CN106177991B - miR-130b在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miR‑130b在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。本发明揭示了miR‑130b在整个I型干扰素通路过程中起着负向调控的作用，miR‑130b或其类似物可以有效地缓解自身免疫性疾病如狼疮肾炎，因此miR‑130b可以作为自身免疫性疾病如狼疮肾炎干预治疗的一个新靶点。

Description

miR-130b在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及miR-130b在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

背景技术

自身免疫性疾病是机体对自身抗原发生免疫应答而导致自身组织损害所引起的疾病。自身免疫性疾病可分为器官特异性和全身性自身免疫性疾病。而后者全身性自身免疫性疾病，又称系统性自身免疫疾病。患者的病变可见于多种器官和组织，系统性红斑狼疮(SLE)是典型的全身性自身免疫性疾病。自身抗体和自身反应性T淋巴细胞介导的对自身成分发生的获得性免疫应答是自身免疫性疾病发生的原因。因为I型干扰素在先天免疫和适应免疫中发挥着重要的功能和作用，所以它往往在一些自身免疫性疾病，如系统红斑狼疮，多发性硬化，干燥症，胰岛素依赖型糖尿病等中扮演着重要的角色。

而狼疮肾炎(lupus nephritis，LN)是SLE最普遍、最严重的并发症之一。虽然狼疮肾炎的具体发病机理至今仍不是十分清楚，但目前的研究显示狼疮肾炎是由自身免疫复合物沉积在肾脏从而导致的一系列免疫反应发生以及相应的肾脏损伤。对于狼疮肾炎的治疗，现今主要使用一些免疫抑制剂或者激素，但是对于患者的副作用还是比较大的。

Ι型干扰素，是一类具有抗病毒、抗细菌感染和免疫调节功能的细胞因子，在先天免疫和适应免疫发挥着重要作用。近来研究发现，在系统性红斑狼疮(SLE)中，Ι型干扰素通路是异常活化的，活化的Ι型干扰素通路可以激活自身反应的T细胞、DC细胞和B细胞等，从而促进自身免疫反应，加重SLE患者的病情。在最近的更多研究中发现，Type I IFN可以加重一些自发狼疮小鼠(如NZB/W F1小鼠)肾炎的发生。例如，IFNα-adv诱导的NZB/W F1小鼠就是一种加速狼疮肾炎发生的模型。通过将IFNα-adv尾静脉注射到狼疮小鼠NZB/W F1中，在短时间内(7w-9w)NZB/W F1小鼠就会产生大量的蛋白尿，狼疮特异性抗体(如抗dsDNA抗体)以及相应的狼疮肾小球肾炎(Mathian,A.,et al.,IFN-Induces Early Lethal Lupusin Preautoimmune(New Zealand Black x New Zealand White)F1but Not in BALB/cMice.The Journal of Immunology,2005.174(5):p.2499-2506)。这些发现都为研究狼疮肾炎的发病机制以及治疗提供了很好的疾病模型。

肾系膜细胞(renal mesangial cells，RMCs)是构成肾小球细胞群的主要细胞之一，起着维持整个肾小球环境稳定平衡的作用。在狼疮肾炎中，当自身免疫复合物沉积在肾小球表面上时，肾系膜细胞自身会产生相应的炎症反应，如分泌一些趋化因子及细胞因子，致使血液中的免疫细胞迁移至肾脏，导致肾脏的损伤。因此通过在肾系膜细胞中探究一些信号通路(如I型干扰素通路)的调控机制，可以为了解肾炎的具体发病机理提供更好的支持背景。

发明内容

本发明的目的在于提供miR-130b在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

在本发明的第一方面，提供一种miR-130b或其上调剂在制备预防、缓解或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

在一个优选例中，所述的miR-130b上调剂包括：miR-130b类似物，miR-130b激动剂。

在另一优选例中，所述的miR-130b类似物正向序列如SEQ ID NO:2所示；反向序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述的药物还用于：负向调控Type I IFN通路及其下游基因(包括IFIT1、CCL5)的表达。

