:122所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:123所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:124所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:125所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:126所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第二结合结构域和第三结合结构域与CD20结合,其分别包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:127所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:128所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:129所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:131所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:132所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述第二结合结构域和第三结合结构域与Claudin18.2结合,其分别包含:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:133所示的VH,和氨基酸序列如SEQ IDNO:134所示的VL;或(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:166所示的VH,和氨基酸序列如SEQ IDNO:167所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述第二结合结构域和第三结合结构域与CD20结合,其分别包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:135所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述第一Fc区为knob-Fc,所述第二Fc区为hole-Fc。
在一些实施方式中,本发明所述第一Fc区与所述第二Fc区之间通过铰链区的二硫键和杵臼结构连接。
在一些实施方式中,本发明所述第一Fc区和/或第二Fc区为来自IgG的Fc区,优选为来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。
在一些实施方式中,本发明所述第CH1为来自IgG的CH1,优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1。
在一些实施方式中,本发明所述CL为来自λ或κ轻链的CL。
在一些实施方式中,本发明连接肽可以是包含G(甘氨酸)、S(丝氨酸)和A(丙氨酸)或由G和S组成的柔性多肽,其长度可为2-30个氨基酸残基;进一步优选地,连接肽包括但不限于(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n和AS(GGGGS)n等,n可为1-6的整数,如1、2、3、4、5、6。
在一些实施方案中,本发明所述第一结合结构域的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3来自表2-5中样品MFI与JSCD3 MFI比值在0.30-0.80之间的任意单克隆抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述双特异性抗体具有四条多肽链,所述四条多肽链分别为:
(1)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列;或
(2)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列;或
(3)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:148所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列;或
(4)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:150所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列;或
(5)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:155所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列;或
(6)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列;或
(7)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:164所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列。
在又一个方面,本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段,其包含结合CD3的结合结构域,其中,所述结合CD3的结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为:
HCDR1:X1YAMN,其中,X1为T或K;
HCDR2:RIRSKYNNYATYYAX2SVKX3,其中,X2为D或A,X3为D或G;
HCDR3:HGX3X4GX5X6X7X8X9X10X11AY,其中,X3为N或A,X4为F或A,X5为N或A,X6为S或A,X7为Y或A,X8为V或A,X9为S或A,X10为W或A,X11为F或A;
LCDR1:X12SSTGAVTTX13NYX14N,其中,X12为R或G,X13为S或G,X14为A或P;
LCDR2:GTNKRAP;
LCDR3:AX15X16X17X18X19X20X21X22,其中,X15为L或A,X16为W或A,X17为Y或A,X18为S或A,X19为N或A,X20为L或A,X21为W或A,X22为V或A;
条件是,所述结合CD3的结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3不同时为:氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
在一些实施方式中,所述结合CD3的结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为:
HCDR1:X1YAMN,其中,X1为T或K(优选为K);
HCDR2:RIRSKYNNYATYYAX2SVKX3,其中,X2为D或A(优选为A),X3为D或G(优选为G);
HCDR3:HGX3X4GX5X6X7X8X9X10X11AY,其中,X3为N,X4为F,X5为N或A,X6为S或A,X7为Y或A,X8为V或A,X9为S或A,X10为W,X11为F或A(优选为F);
LCDR1:X12SSTGAVTTX13NYX14N,其中,X12为R或G(优选G),X13为S或G(优选G),X14为A或P(优选P);
LCDR2:GTNKRAP;
LCDR3:AX15X16X17X18X19X20X21X22,其中,X15为L或A(优选L),X16为W,X17为Y或A(优选Y),X18为S或A(优选S),X19为N或A(优选N),X20为L或A(优选L),X21为W,X22为V或A;
条件是,所述结合CD3的结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3不同时为:氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ IDNO:1或2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3或4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ IDNO:5-22中任一项所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23或24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:26-42中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3:
所述HCDR1、HCDR2、HCDR3为:
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3;或
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3;或
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5-22中任一项所示的HCDR3;
所述LCDR1、LCDR2、LCDR3为:
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的LCDR3;或
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26-42中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ IDNO:1或2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3或4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ IDNO:5、9、10、11、15、17、18、19或20所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23或24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、30、33、35、36、37、39、40、41或42所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的LCDR3;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、33、36或37所示的LCDR3;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、35、37、39或40所示的LCDR3;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、33、40、41或42所示的LCDR3;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、33、35、36、37、40、41或42所示的LCDR3;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26或30所示的LCDR3;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33、35、36、37或42所示的LCDR3;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、35、36、37、39、41或42所示的LCDR3;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、33、35、36、40、41或42所示的LCDR3;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:9、10或19所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示的LCDR3;或
(Ⅻ)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ IDNO:43-62中任一项所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63-81中任一项所示的VL。在一些实施方案中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:43-45、49-51、55和57-60中任一项所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63-65、67、69、72、74-76和78-81中任一项所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD3的结合结构域包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示的VL;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65、67、72、75或76所示的VL;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、74、76、78或79所示的VL;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、72、79、80或81所示的VL;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65、67、72、74、75、76、79、80或81所示的VL;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65或69所示的VL;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:72、74、75、76或81所示的VL;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、74、75、76、78、80或81所示的VL;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、72、74、75、79、80或81所示的VL;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:49、50或59所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的VL;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示的VL;或
(Ⅻ)氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:82-101中任一项所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:102-120中任一项所示的轻链。在优选的实施方案中,本发明所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:82-84、88-90、94和96-99中任一所示,轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:102-104、106、108、111、113-115和117-120中任一所示。
在一些实施方式中,本发明所述抗体包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:83所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:103所示的轻链;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:84所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:104、106、111、114或115所示的轻链;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:88所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:106、113、115、117或118所示的轻链;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:89所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:106、111、118、119或120所示的轻链;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:90所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:104、106、111、113、114、115、118、119或120所示的轻链;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:94所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:104或108所示的轻链;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:111、113、114、115或120所示的轻链;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:97所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:106、113、114、115、117、119或120所示的轻链;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:99所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:106、111、113、114、118、119或120所示的轻链;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:88、89或98所示的重链,和氨基酸序列如SEQ IDNO:102所示的轻链;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:98所示的重链,和氨基酸序列如SEQ ID NO:114所示的轻链。
