CN110787146A - 氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统的制备方法及其应用，涉及高负载顺铂高分子前体药物及透明质酸包覆高负载化顺铂纳米递药系统的构建及其制备，可用于肿瘤的主动靶向治疗。本发明以聚乙烯亚胺为骨架，选用含有氧化还原响应性二硫键的胱胺与丁二酸酐反应后与顺铂络合得到顺铂配合物。所得顺铂配合物与聚乙烯亚胺共价结合得到高负载量的顺铂高分子前体药物，外层再包覆透明质酸靶向基团，得到具有肿瘤主动靶向作用的氧化还原响应性顺铂纳米递药系统。与传统化疗药物顺铂相比，本发明可实现肿瘤主动靶向递药和氧化还原响应性释药，发挥抗肿瘤治疗作用的同时，可有效降低顺铂对机体其它脏器的毒副作用，具有良好的临床应用前景。

Description

氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统的制备方法及其 应用
技术领域
本发明涉及高负载顺铂高分子前体药物及透明质酸包覆氧化还原响应性肿瘤靶向纳米递药系统的制备方法，该类纳米递药系统可用于肿瘤的治疗。
背景技术
顺铂(Cisplatin)即顺二氯二氨合铂，作为铂类抗肿瘤化疗药物经美国FDA批准上市后在临床治疗中显示了较好的抗肿瘤效果，广泛用于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、乳腺癌等肿瘤的治疗。顺铂进入细胞后，在细胞内发生离解反应生成水合配离子并向细胞核转运，与细胞核内DNA结合，使DNA复制受阻，致使细胞凋亡和坏死。顺铂抑制DNA复制的作用是非特异性的，因此顺铂具有较强的全身毒副作用，如肾损害，耳毒性，神经毒性，胃肠毒性，骨髓毒性，贫血等[Dalton Transactions,2007,4903-4917；CancerTherapy,2007,5:537-583]。因此，对顺铂进行药物化学和制剂学改造，提高顺铂的治疗效果，降低其毒副作用具有重要的理论意义和实用价值。
传统的小分子抗肿瘤化疗药物存在毒副作用大、药物有效利用率和透膜能力低、缺乏理想的特异性配体以及需要频繁给药等缺点，从而使其临床应用受到一定限制。高分子前体药物将载体与活性药物以可生物降解的共价键相连接，可以使药物长效化、稳定化，减少药物的毒副作用，避免间歇给药的血药浓度峰谷变化，并可以改善其在体内的分布，提高选择性和利用率[化学通报,2011,74:131-136]。正因为高分子前体药物具有以上诸多优点，一经提出就受到了全世界的关注，目前已经成为药物研发领域的热点之一。聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)是一类阳离子聚合物，其结构中含有大量的氨基基团，易于化学修饰，可实现药物的高负载化，且PEI特有的“质子海绵效应”有利于纳米递送载体从溶酶体中逃逸，将药物释放至细胞质中，降低溶酶体对药物的降解，从而提高其治疗效果。
谷胱甘肽(Glutathione,GSH)作为生物体中的一种重要抗氧化剂，在细胞内外的浓度差异很大，细胞质中还原型谷胱甘肽的浓度是氧化型的500～1000倍，因此相对细胞外而言，肿瘤细胞内是很强的还原环境，故二硫键在细胞外环境里可保持稳定，在细胞质的还原环境中容易发生断裂，因此利用二硫键的氧化还原响应特性可实现药物在肿瘤细胞内的快速释放，产生刺激响应特性。已有研究证实肿瘤细胞表面高表达CD44，可与透明质酸(Hyaluronic acid,HA)特异性结合，两者具有靶向识别作用[Journal of Colloid andInterface Science,2017,493:181-189]。因此，本发明首次采用富含氨基可修饰基团的聚乙烯亚胺(PEI)为骨架，选用含有氧化还原响应性二硫键的胱胺为原料将顺铂高负载于PEI上得到顺铂高分子前体药物，并将HA作为靶向基团包覆在聚合物表面制备得到具有氧化还原响应性肿瘤靶向纳米递药系统，通过与肿瘤细胞表面CD44结合起到靶向作用，实现肿瘤靶向递送和氧化还原响应性释药，更好地发挥抗肿瘤治疗作用。
发明内容
本发明的目的是提供能够高负载顺铂药物，具有氧化还原响应性肿瘤靶向治疗的纳米递药系统的制备方法，该类递药系统利用聚乙烯亚胺的丰富氨基和含二硫键的胱胺构建顺铂高分子前体药物，可以显著增加顺铂的负载量和氧化还原响应性释药，外层包覆的透明质酸靶向基团可实现肿瘤靶向递送，减少化疗药物顺铂在正常组织中的分布，得到高效低毒的递药系统，为抗肿瘤药物的研究提供新思路。