在另一优选例中，所述的药物还用于：抑制STAT1磷酸化。

在另一优选例中，所述的自身免疫性疾病包括：狼疮肾炎，多发性硬化，类风湿性关节炎，干燥综合症，胰岛素依赖型糖尿病，重症肌无力。

在本发明的另一方面，提供一种miR-130b的用途，用于筛选缓解、预防或治疗自身免疫性疾病的药物。

在本发明的另一方面，提供一种预防、缓解或治疗自身免疫性疾病的药物，所述的药物是miR-130b类似物或激动剂。

在一个优选例中，所述的药物是miR-130b类似物，其正向序列如SEQ ID NO:2所示；反向序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明的另一方面，提供一种筛选预防、缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达miR-130b的体系；和

(2)检测所述体系中miR-130b的表达；

其中，若所述候选物质可提高(优选显著提高，如提高20％以上，较佳的提高50％以上；更佳的提高80％以上)miR-130b的表达，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达miR-130b的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中miR-130b的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miR-130b的体系；

如果测试组中miR-130b的表达在统计学上高于(优选显著高于，如提高20％以上，较佳的提高50％以上；更佳的提高80％以上)对照组，就表明该候选物是预防或治疗自身免疫性疾病的潜在物质。

在另一优选例中，所述的候选物质可以是：基于miR-130b或调控其表达的基因或蛋白而设计的大分子(如肽、过表达载体)或小分子(如化合物)。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗自身免疫性疾病有用的物质。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、miR-130b显著抑制Type I IFN诱导的下游基因表达。

1a、在小鼠原代肾系膜细胞中，转入miR-130b类似物mimics(mir 130b)及阴性对照(NC)，1000U/ml Type I IFN刺激6hr,检测其下游基因表达。

1b、转入miR-130b抑制剂inhibitor(I130b)及阴性对照(INC)，Type I IFN刺激6hr。

1c、分别转入miR-130b类似物(mir 130b)24hr后或抑制剂(I130b)48hr后，Type IIFN刺激6hr，检测细胞上清中CCL5的表达水平。

图2、miR-130b通过抑制STAT1磷酸化来负向调控Type I IFN通路。

2a、在小鼠原代肾系膜细胞中，分别转入miR-130b类似物mimics(miR-130b)及阴性对照(NC)，24hr之后，Type I IFN刺激细胞。

2b、分别转入miR-130b抑制剂inhibitor(I130b)及阴性对照(INC)至细胞中，48hr之后，Type I IFN刺激细胞。

图3、活体过表达miR-130b可以抑制IFNα-adv诱导的NZB/W F1小鼠(IFNadv F1)狼疮肾炎的发生。

3a、在注射IFNα-adv第49天后，采集小鼠肾脏组织并抽提RNA，检测其miR-130b的表达水平。

3b、在注射IFNα-adv的第21天，35天，49天，收集小鼠的24hr尿液。采用BCA方法检测其尿蛋白。

3c、在注射IFNα-adv第49天后杀获取小鼠肾脏组织，进行石蜡切片以及PAS染色。

具体实施方式

本发明人在研究中发现，整个I型干扰素通路过程中miR-130b起着负向调控的作用，miR-130b或其类似物(模拟物)可以有效地缓解自身免疫性疾病如狼疮肾炎，因此miR-130b可以作为自身免疫性疾病如狼疮肾炎干预治疗的一个新靶点。

miR-130b及其治疗用途

本发明中，所述的miR-130b是具有SEQ ID NO:1所示核酸序列的小核糖核酸(MIMAT0000387)：

5’-CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU-3’(SEQ ID NO:1)。

在本发明的实施例中，在小鼠原代肾系膜细胞中，通过采用miR-130b的mimics来过表达miR-130b或miR-130b的inhibitor来抑制其表达，并且利用western blotting等一系列实验，检测miR-130b对I型干扰素通路的影响。进一步地联合活体的干预实验，将miR-130b的人工合成类似物agomir通过尾静脉注射入IFNα-adv诱导的狼疮NZB/W F1小鼠中，观察其对于狼疮肾炎诱导的影响。采用RT-qPCR检测miR-130b的过表达效率。通过接取小鼠的24H尿液来观察蛋白尿的改变。对肾脏组织切片进行PAS染色，从而分析小鼠的肾脏病理变化。结果，在小鼠原代肾系膜细胞中，miR-130b通过显著降低STAT1的磷酸化进而抑制TypeI IFN诱导的下游基因表达。在活体干预实验中，注射miR-130b agomir的小鼠其狼疮肾炎得到缓解。

