CN110366432A - 基于pd-l1表达的肿瘤和免疫细胞成像 - Google Patents

Abstract

当前公开的主题提供了包含可以检测程序性死亡配体1(PD‑L1)的成像剂的组合物、试剂盒和方法。当前公开的成像剂可以用于检测受试者的疾病和紊乱，诸如癌症、感染和炎症。

Description

基于PD-L1表达的肿瘤和免疫细胞成像

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月23日提交的美国临时申请第62/438,575号和2017年6月14日提交的美国临时申请第62/519,534号的权益，这些申请通过引用以其整体并入本文。

联邦政府资助的研究或开发

本发明根据由美国国立卫生研究院(National Institute of Health)(NIH)授予的NIH R01CA16631在政府支持下进行。政府在本发明中拥有某些权利。

背景

分子成像可以报告关于肿瘤免疫微环境的状态，并指导免疫治疗策略以增强免疫调节治疗的效力。可以快速报告关于免疫调节治疗的靶的成像剂很少。

利用一个人自己的免疫系统来杀伤癌细胞的免疫治疗，正在各种癌症的治疗中发挥着核心作用(Topalian等人，2016)。尽管治疗结果显著改善，但许多癌症对免疫调节治疗没有响应。通过免疫组织化学(IHC)起作用的现有伴随诊断仅提供动态肿瘤免疫环境的快照，并且通常不能准确预测治疗响应(Mansfield和Dong,2016)。无创成像技术可以提供肿瘤生物学的定量、实时评估并指导药物开发(Willmann等人，2008)。

平移成像技术中最分子化和定量化的正电子发射断层扫描成像术(PET)，已被用于重复测量给定患者的所有病变中的整体靶表达。分子靶向的PET示踪剂，诸如[¹⁸F]氟代雌二醇(¹⁸F-FES)检测雌激素受体(ER)阳性乳腺癌，可以预测对治疗的响应和无进展生存期(Peterson等人，2008，和Linden等人，2006)。PET示踪剂，以及可以提供与免疫调节治疗相关的靶表达的快速和实时评估的用于包括但不限于磁共振成像(MRI)、荧光成像、近红外(NIR)成像、光声成像和拉曼成像的其他成像方法的成像剂可以显著有益于正在进行的临床试验。

程序性死亡配体1(PD-L1)是一种在数种癌症中过表达并有助于肿瘤免疫抑制的免疫检查点蛋白。肿瘤PD-L1表达指示肿瘤对PD-1和PD-L1靶向治疗的响应。已经证明，放射性标记的抗PD-L1抗体可以用于无创地评估人类肿瘤异种移植物和同基因肿瘤模型中的PD-L1表达(Heskamp等人，2015；Maute等人，2015；Chatterjee等人，2016；Deng等人，2016；Hettich等人，2016；Josefsson等人，2016)。虽然放射性标记的抗体缀合物越来越多地用于肿瘤特异性蛋白质成像，但需要延长高达数天的较长清除时间，，以增强对比度和病变检测(Pandit-Taskar等人，2015；Oosting等人，2016)。

概述

在一些方面，当前公开的主题提供了成像剂，所述成像剂包含对程序性死亡配体1(PD-L1)具有结合特异性的肽和报告部分以及任选地接头的缀合物，其中接头当存在时连接肽和报告部分，而当接头不存在时，报告部分通过肽的氨基酸的伯胺直接附接到肽。在其他方面，报告部分被直接掺入肽中，例如，其中报告部分构成肽的放射性标记的氨基酸，诸如放射性标记的碘代酪氨酸或和氟代酪氨酸。

在特定方面，对PD-L1具有结合特异性的肽与PD-L1的氨基酸Y56、E58、A113、M115和Y123相互作用。

在某些方面，肽是WL12，并且成像剂是选自由以下组成的组的化合物：式(I)、式(II)和式(III)：

DK-A-221–(L)_n–Rpt(II)；或

DK-A-222–(L)_n–Rpt(III)；

其中：n是选自由0和1组成的组的整数；L是接头；并且Rpt是报告部分；并且其中所述报告部分或接头当存在时附接到构成式(I)、式(II)或式(III)的成像剂的肽的氨基酸的伯胺基团。

在特定方面中，式(I)的化合物是WL12 DOTA：

在其他方面中，当前公开的主题提供了用于检测程序性死亡配体1(PD-L1)的成像方法，该方法包括：(a)提供有效量的成像剂，所述成像剂包含对程序性死亡配体1(PD-L1)具有结合特异性的肽和报告部分以及任选地接头的缀合物，其中接头当存在时连接肽和报告部分，而当接头不存在时，报告部分通过肽的氨基酸的伯胺直接附接到肽；(b)使一种或更多种细胞或组织与成像剂接触；以及(c)制作图像以检测PD-L1。在特定方面中，成像剂是式(I)的化合物或与PD-L1的Y56、E58、A113、M115和Y123相互作用的肽。

在某些方面中，当前公开的成像剂可以用于检测受试者的疾病和紊乱，诸如癌症、感染和炎症。

在又更多方面中，当前公开的主题提供了用于检测程序性死亡配体1(PD-L1)的试剂盒，该试剂盒包括成像剂，所述成像剂包含对程序性死亡配体1(PD-L1)具有结合特异性的肽和报告部分以及任选地接头的缀合物，其中接头当存在时连接肽和报告部分，而当接头不存在时，报告部分通过肽的氨基酸的伯胺直接附接到肽。

上文已经陈述了当前公开的主题的某些方面，其全部或部分由当前公开的主题所陈述，当结合下文作为最佳描述的所附实施例和附图考虑时，其他方面随描述进行将变得明显。

附图简述

已经如此概括地描述了当前公开的主题，现在将参考附图，附图不必按比例绘制，并且其中：

图1A、图1B和图1C示出了WL12与PD-L1的结合。图1A示出了WL12及其类似物的结构表示和WL12的氨基酸序列(WL12氨基酸序列＝环-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Leu-Hyp-Trp-Ser-Trp(甲基)-NMeNle-NMeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2)；图1B示出了WL12与PD-L1的预测结合模式。WL12在PD-L1的沟中形成β折叠样结构。WL12以青色示出。PD-L1的表面表示以灰色示出，且带和关键侧链以品红色示出；并且图1C示出了WL12模拟PD-1与PD-L1的结合。PD-1的结构以青色示出。PD-1的两条主要相互作用的β链与结合PD-L1的WL12所采用的构象良好重叠；

图2示出了肽WL12的远UV CD光谱；

图3示出了WL的电喷雾电离(ESI)质谱；理论化学式：C₉₁H₁₂₈N₂₂O₂₀S₂。观察到的m/z：1882.7-(M+1)⁺¹，941.9-(M+2)⁺²/2。预期的：1882.19；

图4示出了WL12D的RP-HPLC纯化；

图5示出了PDL1-PD的低分辨率质谱；理论化学式：C₉₁H₁₂₈N₂₂O₂₀S₂，精确质量：2339.14，分子量：2340.65，观察到的m/z：2340.9-(M+1)⁺¹，1171.1-(M+2)⁺²/2和781.1-(M+2)⁺³/3；

图6示出了[PDL1-PD-Cu²⁺]的RP-HPLC纯化；

图7示出了[PDL1-PD-Cu²⁺]复合物的低分辨率质谱；理论化学式：C₁₁₀H₁₅₆N₂₆O₂₉S，精确质量：2400.05，分子量：2402.18，观察到的m/z：2402.6-(M+1)⁺¹，1201.9-(M+2)⁺²/2；

图8A、图8B和图8C示出了PD-L1结合肽WL12的体外表征。图8A示出了竞争性抑制测定，该测定显示WL12类似物抑制PD-1:PD-L1相互作用的亲和力；图8B示出了用于体外研究的细胞系的流式细胞术直方图，该图显示了可变的PD-L1表达；并且图8C示出了[⁶⁴Cu]W12展示了对具有高PD-L1表达的细胞的增加的结合，这可以被过量的肽(PEP)阻断；

图9示出了PD-L1结合PD-1的代表性曲线；K_D＝69.66±11.65nM(95％CI 44.82-94.48nM)；

图10示出了用WL12D-Cu²⁺复合物抑制PD-L1与PD-1的结合的代表性曲线；IC₅₀＝2.97nM(95％CI 2.17-40.5nM)K_i＝1.38nM(95％CI1.01-1.89nM)；

图11示出了[⁶⁴Cu]WL12放射性示踪剂(红色)和“冷”WL12-Cu²⁺复合物的RP-HPLC色谱图；

图12示出了PDL1-PD和[PDL1-PD-Cu²⁺]的混合物的RP-HPLC色谱图；

图13示出了用于摄取测定的不同细胞系的平均荧光强度值；

图14示出了细胞系MFI对％ID的相关性；

图15A和15B示出了用[⁶⁴Cu]WL12快速体内检测肿瘤PD-L1表达。对具有hPD-L1肿瘤(红色箭头)和CHO肿瘤(蓝色箭头)的NSG小鼠静脉内施用150μCi的[⁶⁴Cu]WL12，并在注射放射性示踪剂后10min、30min、60min和120min获得图像。图15A示出了横截面图像(上图)和渲染的3D体积图像(下图)，其显示[⁶⁴Cu]WL12在hPD-L1肿瘤中的特异性积聚；并且图15B示出了PD-L1 IHC在hPD-L1肿瘤中展示了强免疫反应性(棕色)；

图16示出了NSG小鼠中的hPD-L1肿瘤的[⁶⁴Cu]WL12的特异性摄取。具有hPD-L1肿瘤和CHO肿瘤并在注射示踪剂后24h时注射了[⁶⁴Cu]WL12的NSG小鼠的代表性体积渲染的PET-CT图像。与CHO(蓝色箭头)肿瘤相比，hPD-L1(红色箭头)肿瘤的摄取增加证实了PD-L1介导的放射性示踪剂的摄取；

图17示出了[⁶⁴Cu]WL12在具有hPD-L1肿瘤和CHO肿瘤的NSG小鼠中的离体生物分布分析。对NSG小鼠静脉内施用20μCi的[⁶⁴Cu]WL12，并在注射后60min和120min时收获组织。对于阻断研究，小鼠接受了过量的肽(pep)与放射性示踪剂注射；

图18A、图18B和图18C示出了：(图18A)Wl12-IR800CW缀合物的结构(化学式：C₁₃₇H₁₇₇N₂₄O₃₄，分子量：2864.34)，(图18B)WL12-IR800CW的HPLC色谱图，且峰下记录的UV-Vis光谱(插图)记指示染料与肽的缀合；以及(图18C)与预期分子量相关的WL12-IR800CW缀合物的ESI-MS谱；

图19A、图19B和图19C示出了WL12-IR800CW在具有CHO肿瘤和hPD-L1肿瘤的小鼠中的评估：(图19A)注射5纳摩尔的WL12-IR800CW的小鼠和注射缀合物后24h记录的离体器官的代表性图像，(图19B，阻断)注射25纳摩尔的未修饰的WL12和5纳摩尔的WL12-IR800CW的小鼠的代表性图像，在注射后24h获得；以及(图19C)从用1纳摩尔、3纳摩尔和5纳摩尔的缀合物处理并用WL12阻断的小鼠获得的选择的器官和肿瘤中WL12-IR800CW的离体生物分布的定量(数字表示对应的器官，n＝4)；

图20A、图20B、图20C和图20D示出了，人类NSCLC和TNBC异种移植物中的[¹¹¹In]阿特珠单抗(atezolizumab)摄取不完全是表达依赖性的。(A)不同的TNBC和NSCLC细胞系的流式细胞术分析，示出了可变的PD-L1表达；(B)[¹¹¹In]AtzMab与癌细胞系的结合依赖于PD-L1表达；(C)与PD-L1低的SUM149相比，PD-L1高的MDAMB231 TNBC异种移植物中的[¹¹¹In]AtzMab的摄取增加；以及(D)与PD-L1低的H1155相比，PD-L1高的H2444 NSCLC异种移植物中的[¹¹¹In]AtzMab的摄取增加。示出了对应的组织学。来自Chatterjee等人，Oncotarget,2016；

图21A、图21B、图21C和图21D示出了[⁶⁴Cu]WL12-PET检测肿瘤中的AtzMab积聚。(A)全身[⁶⁴Cu]WL12图像示出了到注射后60min在hPD-L1肿瘤上的放射性的特异性积聚；(B)在示踪剂注射前24h，接受20mg/kg剂量的AtzMab的小鼠中的hPD-L1肿瘤中的[⁶⁴Cu]WL12摄取显著减少；(C)对应的生物分布研究证实了[⁶⁴Cu]WL12检测肿瘤中AtzMab PD-L1结合(engagement)的潜力；以及(D)WL12抑制AtzMab与PD-L1的结合。与连续稀释的WL12一起孵育的hPD-L1细胞用Cy5-AtzMab或商业BD抗体BD-MIH1-PE来染色。平均荧光强度(MFI)对肽浓度的图示出Cy5-AtzMab和BD-MIH1-PE的IC₅₀分别为2.5nM和37.8nM；

图22示出，[⁶⁴Cu]WL12-PET检测三阴性乳腺癌异种移植物中的AtzMab积聚。在示踪剂注射前24h接受20mg/kg剂量的AtzMab的小鼠中，MDAMB231肿瘤中的[⁶⁴Cu]WL12摄取显著减少；

图23A、图23B和图23C示出了(A)Wl12-IR800缀合物的结构(化学式:C₁₃₇H₁₇₇N₂₄O₃₄，分子量：2864.34)；(B)WL12-IR800的HPLC色谱图，且峰下记录的UV-Vis光谱指示染料与肽的缀合(插图)；以及(C)与预期分子量相关的WL12-IR800的ESI-MS谱；

图24A、图24B和图24C示出了WL12-IR800在具有CHO肿瘤和hPD-L1肿瘤的小鼠中的评估：(A)注射5纳摩尔的WL12-IR800的小鼠和注射缀合物后24h记录的离体器官的代表性图像，(B，阻断)注射25纳摩尔的未修饰的WL12和5纳摩尔的WL12-IR800的小鼠的代表性图像，在注射后24h获得；以及(C)从用1纳摩尔、3纳摩尔和5纳摩尔的缀合物处理并用WL12阻断的小鼠获得的选择的器官和肿瘤中的WL12-IR800的离体生物分布的定量(数字表示对应的器官，n＝4)；

图25A和图25B示出了[⁶⁸Ga]WL12在CHO肿瘤模型和CHO-hPD-L1肿瘤模型中的评估：(1)在CHO-hPD-L1肿瘤(红色箭头，高PD-L1表达)和CHO肿瘤(黑色箭头，低PD-L1表达)(n＝3)中的[⁶⁸Ga]WL12摄取的PET-CT(体积渲染的)图像证实了PD-L1介导的放射性示踪剂的摄取；以及(B)在同一肿瘤模型中注射[⁶⁸Ga]WL12后1h时的离体生物分布分析。阻断剂量组用50微克的冷肽共注射；

图26示出了[¹⁸F]WL12在CHO肿瘤模型和CHO-hPD-L1肿瘤模型中的评估。(A)在CHO-hPD-L1肿瘤(红色箭头，高PD-L1表达)和CHO肿瘤(蓝色箭头，低PD-L1表达)(n＝3)中的[¹⁸F]WL12摄取的PET-CT(体积渲染的)图像证实了PD-L1介导的放射性示踪剂的摄取；

图27示出了用20mg/Kg剂量的阿特珠单抗注射具有MDAMB231肿瘤和SUM149肿瘤的小鼠。mAb给药后二十小时，将小鼠注射20μCi的[⁶⁴Cu]WL12，并在示踪剂注射后24h进行生物分布研究。数据证明，在肿瘤中结合PD-L1的阿特珠单抗可以通过[⁶⁴Cu]WL12来定量；

图28示出了PD-L1治疗性抗体阿特珠单抗的剂量依赖性PD-L1占据确定。将具有MDAB231乳腺肿瘤的小鼠注射不同剂量的阿特珠单抗，并且24h后，将小鼠注射[⁶⁴Cu]WL12，并在示踪剂注射后2h时进行生物分布研究。数据表明，随抗体剂量增加，肿瘤中的[⁶⁴Cu]WL12积聚减少；

图29示出了通过[⁶⁴Cu]WL12测量的阿特珠单抗的PD-L1占据的时间和剂量依赖性变化。具有MDAMB231肿瘤的小鼠接受1mg/kg或10mg/kg剂量的阿特珠单抗。在mAb给药后24h或120h，将小鼠注射[⁶⁴Cu]WL12，并通过生物分布研究来测量放射性的肿瘤积聚。如预期的，在10mg/kg剂量，在24h和120h两者都观察到PD-L1的完全阻断。而在1mg/kg剂量，在120h可以观察到[⁶⁴Cu]WL12的积聚增加，但在24h未观察到[⁶⁴Cu]WL12的积聚增加，表明当使用低mAb剂量时，阿特珠单抗随时间从肿瘤清除。这些数据表明，可以使用当前公开的肽分析PD-L1治疗性mAb在肿瘤中的保留时间；

图30示出了DK-A-221和DK-A-222的化学结构；

图31A和图31B示出了关于DK222PD-L1结合肽的数据。合成了NOTA缀合的DK222并在具有CHO/CHO-HPD-L1肿瘤的小鼠中评估。成像(A)和生物分布(B)数据示出了[⁶⁴Cu]DK222的优越的药物代谢动力学；

图32示出了[⁶⁴Cu]DK222在具有CHO/CHO-hPD-L1肿瘤的NSG小鼠中的生物分布；

图33A、图33B和图33C证明，WL12体外抑制PD-1和PD-L1治疗剂之间的相互作用。图33A示出，WL12与PD-L1(绿色和青色)的结合模式跟PD-1与AtzMab(红色和青色)、AveMab(橙色和青色)和DurMab(蓝色和青色)的结合模式重叠。非相互作用残基以灰色示出。涵盖共用的结合区域(青色)的多种接触说明了不同治疗性mAb的不同结合机制。图33B示出，WL12抑制Cy5-缀合的AtzMab、Cy5-缀合的AveMab和Cy5-缀合的DurMab结合PD-L1，如通过竞争性抑制证明的。平均荧光强度通过流式细胞术来确定。图33C示出，与PBS对照相比，在60nMAtzMab、AveMab和DurMab的存在下，[⁶⁴Cu]WL12与PD-L1阳性的HCC827、H226、hPD-L1和MDAMB231细胞的结合受到抑制。还示出了[⁶⁴Cu]WL12在PD-L1阴性的CHO和SUM149细胞中的结合。****，P<0.0001；NS，不显著；