本发明采用不同分子量的直链聚乙烯亚胺(LPEI)或支化聚乙烯亚胺(BPEI)为骨架，选用含有氧化还原响应性二硫键的胱胺与丁二酸酐反应后与顺铂络合得到顺铂配合物。所得顺铂配合物与聚乙烯亚胺的丰富氨基共价结合得到高负载量的顺铂高分子前体药物，顺铂的负载量可达32.66％。外层再包覆一定比例的透明质酸靶向基团，得到具有肿瘤主动靶向作用的氧化还原响应性顺铂纳米递药系统，通过活性评价得到高效低毒的顺铂类抗肿瘤药物。
一种氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)顺铂在37℃避光条件下搅拌至完全溶解于Ⅲ级超纯水后冷却至室温，加入相应摩尔配比的硝酸银后室温避光搅拌48h，离心两次(5000rpm，1h/次)，用0.1μm水系滤器对上清液进行过滤得到水化顺铂溶液(3mg·mL-1)备用。胱胺二盐酸盐室温下溶于甲醇中，与一定量的三乙胺在冰浴条件(0℃～4℃)下搅拌30min后，加入相应比例的丁二酸酐的1,4-二氧六环溶液室温下搅拌反应1.5h，减压蒸除有机相，加入相应量的0.3％Na2CO3水溶液，用乙醚萃取3次得到胱胺-丁二酸钠水溶液。将上述胱胺-丁二酸钠水溶液按照一定比例缓慢滴加到水化顺铂溶液中，室温避光搅拌48h后将反应液浓缩，采用截留分子量为100的透析袋透析纯化(Ⅲ级超纯水中透析3次，每2h换水一次)后冷冻干燥得到顺铂配合物。
(2)将特定配比的羰基二咪唑与顺铂配合物水溶液(7.73mg·mL-1)在一定温度下搅拌反应，而后按照相应接枝比例与一定分子量的聚乙烯亚胺继续搅拌反应。反应结束后采用截留分子量为7000的透析袋透析纯化(Ⅲ级超纯水中透析4次，每2h换水一次)后冷冻干燥得到顺铂高分子前体药物。
(3)将一定量的透明质酸水溶液(5mg·mL-1)加入到上述顺铂高分子前体药物水溶液(1mg·mL-1)中，一定温度下避光超声后得到氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统。
上述氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统活性评价实验结果表明，与临床使用的传统化疗药物顺铂相比，该类递药系统可实现肿瘤靶向递药和氧化还原响应性释药，在发挥有效抗肿瘤作用的同时，可极大降低顺铂对机体其它脏器的毒副作用，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1是HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4氧化还原响应性释药。**P<0.01，同时间点与10μM组的释药量比较。
图2是HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4的HA竞争性摄取抑制实验。n＝3，
Figure BDA0002214763180000051
**P<0.01，HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4+2mg/mL HA组与HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4+0mg/mL HA组相比。
图3(A)是荷瘤裸鼠肿瘤体积变化图。n＝4，
Figure BDA0002214763180000053
*P<0.05，**P<0.01，Cisplatin组与Control组相比较，##P<0.01，HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4组与Control组相比较。
图3(B)是荷瘤裸鼠相对体重变化图。n＝4， *P<0.05，**P<0.01，Cisplatin组与Control组相比较，#P<0.05，##P<0.01，HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4组与Control组相比较，&P<0.05，&&P<0.01，HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4组与Cisplatin组相比较。
图4是荷瘤裸鼠各组织器官的HE染色图(50μm)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1顺铂配合物的制备
称取顺铂675.0mg(2.23mmol)加入225mLⅢ级超纯水中，在37℃避光条件下搅拌至完全溶解后冷却至室温，加入758.2mg(4.45mmol)硝酸银，继续在室温避光条件下搅拌反应48h。反应结束后将反应液离心2次(5000rpm，每次1h)，取上清液，用0.1μm水系滤器进行过滤得到水化顺铂溶液。