基于本发明的阐述，miR-130b是一个新的、与自身免疫性疾病密切相关的药物靶点。针对miR-130b的各种治疗手段可以作为防治动物(特别是人)的自身免疫性疾病的新颖且有效的手段。

并且，miR-130b也可以用于作为药物筛选的靶点，筛选通过提高miR-130b的表达或活性而缓解或治疗自身免疫性疾病的药物。

本发明中，所述的miR-130b可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了miR-130b或其前体的序列后，本领域人员可以方便地制备获得miR-130b或其前体。

miR-130b上调剂的治疗用途

基于本发明人的新发现，所述的miR-130b或其上调剂可用于制备缓解或治疗自身免疫性疾病的组合物，特别是药物组合物。

所述的miR-130b的上调剂是指任何可提高miR-130b或其前体的活性、提高miR-130b或其前体的稳定性、上调miR-130b或其前体的表达、增加miR-130b或其前体有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调miR-130b有用的物质，从而可用于缓解或治疗自身免疫性疾病。

作为本发明的优选方式，所述的miR-130b上调剂是miR-130b的类似物(mimics)或激动剂(Agomir)，其具有与所述miR-130b相同的效果，或者能够提高miR-130b的表达或活性。

所述的miR-130b的上调剂可以是经修饰的上调剂，所述的修饰包括：甲氧基化修饰、硫代修饰、胆固醇修饰、烷基修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、和/或磷酸骨架由磷脂连接代替的反义核82F7酸。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的miR-130b或其上调剂(包括类似物或激动剂)，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于缓解或治疗自身免疫性疾病。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

在得知了所述miR-130b或其上调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的miR-130b或其上调剂或它们的药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等。

本发明所述的miR-130b或其上调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的miR-130b或其上调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的miR-130b或其上调剂每天以约0.01mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.1mg-20mg/kg动物体重；如9-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

miR-130b作为自身免疫性疾病预后的标志物

根据本发明人的研究成果，miR-130b是一个新的、与自身免疫性疾病的预后密切相关的靶点。针对miR-130b的各种检测试剂可以用于自身免疫性疾病的预后，早期评估自身免疫性疾病治疗药物的疗效，优化治疗方案。可藉由miR-130b表达水平在用药前后的高低，评判患者在治疗后是否需要长期用药。

可采用各种本领域已知的技术来检测细胞内miR-130b的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如原位杂交法，聚合酶链式反应技术(PCR)，Southern印迹法、DNA序列分析等，这些方法可结合使用。

本发明还提供了用于在分析物中检测miR-130b的存在与否以及表达情况的试剂。作为一种优选方式，可以采用特异性扩增miR-130b的引物；或特异性识别miR-130b的探针来确定miR-130b的存在与否。

针对miR-130b的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与miR-130b上特定位点发生特异性结合，而不与miR-130b以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。

药物筛选

在得知了miR-130b与自身免疫性疾病的密切相关性后，可以基于该特征来筛选提高miR-130b的表达(及miR-130b的上调剂)的物质。可从所述的物质中找到对于预防或治疗自身免疫性疾病真正有用的药物。

因此，本发明提供一种筛选缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达miR-130b的体系；和检测所述体系中miR-130b的表达；若所述候选物质可提高miR-130b的表达，则表明该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质。所述的表达miR-130b的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达miR-130b的细胞；或可以是重组表达miR-130b的细胞。所述的表达miR-130b的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR-130b的表达的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miR-130b的体系。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于缓解或治疗自身免疫性疾病真正有用的物质。

本发明对于miR-130b的表达、活性、存在量的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的基因定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：聚合酶链式反应技术(PCR)，Southern印迹法等。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于提高miR-130b的表达和活性，进而缓解或治疗自身免疫性疾病有用的物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、小鼠原代肾系膜细胞培养和转染