图34A是围绕PD-L1与PD-1相互作用界面的分子表面的示意图。参与与PD-1竞争治疗剂相互作用的常见残基以青色示出，PD-1相互作用特异性分子接触以紫色示出，并且非相互作用残基以灰色示出。为了说明分子相互作用中的重叠，结合的PD-1的结构以紫色示出，并且WL12的预测构象以绿色示出；

图34B示出，WL12在hPD-L1细胞中抑制Cy5缀合的PD-1-Fc蛋白与PD-L1的结合。平均荧光强度通过流式细胞术来确定；

图35C示出，WL12(5nM)在HCC827和H226细胞中抑制Cy5-缀合的AtzMab、AveMab和DurMab(2nM)与PD-L1的结合。平均荧光强度通过流式细胞术来确定，并且图35D示出了来自图34B和图35C的通过流式细胞术确定的平均荧光强度；

图35A、图35B、图35C、图35D、图35E、图35F、图35G、图35H和图35I展示了，在具有可变PD-L1表达的异种移植物中，使用[⁶⁴Cu]WL12在肿瘤处定量了PD-L1 mAb的PD-L1结合。图35A-图35H示出了与盐水处理的对照相比，在放射性示踪剂注射前24h用20mg/kg的ATzMab处理的小鼠中，H226(图35A、图35B)、HCC827(图35C、图35D)和hPD-L1/CHO(图35G、图35H)异种移植物中[⁶⁴Cu]WL12的摄取减少。全身、体积渲染的[⁶⁴Cu]WL12 PET-CT图像(图35A、图35D、图35G)和离体生物分布(图35B、图35E、图35H)。图35C、图35F和图35I示出来自对应肿瘤示出的针对PD-L1的IHC染色，****，P<0.0001；***，P<0.001；NS，不显著；

图36A、图36B、图36C和图36D示出了：图36A，不同细胞系中的PD-L1表达和对应的平均荧光强度值。图36B、图36C和图36D，在示踪剂注射前24h接受20mg/Kg剂量的AtzMab的具有H226(B)、HCC827(C)或hPD-L1/CHO(D)肿瘤的荷肿瘤小鼠中[⁶⁴Cu]WL12的离体生物分布。示出的数据为平均值±SEM。****，P<0.0001；***，P<0.001；NS，不显著；

图37A、图37B、图37C、图37D、图37E和图37F展示了使用[⁶⁴Cu]WL12检测的肿瘤PD-L1表达及其与AtzMab的结合的动态变化。图37A示出了在用多西环素处理6h和72h的A549-iPDL1细胞中PD-L1细胞表面表达增加。流式细胞术直方图。图37B示出，WL12(5nM)抑制Cy5-缀合的AtzMab、AveMab和DurMab(2nM)与用多西环素处理72h的A549-iPD-L1细胞的结合。图37C示出与对照相比，在60nM AtzMab的存在下，[⁶⁴Cu]WL12与A549-iPDL1细胞(72h多西环素)的结合显著减少。图37D和图37E示出与盐水对照相比，在放射性示踪剂注射前24h接受静脉注射AtzMab的小鼠中，A549-iPDL1异种移植物中的[⁶⁴Cu]WL12摄取显著更低，并且与亲本A549异种移植物相似。体积渲染的全身PET-CT图像(D)和离体定量(图37E)。图37F示出针对对应肿瘤的PD-L1的IHC染色。****，P<0.0001；NS，不显著；

图38示出了在给予多西环素72h，并在放射性示踪剂注射前24h用20mg/kg的AtzMab处理的具有A549-iPDL1肿瘤和A549对照肿瘤的小鼠中，[⁶⁴Cu]WL12的离体生物分布。****，P<0.0001；NS，不显著；

图39A、图39B、图39C、图39D、图39E、图39F展示了使用[⁶⁴Cu]WL12定量的三种不同PD-L1治疗性mAb对肿瘤PD-L1的结合。图39A-图39E.在放射性示踪剂注射前24h接受AtzMab(20mg/kg)、AveMab(10mg/kg)或DurMab(10mg/kg)的小鼠中，[⁶⁴Cu]WL12摄取在MDAMB231异种移植物中显著减少。盐水(图39A)、AtzMab(图39B)、AveMab(图39C)、DurMab(图39D)处理的小鼠的全身体积渲染的[⁶⁴Cu]WL12 PET-CT图像和离体生物分布(图39E)。图39F示出了针对对应肿瘤中的PD-L1的IHC染色。****，P<0.0001；NS，不显著；

图40示出了，在放射性示踪剂注射之前24h用Atzmab(20mg/kg)、AveMab(10mg/kg)或DurMab(10mg/kg)处理的具有MDAMB231的小鼠中的[⁶⁴Cu]WL12的离体生物分布。****，P<0.0001；NS，不显著；

图41A、图41B、图41C、图41D和图41E展示了剂量和时间对使用[⁶⁴Cu]WL12定量的AtzMab的肿瘤PD-L1占据的效应。图41A示出剂量-暴露关系，描绘随AtzMab剂量(mg/kg)的增加，小鼠的MDA-MB-231肿瘤中的游离PD-L1配体减少。接受0.06mg/kg、0.6mg/kg和3.2mg/kg的AtzMab的具有MDAMB231肿瘤的小鼠的全身[⁶⁴Cu]WL12 PET-CT图像(图41A)。图41B和图41C示出了用递增剂量的AtzMab(0.0009mg/kg至24mg/kg)处理的小鼠的肿瘤中[⁶⁴Cu]WL12摄取的离体定量。在放射性示踪剂注射前24h注射AtzMab(图41B)。计算了游离PD-L1配体相对于在0mg/kg测量的游离PD-L1配体中位值的百分比(图41C)。蓝色空心点：在小鼠中测量的每个剂量水平的游离PD-L1配体。红色虚线：平均模型预测的剂量-响应关系。图41D和图41E示出AtzMab(mg/kg)剂量对肿瘤PD-L1占据随时间变化的效应，描绘了在0.6mg/kg或1mg/kg剂量的AtzMab的情况下的游离PD-L1配体的增加，但在用10mg/kg或20mg/kg AtzMab剂量的情况下游离PD-L1配体不增加，这重述了mAb的非线性动力学。全身体积渲染的[⁶⁴Cu]WL12 PET-CT图像(D)和离体生物分布(E)。****，P<0.0001；NS，不显著；

图42示出在示踪剂注射前24h，随着AtzMab的剂量递增(0.0009至12mg/kg)，具有MDAMB231肿瘤的小鼠中的[⁶⁴Cu]WL12的离体生物分布；

图43示出DK-A-221和DK-A-222及其类似物的结构表示以及DK-A-221的氨基酸序列(DK-A-221氨基酸序列＝环-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Glu-Hyp-Trp-Ser-Trp(羧甲基)-NMeNLe-NMeNLe-Lys-Cys-)-Gly-NH2)。

本专利或申请文件包含至少一幅以彩色制作的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布物的副本将在请求和支付必要费用后由主管局提供。

详细描述

现在将在下文中参照附图更全面地描述当前公开的主题，在附图中示出当前公开的主题的一些但不是全部的实施方案。相同的数字在全文中指代相同的要素。当前公开的主题可以以许多不同的形式来体现并且不应当被解释为限于本文列出的实施方案；相反，提供这些实施方案使得本公开内容将满足适用的法律要求。事实上，受益于前面的描述和相关的附图中呈现的教导，本文列出的当前公开的主题的许多修改和其他实施方案将被当前公开的主题所属领域中的技术人员所想到。因此，应当理解，当前公开的主题不限于所公开的具体实施方案，并且修改和其他实施方案被意图包括在所附权利要求书的范围内。

I.包含成像剂的组合物

在一些实施方案中，当前公开的主题提供了用于检测免疫检查点蛋白诸如PD-L1的高度特异性的基于肽的正电子发射断层扫描成像术(PET)成像剂。这些成像剂可以用于在向受试者施用后很快且特异性地检测肿瘤PD-L1表达。

因此，在一些实施方案中，当前公开的主题提供了成像剂，所述成像剂包含对程序性死亡配体1(PD-L1)具有结合特异性的肽和报告部分以及任选地接头的缀合物，其中接头当存在时连接肽和报告部分，而当接头不存在时，报告部分通过肽的氨基酸的伯胺直接附接到肽。在其他实施方案中，报告部分被直接掺入肽中，例如，其中报告部分包含肽的放射性标记的氨基酸，诸如放射性标记的碘代酪氨酸或和氟代酪氨酸。

在一些实施方案中，对程序性死亡配体1(PD-L1)具有结合特异性的肽可以与PD-L1的四个特定氨基酸相互作用。在特定实施方案中，肽可以与PD-L1的氨基酸Y56、E58、D61和A113相互作用。在一些实施方案中，对PD-L1具有结合特异性的肽可以与PD-L1的五个特定氨基酸相互作用。在特定实施方案中，肽可以与PD-L1的氨基酸Y56、E58、A113、M115和Y123相互作用。在一些实施方案中，与PD-L1相互作用的肽是肽WL12。肽WL12可以具有环-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Leu-Hyp-Trp-Ser-Trp(甲基)-NMeNle-NMeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2的氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)。

在一些实施方案中，WL12可以与PD-L1的四个氨基酸相互作用。在特定实施方案中，WL12可以与PD-L1的氨基酸Y56、E58、D61和A113相互作用。在一些实施方案中，WL12可以与PD-L1的五个氨基酸相互作用。在特定实施方案中，WL12可以与PD-L1的氨基酸Y56、E58、A113、M115和Y123相互作用。在其他实施方案中，与PD-L1相互作用的肽是DK-A-221。肽DK-A-221可以具有环-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Glu-Hyp-Trp-Ser-Trp(羧甲基)-NMeNle-NMeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2的氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)。

在一些实施方案中，DK-A-221可以与PD-L1的四个氨基酸相互作用。在特定实施方案中，DK-A-221可以与PD-L1的氨基酸Y56、E58、D61和A113相互作用。在一些实施方案中，DK-A-221可以与PD-L1的五个氨基酸相互作用。在特定实施方案中，DK-A-221可以与PD-L1的氨基酸Y56、E58、A113、M115和Y123相互作用。在其他实施方案中，与PD-L1相互作用的肽是DK-A-222。在一些实施方案中，DK-A-222可以与PD-L1的四个氨基酸相互作用。在特定实施方案中，DK-A-222可以与PD-L1的氨基酸Y56、E58、D61和A113相互作用。在一些实施方案中，DK-A-222可以与PD-L1的五个氨基酸相互作用。在特定实施方案中，DK-A-222可以与PD-L1的氨基酸Y56、E58、A113、M115和Y123相互作用。

在一些实施方案中，对PD-L1具有结合特异性的肽可以与SEQ ID NO.:1具有至少80％序列同一性。对PD-L1具有结合特异性的肽可以与SEQ ID NO.:2具有至少80％序列同一性。对PD-L1具有结合特异性的肽可以与SEQ ID NO.:1具有至少85％序列同一性。对PD-L1具有结合特异性的肽可以与SEQ ID NO.:2具有至少85％序列同一性。对PD-L1具有结合特异性的肽可以与SEQ ID NO.:1具有至少90％序列同一性。对PD-L1具有结合特异性的肽可以与SEQ ID NO.:2具有至少90％序列同一性。对PD-L1具有结合特异性的肽可以与SEQID NO.:1具有至少95％序列同一性。对PD-L1具有结合特异性的肽可以与SEQ ID NO.:2具有至少95％序列同一性。对PD-L1具有结合特异性的肽可以与SEQ ID NO.:1具有100％序列同一性。对PD-L1具有结合特异性的肽可以与SEQ ID NO.:2具有100％序列同一性。

如本领域已知的，术语“同一性百分比”是两个或更多个多肽序列之间或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列来确定的。在本领域中，根据具体情况而定，“同一性”还意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，如通过这样的序列的字符串之间的匹配来确定的。“同一性”和“相似性”可以通过已知的方法容易地计算，包括但不限于以下中描述的方法：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,ed.)OxfordUniversity Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,ed.)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of SequenceData,Part I(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,eds.)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,ed.)Academic Press(1987)；和Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.)StocktonPress,New York(1991)。确定同一性的优选的方法被设计为给予测试的序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法被编成公开可得的计算机程序。序列比对和同一性百分比计算可以使用LASERGENE生物信息学计算包(DNASTAR Inc.,Madison,Wis.)的Megalign程序来进行。多重序列比对可使用Clustal比对方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151-153)用默认参数包括成对比对的默认参数来进行。

如本文使用的，术语“氨基酸”和“残基”是可互换的，并且当用于肽或多肽的上下文中时，指天然存在的和合成的氨基酸二者，以及氨基酸类似物、氨基酸模拟物和与天然存在的氨基酸化学上相似的非天然存在的氨基酸。

术语“天然存在的氨基酸”和“天然编码的氨基酸”可互换使用，并且是指由遗传密码编码的氨基酸，以及由遗传密码编码的在合成后被修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。

“氨基酸类似物”是具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，结合氢、羧基基团、氨基基团和R基团的α-碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、或甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物可以具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是将保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。

术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然编码的氨基酸”可互换使用，并且是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，但不通过翻译复合物掺入到生长的多肽链中的化合物。“非天然存在的氨基酸”还包括但不限于通过天然编码的氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸)的修饰(例如翻译后修饰)而出现的氨基酸，但其本身不通过翻译复合物天然掺入到生长的多肽链中。可以被插入到多肽序列中或取代多肽序列中的野生型残基的非天然存在的氨基酸的实例的非限制性列表包括β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和具有衍生侧链的氨基酸。实例包括(以L形式或D形式；缩写为括号中的)：瓜氨酸(Cit)、高瓜氨酸(hCit)、Nα-甲基瓜氨酸(NMcCit)、Nα-甲基高瓜氨酸(Nα-MeHoCit)、鸟氨酸(Orn)、Nα-甲基鸟氨酸(Nα-MeOrn或NMeOrn)、肌氨酸(Sar)、高赖氨酸(hLys或hK)、高精氨酸(hArg或hR)、高谷氨酰胺(hQ)、Nα-甲基精氨酸(NMeR)、Nα-甲基亮氨酸(Nα-MeL或NMeL)、N-甲基高赖氨酸(NMeHoK)、Nα-甲基谷氨酰胺(NMeQ)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、1,2,3,4-四氢异喹啉(Tic)、八氢吲哚-2-羧酸(Oic)、3-(1-萘基)丙氨酸(1-Nal)、3-(2-萘基)丙氨酸(2-Nal)、1,2,3,4-四氢异喹啉(Tic)、2-茚满基甘氨酸(IgI)、对碘代苯丙氨酸(pI-Phe)、对氨基苯丙氨酸(4AmP或4-氨基-Phe)、4-胍基苯丙氨酸(Guf)、甘氨酰基赖氨酸(缩写为“K(Nε-甘氨酰基)”或“K(甘氨酰基)”或“K(gly)”)、硝基苯丙氨酸(硝基phe)、氨基苯丙氨酸(氨基phe或氨基-Phe)、苄基苯丙氨酸(苄基phe)、γ-羧基谷氨酸(γ-羧基glu)、羟基脯氨酸(羟基pro)、对羧基-苯丙氨酸(Cpa)、α-氨基己二酸(Aad)、Nα-甲基缬氨酸(NMeVal)、Nα-甲基亮氨酸(NMeLeu)、Nα-甲基正亮氨酸(NMeNle)、环戊基甘氨酸(Cpg)、环己基甘氨酸(Chg)、乙酰精氨酸(乙酰arg)、α,β-二氨基丙酸(Dpr)、α,γ-二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、环己基丙氨酸(Cha)、4-甲基-苯丙氨酸(MePhe)、β,β-二苯基-丙氨酸(BiPhA)、氨基丁酸(Abu)、4-苯基-苯丙氨酸(或二苯基丙氨酸；4Bip)、α-氨基-异丁酸(Aib)、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基辛酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁链素、二氨基庚二酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、4-羟基脯氨酸(Hyp)、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、€-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、ω-甲基精氨酸、4-氨基-O-邻苯二甲酸(4APA)、N-乙酰氨基萄葡糖基-L-丝氨酸、N-乙酰氨基萄葡糖基-L-苏氨酸、O-磷酸酪氨酸和其他相似氨基酸，以及具体列出的那些中的任一个的衍生形式。

“肽”或“蛋白”包含一系列通过肽键连接在一起的至少三个氨基酸。术语“蛋白”和“肽”可以可互换地使用。肽可以指单独的肽或肽的集合。另外，当前公开的成像剂中的氨基酸中的一个或更多个可以例如通过以下来修饰：添加化学实体，诸如碳水化合物基团，磷酸基团，法呢基基团(farnesyl group)，异法呢基基团，亚砜基团，脂肪酸基团，用于缀合、官能化或其他修饰的接头等。在一些实施方案中，其他修饰可以包括D-氨基酸的掺入，缀合至N-末端和C-末端的其他分子，荧光探针、生物分子诸如聚(乙二醇)、靶向配体等的缀合，反向-翻转(retro-inversion)等。修饰应当基本上都不干扰所期望的肽生物活性。

