CN115089728A - 一种膀胱癌靶向纳米药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种膀胱癌靶向纳米药物及其制备方法。本发明提供一种膀胱癌靶向纳米药物，包括氨基改性介孔硅载体、负载于所述氨基改性介孔硅载体的介孔中的膀胱癌原料药，以及接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面的分子开关；所述分子开关包括苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体，所述苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体通过B‑N配位键形成超分子组装体；所述分子开关通过B‑N配位键接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面。本发明提供的膀胱癌靶向纳米药物能够高效靶向膀胱癌病灶，且提高膀胱癌药物在膀胱内的持留时间，进而高效抑制膀胱癌的发生发展进程，防止术后膀胱癌复发。

Description

一种膀胱癌靶向纳米药物及其制备方法
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种膀胱癌靶向纳米药物及其制备方法。
背景技术
膀胱癌是临床极为常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。目前，临床膀胱癌的化学治疗主要采用顺铂、阿霉素等抗肿瘤药物，通过单纯药物的膀胱灌注或静脉注射，实现对膀胱癌发展的抑制。然而，鉴于上述小分子抗肿瘤药物存在靶向性差、对正常组织毒性大、在膀胱肿瘤部位持留时间短等问题，使得膀胱癌的化学治疗效率往往偏低。
纳米药物是通过纳米载体负载或小分子药物自组装手段，实现抗肿瘤药物的纳米化，通过引入肿瘤靶向分子、智能响应元件，增强抗肿瘤药物的病灶靶向性，同时赋予药物可控释放性能，提高肿瘤化学治疗效率。然而，迄今罕见有针对膀胱癌的纳米药物设计与应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种膀胱癌靶向纳米药物及其制备方法，本发明提供的膀胱癌靶向纳米药物能够高效靶向膀胱癌病灶，且提高膀胱癌药物在膀胱内的持留时间，进而高效抑制膀胱癌的发生发展进程，防止术后膀胱癌复发。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种膀胱癌靶向纳米药物，包括氨基改性介孔硅载体、负载于所述氨基改性介孔硅载体的介孔中的膀胱癌原料药，以及接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面的分子开关；所述分子开关包括苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体，所述苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体通过B-N配位键形成超分子组装体；所述分子开关通过B-N配位键接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面。
优选的，所述分子开关还包括卡介苗可溶性蛋白Groel1，所述分子开关还包括卡介苗可溶性蛋白Groel1时，所述苯硼酸修饰的壳聚糖分别和膀胱癌抗体以及卡介苗可溶性蛋白Groel1通过B-N配位键形成超分子组装体。
优选的，所述氨基改性介孔硅载体的介孔的尺寸为3～8nm。
优选的，所述分子开关的制备方法包括以下步骤：
将苯硼酸修饰的壳聚糖、膀胱癌抗体和缓冲溶液混合，得到所述分子开关。
优选的，所述苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体的质量比为1:(0.005～0.01)。
优选的，所述膀胱癌抗体的制备方法包括以下步骤：
将膀胱癌抗原缓冲溶液、卡介苗可溶性蛋白Groel1、偶联剂和蛋白交联剂混合，得到膀胱癌疫苗；
采用所述膀胱癌疫苗免疫动物后分离动物血清，得到所述膀胱癌抗体。
优选的，所述苯硼酸修饰的壳聚糖的制备方法包括以下步骤：
将卤代甲基苯硼酸、壳聚糖和醇溶剂混合发生偶联反应，得到苯硼酸修饰的壳聚糖。
优选的，所述氨基改性介孔硅载体的制备方法包括以下：
将十六烷基三甲基溴化铵、氢氧化钠、正硅酸乙酯、水和有机溶剂混合，得到介孔硅材料；