在一些实施方式中,本发明所述抗体是单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体,所述抗原结合片段为Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dsFv、scFv或sdAb。
在一些实施方案中,本发明所述抗体是特异性结合CD3的单克隆抗体,其HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如前文任一实施方案所述;或其VH和VL如前文任一实施方案所述,或其CH和CL如前文任一实施方案所述;条件是,所述单克隆抗体的VH不是SEQ IDNO:43所示的氨基酸序列,且VL不是SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列,或所述单克隆抗体的CH不是SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列,且CL不是SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明所述抗体是特异性结合CD3的单克隆抗体,其HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3来自表2-5中样品MFI与JSCD3 MFI比值在0.30-0.80之间的任意单克隆抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3,或其VH和VL来自表2-5中样品MFI与JSCD3 MFI比值在0.30-0.80之间的任意单克隆抗体的VH和VL,或其CH和CL来自表2-5中样品MFI与JSCD3 MFI比值在0.30-0.80之间的任意单克隆抗体的CH和CL。
在一些实施方式中,本发明所述抗体或其抗原结合片段还包含一个或两个结合肿瘤相关抗原的结合结构域。
在一些实施方式中,本发明所述肿瘤相关抗原选自BCMA、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CDK4、CEA、Claudin 18.2、EGFR、ROR1、TGF-β和5T4;优选地,所述肿瘤相关抗原是Claudin 18.2、CD20或BCMA。
在一些实施方式中,本发明所述肿瘤相关抗原是Claudin 18.2或CD20。在一些实施方式中,本发明所述结合Claudin 18.2的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:121所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:122所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:123所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:124所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:125所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:126所示的LCDR3。在一些实施方式中,本发明所述结合CD20的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:127所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQID NO:128所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:129所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ IDNO:130所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:131所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ IDNO:132所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明所述结合Claudin 18.2的结合结构域包含:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:133所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:134所示的VL;或(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:166所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:167所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述结合CD20的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQID NO:135所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示的VL。
在一些实施方式中,本发明提供了一种抗体(优选为双特异性抗体),其包含结合CD3的结合结构域和结合CD20的结合结构域,其中,所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO:25所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;所述结合CD20的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:127所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:128所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:129所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:131所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:132所示的LCDR3。
在一些实施方式中,本发明提供了一种抗体(优选为双特异性抗体),其包含结合CD3的结合结构域和结合CD20的结合结构域,其中,所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的VL,所述结合CD20的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:135所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示的VL。
在一些实施方式中,本发明所述抗体的Fc区为来自IgG的Fc,例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc,和/或所述抗体的CL为来自λ或κ轻链的CL;优选地,所述Fc区包含杵臼结构。
在一些实施方式中,本发明所述抗体具有四条多肽链,所述四条多肽链分别为:
(1)具有如SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,具有如SEQID NO:143所示的氨基酸序列;或
(2)具有如SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(3)具有如SEQ ID NO:148所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(4)具有如SEQ ID NO:150所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(5)具有如SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:155所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(6)具有如SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(7)具有如SEQ ID NO:164所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列的第四多肽链。
本发明的所述抗体的可变区CDR的精确氨基酸序列边界可使用许多公知的方案的任何方案来确定,包括基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883;Al-Lazikani等人,“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath),Contact(University College London),国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(1999NucleicAcids Research,27,209-212),以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。本发明抗体的CDR可以由本领域的技术人员根据本领域的任何方案(例如不同的指派系统或组合)确定边界。
应该注意,基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此,在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时,所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体,其可变区序列包含所述的具体CDR序列,但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
具有不同特异性(即,针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而,尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的,但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少两种,可以确定最小重叠区域,从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了,通过抗体的结构和蛋白折叠,可以确定CDR序列其余部分的残基。因此,本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如,在一个CDR的变体中,最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变,而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
本发明所述的人源化抗体,可以使用本领域已知的方法将鼠源CDR区插入人种系框架区。参见Winter等人的美国专利No.5,225,539及Queen等人的美国专利No.5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370。
在一些实施方式中,氨基酸变化包括氨基酸缺失、插入或置换。在一些实施方式中,本发明的抗CLDN-18.2抗体或其抗原结合片段包括具有已通过氨基酸缺失、插入或置换突变的,但仍与上述抗体(特别地在上述序列中描绘的CDR区中)有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的那些抗体。在一些实施方式中,本发明的抗体与具体序列中描绘的CDR区相比较时,在CDR区中已通过氨基酸缺失、插入或置换的氨基酸突变不超过1、2、3、4或5个。
在一些实施方式中,编码本发明抗体的多核苷酸包括已通过核苷酸缺失、插入或置换突变的,但仍然与上文中所述的序列中描绘的CDR对应编码区具有至少约60、70、80、90、95或100%同一性的多核苷酸。
在一些实施方式中,可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰,以此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在一些实施方式中,可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体,例如“硫代MAb”,其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。
在一些实施方式中,本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括,但不限于,水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括,但不限于,聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
在一些实施方案中,双特异性抗体的第一结合结构域和第二结合结构域可以通过接头彼此连接,再进一步结合至第一Fc区;第三结合结构域结合至第二Fc区。在一些实施方案中,接头是肽接头。
本发明的双特异性抗体的Fc区可以是人Fc区。本发明的双特异性抗体的Fc区可以是任何同种型,包括但不限于IgG1,IgG2,IgG3或IgG4。在一些实施方案中,所述第一和所述第二抗体的Fc区都是IgG1同种型。在一些实施方案中,所述第一和所述第二抗体的Fc区都是IgG4同种型。在一些实施方案中,所述抗体的Fc区之一是IgG1同种型而另一个是IgG4同种型。在后一个实施方案中,所得到的双特异性抗体包含IgG1的Fc区和IgG4的Fc区,因此就效应子功能的激活而言可具有令人感兴趣的中间特性。
术语“Knob into Hole结构”或“杵臼结构”,是将抗体Fc的CH3的疏水氨基酸进行突变。将一条链CH3的侧链氨基酸突变形成分子比较大的疏水氨基酸(knob),以加强疏水作用力;另一个CH3侧链氨基酸突变形成小的氨基酸(hole),用于减少空间位阻;突变后带有Knob的和带有Hole的CH3以疏水作用形式形成Knob into Hole结构(KiH),有利于重链异源二聚体的形成;KiH突变主要是发生在CH3结构域的空间结构的内部疏水氨基酸,突变后暴露在外面的氨基酸几乎没有变化,所以不影响Fc的效应功能和引起的免疫原性。术语“knob-Fc”是指在抗体Fc区包含T366W的点突变,以形成类似knob的空间结构。相对应地,“hole-Fc”是指在抗体Fc区包含T366S、L368A、Y407V的点突变,以形成类似hole的空间结构。为进一步地促进异二聚体的形成,还可在knob-Fc和hole-Fc分别引入S354C和Y349C的点突变,通过二硫键进一步促进异二聚体的形成。同时,为了减弱和蛋白A的结合,还可在hole-Fc分别引入H435R和Y436F的点突变。
在本发明的双特异性抗体的背景下,与指定的Fc区嵌合形式相比,Fc区可以包含一个或多个氨基酸改变(例如,插入,缺失或取代),而不改变所需的功能性。例如,本发明包括在Fc区中包含一个或多个修饰的双特异性抗原结合分子,其导致在Fc和FcRn之间具有修饰的结合相互作用(例如增强或减弱)的修饰的Fc区。此类Fc修饰的非限制性实例包括例如人IgG4 Fc区的氨基酸序列的位置228处的丝氨酸(“S”)至脯氨酸(“P”)的突变。
双特异性抗体形式
本发明提供双特异性抗体,其有效地促进T细胞介导的对肿瘤细胞的杀灭。取决于具体用途的合意的功能性质,具体的抗原结合区可以选自本发明所提供的抗体或抗原结合区的组,或与本发明所提供的抗体或抗原结合区共享例如表位或交叉阻断区的那些抗体或抗原结合区。本领域已知双特异性抗体的许多不同的形式和用途,且由Chames和Baty(2009)Curr Opin Drug Disc Dev12:276所综述。
在一些实施方案中,本发明包含结合CD3的抗原结合位点和结合肿瘤相关抗原的抗原结合位点的抗体可以是双特异性抗体,其中双特异性抗体可以采用广泛多种构形,例如为含Fc片段的双特异性抗体(IgG-like双特异性抗体)与不含Fc片段的双特异性抗体(non-IgG-like双特异性抗体)。IgG-like双特异性抗体主要包括Triomabs/quadroma、DVD-Ig(dual variable domain Ig)、CrossMAb、Two-in-one IgG、scFv2-Fc。non-IgG-like双特异性抗体主要包括TandAb(tandem diabody)、scFv-HSA-scFv、BiTE(bi-specific T-cellengager)、DART(dual affinity retargeting)、Nanobody。本发明的例示性双特异性抗体分子具有四条多肽链,其中(a)所述第一多肽链自N端到C端具有VH1-CH1-连接肽-VL2-连接肽-铰链区-第一Fc区,所述第二多肽链自N端到C端具有VL1-CL-连接肽-VH2;所述第三多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-铰链区-第二Fc区,所述第四多肽链自N端到C端具有VL2-CL;或(b)其中所述第一多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-连接肽-VL1-连接肽-铰链区-第一Fc区,所述第二多肽链自N端到C端具有VL2-CL-连接肽-VH1;所述第三多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-铰链区-第二Fc区,所述第四多肽链自N端到C端具有VL2-CL。其中,所述连接肽包含G(甘氨酸)、S(丝氨酸)和A(丙氨酸)或由G和S组成的柔性多肽,其长度可为2-30个氨基酸残基;进一步优选地,连接肽包括但不限于(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n和AS(GGGGS)n等,n可为1-6的整数。该双特异性抗体形式具有许多独特的性能和优势,例如优异的稳定性,毒性低,在用于多个靶点的双特异性抗体制备时都显示出优异的肿瘤杀伤活性。
