CN116327979A - 一种过渡金属基介孔纳米催化药物、制备方法及用途 - Google Patents

一种过渡金属基介孔纳米催化药物、制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米催化药物技术领域。为解决现有的纳米催化药物难以有效在肿瘤部位富集、难以提高肿瘤细胞内的H2O2含量而导致治疗效果不理想的技术问题，本发明实施例提供一种过渡金属基介孔纳米催化药物、制备方法及用途，所述催化药物的表达式如（1）所示：FA‑CS‑DMMA/CMC@Y‑MSN@Z/E（1）；所述制备方法包括采用Y‑MSN负载化疗药剂和外源性过氧化氢提供剂，得到Y‑MSN@Z/E；采用叶酸和2，3‑二甲基马来酸酐修饰壳聚糖，制备得到FA‑CS‑DMMA；将羧甲基壳聚糖和FA‑CS‑DMMA以静电吸附的方式修饰在Y‑MSN@Z/E的表面，制备得到纳米催化药物；所述过渡金属基介孔纳米催化药物可以用于制备用于治疗癌症的药物。

Description

一种过渡金属基介孔纳米催化药物、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及纳米催化药物技术领域，尤其涉及一种过渡金属基介孔纳米催化药物、制备方法及用途。
背景技术
纳米催化药物作为纳米催化和纳米医学的结合，与传统的肿瘤治疗方法相比，具有高选择性和催化活性。纳米催化药物通过芬顿或类芬顿反应可以生成有细胞毒性的活性氧ROS。
一些过渡金属离子（Fe3+、Cu2+、Mn2+、Co2+）表现出优异的芬顿催化活性。将过渡金属离子与多孔结构材料（如金属-有机框架MOF、介孔二氧化硅MSN）结合，利用含过渡金属的多孔材料催化内源性过氧化氢H2O2发生芬顿或者类芬顿反应，产生具有细胞毒性的ROS杀死癌细胞，已经被证明具有理想的肿瘤治疗效果。
基于芬顿反应的化学动力学疗法CDT，是近年来备受关注的一种产生ROS的治疗方法。在目前所有产生ROS的方法中，ROS生成浓度至关重要，ROS的量不足反而会促进肿瘤的生长，这是限制CDT疗效的重要因素。其利用含铜、铁、锰等过渡金属的纳米材料作为催化剂在肿瘤部位生成有毒的羟基自由基∙OH。然而，该治疗方法中，作为芬顿反应的重要底物，肿瘤组织内源性H2O2仍不足以产生足量的∙OH。因此，寻找合适的方法提高肿瘤细胞中H2O2的浓度促进芬顿反应以提高疗效极其关键。
因此，目前现有技术存在的主要问题是：纳米催化药物难以精确在肿瘤部位富集，肿瘤细胞内的H2O2含量太低无法产生足量的∙OH，从而使化学动力学疗法CDT效果不理想。
发明内容
为解决现有的纳米催化药物难以有效在肿瘤部位富集、难以提高肿瘤细胞内的H2O2含量而导致治疗效果不理想的技术问题，本发明实施例提供一种过渡金属基介孔纳米催化药物、制备方法及用途。
本发明实施例通过下述技术方案实现：
第一方面，本发明实施例提供一种过渡金属基介孔纳米催化药物，所述催化药物的表达式如（1）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E （1）
其中，Y表示过渡金属；MSN表示介孔二氧化硅；Z表示化疗药剂；E表示外源性过氧化氢提供剂，CMC表示羧甲基壳聚糖，CS表示壳聚糖，FA表示叶酸，DMMA表示2，3-二甲基马来酸酐；
Y-MSN表示过渡金属离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料；
Y-MSN@Z/E表示Y-MSN先负载化疗药剂再负载外源性过氧化氢提供剂得到的材料；
FA-CS-DMMA表示壳聚糖接枝叶酸和2，3-二甲基马来酸酐后得到的材料；
FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E表示羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式与Y-MSN@Z/E结合得到的材料。
进一步的，所述Y-MSN@Z/E表示：Y-MSN先通过疏水作用负载化疗药剂得到Y-MSN@Z，Y-MSN@Z再通过亲水作用负载外源性过氧化氢提供剂后得到的Y-MSN@Z/E材料；
其中，Y-MSN@Z表示Y-MSN负载化疗药剂得到的材料。
进一步的，所述过渡金属为铁、铜、锰或钴。
进一步的，外源性过氧化氢提供剂为葡萄糖氧化酶、金属过氧化物或抗坏血酸盐。
进一步的，所述过渡金属为铜，Y-MSN为Cu-MSN，所述化疗药剂为阿霉素，所述外源性过氧化氢提供剂为抗坏血酸盐；
所述催化药物的表达式如式（2）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）
其中，DOX表示阿霉素，AA表示抗坏血酸盐；
所述Cu-MSN@DOX/AA表示：Cu-MSN先通过疏水作用负载阿霉素得到Cu-MSN@D，Cu-MSN@D再通过亲水作用负载抗坏血酸盐后得到的Cu-MSN@DOX/AA材料；
其中，Cu-MSN@D表示Cu-MSN负载阿霉素得到的材料。
进一步的，Cu-MSN与阿霉素的摩尔比为1-25:1-3；所述Cu-MSN@D与抗坏血酸盐的摩尔比为1:1-4。
第二方面，本发明实施例提供一种过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，包括：
采用Y-MSN负载化疗药剂和外源性过氧化氢提供剂，得到Y-MSN@Z/E；
采用叶酸和2，3-二甲基马来酸酐修饰壳聚糖，制备得到FA-CS-DMMA；
将羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式修饰在Y-MSN@Z/E的表面，制备得到纳米催化药物；所述纳米催化药物的表达式如式（1）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E （1）
其中，Y表示过渡金属；MSN表示介孔二氧化硅；Z表示化疗药剂；E表示外源性过氧化氢提供剂，CMC表示羧甲基壳聚糖，CS表示壳聚糖，FA表示叶酸，DMMA表示2，3-二甲基马来酸酐；Y-MSN表示过渡金属离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料。
进一步的，所述过渡金属为铜，所述化疗药剂为阿霉素，所述外源性过氧化氢提供剂为抗坏血酸盐；
所述制备方法包括：
采用Cu-MSN负载阿霉素和抗坏血酸盐，制备得到Cu-MSN@DOX/AA；
采用叶酸和2，3-二甲基马来酸酐修饰壳聚糖，制备得到FA-CS-DMMA；
将羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式修饰在Cu-MSN@DOX/AA的表面，制备得到所述纳米催化药物；所述催化药物的表达式如式（2）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）
其中，DOX表示阿霉素，AA表示抗坏血酸盐；Cu-MSN表示正二价铜离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料。
进一步的，所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法还包括：
采用正二价铜离子掺杂介孔二氧化硅纳米颗粒，制备得到Cu-MSN。
进一步的，采用正二价铜离子掺杂介孔二氧化硅纳米颗粒，制备得到Cu-MSN；包括：
将十六烷基三甲基卤化铵作为模板剂溶解于氨水、C1-C3的醇和水的混合溶液，于60-75℃下搅拌混匀，得到混匀液；
按照反应配比将硅源、硅烷偶联剂和可溶性铜盐溶解于C1-C3的醇中，得到滴加液；
将滴加液以滴入的方式加入所述混匀液中，继续搅拌8-12小时，用无水乙醇和盐酸的混合液移除模板剂，分离产物，得到Cu-MSN。
进一步的，十六烷基三甲基卤化铵为十六烷基三甲基氯化铵或十六烷基三甲基溴化铵；所述C1-C3的醇为无水乙醇；氨水、C1-C3的醇和水的混合溶液为氨水、无水乙醇和水的混合溶液；所述氨水、无水乙醇和水的混合溶液采用氨的质量分数为30%的氨水、无水乙醇和去离子水按照体积比1:19:100配制而成。
进一步的，按照反应配比将硅源、硅烷偶联剂和可溶性铜盐溶解于C1-C3的醇中，得到滴加液；包括：
将正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷和Cu(NO3)2∙3H2O按照摩尔比70:5:1溶解于无水乙醇中，得到滴加液。
进一步的，采用Cu-MSN负载阿霉素和抗坏血酸盐，制备得到Cu-MSN@DOX/AA；包括：
Cu-MSN先通过疏水作用负载阿霉素得到Cu-MSN@D，Cu-MSN@D再通过亲水作用负载抗坏血酸盐后得到的Cu-MSN@DOX/AA材料；