将所述介孔硅材料和硅烷偶联剂混合改性，得到所述氨基改性介孔硅载体，所述硅烷偶联剂含有氨基基团。
本发明提供上述技术方案所述的膀胱癌靶向纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
将氨基改性介孔硅载体、膀胱癌原料药和水混合，得到载药氨基改性介孔硅载体分散液；
将载药氨基改性介孔硅载体分散液和分子开关缓冲溶液混合后固液分离，得到所述膀胱癌靶向纳米药物。
优选的，所述氨基改性介孔硅载体和膀胱癌原料药的质量比为1:(0.1～0.2)。
本发明提供一种膀胱癌靶向纳米药物，包括氨基改性介孔硅载体、负载于所述氨基改性介孔硅载体的介孔中的膀胱癌原料药，以及接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面的分子开关；所述分子开关包括苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体，所述苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体通过B-N配位键形成超分子组装体；所述分子开关通过B-N配位键接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面。本发明提供的膀胱癌靶向纳米药物包括接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面的分子开关，分子开关中的膀胱癌抗体能够高效靶向膀胱癌病灶，分子开关中的苯硼酸修饰的壳聚糖具有活性氧响应性功能，当所述膀胱癌靶向纳米药物靶向富集于膀胱癌病灶后，分子开光中的苯硼酸结构在膀胱癌病灶环境中的活性氧(炎症分子产生)作用下，将膀胱癌抗体从所述氨基改性介孔硅载体表面脱离，将负载于氨基改性介孔硅载体介孔内的膀胱癌原料药在膀胱癌病灶原位释放，；同时由于分子开光中的苯硼酸结构同时能够对膀胱癌细胞环境中的蛋白质具有响应性功能，延长了膀胱癌靶向纳米药物在病灶部位的持留时间。由此，本发明提供的膀胱癌靶向纳米药物能够高效靶向膀胱癌病灶，且提高膀胱癌药物在膀胱内的持留时间，进而高效抑制膀胱癌的发生发展进程，防止术后膀胱癌复发。
进一步的，所述分子开关还包括卡介苗可溶性蛋白Groel1，所述所述分子开关还包括卡介苗可溶性蛋白Groel1时，所述苯硼酸修饰的壳聚糖分别和膀胱癌抗体以及介苗可溶性蛋白Groel1通过B-N配位键形成超分子组装体。本发明提供的膀胱癌靶向纳米药物的分子开关还包括卡介苗可溶性蛋白Groel1，所述苯硼酸修饰的壳聚糖、膀胱癌抗体和介苗可溶性蛋白Groel1形成超分子组装体能够进一步实现对载药氨基改性介孔硅载体的包覆，提高载药氨基改性介孔硅载体的结构稳定性，降低膀胱癌原料药在未到达膀胱癌病灶前释放的几率，降低膀胱癌靶向纳米药物对正常膀胱细胞的的损伤。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT的透射电镜照片；
图2为本发明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT与原始氨基改性介孔硅载体MSN的Zeta电势；
图3本发明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT在不同溶液中孵育12小时后的顺铂释放率；
图4为本发明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT与单纯顺铂组的顺铂尿液排出曲线；
图5为为本发明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT、单纯顺铂及氨基改性介孔硅载体MSN对膀胱癌的抑制效果图。
具体实施方式
本发明提供了一种膀胱癌靶向纳米药物，包括氨基改性介孔硅载体、负载于所述氨基改性介孔硅载体的介孔中的膀胱癌原料药，以及接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面的分子开关；所述分子开关包括苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体，所述苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体通过B-N配位键形成超分子组装体；所述分子开关通过B-N配位键接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面。