在当前公开的成像剂的一些实施方案中，报告部分选自由以下组成的组：螯合剂、放射性标记的基质、荧光染料、光声报告分子和拉曼活性报告分子。

在当前公开的成像剂的一些实施方案中，报告部分是螯合剂，并且螯合剂选自由以下组成的组：DOTAGA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷,1-(戊二酸)-4,7,10-三乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTASA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-(2-琥珀酸)-4,7,10-三乙酸)、CB-DO2A(10-二(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂二环[5.5.2]十四烷)、DEPA(7-[2-(二-羧甲基氨基)-乙基]-4,10-二-羧甲基-1,4,7,10-四氮杂-环十二-1-基-乙酸))、3p-C-DEPA(2-[(羧甲基)][5-(4-硝基苯基-1-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]戊烷-2-基)氨基]乙酸))、TCMC(2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7,10-四氮杂-1,4,7,10-四-(2-氨基甲酰基甲基)-环十二烷)、氧代-DO3A(1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-5-S-(4-异硫氰基苄基)-4,7,10-三乙酸)、p-NH₂-Bn-氧代-DO3A(1-氧杂-4,7,10-四氮杂环十二烷-5-S-(4-氨基苄基)-4,7,10-三乙酸)、TE2A((1,8-N,N′-二-(羧甲基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷)、MM-TE2A、DM-TE2A、CB-TE2A(4,11-二(羧甲基)-1,4,8,11-四氮杂二环[6.6.2]十六烷)、CB-TE1A1P(4,8,11-四氮杂环十四烷-1-(甲烷膦酸)-8-(甲烷羧酸)、CB-TE2P(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,8-二(甲烷膦酸))、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N′,N″-三乙酸)、NODA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸酯)；NODAGA(1,4,7-三氮杂环壬烷,1-戊二酸-4,7-乙酸)、NOTAGA(1,4,7-三氮壬烷-1,4-二基)二乙酸)、DFO(去铁胺(Desferoxamine))、NETA([4-[2-(二-羧甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三氮壬烷-1-基}-乙酸)、TACN-TM(N,N',N",三(2-巯基乙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷)、Diamsar(1,8-二氨基-3,6,10,13,16,19-六氮杂二环(6,6,6)二十烷、3,6,10,13,16,19-六氮杂二环[6.6.6]二十烷-1,8-二胺)、Sarar(1-N-(4-氨基苄基)-3,6,10,13,16,19-六氮杂二环[6.6.6]二十烷-1,8-二胺)、AmBaSar(4-((8-氨基-3,6,10,13,16,19-六氮杂二环[6.6.6]二十烷-1-基氨基)甲基)苯甲酸)和BaBaSar。

在一些实施方案中，肽、接头、报告缀合物经由点击化学制备。参见例如，2017年2月16日公布的Pomper等人的国际专利申请公布第WO/2017/027870号Triazole ConjugatedUreas,Thioureas,Carbamates,and"Reversed"Carbamates for PSMA-Targeted ImagingAgents and Uses Thereof，以及2014年11月20日公布的Pomper等人的美国专利申请公布第20140341804号Homomultivalent and Heteromultivalent Inhibitors of ProstateSpecific Membrane Antigen(Pmsa)and Uses Thereof，其中每一个都通过引用以其整体并入。

在具体的实施方案中，螯合剂具有选自以下的结构：

在更具体的实施方案中，报告部分是螯合剂，并且螯合剂还包括放射性金属，所述放射性金属选自由以下组成的组：^94mTc、^99mTc、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁶⁰Cu、⁶¹Cu、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁵⁵Co、⁵⁷Co、⁴⁷Sc、²²⁵Ac、²¹³Bi、²¹²Bi、²¹²Pb、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、¹⁵²Gd、⁸²Rb、⁸⁹Zr和¹⁶⁶Dy。

在当前公开的成像剂的其他实施方案中，报告部分是放射性标记的基质，并且放射性标记的基质包括放射性同位素，所述放射性同位素选自由以下组成的组：¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁶I、¹³¹I、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、⁸⁰Br、^80mBr、⁸²Br、⁸³Br和²¹¹At。在具体的实施方案中，放射性标记的基质包括¹⁸F标记的基质。在更具体的实施方案中，¹⁸F标记的基质选自由以下组成的组：2-氟-PABA、3-氟-PABA、2-氟-甘露醇和N-琥珀酰亚胺基-4-氟苯甲酸酯。在一些实施方案中，使用AlF方法用¹⁸F标记基质，例如基于通过NOTA、NODA或本领域已知的任何其它合适的螯合剂对氟化铝的螯合。参见例如，Liu S.等人，“One-step radiosynthesisof¹⁸F-AlF-NOTA-RGD₂ for tumor angiogenisis PET imaging.Eur J Nucl Med MolImaging.2011,38(9):1732-41；McBride W.J.等人，“A novel method of¹⁸Fradiolabeling for PET.J Nucl Med.2009；50:991–998；McBride W.J,D’Souza CA,Sharkey RM,Sharkey RM,Karacay H,Rossi EA,Chang C-H,Goldenberg DM.Improved ¹⁸Flabeling of peptides with a fluoride-aluminum-chelate complex.BioconjugChem.2010；21:1331–1340。

在当前公开的成像剂的其他实施方案中，报告部分是荧光染料，并且荧光染料选自由以下组成的组：碳菁、吲哚碳菁、氧杂碳菁、硫杂碳菁、部花青、多甲川、香豆素、罗丹明、呫吨、荧光素、硼二吡咯甲烷(BODIPY)染料或其衍生物，包括但不限于BODIPY FL、BODIPYR6G、BODIPY TR、BODIPY TMR、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650和BODIPY 650/665、Cy5、Cy5.5、Cy7、VivoTag-680、VivoTag-S680、VivoTag-S750、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750、AlexaFluor790、Dy677、Dy676、Dy682、Dy752、Dy780、DyLight547、Dylight647、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750、IR800(高氯酸二甲基{4-[1,5,5-三(4-二甲基氨基苯基)-2,4-戊二烯亚基]-2,5-环己二烯-1-亚基}铵)、IRDye 800CW、IRDye 800RS、IRDye 700DX、ADS780WS、ADS830WS和ADS832WS。

在当前公开的成像剂的其他实施方案中，报告部分是光声报告分子，并且光声报告分子选自由以下组成的组：染料或纳米颗粒。在具体的实施方案中，染料包括荧光染料。在更具体的实施方案中，荧光染料选自由以下组成的组：吲哚菁绿(ICG)、Alexa Fluor750、伊文思蓝、BHQ3、QXL680、IRDye880CW、MMPSense 680、亚甲蓝、PPCy-C8和Cypate-C18。参见Wu等人，Int.J.Mol.Sci.,15,23616-23639(2014)。

在其他实施方案中，纳米颗粒选自由以下组成的组：等离子体纳米颗粒，包括但不限于金纳米球、金纳米壳、金纳米棒、金纳米笼、金纳米星和金纳米簇、量子点、纳米金刚石、聚吡咯纳米颗粒、硫化铜纳米颗粒、石墨烯纳米片、氧化铁-金核-壳纳米颗粒、Gd₂O₃纳米颗粒、单壁碳纳米管、负载染料的全氟化碳纳米颗粒和超顺磁性氧化铁纳米颗粒。

在当前公开的成像剂的其他实施方案中，报告部分是拉曼活性报告分子，并且拉曼活性报告分子选自由以下组成的组：单壁碳纳米管(SWNT)和表面增强的拉曼散射(SERS)剂。在具体的实施方案中，SERS剂包括用拉曼活性报告分子标记的金属(例如金或银)纳米颗粒。在更具体的实施方案中，拉曼活性报告分子包括荧光染料。在某些实施方案中，荧光染料选自由以下组成的组：Cy3、Cy5、罗丹明和硫属吡喃鎓(chalcogenopyrylium)染料。

在当前公开的成像剂的其他实施方案中，接头选自由以下组成的组：

(a)

其中：Rpt是报告部分；W₁选自由以下组成的组：C₁-C₆亚烷基、C₃-C₆亚环烷基和亚芳基；W₂选自由以下组成的组：-NR¹-(C＝O)-、-NR¹-(C＝S)-、-(C＝O)-NR¹-、-(C＝S)-NR¹-和-S-，其中每个R¹独立地是H或C₁-C₄烷基；每个R₂独立地是H或-COOR₃，其中每个R₃独立地是H、C₁-C₆烷基、C₂-C₁₂芳基或C₄-C₁₆烷基芳基；b是选自由以下组成的组的整数：0、1、2和3；d是选自由以下组成的组的整数：1、2、3、4、5、6、7和8；并且其中波浪线表示所述接头和所述肽之间的附接点；

(b)Rpt—X—Y—Z—W₃—

其中：Rpt是报告部分；X和Z各自独立地是C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈炔基、C₁-C₈杂烷基、C₂-C₈杂烯基、C₂-C₈杂炔基、C₁-C₈烷氧基或键，它们各自可以被0-5个R_A取代；Y和W₃各自独立地是-O-、-S(O)_p-、-NH-、-NR_B-、-CH＝CH-、-CR_B＝CH-、-CH＝CR_B-、-NH-CO-、-NH-CO₂-、-NR_B-CO-、-NR_B-CO₂-；-CO-NH-、-CO₂-NH-、-CO-NR_B-、-CO₂-NR_B-或键；p是0、1或2；R_A每次出现时是卤素、羟基、氨基、氰基、硝基、CO₂H、任选地取代的烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的单烷基氨基或二烷基氨基、任选地取代的烷基硫基、任选地取代的烷基亚磺酰基、任选地取代的烷基磺酰基、任选地取代的单烷基甲酰胺或二烷基甲酰胺、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基；并且R_B每次出现时是任选地取代的烷基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的单烷基氨基或二烷基氨基、任选地取代的烷基硫基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基；或者(c)氨基酸接头。

在具体实施方案中，成像剂是选自由以下组成的组的化合物：式(I)、式(II)和式(III)：

DK-A-221–(L)_n–Rpt(II)；或

DK-A-222–(L)_n–Rpt(III)；

其中：n是选自由0和1组成的组的整数；L是接头；并且Rpt是报告部分；以及其中报告部分或接头当存在时附接到构成式(I)、式(II)或式(III)的成像剂的肽的伯胺基团。

在某些实施方案中，接头当存在时附接到式(I)的化合物的¹³鸟氨酸(Orn)伯胺基团。在具体的实施方案中，报告部分包含DOTAGA螯合剂。在更具体的实施方案中，DOTAGA螯合剂还包含⁶⁴Cu放射性金属。

在更多的某些实施方案中，式(I)的化合物是：

本领域普通技术人员在回顾当前公开的主题时将认识到，螯合剂/放射性金属离子的多种组合适用于当前公开的成像剂。代表性螯合剂在本领域中是已知的。通过非限制性实例的方式，某些螯合剂和接头公开于美国专利申请公布第2015/0246144号和第2015/0104387号中，其中每一个都通过参考以其整体并入本文。

在一些实施方案中，成像剂能够在体外、体内和/或离体检测PD-L1。在一些实施方案中，成像剂能够在体内检测PD-L1。多种肿瘤表达PD-L1，并且其过表达在肿瘤细胞中被诱导，作为对肿瘤浸润性细胞毒性T细胞的响应的适应性机制(Topalian等人，2016)。技术人员将认识到，PD-L1可以包含修饰和/或突变，并且仍然适用于当前公开的方法，条件为它仍然可以被当前公开的成像剂检测到。

在一些实施方案中，当前公开的成像剂抑制PD-L1与其配体程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)相互作用的IC₅₀具有从约100nM至约1pM的范围。在一些实施方案中，IC₅₀小于100nM，在其他实施方案中，小于10nM，在其他实施方案中，小于8nM，在其他实施方案中，小于5nM，在其他实施方案中，小于4nM，并且在其他实施方案中，小于3nM。

术语“结合亲和力”是描述两种或更多种化合物以非共价关系彼此缔合有多强的特性。结合亲和力可以定性表征(诸如“强”、“弱”、“高”或“低”)或定量表征(诸如测量K_d)。

II.使用成像剂的检测方法

在一些实施方案中，当前公开的主题提供了用于检测免疫检查点蛋白诸如PD-L1的方法。在一些实施方案中，当前公开的主题提供了用于检测导致PD-L1过表达的疾病、紊乱或状况诸如癌症、炎症、感染等的方法。

在一些实施方案中，当前公开的主题提供了用于检测程序性死亡配体1(PD-L1)的成像方法，该方法包括：(a)提供有效量的成像剂，所述成像剂包含对程序性死亡配体1(PD-L1)具有结合特异性的肽和报告部分以及任选地接头的缀合物，其中接头当存在时连接肽和报告部分，而当接头不存在时，报告部分通过肽的氨基酸的伯胺直接附接到肽，如上文刚刚描述的；(b)使一种或更多种细胞或组织与成像剂接触；以及(c)制作图像以检测PD-L1。

如本文使用的，术语“成像”或“制作图像”是指通过测量化合物发射的能量使用任何成像技术来可视化可检测化合物。在一些实施方案中，术语“成像”是指在施用后，在定位化合物后通过测量化合物发射的能量，在向受试者施用后使用任何成像技术可视化可检测化合物。在一些实施方案中，成像技术包括向受试者施用可以在受试者外部被检测到的化合物。在一些实施方案中，图像借助于积聚在受试者的不同部位的成像剂的空间分布的差异来产生。在一些实施方案中，施用成像剂通过注射来进行。

术语“成像剂”意图包括能够通过例如正电子发射断层扫描成像术(PET)来成像的化合物。如本文使用的，“正电子发射断层扫描成像术成像”或“PET”并入了所有正电子发射断层扫描成像术成像系统或等同物，以及能够进行正电子发射断层扫描成像术成像的所有设备。当前公开的主题的方法可以使用任何这样的装置、或PET装置的变体或等同物、或与任何已知的PET方法结合来实施。参见例如美国专利第6,151,377号、第6,072,177号、第5,900,636号、第5,608,221号、第5,532,489号、第5,272,343号、第5,103,098号，其中每一个都通过引用并入。包括动物成像形式，例如微型PET(Corcorde Microsystems,Inc.)。

取决于报告部分，当前公开的成像剂可以用于PET、单光子发射计算机断层扫描成像术(SPECT)、近红外(荧光)、光声和拉曼成像。

在一些实施方案中，成像包括使用检测系统扫描整个受试者或患者，或受试者或患者的特定区域，并检测信号。然后，将检测到的信号转换成图像。所得图像应当由有经验的观察者诸如例如医师来读取。通常，成像在施用成像剂后约1分钟至约48小时进行。成像的精确时机将依赖于因素诸如所施用化合物的清除率，这对本领域技术人员将是容易明显的。成像的时间范围可以基于所用的放射性核苷酸而不同。在特定实施方案中，成像在施用后约1分钟和约4小时之间，诸如15分钟和30分钟之间、30分钟和45分钟之间、45分钟和60分钟之间、60分钟和90分钟之间以及60分钟和120分钟之间进行。在一些实施方案中，PD-L1的检测在向受试者施用成像剂后约60分钟立即进行。在一些实施方案中，成像可以在用标记有Zr-89的肽注射后24小时进行。在一些实施方案中，成像可以在用标记有I-124的肽注射后24小时进行。

已经获得图像后，本领域技术人员可以确定化合物的定位。使用该信息，技术人员可以确定例如是否存在状况诸如感染、炎症或癌症，状况的程度或受试者正在接受的治疗的效力。

在一些实施方案中，细胞或组织与成像剂的接触在体外、体内或离体进行。“接触”意指导致当前公开的主题的至少一种成像剂与至少一个细胞或组织物理接触的任何行为。因此，它可以包括使细胞或组织暴露于足以导致至少一种成像剂与至少一个细胞或组织接触的量的成像剂。在一些实施方案中，该方法可以通过在受控环境诸如培养皿或管中将成像剂和细胞或组织引入且优选地混合来体外或离体实施。在一些实施方案中，该方法可以被体内实施，在该情况下接触意指使受试者中的至少一个细胞或组织暴露于当前公开的主题的至少一种成像剂，诸如经由任何适合的途径将成像剂向受试者施用。在一些实施方案中，细胞或组织与成像剂的接触在受试者中进行。

术语成像剂的“有效量”是，当使用本文描述的技术例如正电子发射断层扫描成像术(PET)成像时提供可读信号所必需或足够的量。有效量可以依赖于因素诸如受试者的大小和体重、疾病的类型或特定化合物而不同。例如，化合物的选择可以影响“有效量”的构成。本领域普通技术人员将能够研究本文所包括的因素，并且无需过度实验就能够做出关于化合物的有效量的确定。

通过当前公开的方法在其许多实施方案中诊断或治疗的受试者期望地是人类受试者，然而应当理解的是，本文描述的方法对于所有脊椎动物物种有效，所有脊椎动物物种被意图包括在术语“受试者”中。因此，“受试者”可以包括用于医疗目的，诸如用于诊断或治疗现有疾病、紊乱、状况的人类受试者，或用于医疗目的、兽医目的或发育目的动物受试者。合适的动物受试者包括哺乳动物，其包括但不限于灵长目动物，例如人类、猴、猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猕猴等；牛科动物，例如牛(cattle)、牛(oxen)等；绵羊类(ovine)，例如绵羊(sheep)等；山羊类(caprines)，例如山羊(goat)等；猪类，例如猪(pig)、猪(hog)等；马科动物，例如马、驴、斑马等；猫科动物，包括野猫和家猫；犬科动物，包括狗；兔形目动物，包括家兔、野兔等；以及啮齿目动物，包括小鼠、大鼠、豚鼠等。动物可以是转基因动物。在一些实施方案中，受试者是人类，包括但不限于胎儿、新生儿、婴儿、少年和成年的受试者。此外，“受试者”可以包括患有疾病、紊乱或状况的或被怀疑患有疾病、紊乱或状况的患者。因此，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。受试者还包括动物疾病模型(例如在实验中使用的大鼠或小鼠等)。在一些实施方案中，受试者是人类、大鼠、小鼠、猫、狗、马、绵羊、牛、猴、禽或两栖动物。

通常，当前公开的成像剂可以通过任何合适的施用途径向受试者施用用于检测疾病、紊乱或状况，所述合适的施用途径包括口服、经鼻、经粘膜、经眼、直肠、阴道内、或肠胃外(包括静脉内、肌肉内、皮下、髓内的注入，以及鞘内、直接心室内、静脉内、关节内、胸骨内、滑液内、肝内、病灶内、颅内、腹膜内、鼻内或眼内的注入)、脑池内、局部(如通过粉末、软膏或滴剂(包括眼药水)，包括含服和经舌下、透皮，通过吸入喷雾剂)、或本领域中已知的其他递送模式。

如本文所使用的措辞“全身施用”、“全身地施用”、“外周施用”和“外周地施用”意指施用组合物使得其进入受试者或患者的系统，并且因此经受代谢，和其他相似的过程，例如皮下或静脉内施用。