其中，Cu-MSN@D表示Cu-MSN负载阿霉素得到的材料。
进一步的，采用所述Cu-MSN负载阿霉素和抗坏血酸盐，制备得到Cu-MSN@DOX/AA；包括：
将Cu-MSN和DOX分散在二甲亚砜中，得到Cu-MSN@D；
将Cu-MSN@D和抗坏血酸盐分散在水中并在无氧环境避光搅拌8-12小时，分离产物，得到Cu-MSN@DOX/AA。
进一步的，Cu-MSN与DOX的摩尔比为1-25:1-3；优选10:1；所述Cu-MSN@D与抗坏血酸盐的摩尔比为1:1-4；优选1:4。
进一步的，采用叶酸和2,3-二甲基马来酸酐修饰壳聚糖，制备得到FA-CS-DMMA；包括：
将活化剂分散在二甲亚砜中，加入叶酸，室温下搅拌混匀，分离产物，得到羧基活化的叶酸；
将所述羧基活化的叶酸加入溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中，避光搅拌8-12小时,分离产物，得到FA-CS；
将FA-CS、2，3二甲基马来酸酐和三乙胺分散在二甲亚砜中，无氧环境搅拌12-24小时,分离产物，得到黄色粉末FA-CS-DMMA。
进一步的，所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺；
叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺的摩尔比为20:16:7；
溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液采用质量分数为1%-3%的稀醋酸溶解壳聚糖制成；溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中壳聚糖的质量分数为1%；羧基活化的叶酸与壳聚糖的质量比为900:25-27；FA-CS和2，3二甲基马来酸酐和三乙胺的摩尔比为1:3:0.072。
进一步的，将羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式修饰在Cu-MSN@DOX/AA的表面，制备得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA；包括：
向Cu-MSN@DOX/AA的溶液中加入FA-CS-DMMA和羧甲基壳聚糖，在无氧环境搅拌反应后，分离产物，制备得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA。
进一步的，向Cu-MSN@DOX/AA的溶液中加入FA-CS-DMMA和羧甲基壳聚糖，在无氧环境搅拌反应后，分离产物，制备得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA；包括：
向10体积份、浓度为1质量份/体积份的Cu-MSN@DOX/AA的水溶液中，加入0.5体积份、浓度为4质量份/体积份的FA-CS-DMMA的水溶液和加入0.5体积份、浓度为2质量份/体积份的羧甲基壳聚糖的水溶液，无氧环境中，搅拌反应，分离产物后得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA。
第三方面，本发明实施例提供所述纳米催化药物或所述制备方法制备得到的纳米催化药物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明实施例与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明实施例提供一种过渡金属基介孔纳米催化药物、制备方法及用途，通过式（1）所述纳米催化药物最终在化学动力学疗法和化疗的协同作用下提高了抗癌效果，从而，解决现有的纳米催化药物难以有效在肿瘤部位富集、难以提高肿瘤细胞内的H2O2含量而导致治疗效果不理想的技术问题。
附图说明
图1为FCDC@Cu-MSN@DA的合成过程以及杀死癌细胞的示意图。
图2为FCDC@Cu-MSN@DA在癌细胞中协同化学动力学疗法和化疗杀死癌细胞的示意图。
图3为Cu-MSN的透射电镜图。
图4 为Cu-MSN的水合粒径分布图。
图5为Cu-MSN和FCDC@Cu-MSN@DA的氮气吸附脱附曲线图。
图6为Cu-MSN的X射线色散谱图。
图7为FCDC@Cu-MSN@DA的扫描电镜图。
图8为4T1肿瘤异种移植建立示意图。
图9为治疗后6组的肿瘤照片。
图10为FCDC@Cu-MSN@DA在不同时间内生成·OH的ESR图。
图11为FCDC@Cu-MSN@DA在不同时间内生成1O2的ESR图。
图12为检测TMB被FCDC@Cu-MSN@DA生成的·OH 氧化的紫外可见光谱图。
图13为使用DTNB检测GSH被FCDC@Cu-MSN@DA不同时间消耗情况图。
图14为FCDC@Cu-MSN@DA在不同pH值下的DOX累积释放图。
图15为FCDC@Cu-MSN@DA在不同pH值下的AA累积释放图。
图16为不同pH值溶液中铜离子的释放曲线图。
图17为4T1细胞在不同浓度Cu-MSN和FCDC@Cu-MSN孵育后的细胞毒性图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
技术术语
纳米催化药物FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@DOX/AA中各符号的含义表示如下：
-表示化学接枝；/表示物理包裹；@表示通过物理作用负载药物。
C1-C3的醇表示C原子数为1-3的一元醇或二元醇。
为了便于表述，说明书中FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@DOX/AA缩写为FCDC@Cu-MSN@DA。无氧环境指的是氮气氛围或者惰性气体氛围等等无氧的反应环境。
实施例
第一方面，本发明实施例提供一种过渡金属基介孔纳米催化药物，所述催化药物的表达式如（1）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E （1）
其中，Y表示过渡金属；可选地，所述过渡金属可以为铁、铜、锰或钴。优选为铜。
MSN表示介孔二氧化硅。Z表示化疗药剂；可选地，所述化疗药剂为盐酸阿霉素、紫杉醇或顺铂。E表示外源性过氧化氢提供剂，CMC表示羧甲基壳聚糖，CS表示壳聚糖，FA表示叶酸，DMMA表示2,3-二甲基马来酸酐；Y-MSN表示过渡金属离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料；Y-MSN@Z/E表示Y-MSN先负载化疗药剂再负载外源性过氧化氢提供剂得到的材料；FA-CS-DMMA表示壳聚糖接枝叶酸和2,3-二甲基马来酸酐后得到的材料；FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E表示羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式与Y-MSN@Z/E结合得到的材料。
在本发明实施例的纳米催化药物中，介孔二氧化硅MSN作为药物递送系统中常见的载体，需要在特定刺激下将抗肿瘤药物转运到肿瘤部位并按需释放。壳聚糖CS是一种天然阳离子多糖，具有良好的可降解性和生物相容性；丰富的氨基使其可以功能化修饰，通过与功能基团偶联制备CS衍生物引入刺激响应特性和靶向功能，CS是一种提高纳米药物载体稳定性和pH响应的理想选择。
为了实现β羧酸酰胺键断开而实现电荷逆转，发明人选择了马来酸酰胺、柠檬酸酰胺、顺乌头酸酰胺、2-（2'-羧乙基）马来酸酰胺和1-甲基-2-（2'-羧基乙基）马来酰胺等五种马来酸酰胺衍生物在37℃时不同pH条件下的降解动力学。结果表明，酰胺的降解在很大程度上取决于顺式双键上的取代基和环境的酸度。由于取代基增强了β-羧酰胺的分子内环化形成五元环，并且取代基数量的增加可以加速降解速率。此外，发明人发现极端酸性环境（低pH值）明显有利于酰胺的环化反应和降解速率。因此，发明人选择了2,3二甲基马来酸酐来制备上述纳米催化药物。
进一步的，所述Y-MSN@Z/E表示：Y-MSN先通过疏水作用负载化疗药剂得到Y-MSN@Z，Y-MSN@Z再通过亲水作用负载外源性过氧化氢提供剂后得到的Y-MSN@Z/E材料；
其中，Y-MSN@Z表示Y-MSN负载化疗药剂得到的材料。
第二方面，本发明实施例提供一种过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，包括：
采用Y-MSN负载化疗药剂和外源性过氧化氢提供剂，得到Y-MSN@Z/E；
采用叶酸和2,3-二甲基马来酸酐修饰壳聚糖，制备得到FA-CS-DMMA；
将羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式修饰在Y-MSN@Z/E的表面，制备得到纳米催化药物；所述纳米催化药物的表达式如式（1）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E （1）
其中，Y表示过渡金属；MSN表示介孔二氧化硅；Z表示化疗药剂；E表示外源性过氧化氢提供剂，CMC表示羧甲基壳聚糖，CS表示壳聚糖，FA表示叶酸，DMMA表示2,3-二甲基马来酸酐；Y-MSN表示过渡金属离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料。
外源性过氧化氢提供剂可以为葡萄糖氧化酶、金属过氧化物和抗坏血酸盐，可选地，外源性过氧化氢提供剂为抗坏血酸盐；抗坏血酸盐具有相对分子质量小，亲水性好，以及生物相容性优良的特点。
进一步的，所述过渡金属为铜，所述化疗药剂为阿霉素，所述外源性过氧化氢提供剂为抗坏血酸盐；
所述制备方法包括：
采用Cu-MSN负载阿霉素和抗坏血酸盐，制备得到Cu-MSN@DOX/AA；
采用叶酸和2,3-二甲基马来酸酐修饰壳聚糖，制备得到FA-CS-DMMA；
将羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式修饰在Cu-MSN@DOX/AA的表面，制备得到所述纳米催化药物；所述催化药物的表达式如式（2）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）
其中，DOX表示阿霉素，AA表示抗坏血酸盐；Cu-MSN表示正二价铜离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料。
进一步的，所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法还包括：
采用正二价铜离子掺杂介孔二氧化硅纳米颗粒，制备得到Cu-MSN。
进一步的，制备Cu-MSN包括：
将十六烷基三甲基卤化铵作为模板剂溶解于氨水、C1-C3的醇和水的混合溶液，于60-75℃下搅拌混匀，得到混匀液；
发明人发现，超出60-75℃区间会造成Si-O-Si结构的崩塌或者Cu2+掺入Si-O-Si键失败，产物粒径超出300 nm，尺寸不理想会造成纳米颗粒在体内转运过程效率低。
按照反应配比将硅源、硅烷偶联剂和可溶性铜盐溶解于C1-C3的醇中，得到滴加液；将滴加液以滴入的方式加入所述混匀液中，继续搅拌8-12小时，用无水乙醇和盐酸的混合液移除模板剂，分离产物，得到Cu-MSN。
进一步的，十六烷基三甲基卤化铵为十六烷基三甲基氯化铵或十六烷基三甲基溴化铵；所述C1-C3的醇为无水乙醇；氨水、C1-C3的醇和水的混合溶液为氨水、无水乙醇和水的混合溶液；所述氨水、无水乙醇和水的混合溶液采用氨的质量分数为30%的氨水、无水乙醇和去离子水按照体积比1:19:100配制而成。
发明人采用强碱如氢氧化钠等参与反应，但是合成失败；又采用氨水等弱碱参与反应，发现合成结果不理想；最终发明采用氨水与小分子醇的混合溶液，反应较为理想，特别采用氨的质量分数为30%的氨水、无水乙醇和去离子水的混合溶液按照体积比1:19:100混合作为反应环境，合成效果最佳。
氨的质量分数为30%的氨水可以对应换算成其它质量分数（比如20%或25%）的氨水并对体积比做相应的调整也可实现与上述水与无水乙醇的混合溶液类似的效果。
进一步的，按照反应配比将硅源、硅烷偶联剂和可溶性铜盐溶解于C1-C3的醇中，得到滴加液；包括：
将正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷和Cu(NO3)2∙3H2O按照摩尔比70:5:1溶解于无水乙醇中，得到滴加液。
进一步的，制备Cu-MSN@DOX/AA包括：
Cu-MSN先通过疏水作用负载阿霉素得到Cu-MSN@D，Cu-MSN@D再通过亲水作用负载抗坏血酸盐后得到的Cu-MSN@DOX/AA材料；
其中，Cu-MSN@D表示Cu-MSN负载阿霉素得到的材料。
进一步的，制备Cu-MSN@DOX/AA；包括：
将Cu-MSN和DOX分散在二甲亚砜中，得到Cu-MSN@D；
将Cu-MSN@D和抗坏血酸盐分散在水中并在无氧环境避光搅拌8-12小时，分离产物，得到Cu-MSN@DOX/AA。
进一步的，Cu-MSN与DOX的摩尔比为1-25:1-3；优选10:1；所述Cu-MSN@D与抗坏血酸盐的摩尔比为1:1-4；优选1:4。
示例性的，发明人将Cu-MSN和DOX∙HCl按照不同投料摩尔比1:1，5:1，25:3，10:1分散在二甲基亚砜DMSO中，然后加入少量三乙胺TEA，在室温黑暗的条件下连续搅拌10-12小时；通过用去离子水和乙醇离心洗涤3-5次去除游离DOX，通过冷冻干燥收集Cu-MSN@D。具体见下表1。
表1 Cu-MSN与DOX∙HCl不同投料比对应的载药率和包封率
Cu-MSN:DOX∙HCl投料比 载药率 包封率
1:1 13.78% 95.61%
5:1 15.54% 91.32%
25:3 13.77% 96.69%
10:1 17.65% 88.37%
发明人将Cu-MSN@D和AA按照不同投料摩尔比1:4，1:3，1:2，1:1分散在去离子水中(选择AA作为外源性过氧化氢提供剂，因为与其他原料相比，如葡萄糖氧化酶，金属过氧化物等，AA具有相对分子质量小，亲水性好，以及生物相容性优良的特点）。在氮气环境中常温黑暗条件下搅拌8-12小时，最后通过冷冻干燥收集Cu-MSN@DA。具体见下表2。
表2 Cu-MSN@D与AA不同投料比对应的载药率和包封率
Cu-MSN@D:AA投料比 载药率 包封率
1:1 25.86% 95.61%
1:2 17.92% 97.43%
1:3 17.77% 97.09%
1:4 16.65% 98.3%
进一步的，制备FA-CS-DMMA包括：将活化剂分散在二甲亚砜中，加入叶酸，室温下搅拌混匀，分离产物，得到羧基活化的叶酸；将所述羧基活化的叶酸加入溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中，避光搅拌8-12小时，分离产物，得到FA-CS；将FA-CS、2,3二甲基马来酸酐和三乙胺分散在二甲亚砜中，无氧环境搅拌12-24小时,分离产物，得到黄色粉末FA-CS-DMMA。
进一步的，所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺；
叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺的摩尔比为20:16:7；溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液采用质量分数为1%-3%的稀醋酸溶解壳聚糖制成；溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中壳聚糖的质量分数为1%；羧基活化的叶酸与壳聚糖的质量比为900:25-27；FA-CS和2,3二甲基马来酸酐和三乙胺的摩尔比为1:3:0.072。
进一步的，向Cu-MSN@DOX/AA的溶液中加入FA-CS-DMMA和羧甲基壳聚糖，在无氧环境搅拌反应后，分离产物，制备得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA。
进一步的，向10体积份、浓度为1质量份/体积份的Cu-MSN@DOX/AA的水溶液中，加入0.5体积份、浓度为4质量份/体积份的FA-CS-DMMA的水溶液和加入0.5体积份、浓度为2质量份/体积份的羧甲基壳聚糖的水溶液，无氧环境中，搅拌反应，分离产物后得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA。
实施例1
一种过渡金属基介孔纳米催化药物，所述催化药物的表达式如（1）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E （1）
其中，Y表示过渡金属，所述过渡金属为铁、铜、锰或钴；MSN表示介孔二氧化硅；Z表示化疗药剂；E表示外源性过氧化氢提供剂，外源性过氧化氢提供剂为葡萄糖氧化酶、金属过氧化物或抗坏血酸盐；CMC表示羧甲基壳聚糖，CS表示壳聚糖，FA表示叶酸，DMMA表示2,3-二甲基马来酸酐；
Y-MSN表示过渡金属离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料；
Y-MSN@Z/E表示Y-MSN先负载化疗药剂再负载外源性过氧化氢提供剂得到的材料；