胱胺二盐酸盐499.4mg(2.18mmol)于室温条件下溶解于24.6mL甲醇中。在冰浴条件下，向胱胺二盐酸盐的甲醇溶液中加入三乙胺445.7mg(4.36mmol)并搅拌30min。称取丁二酸酐202.4mg(1.98mmol)于室温条件下溶解于36.97mL无水1,4-二氧六环中，将上述溶液加至胱胺二盐酸盐的甲醇溶液中，同时撤去冰浴，室温搅拌反应1.5h。反应结束后将反应液旋转蒸发除去有机溶剂，加入0.3％Na2CO3水溶液77mL，用乙醚萃取3次，每次萃取所用乙醚的体积为150mL，收集水相，旋转蒸发除去残余乙醚得到胱胺-丁二酸钠溶液。
将77mL胱胺-丁二酸钠溶液缓慢滴加到200mL水化顺铂溶液中，室温避光搅拌反应48h。反应结束后将反应液减压浓缩至约10mL，转移至截留分子量为100的透析袋中，于3000mLⅢ级超纯水中透析3次，每2h换水一次，透析完成后冷冻干燥得到黄色粉末状顺铂配合物。
顺铂配合物的IR和1H NMR解析结果如下：IR(KBr):3387,3194,3082,2943,1636,1543,1396,1150,1049,636cm-1。1H NMR(400MHz,D2O):δ2.46-2.48(6H,m),2.85(t,2H,J＝6.4Hz),3.17-3.23(2H,m),3.52(t,2H,J＝6.4Hz)ppm。经红外和核磁共振氢谱鉴定，所得产物与目标产物结构一致。
实施例2顺铂高分子前体药物BPEI-SS-Pt的制备
称取支化聚乙烯亚胺(BPEI)48.8mg(2μmol)溶于5mLⅢ级超纯水中，60℃超声15min至完全溶解，得到无色澄清的BPEI水溶液；顺铂配合物77.3mg(143μmol)溶于10mLⅢ级超纯水中，室温下搅拌至完全溶解，得到黄色澄清透明的顺铂配合物水溶液。向顺铂配合物水溶液中加入羰基二咪唑25.6mg(158μmol)，在冰浴条件下搅拌1h后撤除冰浴，待反应液恢复室温后向反应液中加入BPEI水溶液，室温避光搅拌反应24h。反应结束后将反应液转移至截留分子量为7000的透析袋中，于2000mLⅢ级超纯水中透析4次，每2h换水一次。透析完成后冷冻干燥得到黄色固体BPEI-SS-Pt。
产物红外图谱解析结果如下：IR(KBr):3564,2962,1717,1636,1558,1508,1458,1339,1026,806,706cm-1。经红外图谱鉴定，所得产物与目标产物结构一致。经电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定可知BPEI-SS-Pt中顺铂的负载量为32.66％。
实施例3氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4的制备
以HA和BPEI-SS-Pt质量比1:4为例。称取10.0mg BPEI-SS-Pt溶于10mLⅢ级超纯水中，在50℃避光超声2h至完全溶解，得到浓度为1mg·mL-1的BPEI-SS-Pt水溶液。称取30.0mgHA溶于6mLⅢ级超纯水中，振荡至完全溶解，得到浓度为5mg·mL-1的HA水溶液。按照质量比1:4(HA:BPEI-SS-Pt)吸取相应体积HA溶液，加入到BPEI-SS-Pt的水溶液中，避光常温超声1h得到复合物纳米粒HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4，避光保存于4℃冰箱。用激光纳米粒度测定仪测定纳米粒的粒径和电位，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定铂的含量。
HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4纳米递药系统的粒径、PDI及其zeta电位测定实验结果表明，在HA与BPEI-SS-Pt复合质量比为1:4时，纳米递药系统的粒径为159.0±21.0nm，分散系数PDI为0.069±0.022，粒径分布范围较窄(PDI<0.3)，即得到了分散均一的纳米递药系统，可满足肿瘤靶向递送的要求。纳米递送系统的zeta电位为34.7±1.7mV，纳米粒荷正电。经计算知纳米递药系统中顺铂的包封率为95.5％，顺铂的负载量为29.23％。
实施例4氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4的氧化还原响应特性评价