如本文所使用的措辞“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”意指通常通过注入的、不同于肠内和局部施用的施用模式，并且包括而不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、眼内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注入和输注。

在一些实施方案中，成像剂显示出至少3:1的靶与非靶比率。在一些实施方案中，术语“靶”是指显示出PD-L1蛋白过表达的细胞或组织，并且术语“非靶”是指不显示PD-L1蛋白过表达的细胞或组织。

在一些实施方案中，成像方法用于检测癌症。受试者或患者的“癌症”是指具有致癌细胞的典型特征的细胞的存在，致癌细胞的典型特征例如，不受控制的增殖、专门化功能的损失、永生性、显著的转移潜能、抗凋亡活性的显著增加、快速的生长和增殖速率以及某些特征形态和细胞标志物。在一些情况下，癌细胞将呈肿瘤的形式；这样的细胞可以局部存在于动物内，或作为独立的细胞在血流中循环，例如白血病细胞。如本文使用的癌症包括新诊断或复发的癌症，包括但不限于母细胞瘤、上皮癌(carcinomas)、胶质瘤、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤和肉瘤。如本文使用的癌症包括但不限于，头癌、颈癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌诸如三阴性乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、白血病/淋巴瘤、子宫癌、皮肤癌、内分泌癌、泌尿系统癌、胰腺癌、胃肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、脑癌和腺瘤。在一些实施方案中，癌症包括0期癌症。在一些实施方案中，癌症包括I期癌症。在一些实施方案中，癌症包括II期癌症。在一些实施方案中，癌症包括III期癌症。在一些实施方案中，癌症包括IV期癌症。在一些实施方案中，癌症是难治性和/或转移性的。

如本文使用的，“肿瘤”是指所有的赘生性细胞生长和增殖，不论恶性或良性，以及所有的癌前和癌性细胞和组织。如本文使用的，“实体瘤”是通常不含囊肿或液体区域的异常组织块。作为非限制性实例，实体肿瘤可以在脑、结肠、乳腺、前列腺、肝、肾、肺、食道、头颈部、卵巢、子宫颈、胃、结肠、直肠、膀胱、子宫、睾丸和胰腺中。在一些实施方案中，成像方法用于检测实体肿瘤。

在又其他的实施方案中，成像方法用于检测转移性癌症。

在一些实施方案中，成像方法用于检测感染。传染病，诸如由任何真菌或细菌引起的感染，被设想使用当前公开的主题进行检测。如本文使用的，术语“感染”是指致病生物体对宿主生物体的身体组织的入侵、致病生物体的繁殖以及宿主组织对这些生物体及其产生的毒素的反应。感染包括但不限于医院感染，外科手术感染，和严重腹部感染、诸如腹膜炎、胰腺炎、胆囊脓胸和胸膜脓胸，以及骨感染、诸如骨髓炎。还设想了检测败血症、脓毒症和脓毒性休克、由于使用免疫抑制剂药物引起的感染或使用免疫抑制剂药物后的感染、癌症化学治疗、辐照、污染的i.v.液、出血性休克、局部缺血、创伤、癌症、免疫缺陷、病毒感染和糖尿病。微生物感染的实例，诸如细菌和/或真菌感染，包括但不限于由于以下引起的感染：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、大肠杆菌(E.coli)、克雷伯氏菌属的种(Klebsiella sp.)、肠杆菌属的种(Enterobacter sp.)、变形杆菌属的种(Proteus sp.)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、葡萄球菌属的种(Staphylococcus spp.)，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)和凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌属的种(Enterococcus sp.)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、拟杆菌属的种(Bacteroides spp.)、不动杆菌属的种(Acinetobacter spp.)、幽门杆菌属的种(Helicobacter spp.)、假丝酵母属的种(Candidasp.)等。包括由于耐药微生物，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(VRE)引起的感染。在一些实施方案中，感染是细菌感染。在一些实施方案中，感染是慢性细菌感染。在一些实施方案中，细菌感染是结核。在一些实施方案中，感染是播散性结核。在一些实施方案中，感染可以是甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎和/或人类免疫缺陷病毒。

在一些实施方案中，成像方法用于检测炎症。与炎症相关的紊乱的实例包括但不限于哮喘、自身免疫疾病、自身炎症疾病、乳糜泻、憩室炎、肾小球肾炎、化脓性汗腺炎、超敏反应、炎性肠病、间质性膀胱炎、耳炎、盆腔炎、再灌注损伤、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、移植排斥、狼疮，包括系统性红斑狼疮、和血管炎。在一些实施方案中，炎症由类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮引起。

PD-L1结合其受体PD-1，可见于活化的T细胞、B细胞和髓样细胞上，以调节活化或抑制。因此，当前公开的检测PD-L1表达的成像剂可以用于检测免疫细胞，诸如T细胞、B细胞和髓样细胞。在一些实施方案中，当前公开的成像剂检测肿瘤中的免疫细胞。在一些实施方案中，当前公开的成像剂检测受试者中免疫细胞的全身分布。在一些实施方案中，成像方法用于检测感染细胞中的免疫细胞应答。在一些实施方案中，成像方法用于检测炎性细胞中的免疫细胞应答。

在一些实施方案中，当前公开的成像方法检测和/或测量PD-L1表达的变化，诸如治疗诱导的PD-L1表达的变化。这些方法可以用于确定特定治疗方法的效力和/或确定有效的治疗剂量范围。

III.包含成像剂的试剂盒

在一些实施方案中，当前公开的主题提供了如上文描述的用于检测程序性死亡配体1(PD-L1)的试剂盒，该试剂盒包括成像剂，所述成像剂包含对程序性死亡配体1(PD-L1)具有结合特异性的肽和报告部分以及任选地接头的缀合物，其中接头当存在时连接肽和报告部分，而当接头不存在时，报告部分通过肽的氨基酸的伯胺直接附接到肽。

典型地，当前公开的主题的试剂盒包括当前公开的成像剂和如何进行至少一种当前公开的方法的说明。成像剂通常以足以检测至少一个受试者或患者的PD-L1至少一次的量在试剂盒中提供。试剂盒还可以包括进行当前公开的方法的至少一个实施方案所必需的一些或所有其他试剂和用品。

在其最简单的形式中，根据当前公开的主题的试剂盒包括包含根据当前公开的主题的至少一种类型的成像剂的容器。在一些实施方案中，试剂盒包括多于一个容器，其中每个容器可以包含可用于进行当前公开的方法的一个或更多个实施方案的至少一种成像剂或其他物质。

容器可以是适用于包含可用于进行当前公开的方法的当前公开的组合物或另一种物质的任何材料。因此，容器可以是小瓶或安瓿。它可以由任何合适的材料诸如玻璃、塑料、金属或纸或纸制品制成。在实施方案中，它是可以诸如通过塞子、塞子和压接密封件、或塑料或金属帽密封的玻璃或塑料安瓿或小瓶。包含在容器中的成像剂的量可以由本领域技术人员根据当前公开的主题来选择，而无需基于相关的许多参数过度实验。

在实施方案中，容器作为通常包括包装材料的较大单元(为简单起见，以下称为试剂盒)的组成部分提供。当前公开的试剂盒可以包括合适的包装和说明和/或与组合物的使用相关的其他信息。通常，试剂盒由坚固材料诸如纸板和塑料制成，并且可以包含直接印刷在其上的说明或其他信息。试剂盒可以包括包含本发明的组合物的多个容器。在这样的试剂盒中，每个容器可以是相同大小，并且容器彼此包含相同量的组合物，或者不同容器可以具有不同大小和/或包含不同量的组合物或具有不同成分的组合物。本领域技术人员将立即意识到，本发明设想了容器大小和内容物的许多不同配置，并且因此本文不需要具体列举所有的排列。

虽然本文使用了特定术语，但它们仅用于一般的和描述性的意义，而非用于限制的目的。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与这个当前描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

遵循长期存在的专利法公约，当在本申请包括权利要求中使用时，术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”是指“一个或更多个”。

因此，例如，提及“受试者(a subject)”包括多于一个受试者，除非上下文清楚地是相反的(例如，多于一个受试者)等等。

贯穿本说明书和权利要求书，术语“包括/包含(comprise)”、“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”以非排他性含义使用，除了在上下文另外要求的情况下。同样地，术语“包括”及其语法变体被意图是非限制性的，使得列表中项目的列举将不排除可以被取代或被添加到所列出的项目的其他相似的项目。

为了本说明书和所附的权利要求书的目的，除非另外指示，否则本说明书和权利要求书中使用的表示量、大小、尺寸、比例、形状、式(formulation)、参数、百分比、参数、数量、特征、和其他数值的所有数字在所有情况下应理解为由术语“约”修饰，即使术语“约”可能未明确地与该值、量或范围一起出现。因此，除非相反地指示，否则在以下说明书和所附的权利要求书中列出的数值参数不是精确的且不需要是精确的，但是如期望的可以是近似的和/或更大的或更小的，反映了公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素，依赖于当前公开的主题寻求获得的期望的特性。例如，当术语“约”是指值时，可以意图涵盖与所指定的量在一些实施方案中±100％、在一些实施方案中±50％、在一些实施方案中±20％、在一些实施方案中±10％、在一些实施方案中±5％、在一些实施方案中±1％、在一些实施方案中±0.5％、以及在一些实施方案中±0.1％的变化，因为这样的变化对于进行所公开的方法或使用所公开的组合物是适当的。

此外，当术语“约”连同一个或更多个数字或数值范围使用时，应当被理解为是指所有这样的数，包括范围中所有的数字以及通过将边界延伸至高于和低于所列出的数值的范围的修饰。按端点列举的数值范围包括归入该范围内的所有数字，例如全部整数，包括其分数(例如1至5的列举包括1、2、3、4和5，以及其分数例如1.5、2.25、3.75、4.1等)以及该范围内的任何范围。

实施例

以下实施例已经被包括以向本领域普通技术人员提供用于实施当前公开的主题的代表性实施方案的指导。根据本公开内容和本领域技术的一般水平，本领域技术人员可以意识到，以下实施例意图仅意图是示例性的，并且可以使用许多变化、修改和改变而不偏离当前公开的主题的范围。随后的综合描述和具体实施例仅意图用于说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制通过其他方法制备本公开内容的化合物。

实施例1

使用高度特异性肽用PET快速检测肿瘤PD-L1

1.1背景.肿瘤微环境(TME)中增加的PD-L1通过经由与由活性免疫浸润物表达的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)受体结合使免疫浸润物失活而引起免疫抑制(Okazaki等人，2007，和Topalian等人，2015)。肿瘤细胞上的PD-L1表达和TME中的PD-L1表达被认为是用于患者分层和治疗监测的潜在生物标志物(Herbst等人，2014)。美国食品和药品管理局最近批准了一项基于PD-L1 IHC的补充诊断测试，表明PD-L1可能是用于体内成像的合适的靶(Roach等人，2016)。

目前，免疫组织化学(IHC)检测是用于PD-L1/PD-1靶向治疗的治疗监测的研究最充分的预测性生物标志物，但是这种方法及其可获得的FDA批准的PD-L1诊断IHC测试有显著的局限性(Roach等人，2016；Mansfield和Dong，2016；和Phillips等人，2015)，受不一致的抗原阳性定义、不一致的检测抗体、不足的测定间一致性以及肿瘤内和肿瘤间异质性妨碍，损害了准确性和可靠性，并且因此妨碍了治疗决策。此外，用于测试的通过活组织检查获得的组织样品通常非常有限，并且可能是分子分型(profiling)所需要的，以鉴定对现有治疗赋予敏感性或耐受性的其他途径中的可靶向致癌突变(例如表皮生长因子受体(EGFR)、间变性淋巴瘤激酶、DNA修复基因)。这样珍贵的样品经常使得进行用于可靠展现PD-L1表达的多种PD-L1评估不实用。预期的是，能够无创评估PD-L1表达水平、动力学和分布，并在施用后60分钟内在标准临床成像工作流程内无创评估PD-L1表达水平、动力学和分布的新的PET成像剂将克服可用的(基于IHC的)评估PD-L1表达状态方法的缺点。

肿瘤免疫微环境的动态性质为开发允许快速评估TME的PET示踪剂提供了理论基础。在这方面，低分子量、基于肽的PET示踪剂由于其快速清除和合成易处理性因而是临床应用的理想候选物(Reubi等人，2008；Sun等人，2016)。靶向生长抑素受体和趋化因子受体4(CXCR4)的基于肽的PET示踪剂在患者中产生高的靶-对-非靶比率(Herrmann等人，2016；Gourni等人，2011)。

最近，已经报道了特异性结合PD-L1的肽(参见2016年3月17日公布的Miller等人的国际PCT专利申请公布第WO2016039749号Macrocyclic Inhibitors of the PD-1/PD-L1and CD80(B7-1)/PD-L1 Protein/Protein Interactions；2016年6月23日公布的Mapelli等人的国际PCT专利申请公布第WO2016/100285号Immunomodulators；2016年6月23日公布的Sun等人的国际PCT专利申请公布第WO2016/100608号Immunomodulators；2016年8月11日公布的Miller等人的国际PCT专利申请公布第WO2016/126646号Immunomodulators，其中每一个都以其整体并入本文)；然而，它们体内检测PD-L1表达的潜力尚未被确立。假设的是那些PD-L1结合肽具有快速和高特异性地检测肿瘤中的PD-L1表达的潜力。为了测试这个假设，从报道的肽文库选择了最适用于缀合且具有单一伯胺的肽WL12，并评估了其与PD-L1的结合模式。将DOTAGA螯合剂缀合到WL12，用于用⁶⁴Cu放射性标记以产生[⁶⁴Cu]WL12(Eisenwiener等人，2000)，评估了肽衍生物与PD-L1的结合亲和力，并确定了具有可变PD-L1表达的细胞系中的[⁶⁴Cu]WL12的体外摄取。作为概念验证，在具有组成型人类PD-L1表达(hPD-L1)的中国仓鼠卵巢(CHO)肿瘤和等基因阴性对照肿瘤(CHO)的NSG小鼠中，对[⁶⁴Cu]WL12通过PET成像检测体内PD-L1表达的能力进行了评估。[⁶⁴Cu]WL12的组织分布和靶特异性通过离体生物分布和阻断研究得到证实。

1.2结果和讨论

1.2.1WL12以与PD-1的模式相似的模式结合PD-L1。为了评估WL12与PD-L1的结合模式，使用人类PD-L1与PD-1结合的共晶体结构(PDB ID:4ZQK)(Zak等人，2015)以在PD-1的位置处对接WL12。鉴于大环化合物WL12的结构复杂性，我们首先进行了构象搜索，并使用Glide将构象异构体对接到PD-L1上的PD-1结合位点中(Friesner等人，2004；Halgren等人，2004)。WL12形成β折叠样结构并在两个大环链的骨架之间形成两个氢键(图1B)。圆二色性实验支持这种构象(图2)。PD-1与结合的WL12的结构的重叠揭示了两者之间的结合模式的相似性。形成与PD-L1的结合界面的PD-1的两条β链与WL12的伪链重叠(图1C)。WL12的L-亮氨酸插入到与PD-1的Ile134相同的小疏水口袋中，并且两个正亮氨酸残基中的一个与PD-1的Ile126对齐。除了这些疏水相互作用外，WL12和PD-L1之间还存在许多氢键。WL12上的天冬酰胺的甲酰胺与Tyr123形成氢键，甘氨酸酰胺与Gly120的骨架形成氢键，且丝氨酸羟基与Gln66相互作用。鸟氨酸残基被暴露且不参加与PD-L1的结合。不希望受任何一种特定理论的束缚，这表明，通过胺偶联方法缀合合适的标记不会破坏WL12与PD-L1的结合。

1.2.2[⁶⁴Cu]WL12示出了体外PD-L1特异性细胞摄取。使用¹³鸟氨酸(Orn)伯胺来缀合DOTAGA，然后使用其制备非放射性Cu²⁺类似物(WL12-Cu)并用⁶⁴Cu放射性标记。所得的WL12D和对应的WL12-Cu通过HPLC来纯化，通过质谱术来表征(图2、图3、图4、图5、图6和图7)，并经受体外评估。为了评估WL12及其衍生物抑制PD-L1与PD-1相互作用的半最大抑制浓度(IC₅₀)，优化了先前描述的依赖于荧光共振能量转移的体外测定(Woodard等人，2014)。观察到WL12、WL12D和WL12-Cu的IC₅₀值分别为22nM、23nM和2.9nM(图8A、图9、图10和以下表1)。这些数据表明，WL12在用DOTAGA修饰¹³Orn侧链并螯合到Cu²⁺后，保持与PD-L1的高结合亲和力。

表1：WL12-未修饰的肽、WL12D-与DOTAGA缀合的肽、WL-Cu²⁺-WL12D的铜复合物。95％CI-95％置信区间。

化合物	IC<sub>50</sub>[nM]	95％CI[nM]	K<sub>i</sub>[nM]	95％CI[nM]
					WL12	20.3	11.4-46.1	1.1	5.3-21.5
WL12D	22.2	14.7-33.7	10.4	6.8-15.7
					WL-Cu<sup>2+</sup>	2.97	2.17-4.5	1.38	1.01-1.89

为了证明PD-L1特异性和细胞摄取，产生了具有高比放射性(1.9±0.1mCi/μg)和放射化学纯度(>95％)的[⁶⁴Cu]WL12(图11和图12)。与阴性对照CHO细胞相比，与[⁶⁴Cu]WL12一起孵育1h的hPD-L1细胞示出了孵育剂量的摄取>50％，且结合的放射性增加43倍(图8C)。然后通过将hPD-L1细胞与[⁶⁴Cu]WL12单独孵育或将hPD-L1细胞与[⁶⁴Cu]WL12在1μM阻断剂量的WL12存在下孵育来测试结合特异性。观察到在肽的存在下结合的[⁶⁴Cu]WL12减少>95％，表明[⁶⁴Cu]WL12与PD-L1的结合是特异性的(图8C)。在分别显示出高和低PD-L1表达的两种三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系MDAMB231和SUM149中，进一步测试了[⁶⁴Cu]WL12检测内源性PD-L1表达的能力(图8B)。与SUM149细胞相比，MDAMB231细胞的放射性的摄取高两倍，进一步证实了[⁶⁴Cu]WL12对PD-L1的特异性(图8C)。PD-L1表达的流式细胞术分析证明平均荧光强度值的顺序如下：hPD-L1>MDAMB231>SUM149>CHO，这与放射性的摄取相关(r＝0.9977，图13和图14)。共同地，这些结果证明[⁶⁴Cu]WL12以PD-L1表达依赖的方式体外结合癌细胞。

