ES2310122A1 - Nanoparticulas que comprenden una ciclodextrina y una molecula biologicamente activa y sus aplicaciones. - Google Patents

Nanoparticulas que comprenden una ciclodextrina y una molecula biologicamente activa y sus aplicaciones. Download PDF

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Abstract

Las nanopartículas comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa. Dichas nanopartículas pueden asociar elevadas cantidades de moléculas biológicamente activas, especialmente, de naturaleza hidrófoba, y liberar la molécula biológicamente activa proporcionando unos niveles plasmáticos sostenidos y constantes de la misma cuando son administradas por vía oral o a través de cualquier otra mucosa del organismo.

Description

Nanopartículas que comprenden una ciclodextrina y una molécula biológicamente activa y sus aplicaciones.
Campo de la invención
La invención se relaciona con unas nanopartículas, con características bioadhesivas, que comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa. La invención también se relaciona con un procedimiento para su producción, con composiciones que contienen dichas nanopartículas y con sus aplicaciones.
Antecedentes de la invención
En los últimos años, se ha desarrollado el uso de nanopartículas poliméricas biodegradables como vehículos para la administración de fármacos, especialmente, por vía oral. Las nanopartículas se definen, en general, como sistemas coloidales de tipo partícula sólida, con un tamaño inferior al micrómetro, constituidas por polímeros naturales o sintéticos. Dependiendo del proceso seguido en su elaboración se pueden obtener dos tipos de estructuras: nanoesferas o nanocápsulas. Las nanoesferas tienen una estructura de tipo matriz polimérica, en la que se encuentra dispersado el principio activo, mientras que las nanocápsulas poseen un núcleo que contiene el principio activo, rodeado de una cubierta, tal como una cubierta polimérica. Debido a la elevada superficie específica de estos sistemas el principio activo también puede ser adsorbido sobre la superficie del sistema nanoparticular.
La vía oral es la vía más popular y atractiva para la administración de medicamentos. El uso de esta vía se asocia con un aumento significativo de la aceptación de la medicación por parte del paciente y con menores costes sanitarios. Sin embargo, un importante número de fármacos presenta una eficacia muy baja cuando se administran por medio de esa vía. Este fenómeno puede ser debido a uno o varios de los siguientes factores que condicionan la biodisponibilidad oral de un fármaco: (i) baja permeabilidad de la molécula activa para atravesar la mucosa (asociado generalmente a fármacos de naturaleza hidrófila), (ii) baja estabilidad en el ambiente gastrointestinal (presencia de valores de pH extremos, enzimas, etc.), (iii) liberación incompleta del fármaco desde la forma de dosificación, (iv) baja solubilidad del principio activo en el ambiente gastrointestinal (asociado a fármacos de naturaleza hidrófoba), y (v) metabolismo presistémico.
Los sistemas nanoparticulados permiten, en numerosas ocasiones, aumentar de forma significativa la biodisponibilidad de la molécula biológicamente activa y, así, ofrecer nuevas estrategias de administración. La mejora de la biodisponibilidad obtenida tras utilizar estos vehículos se puede explicar mediante la habilidad de las nanopartículas poliméricas para desarrollar interacciones bioadhesivas con el tracto de la mucosa gastrointestinal. Así, cuando una suspensión de nanopartículas se administra por la vía oral, estos transportadores pueden interaccionar y desarrollar interacciones adhesivas con diversos componentes de la mucosa. Dependiendo de ciertos parámetros físico-químicos (tales como la naturaleza del polímero, tamaño, carga superficial o la presencia de ciertos recubrimientos o ligandos en el vehículo), las características bioadhesivas de las nanopartículas pueden variar y permitir, en ciertos casos, alcanzar la superficie del entericito, y, eventualmente, desarrollar interacciones bioadhesivas en regiones muy concretas del tracto gastrointestinal. Todos estos fenómenos conducen a (i) un incremento del tiempo de residencia de la forma farmacéutica en contacto íntimo con la superficie de la mucosa, o a (ii) una localización específica del vehículo (con el fármaco) en una determinada zona. Una vez que las nanopartículas están adheridas a la mucosa, éstas pueden promover la absorción del fármaco transportado y su acceso a la circulación sistémica mediante diversos mecanismos.
Ejemplos ilustrativos de fármacos cuya biodisponibilidad oral aumenta mediante su encapsulación o asociación a nanopartículas incluyen calcitonina de salmón, furosemida, avarol, dicumarol, nifedipina, fluoropirimidinas, plásmidos, etc.
Como polímeros biodegradables para la fabricación de sistemas particulados tienen especial importancia los homo- y co-polímeros de los ácidos láctico y glicólico (PLGA) ya que presentan una buena compatibilidad tisular, no son tóxicos y han sido usados durante muchos años como material de suturas reabsorbibles. Estos (co)polímeros son solubles en disolventes orgánicos, tales como cloroformo, diclorometano, acetona y acetato de etilo e insolubles en medios acuosos; sin embargo, son capaces de captar agua e hincharse en mayor o menor grado, dependiendo de su peso molecular y de su composición. Entre los inconvenientes que presentan estos polímeros merece la pena resaltar que el PLGA puede resultar bastante hidrófobo comparado con muchos de los antígenos que transporta. Además, tanto la hidratación como la degradación del PLGA son requisitos imprescindibles para la liberación del antígeno durante la fase de erosión. Esta erosión produce un microentorno bastante ácido debido a la acumulación de los productos de degradación del polímero, los ácidos láctico y glicólico; el pH puede bajar hasta ser del orden de 2-3. En estas condiciones, las proteínas liberadas sufren hidrólisis y agregación en el medio acidificado y muchos antígenos pierden su capacidad antigénica. Finalmente, su elevado precio podría limitar su uso y favorecería la búsqueda de otros materiales menos costosos.
Como alternativa a los poliésteres, las nanopartículas preparadas con otros polímeros han resultado ser adecuadas para la administración de fármacos por vía oral. Uno de los polímeros más utilizados es el quitosano. El quitosano es un polímero similar a la celulosa que proviene de la desacetilación de la quitina, componente mayoritario del exoesqueleto de los crustáceos. El quitosano puede formularse en nanopartículas de diferentes tamaños donde lleva el fármaco incorporado. Las partículas de quitosano son capaces de aumentar la absorción de proteínas en la superficie mucosa, induciendo una apertura transitoria de las uniones estrechas. Además, el quitosano puede tener un efecto inmunomodulador, estimulando la producción de citoquinas in vitro y mejorando el balance natural Th2/Th3 a nivel de mucosas en ausencia de antígeno.
Recientemente, se ha propuesto el copolímero de metil vinil eter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez®], como material biodegradable para producir nanopartículas (Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330). Estos copolímeros PVM/MA son ampliamente utilizados como espesantes, estabilizantes de soluciones acuosas, componentes de adhesivos dentales, parches transdérmicos y en comprimidos bucales. Entre las principales ventajas de estos polianhídridos merece la pena destacar su bajo coste, su baja toxicidad oral y la disponibilidad de grupos funcionales que pueden reaccionar fácilmente con moléculas que contengan grupos hidroxilo o amino (Arbos et al., J. Control. Release, 89 (2003) 19-30). De este modo, en un medio acuoso, el grupo anhídrido se hidroliza dando lugar a dos grupos carboxilos y esta reacción permite unir ligandos fácilmente a la cadena polimérica o bien a la superficie de las nanopartículas preparadas.
Las ciclodextrinas (CD) son un grupo de oligosacáridos cíclicos, obtenidos por degradación enzimática del almidón. Están compuestas por unidades de \alpha-1,4-glucopiranosa unidas entre sí, formando una estructura de tipo cono truncado con una cavidad interna hidrófoba. Las CD pueden contener más de 15 unidades de \alpha-1,4-glucopiranosa, aunque las más abundantes contienen 6 (\alpha-CD), 7 (\beta-CD) ú 8 (\gamma-CD) unidades de \alpha-1,4-glucopiranosa. En aplicaciones farmacéuticas, la \beta-CD y sus derivados son los más utilizados, en particular, la 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD). Esta CD presenta una elevada solubilidad acuosa, una toxicidad inferior así como una cavidad más hidrófoba en comparación con el compuesto de origen (\beta-CD). Los complejos formados mediante la utilización de ciclodextrinas pueden proporcionar, a la molécula huésped, estabilidad y aumento de solubilidad acuosa, lo que puede llevar a incrementos de la biodisponibilidad de esa molécula (e.g., fármaco) y/o la reducción de efectos adversos. Además, se ha descrito en la literatura la capacidad de aumentar la capacidad de carga de liposomas y micropartículas. Asimismo, las CD son capaces de modificar el perfil de liberación del fármaco encapsulado.
Numerosos agentes antitumorales se administran por vía parenteral, lo que plantea diversos problemas. Entre las principales ventajas que supondría la administración de agentes antitumorales por vía oral, merece la pena destacar el aumento de la calidad de vida de los pacientes así como la reducción de los costes sanitarios. Esta vía de administración permitiría una exposición continua de las células cancerosas al fármaco antitumoral a un nivel de concentración apropiado y sostenido lo que puede mejorar el índice terapéutico y reducir los efectos secundarios. Sin embargo, la gran mayoría de estos fármacos (e.g., paclitaxel) presentan una baja biodisponibilidad al ser administrados por vía oral.
El paclitaxel (Taxol®, Bristol Myers Squibb Company), un producto extraído del árbol Taxus brevifolia, fue descrito por primera vez en 1.971 y desde 1.993 es el agente quimioterápico contra el cáncer más empleado en todo el mundo. El paclitaxel actúa a nivel celular promoviendo la polimerización de la tubulina. De este modo, los microtúbulos formados en presencia de paclitaxel son extraordinariamente estables y no funcionales, causando así la muerte celular por la incapacidad dinámica y funcional de los microtúbulos para la división celular. En Europa, este fármaco está indicado tanto como agente individual como en combinación con otros tratamientos oncológicos para el tratamiento de cáncer de ovario, de mama y de células pulmonares no pequeñas, tanto avanzado como metastático.
El principal inconveniente de este fármaco radica en su escasa biodisponibilidad oral debido a su baja solubilidad acuosa y al efecto de metabolismo de primer paso principalmente. Tras la administración oral, el paclitaxel es sustrato de la glicoproteina-P, así como de otros miembros de la superfamilia ABC (ATP-binding cassette), tales como BCRP y MRP2. La superfamilia ABC transportadora de proteínas juega un papel central en la defensa del organismo frente a compuestos tóxicos y frente a algunos agentes anticancerosos. Dichas proteínas (glicoproteina-P, MRP2 y BCRP) están localizadas en la zona apical de las membranas intestinal, hepática y renal, mediando el bombeo de xenobióticos y toxinas a la luz intestinal, biliar y orina. Además, tanto la glicoproteina-P como MRP2 se localizan conjuntamente junto con CYP3A4, glutation-S-transferasas y UDP-glucuronosiltransferasas lo que supone una actuación sinérgica en la regulación de la biodisponibilidad oral de los fármacos administrados.
Por todo ello, actualmente, el paclitaxel está formulado para su uso en clínica y por vía intravenosa en un vehículo compuesto por Cremophor EL:etanol (1:1). Con el fin de prevenir y minimizar los efectos tóxicos del Cremophor EL por vía intravenosa y mejorar el índice terapéutico del fármaco, recientemente, se ha comercializado una nueva formulación basada en la encapsulación del fármaco en nanopartículas de albúmina denominada Abraxane® (Green et al. Annals of Oncology 17:1263-1268, 2006).
Por tanto, existe la necesidad de desarrollar sistemas de administración de fármacos capaces de aumentar la biodisponibilidad cuando se administran por vía oral de numerosos principios activos, especialmente, de aquellos fármacos de naturaleza lipófila y/o que sean sustrato de la glicoproteína-P (e.g., paclitaxel). Ventajosamente, dichos sistemas de administración deberían tener propiedades bioadhesivas, deberían tener la capacidad de incorporar cantidades variables de fármacos lipófilos, e, idealmente, deberían ser capaces de evitar el efecto de la glicoproteína-P sobre el fármaco transportado. Estos objetivos pueden ser conseguidos mediante las nanopartículas proporcionadas por la presente invención.
Compendio de la invención
Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que la asociación de las nanopartículas de un polímero biodegradable, tal como el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA), con ciclodextrinas unidas a moléculas biológicamente activas, permite obtener unas nanopartículas con características fisicoquímicas y de bioadhesión a la mucosa gastrointestinal que las convierten en sistemas de gran interés como transportadores de todo tipo de moléculas biológicamente activas, especialmente, moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba (lipófila), tal como el paclitaxel. Dichas nanopartículas pueden prolongar el tiempo de residencia en la mucosa tras su administración oral. Además, dichas nanopartículas pueden mejorar la biodisponibilidad de moléculas biológicamente activas que pudieran ser sustrato de la glicoproteína-P. Asimismo, dichas nanopartículas pueden utilizarse como sistemas para la administración de fármacos con elevada toxicidad (e.g., citostáticos) al ofrecer niveles plasmáticos sostenidos y constantes de la molécula biológicamente activa durante periodos de tiempo de hasta 24 horas, lo que posibilita tratamientos alternativos a la perfusión hospitalaria, permitiendo un abaratamiento del coste sanitario de los tratamientos con este tipo de fármacos.
Por tanto, la invención proporciona unas nanopartículas con capacidad para asociar elevadas cantidades de moléculas biológicamente activas, especialmente, de naturaleza hidrófoba, para su administración efectiva a través de mucosas, especialmente, por vía oral, debido a que presentan unas características bioadhesivas adecuadas que favorecen la interacción de las nanopartículas (conteniendo la molécula biológicamente activa) con la superficie de la mucosa, son capaces de transportar un amplio rango de moléculas biológicamente activas, especialmente, de naturaleza lipófila y, sobretodo, de liberar la molécula biológicamente activa proporcionando unos niveles plasmáticos sostenidos y constantes del mismo cuando son administradas por vía oral o a través de cualquier otra mucosa del organismo. Si la molécula biológicamente activa transportada es sustrato de la glicoproteína-P, las nanopartículas de la invención son capaces de evitar la acción de esta proteína sobre la molécula biológicamente activa en cuestión.
Las nanopartículas proporcionadas por esta invención comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa. En particular, se ha encontrado que nanopartículas formadas por un copolímero de polivinil metil éter y anhídrido maleico y \beta-ciclodextrina (\beta-CD), 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD) ó 6-monodeoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina (NH-\beta-CD) son fáciles de producir, y dan excelentes características de bioadhesión, tamaño y potencial zeta que las hace adecuadas para la administración de moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba (e.g., paclitaxel). Además, se ha encontrado que la selección del tipo de ciclodextrina utilizada en su producción permite modular convenientemente las características de estas nanopartículas lo cual puede ser aprovechado ventajosamente según el tipo de molécula biológicamente activa a transportar y/o el modo de administración de la formulación farmacéutica. Por último, se ha encontrado que la incorporación del paclitaxel en estas nanopartículas permite incrementar de forma muy importante la biodisponibilidad oral del mismo, minimizando el efecto de la glicoproteína-P a nivel de la mucosa gastrointestinal.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención se relaciona con nanopartículas que comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa, útiles para el transporte de moléculas biológicamente activas. En una realización particular, el polímero biodegradable es un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA). En otra realización particular, la ciclodextrina es \beta-CD, OH-\beta-CD o NH-\beta-CD.