在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
本发明提供的膀胱癌靶向纳米药物包括氨基改性介孔硅载体。
在本发明中，所述氨基改性介孔硅载体的尺寸为纳米级。
在本发明中，所述氨基改性介孔硅载体的介孔的尺寸优选为3～8nm，更优选为4～6nm。
在本发明中，所述氨基改性介孔硅载体的Zeta电势具体优选为+35mV。
在本发明中，所述氨基改性介孔硅载体的制备方法优选包括以下步骤：
将十六烷基三甲基溴化铵、氢氧化钠、正硅酸乙酯、水和有机溶剂混合，得到介孔硅材料；
将所述介孔硅材料和硅烷偶联剂混合改性，得到所述氨基改性介孔硅载体。
本发明将十六烷基三甲基溴化铵、氢氧化钠、正硅酸乙酯、水和有机溶剂混合(以下称为第一混合)，得到介孔硅材料。
在本发明中，所述十六烷基三甲基溴化铵作为有机模板剂。
在本发明中，所述有机溶剂具体优选为均三甲苯。
在本发明中，所述水优选为去离子水。
在本发明中，所述第一混合优选包括以下步骤：
将氢氧化钠溶解于部分水中，得到氢氧化钠溶液；
将剩余水、十六烷基三甲基溴化铵、所述氢氧化钠溶液、所述有机溶剂进行第二混合，得到碱性胶束液；
将所述碱性胶束液和所述正硅酸乙酯进行第三混合，得到所述介孔硅材料。
在本发明中，所述氢氧化钠溶液的质量浓度优选为2mol/L。
在本发明中，所述剩余水的体积和所述十六烷基三甲基溴化铵的质量之比优选为1mL:(1～5)mg，更优选为1mL:(1.5～4)mg。
在本发明中，所述十六烷基三甲基溴化铵的质量和所述氢氧化钠溶液的体积之比优选为(1.5～4)mg:(0.1～1)mL，优选为(2～3.5)mg:(0.1～1)mL。
在本发明中，所述十六烷基三甲基溴化铵的质量和所述有机溶剂的体积之比优选为(1.5～4)mg:(1～2)mL，优选为(2～3.5)mg:(1～2)mL。
在本发明中，所述第二混合优选包括依稀进行超声混合和搅拌混合。
在本发明中，所述超声混合的温度优选为室温，所述超声混合的时间优选为10～30min。
在本发明中，所述搅拌混合的温度优选为80℃。
在本发明中，所述搅拌混合的转速优选为400～800r/min，更优选为450～750r/min。
在本发明中，所述搅拌混合的时间优选为10min。
在本发明中，所述搅拌混合优选在水浴或油浴条件下进行。
在本发明中，所述十六烷基三甲基溴化铵的质量和所述正硅酸乙酯的体积之比优选为(1.5～4)mg:(1～2)mL，优选为(2～3.5)mg:(1～2)mL。
在本发明中，所述第三混合优选在搅拌的条件下进行，在本发明中，所述搅拌的转速优选为400～800r/min，更优选为450～750r/min。
在本发明中，所述第三混合的温度优选为80℃。
在本发明中，所述第三混合的时间优选为1～2h。
得到介孔硅材料后，本发明将所述介孔硅材料和硅烷偶联剂混合改性，得到所述氨基改性介孔硅载体，所述硅烷偶联剂含有氨基基团。
在本发明中，所述硅烷偶联剂具体优选为氨丙基三乙氧基硅烷。
在本发明中，所述硅烷偶联剂具体优选为氨丙基三乙氧基硅烷时，所述十六烷基三甲基溴化铵的质量和所述硅烷偶联剂的体积之比优选为(1.5～4)mg:(100～500)μL，优选为(2～3.5)mg:(100～500)μL。
在本发明中，所述混合改性优选在搅拌的条件下进行，在本发明中，所述搅拌的转速优选为400～800r/min，更优选为450～750r/min。
在本发明中，所述混合改性的温度优选为80℃。
在本发明中，所述混合改性的时间优选为30min。
本发明提供的膀胱癌靶向纳米药物包括负载于所述氨基改性介孔硅载体的介孔中的膀胱癌原料药。
在本发明中，所述膀胱癌原料药优选包括顺铂和/或阿霉素。
在本发明中，所述膀胱癌原料药优选包括顺铂和阿霉素时，所述顺铂和阿霉素的质量比优选为(1～2):(1～2)。
在本发明中，膀胱癌原料药占所述氨基改性介孔硅载体的质量百分比优选为5～20％，更优选为12～17.5％。
在本发明中，所述膀胱癌原料药优选包括顺铂时，所述顺铂占所述氨基改性介孔硅载体的质量百分比优选为5～15％，更优选为12％。
在本发明中，所述膀胱癌原料药优选包括顺铂和阿霉素时，所述顺铂占所述氨基改性介孔硅载体的质量百分比优选为5～10％，更优选为8.5％，所述阿霉素占所述氨基改性介孔硅载体的质量百分比优选为5～10％，更优选为9％。
在本发明中，下文中的药物负载量为膀胱癌原料药占所述氨基改性介孔硅载体的质量百分比。