1.2.3[⁶⁴Cu]WL12在具有高PD-L1表达的肿瘤中特异性积聚。为了了解[⁶⁴Cu]WL12的体内特异性和分布，在具有hPD-L1和CHO肿瘤的小鼠(n＝4)中进行了PET-CT成像研究。PET成像研究示出了[⁶⁴Cu]WL12在hPD-L1肿瘤中的稳健摄取。早在10min可以观察到hPD-L1肿瘤中的增加的摄取，并保持直到注射后24h(图15A和图16)，且通过IHC证实了PD-L1表达(图15B)。除了肿瘤外，在肾和肝中也观察到了高摄取。为了证实PET成像观察结果，在注射[⁶⁴Cu]WL12后1h和2h进行了生物分布研究(分别为n＝3和n＝5)。考虑到在PD-L1阳性肿瘤中观察到的快速摄取，认为在1h和2h的生物分布对于开发¹⁸F标记的类似物将提供更多信息。与成像研究一致，hPD-L1肿瘤在1h时显示放射性摄取占注射剂量/g的百分比(％ID/g)值为14.9±0.8。相比之下，对照CHO肿瘤摄取为4.0±0.6％ID/g(图17)。肾和肝中的摄取也相对较高，分别具有34.4±3.1％ID/g和24.2±2.5％ID/g的摄取值。hPD-L1肿瘤的肿瘤对肌肉比率和肿瘤对血液比率分别为25.6±1.9和4.7±1.2，与[⁶⁴Cu]WL12提供具有高信噪比的PD-L1特异性图像的能力一致(图15A和图15B)。

在2h时进行的生物分布研究示出了相似的谱，在肾、肝和肿瘤中具有放射性降低的趋势(图17)。为了证明体内特异性，将[⁶⁴Cu]WL12与过量WL12(50μg，2mg/kg)共注射，并在2h时进行生物分布研究。在hPD-L1肿瘤中观察到％ID/g值的>75％减少(P<0.0001)，而在对照CHO肿瘤中未观察到显著差异。肾也示出了减少的摄取。在其他组织中未观察到放射性摄取的显著差异。肝中的摄取增加是用基于⁶⁴Cu的成像剂经常观察到的趋势(Anderson等人，2009)，其可能是由于Cu²⁺从螯合剂解离，并随后转螯合至血浆蛋白，诸如白蛋白和铜蓝蛋白所致(Smith-Jones等人，1991；Wadas等人，2007；和Boswell等人，2004)。增加的肾摄取也表明了肽的主要的肾清除。在脾、胸腺和褐色脂肪(已知表达PD-L1且报告示出放射性标记的抗体摄取增加的组织)中观察到的低摄取(Chatterjee等人，2016；Hettich等人，2016；Josefsson等人，2016)，表明[⁶⁴Cu]WL12对小鼠PD-L1具有非常低的亲和力或没有亲和力。进一步支持[⁶⁴Cu]WL12对人类PD-L1的特异性，除了肾，这些组织中的摄取在对照组和阻断剂量组之间没有注意到显著差异。成像和生物分布研究共同证明，[⁶⁴Cu]WL12快速且特异性地结合人类PD-L1。

1.2.4CD结果.为了评估水性和膜模拟溶液中的WL12二级结构，在水、DPC和SDS的组合中运行了CD光谱术。如图2中呈现的，Trp残基对220-240nm范围内的WL12肽的CD光谱具有显著影响。在无表面活性剂的溶液中，观察到在约220nm处的最低值，和在约230nm处的正的肩峰。在添加表面活性剂后，两个带轻微地红移，并注意到后者的强度增加。这些带可归因于Trp-Trp耦合。两个Trp发色团非常接近，并且它们表现为单一的吸收单元。因此，它们的激发态相互作用，并且该二聚体系统的激发态在两个单体上都是离域的(delocalized)。这种被称为激子效应的现象导致激发态分裂成两个分量，一个来自两个单体激发的同相组合，另一个来自异相组合。(Grishina 1994，和Kelly 2000)。

无序肽的CD光谱典型特征在于低于200nm的单一带，而α-螺旋呈现208nm和222nm处的两个负带及192nm处的一个正带，并且β-折叠结构通常显示217nm处的负带及195nm处的正带。因此，WL12肽的CD光谱上的～205nm处的强负带和～190nm处的强正带可能表明无规卷曲构象和更有序的结构的混合。CD光谱的解卷积表明在所有测量条件下β-折叠含量都较高(～40％)。然而，Trp发色团对WL12的远UV CD光谱的强贡献影响了二级结构含量的定量分析的精度，并且应当谨慎解释结果。

1.3概述总之，使用高特异性PD-L1结合肽[⁶⁴Cu]WL12，用PET体外和体内证明了快速肿瘤PD-L1检测和PD-L1选择性。[⁶⁴Cu]WL12的药物代谢动力学和生物分布表明，使PD-L1检测符合放射性示踪剂施用后60min内对患者成像的标准临床工作流程是可行的。以整体对所有恶性病变中的PD-L1表达的快速和无创检测为对患者进行分层用于免疫调节治疗提供了前所未有的机会。

1.4材料和方法

1.4.1材料：PD-L1结合肽WL12由CPC Scientific(Sunnyvale,CA)定制合成且纯度>95％。所有其他化学品购自Sigma-Aldrich或Fisher Scientific，除非另外说明。2,2',2”-(10-(2，6-二氧四氢-2H-吡喃-3-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(DOTAGA无水物)和[⁶⁴Cu]Cl₂分别购自CheMatech Macrocycle Design Technologies(目录#C109；Dijon,France)和The University of Wisconsin。所有细胞培养相关试剂购自Invitrogen，除非另外说明。多克隆抗人类IgG-Eu³⁺穴状化合物(Cryptate)(目录#61HFCKLA)和XL665-缀合小鼠单克隆抗6组氨酸抗体(目录#61HISXLA)购自Cisbio Assays(Bedford,MA)。重组人类PD-1Fc嵌合蛋白(目录#1086-PD-050)和重组人类PD-L1(B7-H1)-His标签蛋白(目录#9049-B7)从R&D Systems(Minneapolis,MN)获得。

1.4.2对接研究(docking studies)：为了进行WL12与PD-L1的对接，使用人类PD-1与PD-L1结合的晶体结构(PDB ID:4ZQK)作为模板。该模型首先使用Maestro(Release 2016-2:Maestro，10.6版，LLC,New York,NY,2016)中的ProteinPreparation Wizard制作(Sastry等人，2013)。这包括分配键顺序和形式电荷、添加氢原子及添加缺少的侧链。优化蛋白内的氢键网络(包括重定向巯基和羟基基团，对Asn、Gln和His侧链取样，以及预测His、Asp和Glu的质子化状态)，随后是简洁的最小化。去除PD-1的结构。对WL12的结构的构象搜索使用Prime Conformational Search(Release2016-2:Prime，4.4版，LLC,New York,NY,2016)来进行。选择了100个能量最低的构象异构体进行对接实验。对接用Glide(Release 2016-2:Glide，7.1版，LLC,New York,NY,2016)来进行，使用默认设置和输入环构象(Friesner等人，2004，Halgren等人，2004)。用于这些计算的软件由SBGrid策划(Morin等人，2013)。

1.4.3圆二色性(CD)测量：肽在无表面活性剂的水性溶液和在十二烷基磷脂酰胆碱(DPC)、十二烷基硫酸钠(SDS)以及以摩尔比5:1混合的DPC:SDS胶束的水性胶束溶液中的CD光谱，使用Jasco J-815分光偏振仪(Jasco,Easton,MD)来获得。所有测量使用0.15mg/mL肽溶液在25℃完成。实验在185-260nm范围内进行，并且以一式三份进行，以增加信噪比。最终光谱通过背景减法来校正，并按平均残基摩尔椭圆率MRME(度×cm²×dmol^-1)相比于波长λ(nm)分析。二级结构的含量使用CONTIN方法(Sreerama等人，2000)从光谱来计算。

1.4.4WL12-DOTAGA(WL12D)的合成：将3mg的肽(1.5μmol)溶解在0.5mL的DMF中，并与3.7mg的DOTAGA无水物(7.51μmol溶于0.5mL的DMF中)和20μl的二异丙基乙基胺(DIPEA)混合。将反应混合物在室温搅拌2h，并将产物在反相高效液相色谱(RP-HPLC)系统(VarianProStar)上纯化，用Agilent Technology 1260Infinity光电二极管阵列检测器(AgilentTechnologies,Wilmington,DE)，使用半制备型C-18Luna柱(5mm，10x 250mm Phenomenex,Torrance,CA)，并梯度洗脱，从98％H₂O(0.1％TFA)和2％MeOH(0.1％TFA)开始，以4mL/min的流速在60min内达到100％的MeOH。所期望的WL12D在44.5min时收集、蒸发、溶解在去离子水中并冻干，产生3.1mg(1.3μmol)的作为白色粉末的产物(产率：82.9％，图2)。将所得的缀合物溶解在H₂O-MeOH 50％(v/v)和0.1％的甲酸中，通过电喷雾电离质谱(ESI MS，Esquire3000Plus spectrometer,Bruker Daltonics,Billerica,MA)进行分析(图4)。理论化学式：C₉₁H₁₂₈N₂₂O₂₀S₂。观察到的ESI-MS m/z：2340.9-(M+1)⁺¹，1171.1-(M+2)⁺²/2和781.1-(M+2)⁺³/3。(预期的：2340.65)

1.4.5WL12-Cu²⁺复合物的制备：将1.5mg的WL12D(0.64μmol)溶解在200μL的乙酸钠(0.1M，用冰乙酸调节的pH＝4.5)并添加55μL的0.02M CuCl₂水溶液(1.1μmol)。将得到的反应混合物在65℃孵育30min，并通过如对WL12D描述的RP-HPLC纯化(图5)，冻干，并将所得的浅蓝色粉末通过ESI MS分析(图6)。然后将WL12-Cu²⁺复合物用于优化RP-HPLC条件，作为用于放射性标记的标准品，以及用于PD-L1和PD-1竞争结合测定(图7)。理论化学式：C₁₁₀H₁₅₆N₂₆O₂₉S。观察到的ESI-MS m/z：2402.6-(M+1)⁺¹，1201.9-(M+2)⁺²/2(预期的：2402.18)

1.4.6PD-L1和PD-1结合抑制测定：用于PD-L1结合PD-1的竞争性抑制测定从先前描述的Cisbio的讨论(Woodard等人，2014)中的基于荧光共振能量转移(FRET)的测定来优化。所有结合/抑制测定在21μL的FRET测定缓冲液(dPBS、牛血清白蛋白(0.1％，w/v)、Tween-20(0.05％v/v)和氟化钠(400mM))中进行。测定条件首先针对PD-1和PD-L1浓度进行优化。将终浓度为10nM、20nM和40nM的PD-1-Ig与终浓度范围从0.65nM至320nM的PD-L1-His标签一起孵育15min(每种浓度一式三份)，随后添加10μL含有抗人类IgG-Eu³⁺穴状化合物(IgG-Eu，终浓度2nM)和抗6HIS-XL665单克隆抗体(抗6HIS-XL665，终浓度40nM)的FRET缓冲液。在室温孵育1小时后，添加1μL的NaF测定缓冲溶液(终浓度400mM)，并使用Perkin ElmerVictor3 1420多标签计数器(Perkin Elmer,Waltham,MA)来读取板。

对于竞争性抑制测定，将抑制剂(WL12、WL12D和WL12-Cu²⁺，范围：1pM至1mM)与PD-L1-His标签(最终80nM)在10μL测定缓冲液中预孵育15min，随后添加5μL的含有PD-1-Ig(终浓度20nM)的测定缓冲液并孵育15min。然后添加5μL的具有IgG-Eu(终浓度2nM)和抗6HIS-XL665(终浓度40nM)的测定缓冲液。在室温孵育1小时后，添加1μL的NaF(终浓度400mM)，并在Perkin Elmer Victor3 1420多标签计数器上读取板。IC₅₀和K_i值通过将数据拟合到S形剂量响应曲线和Cheng-Prusoff方程来计算，并推导出在80nM的浓度的PD-L1的K_D＝70nM。所有实验以一式三份进行并重复三次。

1.4.7.[⁶⁴Cu]WL12的产生：将购自University of Wisconsin的⁶⁴CuCl₂蒸发至小体积，并通过用0.1M乙酸钠溶液滴定转化为⁶⁴Cu(OAc)₂。对于放射性标记，将在100μL的乙酸钠中的约10μg的WL12D肽缀合物(4.27nmol)与～185MBq(～5mCi)的⁶⁴Cu(OAc)₂混合，并在65℃孵育30min。使用配有放射性单通道放射检测器(型号105S；Bioscan,Poway,California)和设置在280nm的Varian ProStar UV吸收检测器的Varian ProStar系统，将得到的放射性示踪剂在C-18(Luna,5μm,10×250mm；Phenomenex)半制备柱上纯化。应用梯度洗脱，以98％H₂O(0.1％TFA)和2％MeOH(0.1％TFA)开始，以5mL/min的流速在70min内达到90％MeOH。[⁶⁴Cu]WL12在～56.2min收集(未标记的肽的保留时间：53.6min)，蒸发，用含有5％DMSO和两滴Tween 20的盐水稀释，用于体外和体内评估。以52.09±6.3％的产率获得了[⁶⁴Cu]WL12，且比活性为1.9±0.11mCi/μg。

1.4.7.细胞系：中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1(以下称为CHO)和三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系MDAMB231购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas,VA)，并传代少于3个月，其后从小瓶的冷冻细胞启始新培养物。SUM149细胞系由Medical University ofSouth Carolina的Stephen P.Ethier博士善意提供，并在Johns Hopkins遗传资源机构通过STR谱系分析验证。将SUM149细胞在具有5％FBS、1％P/S和5μg/mL胰岛素以及0.5μg/mL氢化可的松的Ham’s F-12培养基中维持。所有其他细胞系在37℃在含有5％CO₂的气氛的培养箱中在ATCC推荐的培养基中培养。稳定表达人类PD-L1(以下称为hPD-L1)的CHO细胞系在我们的实验室产生(Chatterjee等人，2016)，并在具有10％FBS、1％P/S和2mg/mL G418的F-12K培养基中维持。

1.4.8.流式细胞术：通过离心收集悬浮液中的细胞，并使用无酶、基于PBS的细胞解离缓冲液(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)分离贴壁细胞。将收获的细胞用流式细胞术缓冲液(具有2mM EDTA和0.5％FBS的1xPBS)洗涤两次。根据制造商的方案，用与藻红蛋白缀合的抗人类PD-L1抗体(称为BD-MIH-PE，克隆#MIH1，目录#557924，BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)将细胞染色，并在FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson)上进行分析。记录了至少20,000事件。

1.4.9.体外结合：[⁶⁴Cu]WL12与hPD-L1、CHO、MDAMB231和SUM149细胞的体外结合通过将1μCi的放射性示踪剂与1×10⁶个细胞在37℃孵育1h来确定。孵育后，将细胞用冷PBS洗涤三次，然后在自动化γ计数器(1282Compugamma CS,Pharmacia/LKBNuclear,Inc.,Gaithersburg,MD)上计数。为了证明[⁶⁴Cu]WL12的PD-L1特异性结合，用1μM的WL12肽或人源化抗PD-L1抗体阿特珠单抗进行了PD-L1阻断。平均荧光强度值与％孵育剂量(％ID)摄取相关。所有细胞摄取研究针对每个细胞系一式三份地进行，并重复三次。

1.4.10.动物模型：动物研究根据JHU动物护理和使用委员会(Animal Care andUse Committee)(ACUC)批准的方案来进行。六至八周龄、雌性、非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷γ(NSG)小鼠从JHU免疫受损动物中心(Immune Compromised Animal Core)获得。将小鼠用10×10⁶的CHO-PDL1和CHO细胞皮下植入到上侧腹的相对侧中。当肿瘤达到200-300mm³的体积时，将小鼠用于成像或生物分布实验。

1.4.11.小鼠异种移植物的PET-CT成像：将小鼠用200μL的盐水中150μCi的[⁶⁴Cu]WL12静脉注射(n＝3)，在放置在扫描仪上之前在3％异氟烷下麻醉。在成像期间，将小鼠维持在1％的异氟烷水平。PET图像在ARGUS小动物PET/CT扫描仪(Sedecal,Madrid,Spain)中以两个床位置以10min/床来获得。在每次PET扫描结束时进行CT扫描(512个投影)，用于解剖学配准(co-registration)。PET数据使用二维有序子集期望最大化算法(2D-OSEM)来重建，并针对死时间和放射性衰变校正。每cc的％ID值基于从已知的放射性量获得的校准因子来计算。最终的数据可视化和图像生成使用(FEI,Hillsboro,OR)来实现。

1.4.12.离体生物分布：将具有分别具有高PD-L1表达和低PD-L1表达的hPD-L1肿瘤和CHO肿瘤的小鼠(n＝5)用40μCi的[⁶⁴Cu]WL12静脉注射。在[⁶⁴Cu]WL12注射后1h和2h，收获血液、肿瘤和选择的组织，称重并在自动化γ计数器(Perkin Elmer-2480AutomaticGamma计数器-Wizard23"Wallac)中计数。对于阻断研究，将小鼠用2mg/kg(50μg)的未修饰的肽与放射性示踪剂共注射。每克组织注射剂量的百分比(％ID/g)值基于信号衰减校正和针对一式三份测量的外部[⁶⁴Cu]标准的归一化计算。示出的生物分布数据是平均值±平均值的标准误差(SEM)。

1.4.13.数据分析：统计分析使用Prism 6软件(GraphPad Software,La Jolla,CA)使用非配对双尾t检验来进行。P值<0.05被认为是显著的，并且比较参考是具有低PD-L1表达的细胞系或肿瘤。流式细胞术数据使用FlowJo软件(Tree Star,Ashland,OR.)来分析。IC₅₀和K_i值通过使用Prism 6软件(GraphPad)来计算。