En una realización particular, la molécula biológicamente activa presente en las nanopartículas de la invención es paclitaxel. En este caso, las nanopartículas permiten aumentos espectaculares de la biodisponibilidad oral del paclitaxel, cuya absorción oral es prácticamente nula debido a sus características físico-químicas (elevada lipofilia) y a ser sustrato de la glicoproteína-P localizada en el tracto gastrointestinal.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende dichas nanopartículas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de dichas nanopartículas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es una gráfica que muestra la variación de la cantidad de ciclodextrina (CD) asociada a las nanopartículas de PMV/MA en función del tipo de CD utilizada [\beta-CD: \beta-ciclodextrina; OH-\beta-CD: 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina; NH-\beta-CD: 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina] y del tiempo de incubación de ésta con el copolímero de metilviniléter y anhídrido maleico (PVM/MA) (100 mg) antes de la preparación de las nanopartículas. Los resultados muestran la media \pm desviación típica (n = 8).
La Figura 2 es una fotografía del resultado obtenido al someter una muestra liofilizada de nanopartículas a base de PVM/MA con \beta-ciclodextrina (\beta-CD-NP) a microscopia de barrido electrónico.
La Figura 3 es una gráfica que muestra la liberación de RBITC desde nanopartículas que contienen ciclodextrinas \beta-CD-NP: nanopartículas a base de PVM/MA con \beta-CD; OH-\beta-CD-NP: nanopartículas a base de PVM/MA con OH-\beta-CD; NH-\beta-CD-NP: nanopartículas a base de PVM/MA con NH-\beta-CD) y de las nanopartículas control (NP) tras su incubación en medio gástrico simulado (durante la primera hora: 0-1 h) y en medio intestinal simulado (1 a 24 h) a 37\pm1ºC. Los datos muestran la media \pm desviación típica (n=3).
La Figura 4 muestra un diagrama de barras que representa la distribución de (A) nanopartículas a base de PVM/MA con hidroxipropil-\beta-CD (OH-\beta-CD-NP); (B) nanopartículas a base de PVM/MA con \beta-CD; y (C) nanopartículas control (NP), en la mucosa del tracto gastrointestinal tras la administración oral de 10 mg de nanopartículas marcadas fluorescentemente con RBITC. El eje x representa los diferentes segmentos de la mucosa; el eje y representa la fracción de nanopartículas adherida a la mucosa; y el eje z representa el tiempo después de la administración.
La Figura 5 es una gráfica que muestra las curvas de bioadhesión obtenidas al representar la fracción de nanopartículas adherida en el tracto gastrointestinal entero respecto al tiempo. Las formulaciones representadas son (\bullet) OH-\beta-CD-NP; (\ding{115})\beta-CD-NP; y (\ding{110}) NP Control. Los valores representan la media \pm desviación estándar (n=3).
La Figura 6 es un conjunto de fotografias que muestran la visualización por microscopía de fluorescencia de las nanopartículas control (A) y OH-\beta-CD-NP (B, C) adheridas al íleo de rata tras 2 horas de la administración oral de una única dosis de 10 mg.
La Figura 7 es una gráfica que muestra la evolución de la cantidad de paclitaxel (PTX) encapsulado en diferentes formulaciones en función del tipo de ciclodextrina utilizada y la cantidad de fármaco añadido inicialmente. Los resultados muestran media\pmdesviación típica (n = 6). PTX-NP: nanopartículas convencionales de PVM/MA con paclitaxel; PTX-\beta-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y \beta-CD con paclitaxel; PTX-OH-\beta-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y OH-\beta-CD con paclitaxel; y PTX-NH-\beta-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y NH-\beta-CD con paclitaxel.
La Figura 8 es un conjunto de gráficas que representan las concentraciones plasmáticas de paclitaxel (PTX) en función del tiempo tras la administración en animales de laboratorio de las distintas formulaciones de PTX. Los resultados muestran la media \pm desviación típica. (A) Vía intravenosa, dosis: 10 mg/kg. Taxol®: formulación comercial de paclitaxel. (B) Vía oral, dosis: 10 mg/kg. Taxol®: formulación comercial de paclitaxel; PTX-\beta-CD: complejo \beta-CD con paclitaxel; PTX-OH-\beta-CD: complejo OH-\beta-CD con paclitaxel; PTX-NH-\beta-CD: complejo NH-\beta-CD con paclitaxel. (C) Vía oral, dosis: 10 mg/kg. PTX-NP: nanopartículas convencionales de PVM/MA con paclitaxel; PTX-\beta-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y \beta-CD con paclitaxel; PTX-OH-\beta-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y OH-\beta-CD con paclitaxel; PTX-NH-\beta-CD-NP: nanopartículas de PVM/MA y NH-\beta-CD con paclitaxel; Taxol®: formulación comercial con paclitaxel.
Descripción detallada de la invención Nanopartículas
En un aspecto, la invención se relaciona con unas nanopartículas, en adelante nanopartículas de la invención, que comprenden un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa.
Las nanopartículas de la invención poseen unas adecuadas características físico-químicas, de especificidad y de bioadhesión a la mucosa gastrointestinal, lo que las convierte en sistemas potencialmente útiles para el transporte de moléculas biológicamente activas, en particular, moléculas biológicamente activas de naturaleza lipófila (e.g., paclitaxel, etc.) y/o moléculas biológicamente activas que sean sustrato de la glicoproteína-P. Las nanopartículas de la invención pueden mejorar la biodisponibilidad de moléculas biológicamente activas, en general, y, en particular, de moléculas biológicamente activas de naturaleza lipófila y/o de moléculas biológicamente activas que puedan ser sustrato de la glicoproteína-P. De hecho, las nanopartículas de la invención pueden prolongar el tiempo de residencia en la mucosa tras su administración por vía oral. Asimismo, las nanopartículas de la invención pueden ser utilizados como sistema de transporte de moléculas biológicamente activas con elevada toxicidad, por ejemplo, citostáticos, debido a que ofrecen niveles plasmáticos sostenidos y constantes de tales fármacos durante periodos de tiempo de hasta 24 horas, lo que permite el diseño de tratamientos alternativos a la perfusión hospitalaria, redundando en un abaratamiento del coste sanitario de los tratamientos con este tipo de fármacos.
El término "nanopartícula", tal como aquí se utiliza, se refiere a esferas o formas similares con un tamaño medio inferior a 1,0 micrómetro (\mum). En general, las nanopartículas de la invención presentan un tamaño medio de partícula comprendido entre 1 y 999 nanómetros (nm), preferentemente entre 10 y 900 nm. En una realización particular, las nanopartículas de la invención presentan un tamaño medio de partícula comprendido entre 100 y 400 nm.
Por "tamaño medio" se entiende el diámetro promedio de la población de nanopartículas que se mueve conjuntamente en un medio acuoso. El tamaño medio de estos sistemas se puede medir por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia y que se describen, a modo ilustrativo, en la parte experimental que acompaña a los ejemplos descritos más adelante. El tamaño medio de las partículas puede verse influenciado principalmente por la cantidad y peso molecular del polímero biodegradable, por la naturaleza y cantidad de la ciclodextrina, o derivado de la misma, y por la naturaleza y cantidad de la molécula biológicamente activa, presentes en las nanopartículas de la invención (en general, a mayor cantidad o peso molecular de dichos componentes, el tamaño medio de la nanopartícula se incrementará), y por algunos parámetros del procedimiento de producción de dichas nanopartículas, tales como la velocidad de agitación, etc.
Polímero biodegradable
Las nanopartículas de la invención comprenden un polímero biodegradable. El término "biodegradable", tal como aquí se utiliza, se refiere a polímeros que se disuelven o degradan en un periodo de tiempo que es aceptable para la aplicación deseada, en este caso terapia in vivo, una vez que se exponen a una solución fisiológica de pH comprendido entre 1 y 9, típicamente, entre 4 y 9, a una temperatura comprendida entre 25ºC y 40ºC.
Prácticamente cualquier polímero biodegradable conocido en el estado de la técnica que dé lugar a la formación de nanopartículas puede ser utilizado para la puesta en práctica de la presente invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos polímeros biodegradables incluyen polihidroxiácidos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., y copolimeros de éstos, e.g., poli(ácido láctico-co-glicólico) [PLGA], etc.; polianhidridos; poliésteres; polisacáridos, e.g., quitosano, etc. El peso molecular de dicho polímero biodegradable puede variar dentro de un amplio intervalo siempre y cuando satisfaga las condiciones establecidas de formar nanopartículas y ser
biodegradable.
En una realización particular, el polímero biodegradable utilizado es el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico en forma anhídrido (PVM/MA). En una realización concreta puede utilizarse, por ejemplo, el copolímero PVM/MA comercializado con la denominación comercial Gantrez® AN. En una realización particular, dicho copolímero PVM/MA tiene un peso molecular comprendido entre 100 y 2.400 kDa, preferentemente entre 200 y 2.000 kDa, más preferentemente entre 180 y 250 kDa. Este polímero biodegradable (PVM/MA) resulta particularmente ventajoso ya que se utiliza ampliamente en tecnología farmacéutica debido a su baja toxicidad (DL_{50} = 8-9 g/kg por vía oral) y excelente biocompatibilidad. Además, es fácil de obtener, tanto por la cantidad como por su precio. Este polímero biodegradable (PVM/MA) puede reaccionar con distintas sustancias hidrófilas, debida a la presencia de sus grupos anhídridos, sin tener que recurrir a los reactivos orgánicos usuales (glutaraldehído, derivados de carbodiimida, etc.) que poseen una toxicidad importante. En un medio acuoso, el copolímero PVM/MA es insoluble, pero sus grupos anhídrido se hidrolizan dando lugar a unos grupos carboxílicos. La disolución es lenta y depende de las condiciones en las que se produce. Debido a la disponibilidad de grupos funcionales en PVM/MA, la unión covalente de moléculas con grupos nucleofilicos, tales como hidróxido o amino, tiene lugar por simple incubación en un medio
acuoso.
La solicitud de patente internacional WO 02/069938, cuyo contenido se incorpora en esta descripción por referencia, describe nanopartículas de copolímero PVM/MA. A modo ilustrativo, dichas nanopartículas de copolímero PVM/MA pueden obtenerse fácilmente por desolvatación del copolímero, mediante la adición, a una solución orgánica del mismo, de un primer disolvente polar (miscible con una disolución del copolímero) y posterior adición de un segundo líquido no disolvente, tal como una solución hidroalcohólica. Opcionalmente, se puede adicionar un agente reticulante.
Ciclodextrina y sus derivados
Las nanopartículas de la invención comprenden, además del polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "ciclodextrina" incluye cualquier oligosacárido cíclico compuesto por unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos \alpha-1,4 (\alpha-1,4-glucopiranosa). Estas unidades se producen como resultado de una reacción de transglicosilación intramolecular de la degradación del almidón por la enzima ciclodextrina glucanotransferasa (CGTasa).
La "ciclodextrina" puede contener más de 15 unidades de \alpha-1,4-glucopiranosa, aunque las más abundantes contienen 6, 7 ú 8 unidades de \alpha-1,4-glucopiranosa, que constituyen las denominadas alfa-ciclodextrinas (\alpha-CD), beta-ciclodextrinas (\beta-CD) o gamma-ciclodextrinas (\gamma-CD), respectivamente. Todas ellas tienen una estructura de tipo cono truncado, con una cavidad interna hidrófoba y una cara externa hidrófila. Esto es debido a que los grupos hidroxilo se encuentran orientados hacia el exterior de la ciclodextrina mientras que en su cavidad interna, de carácter hidrófobo, esta cubierta por los hidrógenos del grupo metileno así como por oxígenos tipo éter. De este modo es capaz de actuar como hospedador atrapando a la molécula huésped de forma completa o parcial. En una realización particular, dicha ciclodextrina es una alfa-ciclodextrina, una beta-ciclodextrina o una gamma-ciclodextrina.
El término "derivado de ciclodextrina", tal como se utiliza en esta descripción, incluye cualquier ciclodextrina que presenta, al menos, un grupo hidroxilo terminal modificado. La modificación química de las ciclodextrinas puede alterar sus propiedades químico-físicas, mejorando la solubilidad, estabilidad y controlando la actividad química de las moléculas con las que están unidas (moléculas huésped). Se ha descrito la incorporación, mediante reacción de los grupos OH de las ciclodextrinas, de grupos alquilo, arilo, carboxialquilo, cianoalquilo, hidroxialquilo, sulfoalquilo, amino, azido, heterociclilos, acetilo, benzoilo, succinilo, y otros grupos que contienen fósforo, azufre, etc. (Robyt (1998) "Essentials of carbohidrate chemistry", Ed. Charles R. Cantor, Springer Advanced Text in Chemistry). En una realización particular, al menos, uno de dichos grupos hidroxilo terminales está modificado, reemplazando el hidrógeno por un grupo alquilo C_{1}-C_{8} lineal o ramificado, e.g., metilo, etilo, propilo, etc.; trialquil(C-{1}-C_{8})sililo, e.g., t-butildimetilsililo, etc.; hidroxialquilo C_{1}-C_{8}, e.g., 2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo, etc.; alquil(C_{1}-C_{8})carbonilo, opcionalmente sustituido por un grupo carboxilo, e.g., acetilo, succinilo, etc.; arilcarbonilo, e.g., benzoilo, etc.; cianoalquil(C_{1}-C_{2}), e.g., cianometilo, cianoetilo; amino, opcionalmente sustituido; azido; sulfo; sulfoalquilo (C_{1}-C_{4}); o por un radical de un sacárido, e.g., glucosilo, manosilo, etc. En otra realización particular, dos o más de los grupos hidroxilo terminales de una CD, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, ó 7 grupos hidroxilo terminales presentes en una \beta-CD, están modificados por alguno de dichos grupos.
Las ciclodextrinas madre (es decir, sin derivatizar), en particular, la \beta-CD, tienen una solubilidad acuosa limitada comparada con los sacáridos acíclicos debido, en parte, a las fuertes uniones entre las moléculas de la ciclodextrina en estado cristalino. Además, la \beta-CD es capaz de formar enlaces de hidrógeno intramoleculares entre los grupos hidroxilo secundarios produciendo de este modo entalpías de solución desfavorables, y, por tanto, una baja solubilidad acuosa. La sustitución de alguno de los enlaces de hidrógeno por grupos hidrófobos, tales como metoxi- o etoxi-, tiene como resultado el aumento de la solubilidad acuosa. Por ejemplo, la solubilidad acuosa de la \beta-CD es del 1,85% (p/v) a temperatura ambiente pero ésta puede aumentar hasta 150 veces al aumentar el grado de metilación (metil-\beta-CD). Otro derivado de ciclodextrina particularmente importante es la 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD), obtenido tras el tratamiento de la \beta-CD con óxido de propileno, que tiene una solubilidad acuosa del 60% (p/v). Igualmente, estos derivados pueden mejorar el perfil toxicológico, la capacidad para encapsular moléculas biológicamente activas y modular su perfil de liberación. El principal problema de las ciclodextrinas madre es la nefrotoxicidad tras ser administradas por vía parenteral, principalmente para la \beta-CD, debido a su baja solubilidad acuosa. Por ello, los derivados más hidrófilos, tales como la OH-\beta-CD, disminuyen esos problemas de nefrotoxicidad al poder ser eliminados más fácilmente. No ocurre lo mismo para los derivados metilados de la \beta-CD, que, a pesar de ser más soluble que la \beta-CD, no estarían exentos de provocar toxicidad sistémica, debido a su mayor capacidad para interaccionar con lípidos endógenos, lo que limita su uso por vía parenteral. Por el contrario, los estudios de toxicidad realizados tras la administración por vía oral muestran que las ciclodextrinas así como sus derivados no son tóxicas por esta vía.