在一个实施方案中,本发明的双特异性抗体是双抗体、交叉抗体(cross-body)、或通过受控的Fab臂交换所获得的双特异性抗体。
不同种类的双特异性抗体的实例包括但不限于:
1)带有迫使异二聚化的互补性CH3域的IgG样分子;
2)重组IgG样双靶向性分子,其中所述分子的两面每个都包含至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的部分;
3)IgG融合分子,其中将全长IgG抗体融合至另外的Fab片段或Fab片段的部分;
4)Fc融合分子,其中将单链Fv分子或稳定化(stabilized)的双抗体融合至重链恒定域、Fc区或其部分;
5)Fab融合分子,其中将不同Fab片段融合至一起;
6)基于scFv和双抗体和重链抗体(例如,域抗体、纳米抗体)的抗体,其中将不同的单链Fv分子或不同双抗体或不同重链抗体(例如,域抗体、纳米抗体)彼此融合或融合至另一个蛋白质或载体分子。
带有互补性CH3域分子的IgG样分子的实例包括但不限于Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、Knobs-into-Holes(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电配对的(the electrostatically-matched)(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、StrandExchange Engineered Domain body(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)、和DuoBody(Genmab A/S)。
重组IgG样双靶向性分子的实例包括但不限于Dual Targeting(DT)-Ig(GSK/Domantis)、Two-in-one Antibody(Genentech)、Cross-linked Mabs(Karmanos CancerCenter)、mAb2(F-Star)、和CovX-body(CovX/Pfizer)。
IgG融合分子的实例包括但不限于Dual Variable Domain(DVD)-Ig(Abbott)、IgG样Bispecific(ImClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)、和TvAb(Roche)。
Fc融合分子的实例包括但不限于scFv/Fc Fusions(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、DualAffinityRetargeting Technology(Fc-DART)(MacroGenics)、和Dual(scFv)2-Fab(抗体药物国家工程研究中心,中国)。
Fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action or Bis-Fab(Genentech)、Dock-and-Lock(DNL)(ImmunoMedics)、BivalentBispecific(Biotecnol)、和Fab-Fv(UCB-Celltech)。
基于scFv、双抗体和域抗体的实例包括但不限于Bispecific T Cell Engager(BiTE)(Micromet,Tandem Diabody(Tandab)(Affimed)、Dual Affinity RetargetingTechnology(DART)(MacroGenics)、Single-chain Diabody(Academic)、TCR-likeAntibodies(AIT,ReceptorLogics)、Human SerumAlbumin scFv Fusion(Merrimack)和COMBODY(Epigen Biotech)、双靶向性纳米抗体(dual targeting nanobodies)(Ablynx)、双靶向性仅重链域抗体(dualtargeting heavy chain only domain antibodies)。
抗体表达
在又一个方面,本发明提供了一种多核苷酸,其编码如本文所述的双特异性抗体。所述多核苷酸可以包含编码双特异性抗体的4条多肽链的氨基酸序列的多核苷酸。
在又一个方面,本发明提供了一种表达载体,其包含如本文所述的多核苷酸,优选地,所述载体为真核表达载体。在一些实施方式中,如本文所述的多核苷酸包含在一个或多个表达载体中。
在又一个方面,本发明提供了一种宿主细胞,其包含如本文所述的多核苷酸或如本文所述的表达载体,优选地,所述宿主细胞是真核细胞,更优选哺乳动物细胞。
在又一个方面,本发明提供了一种用于制备如本文所述的双特异性抗体的方法,所述方法包括在适合于所述抗体表达的条件下在本文所述的宿主细胞中表达所述抗体,并从所述宿主细胞回收所表达的抗体。
本发明提供用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞,包括可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的许多永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2/0细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞、A549细胞、293T细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过测定哪种细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。
在一个实施方式中,本发明提供制备本文所述的双特异性抗体的方法,其中所述方法包括,将表达载体导入哺乳动物宿主细胞中,培养宿主细胞足够的一段时间,以允许抗体在宿主细胞中表达或者更优选使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中,以产生抗体。可采用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
很可能由不同细胞系表达或在转基因动物中表达的抗体彼此具有不同的糖基化。然而,由本文提供的核酸分子编码的或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体是本发明的组成部分,而不论抗体的糖基化如何。同样,在某些实施方式中,非岩藻糖基化抗体是有利的,因为它们通常在体外和体内具有比其岩藻糖基化对应物更强力的功效,并且不可能是免疫原性的,因为它们的糖结构是天然人血清IgG的正常组分。
药物组合物和药物制剂
在又一个方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含如本文任一实施方案所述的双特异性抗体、多核苷酸、表达载体或宿主细胞,和药学上可接受的载体或赋形剂。
在又一个方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含如本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、表达载体或宿主细胞,和药学上可接受的载体或赋形剂。
应理解,本文所述的药物组合物可以整合制剂中合适的运载体、赋形剂和其他试剂以联合给药,从而提供改善的转移、递送、耐受等。
术语“药物组合物”指这样的制剂,其允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在,并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
可以通过将具有所需纯度的本文所述的双特异性抗体与一种或多种任选的药用辅料(Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编辑(1980))混合来制备包含本文所述的双特异性抗体的药物制剂,优选地以水溶液或冻干制剂的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含一种或多种其它活性成分,所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的,优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。在一些实施方式中,其它的活性成分为化疗剂、免疫检查点抑制剂、生长抑制剂、抗生素或已知的各种抗肿瘤或抗癌剂,所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
在一些实施方式中,本发明的药物组合物还包含编码本文所述的双特异性抗体的多核苷酸的组合物。
在又一个方面,本发明提供了一种药物组合,其包含如本文任一实施方案所述的双特异性抗体、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、或药物组合物,以及一种或多种另外的治疗剂。
在又一个方面,本发明提供了一种试剂盒,其包括如本文任一实施方案所述的双特异性抗体、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、或药物组合物。
在一些实施方式中,本发明的药物组合物还包含编码本文所述的抗体的多核苷酸的组合物。
在又一个方面,本发明提供了一种药物组合,其包含如本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、或药物组合物,以及一种或多种另外的治疗剂。
在又一个方面,本发明提供了一种试剂盒,其包括如本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、或药物组合物。
医药用途
在又一个方面,本发明提供如本文任一实施方案所述的双特异性抗体、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞、或药物组合物在制备用于预防或治疗对象癌症的药物中的用途。
在又一个方面,本发明提供如本文任一实施方案所述的双特异性抗体、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞、或药物组合物,其用于预防或治疗对象的癌症。
在又一个方面,本发明提供一种预防或治疗对象的癌症的方法,其包括向有需要的受试者施用如本文任一实施方案所述的双特异性抗体、多核苷酸分子、表达载体、宿主细胞、或药物组合物。
在又一个方面,本发明提供了如本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、或药物组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
在又一个方面,本发明提供了如本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、或药物组合物,其用于预防或治疗癌症。
在又一个方面,本发明提供了一种预防或治疗癌症的方法,其包括向有需要的受试者施用如本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、或药物组合物。
本文中,所述癌症优选是表达选自以下一种或多种肿瘤相关抗原的癌症:BCMA、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CDK4、CEA、Claudin 18.2、EGFR、ROR1、TGF-β和5T4。更优选地,所述肿瘤相关抗原选自Claudin 18.2、CD20和BCMA中的一种或多种。示例性的癌症包括前文所述的癌症。
优选地,所述癌症与CLDN18相关;更具体而言,所述癌症高表达Claudin 18.2。因此,在优选的实施方案中,所述癌症为其癌细胞高表达Claudin 18.2的癌症。本文所述的“高表达”意指癌细胞或癌组织中的Claudin 18.2表达量高于正常细胞或正常组织中的Claudin 18.2表达量。可采用常规的方法测试正常人群中正常细胞或组织中的Claudin18.2表达量,以此为基准判定对象相对应的细胞或组织中Claudin 18.2是否高表达。
在一些实施方式中,所述与CLDN18相关的癌症选自胃癌、食道癌、胃食管癌、胰腺癌、胆管癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌、肠癌和膀胱癌。
优选地,所述癌症与CD20相关;在一些实施方式中,所述与CD20相关的癌症选自急性B淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、滤泡淋巴瘤,非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓细胞白血病和Burkitt淋巴瘤。
在一些实施方式中,本发明给药方式包括但不限于口服、静脉内、皮下、肌内、动脉内、关节内(例如在关节炎关节中)、通过吸入、气雾剂递送或肿瘤内给予等。
在一些实施方式中,本发明还包括向受试者联合施用治疗有效量的一种或多种疗法(例如治疗方式和/或其它治疗剂)。在一些实施方式中,所述疗法包括手术治疗和/或放射疗法。
在一个实施方式中,本发明的癌症治疗方法还包括施用本文所述的双特异性抗体的表达稳定或增加剂。双特异性抗体的表达优选在癌细胞的细胞表面。双特异性抗体表达稳定或增加剂可以是奥沙利铂和/或5-FU。
在一些实施方式中,本发明提供的方法或用途还包括向个体施用一种或多种疗法(例如治疗方式和/或其它治疗剂)。可以单独或与疗法中的其它治疗剂组合使用本发明的抗体。例如,可以与至少一种另外的治疗剂共施用。例如,PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体和/或CTLA-4抗体。
用于诊断和检测的方法
在又一个方面,本发明提供了一种使用如本文所述的双特异性抗体检测CD3或CLDN-18.2或CD20在样品中的存在的方法。术语“检测”用于本文中时,包括定量或定性检测。在一些实施方式中,所述样品是生物样品。在某些实施方式中,生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方式中,生物样品包含细胞或组织。所述方法包括使本发明的双特异性抗体与样品接触,并检测所述双特异性抗体与CD3或CLDN-18.2或CD20形成的结合物的存在和/或该结合物的量。
本发明包括所叙述特定实施方式的所有组合。本发明的进一步实施方式及可应用性的完整范畴将自下文所提供的详细描述变得显而易见。然而,应理解,尽管详细描述及特定实施例指示本发明的优选实施方式,但仅以说明的方式提供这些描述及实施例,因为本发明的精神及范畴内的各种改变及修改将自此详细描述对熟悉此项技术者变得显而易见。出于所有目的,包括引文在内的本文所引用的所有公开物、专利及专利申请将以引用的方式全部并入本文。
实施例
提供以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面,不应被解释为限制其范围。
实施例1、抗CD3抗体或其抗原结合片段
抗体序列设计:
以抗体JSCD3(又称为JS202-JSCD3,其重链序列为JSCD3-HC和轻链序列为JSCD3-LC)起始,出于降低抗体的亲和力、减少毒性等目的,对抗体的CDR区进行突变,筛选出以下多种氨基酸序列:轻链JSCD3-LC的CDR区进行突变,产生CD3-LC1、CD3-LC2、CD3-LC3、CD3-LC4、CD3-LC5、CD3-LC6、CD3-LC7、CD3-LC8、CD3-LC9、CD3-LC10、CD3-LC11、CD3-LC12、CD3-LC13、CD3-LC14、CD3-LC15、CD3-LC16、CD3-LC17、CD3-LC18和JSCD3-LC-VtoA,共18个序列;重链JSCD3-HC的CDR区进行突变,产生CD3-HC1、CD3-HC2、CD3-HC3、CD3-HC4、CD3-HC5、CD3-HC6、CD3-HC7、CD3-HC8、CD3-HC9、CD3-HC10、CD3-HC11、CD3-HC12、CD3-HC13、CD3-HC14、CD3-HC15、CD3-HC16、CD3-HC17、CD3-HC18、JSCD3-HC-WtoA和JSCD3-HC-FtoA共20个序列。
序列如下:
JSCD3-HC(斜体字表示VH,下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
JSCD3-HC-FtoA的氨基酸序列如SEQ ID NO:83所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:44)。
CD3-HC1的氨基酸序列如SEQ ID NO:84所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:45)。