从C57/B6的小鼠肾脏获取肾皮质，通过一系列大小不同的细胞筛网(BD公司)，将获得的肾小球悬液加入Collagenase D(Roche公司)，37℃孵育30min，随后终止消化并且离心去上清，培养于DMEM(加10％小牛血清，加20％F12，加1.5％HEPES，加100U/ml青霉素-链霉素)培养基中，37℃5％CO₂，传至第四代使用。

小鼠原代肾系膜细胞按照LipoRNAiMAX说明书方法转染入miR-130b类似物mimics及阴性对照(NC)等。miR-130b的类似物(mimics)及抑制剂(inhibitor)及相应的阴性对照由上海吉玛公司合成。

miR-130b类似物的序列为：

正向：5’-CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU-3’(SEQ ID NO:2)，

反向：3’-GCCCUUUCAUCAUUGCACUGUU-5’(SEQ ID NO:3)。

miR-130b抑制剂的序列为：

5’-AUGCCCUUUCAUCAUUGCACUG-3’(SEQ ID NO:4)。

Agomir negative control(NC)的序列为：

5’-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3’(SEQ ID NO:5)，胆固醇修饰。

2、RNA抽提和逆转录

小鼠原代肾系膜细胞培养于24孔，用LipoRNAiMAX脂质体转染方法转染miR-130b(200nM)及阴性对照(NC)的类似物mimics，或miR-130b(400nM)及阴性对照(INC)的抑制剂inhibitor，4hr后换液，24hr或48hr后加入Type I IFN(1000u/ml，PBL公司)，刺激6hr后，除去上清，使用酚氯仿法抽提RNA。NZB/W F1小鼠的肾脏进行组织研磨并且也采用酚氯仿法抽提RNA。

应用酚氯仿法抽提Trizol(Invitrogen公司产品)得到的RNA用毛细管电泳(NanoDrop Specthophotometer)鉴定其完整性和测定其浓度。miRNA的逆转录是经miRNAs特异性引物(Applied Biosystems公司)进行的，加样体系为dNTP 0.03ul、MMLV 0.2ul、10×Buffer 0.3ul、RNase Inhibitor 0.02ul、ddH₂O(Without RNase)0.45ul、Primer 1ul和RNA 1ul，逆转录反应条件为16℃*30min 42℃*30min 85℃*5min。mRNA的逆转录采用PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa公司)，加样体系为10ul，逆转录反应条件为37℃*15min85℃*5s。

3、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

在ABI ViiA7测序仪(Applied Biosystems公司)上进行实时荧光定量PCR操作。

4、免疫印迹实验(western blotting)

小鼠原代肾系膜细胞细胞培养于6孔板，用LipoRNAiMAX脂质体转染方法转染miR-130b类似物mimics(200nM)及阴性对照(NC)，或其抑制剂inhibitor(400nM)及阴性对照(INC)，4hr后换液，24hr或48hr后加入1000u/mlType I IFN，应用RIPA Buffer(Thermo公司)裂解法抽提总蛋白。采用抗体pSTAT1(CST公司)，STAT1(Santa Cruz公司)，β-tubulin(abcam公司)。

5、酶联免疫吸附实验(ELISA)

小鼠原代肾系膜细胞培养于24孔，转染miR-130b的mimics(200nM)或inhibitor(400nM)及相应阴性对照，24hr或48hr加入1000u/ml Type I IFN刺激6hr，吸取上清，用小鼠的CCL5ELISA kit(R&D公司和上海西唐公司)检测细胞上清CCL5水平。

6、miR-130b体内干预IFNα-adenovirus(adv)诱导的NZB/W F1小鼠狼疮肾炎实验

miR-130b的类似物agomir及阴性对照来自于广东锐博公司，NZB和NZW小鼠来自于美国Jaxson lab，将雌性NZB与雄性NZW小鼠交配产生NZB/W F1狼疮小鼠，所有小鼠均在SPF环境下饲养。

将IFNα-adv以及Ctrl-adv(山东Vigene公司)分别尾静脉注射(10⁹vp)至6周(w)大小的NZB/W F1小鼠。第21天之后，在IFNα-adv处理组中，分别尾静脉注射mir-130b agomir及阴性对照(NC)(24nm)至NZB/W F1小鼠中，连续注射3天。第35天之后，再次重复先前的处理。第49天之后，杀死小鼠并收集肾脏等组织。