Las ciclodextrinas son macromoléculas solubles en agua que han sido aprobadas para la administración de fármacos por vía oral, parenteral y tópica. Las aplicaciones de las ciclodextrinas en la administración oral de fármacos se deben, principalmente, a la mejora en la biodisponibilidad oral del fármaco, debido al aumento de la solubilidad, aumento de la estabilidad del fármaco en el tracto gastrointestinal y/o en la formulación. Además, para determinados fármacos, resulta interesante el potencial de las ciclodextrinas en la reducción de la irritación local producida por el propio fármaco, el control de la liberación del fármaco a lo largo del tracto gastrointestinal o bien el enmascaramiento de caracteres organolépticos desagradables, entre otros. Tal es el caso del itraconazol, que está comercializado en EEUU y Europa asociado a la OH-\beta-CD para su administración por vía oral, reduciéndose de manera importante la irritación que administrado de manera aislada produce en el tracto gastrointestinal.
Por otro lado, las ciclodextrinas también son utilizadas por su poder de aumentar la permeabilidad del fármaco a través de piel y mucosas, lo que produce una mejor absorción y más uniforme del fármaco. Esto se traduce en un aumento de la actividad de fármaco tras su administración, tal como, por ejemplo, el complejo formado entre la flutamida y la OH-\beta-CD, que mejora sustancialmente la absorción del fármaco tras su administración por vía oral.
En una realización particular, dicho derivado de ciclodextrina, es un derivado de una alfa-ciclodextrina, o de una beta-ciclodextrina, o de una gamma-ciclodextrina. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de derivados de ciclodextrina que se pueden utilizar para la puesta en práctica de la presente invención incluyen etil-\beta-CD, heptakis(2,3,6-tri-O-etil)-\betaP-CD, 2-hidroxipropil-\beta-CD, 2-O-2-hidroxipropil-\beta-CD, 2-hidroxietil-\beta-CD, derivados succinilados de \beta-CD, derivados succinilados de 2-hidroxi-propil-\beta-CD, butil-\beta-CD, heptakis(2,6-di-O-n-butil)-\beta-CD, heptakis(2,6-di-O-n-pentil)-\beta-CD, metil-\beta-CD, metil-\beta-CD, carboximetil-\beta-CD, carboxietil-\beta-CD, heptakis(2,6-di-O-metil)-\beta-CD, heptakis(2,3,6-tri-O-metil)-\beta-CD, acetil-\beta-CD, heptakis(3-O-acetil-2,6-di-O-n-pentil)-\beta-CD, heptakis(3-O-acetil-2,6-di-O-metil)-\beta-CD, sulfo-\beta-CD, sulfa-propil-\beta-CD, n-butil-\beta-CD, heptakis(3-O-n-butiril-2,6-di-O-pentil)-\beta-CD, 2-cianoetil-\beta-CD, 6-monodeoxi-6-monoazido-\beta-CD, heptakis(2,3,6-tri-O-bencil)-\beta-CD, heptakis(2,3,6-tri-O-benzoil)-\beta-CD, 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-CD, heptakis(2,6-di-O-n-pentil-3-O-trifluoroacetil)-\beta-CD, heptakis(2,3,6-tri-O-n-octil)-\beta-CD, heptakis(2,3-di-O-acetil-6-O-terbutildimetilsilil)-\beta-CD, heptakis(6-O-terbutildimetilsilil)-\beta-CD, heptakis(6-O-terbutildimetilsilil-2,3-di-O-metil)-\beta-CD, heptakis(2,6-di-terbutildimetilsilil)-\beta-CD, heptakis(2,3,6-tri-O-trifluoroacetil)-\beta-CD, heptakis(2,6-di-O-metil-3-O-n-pentil)-\beta-CD.
La relación en peso entre la ciclodextrina, o derivado de la misma, y el polímero biodegradable puede variar dentro de un amplio intervalo, en una realización particular, dicha relación en peso ciclodextrina (o derivado de la misma): polímero biodegradable es de 1:1-10, preferentemente de 1:1-5, más preferentemente alrededor de 1:4. En una realización particular, dicho polímero biodegradable es PVM/MA.
Como se ha mencionado previamente, en aplicaciones farmacéuticas, la \beta-CD y sus derivados son los más utilizados, en particular, la 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD) ya que presenta una elevada solubilidad acuosa, una baja toxicidad y una cavidad más hidrófoba que la de la \beta-CD.
En una realización particular, la ciclodextrina presente en las nanopartículas de la invención no tiene ningún grupo hidroxilo sustituido. En una realización concreta, dicha ciclodextrina es la beta-ciclodextrina (\beta-CD), que contiene 7 unidades de \alpha-1,4-glucopiranosa. Aunque la relación, en peso, \beta-CD:polímero biodegradable es de 1:1-10, preferentemente de 1:1-5, relaciones 1:4 dan buenos resultados. A modo ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de \beta-CD/mg polímero biodegradable da una asociación eficiente. En este caso, la cantidad de \beta-CD asociada a las nanopartículas es de aproximadamente 90 microgramos/mg nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener, en general, forma esférica y un tamaño cercano a los 150 nm.
En otra realización particular, la ciclodextrina presente en las nanopartículas de la invención es un derivado más hidrófilo de la \beta-CD, tal como un derivado hidroxilado de la \beta-CD que comprende uno o más grupos hidroxialquilo (e.g., hidroxipropilo). En una realización particular preferida se utiliza la 2-hidroxiprolil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD). La relación, en peso, OH-\beta-CD:polímero biodegradable es de 1:1-10, preferentemente de 1:1-5, aunque una relación 1:4 rinde buenos resultados. A modo ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de OH-\beta-CD/mg polímero biodegradable da una asociación eficiente. En este caso, la cantidad de \beta-CD asociada a las nanopartículas es de aproximadamente 65 microgramos/mg nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener, en general, forma esférica y un tamaño cercano a los 150 nm.
En otra realización particular, la ciclodextrina presente en las nanopartículas de la invención es un derivado de una CD que presenta uno o más grupos funcionales terminales diferentes al hidroxilo, e.g., uno o más grupos amino, opcionalmente sustituidos. Los grupos amino, a su vez pueden estar sustituidos y presentar otros grupos funcionales, e.g., alquilo C_{1}-C_{4}; ejemplos ilustrativos de dichos grupos amino sustituidos incluyen metilamina, etilamina, dietilamina, etc.). En una realización particular preferida, dicho grupo amino es un grupo amino libre, sin sustituir (-NH_{2}). En diversos ensayos realizados, se ha observado que con dichos grupos, las nanopartículas de la invención administradas por vía oral se acumulan sobre ciertos segmentos del tracto intestinal, lo que permite una administración específica. En una realización concreta, el derivado de ciclodextrina presente en las nanopartículas de la invención es la 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina (NH-\beta-CD). La relación, en peso, NH-\beta-CD:polímero biodegradable es de 1:1-10, preferentemente de 1:1-5, aunque una relación 1:4 rinde buenos resultados. Estas nanopartículas se caracterizan por tener, en general, forma esférica y un tamaño cercano a los 150 nm.
En una realización particular, la ciclodextrina, o derivado de la misma, presente en las nanopartículas de la invención se selecciona del grupo formado por \beta-ciclodextrina (\beta-CD), 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD), 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina (NH-\beta-CD) y sus mezclas.
Diversos ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que las nanopartículas a base de un polímero biodegradable que contienen ciclodextrina permiten la formación de interacciones bioadhesivas directas entre estos vehículos (nanopartículas) y componentes de la superficie del tracto gastrointestinal. Este estrecho contacto es de interés para aumentar la biodisponibilidad de moléculas biológicamente activas cuando se administran a través de alguna vía que dé acceso a una mucosa (e.g., vía oral, rectal, vaginal, ocular o nasal).
Las nanopartículas a base de un polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) que contienen ciclodextrina (nanopartículas vacías, es decir, sin molécula biológicamente activa) pueden ser obtenidas por un procedimiento basado en el método de desplazamiento del disolvente descrito, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 02/069938. A modo ilustrativo, dichas nanopartículas vacías que comprenden un polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y una ciclodextrina, o un derivado de la misma, pueden obtenerse por dos procedimientos alternativos, concretamente, mediante incubación simultánea de los dos componentes, polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y ciclodextrina o derivado de la misma (e.g., \beta-CD, OH-\beta-CD o NH-\beta-CD) en la fase orgánica [alternativa 1], o bien mediante incubación de las nanopartículas de polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) con una solución acuosa de ciclodextrina, o un derivado de la misma (e.g., \beta-CD, OH-\beta-CD o NH-\beta-CD) [alternativa 2].
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Molécula biológicamente activa
Las nanopartículas de la invención comprenden, además del polímero biodegradable y de una ciclodextrina o un derivado de la misma, una molécula biológicamente activa.
El término "molécula biológicamente activa", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier sustancia que se administra a un sujeto, preferentemente un ser humano, con fines profilácticos o terapéuticos; es decir, cualquier sustancia que puede ser utilizada en el tratamiento, cura, prevención o diagnosis de una enfermedad o para mejorar el bienestar físico y mental de humanos y animales. En general, dicho término "molécula biológicamente activa" incluye tanto fármacos como antígenos y alergenos.
Las nanopartículas de la invención pueden incorporar una o más moléculas biológicamente activas independientemente de las características de solubilidad de las mismas, aunque, dichas nanopartículas han resultado ser un sistema particularmente útil para la administración de moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba.
Las nanopartículas de la invención permiten modificar la distribución de la molécula biológicamente activa que contienen al ser administradas por una vía que dé acceso a alguna mucosa del organismo (e.g., oral, rectal, nasal, vaginal, ocular, etc.).
La naturaleza química de la molécula biológicamente activa puede variar dentro de un amplio intervalo, desde moléculas pequeñas hasta compuestos macromoleculares (péptidos, polinucleótidos, etc.).
En una realización particular, dicha molécula biológicamente activa es un péptido o una proteína. Tal como aquí se utiliza, el término "péptido" se refiere a un compuesto formado por aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos e incluye oligopéptidos (formados por 10 o menos aminoácidos) y polipéptidos (formados por más de 10 aminoácidos). Asimismo, el término "proteína" tal como aquí se utiliza se refiere a macromoléculas de masa molecular elevada formadas por cadenas lineales de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos; las proteínas pueden estar formadas por una o varias cadenas peptídicas.
En otra realización particular, dicha molécula biológicamente activa es un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleótido, un polinucleótido o un ácido nucleico. Tal como aquí se utiliza, un "oligonucleótido" es un polímero de nucleótidos unidos por enlaces 5'-3' fosfodiéster de longitud igual o inferior a 50 nucleótidos, mientras que un "polinucleótido" es un polímero de nucleótidos unidos por enlaces 5'-3' fosfodiéster de longitud superior a 50 unidades. Asimismo, el término "ácido nucleico" se refiere también a un polímero de nucleótidos unidos por enlaces 5'-3' fosfodiéster; dependiendo de si se trata de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos el ácido nucleico será ARN o ADN, respectivamente. Los ácidos nucleicos desempeñan distintas funciones en las células de los organismos vivos tales como el almacenamiento de la información genética y su transferencia a la generación siguiente (ADN) o la expresión de esa información durante la síntesis de proteínas (ARNm y ARNt), es componente estructural de orgánulos celulares, tales como los ribosomas (ARNr), cataliza ciertas reacciones químicas (ribozimas) y participa en mecanismos de regulación de la expresión génica (mediante ARN complementarios de ARNm o de ARNbc en la ribointerferencia).
En otra realización particular, dicha molécula biológicamente activa es una molécula (orgánica o inorgánica) pequeña; generalmente, estas moléculas se obtienen por métodos de síntesis química o semisintéticos o, alternativamente, se aíslan de sus fuentes. En una realización concreta, dicha molécula (orgánica o inorgánica) pequeña, tiene un peso molecular relativamente bajo, generalmente, igual o inferior a 5.000, típicamente, igual o inferior a 2.500, ventajosamente, igual o inferior a 1.500. Numerosos principios activos terapéuticos contienen estas características y, por tanto, pueden ser utilizados en la puesta en práctica de la presente invención.
Aunque la molécula biológicamente activa presente en las nanopartículas de la invención puede ser tanto una sustancia hidrófila como una sustancia hidrófoba, en una realización particular, las nanopartículas de la invención son particularmente útiles para administrar moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba. Por tanto, en una realización particular, la molécula biológicamente activa presente en las nanopartículas de la invención es una sustancia hidrófoba. Tal como aquí se utiliza, una "sustancia hidrófoba" es una sustancia que, por sus propiedades o composición, es poco soluble en medios acuosos, teniendo típicamente una solubilidad inferior al 1% (1 gramo de principio activo en 100 ml de disolvente acuoso) a 20ºC, en un pH comprendido entre 1-7,5 y presión atmosférica.
Prácticamente cualquier molécula biológicamente activa de naturaleza hidrófoba puede ser utilizada en la puesta en práctica de la presente invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de moléculas biológicamente activas de naturaleza hidrófoba que pueden estar presentes en las nanopartículas de la invención incluyen agentes antiparasitarios (e.g., albendazol, mebendazol, praziquantel, etc.); antifúngicos (e.g., clotrimazol, itraconazol, etc.), antibióticos (e.g., sulfametiazol, gentamicina, griseofulvina, etc.), cardiotónicos (e.g., digoxina, etc.), agentes antitumorales (e.g., camptotecina, metotrexato, docetaxel, fluorouracilo, paclitaxel, etc.), inmunosupresores (e.g., tacrolimus, ciclosporina), (gluco)corticoides (e.g., cortisona, dexametasona, prednisolona, prednisona, triamcinolona, etc.), etc.
En otra realización particular, la molécula biológicamente activa presente en las nanopartículas de la invención es una sustancia que es sustrato de la glicoproteína-P. De hecho, una importante aplicación de las nanopartículas de la invención radica en su capacidad para minimizar el efecto negativo de la glicoproteína-P sobre la absorción a través de mucosas de un determinado fármaco.
Como es conocido, la glicoproteína-P (PGY1; enzima EC 3.6.3.44) es una proteína que, en los seres humanos, está codificada por el gen ABCB1, también denominado gen MDRI (multidrug resistance 1). La glicoproteína-P funciona como una bomba o transportador transmembrana que transfiere sus sustratos (generalmente fármacos y otros xenobióticos) desde su dominio intracelular a su dominio extracelular. Dependiendo de su localización anatómica, la glicoproteína-P realiza su función de 3 formas principales: (1) la glicoproteína-P limita la entrada del fármaco en el organismo después de su administración oral como resultado de su expresión en la membrana luminar de los enterocitos; (2) una vez que el fármaco ha alcanzado la circulación sanguínea, la glicoproteína-P promueve su eliminación en la bilis y en la orina, como consecuencia de su expresión en la membrana canalicular de los hepatocitos y en la membrana luminar de las células de los túbulos proximales de los riñones; y (3) ya en la circulación sanguínea sistémica, limita la penetración del fármaco en los tejidos sensibles.