FA-CS-DMMA表示壳聚糖接枝叶酸和2,3-二甲基马来酸酐后得到的材料；
FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E表示羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式与Y-MSN@Z/E结合得到的材料。
进一步的，所述Y-MSN@Z/E表示：Y-MSN先通过疏水作用负载化疗药剂得到Y-MSN@Z，Y-MSN@Z再通过亲水作用负载抗坏血酸盐后得到的Y-MSN@Z/E材料；
其中，Y-MSN@Z表示Y-MSN负载化疗药剂得到的材料。
过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，包括：
S1.采用Y-MSN负载化疗药剂和外源性过氧化氢提供剂，得到Y-MSN@Z/E；
S2.采用叶酸和2,3-二甲基马来酸酐修饰壳聚糖，制备得到FA-CS-DMMA；
S3.将羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式修饰在Y-MSN@Z/E的表面，制备得到纳米催化药物；所述纳米催化药物的表达式如式（1）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E （1）
其中，Y表示过渡金属；MSN表示介孔二氧化硅；Z表示化疗药剂；E表示外源性过氧化氢提供剂，CMC表示羧甲基壳聚糖，CS表示壳聚糖，FA表示叶酸，DMMA表示2,3-二甲基马来酸酐；Y-MSN表示过渡金属离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料。
实施例2
一种铜基介孔纳米催化药物，所述催化药物的表达式如式（2）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）
其中，DOX表示阿霉素，AA表示抗坏血酸盐；
所述Cu-MSN@DOX/AA表示：Cu-MSN先通过疏水作用负载阿霉素得到Cu-MSN@D，Cu-MSN@D再通过亲水作用负载抗坏血酸盐后得到的Cu-MSN@DOX/AA材料；
其中，Cu-MSN@D表示Cu-MSN负载阿霉素得到的材料。
Cu-MSN与阿霉素的摩尔比为1:1；所述Cu-MSN@D与抗坏血酸盐的摩尔比为1:1。
实施例3
一种铜基介孔纳米催化药物，所述催化药物的表达式如式（2）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）
其中，DOX表示阿霉素，AA表示抗坏血酸盐；
所述Cu-MSN@DOX/AA表示：Cu-MSN先通过疏水作用负载阿霉素得到Cu-MSN@D，Cu-MSN@D再通过亲水作用负载抗坏血酸盐后得到的Cu-MSN@DOX/AA材料；
其中，Cu-MSN@D表示Cu-MSN负载阿霉素得到的材料。
Cu-MSN与阿霉素的摩尔比为25:3；所述Cu-MSN@D与抗坏血酸盐的摩尔比为1:4。
实施例4
一种过渡金属基介孔纳米催化药物，所述催化药物的表达式如式（2）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）
其中，DOX表示阿霉素，AA表示抗坏血酸盐；
所述Cu-MSN@DOX/AA表示：Cu-MSN先通过疏水作用负载阿霉素得到Cu-MSN@D，Cu-MSN@D再通过亲水作用负载抗坏血酸盐后得到的Cu-MSN@DOX/AA材料；
其中，Cu-MSN@D表示Cu-MSN负载阿霉素得到的材料。
Cu-MSN与阿霉素的摩尔比为10:1；所述Cu-MSN@D与抗坏血酸盐的摩尔比为1:2。
实施例5
一种铜基介孔纳米催化药物的制备方法，包括：
S10.制备Cu-MSN；包括：
S101. 将十六烷基三甲基氯化铵作为模板剂溶解于氨水、无水乙醇和水的混合溶液，于60℃水浴搅拌混匀，得到混匀液；氨水、无水乙醇和水的混合溶液采用氨的质量分数为30%的氨水、无水乙醇和去离子水按照体积比1:19:100配制而成；
S102.将正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷和Cu(NO3)2∙3H2O按照摩尔比70:5:1溶解于无水乙醇中，得到滴加液；
S103.将滴加液以滴入的方式加入所述混匀液中，继续搅拌8小时，分离产物，得到Cu-MSN；
S20.制备Cu-MSN@DOX/AA包括：
S201.将摩尔比为1:1的Cu-MSN和DOX分散在二甲亚砜中，得到Cu-MSN@D；其中，Cu-MSN@D表示Cu-MSN负载阿霉素得到的材料；
S202.将摩尔比为1:1的Cu-MSN@D和抗坏血酸盐分散在水中并在无氧环境避光搅拌8小时，分离产物，得到Cu-MSN@DOX/AA。
S30.制备FA-CS-DMMA；包括：
S301.将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺分散在二甲亚砜中，加入叶酸，室温下搅拌混匀，分离产物，得到羧基活化的叶酸；叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺的摩尔比为20:16:7；
S302.将所述羧基活化的叶酸加入溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中，避光搅拌8-12小时,分离产物，得到FA-CS；
S303.将摩尔比为1:3:0.072的FA-CS、2,3二甲基马来酸酐和三乙胺分散在二甲亚砜中，无氧环境搅拌12小时，分离产物，得到黄色粉末FA-CS-DMMA。
溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液采用质量分数为1%的稀醋酸溶解壳聚糖制成；溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中壳聚糖的质量分数为1%；羧基活化的叶酸与壳聚糖的质量比为900:25。
S40.制表达式如式（2）所示的纳米催化药物：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）
其中，DOX表示阿霉素，AA表示抗坏血酸盐；Cu-MSN表示正二价铜离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料；包括：
S401.向10 mL、浓度为1mg/mL的Cu-MSN@DOX/AA的水溶液中，加入0.5 mL、浓度为0.4 mg/mL的FA-CS-DMMA的水溶液和加入0.5 mL、浓度为2 mg/mL的羧甲基壳聚糖的水溶液，无氧环境中，搅拌反应，分离产物后得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA。
实施例6
一种铜基介孔纳米催化药物的制备方法，包括：
S10.制备Cu-MSN；包括：
S101. 将十六烷基三甲基溴化铵作为模板剂溶解于氨水、无水乙醇和水的混合溶液，于75℃水浴搅拌混匀，得到混匀液；氨水、无水乙醇和水的混合溶液采用氨的质量分数为30%的氨水、无水乙醇和去离子水按照体积比1:19:100配制而成；
S102.将正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷和Cu(NO3)2∙3H2O按照摩尔比70:5:1溶解于无水乙醇中，得到滴加液；
S103.将滴加液以滴入的方式加入所述混匀液中，继续搅拌12小时，分离产物，得到Cu-MSN。
S20.制备Cu-MSN@DOX/AA；包括：
S201.将摩尔比为25:3的Cu-MSN和DOX分散在二甲亚砜中，得到Cu-MSN@D；其中，Cu-MSN@D表示Cu-MSN负载阿霉素得到的材料；
S202.将摩尔比为1:4的Cu-MSN@D和抗坏血酸盐分散在水中并在无氧环境避光搅拌8-12小时，分离产物，得到Cu-MSN@DOX/AA。
S30.制备FA-CS-DMMA；包括：
S301.将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺分散在二甲亚砜中，加入叶酸，室温下搅拌混匀，分离产物，得到羧基活化的叶酸；叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺的摩尔比为20:16:7；
S302.将所述羧基活化的叶酸加入溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中，避光搅拌8-12小时,分离产物，得到FA-CS；