CD3-HC2的氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGAFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:46)。
CD3-HC3的氨基酸序列如SEQ ID NO:86所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNAGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:47)。
CD3-HC4的氨基酸序列如SEQ ID NO:87所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGAAGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:48)。
CD3-HC5的氨基酸序列如SEQ ID NO:88所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGASYVSWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:49)。
CD3-HC6的氨基酸序列如SEQ ID NO:89所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSAVSWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)。
CD3-HC7的氨基酸序列如SEQ ID NO:90所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGASAVSWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:51)。
CD3-HC8的氨基酸序列如SEQ ID NO:91所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSAFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:52)。
CD3-HC9的氨基酸序列如SEQ ID NO:92所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSAVSAFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:53)。
CD3-HC10的氨基酸序列如SEQ ID NO:93所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGASYVSAFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:54)。
CD3-HC11的氨基酸序列如SEQ ID NO:94所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:55)。
CD3-HC12的氨基酸序列如SEQ ID NO:95所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSAAAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:56)。
CD3-HC13的氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNAYVSWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:57)。
CD3-HC14的氨基酸序列如SEQ ID NO:97所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYASWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:58)。
CD3-HC15的氨基酸序列如SEQ ID NO:98所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:59)。
CD3-HC16的氨基酸序列如SEQ ID NO:99所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNAYASWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:60)。
CD3-HC17的氨基酸序列如SEQ ID NO:100所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNAYVAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:61)。
CD3-HC18的氨基酸序列如SEQ ID NO:101所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSKYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYAAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:62)。
JSCD3-HC-WtoA的氨基酸序列如SEQ ID NO:140所示,其可变区序列如下(下划线依次表示HCDR1、HCDR2和HCDR3):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSAFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:139)。
JSCD3-LC(斜体字表示VL,下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
JSCD3-LC-VtoA的氨基酸序列如SEQ ID NO:103所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWAFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:64)。
CD3-LC1的氨基酸序列如SEQ ID NO:104所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:65)。
CD3-LC2的氨基酸序列如SEQ ID NO:105所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALAYSNLWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:66)。
CD3-LC3的氨基酸序列如SEQ ID NO:106所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWASNLWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:67)。
CD3-LC4的氨基酸序列如SEQ ID NO:107所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALAASNLWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:68)。
CD3-LC5的氨基酸序列如SEQ ID NO:108所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSALWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:69)。
CD3-LC6的氨基酸序列如SEQ ID NO:109所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLAVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:70)。
CD3-LC7的氨基酸序列如SEQ ID NO:110所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSALAVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:71)。
CD3-LC8的氨基酸序列如SEQ ID NO:111所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWAFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:72)。
CD3-LC9的氨基酸序列如SEQ ID NO:112所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLAAFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:73)。
CD3-LC10的氨基酸序列如SEQ ID NO:113所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSALWAFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:74)。
CD3-LC11的氨基酸序列如SEQ ID NO:114所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNAWAFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:75)。
CD3-LC12的氨基酸序列如SEQ ID NO:113所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSALWAFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:74)。
CD3-LC13的氨基酸序列如SEQ ID NO:115所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSAAWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:76)。
CD3-LC14的氨基酸序列如SEQ ID NO:116所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALAYSNLAVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:77)。
CD3-LC15的氨基酸序列如SEQ ID NO:117所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWASALWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:78)。
CD3-LC16的氨基酸序列如SEQ ID NO:118所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCAAWYSNLWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:79)。
CD3-LC17的氨基酸序列如SEQ ID NO:119所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYANLWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:80)。
CD3-LC18的氨基酸序列如SEQ ID NO:120所示,其可变区序列如下(下划线依次表示LCDR1、LCDR2和LCDR3):
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCAAWYANLWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:81)。
上述重链、轻链、重链可变区、轻链可变区、重链CDR和轻链CDR序列的序列编号汇总如下:
将重链JSCD3-HC-WtoA和轻链JSCD3-LC-VtoA组合得到抗CD3体JSCD3-A1;将重链JSCD3-HC-FtoA和轻链JSCD3-LC-VtoA组合得到抗CD3体JSCD3-A2。
将上述重链JSCD3-HC、CD3-HC1~CD3-HC18,和轻链JSCD3-LC、CD3-LC1~CD3-LC17两两配对组合,配对组合得到的抗CD3抗体如下表1A、表1B和表1C所示。
抗CD3抗体的制备方法如下:
(1)抗CD3抗体分子的的质粒构建:委托金斯瑞合成抗体的重链于puc57,通过SapI酶切并连接至HXT4S载体,得到表达载体HXT4S-CD3-HC。委托金斯瑞合成人抗体的轻链于puc57,通过SapI酶切并连接至HXT2载体,得到表达载体HXT2-CD3-LC。
(2)抗CD3抗体分子的表达:将上述构建的每个抗CD3抗体各自的表达载体用无内毒素的试剂盒进行质粒大提,供后面哺乳动物细胞表达使用,具体操作按照常规的普通分子生物学方法进行。将CHO-K1细胞(经过基因组水平的改造使细胞适用于瞬转表达,君实生物)使用CD CHO培养基(Gibco),在36.5℃,120rmp,7%CO2条件下培养,当细胞密度达到(2-6)×106/mL时,用CD CHO培养基进行传代扩增。转染前一天,将CHO-K1细胞密度稀释至(1.5-2.0)×106/mL,放置摇床(培养条件为36.5℃,120rmp,7%CO2)培养,次日当细胞密度达到约3.5×106/mL时进行转染。转染时,先向反应器中加入十分之一转染体积的CD CHO培养基,依次加入1-2ug/mL转染体积的上述质粒,3-14ug/mL的PEI(聚乙烯亚胺),混匀后室温孵育20-30分钟,然后将上述混合物缓慢加入到预先处理好的上述CHO-K1细胞中,形成转染混合物,边加边混匀。将转染混合物放入摇床培养,培养条件为36.5℃,120rmp,7%CO2。培养周期为转染后6-10天,每两天补料一次。
(3)抗CD3抗体分子的纯化:上述转染混合物培养结束后,1000rmp离心10min弃去沉淀,然后12000rmp离心30min收集细胞上清并进行无菌过滤。第一步,用AKTA Avant纯化仪进行纯化,先用0.1M NaOH对装填mabselect sure LX柱子进行消毒15-20min,然后用PBS缓冲液平衡3-5个柱体积后上样,上样完成后,用pH 5.5醋酸钠缓冲液进行淋洗,最后用pH3.6的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱目的蛋白;第二步,用Eshmuno CPX进行精纯,平衡液为pH5.5,50mM醋酸-醋酸钠体系,洗脱液为pH5.5,50mM醋酸-醋酸钠+1M NaCl缓冲体系,采用线性洗脱方式,收集目的蛋白,经SEC-HPLC测定,单体纯度可达到95%以上,即得到抗CD3抗体。
表1A:抗CD3抗体的轻重链组合表
CD3-HC1 | CD3-HC2 | CD3-HC3 | CD3-HC4 | CD3-HC5 | CD3-HC6 | |
CD3-LC1 | JSCD3-1 | JSCD3-20 | JSCD3-39 | JSCD3-58 | JSCD3-77 | JSCD3-96 |
CD3-LC2 | JSCD3-2 | JSCD3-21 | JSCD3-40 | JSCD3-59 | JSCD3-78 | JSCD3-97 |
CD3-LC3 | JSCD3-3 | JSCD3-22 | JSCD3-41 | JSCD3-60 | JSCD3-79 | JSCD3-98 |
CD3-LC4 | JSCD3-4 | JSCD3-23 | JSCD3-42 | JSCD3-61 | JSCD3-80 | JSCD3-99 |
CD3-LC5 | JSCD3-5 | JSCD3-24 | JSCD3-43 | JSCD3-62 | JSCD3-81 | JSCD3-100 |
CD3-LC6 | JSCD3-6 | JSCD3-25 | JSCD3-44 | JSCD3-63 | JSCD3-82 | JSCD3-101 |
CD3-LC7 | JSCD3-7 | JSCD3-26 | JSCD3-45 | JSCD3-64 | JSCD3-83 | JSCD3-102 |
CD3-LC8 | JSCD3-8 | JSCD3-27 | JSCD3-46 | JSCD3-65 | JSCD3-84 | JSCD3-103 |
CD3-LC9 | JSCD3-9 | JSCD3-28 | JSCD3-47 | JSCD3-66 | JSCD3-85 | JSCD3-104 |
CD3-LC10 | JSCD3-10 | JSCD3-29 | JSCD3-48 | JSCD3-67 | JSCD3-86 | JSCD3-105 |
CD3-LC11 | JSCD3-11 | JSCD3-30 | JSCD3-49 | JSCD3-68 | JSCD3-87 | JSCD3-106 |
CD3-LC12 | JSCD3-12 | JSCD3-31 | JSCD3-50 | JSCD3-69 | JSCD3-88 | JSCD3-107 |
CD3-LC13 | JSCD3-13 | JSCD3-32 | JSCD3-51 | JSCD3-70 | JSCD3-89 | JSCD3-108 |
CD3-LC14 | JSCD3-14 | JSCD3-33 | JSCD3-52 | JSCD3-71 | JSCD3-90 | JSCD3-109 |
CD3-LC15 | JSCD3-15 | JSCD3-34 | JSCD3-53 | JSCD3-72 | JSCD3-91 | JSCD3-110 |
CD3-LC16 | JSCD3-16 | JSCD3-35 | JSCD3-54 | JSCD3-73 | JSCD3-92 | JSCD3-111 |