Por tanto, una sustancia sustrato de la glicoproteína-P se refiere a una sustancia, e.g., un xenobiótico, con afinidad para unirse al dominio intracelular de la glicoproteína-P de manera que mediante consumo de ATP puede ser transportada al exterior de la célula según la siguiente reacción:
ATP + H_{2}O + xenobiótico(dentro) = ADP + fosfato + xenobiótico(fuera)
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de sustratos conocidos de la glicoproteína-P que pueden estar presentes en las nanopartículas de la invención como moléculas biológicamente activas incluyen, entre otros (Fromm MF; Trends 2004; 25: 423-429), agentes anti-tumorales (e.g., docetaxel, etoposido, imatinib, paclitaxel, teniposido, vinblastina, vincristina, antraciclinas (e.g., doxorubicina, daunorubicina, epirubicina, etc.), etc.); antagonistas de \beta-adrenoceptor (e.g., bunitrolol, carvedilol, celiprolol, talinolol, etc.); bloqueantes de canales de Ca^{2+} (e.g., diltiazem, mibefradil, verapamil, etc.); fármacos cardiotónicos (e.g., digitoxina, digoxina, quinidina, etc.), agentes antivirales (e.g., amprenavir, indinavir, nelfinavir, saquinavir, ritonavir, etc.); esteroides (e.g., dexametasona, metilprednisolona, etc.); inmunosupresores (e.g., ciclosporina A, sirolimus, tacrolimus, etc.); fármacos antiheméticos (domperidona, ondansetron, etc.); antibióticos (e.g., eritromicina, levofloxacino, etc.); agentes antilipidémicos (e.g., atorvastatina, lovastatina, etc.); antagonistas de receptores H_{1} de la histamina (e.g., fexofenadina, terfenadina, etc.); y fármacos de otros grupos terapéuticos (e.g., amitriptilina, colchicina, debrisoquina, itraconazol, losartan, morfina, fenitoina, rifampina, actinomicina D, topotecan, estradiol, rapamicina, FK506, etc).
En una realización particular, la molécula biológicamente activa presente en las nanopartículas de la invención es paclitaxel.
En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende nanopartículas de la invención que contienen uno o más fármacos diferentes. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos fármacos incluyen agentes pertenecientes a distintos grupos terapéuticos, por ejemplo, agentes anti-tumorales, antagonistas de \beta-adrenoceptor, agentes analgésicos, bloqueantes de canales de Ca^{2+}, fármacos cardiotónicos, agentes antivirales, esteroides, inmunosupresores, fármacos antiheméticos, antibióticos (e.g., antibacterianos, antifúngicos, antivirales, antiparasitarios, etc.) agentes antilipidémicos, antagonistas de receptores H_{1} de la histamina, agentes antiinflamatorios, neuroprotectores, antialérgicos, antiasmáticos, antibióticos, surfactantes pulmonares, etc.
Como puede apreciarse, algunas moléculas biológicamente activas que son sustrato de la glicoproteína-P tienen naturaleza hidrófoba. Asimismo, el sistema de administración de moléculas biológicamente activas proporcionado por la presente invención contempla la posibilidad de administrar fármacos de numerosos grupos terapéuticos.
En otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende nanopartículas de la invención que contienen uno o más antígenos diferentes con fines vacunales o bien uno o más alergenos diferentes con fines inmuno-terapéuticos como molécula biológicamente activa.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "antígeno" se refiere a cualquier sustancia capaz de ser reconocida por el sistema inmune de un sujeto y/o capaz de inducir en un sujeto una respuesta inmune humoral o una respuesta inmune celular que conduce a la activación de linfocitos B y/o T cuando se introduce en un sujeto; a modo ilustrativo, dicho término incluye cualquier producto inmunogénico, nativo o recombinante, obtenido de un organismo superior o de un microorganismo, por ejemplo, una bacteria, un virus, un parásito, un protozoo, un hongo, etc., que contiene uno o más determinantes antigénicos, por ejemplo, componentes estructurales de dichos organismos; toxinas, por ejemplo, exotoxinas, etc. Prácticamente cualquier antígeno puede ser utilizado en la elaboración de nanopartículas de la invención cargadas con antígeno. A modo ilustrativo, no limitativo, el término "antígeno" incluye:
-
antígenos "microbianos", es decir, antígenos de microorganismos, incluyendo, aunque sin limitarse, virus, bacterias, hongos y parásitos infecciosos; dichos antígenos incluyen el microorganismo intacto así como partes, fragmentos y derivados de los mismos, bien de origen natural o artificial, así como productos sintéticos o recombinantes que son idénticos o similares a los antígenos naturales de un microorganismo e inducen una respuesta inmune específica para ese microorganismo; en este sentido, un compuesto es similar a un antígeno natural de un microorganismo si induce una respuesta inmune (humoral y/o celular) como la del antígeno natural de ese microorganismo; dichos antígenos se utilizan de forma rutinaria por los expertos en la materia; y
-
antígenos "tumorales", es decir, sustancias, por ejemplo, péptidos, asociadas a un tumor o a un cáncer ("marcador tumoral"), que es capaz de provocar una respuesta immune, en particular, cuando es presentado en el contexto de una molécula del CMH, e.g., Her2 (cáncer de mama); GD2 (neuroblastoma); EGF-R (glioblastoma maligno); CEA (cáncer de tiroide medular); CD52 (leucemia); proteína gp100 de melanoma humano; proteína melan-A/MART-1 de melanoma humano; tirosinasa; proteína NA17-A nt; proteína MAGE-3; proteína p53; proteína HPV16E7; fragmentos antigénicos de dichos antígenos; etc.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "alergeno" se refiere a una sustancia a la que un sujeto es sensible y provoca una reacción inmunitaria, por ejemplo, extractos alergénicos de pólenes, extractos alergénicos de insectos, extractos alergénicos de alimentos o productos alimenticios, componentes presentes en saliva, pinzas o aguijones de insectos que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, componentes presentes en plantas que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, etc., por ejemplo, extractos proteicos de pólenes, tal como el polen de gramíneas, extractos alergénicos de Lolium perenne, extractos alergénicos de olea (olivo), etc.; extractos proteicos de insectos, tal como de ácaros del polvo, etc.; extractos alergénicos de componentes alimentarios, etc. Prácticamente cualquier alergeno puede ser utilizado en la elaboración de las nanopartículas cargadas con alergeno de la composición de la invención; no obstante, en una realización particular, dicho alergeno es la ovoalbúmina (OVA), una proteína ampliamente utilizada como modelo alergénico experimental.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas moléculas biológicamente activas que pueden contener las nanopartículas de la invención incluyen antígenos bacterianos: citoplasmáticos, periplásmicos, de la envoltura celular (e.g., proteínas de membrana interna, proteínas de membrana externa, lipopolisacáridos y complejos mixtos, proteínas asociadas a la pared celular, etc.), etc.; antígenos de estructuras superficiales (e.g., fimbriae, glicocálix, flagelares, etc.), incluyendo los de patógenos intracelulares, como por ejemplo Brucella sp., Salmonella sp., etc; antígenos de microorganismos eucariotas, tanto solubles como superficiales; antígenos virales, por ejemplo, matriciales, de cápsides, de envol-
turas, internos (incluidos enzimáticos), alergenos de especies animales (ácaros, etc.), de plantas (gramíneas, etc.), etc.
Las nanopartículas de la invención pueden obtenerse mediante un procedimiento, basado en el método de desplazamiento del disolvente descrito, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 02/069938, que comprende (i) la formación de un complejo (ciclodextrina o derivado de la misma)-(molécula biológicamente activa), en adelante complejo [CD:MBA], y (ii) la incorporación de dicho complejo [CD:MBA] a una solución del polímero biodegradable en un disolvente orgánico antes de la formación de nanopartículas.
Brevemente, la formación de dicho complejo [CD:MBA] comprende la adición de una solución de la molécula biológicamente activa (MBA) en un disolvente orgánico, tal como un alcohol, por ejemplo, etanol, sobre una solución acuosa de la ciclodextrina o derivado de la misma (CD). El conjunto se somete a agitación hasta alcanzar el equilibrio. Posteriormente, se eliminan el agua y el disolvente orgánico (e.g., etanol) por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, bajo evaporación reducida o cualquier otro sistema de eliminación de disolventes.
La relación molar CD:MBA presente en dicho complejo [CD:MBA] puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otros factores de la ciclodextrina o derivado de la misma (CD) y de la molécula biológicamente activa (MBA) presentes en dicho complejo; no obstante, en una realización particular, la relación molar CD:MBA presente en dicho complejo [CD:MBA] es 1:1-4, típicamente 1:1-2. En una realización concreta, cuando la molécula biológicamente activa es paclitaxel, la relación molar CD:MBA en dicho complejo [CD:MBA] es 1:1.
La incorporación de dicho complejo [CD:MBA] a una solución del polímero biodegradable en un disolvente orgánico antes de la formación de nanopartículas puede llevarse a cabo mediante adición de dicho complejo a la solución de polímero biodegradable y posterior incubación simultánea de ambos componentes, polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y complejo [CD:MBA], en la fase orgánica (e.g., acetona) que comprende el polímero biodegradable (e.g., PVM/MA), durante un periodo de tiempo apropiado, típicamente comprendido entre 10 y 60 minutos, a una temperatura comprendida entre 20ºC y 30ºC aproximadamente (en una realización particular, cuando la molécula biológicamente activa es paclitaxel, la incubación se puede realizar durante un periodo de tiempo de 30 minutos a temperatura ambiente (25ºC)), bajo agitación, por ejemplo, mediante el empleo de un agitador mecánico, magnético o ultrasonidos); operando de esta manera, se obtiene, en general, un alto grado de asociación del complejo[CD:MBA] al polímero biodegradable. Brevemente, esta etapa comprende la disolución y/o dispersión simultánea del polímero biodegradable y el complejo [CD:MBA] en un disolvente orgánico (e.g., acetona). La incubación de la mezcla se realiza bajo agitación a temperatura ambiente durante un determinado periodo de tiempo. Preferentemente, la concentración del polímero biodegradable está comprendida entre 0,001% y 10% p/v y la del complejo [CD:MBA] entre 0,001% y 5% p/v. Opcionalmente, sobre dicha solución, si se desea, se adiciona un volumen determinado de un disolvente polar miscible con la disolución de los polímeros (e.g., etanol). También, opcionalmente, si se desea, se puede utilizar un agente reticulante para mejorar la estabilidad de las nanopartículas, tal como se describe en WO 02/069938. Ejemplos ilustrativos de agentes reticulantes que pueden utilizarse incluyen las moléculas diaminadas (e.g., 1,3-diaminopropano, etc.), polisacáridos o sacáridos simples, proteínas, y, en general, cualquier molécula que presente grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos presentes en el polímero biodegradable, por ejemplo, con los grupos anhídrido presentes en PVM/MA. No obstante, en general, no resulta necesario reticular pues esto tiene lugar de forma simultánea debido a la presencia de la ciclodextrina o derivado de la misma. En caso de que se deseara reticular, se debería añadir una cantidad pequeña de cualquiera de los productos indicados.
A continuación, para formar las nanopartículas de la invención, sobre la mezcla anterior se añade un volumen similar de un segundo líquido no disolvente, preferentemente una solución hidroalcohólica. En una realización particular, se utiliza agua de calidad farmacéutica (agua purificada o agua para inyectables (p.i.), según la aplicación). Preferentemente, la relación fase orgánica:solución hidroalcohólica está incluida dentro del intervalo comprendido entre 1:1 y 1:10 en volumen. Las nanopartículas se forman instantáneamente en el medio, bajo apariencia de una suspensión lechosa. Los disolventes orgánicos pueden ser eliminados por cualquier procedimiento adecuado tal como evaporación a presión reducida, quedando las nanopartículas en una suspensión acuosa estable. Eventualmente, si se desea, las nanopartículas se pueden purificar por medios convencionales tales como centrifugación, ultracentrifugación, filtración tangencial, o evaporación, incluyendo la utilización de vacío. Finalmente, si se desea, las nanopartículas se pueden liofilizar para su almacenaje y conservación a largo término. Para facilitar la liofilización se pueden utilizar agentes crioprotectores habituales tales como sacarosa, lactosa o manitol, preferentemente en una concentración comprendida entre el 0,1 y el 10% en peso.
Alternativamente, las nanopartículas de la invención, a base de un polímero biodegradable pueden ser obtenidas mediante un procedimiento que comprende la incubación de las nanopartículas de polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) con una solución acuosa que comprende el complejo [CD:MBA]. Esta alternativa comprende, brevemente, la disolución del polímero biodegradable en un disolvente orgánico, tal como acetona. Posteriormente, sobre esa solución, se adiciona un volumen determinado de solución hidroalcohólica, tal como etanol, y, finalmente, un volumen similar de agua. Las nanopartículas se forman instantáneamente en el medio bajo la apariencia de una suspensión lechosa. Los disolventes orgánicos son eliminados de forma similar a como se ha descrito en el procedimiento anterior, por ejemplo, por evaporación a presión reducida, quedando las nanopartículas en una suspensión acuosa estable. Seguidamente, las nanopartículas de polímero biodegradable se incuban en una solución acuosa que comprende el complejo [CD:MBA] previamente obtenido. La incubación de las nanopartículas de polímero biodegradable con el complejo [CD:MBA] puede realizarse bajo agitación (e.g., mediante el empleo de un agitador mecánico, magnético o ultrasonidos) durante un periodo determinado de tiempo a una temperatura apropiada en condiciones similares a las mencionadas en relación con el procedimiento anterior (e.g., durante un periodo de tiempo comprendido, en general, entre 10 y 60 minutos, a una temperatura comprendida entre 20ºC y 30ºC). Posteriormente, las nanopartículas se purifican por métodos convencionales, por ejemplo, centrifugación, y, finalmente, se liofilizan, si se desea, siguiendo los mismos procedimientos descritos anteriormente.
La relación ponderal MBA:polímero biodegradable presente en las nanopartículas de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otros factores del polímero biodegradable (e.g., PVMIMA) y de la molécula biológicamente activa (MBA) presentes en dichas nanopartículas; no obstante, en una realización particular, la relación MBA:polímero biodegradable, en peso, presente en dichas nanopartículas de la invención es 1:4-20, preferentemente, 1:10.
La relación complejo [CD-MBA]:polímero biodegradable presente en las nanopartículas de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otros factores del polímero biodegradable (e.g., PVMIMA), de la ciclodextrina o derivado de la misma y de la molécula biológicamente activa (MBA) presentes en dichas nanopartículas; no obstante, en una realización particular, la relación complejo [CD-MBA]:polímero biodegradable, en peso, presente en dichas nanopartículas de la invención es 1:1-20, ventajosamente 1:2-20, preferentemente, 3:10 (aproximadamente 1:3,3), en peso.