S303.将摩尔比为1:3:0.072的FA-CS、2,3二甲基马来酸酐和三乙胺分散在二甲亚砜中，无氧环境搅拌12小时，分离产物，得到黄色粉末FA-CS-DMMA。
溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液采用质量分数为3%的稀醋酸溶解壳聚糖制成；溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中壳聚糖的质量分数为1%；羧基活化的叶酸与壳聚糖的质量比为900:27。
S40.将羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式修饰在Cu-MSN@DOX/AA的表面，制备得到所述纳米催化药物；所述催化药物的表达式如式（2）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）
其中，DOX表示阿霉素，AA表示抗坏血酸盐；Cu-MSN表示正二价铜离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料；包括：
S401.向20 mL、浓度为2 mg/mL的Cu-MSN@DOX/AA的水溶液中，加入1 mL、浓度为0.8 mg/mL的FA-CS-DMMA的水溶液和加入1 mL、浓度为4 mg/mL的羧甲基壳聚糖的水溶液，无氧环境中，搅拌反应，分离产物后得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA。
实施例7
一种铜基介孔纳米催化药物的制备方法，包括：
S10.制备Cu-MSN；包括：
S101. 将十六烷基三甲基氯化铵作为模板剂溶解于氨水、无水乙醇和水的混合溶液，于70℃水浴搅拌混匀，得到混匀液；氨水、无水乙醇和水的混合溶液采用氨的质量分数为30%的氨水、无水乙醇和去离子水按照体积比1:19:100配制而成；
S102.将正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷和Cu(NO3)2∙3H2O按照摩尔比70:5:1溶解于无水乙醇中，得到滴加液；
S103.将滴加液以滴入的方式加入所述混匀液中，继续搅拌10小时，分离产物，得到Cu-MSN。
S20.制备Cu-MSN@DOX/AA；包括：
S201.将摩尔比为10:1的Cu-MSN和DOX分散在二甲亚砜中，得到Cu-MSN@D；其中，Cu-MSN@D表示Cu-MSN负载阿霉素得到的材料；
S202.将摩尔比为1:3的Cu-MSN@D和抗坏血酸盐分散在水中并在无氧环境避光搅拌8-12小时，分离产物，得到Cu-MSN@DOX/AA。
S30.制备FA-CS-DMMA；包括：
S301.将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺分散在二甲亚砜中，加入叶酸，室温下搅拌混匀，分离产物，得到羧基活化的叶酸；叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺的摩尔比为20:16:7；
S302.将所述羧基活化的叶酸加入溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中，避光搅拌10小时,分离产物，得到FA-CS；
S303.将摩尔比为1:3:0.072的FA-CS、2,3二甲基马来酸酐和三乙胺分散在二甲亚砜中，无氧环境搅拌18小时，分离产物，得到黄色粉末FA-CS-DMMA。
溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液采用质量分数为2%的稀醋酸溶解壳聚糖制成；溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中壳聚糖的质量分数为1%；羧基活化的叶酸与壳聚糖的质量比为900:26。
S40.将羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式修饰在Cu-MSN@DOX/AA的表面，制备得到所述纳米催化药物；所述催化药物的表达式如式（2）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）
其中，DOX表示阿霉素，AA表示抗坏血酸盐；Cu-MSN表示正二价铜离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料；包括：
S401.向40mL、浓度为4 mg/mL的Cu-MSN@DOX/AA的水溶液中，加入2 mL、浓度为1.6mg/mL的FA-CS-DMMA的水溶液和加入2 mL、浓度为8 mg/mL的羧甲基壳聚糖的水溶液，无氧环境中，搅拌反应，分离产物后得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA。
实验例
1.实验材料
氨水（NH3·H2O）、无水乙醇（EtOH）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、正硅酸乙酯（TEOS）、盐酸（HCl）、三乙胺（TEA）、三水硝酸铜（Cu(NO3)2∙3H2O）、二甲基亚砜（DMSO）、3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）购自成都科龙化工有限公司。叶酸（FA）、壳聚糖（低分子量，90%脱乙酰度） 、羧甲基壳聚糖（取代度≥85%）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自上海麦克莱恩生化科技有限公司；5,5'-二硫代苯二亚胺（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、还原型谷胱甘肽（GSH）、盐酸阿霉素（HCl-DOX）、2,3-二甲基马来酸酐（DMMA）、抗坏血酸钠（AscHNa）和5,5-二甲基-1-吡咯啉氧化物（DMPO）购自阿拉丁（中国上海）。3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT），钙黄绿素乙酰氧基甲酯（Calcein-AM），碘化丙啶（PI），4′,6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI），2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），DNA损伤检测试剂盒，带有膜联蛋白V-FITC和PI的凋亡试剂盒以及谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）检测试剂盒均购自碧云天（中国上海）。
制备铜基介孔纳米催化药物，所述催化药物的表达式如式（2）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）。
式（2）的制备流程以及作用机理如图1和图2所示，制备方法包括：
1. 制备Cu-MSN的步骤为：将2 mL的 NH3·H2O和38 mL乙醇溶解在200 mL去离子水中，加入1.0 g的CTAB搅拌溶解；并在65℃下持续搅拌；然后，将0.58 mmol的正硅酸乙酯、0.21 mmol的Cu(NO3)2∙3H2O、0.85 mmol的APTES 溶于25 mL无水乙醇搅拌均匀，滴加到CTAB溶液中；反应10小时后，用150 mL无水乙醇和18 mL质量分数为37%的盐酸的混合液移除模板剂，并通过高速离心收集产物。
2.制备Cu-MSN@DOX/AA的步骤为：将0.01 mol的Cu-MSN和0.001mol的DOX∙HCl分散在二甲基亚砜DMSO中，然后加入0.72 mmoL的三乙胺TEA，在室温黑暗的条件下连续搅拌过夜；通过用去离子水和乙醇离心洗涤三次去除游离DOX，通过冷冻干燥收集Cu-MSN@D。将1mol的Cu-MSN@D和4 mol的AA分散在去离子水中，在氮气环境中常温黑暗条件下搅拌12小时，最后通过冷冻干燥收集Cu-MSN@DOX/AA。
3.制备FA-CS-DMMA的步骤为：将1.6 mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC、0.75 mmol的N-羟基琥珀酸亚胺NHS分散在DMSO中，加入2.04 mmol叶酸FA在30℃（25-37℃）水浴条件持续搅拌4小时，反应产物用冷乙醚中沉淀去除副产物得到活化的FA；26.93 mg壳聚糖CS在质量浓度1%-3%的稀醋酸溶液中充分溶解，将活化后的FA加入其中黑暗条件下搅拌8-12小时，然后加入氢氧化钠溶液将溶液pH值调至8.0-9.0；以5000 rpm转速离心后用去离子水洗涤，用pH 7.4的PBS透析纯化3天后得到产物FA-CS；按照摩尔比1 mol:3 mol:0.072 mmol将FA-CS、2,3二甲基马来酸酐DMMA 和TEA混合分散在20-30 mL的DMSO中，在干燥氮气保护下搅拌12-24小时；最后，透析纯化去除多余DMMA，通过冷冻干燥获得黄色粉末FA-CS-DMMA。