本发明提供的膀胱癌靶向纳米药物包括接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面的分子开关；所述分子开关包括苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体，所述苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体通过B-N配位键形成超分子组装体；所述分子开关通过B-N配位键接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面。
在本发明中，所述分子开关优选还包括卡介苗可溶性蛋白Groel1。
在本发明中，所述所述分子开关优选还包括卡介苗可溶性蛋白Groel1时，所述苯硼酸修饰的壳聚糖分别和膀胱癌抗体以及卡介苗可溶性蛋白Groel1通过B-N配位键形成超分子组装体。
在本发明中，所述分子开关的制备方法优选包括以下步骤：
将苯硼酸修饰的壳聚糖、膀胱癌抗体和缓冲溶液混合(以下称为第四混合)，得到所述分子开关。
在本发明中，所述苯硼酸修饰的壳聚糖的制备方法优选包括以下步骤：
将卤代甲基苯硼酸、壳聚糖和醇溶剂混合(以下称为第五混合)发生偶联反应，得到苯硼酸修饰的壳聚糖。
在本发明中，所述卤代甲基苯硼酸具体优选为溴甲基苯硼酸。
在本发明中，所述醇溶剂具体优选为甲醇。
在本发明中，所述壳聚糖的分子量优选为2000～10000Da，更优选为3000～8000Da。
在本发明中，所述卤代甲基苯硼酸和壳聚糖的质量之比优选为5:1。
在本发明中，所述壳聚糖的质量和所述醇溶剂的体积之比优选为2g:500mL。
本发明对所述第五混合具体实施过程没有特殊要求。
在本发明中，所述偶联反应的温度优选为50℃。
在本发明中，所述偶联反应的时间优选为24～48h。
在本发明中，所述偶联反应优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速优选为400～800r/min。在本发明中，所述搅拌的具体实施方式优选为磁力搅拌。
在本发明中，所述偶联反应得到偶联反应液，本发明优选对所述偶联反应液进行后处理，得到所述苯硼酸修饰的壳聚糖。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行甲醇透析、去离水透析和干燥。本发明优选将所述偶联反应液加入透析袋依次浸渍于甲醇和去离子水中进行所述甲醇透析和去离水透析，所述透析袋的截留分子量优选为800～1000Da，更优选为850～900Da。在本发明中，所述甲醇透析的温度优选为室温，所述甲醇透析的时间优选为2天，在本发明中，所述去离子水透析的温度优选为2天，所述去离子水透析的时间优选为2天。本发明优选将所述去离子水透析后得到的所述透析袋中的透析浓缩液进行干燥，在本发明中，所述干燥具体优选为冷冻干燥。
在本发明中，所述膀胱癌抗体的制备方法优选包括以下步骤：
将膀胱癌抗原缓冲溶液、卡介苗可溶性蛋白Groel1、偶联剂和蛋白交联剂混合(以下称为第六混合)，得到膀胱癌疫苗；
采用所述膀胱癌疫苗免疫动物后分离动物血清，得到所述膀胱癌抗体。
本发明将膀胱癌抗原缓冲溶液、卡介苗可溶性蛋白Groel1、偶联剂和蛋白交联剂第六混合，得到膀胱癌疫苗。
在本发明中，所述膀胱癌抗原缓冲溶液优选为膀胱癌抗原的PBS缓冲溶液。
在本发明中，所述膀胱癌抗原缓冲溶液中的蛋白质含量优选为1mg/mL。
在本发明中，所述膀胱癌抗原的制备方法包括以下步骤：获取临床膀胱癌患者膀胱癌标本，将所述膀胱癌标本加入到组织匀浆器，冰浴条件下匀浆；将匀浆液转移到离心管中离心分离，得到膀胱癌抗原溶液，即为所述膀胱癌抗原。在本发明中，所述膀胱癌标本的质量优选为0.01～0.1g，所述匀浆的次数优选为25～100次，所述离心分离的转速优选为12000r/min，所述离心分离的时间优选为10min。
在本发明中，所述膀胱癌标本具体为待治疗患者的膀胱癌样本。
在本发明中，所述偶联剂具体优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
在本发明中，所述蛋白交联剂具体优选为N-羟基硫代琥珀酰亚胺。
在本发明中，所述膀胱癌抗原缓冲溶液的体积与所述偶联剂的质量之比优选为10mL:2mg。
在本发明中，所述膀胱癌抗原缓冲溶液的体积与所述蛋白交联剂的质量之比优选为10mL:2mg。
在本发明中，所述膀胱癌抗原缓冲溶液的体积与所述卡介苗可溶性蛋白Groel1的质量之比优选为10mL:2mg。
在本发明中，所述第六混合的温度优选为4℃。
在本发明中，所述第六混合的时间优选为2～12h。
在本发明中，所述第六混合优选在搅拌的条件下进行。