CD3-LC17 | JSCD3-17 | JSCD3-36 | JSCD3-55 | JSCD3-74 | JSCD3-93 | JSCD3-112 |
CD3-LC18 | JSCD3-18 | JSCD3-37 | JSCD3-56 | JSCD3-75 | JSCD3-94 | JSCD3-113 |
JSCD3-LC | JSCD3-19 | JSCD3-38 | JSCD3-57 | JSCD3-76 | JSCD3-95 | JSCD3-114 |
表1B:抗CD3抗体的轻重链组合表
表1C:抗CD3抗体的轻重链组合表
实施例2、抗CD3抗体与人CD3的结合活性初步研究
将内源性表达人CD3的细胞(Jurkat细胞,中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)分别与稀释成10μg/ml浓度的抗CD3抗体在4℃孵育30min,洗去残留抗体后与荧光二抗(PE-抗人IgG)孵育,最后用C6 PLUS流式细胞仪检测荧光强度,荧光信号越强,抗体与靶点亲和力越高。
根据表2-5的平均荧光强度(MFI)测试结果,CDR突变后的抗CD3抗体与人CD3的结合活性均有不同程度的降低,选择抗体JSCD3-1、JSCD3-3、JSCD3-5、JSCD3-8、JSCD3-11、JSCD3-13、JSCD3-79、JSCD3-88、JSCD3-89、JSCD3-91、JSCD3-92、JSCD3-93、JSCD3-94、JSCD3-95、JSCD3-98、JSCD3-103、JSCD3-111、JSCD3-112、JSCD3-113、JSCD3-114、JSCD3-115、JSCD3-117、JSCD3-122、JSCD3-124、JSCD3-125、JSCD3-126、JSCD3-127、JSCD3-130、JSCD3-131、JSCD3-132、JSCD3-162、JSCD3-173、JSCD3-191、JSCD3-195、JSCD3-210、JSCD3-217、JSCD3-236、JSCD3-238、JSCD3-239、JSCD3-241、JSCD3-246、JSCD3-250、JSCD3-255、JSCD3-257、JSCD3-258、JSCD3-259、JSCD3-260、JSCD3-262、JSCD3-264、JSCD3-265、JSCD3-268、JSCD3-277、JSCD3-285、JSCD3-288、JSCD3-293、JSCD3-296、JSCD3-297、JSCD3-301、JSCD3-302、JSCD3-303、JSCD3-324、JSCD3-325进行下一步研究。
表2:抗CD3抗体与人CD3结合活性结果I
表3:抗CD3抗体与人CD3结合活性结果II
表4:抗CD3抗体与人CD3结合活性结果III
表5:抗CD3抗体与人CD3结合活性结果IV
实施例3、抗CD3抗体的SEC检测结果
对实施例2选择的抗CD3抗体进行SEC-HPLC纯度检测。
SEC-HPLC纯度采用安装了SEC色谱柱(XBridge BEH SEC7.8*300mm,3.5μm)的HPLC(Agilent 1260)进行检测。流动相组成为50mM磷酸盐,300mM氯化钠,pH 6.8±0.2。采用峰面积归一化对结果进行定量分析。分别计算单体、聚体和片段的峰面积百分比。具体测试结果见表6。
由表6看出,抗体表达的质量较好,其中JSCD3-1、JSCD3-8、JSCD3-11、JSCD3-13、JSCD3-88、JSCD3-89、JSCD3-98、JSCD3-103、JSCD3-111、JSCD3-113、JSCD3-114、JSCD3-115、JSCD3-117、JSCD3-122、JSCD3-124、JSCD3-125、JSCD3-126、JSCD3-127、JSCD3-130、JSCD3-132、JSCD3-236、JSCD3-238、JSCD3-239、JSCD3-241、JSCD3-246、JSCD3-250、JSCD3-257、JSCD3-258、JSCD3-260、JSCD3-262、JSCD3-264、JSCD3-265、JSCD3-285、JSCD3-288、JSCD3-293、JSCD3-296、JSCD3-297、JSCD3-301、JSCD3-303表达纯化后的抗体质量优异。
表6:SEC纯度测试结果
实施例4、抗CD3抗体与人CD3的结合活性进一步研究
对实施例2选择的抗CD3抗体与JSCD3-A1、JSCD3-A2、JSCD3-Roche、JSCD3-AMG、REGN-CD3、JS202-JSCD3分为12组进行活性测试,具体分组如下:
组一:JSCD3-1、JSCD3-3、JSCD3-8、JSCD3-11、JSCD3-13、JSCD3-79、REGN-CD3、JS202-JSCD3;
组二:JSCD3-88、JSCD3-89、JSCD3-91、JSCD3-257、JSCD3-258、JSCD3-260、REGN-CD3、JS202-JSCD3;
组三:JSCD3-98、JSCD3-103、JSCD3-111、JSCD3-112、JSCD3-113、JSCD3-114、REGN-CD3、JS202-JSCD3;
组四:JSCD3-115、JSCD3-117、JSCD3-122、JSCD3-124、JSCD3-125、JSCD3-126、REGN-CD3、JS202-JSCD3;
组五:JSCD3-127、JSCD3-130、JSCD3-131、JSCD3-132、JSCD3-Roche、JSCD3-AMG、REGN-CD3、JS202-JSCD3;
组六:JSCD3-236、JSCD3-238、JSCD3-239、JSCD3-241、JSCD3-246、JSCD3-250、REGN-CD3、JS202-JSCD3;
组七:JSCD3-262、JSCD3-264、JSCD3-265、JSCD3-285、JSCD3-288、JSCD3-293、REGN-CD3、JS202-JSCD3;
组八:JSCD3-296、JSCD3-297、JSCD3-301、JSCD3-302、REGN-CD3、JS202-JSCD3;
组九:JSCD3-92、JSCD3-95、JSCD3-303、REGN-CD3、JS202-JSCD3;
组十:JSCD3-A1、JSCD3-A2、JS202-JSCD3;
组十一:JSCD3-5、JSCD3-162、JSCD3-173、JSCD3-191、JSCD3-195、JSCD3-210、JSCD3-217、JSCD3-268、JSCD3-324、JSCD3-325、REGN-CD3、JS202-JSCD3;
组十二:JSCD3-93、JSCD3-94、JSCD3-255、JSCD3-259、JSCD3-277、REGN-CD3、JS202-JSCD3。
其中,JSCD3-Roche的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:158所示,轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示;JSCD3-AMG的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:160所示,轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:161所示;REGN-CD3的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:162所示,轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:163所示;JSCD3-Roche、JSCD3-AMG和REGN-CD3的制备如实施例1中抗CD3抗体的制备方法所示。
将上述分组后的抗CD3抗体分别稀释不同的浓度梯度拟合曲线进一步的进行与人CD3的结合活性测试,将内源性表达人CD3的细胞(Jurkat细胞,中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)分别与梯度稀释成系列浓度的抗CD3抗体在4℃孵育30min,洗去残留抗体后与荧光二抗(PE-抗人IgG)孵育,最后用C6 PLUS流式细胞仪检测荧光强度,荧光信号越强,抗体与靶点亲和力越高。
具体测试结果见表7-17和图1-12,CDR突变后的抗CD3抗体与人CD3的结合活性均有不同程度的降低,其中JSCD3-130,JSCD3-132,JSCD3-238,JSCD3-285,JSCD3-191,JSCD3-195相比较于JSCD3亲和力下降约10倍,和REGN-CD3亲和力相当;JSCD3-A2相较于JSCD3亲和力下降约70倍;JSCD3-259相较于JSCD3亲和力下降约100倍;JSCD3-277相较于JSCD3亲和力下降约500倍。其中TOP代表抗体浓度饱和时荧光信号值(MFI-PE),相对结合活性vs JSCD3(%)=JSCD3 EC50值/样品EC50×100%,相对结合活性vs REGN-CD3(%)=REGN-CD3 EC50值/样品EC50×100%。
表7:组一的抗体与人CD3的结合活性测试结果
表8:组二的抗体与人CD3的结合活性测试结果
表9:组三的抗体与人CD3的结合活性测试结果
表10:组四的抗体与人CD3的结合活性测试结果
表11:组五的抗体与人CD3的结合活性测试结果
表12:组六的抗体与人CD3的结合活性测试结果
表13:组七的抗体与人CD3的结合活性测试结果
表14:组八的抗体与人CD3的结合活性测试结果
表15:组九的抗体与人CD3的结合活性测试结果
表16:组十一的抗体与人CD3的结合活性测试结果
表17:组十二的抗体与人CD3的结合活性测试结果
实施例5、双特异抗体分子表达载体的构建
5.1 JS202-7(又称为JS202-7 JSCD3 scFv)双特异抗体的质粒构建
用NheI和NotI酶分别酶切质粒HXT4S-JS012-2B19-HC-7和HXT4s-JS CD20HC-2Muth-HY获取载体和片段,使用T4 DNA连接酶连接,得到第一个表达载体JS012-2B19HC-7-IgG4-hole。委托金斯瑞生物科技有限公司合成编码JSCD3 scFv的基因用引物扩增后BSPQI酶切并连接至载体HXT4S-JS012-2B19-HC-mutb得到第二个表达载体JS012-2B19HC-7-CH1-JSCD3 scFv-IgG4-knob。委托金斯瑞生物科技有限公司合成编码JS012-2B19LC-1-Kappa的基因,通过SapI酶切并连接至HXT2得到第三个表达载体JS012-2B19LC-1-kappa。
5.2 JS202-7 CD3-130-012scFv双特异抗体的质粒构建
通过5.1节中的方法得到第一个表达载体JS012-2B19HC-7-IgG4-hole。分别以HXT4S-JS012-2B19-HC-7-mutb,HXT2-JS012-2B19LC-1和HXT4S-JSCD3-HC7为模板扩增得到载体和片段通过重组得到第二个表达载体JSCD3-HC7-CH1-012ScFv-IgG4-knob。分委托金斯瑞生物科技有限公司合成编码JS012-2B19LC-1-Kappa的基因,通过SapI酶切并连接至HXT2得到第三个表达载体JS012-2B19LC-1-kappa。分委托金斯瑞生物科技有限公司合成编码JSCD3-LC16-Lambda的基因,通过SapI酶切并连接至HXT2得到第四个表达载体JSCD3-LC16-Lambda。
5.3 JS202-7 CD3-Fv双特异抗体的质粒构建
通过5.1节中的方法得到第一个表达载体JS012-2B19HC-7-IgG4-hole。分别以HXT4S-JS012-2B19-HC-7-mutb和HXT2-JSCD3-LC为模板扩增得到载体和片段通过重组得到第二个表达载体JS012-2B19HC-7-CH1-JSCD3 LC-IgG4-knob。分别以HXT2-JS012-2B19LC-1和HXT4S-JSCD3-HC为模板PCR得到载体和片段,通过重组得到第三个表达载体JS012-2B19LC-1-Kappa-JSCD3-HC。委托金斯瑞生物科技有限公司合成编码JS012-2B19LC-1-Kappa的基因,通过SapI酶切并连接至HXT2得到第四个表达载体JS012-2B19LC-1-kappa。
5.4 JS202-7 012-Fv双特异抗体的质粒构建
通过5.1节中的方法得到第一个表达载体JS012-2B19HC-7-IgG4-hole。分别以HXT4S-JSCD3-HC和HXT2-JS012-2B19LC-1以及HXT4S-1A6H2 QGQ-mutb为模板分别PCR得到载体和两个片段,通过重组得到第二个表达载体JSCD3-VH-CH1-JS012-2B19LC-1-IgG4-knob。分别以HXT3-JSCD3-LC和HXT4S-JS012-2B19-HC-7为模板PCR得到载体和片段,通过重组得到第三个表达载体JSCD3-LC-lambda-2B19HC-7。委托金斯瑞生物科技有限公司合成编码JS012-2B19LC-1-Kappa的基因,通过SapI酶切并连接至HXT2得到第四个表达载体JS012-2B19LC-1-kappa。
5.5 JS202-7 CD3 130 012-Fv双特异抗体的质粒构建
通过5.1节中的方法得到第一个表达载体JS012-2B19HC-7-IgG4-hole。分别以HXT4S-JSCD3-HC7和HXT2-JS012-2B19LC-1以及HXT4S-1A6H2 QGQ-mutb为模板分别PCR得到载体和两个片段,通过重组得到第二个表达载体JSCD3-HC7-CH1-JS012-2B19LC-1-IgG4-knob。分别以HXT3-JSCD3-LC16和HXT4S-JS012-2B19-HC-7为模板PCR得到载体和片段,通过重组得到第三个表达载体JSCD3-LC16-lambda-2B19HC-7。委托金斯瑞生物科技有限公司合成编码JS012-2B19LC-1-Kappa的基因,通过SapI酶切并连接至HXT2得到第四个表达载体JS012-2B19LC-1-kappa。
5.6 JS203-7-JSCD3-CD20-Fv双特异抗体的质粒构建
委托金斯瑞合成人CD20的重链JSCD20-HC-2于puc57,通过BSPQI酶切并连接至HXT4S载体,得到表达载体HXT4S-JSCD20-HC-2。将质粒用HindIII和NheI酶切回收获取基因片段JSCD20-HC-2,使用HindIII和NheI酶切质粒HXT4S-JS012-1H17-HC-mut-h并回收得到载体HXT4s-mut h,使用T4 DNA连接酶连接,得到第一个表达载体JSCD20-HC-2-IgG4-hole。分别以HX4-JSCD3 HC-7-2B19 LC-1-mutb和HXT2-JSCD20-LC-2为模板扩增载体和基因片段,通过重组得到第二个表达载体JSCD3-HC-CH1-JSCD20-LC-2-IgG4-knob。分别以HXT3-JSCD3-LC-2B19 HC-7和HXT4s-JS CD20HC-2Mut h为模板扩增载体和基因片段,通过重组得到第三个表达载体JSCD3-LC-lambda-JSCD20-HC-2。委托金斯瑞合成人CD20的轻链JSCD20-LC-2于puc57,通过SapI酶切并连接至HXT2载体,得到第四个表达载体JSCD20-LC-2-kappa。
5.7 JS203-7-CD3 130-CD20-Fv双特异抗体的质粒构建
委托金斯瑞合成人CD20的重链JSCD20-HC-2于puc57,通过SapI酶切并连接至HXT4S载体,得到表达载体HXT4S-JSCD20-HC-2。将质粒用HindIII和NheI酶切回收获取基因片段JSCD20-HC-2,使用HindIII和NheI酶切质粒HXT4S-JS012-1H17-HC-mut-h并回收得到载体HXT4s-mut h,使用T4 DNA连接酶连接,得到第一个表达载体JSCD20-HC-2-IgG4-hole。分别以HX4-JSCD3 HC-2B19 LC-1-mutb和HXT2-JSCD20-LC-2为模板扩增载体和片段,通过重组得到第二个表达载体JSCD3-HC7-CH1-JSCD20-LC-2-IgG4-knob。分别以HXT3-JSCD3-LC16-2B19 HC-7和HXT4s-JSCD20HC-2Mut h为模板扩增载体和片段,通过重组得到第三个表达载体JSCD3-LC16-lambda-JSCD20-HC-2。委托金斯瑞合成人CD20的轻链JSCD20-LC-2于puc57,通过SapI酶切并连接至HXT2载体,得到第四个表达载体JSCD20-LC-2-kappa。
5.8 JS203-7-CD3-Fv双特异抗体的质粒构建
委托金斯瑞合成人CD20的重链JSCD20-HC-2于puc57,通过SapI酶切并连接至HXT4S载体,得到表达载体HXT4S-JSCD20-HC-2。将质粒用HindIII和NheI酶切回收获取基因片段JSCD20-HC-2,使用HindIII和NheI酶切质粒HXT4S-JS012-1H17-HC-mut-h并回收得到载体HXT4s-mut h,使用T4 DNA连接酶连接,得到第一个表达载体JSCD20-HC-2-IgG4-hole。分别以HXT4s-JS CD20HC-2mutb和HXT2-JSCD3-LC为模板扩增载体和片段,通过重组得到第二个表达载体JSCD20-VH-CH1-JSCD3-VL-IgG4-knob。分别以HXT2-JSCD20-LC-2和HXT2-JSCD3-HC为模板扩增载体和片段,通过重组得到第三个表达载体JSCD20-LC-2Kappa-JSCD3-VH。委托金斯瑞合成人CD20的轻链JSCD20-LC-2于puc57,通过SapI酶切并连接至HXT2载体,得到第四个表达载体JSCD20-LC-2-kappa。
实施例6、双特异性抗体分子的表达与纯化
6.1双特异性抗体分子的表达