4.制备FCDC@Cu-MSN@DA的步骤为：向10 mL、浓度为1 mg/mL的Cu-MSN@DOX/AA的水溶液中，加入0.5 mL、浓度为0.4 mg/mL的FA-CS-DMMA的水溶液和加入0.5 mL、浓度为2 mg/mL的羧甲基壳聚糖的水溶液，无氧环境中，搅拌反应，分离产物后得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA即FCDC@Cu-MSN@DA。
表征
将实验例制备的FCDC@Cu-MSN@DA进行表征。通过透射电子显微镜（TEM）图像如图3显示Cu-MSN纳米粒的粒径约为50-60 nm，平均水合粒径为105.1 nm（图4），Cu-MSN的比表面积为549.5 m2/g（图5），X射线色散谱（EDS）图像如图6显示Cu-MSN由N、O、Si、Cu等元素组成，表明Cu2+成功掺杂到介孔二氧化硅骨架中。载药和表面修饰后FCDC@Cu-MSN@DA的SEM图像如图7所示，粒径约为100 nm。
氧化性检测
通过X射线光电子能谱（XPS）分析FCDC@Cu-MSN@DA的元素组成，对Cu 2p的XPS分析表明，在933.5 eV和953.1 eV存在两个主峰，并且在962.6 eV和943.8 eV处有两个卫星峰，表明铜处于二价氧化态（Cu2+）并成功地掺入到MSN结构中形成Si-O-Cu键。通过ICP-OES检测出Cu-MSN中Cu2+含量为3.3%。
为了确定产生活性氧的能力，用电子自旋共振（ESR）检测FCDC@Cu-MSN@DA不同时间催化产生·OH的能力，结果如图10所示，可看出独特四重峰（1:2:2:1）表明产生了·OH，且存在时间依赖性，随着催化反应时间的延长峰的强度增加；图11中三重峰（1:1:1）证实了在催化过程中存在单线态氧（1O2）的形成。
通过3,3,5,5-四甲基苄胺（TMB）显色法测定FCDC@Cu-MSN@DA能产生ROS，并且能通过产生H2O2来增强ROS生成。该方法可将无色TMB底物氧化为蓝色ox-TMB，在370 nm处出现最大吸光度；结果如图12所示，（1）Cu-MSN + H2O2和（2）FCDC@Cu-MSN@DA能够将无色TMB转化为蓝色的氧化产物ox-TMB，而单独添加（3）AA或（4）H2O2时没有颜色变化；表明FCDC@Cu-MSN@DA在模拟肿瘤微环境的酸性环境下具有良好的催化活性，Cu-MSN结构降解释放Cu2+和AA自氧化产生H2O2；Cu2+与GSH反应还原生成Cu+，Cu+与H2O2进行类芬顿催化反应生成∙OH，能够将TMB快速氧化，并且在紫外吸收光谱370 nm处出现明显的吸收峰。
谷胱甘肽（GSH）是一种重要的细胞内抗氧化剂（0.1-10 mM），广泛存在于生物体内。由于肿瘤细胞内存在过表达GSH（GSH≈10 mM），其抗氧化特性能够可以保护细胞免受高反应性∙OH损伤且赋予肿瘤细胞抗凋亡能力。肿瘤细胞中活性氧ROS易被抗氧化剂GSH清除，因此FCDC@Cu-MSN@DA消耗肿瘤细胞中的GSH促进ROS的生成和累计，使用DTNB检测FCDC@Cu-MSN@DA对GSH的消耗作用。GSH与DTNB偶联生成二苯基3-硫代-6-硝基苯甲酸（TNB2−) 在412nm处有明显的吸收峰，随着GSH逐渐被FCDC@Cu-MSN@DA消耗，TNB2−被重新转换成DTNB。如图13所示，FCDC@Cu-MSN@DA在10分钟内能够快速的消耗GSH，充分证明其具有氧化GSH的能力。
体外不同pH缓冲液中DOX和铜离子释放
根据以下方程式计算得Cu-MSN的载药能力（DL）和载药效率（EE）分别为17.65%和88.3%。
DL%=
Figure SMS_1
×100%
EE% =
Figure SMS_2
×100%
Cu-MSN在紫外光谱中没有吸收峰，而FCDC@Cu-MSN@DA在265 nm和480 nm处表现出明显的吸光度，表明AA和DOX成功封装到FCDC@Cu-MSN@DA中。
向透析袋（MWCO=1000）添加FCDC@Cu-MSN@DA（2 mL，1mg/mL）浸入不同pH值（7.4、6.5或5.0）的缓冲液中。然后，将摇床设定为37℃，转速设定为100 rpm。在预定时间（30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时）收集缓冲液，以通过电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）检测释放的铜离子；如图14和图15所示，大约53.5%的DOX和72%的AA在酸性缓冲液（pH 5.0）中释放，相比之下，DOX和AA在弱酸性缓冲液（pH 6.5）中释放量分别低于15%和40%，中性缓冲液（pH 7.4）中的释放量分别低于10%和30%，表明DOX和AA的释放与pH有关，在模拟肿瘤细胞内的溶酶体环境（pH 5.0）中DOX受到刺激响应释放行为明显，并且说明FCDC@Cu-MSN@DA在血液循环中能够保持结构的稳定性和完整性。
通过ICP-OES测量FCDC@Cu-MSN@DA中的Cu2+释放行为，如图16所示，FCDC@Cu-MSN@DA在ABS缓冲液（pH 5.0）中释放了近80%的Cu2+，而在PBS缓冲液（pH 7.4）中的铜离子含量可以忽略不计，这进一步证实了酸性环境引发了Cu-MSN中Si-O-Cu结构的降解，从而释放出Cu2+。
体外细胞毒性
从成都医学院获得血管内皮细胞（EC）、小鼠乳腺癌细胞（4T1）、人乳腺癌细胞（MCF-7）和人非小细胞肺癌（A549）。4T1细胞在添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640中培养，MCF-7细胞和A549细胞在添加10% FBS的DEME培养基中培养，培养温度为37℃，CO2浓度为5%，湿度为100%。
MTT法检测纳米颗粒对肿瘤细胞的生物相容性。EC、4T1细胞分别以每孔5×103个细胞的密度接种在96孔板中。Cu在FCDC@Cu-MSN@DA中的含量通过ICP-OES测定为3.3%。经过一夜的孵育之后，分别用Cu-MSN和FCDC@Cu-MSN在不同浓度下（材料：20，40，80，120，160，200 /mL）与细胞共培养24小时。然后，将细胞与MTT孵育4小时。在移除培养基并添加DMSO后，使用酶标仪获得OD值。结果如图17所示，当Cu-MSN的浓度增加到200 μg/mL时4T1细胞存活率接近80%，由于Cu-MSN纳米颗粒依靠被动靶向在血液循环过程被内皮网状系统吞噬不可避免，导致纳米颗粒到达肿瘤病灶部位的富集量有限；经过多功能壳聚糖表面修饰后的空白材料FCDC@Cu-MSN浓度增加到200 μg/mL 4T1细胞存活率接近70%，由于单独的化学动力学治疗在肿瘤部位由于受到H2O2含量不足，GSH对活性氧的还原作用导致∙OH产生和积累不足以杀死肿瘤细胞。
MTT晶体的形成量在一定范围内与活细胞的数量成正比；当FCDC@Cu-MSN@DA浓度增加到30 μg/mL时，细胞存活率下降到20%以下；然而，即使在200 μg/mL的高浓度下，EC在培养24小时后的存活率仍保持80%以上。这是由于FCDC@Cu-MSN@DA在正常组织或正常细胞的中性pH环境下结构保持稳定和完整，使得FCDC@Cu-MSN@DA与正常细胞具有良好的细胞相容性；FCDC@Cu-MSN@A比FCDC@Cu-MSN@D肿瘤细胞存活率高，证明单独CDT治疗由于受到H2O2含量限制疗效并非最佳；与游离DOX相比，FCDC@Cu-MSN@D肿瘤细胞死亡增加，说明CDT与化疗联合相比单独化疗具有优越性；与CDC@Cu-MSN@DA相比，FCDC@Cu-MSN@DA即使在较低浓度时也具有较强的肿瘤细胞毒性，表明具有主动靶向定位的外源性H2O2增强CDT联合化疗在肿瘤治疗中具有很好的治疗效果，具有广阔的前景。
AM/PI细胞双染色法用于在可视化条件下观察细胞的存活情况。显然FCDC@Cu-MSN@DA诱导的肿瘤细胞凋亡多于对照组DOX和FCDC@Cu-MSN@A，这归因于CDT联合化疗的协同效应比单独CDT或单独化疗的好；并且由于主动靶向作用提高纳米颗粒在肿瘤部位的蓄积以及外源性H2O2放大增强CDT和化疗的协同治疗，FCDC@Cu-MSN@DA诱导的细胞凋亡率也同样高于FCDC@Cu-MSN@D和CDC@Cu-MSN@DA。