在本发明中，所述第六混合时，所述膀胱癌抗原和所述卡介苗可溶性蛋白Groel1进行复合，得到所述膀胱癌疫苗。
在本发明中，所述第六混合得到复合溶液液，本发明优选对所述复合溶液进行后处理，得到所述膀胱癌疫苗。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行无菌水透析和干燥。本发明优选将所述复合溶液加入透析袋依次浸渍于无菌水中进行所述无菌水透析，所述透析袋的截留分子量优选为5000～16000Da，更优选为8000～15000Da。在本发明中，所述无菌水透析的温度优选为室温，所述无菌水透析的时间优选为48h。本发明优选将所述无菌水透析后得到的所述透析袋中的透析浓缩液进行干燥，在本发明中，所述干燥具体优选为冷冻干燥。
得到膀胱癌疫苗后，本发明采用所述膀胱癌疫苗免疫动物后分离动物血清，得到所述膀胱癌抗体。
在本发明中，所述免疫之前，本发明优选采用PBS缓冲溶解所述膀胱癌疫苗，得到膀胱癌疫苗PBS缓冲溶液。
在本发明中，所述膀胱癌疫苗PBS缓冲溶液的质量浓度优选为1mg/mL。
在本发明中，所述免疫优选为皮下免疫方式。
在本发明中，所述动物优选包括小鼠、大鼠、兔或山羊。
在本发明中，所述免疫的次数优选为3次，每2次免疫的间隔时间优选为7天。
在本发明中，第三次免疫的后的第3天，本发明分离动物血清后，采用硫酸铵沉淀法分离纯化，得到膀胱癌抗体。本发明对所述硫酸铵沉淀法没有特殊要求。
在本发明中，所述苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体的质量比优选为1:(0.005～0.01)，更优选为1:(0.006～0.008)。
在本发明中，所述第四混合的原料优选还包括卡介苗可溶性蛋白Groel1时，所述苯硼酸修饰的壳聚糖和卡介苗可溶性蛋白Groel1的质量比优选为1:(0.005～0.05)，更优选为1:(0.006～0.004)。
在本发明中，所述苯硼酸修饰的壳聚糖的质量和所述缓冲溶液的体积之比优选为1g:100mL。
在本发明中，所述第四混合时，所述缓冲溶液具体优选为PBS缓冲液。
在本发明中，所述第四混合的顺序优选为：将所述苯硼酸修饰的壳聚糖溶解于所述缓冲溶液中，得到苯硼酸修饰的壳聚糖缓冲溶液；将所述苯硼酸修饰的壳聚糖缓冲溶液和所述膀胱癌抗体混合。
在本发明中，所述第四混合的原料优选还包括卡介苗可溶性蛋白Groel1时，所述第四混合的顺序优选为：将所述苯硼酸修饰的壳聚糖溶解于所述缓冲溶液中，得到苯硼酸修饰的壳聚糖缓冲溶液；将所述苯硼酸修饰的壳聚糖缓冲溶液、所述膀胱癌抗体和所述卡介苗可溶性蛋白Groel1混合。
在本发明中，所述第四混合的温度优选为内室温。
在本发明中，所述第四混合时间优选为10min。
在本发明中，所述第四混合优选在搅拌的条件下进行。
本发明提供了上述技术方案所述的膀胱癌靶向纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
将氨基改性介孔硅载体、膀胱癌原料药和水混合，得到载药氨基改性介孔硅载体分散液；
将载药氨基改性介孔硅载体分散液和分子开关缓冲溶液混合后固液分离，得到所述膀胱癌靶向纳米药物。
本发明将氨基改性介孔硅载体、膀胱癌原料药和水混合(以下称为第七混合)，得到载药氨基改性介孔硅载体分散液。
在本发明中，所述水优选为无菌水。
在本发明中，所述所述氨基改性介孔硅载体和膀胱癌原料药的质量比优选为1:(0.1～0.2)，更优选为1:(0.12～0.18)。
在本发明中，所述氨基改性介孔硅载体的质量和所述水的体积之比优选为1g:100mL。
在本发明中，所述第七混合的温度优选为4℃。
在本发明中，所述第七混合的时间优选为12～24h。
在本发明中，所述第七混合优选在搅拌的条件下进行，在本发明中，所述搅拌的转速优选为400～800r/min。在本发明中，所述搅拌优选为磁力搅拌。
得到载药氨基改性介孔硅载体分散液后，本发明将载药氨基改性介孔硅载体分散液和分子开关缓冲溶液混合(以下称为第八混合)后固液分离，得到所述膀胱癌靶向纳米药物。
在本发明中，所述分子开关缓冲溶液优选为采用上述技术方案所述的分子开关的制备方法制备得到的分子开关缓冲溶液，再次不再一一赘述。
在本发明中，所述第八混合时，所述分子开关缓冲溶液的体积优选为10mL。
在本发明中，所述第八混合的温度优选为4℃。
在本发明中，所述第八混合的时间优选为1～6h。
在本发明中，所述第八混合优选在搅拌的条件下进行，在本发明中，所述搅拌的转速优选为600r/min。在本发明中，所述搅拌优选为磁力搅拌。