En una realización particular, el polímero biodegradable es PVMIMA.
En otra realización particular, la molécula biológicamente activa es paclitaxel.
En otra realización particular, el derivado de ciclodextrina es \beta-ciclodextrina (\beta-CD), 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD) ó 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina (NH-\beta-CD).
En otra realización particular, la molécula biológicamente activa es paclitaxel y la relación molar (ciclodextrina o derivado de la misma):paclitaxel es 1:1.
En una realización concreta, el complejo [CD:MBA] es un complejo \beta-CD:paclitaxel, en una relación molar 1:1, y la relación en peso paclitaxel:polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) es de 1:4-20, aunque relaciones próximas a 1:10 dan buenos resultados. A modo ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de paclitaxel en el complejo \beta-CD:paclitaxel, en una relación molar 1:1, por mg de polímero da una asociación eficiente. En este caso la cantidad de fármaco asociada a las nanopartículas es de, aproximadamente, 40 microgramos de paclitaxel/mg nanoparticula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener forma esférica y un tamaño cercano a los 300 nm.
En otra realización concreta, el complejo [CD:MBA] es un complejo OH-\beta-CD, en una relación molar 1:1 y la relación en peso paclitaxel:polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) es de 1:4-20, aunque relaciones próximas a 1:10 dan buenos resultados. A modo ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de paclitaxel en el complejo OH-\beta-CD:paclitaxel, en una relación molar 1:1, por mg de polímero da una asociación eficiente. En este caso la cantidad de fármaco asociada a las nanopartículas es de, aproximadamente, 170 microgramos de paclitaxel/mg nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener forma esférica y un tamaño cercano a los 300 nm.
En otra realización concreta, el complejo [CD:MBA] es un complejo NH-\beta-CD, en una relación molar 1:1 y la relación en peso paclitaxel:polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) es de 1:4-20, aunque relaciones próximas a 1:10 dan buenos resultados. A modo ilustrativo, aproximadamente 0,25 mg de paclitaxel en el complejo OH-\beta-CD:paclitaxel, en una relación molar 1:1, por mg de polímero da una asociación eficiente. En este caso la cantidad de fármaco asociada a las nanopartículas es de, aproximadamente, 100 microgramos de paclitaxel/mg nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener forma esférica y un tamaño cercano a los 300 nm.
En una realización particular, al administrar por vía oral una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel formulado en nanopartículas de la invención con \beta-CD, se obtienen niveles plasmáticos constantes y sostenidos durante, al menos, 24 horas, tras alcanzar la concentración plasmática máxima (Cmax) en un tiempo de aproximadamente 5 horas. La concentración plasmática máxima (Cmax) es similar a la obtenida tras la administración de la formulación comercial por vía intravenosa. El área bajo la curva plasmática (AUC) de paclitaxel obtenida por esta formulación es de, aproximadamente, 5 veces superior a la obtenida por administración intravenosa del medicamento comercial administrado a la misma dosis. Esta formulación se caracteriza por ofrecer un tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo (MRT) de aproximadamente 4 veces superior al que se obtiene tras la administración de la formulación comercial por vía intravenosa.
En otra realización particular, al administrar por vía oral una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel formulado en nanopartículas de la invención con OH-\beta-CD, se obtienen niveles plasmáticos constantes y sostenidos durante, al menos, 24 horas, tras alcanzar la concentración plasmática máxima (Cmax) en un tiempo de aproximadamente 6 horas. La concentración plasmática máxima es 2 veces superior a la obtenida tras administración de la formulación comercial por vía intravenosa. El área bajo la curva plasmática (AUC) de paclitaxel obtenida por esta formulación es de, aproximadamente, 5 veces superior a la obtenida por administración intravenosa del medicamento comercial administrado a la misma dosis. Esta formulación se caracteriza por ofrecer un tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo (MRT) de aproximadamente 3,5 veces superior al que se obtiene tras la administración de la formulación comercial por vía intravenosa.
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En otra realización particular, al administrar por vía oral una dosis de 10 mg/kg de paclitaxel formulado en nanopartículas de la invención con NH-\beta-CD, se obtienen niveles plasmáticos constantes y sostenidos durante, al menos, 24 horas, tras alcanzar la concentración plasmática máxima (Cmax) en un tiempo de aproximadamente 4,7 horas. La concentración plasmática máxima es de aproximadamente la mitad de la obtenida tras administración de la formulación comercial por vía intravenosa. El área bajo la curva plasmática (AUC) de paclitaxel obtenida por esta formulación es, aproximadamente, similar a la obtenida por administración intravenosa del medicamento comercial administrado a la misma dosis. Esta formulación se caracteriza por ofrecer un tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo (MRT) de aproximadamente 3 veces superior al que se obtiene tras la administración de la formulación comercial por vía intravenosa.
Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende, al menos, una nanopartícula de la invención, y un excipiente, vehículo o adyuvante, farmacéuticamente aceptable.
En general, dicha molécula biológicamente activa estará formando un complejo con la ciclodextrina o derivado de la misma y dicho complejo, mayoritariamente, estará en el interior de la nanopartícula de la invención; no obstante, podría suceder que una proporción relativamente de dicho complejo que contiene la molécula biológicamente activa estuviera también unida a la superficie de la nanopartícula si bien la mayor parte del mismo estará en el interior (e.g., encapsuladas) de las nanopartículas de la invención.
Las nanopartículas de la invención pueden utilizarse para modificar la distribución de la molécula biológicamente activa asociada al ser administradas por una vía que dé acceso a alguna mucosa del organismo (incluyendo la vía oral, rectal, nasal, vaginal u ocular). Adicionalmente, también pueden administrarse por vía parenteral.
Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier composición líquida (suspensión o dispersión de las nanopartículas) para administración oral, bucal, sublingual, tópica, ocular, nasal, vaginal, parenteral, subcutánea, rectal o transdérmica; cualquier composición en forma de gel, pomada, crema o bálsamo para su administración tópica, ocular, nasal o vaginal; o cualquier composición sólida (comprimidos, cápsulas) para su administración oral. En una realización particular, la composición farmacéutica se administra por vía oral. En otra realización particular, dicha composición farmacéutica se administra por vía parenteral.
Las composiciones farmacéuticas descritas comprenderán los excipientes adecuados para cada formulación. Por ejemplo, en el caso de formulaciones orales en forma de comprimidos o cápsulas se incluirán si es necesario agentes aglutinantes, desintegrantes, lubricantes, agentes de carga, recubrimiento entérico, etc. Las formulaciones sólidas orales se preparan de forma convencional por mezclado, granulación en seco o húmedo e incorporando las nanopartículas de la invención. Las composiciones farmacéuticas también pueden ser adaptadas para su administración parenteral, en forma de, por ejemplo, soluciones, suspensiones o productos liofilizados, estériles, en la forma de dosificación apropiada; en este caso, dichas composiciones farmacéuticas incluirán los excipientes adecuados, tales como tampones, tensioactivos, etc. En cualquier caso, los excipientes se elegirán en función de la forma farmacéutica de administración seleccionada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
En una realización particular de la composición farmacéutica de la invención, la nanopartícula comprende:
1
En otra realización particular de la composición farmacéutica de la invención, la nanopartícula comprende:
2 
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En otra realización todavía más particular de la composición farmacéutica de la invención, la nanopartícula comprende:
3
La proporción de la molécula biológicamente activa incorporada en la nanopartícula de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, puede ser de hasta un 25% en peso respecto al peso total de las nanopartículas. No obstante, la proporción adecuada dependerá en cada caso de la moléculas biológicamente activa incorporada.
La dosis a administrar de nanopartículas de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal, preferentemente, entre 0,1 y 2 mg por kg de peso corporal.
La invención se describe a continuación mediante unos ejemplos que no son limitativos de la invención, sino ilustrativos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos describen la producción y caracterización de nanopartículas a base de un polímero biodegradable (PVM/MA) que incorporan una ciclodextrina (Ejemplos 1-5) y de nanopartículas a base de un polímero biodegradable (PVM/MA) que incorporan una ciclodextrina y una molécula biológicamente activa (Ejemplos 6 y 7) que se encuentra asociada a la ciclodextrina y/o al polímero biodegradable (PVM/MA) que constituye la matriz de dichas nanopartículas. Dichos ejemplos ponen de manifiesto la capacidad de dichas nanopartículas de desarrollar interacciones bioadhesivas con la mucosa y de promover la absorción oral de una molécula biológicamente activa, tal como el paclitaxel. Como puede apreciarse en dichos ejemplos, cuando se utiliza paclitaxel como molécula biológicamente activa, su incorporación en dichas nanopartículas a base de PVM/MA que incorporan una ciclodextrina, en particular, 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, permite obtener niveles plasmáticos constantes y sostenidos de dicho fármaco durante, al menos, 24 horas.
A continuación se describen los métodos generales utilizados para la producción y caracterización de dichas nanopartículas.
A. Producción de nanopartículas que contienen ciclodextrinas, y, opcionalmente, una molécula biológicamente activa
El procedimiento para la producción de nanopartículas a base de un polímero biodegradable (PVM/MA) que incorporan una ciclodextrina, y, opcionalmente, una molécula biológicamente activa, es una modificación de un procedimiento general descrito anteriormente y basado en la desolvatación controlada del polímero [Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330]. Para ello, un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) y una cantidad determinada de ciclodextrina, o, alternativamente, de un complejo ciclodextrina:molécula biológicamente activa, obtenido por métodos convencionales (e.g., Hamada et al., J Biosci Bioeng 102(4):369-71, 2006), en acetona bajo agitación magnética. Tras la incubación, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionan un disolvente orgánico miscible (etanol) y un volumen similar de agua desionizada, dando lugar a la formación de las nanopartículas bajo apariencia de una suspensión lechosa. A continuación, se retiran los disolventes orgánicos (etanol y acetona) mediante evaporación bajo presión reducida, quedando las partículas en una suspensión acuosa estable. Opcionalmente, las nanopartículas formadas pueden ser recubiertas con una molécula biológicamente activa hidrosoluble o con un ligando capaz de conferir a la nanopartícula resultante propiedades de "targeting" específico. Tras dejar homogeneizar la suspensión de nanopartículas, ésta se evapora bajo presión reducida, por ejemplo, mediante el empleo de un rotavapor, tal como un rotavapor Büchi R-144 (Suiza) hasta eliminar ambos disolventes orgánicos. Posteriormente, la suspensión se somete a purificación por ultracentrifugación (Sigma 3k30, rotor Nº-12150, Alemania) o mediante filtración tangencial, y, eventualmente, las nanopartículas pueden congelarse a -80ºC para su posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis Genesis, Nueva York, EEUU).
B. Caracterización físico-química de las nanopartículas
La caracterización de las nanopartículas ha conllevado diversos estudios, que se describen a continuación. Entre los estudios físico-químicos se determinó el tamaño de partícula y la carga superficial de las nanopartículas, ésta última mediante la medida del potencial zeta. Ambos parámetros fueron obtenidos por espectroscopia de correlación fotónica, utilizando un Zetasizer nano Z-S (Malvern Instruments/Optilas, España).
El rendimiento del proceso se calculó por dos métodos. En el primero se calculó el rendimiento de forma gravimétrica, utilizando el peso de las muestras liofilizadas sin agente crioprotector, según la Ecuación 1:
[Ecuación 1]Rendimiento = (Peso del liofilizado/Peso inicial) x 100
donde
peso inicial es el peso del polímero biodegradable (e.g., PVM/MA) y de la ciclodextrina añadida a las formulaciones; y
peso del liofilizado es el peso de las formulaciones tras el proceso de liofilización.
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El segundo método se basó en la cuantificación mediante cromatografia líquida de alta resolución (HPLC) acoplado a un detector de tipo ELSD (evaporative light - scatteripg detection) (Agueros et al., J. Pharm. and Biomed. Anal., 39 (2005) 495-502) mediante el método descrito abajo que permite la cuantificación de las ciclodextrinas y del copolímero PVM/MA. El rendimiento, en este caso, se calculó según la Ecuación 2:
[Ecuación 2]Rendimiento = (Q_{inicial} - Q_{PVM/MA}) x 100
donde
Q_{inicial} es la cantidad inicial de PVM/MA añadida; y
Q_{PVM/MA} es la cantidad de PVM/MA determinada en los sobrenadantes.
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La morfología de las nanopartículas se observó por microscopia electrónica de barrido (Zeiss, DSM 940A Alemania). Para ello, las nanopartículas liofilizadas se cubrieron con una capa de oro molecular de unos 9 nm (Equipo Emitech K550, Sputter-Coater, Reino Unido) y las fotografias se realizaron con un microscopio Zeiss DMS 940 A (Estados Unidos).
Para confirmar la presencia de ciclodextrinas asociadas a las nanopartículas (método de cuantificación descrito abajo) se procedió al análisis elemental de las diferentes formulaciones de nanopartículas, utilizando un analizador elemental modelo LECO CHN-900 (LECO Corporation, Estados Unidos).
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Cuantificación de la cantidad de ciclodextrina asociada a las nanopartículas
Para determinar la cantidad de ciclodextrina no aminada [e.g., \beta-ciclodextrina (\beta-CD) y 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD)] asociada a las nanopartículas se utilizó un método de HPLC acoplado a un detector tipo ELSD. El análisis se realizó en un cromatógrafo modelo 1100 series LC (Agilent, Waldbornn, Alemania) y los datos se analizaron en un ordenador Hewlett-Packard mediante el programa Chem-Station G2171 (Agueros et al., J. Pharm. and Biomed. Anal., 39 (2005) 495-502).
Para el análisis de las muestras, los sobrenadantes obtenidos tras el proceso de purificación de las nanopartículas, se diluyeron hasta 10 ml con agua purificada. Tras la adición del patrón interno (PEG 6000), se tomaron, como muestra, alícuotas de 1 ml de sobrenadante. Las muestras se analizaron utilizando una columna Zorbax Eclipse XDB-Phenyl (Agilent 150 mm x 2,1 mm) y una mezcla de agua/acetonitrilo en gradiente (ver tabla 1) como fase móvil a flujo 0,25 ml/min.
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TABLA 1 Condiciones de gradiente para la fase móvil (A: acetonitrilo; B: agua)
4 
\newpage
Las condiciones del detector (ELSD) se optimizaron hasta conseguir la máxima sensibilidad de acuerdo con el gradiente utilizado en la fase móvil (Temperatura de Nebulizador: 115ºC; Flujo de Nitrógeno: 3,2 ml/min). La separación cromatográfica de las diferentes ciclodextrinas, del PVM/MA y del patrón interno (PEG 6000) se llevó a cabo en menos de 15 minutos. Los tiempos de retención fueron de:
1,08 \pm 0,05 minutos para el PVM/MA;
4,58 \pm 0,07 minutos para la \beta-CD;
10,27 \pm 0,06 para la OH-\beta-CD; y
13,60 \pm 0,04 minutos para el patrón interno.
El límite de cuantificación fue de 0,2 mg/ml para las ciclodextrinas y de 0,05 mg/ml para el polímero (PVM/MA). La precisión no superó el límite del 7%.