4T1细胞的流式细胞术结果显示在不同材料处理（PBS、DOX、FCDC@Cu-MSN@D、FCDC@Cu-MSN@A、CDC@Cu-MSN@DA、FCDC@Cu-MSN@DA）后，FCDC@Cu-MSN@DA在12小时内引起的细胞凋亡最多，表明在靶向作用下外源性H2O2放大增强CDT和化疗的协同治疗效果良好。
GSH消耗和活性氧生成
为了验证CDT药物是否能使GSH减少，从细胞水平研究了不同材料对GSH的消耗作用。在与不同材料（PBS、DOX、FCDC@Cu-MSN@D、FCDC@Cu-MSN@A、CDC@Cu-MSN@DA、FCDC@Cu-MSN@DA）共培养后，与FCDC@Cu-MSN@DA 赋予后4T1细胞中的细胞内GSH含量如预期显著降低，这进一步证实了FCDC@Cu-MSN@DA具有类谷胱甘肽酶活性，在ROS产生之前能消耗GSH。
DCFH-DA是具有细胞膜渗透性的氧化应激指示剂，适用于检测活性氧（ROS）；当它进入细胞后，被细胞酯酶水解转化为非荧光DCFH，随后被氧化产生强荧光产物2',7'-二氯荧光素（DCF），可通过荧光显微镜观察。结果显示4T1细胞与FCDC@Cu-MSN@DA孵育后显示出最强的绿色荧光，表明FCDC@Cu-MSN@DA通过类芬顿反应产生大量的·OH。
细胞核内DNA损伤
DOX作为化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡，能够抑制肿瘤细胞核内的DNA合成和复制。DNA损伤检测试剂盒（γ-H2AX免疫荧光法），是通过免疫荧光染色检测DNA损伤标记物γ-H2AX的含量以确认DNA是否损伤的检测试剂盒，可以通过荧光显微镜检测细胞中的DNA损伤情况。为了验证FCDC@Cu-MSN@DA使肿瘤细胞凋亡主要是通过化疗引发的DNA损伤，使用DNA损伤检测试剂盒考察不同材料（PBS、DOX、FCDC@Cu-MSN@D、FCDC@Cu-MSN@DA）处理后细胞内的DNA损伤情况。结果显示与空白对照组相比，三组细胞分别有不同程度的DNA损伤情况；由于游离DOX在运输过程的损失等原因，单独的DOX组荧光强度较弱；FCDC@Cu-MSN@D与FCDC@Cu-MSN@DA孵育后细胞显示绿色荧光较强，由于聚合物链段的修饰，减少了药物在运输过程中的泄漏，靶向作用增加纳米颗粒的转运效率，纳米颗粒在酸性TME中成功释放药物DOX作用于肿瘤细胞核DNA，诱导肿瘤细胞凋亡。
细胞内摄取研究
通过生物透射电子显微镜（Bio-TEM）直接观察到4T1细胞在不同时间间隔（1、3和5小时）对CDC@Cu-MSN@DA和FCDC@Cu-MSN@DA的吞噬过程。共培养1小时后观察到两组纳米颗粒存在于肿瘤细胞微绒毛附近；3小时观察到靶向修饰后的纳米颗粒FCDC@Cu-MSN@DA逐渐被肿瘤细胞内吞，且灰黑色的靶向纳米颗粒FCDC@Cu-MSN内吞进入细胞的数量明显多于无靶向作用的CDC@Cu-MSN@DA；5小时观察到大量的灰黑色纳米颗粒在肿瘤细胞内累计引发细胞凋亡，细胞结构完全破坏。这些结果表明FCDC@Cu-MSN@DA纳米颗粒在靶向作用下提高转运效率以及在肿瘤部位的富集量，FCDC@Cu-MSN@DA成功被细胞吞噬对肿瘤细胞具有高度的细胞毒性，有望在后续治疗中发挥作用。
为了评估细胞对纳米颗粒的摄取，4T1细胞与FCDC@Cu-MSN@DA共培养1小时、3小时、5小时后用激光共聚焦（CLSM）观察。其中，将细胞核用DAPI染色呈现蓝色，细胞基质中肌动蛋白用Actin-Tracker Green染色呈现绿色，DOX自发红色荧光。结果显示随着孵育时间的增加，4T1细胞内的红色荧光强度逐渐增强，说明细胞摄取纳米颗粒FCDC@Cu-MSN@DA存在明显的时间依赖性。为了验证叶酸修饰后纳米颗粒FCDC@Cu-MSN@DA具有主动靶向特异性识别的能力，将A549、MCF-7和4T1细胞与FCDC@Cu-MSN@DA共培养5小时后用激光共聚焦（CLSM）观察。结果表明共同培育5小时后A549细胞内的红色荧光强度明显低于MCF-7和4T1细胞。由于MCF-7和4T1细胞表面过表达叶酸受体能够与FCDC@Cu-MSN@DA表面的叶酸特异性识别完成细胞内吞，相比于叶酸受体阴性表达的A549细胞，FCDC@Cu-MSN@DA对于很多细胞膜过表达叶酸受体的肿瘤细胞具有更优异的特异性治疗潜力。
体内抗肿瘤效果
30只荷瘤雌性BALB/c小鼠被随机分为6组（n = 5）。肿瘤生长到50 mm3后，给小鼠尾静脉和瘤内注射PBS，游离DOX，FCDC@Cu-MSN@D, FCDC@Cu-MSN@A, CDC@Cu-MSN@DA，FCDC@Cu-MSN@DA（图8所示）。每天测量一次体重和肿瘤体积，通过静脉注射15天后， 几乎所有小鼠的体重均未发生显著变化，但肿瘤体积出现明显差异，PBS组和DOX组肿瘤体积明显增大。治疗结束后从小鼠身上取出肿瘤组织并称重，如图9所示，FCDC@Cu-MSN@DA呈现出最佳的抗肿瘤效果。PBS组、游离DOX组单独的CDT治疗组FCDC@Cu-MSN@A之间的差异不显著，表明游离DOX治疗和单独的CDT治疗抗肿瘤效果不理想，FCDC@Cu-MSN@DA在所有组中显示出最好的抗肿瘤疗效，表明化疗和H2O2增强的CDT靶向联合治疗的疗效最佳。
体内生物安全性研究
血液生化分析显示尾静脉注射FCDC@Cu-MSN@DA后CK、CK-MB、LDH、ALP、AST、UREA和CREA的含量属于正常指标范围内，表明该材料的全身毒副作用小且具有明显的抗肿瘤作用。
从而，本发明实施例提供的过渡金属基介孔纳米催化药物具有靶向定位、载药能力强、稳定性良好、转运效率高和抗肿瘤能力优异等特点；FCDC@Cu-MSN@DA经过靶向特异性识别内吞进入肿瘤细胞后，在酸性TME作用下，Cu-MSN降解释放Cu2+，与GSH之间发生氧化还原反应，消耗抗氧化剂GSH有效增加CDT产物活性氧的积累，放大·OH给癌细胞带来的氧化应激损伤，进一步提高CDT的疗效。同时，化疗药物DOX通过嵌入DNA碱基造成DNA损伤等途径抑制肿瘤细胞的增殖。AA自氧化提供H2O2，Cu2+消耗GSH，经过类芬顿反应产生大量∙OH造成癌细胞严重氧化损伤及负载的化疗药物DOX能有效的抑制肿瘤生长，增强放大CDT和化疗协同治疗癌症；从而，本发明实施例的过渡金属基介孔纳米催化药物可以用于制备用于治疗癌症的药物。

Claims (20)

1.一种过渡金属基介孔纳米催化药物，其特征在于，所述催化药物的表达式如（1）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E （1）
其中，Y表示过渡金属；MSN表示介孔二氧化硅；Z表示化疗药剂；E表示外源性过氧化氢提供剂，CMC表示羧甲基壳聚糖，CS表示壳聚糖，FA表示叶酸，DMMA表示2，3-二甲基马来酸酐；
Y-MSN表示过渡金属离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料；
Y-MSN@Z/E表示Y-MSN先负载化疗药剂再负载外源性过氧化氢提供剂得到的材料；
FA-CS-DMMA表示壳聚糖接枝叶酸和2，3-二甲基马来酸酐后得到的材料；
FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E表示羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式与Y-MSN@Z/E结合得到的材料。
2.根据权利要求1所述的过渡金属基介孔纳米催化药物，其特征在于，所述Y-MSN@Z/E表示：Y-MSN先通过疏水作用负载化疗药剂得到Y-MSN@Z，Y-MSN@Z再通过亲水作用负载外源性过氧化氢提供剂后得到的Y-MSN@Z/E材料；
其中，Y-MSN@Z表示Y-MSN负载化疗药剂得到的材料。
3.根据权利要求1或2所述的过渡金属基介孔纳米催化药物，其特征在于，所述过渡金属为铁、铜、锰或钴。
4.根据权利要求3所述的过渡金属基介孔纳米催化药物，其特征在于，外源性过氧化氢提供剂为葡萄糖氧化酶、金属过氧化物或抗坏血酸盐。
5.根据权利要求4所述的过渡金属基介孔纳米催化药物，其特征在于，所述过渡金属为铜，Y-MSN为Cu-MSN，所述化疗药剂为阿霉素，所述外源性过氧化氢提供剂为抗坏血酸盐；
所述催化药物的表达式如式（2）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）
其中，DOX表示阿霉素，AA表示抗坏血酸盐；
所述Cu-MSN@DOX/AA表示：Cu-MSN先通过疏水作用负载阿霉素得到Cu-MSN@D，Cu-MSN@D再通过亲水作用负载抗坏血酸盐后得到的Cu-MSN@DOX/AA材料；
其中，Cu-MSN@D表示Cu-MSN负载阿霉素得到的材料。