实施例2

对于PD-L1靶向药物开发的PD-L1定向的PET

2.1综述.癌症免疫治疗(CIT)正通过在多种恶性肿瘤中产生持久的响应来改善患者存活。然而，近70％的用免疫检查点靶向治疗处理的患者对单一治疗无响应(Lipson等人，2015；Topalian等人，2015)。存在对鉴定精确免疫治疗响应的决定因素的尚未满足的需求。检查点组合治疗已经延长了生存，但经常以增加的免疫相关不良事件(irAE)为代价，这表明需要增加对组合策略的了解来减轻毒性(Marrone等人，2016)。迫切需要专注的研究，以鉴定用于免疫检查点治疗的新的生物标志物及其组合，以增强其广度和持久性并减少irAE。因此，当前公开的主题的一个方面是开发将基于PD-L1的PET成像用于开发和评估PD-L1靶向治疗药物的策略。与目前依赖基于血浆或组织(活组织检查)的生物标志物的策略(这在晚期患者中是侵入性且不切实际的)不同，所提出的发明将使用PD-L1 PET成像在相关体内模型中建立肿瘤中的PD-L1靶向治疗剂(抗体、肽、小分子)的剂量相比于占据的关系。

2.1.1.基于PET对PD-L1动态的定量实现的进展：最近发现，在NSCLC、TNBC肿瘤和结肠肿瘤内，PD-L1靶向治疗剂AtzMab及其小鼠嵌合体(PRO)的积聚并不完全依赖于PD-L1表达，因为如通过IHC和流式细胞术检测到的，具有高PD-L1表达的H2444 NSCLC异种移植物积聚的放射性标记的AtzMab的量比在具有低PD-L1表达的乳腺癌异种移植物中观察到的那些显著地低(Chatterjee等人，2016)。相似地，在同基因小鼠肿瘤模型中，全身注射的放射性标记的PRO主要与肿瘤脉管系统缔合，并且显示出在肿瘤中很少扩散到肿瘤实质中或不扩散到肿瘤实质中(Deng等人，2016)。这些发现可能可归因于病理生理学特征，包括肿瘤内间质压力升高(Baxter等人，1989；Baxter等人，1990)，这阻止了肿瘤内治疗剂的积聚，这是治疗耐药性的重要因素(Goel等人，2011)。此外，这些效应可能潜在地阻碍主要作用于肿瘤细胞和肿瘤免疫浸润物的PD-L1靶向治疗剂接近肿瘤细胞。因此，肽诸如WL12/[¹⁸F]WL12或相似的放射性标记的肽可以比抗体更有效和高效地穿透肿瘤组织到达靶细胞，因为它们的分子尺寸小得多。因此，通过使用适当的分析和校正，[¹⁸F]WL12测量或使用相似放射性标记的肽进行的测量可能有助于鉴定/优化治疗性mAb在肿瘤组织内的靶向的肿瘤细胞处实现期望的占据所需的剂量。

因此，PD-L1定向的PET已被应用于PD-L1靶向的药物开发。为了评估其潜在价值，在一项创新性策略中，[⁶⁴Cu]WL12已被用于评估和比较治疗性PD-L1抗体阿特珠单抗(AtzMab)的剂量相比于通过PET观察到的在肿瘤中的mAb定位方面的肿瘤PD-L1结合特征。本文公开的临床前观察结果将具有临床上可操作的发现。在患者中，相似的基于PD-L1 PET的成像测量可以潜在地被用于指导治疗剂量强化以改善治疗结果(Yang等人，2013；OudeMunnink等人，2016)。此外，这样的PD-L1 PET测量可以潜在地通过使其在肿瘤部位的潜在靶结合的定量成为可能来指导新的PD-L1靶向治疗剂的未来开发。

2.1.2.在药物开发和评估中使用PD-L1 PET的创新：当前公开的创新性的基于PD-L1肽的PET成像策略允许评估目前和未来的抗PD-L1治疗剂在其最相关的肿瘤处的靶结合能力(即占据和保留时间)。影响血清mAb浓度的动态PD-L1密度/周转和表达PD-L1的肿瘤负荷的程度，以及肿瘤灌注的完整性和所得的肿瘤内mAb积聚，显著影响治疗效力。放射性标记的抗体先前曾被用于定义所需的mAb给药水平和计算靶表面分子占据(Deng等人，2016)，但该方法的关键限制是在作用肿瘤部位的PD-L1占据只能被推测。当前公开的方法将有效地解决这个问题，定量在肿瘤部位的PD-L1占据。除了如此考虑关键肿瘤生理参数对有效mAb剂量和达到的积聚的贡献外，我们预计，我们的新的基于PET示踪剂的量度将改善目前对为何一些具有PD-L1阳性肿瘤的患者对CIT无响应的理解，并且可以指导剂量强化策略以达到在肿瘤中的期望占据水平。

2.1.3.评估PD-L1-PET在开发和评估PD-L1靶向治疗药物中的效用：

2.1.3.1理论基础

靶向PD-L1和PD-1的治疗性抗体已经在具有PD-L1阳性肿瘤的患者中的一小部分中显示出卓越效力。在目前使用的剂量，响应者和非响应者群体展示出在PBMC中的PD-L1占据约为65％，但对PBMC中的PD-L1占据与肿瘤中的PD-L1占据之间的动态关系的了解很少(Brahmer等人，2012)。此外，在肿瘤模型中的研究发现，在一些肿瘤中，PD-L1抗体被限制于肿瘤脉管系统(Deng等人，2016)。放射性标记的AtzMab的初步结果在NSCLC异种移植物中重述了这些发现(Chatterjee等人，2016)。综上所述，这些发现表明，需要改善了解肿瘤中的PD-L1占据及其对剂量的依赖性，以及抗PD-L1抗体在肿瘤中的保留时间，以更好地指导PD-L1定向治疗。不希望受任何一种特定理论的束缚，认为PD-L1 PET将为评估抗PD-L1抗体(或肽和小分子)在靶结合和保留时间方面的这样的PK量度提供有价值的工具。此外，认为PET指导的给药将导致肿瘤内的免疫谱变化，该变化可以通过PD-L1 PET来定量，并与治疗诱导的肿瘤PD-L1表达和免疫细胞浸润物的变化相关。

2.1.3.2代表性数据：可用的抗PD-L1抗体和PD-1衍生物的放射性标记形式已经被用于无创地检测PD-L1表达(Chatterjee等人，2016；Deng等人，2016；Hettich等人，2016；Josefsson等人，2016；Lesniak等人，2016；Heskamp等人，2015；Maute等人，2015)。为此，选择了治疗性抗体AtzMab，因为它的人类和小鼠的交叉反应性和它的PD-L1检测特异性通过PET、SPECT和光学成像，在免疫缺陷小鼠中的人类TNBC和NSCLC异种移植物中以及在4T1同基因乳腺肿瘤模型中得到证明(Chatterjee等人，2016；Lesniak等人，2016)(图20A、图20B、图20C和图20D)。AtzMab以高亲和力结合人类PD-L1和小鼠PD-L1两者，且解离常数(K_d)分别为0.43nM和0.13nM(Irving等人，2012；Powles等人，2014)。AtzMab被临床评估用于治疗晚期或转移性膀胱癌(Powles等人，2014)、黑色素瘤(Hamid等人，2013)、NSCLC(Spigel等人，2013)、RCC(Cho等人，2013)、TNBC和数种其他癌症。

发现在两种癌症类型(NSCLC和TNBC)中，放射性标记的AtzMab在肿瘤内的积聚是PD-L1特异性的(Chatterjee等人，2016；Lesniak等人，2016)。还发现[¹¹¹In]AtzMab在肿瘤内的积聚不完全依赖于PD-L1表达，这表明间质液压力、肿瘤对流和外渗的空间变化可能是贡献因素中的一些，这是抗体经常观察到的问题(Baxter等人，1989)。MDAMB231 TNBC异种移植物显示出比皮下和原位H2444 NSCLC肿瘤更高的组织积聚(按每克注射剂量的百分比；％ID/g)，皮下和原位H2444 NSCLC肿瘤通过流式细胞术和IHC分析两者显示出更高的PD-L1表达(Chatterjee等人，2016)。通过利用我们的新的基于肽的PD-L1 PET示踪剂的特异性和灵活性，我们通过考虑影响肿瘤中抗体分布的众多因素并可应用于多种PD-L1靶向抗体的完全不同的方法，体内分析了表达PD-L1的肿瘤内的AtzMab积聚的动力学。

2.1.3.3通过PD-L1 PET评估PD-L1治疗性抗体在肿瘤中的积聚：在评估WL12对PD-L1的特异性时，发现WL12与AtzMab竞争PD-L1上的相同结合位点。这提供了一种新的且先前未预期到的使用PD-L1定向的PET在需要的肿瘤部位处评估AtzMab治疗的手段。对PD-L1抗体在肿瘤中的分布的改善的了解可能影响临床抗体给药和治疗监测。因此，测试了[⁶⁴Cu]WL12-PET评估AtzMab结合肿瘤内PD-L1的能力。如通过[⁶⁴Cu]WL12-PET和生物分布研究来定量的，在注射了AtzMab(20mg/kg)的小鼠中，hPD-L1肿瘤中的放射性积聚减少了80％(图21A、图21B和图21C)。观察到除了肾外的其他组织中放射性摄取减少，但没有显著差异，表明[⁶⁴Cu]WL12结合对人类PD-L1是特异性的(Lesniak等人，2016)。通过体外结合研究，我们发现未标记的WL12浓度依赖性地抑制Cy5-缀合的AtzMab的PD-L1结合，且IC₅₀为37.8nM，证实两种配体竞争PD-L1结合(图21D)，但是AtzMab在抑制[⁶⁴Cu]WL12结合方面比WL12更强，并且将允许在AtzMab给药后检测肿瘤中未被占据的PD-L1水平。共同地，这些结果证明WL12和AtzMab的结合位点重叠，并表明[⁶⁴Cu]WL12-PET用于评估表达PD-L1的肿瘤中AtzMab的靶结合和保留时间(靶结合效力)的潜在效用。这种方法的适用性扩展到具有PD-L1表达天然增加的癌细胞系。在三阴性乳腺癌异种移植物中，观察到[⁶⁴Cu]WL12检测高PD-L1表达的MDAMB231异种移植物中AtzMab积聚的能力(图22)。还观察到接受20mg/Kg AtzMab剂量的小鼠中PD-L1 PET成像剂摄取的显著减少。

考虑用其他PD-L1靶向治疗性抗体诸如阿维鲁单抗(Avelumab)(AvMab)的相似的应用。AvMab是一种人类IgG1抗体，目前正处在数种癌症包括NSCLC(NCT02395172)、晚期RCC和胃癌的多种三期临床试验中。分析了PD-L1与AvMab复合的晶体结构，并且发现AvMab如同WL12一样与PD-L1上的一些相同氨基酸(R113、D61和E58)相互作用(Liu等人，2016)，表明基于WL12的示踪剂用于评估AvMab和其他可能的PD-L1定向的治疗性mAb的体内靶结合的潜在有利效用。这些研究将验证PD-L1-PET评估正在进行的PD-L1 mAb治疗在靶结合效力方面的潜力。

实施例3

通过治疗诊断抗体进行的PD-L1结合的无创定量

3.1综述.程序性死亡配体-1(PD-L1)靶向抗体治疗被用于近四分之一的涉及免疫检查点抑制剂的临床试验。为确保最佳免疫应答的总PD-L1水平、PD-L1治疗剂对其的占据、以及给药与肿瘤内靶结合的程度和持续时间的相关性，目前仍不了解。肿瘤中PD-L1的占据可以受到PD-L1的表达以及肿瘤内在和外在参数的动态变化的影响，这改变血浆和肿瘤抗体浓度。然而，外周药物代谢动力学和药效动力学评估没有捕捉到这些关键变化。为了解决PD-L1治疗剂的剂量-药物暴露关系的空缺，研究了能够定量PD-L1表达的动态变化的放射性标记的PD-L1结合肽。结构分析显示了肽和治疗性单克隆抗体(mAb)与PD-L1相互作用的重叠，这允许使用正电子发射断层扫描成像术(PET)来测量治疗性mAb在肿瘤中的占据。在多种异种移植物模型中，PET成像和生物分布研究显示，可变PD-L1表达及其被PD-L1治疗性抗体饱和可以被定量。此外，测量了三种不同抗体在肿瘤中的PD-L1占据，并定量了对肿瘤中PD-L1占据的剂量和时间效应。基于肽的PD-L1 PET有希望作为用于优化剂量和治疗方案的工具，目的是减少免疫相关的不良事件。

更具体地，当前公开的主题使用定量正电子发射断层扫描成像术(PET)成像来解决体内表征肿瘤的PD-L1表达水平和PD-L1 mAb靶结合的需要。它对于重复测量肿瘤中的靶表达有效(Willman等人，2008)且对于药物开发和评估有效，但是仅被很少地用于肿瘤学中的受体占据研究(Rathkopf等人，2013)，并且尚未被具体实现用于PD-L1或PD-1mAb的药物代谢动力学和药效动力学评估(Peterson等人，2008；Linden等人，2006)。

最近开发了一种用⁶⁴Cu放射性标记的小肽，[⁶⁴Cu]WL12，其以高亲和力和特异性结合人类PD-L1，并在放射性示踪剂施用120min内产生高对比度图像(Chatterjee等人，2017)。本实施例描述了用于PD-L1检测的[⁶⁴Cu]WL12-PET，并定量了肺癌和乳腺癌实验模型中PD-L1表达的动态变化。评估了[⁶⁴Cu]WL12 PET评估三种不同的FDA批准的mAb(阿特珠单抗、阿维鲁单抗和德瓦鲁单抗(Durvalumab)(DurMab))的PD-L1结合的能力。此外，对PD-L1mAb剂量与在肿瘤处的PD-L1结合的程度和持续时间的相关性进行了无创评估。

3.2背景.癌症免疫治疗(CIT)对多种恶性肿瘤产生持久的响应。一个优选的CIT靶是检查点蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)。许多肿瘤表达PD-L1作为逃避肿瘤浸润性细胞毒性T细胞的手段(Topalian等人，2016)，经由直接结合PD-1受体引起免疫抑制(Okazaki等人，2007；Topalian等人，2015)。抑制PD-L1:PD-1相互作用的多种PD-L1靶向的单克隆抗体治疗剂(mAb)正处在临床试验中，并且接受这些治疗的患者中近30％展示出持久的响应(Topalian等人，2015；Lipson等人，2015)。然而，尽管取得了这些成功，但对有助于异常响应模式诸如延迟或混合的肿瘤消退的生物学机制的理解还不完整，这些异常响应模式构成了临床挑战，并限制了临床医师推进检查点治疗的能力。

抗PD-L1 mAb的治疗作用主要被认为发生在肿瘤微环境内(Topalian等人，2015)。然而，药效动力学(PD)数据有限；它们不反映作用部位(肿瘤)处的靶结合，它们仅在有限数量的试验中被报道，并且它们是使用外周血单核细胞(PBMC)获得的。对于PD-L1抗体BMS-936559，已经报道范围从0.1mg/kg至10mg/kg的剂量的均一靶占据为64-70％(Brahmer等人，2012)。为确保最佳免疫应答的关于PD-L1 mAb在最相关部位(即肿瘤)的分布，以及给药与靶结合的程度和持续时间的相关性，许多仍不了解。

用于PD-L1/PD-1靶向治疗的治疗监测的研究最充分的预测性生物标志物是PD-L1免疫组织化学(IHC)(Gibney等人，2016)。然而，该方法具有重大的局限性，因为它需要可获得性受限的活组织检查样品，并且可能不能正确反映瞬时动态的免疫肿瘤微环境(TME)以及PD-L1表达的肿瘤内和肿瘤间异质性(Mansfield等人，2016；McLaughlin等人，2016)。存在对原发性和转移性肿瘤中的PD-L1表达水平、动力学和PD-L1治疗药物分布的无创评估并且在标准临床成像工作流程内进行无创评估的尚未满足的需求。

3.3.结果

3.3.1PD-L1与WL12和PD-L1 mAb相互作用的结构分析和体外验证.WL12是14个氨基酸的肽，其以高亲和力抑制PD-L1:PD-1相互作用(IC₅₀：(20nM)(Chatterjee等人，2017)。早先的分子建模分析表明了PD-L1:WL12和PD-L1:PD-1的相互作用表面的重叠，且PD-L1的四个氨基酸(Y56、E58、D61和A113)有助于显著的分子相互作用(Chatterjee等人，2017)。与治疗性抗体阿特珠单抗(AtzMab)复合的PD-L1的埋藏表面大于与PD-1复合的PD-L1的埋藏表面(Lee等人，2017)。不希望受任何一种特定理论的束缚，认为PD-L1上的WL12相互作用表面也与临床上可获得的治疗性mAb的重叠，因为它们被相似地设计以抑制PD-L1:PD-1相互作用。为了测试这一点，将WL12的预测的结合构象与PD-L1 mAb的进行了比较。所有mAb之间以及PD-1和WL12之间的AA接触的重叠，揭示了包含PD-L1残基Y56、E58、A113、M115和Y123的共同结合结构域。如PD-L1分子表面的可视化中揭示的(图33A、图34A)，重叠区域(青色)形成深口袋，并充当用于所有相互作用点的锚点。在表面积方面，AtzMab(红色)与更多的PD-L1表面相互作用，且来自抗体的环与共同结合核心的所有侧面上的残基产生分子接触，并与来自PD-1(紫色)、WL12(绿色)、阿维鲁单抗(AveMab，橙色)和德瓦鲁单抗(DurMab，蓝色)的相互作用表面重叠。