将实施例5中构建的每个双特异性抗体各自的表达载体用无内毒素的试剂盒进行质粒大提,供后面哺乳动物细胞表达使用,具体操作按照常规的普通分子生物学方法进行。将CHO-K1细胞(经过基因组水平的改造使细胞适用于瞬转表达,君实生物)使用CD CHO培养基(Gibco),在36.5℃,120rmp,7%CO2条件下培养,当细胞密度达到(2-6)×106/mL时,用CDCHO培养基进行传代扩增。转染前一天,将CHO-K1细胞密度稀释至(1.5-2.0)×106/mL,放置摇床(培养条件为36.5℃,120rmp,7%CO2)培养,次日当细胞密度达到约3.5×106/mL时进行转染。转染时,先向反应器中加入十分之一转染体积的CD CHO培养基,依次加入1-2ug/mL转染体积的上述质粒,3-14ug/mL的PEI(聚乙烯亚胺),混匀后室温孵育20-30分钟,然后将上述混合物缓慢加入到预先处理好的上述CHO-K1细胞中,形成转染混合物,边加边混匀。将转染混合物放入摇床培养,培养条件为36.5℃,120rmp,7%CO2。培养周期为转染后6-10天,每两天补料一次。
6.2双特异性抗体分子的纯化
上述转染混合物培养结束后,1000rmp离心10min弃去沉淀,然后12000rmp离心30min收集细胞上清并进行无菌过滤。第一步,用AKTA Avant纯化仪进行纯化,先用0.1MNaOH对装填mabselect sure LX柱子进行消毒15-20min,然后用PBS缓冲液平衡3-5个柱体积后上样,上样完成后,用pH 5.5醋酸钠缓冲液进行淋洗,最后用pH 3.6的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱目的蛋白;第二步,用Eshmuno CPX进行精纯,平衡液为pH5.5,50mM醋酸-醋酸钠体系,洗脱液为pH5.5,50mM醋酸-醋酸钠+1M NaCl缓冲体系,采用线性洗脱方式,收集目的蛋白,经SEC-HPLC测定,单体纯度可达到95%以上,即得到双特异性抗体。
双特异性抗体JS202-7中,第一多肽链(表达载体JS012-2B19HC-7-CH1-JSCD3scFv-IgG4-knob)氨基酸序列如SEQ ID NO:141所示,第二多肽链(表达载体JS012-2B19HC-7-IgG4-hole)氨基酸序列如SEQ ID NO:142所示,第三多肽链(表达载体JS012-2B19LC-1-kappa)氨基酸序列如SEQ ID NO:143所示。双特异性抗体JS202-7的结构示意图如图13所示。
SEQ ID NO:141(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
其中JSCD3 scFv的VH氨基酸序列如SEQ ID NO:137所示,VL氨基酸序列如SEQ IDNO:138所示。
SEQ ID NO:142(黑体字分别表示VH,下划线标出HCDR1-HCDR3)
SEQ ID NO:143(黑体字分别表示VL,下划线标出LCDR1-LCDR3)
双特异性抗体JS202-7 CD3-Fv中,第一多肽链(表达载体JS012-2B19HC-7-CH1-JSCD3 LC-IgG4-knob)氨基酸序列如SEQ ID NO:144所示,第二多肽链(表达载体JS012-2B19LC-1-Kappa-JSCD3-HC)氨基酸序列如SEQ ID NO:145所示,第三多肽链(表达载体JS012-2B19HC-7-IgG4-hole)氨基酸序列如SEQ ID NO:142所示,第四多肽链(表达载体JS012-2B19LC-1-kappa)氨基酸序列如SEQ ID NO:143所示。双特异性抗体JS202-7 CD3-Fv的结构示意图如图14所示。
SEQ ID NO:144(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
SEQ ID NO:145(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
双特异性抗体JS202-7 012-Fv中,第一多肽链(表达载体JSCD3-VH-CH1-JS012-2B19LC-1-IgG4-knob)氨基酸序列如SEQ ID NO:146所示,第二多肽链(表达载体JSCD3-LC-lambda-2B19HC-7)氨基酸序列如SEQ ID NO:147所示,第三多肽链(表达载体JS012-2B19HC-7-IgG4-hole)氨基酸序列如SEQ ID NO:142所示,第四多肽链(表达载体JS012-2B19LC-1-kappa)氨基酸序列如SEQ ID NO:143所示。双特异性抗体JS202-7 012-Fv的结构示意图如图15所示。
SEQ ID NO:146(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
SEQ ID NO:147(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
双特异性抗体JS202-7 CD3 130 012-Fv中,第一多肽链(表达载体JSCD3-HC7-CH1-JS012-2B19LC-1-IgG4-knob)氨基酸序列如SEQ ID NO:148所示,第二多肽链(表达载体JSCD3-LC16-lambda-2B19HC-7)氨基酸序列如SEQ ID NO:149所示,第三多肽链(表达载体JS012-2B19HC-7-IgG4-hole)氨基酸序列如SEQ ID NO:142所示,第四多肽链(表达载体JS012-2B19LC-1-kappa)氨基酸序列如SEQ ID NO:143所示。双特异性抗体JS202-7CD3 130012-Fv的结构示意图如图15所示。
SEQ ID NO:148(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
SEQ ID NO:149(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
双特异性抗体JS203-7-JSCD3-CD20-Fv中,第一多肽链(表达载体JSCD3-HC-CH1-JSCD20-LC-2-IgG4-knob)氨基酸序列如SEQ ID NO:150所示,第二多肽链(表达载体JSCD3-LC-lambda-JSCD20-HC-2)氨基酸序列如SEQ ID NO:151所示,第三多肽链(表达载体JSCD20-HC-2-IgG4-hole)氨基酸序列如SEQ ID NO:152所示,第四多肽链(表达载体JSCD20-LC-2-kappa)氨基酸序列如SEQ ID NO:153所示。双特异性抗体JS203-7-JSCD3-CD20-Fv的结构示意图如图16所示。
SEQ ID NO:150(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
SEQ ID NO:151(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
SEQ ID NO:152(黑体字分别表示VH,下划线标出HCDR1-HCDR3)
SEQ ID NO:153(黑体字分别表示VL,下划线标出LCDR1-LCDR3)
双特异性抗体JS203-7-CD3 130-CD20-Fv中,第一多肽链(表达载体JSCD3-HC7-CH1-JSCD20-LC-2-IgG4-knob)氨基酸序列如SEQ ID NO:154所示,第二多肽链(表达载体JSCD3-LC16-lambda-JSCD20-HC-2)氨基酸序列如SEQ ID NO:155所示,第三多肽链(表达载体JSCD20-HC-2-IgG4-hole)氨基酸序列如SEQ ID NO:152所示,第四多肽链(表达载体JSCD20-LC-2-kappa)氨基酸序列如SEQ ID NO:153所示。双特异性抗体JS203-7-CD3 130-CD20-Fv的结构示意图如图16所示。
SEQ ID NO:154(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
SEQ ID NO:155(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
双特异性抗体JS203-7-CD3-FV中,第一多肽链(表达载体JSCD20-VH-CH1-JSCD3-VL-IgG4-knob)氨基酸序列如SEQ ID NO:156所示,第二多肽链(表达载体JSCD20-LC-2Kappa-JSCD3-VH)氨基酸序列如SEQ ID NO:157所示,第三多肽链(表达载体JSCD20-HC-2-IgG4-hole)氨基酸序列如SEQ ID NO:152所示,第四多肽链(表达载体JSCD20-LC-2-kappa)氨基酸序列如SEQ ID NO:153所示。双特异性抗体JS203-7-CD3-FV的结构示意图如图17所示。
SEQ ID NO:156(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
SEQ ID NO:157(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
双特异性抗体JS202-7 CD3-130-012scFv中,第一多肽链(表达载体JSCD3-HC7-CH1-012ScFv-IgG4-knob)氨基酸序列如SEQ ID NO:164所示,第二多肽链(表达载体JSCD3-LC16-Lambda)氨基酸序列如SEQ ID NO:165所示,第三多肽链(表达载体JS012-2B19HC-7-IgG4-hole)氨基酸序列如SEQ ID NO:142所示,第四多肽链(表达载体JS012-2B19LC-1-kappa)氨基酸序列如SEQ ID NO:143所示。双特异性抗体JS202-7 CD3-130-012scFv的结构示意图如图18所示。
SEQ ID NO:164(黑体字分别表示VL和VH,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
SEQ ID NO:165(黑体字分别表示VL,下划线标出LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)
其中012scFv的VH氨基酸序列如SEQ ID NO:166所示,VL氨基酸序列如SEQ ID NO:167所示。
实施例7、双特异性抗体的结合活性研究
7.1双特异性抗体与人CD3的结合
将内源性表达人CD3的细胞(Jurkat细胞,中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)分别与梯度稀释成系列浓度的抗CD3×Claudin18.2双特异性抗体(JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7)在4℃孵育30min,洗去残留抗体后与荧光二抗(PE-抗人IgG)孵育,最后用C6 PLUS流式细胞仪检测荧光强度,荧光信号越强,抗体与靶点亲和力越高。通过GraphPad拟合抗体剂量依赖性的结合曲线(图19)。
如图19,JS202-7 012-Fv和JS202-7 CD3 130 012-Fv与人CD3表达细胞均能有效结合,JS202-7 CD3-Fv和JS202-7与人CD3表达细胞的结合能力较弱。
7.2双特异性抗体与食蟹猴CD3e的结合
将CHO食蟹猴CD3e(君实生物)分别与梯度稀释成系列浓度的抗CD3×Claudin18.2双特异性抗体(JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7)及阴性对照(抗KLH单抗,anti-KLH hIgG4)在4℃孵育30min,洗去残留抗体后与荧光二抗(PE-抗人IgG)孵育,最后用C6 PLUS流式细胞仪检测荧光强度,荧光信号越强,抗体与靶点亲和力越高。通过GraphPad拟合抗体剂量依赖性的结合曲线(图20)。
如图20,JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv及JS202-7与CHO食蟹猴CD3e细胞均能有效结合,JS202-7 CD3-Fv和JS202-7结合TOP值较低,固认为JS202-7 CD3-Fv和JS202-7与CHO食蟹猴CD3e细胞的结合能力有所减低。
7.3双特异性抗体与CHO Claudin18.2的结合
将CHO Claudin18.2(君实生物)细胞分别分别与梯度稀释成系列浓度的抗CD3×Claudin18.2双特异性抗体(JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7)在4℃孵育30min,洗去残留抗体后与荧光二抗(PE-抗人IgG)孵育,最后用C6PLUS流式细胞仪检测荧光强度,荧光信号越强,抗体与靶点亲和力越高。通过GraphPad拟合抗体剂量依赖性的结合曲线(图21)。
如图21,JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv及JS202-7与CHO Claudin18.2细胞均能有效结合,EC50分别为160.6ng/mL、169.8ng/mL、158.9ng/mL和138.7ng/mL。
实施例8、双特异性抗体的体外药效研究
8.1双特异性抗体对T细胞下游信号通路的激活作用
抗CD3×Claudin18.2双抗,能够与靶细胞上的Claudin18.2结合,进一步结合表达CD3的T细胞,从而激活T细胞下游信号通路。我们利用内源性表达人CD3的NFAT通路荧光素酶系统,以过表达Claudin18.2的CHO细胞为靶细胞,通过报告基因系统检测双抗活性。
将梯度稀释成系列浓度的抗CD3×Claudin18.2双特异性抗体(JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7)与靶细胞CHO Claudin18.2细胞(君实生物)以及Jurkat NFAT效应细胞(君实生物)共孵育,在加入底物One-Lite TMLuciferase Assay system(Vazyme,Cat#DD1203-04)后用酶标仪检测信号,最后用GraphPad分析数据,比较剂量依赖性的细胞活性(图22)。
如图22所示,JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv及JS202-7双抗均能有效激活T细胞下游信号通路,EC50分别为0.7212ng/mL、0.1700ng/mL、1.551ng/mL和2.850ng/mL。
8.2双特异性抗体对T细胞的激活作用
抗CD3×Claudin18.2双特异性抗体能够有效促进外周血单核细胞中T淋巴细胞的激活,一般细胞表面标志物CD69的表达上调是T细胞激活早期的标志,而细胞表面标志物CD25的表达上调是T细胞激活后期的标志,本实验用CD25和CD69双阳性群体的比例上调来评估本研究中抗CD3×Claudin18.2双特异性抗体对T细胞的激活作用。
用人总T细胞分选试剂盒(Miltenyi Biotec,Cat#130-096-535)从商业化的PBMC(Allcells,Cat#PB004F-C)中分离纯化出人总T细胞;然后将纯化的人总T细胞(每孔1×105个细胞)和NUGC4 Claudin18.2细胞(每孔2×104个细胞,君实生物)以及梯度稀释的JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7及阴性对照样品anti-KLHhIgG4,在96孔板中37℃共孵育24h(24小时)。最后收集细胞,用PerCP/Cy5.5抗人CD8a(Biolegend,Cat#301032)、PE抗人CD25(Biolegend,Cat#302606)、BV421抗人CD69(BD,Cat#562884)染色后,用流式细胞仪(BD,CantoⅡ)上机检测。利用FlowJo软件导出CD8+T细胞上CD25+和CD69+双阳性细胞群体的比例,再通过GraphPad prism软件拟合四参数回归曲线,计算EC50值。
如图23所示,本发明的抗CD3×Claudin18.2双特异性抗体JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7都能够有效促进CD8 T淋巴细胞中CD25+和CD69+双阳性细胞群体比例的增加,促进T细胞激活,EC50分别为1.323ng/mL、1.664ng/mL、127.5ng/mL和3.300ng/mL。
实施例9、双特异性抗体的CRS研究
细胞因子释放综合征(CRS)是由于免疫效应细胞和肿瘤细胞的交联导致大量的炎症因子释放。细胞因子的来源包括靶细胞本身和被募集至肿瘤部位的免疫细胞。这种连锁反应会导致免疫细胞的过度活化,导致更多的细胞因子活化,如肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素γ(IFNγ),其次还有白细胞介素IL-6、IL-10、IL-8和IL-2等。本实验分别在不同供体中检测了不同浓度的抗CD3×Claudin18.2双特异性抗体(溶液形式)与PBMC共孵育24小时之后,检测Th1和Th2细胞因子的释放水平,来评估抗CD3×Claudin18.2双特异性抗体是否能够引起细胞因子释放综合征。
实验检测溶液形式的JS202-7 CD3-Fv、JS202-7 012-Fv、JS202-7 CD3 130 012-Fv和JS202-7及阳性对照抗体OKT3以及阴性对照抗体anti-KLH hIgG4均以10μg/ml在体外水平与商业化的PBMC(Allcells,Cat#PB004F-C)孵育,PBMC的总量为3.0×105细胞/孔,该实验在2个不同donor(ID:LP200810、PCH20210100021)的PBMC中分别开展。细胞与抗体在37℃,5%CO2条件下孵育24h,第二天离心收集上清用BD CBA human Th1/Th2 cytokine kitⅡ检测细胞因子释放量。
如图24所示,PBMC与溶液形式的抗体共孵育,阳性对照为OKT3(可从登录号ATCCCRL 8001保藏于美国典型培养物保藏中心的杂交瘤获得),实验结果表明JS202-7 012-Fv和JS202-7 CD3 130 012-Fv能够明显降低引起细胞因子释放综合征的风险,且JS202-7CD3 130 012-Fv不会引起细胞因子释放综合征,JS202-7 CD3-Fv和JS202-7均会引起细胞因子释放综合征。
实施例10、双特异性抗体对小鼠MC38 hClaudin18.2细胞皮下移植瘤生长的抑制