En el caso de la cuantificación de ciclodextrina aminada [e.g., 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina (NH-\beta-CD)] asociada a las nanopartículas se utilizó una variante del método descrito arriba para evitar el solapamiento de los picos de la ciclodextrina y el polímero. Por ello, las muestras se analizaron utilizando una columna NH_{2}-Zorbax (Agilent 4,6 x 150 mm, 5 \mum), calentada a 40ºC y una mezcla de metanol/agua (80/20 v/v) como fase móvil a un flujo de 1 ml/min. Las condiciones del detector (ELSD) fueron las siguientes: Temperatura de Nebulizador: 71ºC y Flujo de Nitrógeno: 1,9 ml/min. La separación cromatográfica de la 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina, se llevó a cabo en menos de 7 minutos. El tiempo de retención fue de 3,8 \pm 0,07 minutos.
Finalmente, la cantidad de ciclodextrina (CD) asociada a las nanopartículas se calculó como la diferencia entre la cantidad de CD añadida inicialmente y la cantidad de CD cuantificada en los sobrenadantes.
Cuantificación de RBITC
La cantidad de rodamina B isotiocianato (RBITC) incorporada en las nanopartículas se determinó por colorimetría a una longitud de onda de 540 nm (Labsystems iEMS Reader MF, Finlandia). Para esta cuantificación, se utilizaron curvas de calibrado de RBITC en NaOH 0,1 N en un intervalo de 5-50 \mug/ml; r = 0,999.
La cantidad de RBITC se estimó como la diferencia entre la cantidad inicial añadida y la cantidad encontrada después de la hidrólisis total de una determinada cantidad de nanopartículas en NaOH 0,1N (24 h, 37ºC).
Liberación de RBITC
La cinética de liberación de RBITC desde las nanopartículas se realizó en tubos de diálisis Vivaspin® 100,000 MWCO (VIVASPIN, Hannover, Alemania). Para ello, 10 mg de nanopartículas se dispersaron en 1 ml de medio gástrico simulado (0-1 h) o medio intestinal simulado (1 a 24 h) (USP XXIII) a 37\pm1ºC. A determinados tiempos, las suspensiones de nanopartículas se centrifugaron (5.000 x g, 15 min) y la cantidad de RBITC en los filtrados se cuantificó por colorimetría (\lambda=540 nm).
Cuantificación de paclitaxel
La cantidad de paclitaxel encapsulado en las nanopartículas se determinó por HPLC. El análisis se llevo a cabo en un cromatógrafo modelo 1100 series LC (Agilent, Waldbornn, Alemania) acoplado a un sistema de detección UV de diodo-array. Los datos se analizaron en un ordenador Hewlett-Packard mediante el programa Chem- Station G2171. Para la separación del paclitaxel se utilizó una columna de fase reversa Phenomenex Gemini C18 (150 mm x 3 mm; 5 \mum) calentada a 30ºC. La fase móvil estaba compuesta por una mezcla de solución reguladora de fosfatos (pH= 2; 0,01 M) y acetonitrilo (en proporción 50/50 en volumen), y fue bombeada a un flujo de 0,5 ml/min. La detección se realizó a 228 nm.
Para el análisis de las muestras en fresco, se tomaron 100 \mul de suspensión acuosa de nanopartículas y se rompieron con 100 \mul de acetonitrilo. Los disolventes se evaporaron (centrifuga-evaporadora) y la muestra se reconstituyó en la fase móvil utilizada. Se inyectaron alícuotas de 100 \mul se inyectan en la columna HPLC para su análisis.
C. Estudios de bioadhesión
Los estudios de bioadhesión se llevaron a cabo utilizando el protocolo descrito previamente [Arbos et al., Int. J. Pharm., 242 (2002) 129-136], de acuerdo con las normas del Comité Ético de la Universidad de Navarra y con legislación europea en animales de experimentación (86/609/EU).
Para ello, ratas macho Wistar, de peso medio 225 g (Harlan, España), se mantuvieron bajo condiciones normales libres de comida y agua. A los animales se les administró por vía oral 1 ml de suspensión acuosa que contenía 10 mg de nanopartículas marcadas con RBITC. Los animales se sacrificaron a diferentes tiempos (0,5, 1, 3 y 8 horas) mediante dislocación cervical. La cavidad abdominal se abrió y se retiró el tracto gastrointestinal, que fue dividido en seis regiones anatómicas: estómago (Sto), intestino delgado (I1, I2, I3 y I4) y ciego (Ce). Cada segmento de la mucosa fue abierto longitudinalmente y enjuagado con PBS (pH 7,4). A su vez, cada una de estas partes se cortó en cinco porciones similares y se digirió el tejido con 1 ml de NaOH 3 M durante 24 horas. Para extraer la rodamina se emplearon 2 ml de metanol, se agitó durante 1 minuto con el vortex y después se centrifugó a 2,000 x g durante 10 minutos (Centrífuga 5804R, Rotor A-4-44, Alemania). Alícuotas de 1 ml de los sobrenadantes obtenidos se diluyeron con agua (3 ml) y se analizaron por espectrofluorimetría a X\lambda_{ex} 540 nm y \lambda_{em} 580 nm (GENios, Austria) para estimar la fracción de nanopartículas adherida a la mucosa. Las rectas de calibrado se prepararon mediante adición de soluciones de RBITC en NaOH 3 M (0,5-10 \mug/ml) a segmentos de tejidos control, que fueron sometidos a las mismas etapas de extracción (r>0,996).
Para poder comparar las diferentes formulaciones, se estudiaron las curvas y cinéticas de bioadhesion. Para ello, se representó la fracción de nanopartículas adheridas frente al tiempo obteniéndose así las curvas de bioadhesión. A partir de éstas, y utilizando la aplicación informática WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, EEUU), se determinaron los parámetros cinéticos de bioadhesión: Q_{max}, AUC_{adh}, T_{max}, MRT_{adh} and K_{adh} (Arbos et al., J. Control. Release, 89 (2003) 19-30). Q_{max} (mg), es la capacidad inicial máxima de nanopartículas adheridas a la mucosa gastrointestinal y está relacionada con la capacidad de éstas de desarrollar interacciones bioadhesivas. AUC_{adh} (mg.h), es el área bajo la curva de la fracción de nanopartículas adheridas, y representa la intensidad de bioadhesión. MRT_{adh} (h), es el tiempo medio estimado que las formulaciones permanecen adheridas a la mucosa. K_{adh} es definida como velocidad de eliminación de la fracción adherida en la mucosa. Todos estos parámetros fueron estimados entre 0 y 8 horas. Los cálculos se realizaron utilizando el programa WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, USA).
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D. Visualización de las nanopartículas adheridas a la mucosa
La visualización de las nanopartículas que contienen ciclodextrinas y, opcionalmente, una molécula biológicamente activa, en la mucosa gastrointestinal se observó por microscopia de fluorescencia. Para ello, se utilizaron las formulaciones que contenían RBITC. Dichas formulaciones (10 mg de nanopartículas) se administraron por vía oral a los animales de laboratorio (ratas macho Wistar) que, dos horas después, fueron sacrificados. Tras el sacrificio, el tracto gastrointestinal fue extraído, recogiendo distintas porciones del intestino delgado que se lavaron con tampón fosfato salino (pH=7,4; 0,15 M), tal como se ha descrito anteriormente para los estudios de bioadhesión. Las diferentes secciones intestinales fueron tratadas con O.C.T.^{TM} (Sakura, Países Bajos) y congeladas en nitrógeno líquido. Posteriormente las muestras del tejido fueron cortadas en secciones de 5 \mum de espesor en un criostato (2800 Frigocut E, Reichert-Jung, Alemania), y fijadas a soportes para su visualización por microscopia de fluorescencia.
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E. Estudios farmacocinéticos
Los estudios farmacocinéticos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas del Comité Ético de la Universidad de Navarra así como de la legislación europea en animales de experimentación (86/609/EU). Para ello, ratas macho Wistar, de peso medio 225 g (Harlan, España), se aislaron en jaulas metabólicas 12 horas antes de la administración de las formulaciones, sin acceso a comida, pero permitiéndoles el acceso libre al agua de bebida.
Los animales se dividieron en 8 grupos de tratamiento (6 animales por grupo) y se trataron con dosis únicas de 10 mg/kg (2,25 mg) de paclitaxel incorporado en alguna de las siguientes formulaciones:
(i)
solución i.v. de Taxol® (Bristol-Myers Squibb, Madrid, España);
(ii)
solución oral de Taxol®;
(iii)
complejo paclitaxel (PTX)-2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD) [PTX-OH-\beta-CD];
(iv)
complejo paclitaxel (PTX)-\beta-ciclodextrina (\beta-CD) [PTX-\beta-CD];
(v)
complejo paclitaxel (PTX)-6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina (NH-\beta-CD) [PTX-NH-\beta-CD];
(vi)
complejo paclitaxel (PTX)-2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD)-nanopartícula a base de PVM/MA (NP) [PTX-OH-\beta-CD-NP];
(vii)
complejo paclitaxel (PTX)-\beta-ciclodextrina (\beta-CD)-nanopartícula a base de PVM/MA (NP) [PTX-\beta-CD-NP]; y
(viii)
complejo paclitaxel (PTX)-6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina-nanopartícula a base de PVM/MA (NP) [PTX-NH-\beta-CD-NP].
A los animales se les administró 1 ml de las distintas formulaciones, disueltas o dispersas en agua, excepto en el caso de la solución i.v. (formulación comercial), que se administró en la vena de la cola (0,3 ml).
Tras la administración se procedió a extraer, a diferentes tiempos, un volumen de sangre de aproximadamente 300 \mul, utilizando ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante y recuperando la volemia del animal (rata) con un volumen equivalente de suero fisiológico vía intraperitoneal (i.p.). La sangre se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante (plasma) se congeló a una temperatura de -80ºC. El estudio se realizó de acuerdo con los principios recogidos en las guías internacionales de experimentación animal (WHO Chronicle, 39 (2): 51-56, 1985; A CIOMS Ethical Code for Animal Experimentation) mediante protocolo aprobado por el Comité Ético de experimentación animal de la Universidad de Navarra.
Pretratamiento de las muestras
La extracción del paclitaxel a partir de plasma se realizó mediante un procedimiento de extracción líquido-liquido, utilizando t-butilmetiléter como disolvente de extracción. Para ello, se tomaron alícuotas de plasma (0,1 ml), se ajustaron a un volumen de 1 ml con agua y se les añadió 0,2 \mug de docetaxel como patrón interno. A continuación, se añadieron 4 ml de ter-butilmetiléter y se agitó durante 1 minuto. Después, se centrifugaron las muestras a 10.000 rpm durante 10 minutos y se recogió el sobrenadante (fase orgánica) que se evaporó en una centrifuga evaporadora (Savant, Barcelona, España). El extracto así obtenido se reconstituyó en 200 \mul de una mezcla (50/50 v,/v) de acetonitrilo y solución reguladora de fosfatos (pH=2; 0,01 M) mediante agitación con vortex durante 1 minuto. La solución resultante fue transferida a un vial de inyección.
Método analítico: HPLC
La cuantificación del paclitaxel se realizó por cromatografia líquida de alta resolución (HPLC) con detección ultravioleta-visible. Como patrón interno se ha utilizado docetaxel. El análisis se llevó a cabo en un cromatógrafo modelo 1100 series LC (Agilent, Waldbornn, Alemania). Los datos se analizaron en un ordenador Hewlett-Packard mediante el programa Chem-Station G2171. Para la separación del paclitaxel se utilizó una columna de fase reversa Gemini C18 (Phenomenex) 150 mm x 3 mm; 5 \mum, calentada a 30ºC. La fase móvil estaba compuesta por una mezcla de solución reguladora de fosfatos (pH=2; 0,01 M) y acetonitrilo (en proporción 50/50 en volumen), y fue propulsada a través de la columna a un flujo de 0,5 ml/min. La detección se realizó a 228 nm.
El método analítico utilizado ha sido validado, comprobándose la relación lineal entre la respuesta del detector y las concentraciones de paclitaxel en plasma a lo largo del intervalo de concentraciones comprendido entre 40 y 3.200 ng/ml.
Análisis Farmacocinético
El análisis farmacocinético de los datos de concentraciones plasmáticas a lo largo del tiempo obtenidos tras la administración de paclitaxel se realizó utilizando el procedimiento de ajuste nocompartimental del programa de ajuste farmacocinético WiNNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, EEUU).
Los parámetros farmacocinéticos calculados fueron los siguientes: la concentración máxima (C_{max}); el tiempo en el cual se alcanza la C_{max} (t_{max}); el área bajo la curva de niveles plasmáticos (AUCO-inf); el tiempo de residencia media (MRT) y la semivida biológica en la fase de eliminación terminal (t_{1/2z}), aclaramiento (C1) y el volumen de distribución en estado de equilibrio estacionario.
El tiempo de residencia media (MRT) se calculó mediante el cociente entre el valor del AUMC (área bajo la curva en el primer momento de la concentración plasmática) y el del AUC. El aclaramiento (C1) como Dosis x Biodisponibilidad/AUC, y el volumen de distribución en estado de equilibrio estacionario (Vss) como el cociente entre el aclaramiento y la constante de eliminación terminal (k), calculada como 1/MRT.
F. Análisis estadístico
Para el estudio de bioadhesión y farmacocinética, las formulaciones se analizaron utilizando el test no paramétrico "Mann-Whitney". Valores de P < 0,05 se consideraron significativos. Todos los cálculos se hicieron con el programa estadístico de software SPSS® (SPSS® 10, Microsoft, Estados Unidos).
Ejemplo 1 Optimización del procedimiento de asociación entre un polímero biodegradable (PVM/MA) y una ciclodextrina para obtener nanopartículas
Las nanopartículas se prepararon por desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento descrito anteriormente [Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330]. Para ello, el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) y una cantidad determinada de \beta-ciclodextrina (\beta-CD), 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (OH-\beta-CD) ó 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina (NH-\beta-CD) se incubaron en acetona bajo agitación magnética. Tras la incubación, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionaron un disolvente orgánico miscible (etanol) y un volumen similar de agua desionizada, dando lugar a la formación de las nanopartículas bajo apariencia de una suspensión lechosa. Tras dejar homogeneizar la suspensión de nanopartículas, ésta se evaporó bajo presión reducida (rotavapor Büchi R-144, Suiza) hasta eliminar ambos disolventes orgánicos. Posteriormente, la suspensión se purificó por ultracentrifugación (Sigma 3k30, rotor Nº-12150, Alemania). Una parte de las nanopartículas obtenidas se congeló a -80ºC para su posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis Genesis, Nueva York, EEUU).
La Figura 1 muestra la cantidad de ciclodextrina asociada a las nanopartículas en función del tiempo de incubación con el polímero biodegradable (PVM/MA) durante la preparación de las nanopartículas. En todos los casos, se observó un tiempo óptimo de incubación entre la CD y el polímero. Este tiempo de incubación fue de 30 minutos. Por último, es de destacar que la \beta-CD se asocia de forma más eficaz a las nanopartículas de PVM/MA que su derivado hidroxilado (OH-\beta-CD) o aminado (NH-\beta-CD).
En función de los resultados obtenidos, para estudios posteriores se seleccionaron las siguientes condiciones experimentales:
-
relación ciclodextrina:copolímero PVM/MA (1:4); y
-
tiempo de incubación 30 minutos.