为了支持上述结构分析，Cy5标记的AtzMab、AveMab和DurMab通过将抗体与商业上可获得的Cy5荧光N-羟基琥珀酰亚胺酯缀合来制备，随后在组成型表达PD-L1的CHO细胞(Cho-hPD-L1)和天然表达PD-L1的MDAMB231乳腺癌细胞中用WL12进行竞争性抑制测定(Chatterjee等人，2016)。观察到WL12剂量依赖性抑制CY5-PD-L1 mAb与PD-L1的结合，且抑制浓度为从2nM-5nM(图33B)。还检测了HCC827和H226非小细胞肺癌(NSCLC)细胞。其中每一种都天然表达PD-L1，在5nM WL12的存在下与荧光形式的AtzMab、AveMab和DurMab一起孵育。流式细胞术示出了结合荧光显著减少(P<0.001)，进一步证明WL12破坏抗体-PD-L1相互作用的能力(图34C和34D)。通过当使用CXCR4特异性抗体MDX1338时未观察到结合荧光的变化，获得了WL12:PD-L1相互作用的特异性的进一步证实。将PD-L1阳性(HCC827、H226、MDAMB231和hPD-L1)和PD-L1阴性(Sum149和CHO)细胞与用⁶⁴Cu放射性标记的WL12类似物([⁶⁴Cu]WL12)一起孵育。先前证明WL12类似物在hPD-L1/CHO细胞中以高亲和力(IC₅₀<20nM)和选择性体外和体内结合PD-L1，但是尚未在具有可变表达的人类癌细胞系中验证(Chatterjee等人，2017)。与PD-L1阴性细胞相比，观察到PD-L1阳性细胞中[⁶⁴Cu]WL12的表达依赖性高摄取(P<0.0001)。此外，作为对PD-L1结合特异性的进一步检查，与PBS处理的对照相比，当用60nM mAb处理时，观察到所有PD-L1阳性细胞的[⁶⁴Cu]WL12摄取的显著阻断(P<0.0001)(图33C)。结果表明，[⁶⁴Cu]WL12可以用于检测肿瘤中的游离PD-L1水平，以及监测PD-L1 mAb与PD-L1的结合。

3.3.2通过AtzMab定量肿瘤PD-L1结合.为了体内无创地评估治疗性mAb在肿瘤处的PD-L1结合，研究了NSCLC异种移植物模型。选择那些模型是因为近50％的NSCLC为PD-L1阳性，且PD-L1 IHC被用作接受免疫检查点治疗的具有NSCLC的患者的预测性生物标志物(Mansfield等人，2016)。将具有分别表现出低和中度PD-L1表达的H226和HCC827细胞来源的异种移植物的NOD scidγ小鼠(图36A)用静脉内施用的单一剂量的AtzMab(20mg/kg持续24h)处理。[⁶⁴Cu]WL12注射后2h获得的PET图像示出了与H226相比，[⁶⁴Cu]WL12在HCC827肿瘤中的积聚更高。与盐水处理的对照组相比，AtzMab处理的小鼠的肿瘤中放射性的积聚存在明确减少，表明可用的PD-L1位点的水平降低(图35A和图35B)。PET成像结果通过离体测量生物分布进一步证实(图35D和图35E、图36B和图36C)，其示出了与盐水对照相比，在AtzMab处理的小鼠中，每克注射剂量的[⁶⁴Cu]WL12百分比值(％ID/g)的显著减少：在具有H226异种移植物的小鼠中为34％(P<0.0001)，并且在具有HCC827异种移植物的小鼠中为47％(P<0.001)。通过异种移植物的PD-L1 IHC证实了PD-L1表达水平(图35C和图35F)。结果证明[⁶⁴Cu]WL12可以用于体内定量AtzMab在肿瘤处靶向PD-L1。

为了评估单一剂量的AtzMab对靶向肿瘤中不同PD-L1水平的效应，在来源于CHO-hPD-L1细胞系的肿瘤中进行了PET和生物分布研究，CHO-hPD-L1细胞系具有比NSCLC细胞高四倍至十倍的PD-L1表达(图36)。与对照相比，用AtzMab(20mg/kg持续24h)处理的具有CHO-hPD-L1/CHO肿瘤的小鼠在CHO-hPD-L1肿瘤中示出了[⁶⁴Cu]WL12摄取的显著减少(图35G)。生物分布研究示出了，与AtzMab处理的肿瘤相比，在CHO-hPD-L1肿瘤中[⁶⁴Cu]WL12结合减少77％(图35H、图36D)(P<0.0001)，展示了对AtzMab肿瘤PD-L1靶向的测量。在PD-L1阴性CHO肿瘤中观察到低水平的[⁶⁴Cu]WL12摄取，这与用AtzMab处理的hPD-L1肿瘤中观察到的相似。这些观察结果通过分别在hPD-L1肿瘤和CHO肿瘤中观察到的强免疫反应性和弱免疫反应性被证实(图35I)。结果证明，[⁶⁴Cu]WL12-PET可以检测肿瘤中的PD-L1表达的分级水平，并且单一的20mg/kg AtzMab剂量可以在肿瘤中结合宽范围的PD-L1水平。

3.3.3.定量PD-L1表达的动态变化.已知PD-L1响应于多种细胞因子而上调，重要的是干扰素γ(IFNγ)，这有助于PD-L1表达的动态和时空异质性(Taube等人，2015；Taube等人，2012)。评估了[⁶⁴Cu]WL12体内定量肿瘤内的诱导型PD-L1表达的稳健性，以确定通过AtzMab处理阻断这样上调的PD-L1是否可通过[⁶⁴Cu]WL12-PET来监测(图37A、图37B、图37C、图37D、图37E和图37F)。

为此，产生了具有多西环素诱导型PD-L1表达的A549 NSCLC细胞系(A549-iPD-L1)。A549是在基线表达低PD-L1的Kras G12S肺腺癌细胞系。将其用含PD-L1的一体化慢病毒pINDUCER20载体转导(Meerbrey等人，2011)，用G418选择，通过流式细胞术证实PD-L1诱导(图37A)，并用于体外和体内研究。WL12阻断了Cy5-PD-L1-mAb与多西环素处理的A549-iPDL1细胞的结合，证实了WL12的特异性(图37B)。此外，将细胞与[⁶⁴Cu]WL12孵育示出了，相比于未处理的细胞和PD-L1低的A549细胞，多西环素处理的细胞的放射性摄取增加了5.5倍(P<0.0001)。在60nM AtzMab、AveMab和DurMab的存在下，[⁶⁴Cu]WL12与多西环素处理的A549-iPDL1细胞的结合显著降低(65％，P>0.0001)(图37C)。体内研究证实了这些体外研究，示出了在多西环素处理72h后，A549-iPDL1 NSCLC肿瘤中[⁶⁴Cu]WL12的积聚比A549对照肿瘤高65％(P>0.0001)。如通过[⁶⁴Cu]WL12-PET和生物分布研究所定量的，与对照A549肿瘤相比，20mg/kg AtzMab处理组的肿瘤中[⁶⁴Cu]WL12摄取的增加降低了>75％(图37D和图37E)。肿瘤的IHC分析展示了A549-iPDL1中有强PD-L1信号，但A549肿瘤中没有，证实了成像和生物分布结果(图37F)。总之，这些结果证明了[⁶⁴Cu]WL12检测PD-L1表达水平的动态变化及其被AtzMab阻断的潜力。因此，预期PET将在标准临床工作流程中定量PD-L1表达的动态变化方面发挥关键作用，为指导治疗决策提供新的方法。

3.3.4.通过不同抗体定量肿瘤PD-L1结合.已经开发了放射性标记的抗PD-L1抗体，并且已经证明了它们无创地评估人类肿瘤异种移植物和同基因鼠肿瘤模型中的PD-L1表达的潜力(Chatterjee等人，2016；Heskamp等人，2015；Maute等人，2015；Deng等人，2016；Hettich等人，2016；Josefsson等人，2016)。虽然这样的放射性标记的抗体缀合物现在被临床使用来检测PD-L1(NCT02453984)及对其他肿瘤特异性蛋白成像(Gebhart等人，2016)以及确定抗体动力学，但是它们的常规临床应用是受限的。为了增强对比度和病变检测(Pandit-Taskar等人，2015；Oosting等人，2016)，需要具有更快清除时间(数小时相比于数天)的放射性示踪剂(Wu,2014)。另一个限制是，使用放射性标记的抗体进行的观察对所研究的抗体高度特异，并且依赖于抗体特性，诸如化合价、形状、大小、等电点和剂量，其中每一个都影响其药物代谢动力学。mAb的这些固有的生物物理特征还影响血浆半衰期、组织暴露和最终效力。需要一种新的方法，其：(i)考虑PD-L1抗体的靶结合，同时(ii)考虑mAb的特性，以及(iii)适用于所有抗体。

评估了[⁶⁴Cu]WL12-PET无创地定量三种FDA批准的抗体AtzMab、AveMab和DurMab中的每一种在肿瘤处的PD-L1结合的能力。用AtzMab、AveMab或DurMab处理具有MDAMB231肿瘤的NSG小鼠，并且24h后用[⁶⁴Cu]WL12-PET对其成像(图39A、图39B、图39C和图39D)。在所有处理的小鼠中，与盐水对照相比，肿瘤中信号较低，证实了肿瘤PD-L1结合导致的游离PD-L1的水平低和通过mAb的放射性示踪剂阻断。肿瘤的离体定量证实了这些观察结果，并证明在注射后120min，mAb处理的小鼠的肿瘤中[⁶⁴Cu]WL12的摄取与盐水对照相比少约60％(P<0.0001)(图39E)。盐水对照的IHC分析展示了肿瘤中的PD-L1强度为中等到高(图39F)。结果证明，无论每种抗体的不同生物物理特性、血浆和组织动力学，PD-L1治疗性mAb的肿瘤PD-L1结合可以通过[⁶⁴Cu]WL12-PET来定量。

3.3.5.剂量对肿瘤处的PD-L1占据的效应.肿瘤处的抗体动力学受肿瘤内在参数和外在参数两者的控制(Agoram,2009)。最近发现，除了PD-L1表达本身以外的因素可以减少PD-L1靶向治疗剂AtzMab及其小鼠嵌合体(PRO304397)在NSCLC、TNBC和结肠肿瘤中的积聚(Chatterjee等人，2016)。此外，以小于1mg/kg的剂量，全身注射的放射性标记的抗PD-L1抗体PRO304397主要与肿瘤脉管系统缔合，并且在表达PD-L1的同基因小鼠肿瘤模型中显示出最小的向肿瘤实质中的扩散(Deng等人，2016)。这些发现可能可归因于因素诸如升高的肿瘤内间质压力(Baxter等人，1989；Baxter等人，1990)，这阻碍了mAb在肿瘤中的积聚，导致耐药性(Goel等人，2011)。这些效应也可能阻碍大的PD-L1定向剂对靶向肿瘤细胞和免疫浸润物的接近。PD-L1和PD-1治疗剂在肿瘤处的占据测量尚未报道，并且限于使用PBMC进行的评估。

为了评估剂量对在肿瘤处肿瘤PD-L1占据的效应，将具有MDAMB231肿瘤的小鼠注射从0.009mg/kg体重至24mg/kg体重的递增剂量的AtzMab。二十四小时后，在注射[⁶⁴Cu]WL12后2h进行了成像和生物分布研究。接受0.06mg/kg的小鼠的PET图像示出，与未治疗的对照相比，[⁶⁴Cu]WL12的摄取没有差异，表明AtzMab在肿瘤处的PD-L1占据较低(图41A)。在0.6mg/kg和3.2mg/kg剂量，肿瘤中的信号强度成比例下降，表明对于3.2mg/kg剂量，抗体在肿瘤处的靶结合接近100％。

然后，肿瘤中积聚的放射性(％ID/g)被用于拟合抑制性S形E_max模型。使用肽放射性示踪剂[⁶⁴Cu]WL12检测到的％ID/g数据适当地拟合并描述了我们实验中使用的AtzMab剂量与肿瘤处游离PD-L1配体的减少之间的关系(图41B和图41C)。导致肿瘤中的50％的最大PD-L1结合的AtzMab剂量(ID₅₀)或游离PD-L1配体从基线的最大分数下降的AtzMab剂量(I_max)估计为0.43mg/kg(表2)。导致90％和96％的I_max的ID₉₀和ID₉₆分别对应为0.87mg/kg和1.19mg/kg。这些剂量水平与Deng等人报道的PRO304397的1mg/kg剂量相当(Deng等人，2016)。假设抗PD-L1抗体和嵌合抗PD-L1抗体PRO304397的相似平均V_ss为50mL/kg，试验性地估计ID₅₀、ID₉₀和ID₉₆产生的预期平均血浆浓度分别为59nM(8.6mcg/mL)、120nM(17.4mcg/mL)和164nM(23.8mcg/mL)。这些结果表明了使用在肿瘤处进行的测量进行剂量选择和优化的潜力。

抗体与其靶的相互作用与小分子的不同，因为抗体结合可以影响PD-L1的天然动力学，诸如PD-L1的稳定化或内化以及抗治疗剂抗体的产生，这可以对抗体肿瘤和血清动力学具有显著影响(Tabrizi等人，2006)。AtzMab的早先药物代谢动力学研究报道了低于0.6-1mg/kg的非线性PK和高于1mg/kg剂量的线性PK，并且注意到发展了ATA的患者的血清抗体浓度趋于减少的趋势(Stroh等人，2017)。然而，这种肿瘤内在和外在参数对PD-L1抗体PK和肿瘤处的占据的效应尚不了解。

为了研究[⁶⁴Cu]WL12-PET检测肿瘤处的抗体动力学的时间变化的能力，将具有MDAMB231肿瘤的NSG小鼠分别注射产生非线性和线性动力学的0.6mg/kg和10mg/kg或20mg/kg剂量的AtzMab，并在24h和120h进行PET成像和生物分布研究。在24h，与未处理的对照相比，[⁶⁴Cu]WL12摄取显著减少，还反映在所有三个剂量组的肿瘤摄取值中(图41D和图41E)。与24h相比，在120h时0.6mg/kg剂量组的[⁶⁴Cu]WL12摄取显著增加。相比之下，10mg/kg或20mg/kg处理组的[⁶⁴Cu]WL12摄取没有显著的时间差异。在120h时，0.06mg/kg处理组和盐水对照组肿瘤中的[⁶⁴Cu]WL12摄取相似，表明了药物从肿瘤中清除，并反映了AtzMab在较低剂量的非线性PK。结果表明，在小鼠模型中，PD-L1结合的剂量依赖性变化和时间依赖性变化两者可以通过[⁶⁴Cu]WL12-PET来评估。

3.3.6.讨论

数百项临床试验中正在研究免疫检查点治疗剂，其中约25％靶向PD-L1。由于接受PD-L1治疗剂的患者中仅30％对治疗有响应，因此正在使用转录、遗传和表观遗传学研究对这些治疗的响应和耐药性的分子和细胞基础进行研究。剂量与跟效力相关的肿瘤处的药物积聚和靶饱和的相关性尚不了解。此外，抗体治疗剂的大尺寸限制了肿瘤穿透，并对作用部位处的药效动力学评估构成了独特的挑战。一直缺少既考虑肿瘤内在参数又考虑肿瘤外在参数、在肿瘤处实时提供PD-L1饱和/占据数据、且可以被广泛应用的有效方法。这种了解的缺少阻碍了剂量选择、剂量优化、治疗剂开发和减少毒性的治疗优化。在我们当前的研究中，显示了放射性标记的PD-L1结合肽可以无创地检测可变的和动态的PD-L1表达水平，并且可以用于测量肿瘤处的占据，同时考虑肿瘤内在参数(PD-L1表达、再循环、间质压力)和外在参数(抗体同种型、动力学、ATA、分解代谢)，因此提供了监测肿瘤处PD-L1:PD-1相互作用抑制性PD-L1抗体的治疗活性的通用手段。

虽然先前已经开发了评估肿瘤中PD-L1表达的基于IHC的临床测试(Herbst等人，2014；Roach等人，2016；Meng等人，2015)，但是PD-L1 IHC仅考虑了单一病变的一小部分(0.1％)。这种方法具有显著的局限性，因为肿瘤微环境中的PD-L1表达是空间和时间异质性的，并且免疫治疗响应本质上是延迟的、复杂的和异位的。此外，用于测试的通过活组织检查获得的组织样品通常非常有限，并且可能是分子分型(profiling)所需要的，以鉴定对现有治疗赋予敏感性或耐受性的其他途径中的可靶向致癌突变(例如BRCA1、BRCA2、PARP)(Nolan等人，2017)。这样珍贵的样品经常使得进行用于可靠展现PD-L1表达的多种PD-L1评估不实用(Gibney等人，2016)。这些问题在具有转移性疾病的患者(在其中免疫检查点治疗被广泛研究的群体)中加重。这些因素导致我们在推进免疫治疗方面的有限的成功。PD-L1表达和更广泛的肿瘤免疫微环境的动态性质，使开发允许快速评估TME的PET放射性示踪剂成为必要。当前公开的用[⁶⁴Cu]WL12的研究证明，PD-L1表达的可变和动态变化可以在标准临床工作流程内定量，对患者选择和监测治疗产生重要的临床意义。

PD-L1治疗性抗体已经成为癌症免疫治疗中的重要的剂。对于小分子，体外结合亲和力测量和占据研究常规地用于CNS疾病的剂量选择和药理学响应的预测(Lee等人，2006)。然而，大分子，诸如抗体，在基于体外结合亲和力预测体内受体占据方面构成了独特的挑战(Agoram,2009)。肿瘤中抗体的浓度受限制mAb的肿瘤内渗透的数个肿瘤内在参数影响，诸如抗原密度和周转、肿瘤负荷和肿瘤灌注。mAb的肿瘤和血浆浓度还受肿瘤外在因素，诸如亲和力、剂量、患者变异性、恶病质和抗治疗性抗体的产生的影响(Sheng等人，2017)。现有PK/PD预测模型依赖于体外和基于PBMC的测量来预测最佳剂量(Deng等人，2016)。然而，当前公开的主题现在证明，PET可以用于实时和无创地测量肿瘤处的治疗性抗体对PD-L1的占据。

通过外周药效动力学评估和PK/PD建模支持的放射性标记的抗体，诸如阿特珠单抗，常规地用于预测在肿瘤处实现所期望的PD-L1占据所需的mAb给药水平(Deng等人，2016)。这些测量和数学建模得出的占据预测经常是对给定抗体特异的，因为抗体的血浆和肿瘤浓度受抗体同种型和生物物理特性诸如电荷和化合价的影响，因此限制了这些观察结果向其他PD-L1 mAb的推广(Kamath,2016)。需要可以用于针对不断扩大的PD-L1治疗性mAb阵列评估肿瘤处的抗体动力学和靶结合潜力的工具。当前公开的主题解决了这个需求。计算机模拟建模研究，联合使用WL12-PET的体外和体内数据，证明肿瘤处的PD-L1饱和/占据可以被定量，这一概念可以应用于临床试验中的所有PD-L1治疗性mAb。

共同地，当前公开的数据证明，肿瘤中PD-L1表达的动态变化和治疗性抗体的PD-L1饱和/占据可以被无创地定量，具有两个特征，即独立于抗体特征，并考虑肿瘤内在和外在参数。对于三种不同的治疗性抗体，AtzMab、AveMab、DurMab，当前公开的将剂量与肿瘤处的PD-L1占据相联系的结果预期与治疗响应和给药效力具有相关性。

3.3.7.概述.