取7-9周龄雌性B-hCD3e人源化小鼠(百奥赛图江苏基因生物技术有限公司),将MC38 hClaudin18.2细胞以1×106个/0.1mL浓度接种小鼠的右后背皮下,待肿瘤生长到约117mm3时按肿瘤体积随机分组,每组6只,共6组,分别为:G1生理盐水(生理盐水)阴性对照组,G2 JS202-7(0.1mg/kg)组,G3 JS202-7(0.3mg/kg)组,G4 JS202-7 CD3 130 012-FV(0.1mg/kg)组,G5 JS202-7 CD3 130 012-FV(0.3mg/kg)组和G6 JS202-7 CD3 130 012-FV(3mg/kg)组。通过腹腔注射给药,每周给药2次,给药体积为10μL/g,连续给药5次,末次给药3天后结束实验。每周测量肿瘤体积及体重2次,记录小鼠体重和肿瘤体积。实验结束时,动物安乐死,计算相对肿瘤抑制率TGI%=(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100%。Ti:治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值;T0:治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值;Vi:阴性对照组在给药第i天的肿瘤体积均值;V0:阴性对照组在给药第0天的肿瘤体积均值。
如图25所示,在动物给药后第17天,生理盐水组平均肿瘤体积为2066±422mm3,JS202-7(0.1mg/kg)组和JS202-7(0.3mg/kg)组平均肿瘤体积分别为1071±119mm3和994±196mm3,与生理盐水组相比,TGI分别为51.0%和55.0%,显著抑制肿瘤生长。G4 JS202-7CD3 130 012-FV(0.1mg/kg)组,G5 JS202-7 CD3 130 012-FV(0.3mg/kg)组和G6 JS202-7CD3 130 012-FV(3mg/kg)组平均肿瘤体积分别为1098±195mm3,854±83mm3和783±179mm3,与生理盐水组相比,TGI分别为49.7%,62.2%和65.8%,显著抑制肿瘤生长。
结果表明JS202-7 CD3 130 012-FV能够体内抑制B-hCD3e人源化小鼠MC38hClaudin18.2细胞皮下移植瘤的生长。
实施例11、双特异性抗体的稳定性
11.1双抗结构的热稳定性
测试目的:
在pH6.0的缓冲体系(20mM组氨酸盐酸组氨酸+230mM蔗糖)中,利用nanoDSF(差示扫描荧光技术)检测JS202-7双抗结构的热稳定性。测试双抗为:JS202-7 CD3 130 012-Fv、JS202-7 CD3 132 012-Fv、JS202-7 CD3 238 012-Fv、JS202-7 CD3 285 012-Fv,其中JS202-7 CD3 132 012-Fv、JS202-7 CD3 238 012-Fv、JS202-7 CD3 285 012-Fv与JS202-7CD3 130 012-Fv相比,仅CD3序列不同;将JS202-7 CD3 130 012-Fv中CD3的VH/VL序列分别替换为JSCD3-130、JSCD3-132、JSCD3-238、JSCD3-285的VH/VL序列,即可得到JS202-7 CD3132 012-Fv、JS202-7 CD3 238 012-Fv、JS202-7 CD3 285 012-Fv。
测试过程及结果:
将双抗JS202-7样品置换到上述的缓冲体系中,控制样品浓度在10mg/ml左右,利用DSF进行检测。结果见表18,JS202-7双抗结构表现了良好的热稳定性。
表18:双特异性抗体的热稳定性
样品 | Tm1(℃) | Tm2(℃) |
JS202-7 CD3 130 012-Fv | 63.7 | 79.1 |
JS202-7 CD3 132 012-Fv | 63.8 | 79.4 |
JS202-7 CD3 238 012-Fv | 68.1 | 79.5 |
JS202-7 CD3 285 012-Fv | 67.8 | 79.1 |
注:Tm为热转化温度。
11.2双抗结构的长期稳定性
测试目的:
检测JS202-7双抗结构长期条件下稳定性。测试双抗为:JS202-7 CD3 130 012-Fv、JS202-7 CD3 132 012-Fv、JS202-7 CD3 238 012-Fv、JS202-7 CD3 285 012-Fv,其中JS202-7 CD3 132 012-Fv、JS202-7 CD3 238 012-Fv、JS202-7 CD3 285 012-Fv与JS202-7CD3 130 012-Fv相比,仅CD3序列不同;将JS202-7 CD3 130 012-Fv中CD3的VH/VL序列分别替换为JSCD3-130、JSCD3-132、JSCD3-238、JSCD3-285的VH/VL序列,即可得到JS202-7 CD3132 012-Fv、JS202-7 CD3 238 012-Fv、JS202-7 CD3 285 012-Fv。
SEC纯度检测方法:
采用安装了BEHSEC色谱柱的高效液相色谱仪检测各组分样品SEC纯度。流动相为50mM PB-300mM Na2SO4(pH 6.8±0.2),流速为0.5mL/min,检测波长为280nm,供试品进样100μg,使用高效液相色谱仪检测。采用面积归一化进行定量分析,以单体的峰面积百分比作为样品的纯度,聚体和片段的峰面积百分比为聚体和片段的含量。
CE-SDS还原检测方法(r-CE-SDS):
采用安装了CE-SDS卡盒的毛细管电泳仪(Maurice仪器)检测各组分样品CE-SDS还原纯度。供试品溶液(1mg/mL)95μl加入2-巯基乙醇5μL,70℃孵育变性热处理15min,使用毛细管电泳仪(Maurice)检测。按面积归一化法计算,以轻链和重链的修正峰面积分别占所有修正峰面积之和的百分比分别计算轻链、重链1和重链2纯度,三者之和即为样品的总纯度。
CE-SDS非还原检测方法(nr-CE-SDS):
采用安装了CE-SDS卡盒的毛细管电泳仪(Maurice仪器)检测各组分样品CE-SDS非还原纯度。供试品溶液(1mg/mL)95μL加入0.25M N-乙马来酰亚胺5μL,70℃孵育变性热处理5min,使用毛细管电泳仪(Maurice)检测。按面积归一化法计算,以主峰的修正峰面积占所有修正峰面积之和的百分比计算纯度。
icIEF检测方法:
采用安装了icIEF卡盒的毛细管电泳仪(Maurice仪器)检测各组分样品等电点。供试品经iCIEF混合液稀释处理后,使用毛细管电泳仪(Maurice)检测。不同等电点组分被聚焦在不同位置而达到聚焦和分离的效果。
结合ELISA实验(与Human CD3E结合)检测方法:
本实验均在37℃条件下进行,使用Thermo Scientific的酶标仪,用固定浓度的His标签human CD3E(1.0μg/mL)包板90min,洗板后用2%BSA封闭90min,加入梯度稀释的JS202样品(1μg/mL起始,3倍梯度稀释至0.005645ng/mL,共12个浓度)孵育60min,洗板后加入稀释5000倍的Mouse Anti-Human IgG4 Fc-HRP作为检测抗体孵育60min进行检测,然后用0.1mg/mL TMB显色15min,最后用2M HCl终止反应,在450nm/620nm下读板。使用GraphPadPrism软件中四参数对数回归(4PL)模型拟合及获取相应的EC50。
细胞活性检测方法:
抗CD3×Claudin18.2双抗,能够与靶细胞上的Claudin18.2结合,进一步结合表达CD3的T细胞,从而激活T细胞下游信号通路。我们利用内源性表达人CD3的NFAT通路荧光素酶系统,以过表达Claudin18.2的CHO细胞为靶细胞,通过报告基因系统检测双抗活性。
测试过程及结果:
将JS202-7双抗置换到pH6.0的缓冲体系(20mM组氨酸盐酸组氨酸+230mM蔗糖)中,控制样品浓度在10mg/ml左右,分装一定体积(1mL/管)的JS202-7双抗样品放置于5±3℃医用冷藏箱,考察0W、2W和4W稳定性,根据时间点检测样品纯度和生物学活性。检测结果显示JS202-7双抗具有良好的长期稳定性,具体见表19。
表19:双特异性抗体的长期稳定性
注:“/”表示未检测。
实施例12、双特异性抗体的活性研究
12.1CD3×CD20双抗与CHO-hCD3细胞的结合研究
将CHO-hCD3细胞(在CHO细胞上面过表达了人CD3蛋白)与不同浓度的双特异性抗体JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv及对照抗体(起始浓度为100μg/ml,3倍稀释,共10个浓度梯度)在4℃孵育30min,然后洗涤并与荧光标记的二抗在4℃条件下避光孵育30分钟。最后用流式细胞仪(BD CantoⅡ)收集细胞,检测细胞表面结合的荧光抗体。用FlowJo分析原始数据得到MFI值,并通过GraphPad拟合抗体剂量依赖性的结合曲线(图26)并计算EC50,阳性对照为REGN1979(Regeneron Pharmaceuticals)。
如图26所示,REGN1979、JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv能够与细胞表面的人CD3结合,EC50分别为0.97μg/mL、0.09198和0.6511μg/mL。
12.2双特异性抗体与Raji细胞的结合
将Raji细胞(一种人B淋巴瘤细胞,CD20阳性)与不同浓度的双特异性抗体JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv及对照抗体(起始浓度为100μg/ml,3倍稀释,共10个浓度梯度)在4℃孵育30min,然后洗涤并与荧光标记的二抗在4℃条件下避光孵育30分钟。最后用流式细胞仪(BD CantoⅡ)收集细胞,检测细胞表面结合的荧光抗体。用FlowJo分析原始数据得到MFI值,并通过GraphPad拟合抗体剂量依赖性的结合曲线(图27)并计算EC50,阳性对照为REGN1979(Regeneron Pharmaceuticals))。
如图27所示,REGN1979、JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv均能够以高亲和力与Raji细胞表面的CD20结合,EC50分别为2.251μg/mL、1.316μg/mL和1.939μg/mL。
12.3双特异性抗体在荧光素酶报告基因系统中的活性检测
将靶细胞Raji(一种人B淋巴瘤细胞,CD20阳性)和效应细胞Jurkat NFAT(稳定表达luc2P/NFAT-RE)分别按照每孔5×104个细胞和每孔1×105个细胞数加入96孔平底白板中(Corning,Cat#3917)。之后用实验缓冲液(RPMI 1640(1X)+2%FBS)将双特异性抗体JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv及对照抗体(起始浓度为1μg/ml,3倍稀释,共12个浓度梯度)加入到细胞板中,并在37℃培养箱中共孵育4-6小时。最后在细胞抗体混合体系中加入ONE-Glo荧光素酶检测试剂(Promega)并用多功能酶标仪(TECAN M1000 pro)检测化学发光信号。通过GraphPad prism软件拟合四参数回归曲线,计算EC50值。
如图28所示,REGN1979、JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv在效应细胞Jurkat NFAT和靶细胞Raji细胞构成的荧光素酶报告基因系统中有很强的的激活T细胞的活性,EC50分别为10.84ng/mL、0.3967ng/mL和2.780ng/mL。
12.4双特异性抗体对T淋巴细胞的激活活性研究
抗CD3/CD20双特异性抗体能够有效促进外周血单核细胞中T淋巴细胞的激活,一般细胞表面标志物CD69的表达上调是T细胞激活早期的标志,而细胞表面标志物CD25的表达上调是T细胞激活后期的标志,本实验用CD25和CD69双阳性群体的比例上调来评估本研究中抗CD3/CD20双特异性抗体对T细胞的激活作用。
用人总T细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotec,Cat#130-096-535)从商业化的PBMC(Allcells,Cat#PB004F-C)中分离纯化出人总T细胞;然后将纯化的人总T细胞(每孔1X105个细胞)和Raji细胞(每孔2×104个细胞)以及梯度稀释的JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv及对照抗体(起始浓度为10μg/ml,5倍稀释,共12个浓度梯度)在96孔板中37℃共孵育24h。最后收集细胞,用APC抗人CD8a(Biolegend,Cat#301049)、PE抗人CD25(Biolegend,Cat#302606)、BV421抗人CD69(BD,Cat#562884)染色后,用流式细胞仪(BD,CantoⅡ)上机检测。利用FlowJo软件导出CD8+T细胞上CD25+CD69+双阳性细胞群体的比例,再通过GraphPad prism软件拟合四参数回归曲线,计算EC50值。
如图29所示,本发明的抗CD3/CD20双特异性抗体REGN1979、JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv都能够有效促进CD8 T淋巴细胞中CD25+和CD69+双阳性细胞群体比例的增加,促进T细胞激活,EC50分别为2.583ng/mL、0.2193ng/mL和5.499ng/mL。
12.5双特异性抗体CRS研究
本研究检测溶液形式的双特异性抗体和对照抗体在体外水平与静息状态下PBMC孵育,引起细胞因子释放的排版布局。该实验在1640完全培养基(RPMI 1640 Medium+10%FBS)条件下孵育,加入50μl的PBMC(3.0×105细胞/孔)。在4个不同donor(LP210817011,LP210825006,LP210821004和PCH202100025)的PBMC中分别开展,抗体检测浓度为10μg/ml,每孔50μl,每个条件设3个复孔。细胞与抗体在37℃,5%CO2条件下孵育24h,第二天离心收集上清用BD CBA human Th1/Th2 cytokine kitⅡ检测细胞因子释放量。
如图30所示,静息状态下PBMC与溶液形式的抗体共孵育,阳性对照为OKT3,实验结果表明,双抗分子以溶液的形式会诱导人PBMC大量释放细胞因子,特别是IL-6和IFN-γ。这可能是因为在反应体系中,有靶细胞CD20+B细胞的存在,因此引起了很强的T细胞激活和多个细胞因子的释放,故在后续临床试验中,需要额外关注继发于药理作用的细胞因子释放风险,做好细胞因子风暴的预防措施,另外JS203-7-JSCD3-CD20-Fv和JS203-7-CD3 130-CD20-Fv的CRS与阳性对照OKT3相比较低,与REGN1979相当。
Claims (20)
1.一种双特异性抗体,其包含第一结合结构域、第二结合结构域和第三结合结构域,其中所述第一结合结构域与CD3结合,所述第二结合结构域和所述第三结合结构域与肿瘤相关抗原结合,所述第一结合结构域具有Fab分子的形式,所述第二结合结构域具有Fv分子或scFv分子的形式,和所述第三结合结构域具有Fab分子的形式。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体,其中,所述肿瘤相关抗原选自BCMA、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CDK4、CEA、Claudin 18.2、EGFR、ROR1、TGF-β和5T4;优选地,所述肿瘤相关抗原是Claudin 18.2、CD20或BCMA。
3.如权利要求1-2中任一项所述的双特异性抗体,其具有四条多肽链,其中所述第一多肽链自N端到C端具有VH1-CH1-连接肽-VL2-连接肽-铰链区-第一Fc区,所述第二多肽链自N端到C端具有VL1-CL-连接肽-VH2;所述第三多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-铰链区-第二Fc区,所述第四多肽链自N端到C端具有VL2-CL;
优选地,所述第一多肽链的VH1-CH1与所述第二多肽链的VL1-CL形成所述第一结合结构域,所述第一多肽链的VL2与所述第二多肽链的VH2形成所述第二结合结构域,所述第三多肽链的VH2-CH1与所述第四多肽链的VL2-CL形成所述第三结合结构域。
4.如权利要求1-2中任一项所述的双特异性抗体,其具有四条多肽链,其中所述第一多肽链自N端到C端具有VH1-CH1-连接肽-VL2-连接肽-VH2-连接肽-铰链区-第一Fc区,所述第二多肽链自N端到C端具有VL1-CL;所述第三多肽链自N端到C端具有VH2-CH1-铰链区-第二Fc区,所述第四多肽链自N端到C端具有VL2-CL;
优选地,所述第一多肽链的VH1-CH1与所述第二多肽链的VL1-CL形成所述第一结合结构域,所述第一多肽链的VL2-连接肽-VH2形成所述第二结合结构域,所述第三多肽链的VH2-CH1与所述第四多肽链的VL2-CL形成所述第三结合结构域。
5.如权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体,其中,所述第一结合结构域包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为:
HCDR1:X1YAMN,其中,X1为T或K;
HCDR2:RIRSKYNNYATYYAX2SVKX3,其中,X2为D或A,X3为D或G;
HCDR3:HGX3X4GX5X6X7X8X9X10X11AY,其中,X3为N或A,X4为F或A,X5为N或A,X6为S或A,X7为Y或A,X8为V或A,X9为S或A,X10为W或A,X11为F或A;
LCDR1:X12SSTGAVTTX13NYX14N,其中,X12为R或G,X13为S或G,X14为A或P;
LCDR2:GTNKRAP;
LCDR3:AX15X16X17X18X19X20X21X22,其中,X15为L或A,X16为W或A,X17为Y或A,X18为S或A,X19为N或A,X20为L或A,X21为W或A,X22为V或A;