6.根据权利要求5所述的过渡金属基介孔纳米催化药物，其特征在于，Cu-MSN与阿霉素的摩尔比为1-25:1-3；所述Cu-MSN@D与抗坏血酸盐的摩尔比为1:1-4。
7.一种过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，包括：
采用Y-MSN负载化疗药剂和外源性过氧化氢提供剂，得到Y-MSN@Z/E；
采用叶酸和2，3-二甲基马来酸酐修饰壳聚糖，制备得到FA-CS-DMMA；
将羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式修饰在Y-MSN@Z/E的表面，制备得到纳米催化药物；所述纳米催化药物的表达式如式（1）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Y-MSN@Z/E （1）
其中，Y表示过渡金属；MSN表示介孔二氧化硅；Z表示化疗药剂；E表示外源性过氧化氢提供剂，CMC表示羧甲基壳聚糖，CS表示壳聚糖，FA表示叶酸，DMMA表示2，3-二甲基马来酸酐；Y-MSN表示过渡金属离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料。
8.根据权利要求7所述的过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，所述过渡金属为铜，所述化疗药剂为阿霉素，所述外源性过氧化氢提供剂为抗坏血酸盐；
所述制备方法包括：
采用Cu-MSN负载阿霉素和抗坏血酸盐，制备得到Cu-MSN@DOX/AA；
采用叶酸和2，3-二甲基马来酸酐修饰壳聚糖，制备得到FA-CS-DMMA；
将羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式修饰在Cu-MSN@DOX/AA的表面，制备得到所述纳米催化药物；所述催化药物的表达式如式（2）所示：
FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA （2）
其中，DOX表示阿霉素，AA表示抗坏血酸盐；Cu-MSN表示正二价铜离子掺杂介孔二氧化硅后得到的材料。
9.根据权利要求8所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，还包括：
采用正二价铜离子掺杂介孔二氧化硅纳米颗粒，制备得到Cu-MSN。
10.根据权利要求9所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，采用正二价铜离子掺杂介孔二氧化硅纳米颗粒，制备得到Cu-MSN；包括：
将十六烷基三甲基卤化铵作为模板剂溶解于氨水、C1-C3的醇和水的混合溶液，于60-75℃下搅拌混匀，得到混匀液；
按照反应配比将硅源、硅烷偶联剂和可溶性铜盐溶解于C1-C3的醇中，得到滴加液；
将滴加液以滴入的方式加入所述混匀液中，继续搅拌8-12小时，用无水乙醇和盐酸的混合液移除模板剂，分离产物，得到Cu-MSN。
11.根据权利要求10所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，十六烷基三甲基卤化铵为十六烷基三甲基氯化铵或十六烷基三甲基溴化铵；所述C1-C3的醇为无水乙醇；氨水、C1-C3的醇和水的混合溶液为氨水、无水乙醇和水的混合溶液；所述氨水、无水乙醇和水的混合溶液采用氨的质量分数为30%的氨水、无水乙醇和去离子水按照体积比1:19:100配制而成。
12.根据权利要求11所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，按照反应配比将硅源、硅烷偶联剂和可溶性铜盐溶解于C1-C3的醇中，得到滴加液；包括：
将正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷和Cu(NO3)2∙3H2O按照摩尔比70:5:1溶解于无水乙醇中，得到滴加液。
13.根据权利要求8所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，采用Cu-MSN负载阿霉素和抗坏血酸盐，制备得到Cu-MSN@DOX/AA；包括：
Cu-MSN先通过疏水作用负载阿霉素得到Cu-MSN@D，Cu-MSN@D再通过亲水作用负载抗坏血酸盐后得到的Cu-MSN@DOX/AA材料；
其中，Cu-MSN@D表示Cu-MSN负载阿霉素得到的材料。
14.根据权利要求8所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，采用所述Cu-MSN负载阿霉素和抗坏血酸盐，制备得到Cu-MSN@DOX/AA；包括：
将Cu-MSN和DOX分散在二甲亚砜中，得到Cu-MSN@D；
将Cu-MSN@D和抗坏血酸盐分散在水中并在无氧环境避光搅拌8-12小时，分离产物，得到Cu-MSN@DOX/AA。
15.根据权利要求14所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，Cu-MSN与DOX的摩尔比为1-25:1-3；优选10:1；所述Cu-MSN@D与抗坏血酸盐的摩尔比为1:1-4；优选1:4。
16.根据权利要求8所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，采用叶酸和2,3-二甲基马来酸酐修饰壳聚糖，制备得到FA-CS-DMMA；包括：
将活化剂分散在二甲亚砜中，加入叶酸，室温下搅拌混匀，分离产物，得到羧基活化的叶酸；
将所述羧基活化的叶酸加入溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中，避光搅拌8-12小时，分离产物，得到FA-CS；
将FA-CS、2，3二甲基马来酸酐和三乙胺分散在二甲亚砜中，无氧环境搅拌12-24小时,分离产物，得到黄色粉末FA-CS-DMMA。
17.根据权利要求16所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，
所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺；
叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺的摩尔比为20:16:7；
溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液采用质量分数为1%-3%的稀醋酸溶解壳聚糖制成；溶解有壳聚糖的稀醋酸溶液中壳聚糖的质量分数为1%；羧基活化的叶酸与壳聚糖的质量比为900:25-27；FA-CS和2，3二甲基马来酸酐和三乙胺的摩尔比为1:3:0.072。
18.根据权利要求8所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法，其特征在于，将羧甲基壳聚糖和FA-CS-DMMA以静电吸附的方式修饰在Cu-MSN@DOX/AA的表面，制备得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA；包括：
向Cu-MSN@DOX/AA的溶液中加入FA-CS-DMMA和羧甲基壳聚糖，在无氧环境搅拌反应后，分离产物，制备得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA。
19.根据权利要求18所述过渡金属基介孔纳米催化药物的制备方法， 其特征在于，向Cu-MSN@DOX/AA的溶液中加入FA-CS-DMMA和羧甲基壳聚糖，在无氧环境搅拌反应后，分离产物，制备得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA；包括：
向10体积份、浓度为1质量份/体积份的Cu-MSN@DOX/AA的水溶液中，加入0.5体积份、浓度为4质量份/体积份的FA-CS-DMMA的水溶液和加入0.5体积份、浓度为2质量份/体积份的羧甲基壳聚糖的水溶液，无氧环境中，搅拌反应，分离产物后得到FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA。
20.权利要求1-6任意一项所述纳米催化药物或权利要求7-19任意一项所述制备方法制备得到的纳米催化药物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
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