当前公开的主题证明，放射性标记的PD-L1结合肽可以无创地检测可变的和动态的PD-L1表达水平，并且可以用于测量肿瘤处的占据，同时考虑肿瘤内在参数(PD-L1表达、再循环、间质压力)和外在参数(抗体同种型、动力学、ATA、分解代谢)，因此提供了监测肿瘤处PD-L1:PD-1相互作用抑制性PD-L1抗体的治疗活性的通用手段。

用[⁶⁴Cu]WL12的研究证明，PD-L1表达的可变和动态变化可以在标准临床工作流程内定量，对患者选择和监测治疗产生重要的临床意义。

用于抗体的现有PK/PD预测模型依赖于体外和基于PBMC的测量来预测最佳剂量(Deng等人，2016)。然而，当前公开的主题证明，PET可以用于实时和无创地测量肿瘤处的治疗性抗体对PD-L1的占据。

需要可以用于针对不断扩大的PD-L1治疗性mAb阵列评估肿瘤处的抗体动力学和靶结合潜力的工具。当前公开的主题现在解决了这个需求。计算机模拟建模研究，联合使用WL12-PET的体外和体内数据，证明肿瘤处的PD-L1饱和/占据可以被定量，这一概念可以应用于临床试验中的所有PD-L1治疗性mAb。

参考文献

在说明书中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献表明目前公开的主题所属领域的技术人员的水平。在本说明书中提及的所有公布物、专利申请、专利和其他参考文献(例如网站、数据库等)通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个单独公布物、专利申请、专利和其他参考文献被具体和单独地指示通过引用并入的相同程度。将理解的是，虽然许多专利申请、专利和其他参考文献在本文中被提及，但这些参考文献并不构成任何这些文件形成本领域公知常识的部分的承认。在本说明书与任何并入的参考文献之间有冲突的情况下，应当以本说明书(包括其任何修改，该修改可能基于并入的参考文献)为准。本文使用了术语的标准的领域公认的含义，除非另外指示。本文使用了各种术语的标准缩写。

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虽然为了清楚理解的目的通过说明和实例的方式相当详细地描述了前述主题，但是本领域技术人员将理解，在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。

序列表：

SEQ ID NO.：1

WL12氨基酸序列＝环-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Leu-Hyp-Trp-Ser-Trp(甲基)-NMeNle-NMeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2)

SEQ ID NO.：2

DK-A-221氨基酸序列＝环-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Glu-Hyp-Trp-Ser-Trp(羧甲基)-NMeNle-NMeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2

Claims (53)

1.一种成像剂，所述成像剂包含对程序性死亡配体1(PD-L1)具有结合特异性的肽和报告部分以及任选地接头的缀合物，其中所述接头当存在时连接所述肽和所述报告部分，而当所述接头不存在时，所述报告部分通过所述肽的氨基酸的伯胺直接附接到所述肽。

2.如权利要求1所述的成像剂，其中对PD-L1具有结合特异性的所述肽与PD-L1的氨基酸Y56、E58、A113、M115和Y123相互作用。

3.如权利要求1或权利要求2的成像剂，其中对程序性死亡配体1(PD-L1)具有结合特异性的所述肽与肽WL12、DK-A-221或DK-A-222具有至少80％序列同一性。

4.如权利要求3所述的成像剂，其中对程序性死亡配体1(PD-L1)具有结合特异性的所述肽与肽WL12、DK-A-221或DK-A-222具有至少85％序列同一性。

5.如权利要求4所述的成像剂，其中对程序性死亡配体1(PD-L1)成像剂具有结合特异性的所述肽与肽WL12、DK-A-221或DK-A-222具有至少90％序列同一性。

6.如权利要求5所述的成像剂，其中对程序性死亡配体1(PD-L1)具有结合特异性的所述肽与肽WL12、DK-A-221或DK-A-222具有100％序列同一性。

7.如权利要求1所述的成像剂，其中所述报告部分选自由以下组成的组：螯合剂、放射性标记的基质、荧光染料、光声报告分子和拉曼活性报告分子。

8.如权利要求7所述的成像剂，其中所述报告部分是螯合剂，并且所述螯合剂选自由以下组成的组：DOTAGA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷,1-(戊二酸)-4,7,10-三乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTASA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-(2-琥珀酸)-4,7,10-三乙酸)、CB-DO2A(10-二(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂二环[5.5.2]十四烷)、DEPA(7-[2-(二-羧甲基氨基)-乙基]-4,10-二-羧甲基-1,4,7,10-四氮杂-环十二-1-基-乙酸))、3p-C-DEPA(2-[(羧甲基)][5-(4-硝基苯基-1-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]戊烷-2-基)氨基]乙酸))、TCMC(2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7,10-四氮杂-1,4,7,10-四-(2-氨基甲酰基甲基)-环十二烷)、氧代-DO3A(1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-5-S-(4-异硫氰基苄基)-4,7,10-三乙酸)、p-NH₂-Bn-氧代-DO3A(1-氧杂-4,7,10-四氮杂环十二烷-5-S-(4-氨基苄基)-4,7,10-三乙酸)、TE2A((1,8-N,N′-二-(羧甲基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷)、MM-TE2A、DM-TE2A、CB-TE2A(4,11-二(羧甲基)-1,4,8,11-四氮杂二环[6.6.2]十六烷)、CB-TE1A1P(4,8,11-四氮杂环十四烷-1-(甲烷膦酸)-8-(甲烷羧酸)、CB-TE2P(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,8-二(甲烷膦酸))、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N′,N″-三乙酸)、NODA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸酯)；NODAGA(1,4,7-三氮杂环壬烷,1-戊二酸-4,7-乙酸)、(NOTAGA)1,4,7-三氮壬烷-1,4-二基)二乙酸DFO(去铁胺)、NETA([4-[2-(二-羧甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三氮壬烷-1-基}-乙酸)、TACN-TM(N,N',N",三(2-巯基乙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷)、Diamsar(1,8-二氨基-3,6,10,13,16,19-六氮杂二环(6,6,6)二十烷、3,6,10,13,16,19-六氮杂二环[6.6.6]二十烷-1,8-二胺)、Sarar(1-N-(4-氨基苄基)-3,6,10,13,16,19-六氮杂二环[6.6.6]二十烷-1,8-二胺)、AmBaSar(4-((8-氨基-3,6,10,13,16,19-六氮杂二环[6.6.6]二十烷-1-基氨基)甲基)苯甲酸)和BaBaSar。

9.如权利要求7所述的成像剂，其中所述螯合剂选自由以下组成的组：

10.根据权利要求7所述的成像剂，其中所述报告部分是螯合剂，并且所述螯合剂还包括放射性金属，所述放射性金属选自由以下组成的组：^94mTc、^99mTc、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁶⁰Cu、⁶¹Cu、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁵⁵Co、⁵⁷Co、⁴⁷Sc、²²⁵Ac、²¹³Bi、²¹²Bi、²¹²Pb、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、¹⁵²Gd、⁸²Rb、⁸⁹Zr和¹⁶⁶Dy。

11.根据权利要求7所述的成像剂，其中所述报告部分是放射性标记的基质，并且所述放射性标记的基质包括放射性同位素，所述放射性同位素选自由以下组成的组：¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁶I、¹³¹I、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、⁸⁰Br、^80mBr、⁸²Br、⁸³Br、¹⁸F和²¹¹At。

12.如权利要求11所述的成像剂，其中所述放射性标记的基质包括¹⁸F标记的基质。

13.如权利要求12所述的成像剂，其中所述¹⁸F标记的基质选自由以下组成的组：2-氟-PABA、3-氟-PABA、2-氟-甘露醇和N-琥珀酰亚胺基-4-氟苯甲酸酯。

14.如权利要求1所述的成像剂，其中所述报告部分被直接掺入到所述肽中。

15.如权利要求14所述的成像剂，其中所述报告部分包含所述肽的放射性标记的氨基酸。

16.如权利要求15所述的成像剂，其中所述放射性标记的氨基酸选自由以下组成的组：碘代酪氨酸和氟代酪氨酸。

17.如权利要求7所述的成像剂，其中所述报告部分是荧光染料，并且所述荧光染料选自由以下组成的组：碳菁、吲哚碳菁、氧杂碳菁、硫杂碳菁、部花青、多甲川、香豆素、罗丹明、呫吨、荧光素、硼-二吡咯甲烷(BODIPY)染料、Cy5、Cy5.5、Cy7、VivoTag-680、VivoTag-S680、VivoTag-S750、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750、AlexaFluor790、Dy677、Dy676、Dy682、Dy752、Dy780、DyLight547、Dylight647、HiLyteFluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor750、IR Dye 800、IRDye 800CW、IRDye800RS、IRDye 700DX、ADS780WS、ADS830WS和ADS832WS。

18.如权利要求7所述的成像剂，其中所述报告部分是光声报告分子，并且所述光声报告分子选自由以下组成的组：染料或纳米颗粒。

19.如权利要求18所述的成像剂，其中所述染料包括荧光染料。

20.如权利要求19所述的成像剂，其中所述荧光染料选自由以下组成的组：吲哚菁绿(ICG)、Alexa Fluor 750、伊文思蓝、BHQ3、QXL680、IRDye880CW、MMPSense 680、亚甲蓝、PPCy-C8和Cypate-C18。

21.如权利要求18所述的成像剂，其中所述纳米颗粒选自由以下组成的组：等离子体纳米颗粒、量子点、纳米金刚石、聚吡咯纳米颗粒、硫化铜纳米颗粒、石墨烯纳米片、氧化铁-金核-壳纳米颗粒、Gd₂O₃纳米颗粒、单壁碳纳米管、负载染料的全氟化碳纳米颗粒和超顺磁性氧化铁纳米颗粒。

22.如权利要求7所述的成像剂，其中所述报告部分是拉曼活性报告分子，并且所述拉曼活性报告分子选自由以下组成的组：单壁碳纳米管(SWNT)和表面增强的拉曼散射(SERS)剂。

23.如权利要求22所述的成像剂，其中所述SERS剂包括用拉曼活性报告分子标记的金属纳米颗粒。

24.如权利要求23所述的成像剂，其中所述拉曼活性报告分子包括荧光染料。

25.如权利要求24所述的成像剂，其中所述荧光染料选自由以下组成的组：Cy3、Cy5、罗丹明和硫属吡喃鎓染料。

26.如权利要求7所述的成像剂，其中所述接头选自由以下组成的组：

(a)

其中：

Rpt是报告部分；

W₁选自由以下组成的组：C₁-C₆亚烷基、C₃-C₆亚环烷基和亚芳基；

W₂选自由以下组成的组：-NR¹-(C＝O)-、-NR¹-(C＝S)-、-(C＝O)-NR¹-、-(C＝S)-NR¹-和-S-，其中每个R¹独立地是H或C₁-C₄烷基；

每个R₂独立地是H或-COOR₃，其中每个R₃独立地是H、C₁-C₆烷基、C₂-C₁₂芳基或C₄-C₁₆烷基芳基；

b是选自由以下组成的组的整数：0、1、2和3；

d是选自由以下组成的组的整数：1、2、3、4、5、6、7和8；并且

其中波浪线表示所述接头和所述肽之间的附接点；

(b)Rpt—X—Y—Z—W₃—

其中：

Rpt是报告部分；

X和Z各自独立地是C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈炔基、C₁-C₈杂烷基、C₂-C₈杂烯基、C₂-C₈杂炔基、C₁-C₈烷氧基或键，它们各自可以被0-5个R_A取代；

Y和W₃各自独立地是-O-、-S(O)_p-、-NH-、-NR_B-、-CH＝CH-、-CR_B＝CH-、-CH＝CR_B-、-NH-CO-、-NH-CO₂-、-NR_B-CO-、-NR_B-CO₂-；-CO-NH-、-CO₂-NH-、-CO-NR_B-、-CO₂-NR_B-或键；

p是0、1或2；

R_A每次出现时是卤素、羟基、氨基、氰基、硝基、CO₂H、任选地取代的烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的单烷基氨基或二烷基氨基、任选地取代的烷基硫基、任选地取代的烷基亚磺酰基、任选地取代的烷基磺酰基、任选地取代的单烷基甲酰胺或二烷基甲酰胺、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基；并且R_B每次出现时是任选地取代的烷基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的单烷基氨基或二烷基氨基、任选地取代的烷基硫基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基；或者

(c)氨基酸接头。

27.如权利要求1所述的成像剂，其中所述成像剂选自由以下组成的组：式(I)、式(II)或式(III)的化合物：

DK-A-221–(L)_n–Rpt(II)；或

DK-A-222–(L)_n–Rpt(III)；

其中：

n是选自由以下组成的组的整数：0和1；

L是接头；并且

Rpt是报告部分；并且

其中所述报告部分或接头当存在时附接到构成所述式(I)、式(II)或式(III)的成像剂的所述肽的氨基酸的伯胺基团。

28.如权利要求26所述的成像剂，其中所述接头当存在时附接到所述式(I)的化合物的¹³鸟氨酸(Orn)伯胺基团。

29.如权利要求26所述的成像剂，其中所述报告部分包括DOTAGA螯合剂。

30.如权利要求28所述的成像剂，其中所述DOTAGA螯合剂还包括⁶⁴Cu放射性金属。

31.如权利要求26所述的成像剂，其中所述式(I)的化合物是：

32.一种用于检测程序性死亡配体1(PD-L1)的成像方法，所述方法包括：

(a)提供有效量的如权利要求1-27中任一项所述的成像剂；

(b)使一种或更多种细胞或组织与所述成像剂接触；以及

(c)制作图像以检测PD-L1。

33.如权利要求31所述的成像方法，其中所述一种或更多种细胞或组织与所述成像剂的接触在体外、体内或离体进行。

34.如权利要求32所述的成像方法，其中所述一种或更多种细胞或组织与所述成像剂的接触在受试者中进行。

35.如权利要求33所述的成像方法，其中所述受试者是人类、大鼠、小鼠、猫、狗、马、绵羊、牛、猴、禽或两栖动物。

36.如权利要求31所述的成像方法，其中所述PD-L1的检测发生于向所述受试者施用所述成像剂后约60-120分钟或更少。

37.如权利要求31所述的成像方法，其中所述成像方法用于检测癌症。

38.如权利要求36所述的成像剂，其中所述癌症选自由以下组成的组：母细胞瘤、上皮癌、胶质瘤、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤、头癌、颈癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、白血病/淋巴瘤、子宫癌、皮肤癌、内分泌癌、泌尿系统癌、胰腺癌、胃肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、脑癌、腺瘤和转移性癌。

39.如权利要求31所述的成像方法，其中所述成像方法用于检测实体瘤。

40.如根据权利要求38所述的成像方法，其中所述实体瘤在选自由以下组成的组的器官中：脑、结肠、乳腺、前列腺、肝、肾、肺、食道、头和颈、卵巢、子宫颈、胃、直肠、膀胱、子宫、睾丸和胰腺。

41.如权利要求31所述的成像方法，其中所述成像方法用于检测感染。

42.如权利要求40所述的成像方法，其中所述感染是微生物感染。

43.如权利要求41所述的成像方法，其中所述微生物感染选自由因一种或更多种微生物引起的感染组成的组，所述微生物选自由以下组成的组：结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、大肠杆菌(E.coli)、克雷伯氏菌属的种(Klebsiella sp.)、肠杆菌属的种(Enterobacter sp.)、变形杆菌属的种(Proteus sp.)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、葡萄球菌属的种(Staphylococcus spp.)，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)和凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌属的种(Enterococcus sp.)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、拟杆菌属的种(Bacteroides spp.)、不动杆菌属的种(Acinetobacter spp.)、幽门杆菌属的种(Helicobacter spp.)、假丝酵母属的种(Candidasp.)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(VRE)。

44.如权利要求31所述的成像方法，其中所述成像方法用于检测炎症。

45.如权利要求43所述的成像剂，其中所述炎症与选自由以下组成的组的紊乱相关：哮喘、自身免疫疾病、自身炎性疾病、乳糜泻、憩室炎、肾小球性肾炎、化脓性汗腺炎、超敏反应、炎性肠病、间质性膀胱炎、耳炎、盆腔炎、再灌注损伤、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、移植排斥、狼疮、系统性红斑狼疮和血管炎。

46.如权利要求44所述的成像方法，其中所述炎症由类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮引起。

47.如权利要求31所述的成像方法，其中所述成像方法用于检测肿瘤中的一种或更多种免疫细胞。

48.如权利要求31所述的成像方法，其中所述成像方法用于检测所述肿瘤中或受试者的免疫细胞的系统性分布。

49.如权利要求31所述的成像方法，其中所述成像方法用于检测对传染病的免疫细胞应答。

50.如权利要求31所述的成像方法，其中所述成像方法用于检测肿瘤中的免疫细胞应答或正常组织对炎性疾病的应答。

51.如权利要求31所述的成像方法，其中所述成像方法检测受试者的PD-L1表达水平。

52.如权利要求31所述的成像方法，其中所述成像方法测量受试者的肿瘤部位处或正常组织中抗体或肽或低分子量剂对PD-L1的占据或靶结合。

53.一种试剂盒，所述试剂盒用于检测程序性死亡配体1(PD-L1)，所述试剂盒包含如权利要求1-27中任一项所述的成像剂。