在本发明中，所述固液分离优选为离心，本发明对所述离心的具体实施过程没有特殊要求。
在本发明中，所述固液分离得到固体产物，本发明优选对所述固体产物进行后处理，得到所述膀胱癌靶向纳米药物。在本发明中，所述后处理优选为洗涤，在本发明中，所述洗涤用溶剂优选为内无菌水。在本发明找那个，所述洗涤的次数优选为3次。
本发明提供了上述技术方案所述膀胱癌靶向纳米药物抗膀胱癌性能评价方法，具体为：采用酸蚀-膀胱癌肿瘤细胞株MB49接种法，建立C57小鼠原位膀胱癌模型；采用上述技术方案所述膀胱癌靶向纳米药物进行膀胱灌注，每隔30min收集小鼠尿液，测定尿液中顺铂含量，反应药物的膀胱内持留能力。采用膀胱灌注法，将上述技术方案所述膀胱癌靶向纳米药物注入荷瘤小鼠膀胱中，注入量为25～250毫克/千克，每天注入1次。处理15天后，采用安乐死方法处死小鼠，摘取膀胱肿瘤进行称重，对肿瘤组织进行TUNEL染色及流式细胞分析，检测肿瘤细胞凋亡率。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
采用胶束介导的硅氧聚合法，制备介孔尺寸为3～8nm氨基改性介孔硅载体：往100mL去离子水中加入300mg十六烷基三甲基溴化铵，0.5mL2mol/L氢氧化钠溶液，1.5mL均三甲苯，超声30min，于80℃油浴、600r/min/条件下搅拌10min。随后加入1.5mL正硅酸乙酯，继续搅拌1.5h；随后加入300μL氨丙基三乙氧基硅烷，继续搅拌30min，得到氨基改性介孔硅载体。
获取临床膀胱癌患者标本0.05g，加入到组织匀浆器，冰浴条件下反复匀浆100次；将匀浆液转移到离心管中，12000r/min条件下离心10min，得到膀胱癌抗原溶液，用PBS缓冲液调整膀胱癌抗原溶液至蛋白浓度为1mg/mL，得到膀胱癌抗原缓冲溶液。往10mL膀胱癌抗原缓冲溶液中加入2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，2mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，2mg卡介苗可溶性蛋白Groel1，于4℃条件下搅拌10h；将反应体系转移到透析袋(截留分子量为5000-16000Da)，在无菌水中透析48h；取出透析袋中的样品，进行冷冻真空干燥，得到膀胱癌疫苗。将膀胱癌疫苗用PBS缓冲液溶解得到膀胱癌疫苗缓冲溶液，其中膀胱癌疫苗缓冲溶液的质量含量为1mg/mL，采用皮下免疫方式，将膀胱癌疫苗缓冲溶液注射至小鼠体内，每隔7天免疫一次，一共免疫3次，最后一次免疫后的第3天，分离小鼠血清，采用硫酸铵沉淀法分离纯化得到膀胱癌抗体。
将10g溴甲基苯硼酸和2g壳聚糖(分子量为2000～10000Da)溶解于500mL甲醇中，将混合液在50℃、600r/min条件下磁力搅拌48小时；将反应液加入到透析袋(截留分子量800～1000Da)，甲醇室温透析2天，去离子水室温透析2天。将透析袋中的液体进行冷冻真空干燥，得到苯硼酸修饰的壳聚糖(记为Chi-BPA)。将1g Chi-BPA溶解于100mL PBS缓冲液中，随后加入10mg膀胱癌抗体，50mg卡介苗可溶性蛋白Groel1，室温条件下搅拌10min，得到分子开关缓冲溶液。
将1g氨基改性介孔硅载体加入到100mL无菌水中，随后加入200mg顺铂，4℃、600r/min条件下磁力搅拌24h；随后加入10mL分子开关缓冲溶液，继续于4℃、600r/min条件下磁力搅拌5h，使分子开关充分与氨基改性介孔硅载体表面结合，离心收集载药粒子，无菌水洗涤3次，得到膀胱癌靶向纳米药物，记为CisPt@MSN@GT。
图1为本发明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT的透射电镜照片；图2为本发明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT与原始氨基改性介孔硅载体MSN的Zeta电势；由图1和图2可以得出：本实施例制备得到的CisPt@MSN@GT尺寸为100～120nm，载体介孔孔径为3～5纳米(图1)。Zeta电势分析结果表明，原始氨基改性介孔硅载体MSN的Zeta电势为+35mV，而实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT的Zeta电势显著下降，仅为+13mV(图2)，表明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT的表面成功被分子开关所包覆，掩盖了部分氨基的正电荷，造成Zeta电势降低。