Ejemplo 2 Producción de nanopartículas que contienen ciclodextrinas 2.1 Producción de nanopartículas que contienen ciclodextrinas
Las nanopartículas se prepararon por desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento descrito anteriormente [Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330]. Para ello, 25 mg de \beta-CD, OH-\beta-CD o NH-\beta-CD se dispersaron en 2 ml de acetona con ayuda de ultrasonidos (Microson^{TM} o en baño de ultrasonidos durante 1 minuto bajo enfriamiento). Esta suspensión se adicionó a una solución de 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] en 3 ml de acetona y se dejó incubar la mezcla durante 30 minutos. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionaron 10 ml de etanol y 10 ml de agua desionizada. La mezcla resultante se dejó homogeneizar durante 5 minutos. A continuación, la suspensión de nanopartículas fue evaporada bajo presión reducida (Büchi R-144, Suiza) hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajustó con agua a 10 ml. Posteriormente, la suspensión se sometió a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g) (Sigma 3k30, rotor Nº-12150, Alemania). Los sobrenadantes se eliminaron y el residuo se resuspendió en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Eventualmente, una parte de las nanopartículas obtenidas se congelaron a -80ºC para su posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis Genesis, Nueva York, EEUU).
2.2 Caracterización físico-química de las distintas nanopartículas a base de PVM/MA que contienen ciclodextrinas obtenidas
La determinación de las características físico-químicas permitió comprobar cómo, independientemente de la CD utilizada, las nanopartículas presentaban tamaños y cargas de superficie similares. Además, esta carga era similar a la de las nanopartículas no tratadas con lo que se puede estimar que la mayor parte de la CD se encontraba localizada en el interior de las nanopartículas y no adsorbidas sobre su superficie. La Tabla 2 resume las características físico-químicas principales de las nanopartículas analizadas.
TABLA 2 Características físico-químicas de las diferentes formulaciones de nanopartículas a base de PVM/MA que contienen ciclodextrinas
5
Como puede observarse en la Tabla 2, independientemente de la ciclodextrina utilizada, las nanopartículas presentaban tamaños y cargas de superficie similares. Además, esta carga era similar a la de las partículas no tratadas con lo que se puede estimar que la mayor parte de la ciclodextrina se encontraba localizada en el interior de las nanopartículas y no adsorbidas sobre su superficie. La asociación entre las ciclodextrinas y las nanopartículas a base de PVM/MA permite obtener nanopartículas de tamaño más pequeño que las convencionales (NP). Como se muestra en la Tabla 2, las nanopartículas a base de PVM/MA que contienen ciclodextrinas muestran un tamaño cercano a los 150 nm. Esta disminución en el tamaño podría estar asociada al alto rendimiento del proceso de fabricación de las nanopartículas. Estos rendimientos se obtuvieron mediante la determinación de su peso al final del proceso y tras su liofilización. Los rendimientos de fabricación se expresan en porcentaje, calculado respecto a la masa inicial del copolímero PVM/MA y la ciclodextrina.
La cantidad de ciclodextrina asociada a las nanopartículas varia en función del tipo de oligosacárido utilizado, siendo de alrededor de 90 \mug/mg para la \beta-CD y de 70 \mug/mg para la OH-\beta-CD y la NH-\beta-CD. La confirmación de la presencia de CD asociadas a las nanopartículas a base de PVM/MA se realizó tras el análisis elemental de las diferentes formulaciones. Los resultados obtenidos (Tabla 3) confirmaron la presencia de CD debido a un aumento importante en la proporción de oxígeno en las formulaciones que llevaban la CD asociada, así como una disminución del porcentaje de carbono, en comparación con las nanopartículas control (NP).
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TABLA 3 Resultados del análisis elemental de las formulaciones control (NP) y de las formulaciones de nanopartículas a base de PVM/MA asociadas a CD
6 
\vskip1.000000\baselineskip
La morfología de las nanopartículas se observó por microscopía electrónica de barrido (Zeiss, Alemania), tras la cual se observó la típica forma esférica de las nanopartículas, homogéneas y de un tamaño comprendido entre 80 y 200 nm. La Figura 2 muestra los resultados de someter una muestra liofilizada de nanopartículas a base de PVM/MA con \beta-CD (\beta-CD-NP) a microscopía de barrido electrónico.
Ejemplo 3 Producción de nanopartículas que contienen ciclodextrinas y RBITC
Las nanopartículas se prepararon por desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento descrito anteriormente [Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330]. Para ello, 25 mg de \beta-CD, OH-\beta-CD o NH-\beta-CD se dispersaron en 2 ml de acetona con ayuda de ultrasonidos (Microson^{TM} o en baño de ultrasonidos durante 1 minuto bajo enfriamiento). Esta suspensión se adicionó a una solución de 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] en 3 ml de acetona y se dejó incubar la mezcla durante 30 minutos. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionaron 10 ml de etanol y 10 ml de agua desionizada. La mezcla resultante se dejó homogeneizar durante 5 minutos. A continuación, la suspensión de nanopartículas fue evaporada bajo presión reducida (Büchi R-144, Suiza) hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajustó con agua a 10 ml. A continuación, se añadió a las nanopartículas una solución acuosa de rodamina B isotiocianato (RBITC) y se dejó incubar durante 5 minutos, a temperatura ambiente y con agitación magnética. Posteriormente, la suspensión se sometió a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g) (Sigma 3k30, rotor Nº-12150, Alemania). Los sobrenadantes se eliminaron y el residuo se resuspendió en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Eventualmente, una parte de las nanopartículas obtenidas se congelaron a -80ºC para su posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis Genesis, Nueva York, EEUU).
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La cantidad de RBITC se estimó como diferencia entre la cantidad inicial añadida y la cantidad encontrada después de la hidrólisis total de una determinada cantidad de nanopartículas en NaOH 0,1 N (24 h, 37ºC). La Tabla 4 muestra los valores de RBITC (\mug RBITC/ mg nanopartícula) para las diferentes formulaciones ensayadas.
TABLA 4 RBITC (\mug/mg) asociada a las nanopartículas
7
La Figura 3 muestra la cinética de liberación de RBITC desde las nanopartículas en medio gástrico simulado (0-1 h) y en medio intestinal simulado (1 a 24 h) a 37\pm1ºC. En todos los casos, se constató que el porcentaje de RBITC liberado tras 24 horas de incubación, fue siempre inferior al 10% de la cantidad asociada a las nanopartículas. Por ello, se puede asumir que los resultados obtenidos en los posteriores estudios de bioadhesión así como en la microscopia de fluorescencia, la intensidad de fluorescencia corresponde a la RBITC asociada a las nanopartículas.
Ejemplo 4 Evaluación de las características bioadhesivas de las nanopartículas que contienen ciclodextrinas en el tracto gastrointestinal de ratas
La Figura 4 muestra el perfil de bioadhesión de las formulaciones ensayadas, representando la fracción de nanopartículas adheridas en los diferentes segmentos del tracto gastrointestinal (estómago; intestino delgado: I1-I4; ciego) a 30 minutos, 1 h, 3 h y 8 h tras la administración oral, de acuerdo con la metodología descrita previamente. Como puede observarse en dicha figura, las nanopartículas asociadas a ciclodextrinas mostraron un perfil de bioadhesión diferente al de las nanopartículas control. En trabajos recientes, el potencial bioadhesivo del copolímero PVM/MA demostró ser mucho mayor incorporado a las nanopartículas que cuando se administró en forma de una solución acuosa simple (Arbos et al., J. Control. Release, 89 (2003) 19-30). Este hecho concuerda con trabajos previos que sugerían que la forma de nanopartícula facilitaría tanto el contacto inicial como las interacciones adhesivas con los componentes de la mucosa.
Pasados 30 minutos de la administración, todas las formulaciones ensayadas mostraron un máximo de bioadhesión en el estómago y en el jejuno (porción I2 en la Figura 4). En cualquier caso, parece observarse una mayor interacción con las nanopartículas asociadas a la OH-\beta-CD. Por lo tanto, 30 minutos después de la administración, se puede decir que alrededor del 12-20% de la dosis administrada de las formulaciones se encuentran adheridas al estómago y aproximadamente entre el 14-22% en el intestino delgado. Dichos valores son significativamente diferentes a los encontrados para las nanopartículas convencionales (a base de PVM/MA) sin CD que menos del 10% y no más del 12% de la dosis administrada se encuentra adherida al estómago e intestino delgado, respectivamente.
A partir de 1 h tras la administración, se puede observar cómo la fracción de nanopartículas con ciclodextrinas adheridas a la mucosa gastrointestinal va disminuyendo y moviéndose a porciones distales del tracto. En cualquier caso, se puede observar que dicha distribución es homogénea y ninguna formulación muestra especificidad por alguna región del tracto gastrointestinal.
Para poder comparar el potencial adhesivo de las diferentes formulaciones, se estudiaron las curvas y cinéticas de bioadhesión. Para ello, se representó la fracción de nanopartículas adheridas frente al tiempo obteniéndose así las curvas de bioadhesión. Esas curvas están representadas en la Figura 5. A partir de éstas, y utilizando la aplicación informática WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, EEUU), se determinaron los parámetros cinéticos de bioadhesión: Q_{max}, AUC_{adh}, T_{max}, MRT_{adh} and K_{adh} (Arbos et al., J. Control. Release, 89 (2003) 19-30). La Tabla 5 recoge estos parámetros.
TABLA 5 Parámetros de bioadhesión para las distintas formulaciones de nanopartículas
8
9
Como puede observarse, las nanopartículas asociadas a OH-\beta-CD están caracterizadas por una AUC_{adh} (parámetro que mide la intensidad de las interacciones bioadhesivas) 1,5 veces superior a la observada para las nanopartículas control (NP). Igualmente, la fracción adherida de las formulaciones asociadas a ciclodextrinas mostraban una velocidad de eliminación (K_{adh}) significativamente inferior que la de las NP control (p<0,01) y un tiempo de residencia medio (MRT_{adh}) de aproximadamente 3,5 horas. Estos resultados permiten suponer que la presencia de ciclodextrinas (principalmente OH-CD) puede facilitar la interacción con la mucosa gastrointestinal y desarrollar interacciones adhesivas con componentes de la mucosa más fuertes que las NP.
Ejemplo 5 Visualización de las nanopartículas que contienen ciclodextrinas en la mucosa gastrointestinal
La visualización de la distribución de las nanopartículas asociadas a ciclodextrinas en la mucosa gastrointestinal se observó por microscopia de fluorescencia. Para ello, las diferentes formulaciones marcadas con RBITC se administraron a animales de laboratorio. Dos horas después de su administración, los animales fueron sacrificados y se examinaron diversas porciones del intestino delgado. La Figura 6 muestra unas fotografiar que permiten observar la distribución de las nanopartículas en muestras de íleo.
En concordancia con los estudios de bioadhesión in vivo, las nanopartículas asociadas a hidroxipropil-\beta-ciclodextrina presentan mayor capacidad establecer interacciones bioadhesivas con la mucosa que las nanopartículas control. Las nanopartículas convencionales no fueron capaces de alcanzar los enterocitos a pesar de su habilidad para penetrar en la capa de mucus que tapiza la mucosa. Por el contrario, las nanopartículas asociadas a ciclodextrina se adhirieron significativamente en los enterocitos del intestino.
Ejemplo 6 Nanopartículas con ciclodextrinas conteniendo paclitaxel
El procedimiento para la fabricación de nanopartículas que contienen ciclodextrinas con paclitaxel se divide en dos etapas diferentes:
1)
Producción del complejo paclitaxel-ciclodextrina, que incluye tanto la formación como la purificación del complejo formado; y
2)
Producción de nanopartículas conteniendo el complejo paclitaxel-ciclodextrina.
Producción del complejo Paclitaxel-Ciclodextrina
Para ello, se preparó una solución acuosa de ciclodextrina (\beta-CD, OH-\beta-CD o NH-\beta-CD) que se añadió sobre una solución etanólica del fármaco paclitaxel (PTX) en una proporción 80:20 (v:v), y con una relación molar fármaco:ciclodextrina (1:1). La mezcla se mantuvo en agitación magnética (300 rpm), en oscuridad y a temperatura ambiente hasta alcanzar el equilibrio (al menos, 72 horas). A continuación, se eliminó el etanol bajo evaporación a presión reducida y se filtró la suspensión (0,45 \mum) para eliminar los cristales de fármaco no disuelto. Finalmente, se eliminó completamente el agua de la solución acuosa final por evaporación bajo presión reducida quedando el complejo paclitaxel-ciclodextrina bajo la apariencia de un polvo blanco.
Producción de nanopartículas conteniendo el complejo paclitaxel-ciclodextrina
Las nanopartículas se obtuvieron por desolvatación controlada tras modificación de un procedimiento descrito anteriormente (Arbos et al., 2002, citado supra). Para ello, una cantidad determinada del complejo formado previamente entre el paclitaxel y la ciclodextrina (\beta-CD, OH-\beta-CD o NH-\beta-CD) se dispersó n 2 ml de acetona. Esta suspensión se adicionó a una solución de 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVMIMA) [Gantrez® AN 119] en 3 ml de acetona y se dejó incubar la mezcla durante 30 minutos. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionaron 10 ml de etanol y 10 ml de agua desionizada. La mezcla resultante se dejó homogeneizar durante 5 minutos. A continuación, la suspensión de nanopartículas fue evaporada bajo presión reducida (Büchi R-144, Suiza) hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajustó con agua a 10 ml. Posteriormente, la suspensión se sometió a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g) (Sigma 3k30, rotor Nº-12150, Alemania). Los sobrenadantes se eliminaron y el residuo se resuspendió en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Una parte de las nanopartículas obtenidas se congeló a -80ºC para su posterior liofilización y conservación a largo plazo (Virtis Genesis, Nueva York, EEUU).
Optimización del proceso de encapsulación del complejo paclitaxel-ciclodextrina en las nanopartículas
La Figura 7 muestra la evolución del contenido en PTX en las nanopartículas que contienen ciclodextrinas y PTX, en función de la cantidad y tipo de ciclodextrina utilizada. En primer lugar, merece la pena destacar que el PTX por sí solo, es decir, sin formar complejo con las CD, no es capaz de incluirse en las nanopartículas, siendo eliminado en el proceso de purificación de las nanopartículas por filtración. Por ello, se hace necesaria la formación del complejo paclitaxel-ciclodextrina (PTX-CD). Para las diferentes ciclodextrinas utilizadas se observó cómo las mejores eficacias de encapsulación se obtuvieron cuando el PTX forma complejo con la OH-(3-CD, seguido de la NH-\beta-CD y de la \beta-CD sin sustituir.
Asimismo se ensayaron también diferentes cantidades de PTX (5, 7,5, 10 y 25 mg), siempre guardando la relación molar 1:1 con la ciclodextrina correspondiente, y se observó cómo para cantidades superiores a 10 mg de PTX [PTX:PVM/MA (1:10)], no se obtuvieron mayores cantidades de fármaco encapsulado, y, por consiguiente se observó una disminución en la eficacia de encapsulación del complejo PTX-CD en las NP. Tras estos ensayos, se determinó que, en las condiciones ensayadas, la cantidad óptima de PTX a incluir en las diferentes formulaciones era de 10 mg, obteniéndose así los mejores rendimientos. La Tabla 7 muestra la cantidad de PTX encapsulado cuando inicialmente se añadía 10 mg en función de las diferentes ciclodextrinas utilizadas para formar el complejo.