通过考察体外模拟肿瘤细胞内还原性水平(10mM GSH)和胞外还原性水平(10μMGSH)中递药系统的释药行为，验证所构建纳米递药系统中二硫键的敏感性与氧化还原响应释药特性。将20μLHA-(BPEI-SS-Pt)-1/4水溶液(1mg·mL-1)用Ⅲ级超纯水稀释至至1mL，加入1mg·mL-1透明质酸酶的PBS溶液(pH 5.0)1mL，于37℃条件下孵育1h后转移至透析袋(截留分子量为3500)中，再将透析袋放入装有40mL不同透析介质(pH 7.4PBS+10μmol/L GSH，pH 7.4PBS+10mmol/L GSH)的烧杯中，于37℃水浴中孵育，模拟体内环境药物释放。分别在设定的时间点0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h从透析外液中取出2mL液体，然后向透析外液中补加2mL新鲜透析介质，用ICP-MS法测定取出液体中Pt的含量。
氧化还原响应特性评价实验结果显示(图1)，相比细胞外低浓度GSH(10μmol/L)，在模拟肿瘤细胞内GSH高浓度的释药介质(10mmol/L)中，纳米递药系统由于二硫键的断裂可实现Pt的快速释放，且在24h时，其释药总量明显较高。上述结果表明纳米递送系统具有较好的氧化还原敏感特性，能够在肿瘤细胞内高GSH浓度条件下快速释放药物，以便达到高效的抗肿瘤作用。
实施例5氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4的靶向性评价
采用CD44底物透明质酸(HA)竞争性摄取抑制实验进行靶向性评价。分别采用含有0mg/mL与2mg/mL HA的1640培养液与A549细胞孵育2h使得细胞表面的CD44受体充分与HA结合。而后将细胞与HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4(Pt浓度2μg/mL)分别孵育2h与4h，用PBS洗涤细胞表面2次，将细胞用胰酶消化，离心收集细胞，加入1mL PBS再分散细胞得细胞悬液，将细胞悬浮液冻干后，加入2mL王水充分溶解，采用2％HNO3溶液稀释定容至50mL，采用ICP-MS测定细胞内Pt的含量。
HA竞争性摄取实验结果表明(图2)，加入游离HA饱和A549细胞表面的CD44后，HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4与细胞孵育2h后，HA能明显抑制HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4纳米粒的入胞，加入游离HA组的细胞内Pt含量低于无HA组。且随着时间达到4h时，HA的竞争性作用更加显著，HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4纳米粒的入胞受到明显的抑制，其细胞内Pt含量大大低于不加HA组。由此可以看出CD44底物HA能够明显减少肿瘤细胞对HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4纳米粒的摄取，验证了所构建纳米递药系统具有CD44靶向作用，可实现肿瘤的主动靶向递送与治疗。
实施例6氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4的抗肿瘤活性评价
选取6～8周龄的BALB/c裸鼠作为实验模型，将100μL人非小细胞肺癌细胞A549(密度为2×107个/mL)接种于小鼠右后背部皮下，待小鼠皮下肿瘤体积长至100mm3时，进行给药，对纳米递药系统的体内抗肿瘤活性进行评价。将接种皮下瘤的BALB/c裸鼠分为3组(每组4只)，分别给予溶媒、顺铂阳性对照药物以及HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4纳米递药系统，以尾静脉注射的方式给药。阳性对照药物顺铂的给药剂量为3mg/kg，HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4的给药剂量与游离药物顺铂的Pt量相同，每间隔2天给药一次，共给药3次。小鼠的肿瘤体积和体重每2天测量一次。小鼠肿瘤的长宽采用数字游标卡尺进行测量，肿瘤体积的计算公式为V＝(a×b2)/2，a为肿瘤的最长直径，b为肿瘤的最短直径。在给药后观察第20天时，终止实验，处死小鼠，收集肿瘤组织、心、肝、脾、肺以及肾组织。将小鼠的心、肝、脾、肺以及肾组织固定在4％多聚甲醛中，石蜡包埋，加工成5mm厚的切片。石蜡切片脱蜡复水后进行HE染色。采用正置显微镜对HE染色的切片进行观察。
HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4纳米递药系统体内抗肿瘤活性实验表明(图3)，在给药后20天时，未做治疗的空白对照组(Control组)小鼠的平均肿瘤体积已接近2000mm3，而阳性药物顺铂组(Cisplatin组)和纳米粒HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4组小鼠的肿瘤体积均得到有效的抑制，纳米递药系统能达到与临床使用药物顺铂等效或更好的体内抗肿瘤活性(如图3A)。图3B结果表明，给药后阳性药物顺铂组小鼠的体重明显下降，而相比于顺铂组，所构建的氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4对小鼠的体重影响较小，毒副作用明显降低。HE染色结果(图4)表明，阳性药物顺铂组肾小管上皮细胞中度水肿，肾小球毛细血管轻度扩张充血，肾的红、白髓质缩小，红髓质可见数个黄褐色颗粒，可见小灶细胞凋亡；肝小叶周围小灶肝细胞凋亡坏死、轻度脂肪变性，可见铁血黄素沉积，表明临床使用的化疗药物顺铂对机体正常组织具有较强肝毒性和肾毒性，与以往文献报道结论一致。本发明所构建HA-(BPEI-SS-Pt)-1/4纳米递药系统对肝脏和脾脏的器官无明显损伤，具有良好的安全性和生物相容性，能够高效、低毒地治疗肿瘤，对化疗药物顺铂的新剂型研究具有重要的临床指导意义。

Claims (7)

1.一种氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统的制备方法，其特征在于：以聚乙烯亚胺为骨架，选用含有氧化还原响应性二硫键的胱胺与丁二酸酐反应后与顺铂络合得到顺铂配合物；所得顺铂配合物与聚乙烯亚胺共价结合得到高负载量的顺铂高分子前体药物，外层再包覆透明质酸靶向基团，得到具有肿瘤主动靶向作用的氧化还原响应性顺铂纳米递药系统；具体包括以下步骤：
(1)顺铂在37℃避光条件下搅拌至完全溶解于Ⅲ级超纯水后冷却至室温，加入相应摩尔配比的硝酸银后室温避光搅拌48h，离心两次，用0.1μm水系滤器对上清液进行过滤得到3mg·mL-1的水化顺铂溶液备用；
胱胺二盐酸盐室温下溶于甲醇中，与一定量的三乙胺在冰浴条件0℃～4℃下搅拌30min后，加入相应比例的丁二酸酐的1,4-二氧六环溶液室温下搅拌反应1.5h，减压蒸除有机相，加入相应量的0.3％Na2CO3水溶液，用乙醚萃取3次得到胱胺-丁二酸钠水溶液；
将上述胱胺-丁二酸钠水溶液按照一定比例缓慢滴加到水化顺铂溶液中，室温避光搅拌48h后将反应液浓缩，采用截留分子量为100的透析袋透析纯化后冷冻干燥得到顺铂配合物；
(2)将特定配比的羰基二咪唑与7.73mg·mL-1顺铂配合物水溶液在一定温度下搅拌反应，而后按照相应接枝比例与一定分子量的聚乙烯亚胺继续搅拌反应，反应结束后采用截留分子量为7000的透析袋透析纯化后冷冻干燥得到顺铂高分子前体药物；
(3)将一定量的5mg·mL-1透明质酸水溶液加入到上述顺铂高分子前体药物水溶液1mg·mL-1中，一定温度下避光超声后得到氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统。
2.根据权利要求1所述的氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，硝酸银与顺铂的摩尔比为1:2～2:1，胱胺二盐酸盐、三乙胺与丁二酸酐的摩尔比为1:2:0.5～1:20:2，碳酸钠与胱胺二盐酸盐的摩尔比为1:1～5:1，胱胺-丁二酸钠与水化顺铂的摩尔比为1:2～2:1。
3.根据权利要求1所述氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，羰基二咪唑与顺铂配合物的摩尔比为1:0.5～5:1，反应温度为20℃～50℃，反应时间为0.5～5h。
4.根据权利要求1所述氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所用聚乙烯亚胺为直链聚乙烯亚胺(LPEI)或支化聚乙烯亚胺(BPEI)，分子量范围600～50K Da。
5.根据权利要求1所述氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，顺铂配合物与聚乙烯亚胺上氨基的摩尔比为1:50～1:1，反应温度为0℃～100℃，反应时间为5～48h。
6.根据权利要求1所述氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，透明质酸和顺铂高分子前体药物的投料质量比为1:50～20:1，温度为10℃～60℃，超声时间为0.1～5h。
7.一种氧化还原响应性肿瘤靶向顺铂纳米递药系统在制备抗肺癌药物中的应用。
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