优选地,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为:
HCDR1:X1YAMN,其中,X1为T或K;
HCDR2:RIRSKYNNYATYYAX2SVKX3,其中,X2为D或A,X3为D或G;
HCDR3:HGX3X4GX5X6X7X8X9X10X11AY,其中,X3为N,X4为F,X5为N或A,X6为S或A,X7为Y或A,X8为V或A,X9为S或A,X10为W,X11为F或A;
LCDR1:X12SSTGAVTTX13NYX14N,其中,X12为R或G,X13为S或G,X14为A或P;
LCDR2:GTNKRAP;
LCDR3:AX15X16X17X18X19X20X21X22,其中,X15为L或A,X16为W,X17为Y或A,X18为S或A,X19为N或A,X20为L或A,X21为W,X22为V或A。
6.如权利要求5所述的双特异性抗体,其中,所述第一结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3或4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5-22中任一项所示、优选如SEQ ID NO:5、9、10、11、15、17、18、19或20所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23或24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:26-42中任一项所示、优选如SEQ ID NO:26、28、30、33、35、36、37、39、40、41或42所示的LCDR3;
优选地,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3为:
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3;或
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3;或
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5-22中任一项所示的HCDR3;
所述LCDR1、LCDR2、LCDR3为:
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的LCDR3;或
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26-42中任一项所示的LCDR3。
7.如权利要求6所述的双特异性抗体,其中,所述第一结合结构域包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的LCDR3;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、33、36或37中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、35、37、39或40中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、33、40、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26、28、33、35、36、37、40、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26或30所示的LCDR3;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:33、35、36、37或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、35、36、37、39、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:28、33、35、36、40、41或42中任一项所示的LCDR3;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:9、10或19中任一项所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ IDNO:23所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(Ⅻ)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示的LCDR3。
8.如权利要求1所述的双特异性抗体,其中,所述第一结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:43-62中任一项所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63-81中任一项所示的VL;优选地,所述第一结合结构域包含:
(Ⅰ)氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示的VL;或
(Ⅱ)氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65、67、72、75或76所示的VL;或
(Ⅲ)氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、74、76、78或79所示的VL;或
(Ⅳ)氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、72、79、80或81所示的VL;或
(Ⅴ)氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65、67、72、74、75、76、79、80或81所示的VL;或
(Ⅵ)氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:65或69所示的VL;或
(Ⅶ)氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:72、74、75、76或81所示的VL;或
(Ⅷ)氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、74、75、76、78、80或81所示的VL;或
(Ⅸ)氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:67、72、74、75、79、80或81所示的VL;或
(Ⅹ)氨基酸序列如SEQ ID NO:49、50或59中任一项所示的VH,和氨基酸序列如SEQ IDNO:63所示的VL;或
(Ⅺ)氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的VL;或
(Ⅻ)氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示的VL。
9.如权利要求1-8中任一项所述的双特异性抗体,其中,所述第二结合结构域和第三结合结构域与Claudin 18.2结合,其分别包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:121所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:122所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:123所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:124所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:125所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:126所示的LCDR3;或所述第二结合结构域和第三结合结构域与CD20结合,其分别包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:127所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:128所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:129所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:131所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:132所示的LCDR3;
优选地,所述第二结合结构域和第三结合结构域与Claudin 18.2结合,其分别包含:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:133所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:134所示的VL;或(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:166所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:167所示的VL;或所述第二结合结构域和第三结合结构域与CD20结合,其分别包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:135所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示的VL。
10.如权利要求3-9中任一项所述的双特异性抗体,其中,所述第一Fc区为knob-Fc,所述第二Fc区为hole-Fc;
优选地,所述第一Fc区与所述第二Fc区之间通过铰链区的二硫键和杵臼结构连接;
优选地,所述第一Fc区和/或第二Fc区为来自IgG的Fc区,优选为来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区;
优选地,所述第CH1为来自IgG的CH1,优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1;
优选地,所述CL为来自λ或κ轻链的CL;
优选地,所述连接肽包含G(甘氨酸)、S(丝氨酸)和A(丙氨酸)或由G和S组成的柔性多肽,其长度可为2-30个氨基酸残基;进一步优选地,连接肽包括但不限于(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n和AS(GGGGS)n等,n为1、2、3、4、5或6。
11.如权利要求1所述的双特异性抗体,其具有四条多肽链,所述四条多肽链分别为:
(1)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列;或
(2)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列;或
(3)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:148所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列;或
(4)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:150所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列;或
(5)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:155所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列;或
(6)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列;或
(7)所述第一多肽链具有如SEQ ID NO:164所示的氨基酸序列,所述第二多肽链具有如SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列,所述第三多肽链具有如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列,所述第四多肽链具有如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列。
12.一种多核苷酸分子,其核苷酸序列选自:
(1)编码权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体的核苷酸序列;和
(2)如(1)所述核苷酸序列的互补序列。
13.一种表达载体,其包含如权利要求12所述的多核苷酸分子,优选地,所述表达载体为真核表达载体。
14.一种宿主细胞,其包含如权利要求12所述的多核苷酸分子,或包含如权利要求13所述的表达载体,或表达权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体;优选地,所述宿主细胞是真核细胞,更优选哺乳动物细胞。
15.一种制备如权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体的方法,所述方法包括在适合于所述双特异性抗体表达的条件下培养权利要求14所述的宿主细胞,使其表达所述权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体,并从所述宿主细胞回收所表达的双特异性抗体。
16.一种药物组合物,其包含权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体、权利要求12所述的多核苷酸分子、权利要求13所述的表达载体或权利要求14所述的宿主细胞,和药学上可接受的载体或赋形剂。
17.权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体、权利要求12所述的多核苷酸分子、权利要求13所述的表达载体、权利要求14所述的宿主细胞或权利要求16所述的药物组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途;优选地,所述癌症与CLDN18或CD20相关;更优选地,所述癌症选自胃癌、食道癌、胃食管癌、胰腺癌、胆管癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌、肠癌和膀胱癌;或所述癌症选自急性B淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、滤泡淋巴瘤,非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓细胞白血病和Burkitt淋巴瘤。
18.一种抗体,其包含结合CD3的结合结构域和结合CD20的结合结构域,其中,所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;所述结合CD20的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:127所示的HCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:128所示的HCDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:129所示的HCDR3,氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的LCDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:131所示的LCDR2,和氨基酸序列如SEQ ID NO:132所示的LCDR3;
优选地,所述结合CD3的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的VL,所述结合CD20的结合结构域包含:氨基酸序列如SEQID NO:135所示的VH,和氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示的VL。
19.如权利要求18所述的抗体,所述抗体的Fc区为来自IgG的Fc,例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc,和/或所述抗体的CL为来自λ或κ轻链的CL;优选地,所述Fc区包含杵臼结构。
20.如权利要求18或19所述的抗体,所述抗体具有四条多肽链,所述四条多肽链分别为:
(1)具有如SEQ ID NO:150所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(2)具有如SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:155所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列的第四多肽链;或
(3)具有如SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列的第一多肽链,具有如SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列的第二多肽链,具有如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列的第三多肽链,具有如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列的第四多肽链。
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