对比例1
与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：将1g氨基改性介孔硅载体加入到100mL无菌水中，随后加入200mg顺铂，4℃、600r/min条件下磁力搅拌24h；继续于4℃、600r/min条件下磁力搅拌5h，离心收集载药粒子，无菌水洗涤3次，得到膀胱癌靶向纳米药物。
对实施例1和对比例1制备的膀胱癌靶向纳米药物的顺铂的负载量进行分析，实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT的负载量(顺铂占氨基改性介孔硅载体的质量百分比)为12％，而不修饰纳米载体分子开关的纳米药物(对比例1)对顺铂的负载量仅为1.7％。
在纯水、PBS缓冲液及健康小鼠尿液处理条件下，实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT具有良好的稳定性，共孵育12小时后顺铂释放率分别为0.2％，3％及4.9％；与此相比，在0.5mmol/L过氧化氢、1mg/mL血红蛋白处理下，实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT中顺铂呈现高效释放趋势，12h后释放率分别达到58％、46％(图3)。表明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT能够灵敏响应活性氧及血红蛋白刺激，高效释放顺铂药物。
采用酸蚀-膀胱癌肿瘤细胞株MB49接种法，建立C57小鼠原位膀胱癌模型；采用上述技术方案所述膀胱癌靶向纳米药物进行膀胱灌注，每隔30min收集小鼠尿液，测定尿液中顺铂含量，反应药物的膀胱内持留能力。采用膀胱灌注法，将上述技术方案所述膀胱癌靶向纳米药物注入荷瘤小鼠膀胱中，注入量为25～250毫克/千克，每天注入1次。处理15天后，采用安乐死方法处死小鼠，摘取膀胱肿瘤进行称重，对肿瘤组织进行TUNEL染色及流式细胞分析，检测肿瘤细胞凋亡率。图4为本发明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT与单纯顺铂组的顺铂尿液排出曲线，图5为为本发明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT、单纯顺铂及氨基改性介孔硅载体MSN对膀胱癌的抑制效果图。尿液荧光分析结果显示，单纯荧光素组(单纯顺铂组)的尿液排出量在30min达到50％，60min达到75％；与此相比，实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT的荧光素排出量在30min仅为12％，60min仅为18％(图4)，表明实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT具有高效的膀胱持留能力。采用单纯顺铂药物膀胱灌注15天后，膀胱肿瘤重量呈现缓慢增加趋势；与此相比，实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT组的膀胱肿瘤重量并未表现出明显增加(图5)。不仅如此，实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT组的肿瘤组织细胞凋亡率高达98％，而单纯顺铂药物组肿瘤组织细胞凋亡率仅65％。上述结果表明：实施例1制备的膀胱癌靶向纳米药物CisPt@MSN@GT对膀胱肿瘤的生长具有显著抑制作用。
实施例2
与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：将1g氨基改性介孔硅载体加入到100mL无菌水中，随后加入100mg顺铂，150mg阿霉素于4℃、600r/min条件下磁力搅拌24h；随后加入10mL分子开关缓冲溶液，继续于4℃、600r/min条件下磁力搅拌5h，使分子开关充分与氨基改性介孔硅载体表面结合，离心收集载药粒子，无菌水洗涤3次，得到膀胱癌靶向纳米药物。
对比例2
与实施例2的制备方法相同，不同之处在于：将1g氨基改性介孔硅载体加入到100mL无菌水中，随后加入100mg顺铂，150mg阿霉素于4℃、600r/min条件下磁力搅拌24h；继续于4℃、600r/min条件下磁力搅拌5h，使分子开关充分与氨基改性介孔硅载体表面结合，离心收集载药粒子，无菌水洗涤3次，得到膀胱癌靶向纳米药物。