7、小鼠24小时(H)尿蛋白测定

使用小鼠代谢笼采取IFNα-adv或ctrl-adv注射后的第21天，35天，49天的NZB/WF1小鼠的24h尿液，采用BCA蛋白定量法，测定小鼠24h尿液中的总蛋白。

8、小鼠肾脏组织病理分析

将NZB/W F1小鼠的肾脏用甲醛固定，进行石蜡切片，采用PAS染色，分析其病理变化。

实施例1、miR-130b能显著抑制Type I IFN诱导的下游基因的表达

本发明人将miR-130b类似物mimics及阴性对照(NC)转入小鼠原代肾系膜细胞中，Type I IFN刺激6hr后，检测Type I IFN诱导的下游基因表达，与对照相比，miR-130b可以显著抑制Type I IFN诱导的下游基因表达，如IFIT1、CCL5(图1a)。

同时将miR-130b抑制剂inhibitor(I130B)及阴性对照(INC)转入小鼠原代肾系膜细胞中，与对照相比，I130B可以显著促进Type I IFN诱导的IFIT1、CCL5表达(图1b)。刺激后检测细胞上清中CCL5的表达水平，结果显示过表达miR-130b能显著抑制CCL5的表达，而抑制miR-130b的表达(I130B)则促进CCL5的表达(图1c)。

上述结果说明，miR-130b能够参与负向调控Type I IFN通路下游基因的表达。

实施例2、miR-130b通过抑制STAT1磷酸化来参与负向调控Type I IFN通路

在Type I IFN通路中，Type I IFN与其受体相结合后，激活下游的磷酸激酶，进一步磷酸化STAT1和STAT2，使其被激活，磷酸化的STAT1和STAT2进入核内，激活Type I IFN诱导的基因表达。其中磷酸化的STAT1在整个Type I IFN通路活化过程中起着重要作用，所以本发明人研究miR-130b是否通过影响STAT1磷酸化来参与调控Type I IFN通路。

本发明人将miR-130b mimics转入小鼠原代肾系膜细胞中，Type I IFN刺激后，通过western blotting发现：与对照(NC)相比，miR-130b能够显著抑制STAT1磷酸化，而对STAT1蛋白表达无明显影响(图2a)。而通过转入miR-130b的抑制剂inhibitor(I130B)可以显著促进STAT1磷酸化(图2b)。

上述结果表明，miR-130b可以通过抑制STAT1磷酸化来参与负向调控Type I IFN通路。

实施例3、活体过表达miR-130b可以抑制IFNα-adv诱导的小鼠狼疮肾炎的发生

为了进一步明确miR-130b在狼疮肾炎发病机理中的作用，本发明人运用miR-130bagomir进行体内干预实验。

在IFNα-adv诱导的NZB/W F1狼疮肾炎模型中，本发明人分别在注射IFNα-adv的第21天和第35天之后，连续3天注射miR-130b agomir及对照。为了验证miR-130b agomir在肾脏的过表达效率，本发明人收集了注射IFNα-adv第49天之后肾脏组织的RNA，做了miR-130b的定量分析。

结果显示，注射了miR-130b agomir的小鼠肾脏组织的miR-130b表达水平比agomir negative control(NC)组以及Ctrl-adv组都要高(图3a)，这说明miR-130b agomir确实能在体内过表达miR-130b的。

进一步地，在检测小鼠的24H尿蛋白时，与注射对照agomir相比，本发明人发现注射miR-130b agomir能够降低小鼠的尿蛋白(图3b)。

与此同时，通过肾脏组织的PAS染色，本发明人发现，与Ctrl-adv对照组相比，在IFNα-adv处理组中仅注射NC agomir会导致肾小球硬化等肾小球损伤的发生。而miR-130bagomir能够显著抑制IFNα-adv诱导的肾小球损伤的发生(图3c)。