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TABLA 7 Cantidad de PTX asociado a diferentes formulaciones de nanopartículas en función del tipo de ciclodextrina utilizada
(cantidad inicial de paclitaxel añadida: 10 mg)
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Ejemplo 7 Estudio farmacocinético tras administración oral de distintas formulaciones de paclitaxel
El paclitaxel es un fármaco que se caracteriza por presentar un perfil farmacocinético dosis-dependiente. Por tanto, previamente fue necesario determinar el perfil farmacocinético tras administrar por vía intravenosa u oral la formulación comercial de paclitaxel a la dosis seleccionada para su formulación en nanopartículas (10 mg/kg).
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Los estudios farmacocinéticos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas del Comité Ético de la Universidad de Navarra así como de la legislación Europea en animales de experimentación (86/609/EU). Para ello, ratas macho Wistar, de peso medio 225 g (Harlan, España), se aislaron en jaulas metabólicas 12 horas antes de la administración de las formulaciones, sin acceso a comida, pero permitiéndoles el acceso libre al agua de bebida.
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TABLA 8 Características físico-químicas de las diferentes formulaciones con complejo paclitaxel-ciclodextrina utilizadas en los estudios farmacocinéticas
11 
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La Tabla 8 resume las características físico-químicas principales de las nanopartículas ensayadas en el estudio farmacocinético. Las nanopartículas control (PTX-NP) muestran un tamaño cercano a los 200 nm con una carga superficial negativa de -38 mV. Por otra parte, las nanopartículas que contienen encapsulado el complejo PTX-CD son significativamente mayores (cercanas a los 300 nm) y muestran un potencial zeta similar en todos los casos. Por último, es de destacar que la presencia del complejo PTX-CD no ejerce ningún efecto sobre el rendimiento de fabricación de las nanopartículas que varía entre el 50-60%.
El estudio farmacocinético se dividió en tres fases. En el primer estudio se administraron 10 mg/kg de la formulación comercial de paclitaxel (Taxol®) por vía intravenosa (i.v.) y oral a dos grupos de ratas macho Wistar (n= 6). El segundo estudio consistió en administrar por vía oral soluciones de paclitaxel (10 mg/kg) con (i) \beta-CD, (ii) OH-\beta-CD, o (iii) NH-\beta-CD, a grupos de ratas compuestos de 6 animales. Finalmente, para el estudio farmacocinético de las diferentes formulaciones se administraron por vía oral a distintos grupos de animales las diferentes formulaciones de nanopartículas (i) PTX-OH-\beta-CD-NP, (ii) PTX-\beta-CD-NP, (iii) PTX-NH-\beta-CD-NP, o (iv) PTX-NP a los animales. La dosis de paclitaxel seleccionada fue de 10 mg/kg.
Tras la administración se procedió a extraer a diferentes tiempos (0,10, 30, 60, 90, 180, 360, 480 minutos, 24 y 30 horas) un volumen de sangre de aproximadamente 300 \mul, utilizando EDTA como anticoagulante y recuperando la volemia del animal (rata) con un volumen equivalente de suero fisiológico vía intraperitoneal (i.p.). El análisis farmacocinético de los resultados obtenidos tras la administración de paclitaxel se realizó utilizando el procedimiento de ajuste nocompartimental del programa de ajuste farmacocinético WiNNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, Estados Unidos).
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 8. Como se puede observar, la administración i.v. de la formulación convencional (taxol comercial) muestra un pico de concentración de paclitaxel en plasma en la primera toma de muestra, seguido de una disminución bifásica a lo largo del tiempo. Dicho perfil es similar al descrito por otros autores (Yeh et al., Pharm Res 22(6): 867-74, 2005). Cuando dicha formulación comercial se administró por vía oral (Figura 8B), los niveles plasmáticos de paclitaxel fueron nulos. Resultados similares se obtuvieron al administrar los complejos PTX:CD, ninguno de ellos permitió detectar o cuantificar niveles significativos de paclitaxel en el tiempo. Por el contrario, al administrar por vía oral las formulaciones de paclitaxel en nanopartículas conteniendo ciclodextrinas y paclitaxel se pudo comprobar que estas formulaciones daban lugar a niveles plasmáticos sostenidos en el tiempo durante, al menos, 24 horas. En el periodo de tiempo comprendido desde las 4 horas hasta las 24 horas posterior a la administración de dichas nanopartículas se pudo observar para las tres formulaciones un "plateau" de concentración plasmática típico de las formulaciones que liberan el fármaco con cinéticas de orden 0. En cualquier caso, las formulaciones PTX-\beta-CD-NP y PTX-OH-\beta-CD-NP permiten obtener niveles plasmáticos sensiblemente superiores (3-4 veces) a los obtenidos con la formulación PTX-NH-\beta-CD-NP. También es interesante resaltar que la administración de paclitaxel en nanopartículas convencionales no permitió la absorción del fármaco.
La Tabla 9 recoge los valores de los parámetros farmacocinéticos obtenidos tras realizar un análisis no compartimental de los datos experimentales obtenidos tras administrar las distintas formulaciones de paclitaxel en nanopartículas. Como puede observarse en dicha tabla, el valor de AUC y MRT experimenta variaciones significativas en función del tipo de ciclodextrina empleada en la formulación. En el caso de las formulaciones orales de PTX-OH-\beta-CD-NP y PTX-\beta-CD-NP se obtuvieron valores de AUC 5 veces superiores a los obtenidos tras administrar la formulación comercial (Taxol®) intravenoso a la misma dosis. En ambas formulaciones la concentración máxima alcanzada resultó ser significativamente mayor que la alcanzada en el resto de formulaciones en un periodo de tiempo de 6 y 5 horas, respectivamente. Por el contrario, para la formulación PTX-NH-\beta-CD-NP se obtuvieron valores de AUC inferiores a los obtenidos tras administrar la formulación comercial (Taxol®) por vía intravenosa; sin embargo, el tiempo medio de residencia del fármaco en el organismo (MRT) fue similar para las tres formulaciones con ciclodextrinas. Estos valores fueron entre 3 y 5 veces superiores a los alcanzados tras administrar la formulación comercial (Taxol®) por vía intravenosa.
Del mismo modo, la semivida de eliminación del fármaco en la fase terminal (T_{1/2z}) fue similar para las formulaciones de nanopartículas que contenía ciclodextrina y paclitaxel, y, en cualquier caso, inferior a la obtenida para la formulación comercial administrada por vía intravenosa (Taxol®).
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TABLA 9 Parámetros farmacocinéticos de las diferentes formulaciones ensayadas
12

Claims (43)

1. Una nanopartícula que comprende un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa.
2. Nanopartícula según la reivindicación 1, en la que dicho polímero biodegradable es un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA).
3. Nanopartícula según la reivindicación 2, en la que dicho polímero biodegradable tiene un peso molecular comprendido entre 100 y 2.400 kDa, preferentemente entre 200 y 2.000 kDa, en particular, entre 180 y 250 kDa.
4. Nanopartícula según la reivindicación 1, en la que dicha ciclodextrina, o derivado de la misma, es una alfa-ciclodextrina, una beta-ciclodextrina o una gamma-ciclodextrina.
5. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó 4, en la que dicha ciclodextrina presenta al menos un grupo hidroxilo terminal modificado.
6. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó 4, en la que dicha ciclodextrina presenta, dos o más grupos hidroxilo terminales modificados.
7. Nanopartícula según la reivindicación 5 ó 6, en la que dicho(s) grupo(s) hidroxilo(s) terminal(es) está(n) modificado(s) reemplazando el hidrógeno por un grupo alquilo C_{1}-C_{8}; trialquil(C_{1}-C_{8})sililo; hidroxialquilo C_{1}-C_{8}; alquil(C_{1}-C_{8})carbonilo, opcionalmente sustituido; arilcarbonilo; cianoalquil(C_{1}-C_{2}); amino, opcionalmente sustituido; azido; sulfo; sulfoalquilo (C_{1}-C_{4}); o por un radical de un azúcar.
8. Nanopartícula según la reivindicación 1, en la que dicha ciclodextrina, o derivado de la misma, se selecciona del grupo formado por \beta-ciclodextrina, 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina y sus mezclas.
9. Nanopartícula según la reivindicación 1, en la que dicha molécula biológicamente activa es una molécula química pequeña, una proteína, un péptido, un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleótido, un polinucleótido o un ácido nucleico.
10. Nanopartícula según la reivindicación 1, en la que dicha molécula biológicamente activa es un fármaco, un antígeno o un alergeno.
11. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó 10, en la que dicha molécula biológicamente activa es una sustancia hidrófoba.
12. Nanopartícula según la reivindicación 11, en la que dicha molécula biológicamente activa es albendazol, mebendazol, praziquantel, clotrimazol, itraconazol, sulfametiazol, gentamicina, griseofulvina, digoxina, camptotecina, metotrexato, docetaxel, fluorouracilo, paclitaxel, tacrolimus, ciclosporina, cortisona, dexametasona, prednisolona, prednisona, o triamcinolona.
13. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó 10, en la que dicha molécula biológicamente activa es una sustancia sustrato de la enzima glicoproteína-P.
14. Nanopartícula según la reivindicación 13, en la que dicha molécula biológicamente activa es docetaxel, etoposido, imatinib, paclitaxel, teniposido, vinblastina, vincristina, doxorubicina, daunorubicina, epirubicina, bunitrolol, carvedilol, celiprolol, talinolol, diltiazem, mibefradil, verapamil, digitoxina, digoxina, quinidina, amprenavir, indinavir, nelfinavir, saquinavir, ritonavir, dexametasona, metilprednisolona, ciclosporina A, sirolimus, tacrolimus, domperidona, ondansetron, eritromicina, levofloxacino, atorvastatina, lovastatina, fexofenadina, terfenadina, amitriptilina, colchicina, debrisoquina, itraconazol, losartan, morfina, fenitoina, rifampina, actinomicina D, topotecan, estradiol, rapamicina o FK506.
15. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó 10, que comprende dos o más moléculas biológicamente activas.
16. Nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en forma liofilizada.
17. Una composición farmacéutica que comprende, al menos, una nanopartícula que comprende un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa, según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, y un excipiente, vehículo o adyuvante, farmacéuticamente aceptable.
18. Composición farmacéutica según la reivindicación 17, en una forma farmacéutica de administración por vía oral, parenteral, tópica, subcutánea, oftálmica, rectal, vaginal, nasal (pulmonar), o transdérmica.
19. Composición farmacéutica según la reivindicación 17, en forma liofilizada.
20. Un procedimiento para la producción de nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1-16 que comprende la etapa de incubar simultáneamente dicho polímero biodegradable y un complejo (ciclodextrina o derivado de la misma):(molécula biológicamente activa) (complejo [CD:MBA]), en un disolvente orgánico, antes de proceder a la desolvatación de dicho polímero biodegradable con una solución hidroalcohólica; o, alternativamente, la etapa de incubar nanopartículas de dicho polímero biodegradable con una solución acuosa que comprende dicho complejo [CD:MBA].
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicho complejo [CD:MBA] se añade a una disolución que comprende dicho polímero biodegradable en un disolvente orgánico.
22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, en el que la concentración de dicho polímero biodegradable está comprendida entre 0,001 y 10% p/v y la concentración de dicho complejo [CD:MBA] entre 0,001 y 5% p/v.
23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que la relación entre el complejo [CD:MBA]:polímero biodegradable está comprendida entre 1:1 y 1:20 en peso.
24. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, en el que la relación fase orgánica/solución hidroalcohólica está comprendida entre 1:1-10 en volumen.
25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, que comprende, además, la eliminación de los disolventes orgánicos y/o la purificación de las nanopartículas obtenidas.
26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, que comprende, además, liofilizar, opcionalmente en presencia de un agente crioprotector, las nanopartículas obtenidas.
27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que dicho polímero biodegradable es el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA), preferentemente con un peso molecular comprendido entre 100 y 2.400 kDa.
28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que dicha ciclodextrina se selecciona entre 3-ciclodextrina, 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina y sus mezclas.
29. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicha molécula biológicamente activa es un fármaco, un antígeno o un alergeno.
30. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 29, en el que dicha molécula biológicamente activa es una sustancia hidrófoba.
31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que dicha molécula biológicamente activa es albendazol, mebendazol, praziquantel, clotrimazol, itraconazol, sulfametiazol, gentamicina, griseofulvina, digoxina, camptotecina, metotrexato, docetaxel, fluorouracilo, paclitaxel, tacrolimus, ciclosporina, cortisona, dexametasona, prednisolona, prednisona, o triamcinolona.
32. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 29, en el que dicha molécula biológicamente activa es una sustancia sustrato de la enzima glicoproteína-P.
33. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que dicha molécula biológicamente activa es docetaxel, etoposido, imatinib, paclitaxel, teniposido, vinblastina, vincristina, doxorubicina, daunorubicina, epirubicina, bunitrolol, carvedilol, celiprolol, talinolol, diltiazem, mibefradil, verapamil, digitoxina, digoxina, quinidina, amprenavir, indinavir, nelfinavir, saquinavir, ritonavir, dexametasona, metilprednisolona, ciclosporina A, sirolimus, tacrolimus, domperidona, ondansetron, eritromicina, levofloxacino, atorvastatina, lovastatina, fexofenadina, terfenadina, amitriptilina, colchicina, debrisoquina, itraconazol, losartan, morfina, fenitoina, rifampina, actinomicina D, topotecan, estradiol, rapamicina o FK506.
34. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicha molécula biológicamente activa es paclitaxel.
35. Una composición farmacéutica que comprende, al menos, una nanopartícula que comprende un polímero biodegradable, una ciclodextrina o un derivado de la misma, y una molécula biológicamente activa, según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, y un excipiente, vehículo o adyuvante, farmacéuticamente aceptable, en la que dicha molécula biológicamente activa es paclitaxel.
36. Composición farmacéutica según la reivindicación 35, en la que dicho polímero biodegradable es un copolímero de PVM/MA.
37. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 35 ó 36, en la que dicha ciclodextrina se selecciona entre \beta-ciclodextrina, 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina y sus mezclas.
38. Composición farmacéutica según la reivindicación 35, 36 ó 37, en la que dicho polímero biodegradable es un copolímero de PVM/MA y dicha ciclodextrina se selecciona entre \beta-ciclodextrina, 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, 6-monodesoxi-6-monoamino-\beta-ciclodextrina y sus mezclas.
39. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, en una forma farmacéutica de administración por vía oral, parenteral, tópica, subcutánea, oftálmica, rectal, vaginal, nasal (pulmonar), o transdérmica.
40. Composición farmacéutica según la reivindicación 35 a 38, en forma liofilizada.
41. Composición farmacéutica según la reivindicación 38, en la que dicha nanopartícula comprende:
13
42. Composición farmacéutica según la reivindicación 38, en la que dicha nanopartícula comprende:
14
43. Composición farmacéutica según la reivindicación 38, en la que dicha nanopartícula comprende:
15
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