对实施例2和对比例2制备的膀胱癌靶向纳米药物的顺铂的负载量进行分析，实施例2制备的膀胱癌靶向纳米药物同时对阿霉素和顺铂的负载量分别达到9％、8.5％，而不修饰分子开关的对照介孔硅纳米粒子(对比例2)对顺铂和阿霉素的负载效率仅为1.2％、0.8％。在纯水、PBS及健康小鼠尿液处理条件下，实施例2制备的膀胱癌靶向纳米药物具有良好的稳定性，共孵育12小时后阿霉素释放率分别仅为0.4％，5％及5.8％，顺铂释放率分别仅为1.2％，3.6％及6.5％；与此相比，在0.5mmol/L过氧化氢、1mg/mL血红蛋白处理下，智能纳米药物中阿霉素及顺铂均呈现高效释放趋势，12小时后阿霉素释放率分别达到62％、55％，顺铂释放率分别达到56％，48％。表明实施例2制备的膀胱癌靶向纳米药物能够灵敏响应活性氧及血红蛋白刺激，同时高效释放顺铂及阿霉素药物。
对实施例2制备的膀胱癌靶向纳米药物抗膀胱癌性能评价：采用静脉注射法，将实施例2制备的膀胱癌靶向纳米药物注入荷瘤小鼠体内，注入量为25～250mg/千克，每天注射1次。处理15天后，采用安乐死方法处死小鼠，摘取膀胱肿瘤进行称重，对肿瘤组织进行病理切片，评价智能纳米药物的抗肿瘤能力。采用单纯顺铂药物静脉注射15天后，膀胱肿瘤重量呈现缓慢增加趋势，肿瘤组织细胞凋亡率仅43％；与此相比，膀胱肿瘤重量并未表现出明显增加，肿瘤组织细胞凋亡率高达95％，表明实施例2制备的膀胱癌靶向纳米药物对膀胱肿瘤的生长具有强烈抑制效应。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种膀胱癌靶向纳米药物，其特征在于，包括氨基改性介孔硅载体、负载于所述氨基改性介孔硅载体的介孔中的膀胱癌原料药，以及接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面的分子开关；所述分子开关包括苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体，所述苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体通过B-N配位键形成超分子组装体；所述分子开关通过B-N配位键接枝包覆于所述氨基改性介孔硅载体表面。
2.根据权利要求1所述的膀胱癌靶向纳米药物，其特征在于，所述分子开关还包括卡介苗可溶性蛋白Groel1，所述分子开关还包括卡介苗可溶性蛋白Groel1时，所述苯硼酸修饰的壳聚糖分别和膀胱癌抗体以及卡介苗可溶性蛋白Groel1通过B-N配位键形成超分子组装体。
3.根据权利要求1所述的膀胱癌靶向纳米药物，其特征在于，所述氨基改性介孔硅载体的介孔的尺寸为3～8nm。
4.根据权利要求1所述的膀胱癌靶向纳米药物，其特征在于，所述分子开关的制备方法包括以下步骤：
将苯硼酸修饰的壳聚糖、膀胱癌抗体和缓冲溶液混合，得到所述分子开关。
5.根据权利要求4所述的膀胱癌靶向纳米药物，其特征在于，所述苯硼酸修饰的壳聚糖和膀胱癌抗体的质量比为1:(0.005～0.01)。
6.根据权利要求4或5所述的膀胱癌靶向纳米药物，其特征在于，所述膀胱癌抗体的制备方法包括以下步骤：
将膀胱癌抗原缓冲溶液、卡介苗可溶性蛋白Groel1、偶联剂和蛋白交联剂混合，得到膀胱癌疫苗；
采用所述膀胱癌疫苗免疫动物后分离动物血清，得到所述膀胱癌抗体。
7.根据权利要求4或5所述的膀胱癌靶向纳米药物，其特征在于，所述苯硼酸修饰的壳聚糖的制备方法包括以下步骤：
将卤代甲基苯硼酸、壳聚糖和醇溶剂混合发生偶联反应，得到苯硼酸修饰的壳聚糖。
8.根据权利要求1所述的膀胱癌靶向纳米药物，其特征在于，所述氨基改性介孔硅载体的制备方法包括以下：
将十六烷基三甲基溴化铵、氢氧化钠、正硅酸乙酯、水和有机溶剂混合，得到介孔硅材料；
将所述介孔硅材料和硅烷偶联剂混合改性，得到所述氨基改性介孔硅载体，所述硅烷偶联剂含有氨基基团。
9.权利要求1～8任一项所述的膀胱癌靶向纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将氨基改性介孔硅载体、膀胱癌原料药和水混合，得到载药氨基改性介孔硅载体分散液；
将载药氨基改性介孔硅载体分散液和分子开关缓冲溶液混合后固液分离，得到所述膀胱癌靶向纳米药物。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述氨基改性介孔硅载体和膀胱癌原料药的质量比为1:(0.1～0.2)。
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