上述结果表明，miR-130b确实能够抑制IFNα-adv诱导的狼疮肾炎的发生。

实施例4、药物筛选

取小鼠原代肾系膜细胞，该细胞可内源性表达miR-130b。将该种细胞作为用于筛选缓解或治疗自身免疫性疾病的药物的细胞模型。

测试组：用候选物质处理的上述细胞的培养物；

对照组：不用候选物质处理的上述细胞的培养物。

在处理后适当时间，测定所述细胞的miR-130b的表达。如果与对照组相比，测试组中的miR-130b的表达显著上升2倍以上，则说明该候选物质是潜在的缓解或自身免疫性疾病的物质。

讨论

在小鼠的原代肾系膜细胞中，通过研究在Type I IFN通路中有功能的miRNAs，本发明人发现miR-130b可以通过抑制STAT1的磷酸化来负向调控Type I IFN通路。并且进一步发现miR-130b可以显著抑制IFNα-adv诱导的NZB/W F1狼疮肾炎的发生。

现已发现I型干扰素通路的异常可引起自身免疫性疾病。例如，I型干扰素在SLE的发病中起着重要的作用。在SLE中，50％的患者都会患有狼疮肾炎，病人组织损伤产生的凋亡细胞和血清中的自身抗体相结合后，可以形成自身免疫复合物。它们刺激pDC产生大量的I型干扰素，而分泌的I型干扰素既可促进自身反应性B细胞的增殖，也可诱导单核细胞向MoDC分化，MoDC摄取凋亡细胞后递呈自身抗原给自身反应性T细胞，这些都导致机体大量产生自身抗体，从而加剧了肾脏等组织的损伤。近来有研究发现在诱导狼疮小鼠模型中，当敲除Type I IFN受体时，小鼠的肾小球肾炎，如蛋白尿和肾小球损伤等症状都不再发生。而随后又有文章指出在自发狼疮小鼠模型中(NZB/W F1小鼠)，持续注射IFNα能够促进小鼠产生自身抗体，T cell活化，蛋白尿提早出现，最终诱导了狼疮肾炎的提早发生。因此抑制异常活化的I型干扰素通路，可以有效治疗和缓解狼疮肾炎疾病的发生和进行。

与此同时，近来的研究显示一些肾脏组织的自身细胞，如肾系膜细胞，也参与到肾脏疾病的过程中。在一些抗自身抗体诱导的的肾炎模型中，肾脏自身细胞产生的I型干扰素可参与到肾炎的发生。一方面在肾系膜细胞中，viral RNA可以通过TLR3加重小鼠的狼疮肾炎。同时另一方面，在肾系膜细胞中，viral RNA可以通过MDA5诱导Type I IFN的产生，进一步促进cytokines和chemokines的产生。尤其在一些自发狼疮小鼠中，肾系膜细胞对这些cytokines和chemokines的产生更加敏感。现今肾系膜细胞的研究已发现其细胞表面及内部表达多种受体(如TLR)，肾系膜细胞可以通过这些受体感知肾脏微环境的变化，激活相应的信号通路，产生的cytokines和chemokines可以通过自分泌，旁分泌或者释放到肾脏外的方式发挥作用，最终可以影响整个机体的免疫应答过程。因此在肾系膜细胞中研究I型干扰素通路将能更好的了解狼疮肾炎的具体发病机理。

miRNA作为一种调控分子，在人类多种疾病的发生和发展过程都有着重要作用。不同于以往的有或无的调节特点，miRNA主要是在数量上对靶基因进行调节。这一特点是siRNA单靶点强大的调节作用或一些分子的拮抗剂和激动剂所无法比拟的。这展示了miRNA在临床应用方面的巨大前景。本发明发现miR-130b在小鼠原代肾系膜细胞中显著负向调控Type I IFN通路，并且可以抑制IFNα-adv诱导的NZB/W F1狼疮肾炎的发生。因此miR-130b可能作为一个新的药物干预靶点，为治疗系统性红斑狼疮等疾病带来新的希望。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种miR-130b的上调剂在制备预防、缓解或治疗狼疮肾炎的药物中的用途；所述药物负向调控Type I IFN 通路及其下游基因的表达。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-130b上调剂包括：miR-130b类似物，miR-130b激动剂。

3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的miR-130b类似物正向序列如SEQ IDNO: 2所示；反向序列如SEQ ID NO: 3所示。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物还用于：抑制STAT1磷酸化。

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